CN116490129A - 具有酶固定化网络的连续生物传感器的工作导线 - Google Patents
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Abstract
公开一种连续生物传感器的工作导线，并且所述工作导线包括具有导电表面的基底和形成在所述导电表面上的酶层。所述酶层包括酶、固定化基质和聚合物交联剂，所述聚合物交联剂使所述酶和所述固定化基质交联，从而形成酶固定化网络。所述酶层之上包括保护层。公开一种用于制造连续生物传感器的工作导线的方法，并且所述方法包括将酶与溶剂结合，从而形成酶混合物。将固定化基质与所述酶混合物混合。在所述混合之后，将聚合物交联剂与所述酶混合物和所述固定化基质结合，从而形成交联混合物。使所述交联混合物稳定。将所稳定的交联混合物施加到所述工作导线，并且使所述工作导线上的所施加的混合物固化。
Description
相关申请
本申请要求2020年10月6日提交并且名称为“Stabilized Enzymatic Sensor”的美国临时专利申请号63/088,018的优先权，所述美国临时专利申请据此全文以引用方式并入。
本申请涉及2020年6月10日提交并且名称为“Sterilizable Metabolic AnalyteSensor”的美国临时申请63/037,072，所述美国临时申请如同全文阐述一般并入本文。本申请还涉及2019年4月5日提交并且名称为“Continuous Glucose Monitoring Device”的美国专利申请号16/375,891；其要求以下美国临时申请的优先权：(1)2018年4月6日提交并且名称为“Continuous Glucose Monitoring Device”的美国临时申请号62/653,821；(2)2019年1月25日提交并且名称为“Carbon Working Electrode for a ContinuousBiological Sensor”的美国临时申请号62/796,832；以及(3)2019年1月25日提交并且名称为“Enhanced Membrane Layers for the Working Electrode of a ContinuousBiological Sensor”的美国临时申请号62/796,842；所述申请中的每个申请都如同全文阐述一般并入本文。
背景技术
内科患者通常患有需要测量和报告生物状况的疾病或病症。例如，如果患者患有糖尿病，则患者准确了解其血液中的葡萄糖水平是非常重要的。常规上，糖尿病患者通过以下来监测其葡萄糖水平：用小刺血针刺其手指，使一滴血液形成，并且然后将测试条浸入所述血液中。测试条定位在手持式测试仪中，所述测试仪对血液执行分析并且在视觉上向患者报告测量的葡萄糖水平。基于此报告水平，患者就食用什么食物或向他们的血液中注射多少胰岛素做出重要决定。尽管全天多次检查葡萄糖水平对患者来说将是有利的，但是由于针刺的疼痛和不便，许多患者未能充分监测他们的葡萄糖水平。结果，患者可能进食不当或者注射过多或过少的胰岛素。无论怎样，患者的生活质量都会下降，并且导致对他们的健康和身体造成永久性损伤的机会增大。糖尿病是一种破坏性的疾病，如果控制不当，可能导致糟糕的生理状况诸如肾衰竭、皮肤溃疡、眼睛出血、失明、疼痛和可能截肢。
定期且准确监测葡萄糖水平对糖尿病患者至关重要。为了促进这种监测，连续葡萄糖监测(CGM)传感器是某种类型的装置，在所述类型的装置中，一天多次从就在皮肤下取样的液体自动测量葡萄糖。CGM装置通常涉及小外壳，电子器件定位在所述小外壳中，并且所述小外壳粘附到患者的皮肤以穿戴一定时间段。装置内的小针递送通常为电化学的皮下传感器。以此方式，患者可在他们身体上安装CGM传感器，并且所述CGM传感器将提供多天自动且准确的葡萄糖监测，而无需患者或护理人员采取任何行动。应理解，根据患者的需要，可以不同间隔执行连续葡萄糖监测。例如，一些连续葡萄糖监测器可被设定或编程为每分钟读取多个读数，而在其他情况下，连续葡萄糖监测器可被编程或设定为大约每小时读取一次读数。应理解，连续葡萄糖监测器可以不同间隔感测和报告读数。
连续葡萄糖监测是复杂的过程，并且已知由于若干个原因，体液中的葡萄糖水平可能会显著升高/提高或迅速降低/降低。因此，单次葡萄糖测量仅提供患者体内葡萄糖瞬时水平的简况。这种单次测量提供关于患者如何随时间推移使用葡萄糖或者患者对特定剂量的胰岛素如何反应的很少信息。因此，即使是坚持严格的手指针刺测试时间表的患者也将有可能会在饮食、运动和胰岛素注射方面做出错误的决定。当然，不太坚持或不准确地执行其条测试的患者会加剧这种情况。为了让患者更全面地了解自己的糖尿病状况并且获得更好的治疗效果，一些糖尿病患者现在使用连续葡萄糖监测。
电化学葡萄糖传感器通过使用电极进行操作，所述电极通常检测在葡萄糖转化为葡糖酸内酯期间由酶的氧化引起的安培信号。然后可将安培信号与葡萄糖浓度相关联。双电极(也称为双极)设计使用工作电极和参比电极，其中参比电极提供工作电极偏置的参考。参比电极基本上完成了电化学电路中的电子流。三电极(或三极)设计具有工作电极、参比电极和反电极。反电极补充在参比电极处的离子损耗并且是离子回路的一部分。
常规CGM系统通常使用工作导线，所述工作导线使用在其上沉积有薄铂层的钽芯。钽是相对坚硬的材料，其能够在不弯曲的情况下被压入皮肤，尽管可使用插入器针来促进插入。此外，钽与其他材料诸如铂相比更廉价，这使得工作导线更经济。众所周知，酶层沉积在铂层之上，所述酶层能够从用户的体液接受氧分子和葡萄糖分子。葡萄糖检测的关键化学过程发生在酶膜内。通常，酶膜具有分散在酶膜内的一种或多种葡萄糖氧化酶(GOx)。当一个葡萄糖分子和一个氧(O2)分子在存在葡萄糖氧化酶的情况下结合时，形成一个葡糖酸盐分子和一个过氧化氢(H2O2)分子。在一种构造中，铂表面促进其中过氧化氢反应以产生水和氢离子并且生成两个电子的反应。通过置于铂导线和参比电极上的偏置电压将电子吸入铂中。以此方式，在铂中流动的电流的大小旨在与过氧化氢反应的数量相关，所述过氧化氢反应旨在与氧化的葡萄糖分子的数量相关。因此，铂导线上的电流测量结果可与患者的体液诸如血液或间质液中的特定葡萄糖水平相关联。
然后工作导线与参比电极相关联，并且在一些情况下与形成CGM传感器的一个或多个反电极相关联。在操作中，CGM传感器耦接到小外壳中的电子器件并与其协作，例如处理器、存储器、无线电和电源定位在所述小外壳中。CGM传感器通常具有一次性施加器装置，所述施加器装置使用小插入器针以将CGM传感器皮下递送到患者体内。一旦CGM传感器就位，就可丢弃施加器，并且将电子器件外壳附接到传感器。尽管电子器件外壳可重复使用并且可长期使用，但CGM传感器和施加器需要相当频繁地(通常每隔几天)更换。
遗憾的是，常规CGM传感器的使用寿命有限，并且因此患者或用户必须移除旧传感器并将新传感器施加到身体上的新位置。这不仅不方便，还可能引起疼痛，而且还会增加使用CGM系统的成本。由于传感器在施加期间容易损坏，插入次数增加意味着传感器的损坏程度增大，并且再次成本增加。
酶层的有限稳定性是常规CGM传感器使用寿命短的关键因素。稳定性有两个组成部分：首先，酶层必须足够敏感，才能生成能够被传感器电子器件使用的电信号，并且其次，灵敏度水平需要保持数天。典型的已知传感器在约5天内具有良好的稳定性，但随后开始逐渐失去灵敏度。然后，在接下来的几天里，CGM系统可能能够使用算法过程根据降低的灵敏度进行调整，并且甚至可指导用户根据降低的灵敏度进行一次或多次现场校准。这些现场校准中的每一次都需要用户进行手指针刺血糖测试并且将结果录入到CGM的电子器件中以重置校准因子。结合算法调整和现场校准，典型的已知传感器由于降低的灵敏度需要大约10-14天更换一次。
同样重要的是，当用户或患者将传感器插入其身体时，传感器应是无菌的。因此，传感器通常在其制造之后被插入密封包装中，并且然后进行灭菌。最常见的灭菌方法中的一种是将密封包装暴露于灭菌气体，诸如通常称为EtO的环氧乙烷。应理解，根据具体应用和环境条件，存在并可使用若干种其他灭菌气体。遗憾的是，使用灭菌气体诸如EtO对传感器进行灭菌导致降低所制造传感器的稳定性和灵敏度。换句话讲，传感器在灭菌之前的稳定性优于已完成灭菌之后的稳定性。为了解决这个问题，已知使用替代的灭菌过程，诸如高功率电子束灭菌过程。然而，电子束过程可能更昂贵、更不可靠，并且经常损坏密封传感器包装中的任何电子器件或电子部件。
发明内容
在一些实施方案中，一种连续生物传感器的工作导线包括具有导电表面的基底和形成在所述导电表面上的酶层。所述酶层包括酶、固定化基质和聚合物交联剂，所述聚合物交联剂使所述酶和所述固定化基质交联，从而形成酶固定化网络。所述酶层之上包括保护层。
在一些实施方案中，一种用于制造连续生物传感器的工作导线的方法包括将酶与溶剂结合，从而形成酶混合物。将固定化基质与所述酶混合物混合。在所述混合之后，将聚合物交联剂与所述酶混合物和所述固定化基质结合，从而形成交联混合物。使所述交联混合物稳定。将所稳定的交联混合物施加到所述工作导线，并且使所述工作导线上的所施加的混合物固化。
附图说明
通过阅读以下具体实施方式并且参考附图和权利要求，本公开的目的和优点将变得显而易见。
图1A是根据一些实施方案的连续葡萄糖监测器的透视图。
图1B是根据一些实施方案的连续葡萄糖监测器系统的内部部件的部分示意图，其中覆盖件和底座被移除。
图2是根据一些实施方案的葡萄糖特异性传感器的工作导线的非按比例横截面视图。
图3是根据一些实施方案的连续葡萄糖监测器的葡萄糖特异性传感器的非按比例横截面图。
图4是根据一些实施方案的用于制造连续生物传感器的工作导线的方法的流程图。
图5A是示出根据一些实施方案的连续葡萄糖监测器的灵敏度结果的曲线图。
图5B是示出根据一些实施方案的传感器的灵敏度结果的图表。
图5C是示出根据一些实施方案的连续葡萄糖监测器的灵敏度结果的曲线图。
图6是示出根据一些实施方案的连续葡萄糖监测器的灵敏度结果的曲线图。
具体实施方式
本文描述的是具有酶层的连续生物传感器诸如连续葡萄糖监测器的工作导线。酶层被配制和加工为具有酶固定化网络。此酶固定化网络在更长的天数内稳定传感器的灵敏度，从而延长其使用寿命，并且减少算法校正或现场患者校准的需要。已根据本公开观察并测试酶固定化网络，以示出在利用灭菌气体诸如EtO灭菌之后的稳定性的提高。以此方式，具有酶固定化网络的传感器在制造之后具有延长的稳定性和使用寿命，并且在EtO灭菌之后表现出更好的稳定性和更长的使用寿命。应理解，可使用其他灭菌气体。
酶固定化网络充当代谢生物酶诸如葡萄糖氧化酶(GOx)的固定化网络。应理解，可根据待检测的特定代谢分析物使用其他酶。例如，乳酸氧化酶可用于监测作为分析物的乳酸，或者羟基丁酸脱氢酶可用于监测酮。此酶固定化网络可使用聚合物或蛋白质来配制。为了形成酶固定化网络，使用交联剂诸如聚合物交联剂或非聚合物交联剂将这些聚合物或蛋白质与酶一起稳定。一旦已使用这种酶固定化网络制造传感器，所述传感器就表现出显著改善的稳定性，并且在气体灭菌之后表现出提高的稳定性。
图1A是根据一些实施方案的连续葡萄糖监测器10的透视图。连续葡萄糖监测器10具有存放内部部件13(参见图1B)的包装12。包装12具有可密封地连接到底座15以提供气密密封的覆盖件14。在使用中，患者或护理人员接收包装12，并且从其相关联的底座15移除覆盖件14。患者或护理人员处理掉覆盖件14，并且通常通过粘合剂将底座15粘附到患者身体。图1B是根据一些实施方案的连续葡萄糖监测器10的内部部件的部分示意图，其中覆盖件14和底座15被移除。一旦覆盖件14和底座15已从包装12移除，就暴露出连续葡萄糖监测器10的内部部件13。这些内部部件13包括施加器16、连续葡萄糖监测器(CGM)传感器17和支持电子器件19，所述支持电子器件包括处理器、部件以及在一些情况下的电池和无线电。应理解，可提供其他结构诸如插入器针。在底座15粘附地附接到患者身体的情况下，患者或护理人员接合施加器16以将CGM传感器17插入患者的皮肤下。一旦CGM传感器17完全插入，就释放并且在许多情况下也可丢弃施加器16。患者现在在他们的身体上安装了操作的连续葡萄糖监测器10，使得CGM传感器17皮下插入，并且电子器件19能够监测葡萄糖水平。在一些实施方案中，电子器件19还包括用于将结果和警报传送到装置诸如支持的移动电话的无线电。在其他实施方案中，无线电可与电子器件19分开提供。
为了患者的安全，至关重要的是CGM传感器17在插入患者体内时是无菌的。因此，整个包装12在运送给患者使用之前由连续葡萄糖监测器制造商消毒。为了最高效制造，连续葡萄糖监测器10在清洁但非无菌环境中组装。因此，CGM传感器17、电子器件19和施加器16被组装到底座15上，并且然后覆盖件14抵靠底座15密封。然后要求存放所有内部部件13的包装12接受严格灭菌。
在用于CGM传感器的已知典型灭菌过程中，首先使用电子束灭菌(EBS)对CGM传感器进行灭菌，并且稍后例如在已将CGM传感器插入到病人体内之后，将电子器件连接到CGM传感器。然而，EBS不能用于连续血糖监测器10。在连续葡萄糖监测器10中，CGM传感器17和电子器件19在灭菌之前制造并连接在一起，并且因此包装12的任何EBS将损坏电子器件19。
在本公开的实施方案中，使用气体灭菌过程诸如通过使用EtO气体对包装12进行灭菌，其中连续葡萄糖监测器10被设计成使得电子器件19在灭菌期间受到保护。在常规CGM系统设计中，EtO气体可有效地对包括CGM传感器17的包装12进行灭菌，但众所周知，EtO气体会通过显著降低酶层的灵敏度和稳定性来对CGM传感器的性能产生负面影响。可渗透到包装12和CGM传感器17深处的EtO气体可能损坏CGM传感器17的酶层。然而，如下文将根据本公开描述的，CGM传感器17被特别构造为抵抗EtO气体的负面影响。由于保护了CGM传感器17中的酶，包装12可使用包括EtO气体的气体灭菌过程高效且有效地灭菌。这种对CGM传感器17的保护被配置为不仅抵抗气体灭菌的负面影响，而且可实际上提高CGM传感器17的灵敏度和稳定性，从而产生卓越的传感器。通过在气体灭菌期间保护酶并改善稳定性，即使在灭菌期间不存在电子器件，使用EtO气体灭菌甚至可能被认为是优选过程。
气体灭菌过程导致对包含CGM传感器17和电子器件19两者的包装进行安全灭菌，并且可改善酶层的稳定性和/或灵敏度以获得性能更好且寿命更久的传感器。由于用于连续葡萄糖监测器10的高效灭菌过程以及CGM传感器17的改善性能，可向患者提供更具成本效益的连续葡萄糖监测器10。尽管特别描述了使用EtO气体的灭菌过程，但应理解可使用其他气体，诸如二氧化氮、汽化的过乙酸或过氧化氢。应理解，根据专用需求，可用其他灭菌气体代替。此外，虽然气体灭菌过程在本公开中被描述为使用EtO气体，但应理解，本发明原理扩展到其他气体和灭菌过程。在一些实施方案中，CGM传感器可单独包装并经受电子束灭菌，其中传感器的膜层被配置为与灭菌之前相比在电子束灭菌之后改善传感器的稳定性和/或灵敏度。在一些实施方案中，连续葡萄糖监测器的干扰层和/或酶层被配置成使得连续葡萄糖监测器10具有一定性能特性，该性能特性的水平与灭菌过程之前相比在完成灭菌过程之后保持相同或得到改善，其中灭菌可以是气体或电子束。
图2描绘了根据一些实施方案的连续葡萄糖特异性传感器的工作导线20的非按比例横截面视图。工作导线20构造有可以是例如钽的基底22。应理解，可使用其他基底诸如如在名称为“Working Wire for a Biological Sensor”并且于2021年5月3日提交的共同未决美国临时专利申请号17/302,415中所阐述的Cr-Co合金；或如在名称为“A CarbonWorking Electrode for a Continuous Biological Sensor”并且于2019年4月5日提交的共同未决美国专利申请号16/375,887中所阐述的具有碳化合物的塑料基底；所有这些文献据此以引用方式并入。应理解，可使用其他基底材料。一般来讲，基底22具有是导电材料的导电表面(即，外表面)。导电表面可以是金属，并且可包括铂、铂/铱合金、铂黑、金或其合金、钯或其合金、镍或其合金、钛及其合金。导电表面可包括不同形式的碳，诸如包括纳米管、富勒烯、石墨烯和/或石墨的一种或多种碳同素异形体。导电表面还可包括碳材料，诸如抗磁性石墨、热解石墨、热解碳、炭黑、碳膏或碳墨。在图2的实施方案中，基底22具有连续层23，所述连续层是基底的导电的外表面。在此实施方案中，连续层23将被描述为铂，尽管可如贯穿本公开所述使用其他导电材料。此铂层可通过电镀或沉积工艺提供，或者在一些情况下可使用拉制填充管(DTF)工艺形成。应理解，可使用其他工艺来施加铂连续层23。
基底22、铂连续层23、干扰层24、酶层25和葡萄糖限制层27形成工作导线20的关键方面。应理解，可根据被测试的特定生物制品和专用需求添加若干其他层。在一些实施方案中，基底22可具有芯28。例如，如果基底22由钽制成，则可提供钛或钛合金的芯以提供附加强度和平直度。其他基底材料可将其他材料用于其芯28。
在一些实施方案中，干扰层24施加在铂连续层23之上。下面将详细描述的此干扰层完全包住铂连续层23，并且设定在导电表面的铂连续层23与酶层25之间。此干扰层被构造为完全包裹铂层，从而保护铂免受进一步氧化作用。干扰层还被构造为基本上限制较大干扰污染物分子诸如对乙酰氨基酚的传递，以减少可到达铂并使电信号结果偏差的不希望活性物种。此外，干扰层能够将受控水平的过氧化氢(H2O2)从酶层传递到铂层，从而提高灵敏度、稳定性和准确性。然后施加高度稳定的酶层25，并且最后将葡萄糖限制层27层叠在酶层25的顶部上。此葡萄糖限制层27(诸如共同未决美国专利申请号16/375,877中描述的葡萄糖限制层)可限制可穿过葡萄糖限制层27并进入酶层25的葡萄糖分子的数量。
如果传感器是葡萄糖传感器，则酶层25最常使用GOx作为活性酶，尽管应理解，例如当测量葡萄糖以外的生物物质时，可使用其他酶。对于具有工作导线20的传感器，酶层25被配制为不仅减少来自灭菌(例如来自暴露于EtO气体29)的任何负面影响，而且在一些情况下可被配制成使得灭菌过程实际上改善传感器的稳定性或灵敏度。正如下面将更详细描述的，酶层25可用特定的蛋白质或聚合物配制并加工，这实现了具有工作导线20的传感器的改善的灭菌响应。
图3是根据一些实施方案的连续葡萄糖监测器的葡萄糖特异性传感器的非按比例横截面图。传感器30按照葡萄糖监测器来描述，但是就本公开中的其他实施方案来说，传感器30也可应用于其他代谢物诸如酮或脂肪酸的监测。传感器30具有工作电极31，所述工作电极与参比电极32(在一些实施方案中，所述参比电极可由银或氯化银构造)协作，以提供可用于确定患者体液中的葡萄糖水平的电化学反应。尽管传感器30被示出为具有一个工作电极31和一个参比电极32，但应理解，一些替代传感器可使用多个工作电极、多个参比电极和反电极。还应理解，传感器30可在工作电极31与参比电极32之间具有不同物理关系。例如，工作电极31和参比电极32可分层布置、螺旋布置、同心布置或并排布置。应理解，许多其他物理布置可与本文的公开内容一致。
工作电极31具有导电部分，所述导电部分对于传感器30被示出为导电线33。此导电线33可以是例如固体铂、在较廉价的金属、碳或塑料上的铂涂层。换句话讲，在一些实施方案中，导电线33可以是导线的导电表面(即，导电层)。应理解，可使用与本公开一致的其他电子导体。工作电极31具有葡萄糖限制层36，所述葡萄糖限制层可用于限制污染物和被接收到酶膜35(也称为酶层)中的葡萄糖的量。
在操作中，葡萄糖限制层36基本上限制可到达酶膜35的葡萄糖的量，例如仅允许传递1000个葡萄糖分子中的约1个。通过严格限制可到达酶膜35的葡萄糖的量，改善了总体响应的线性度。葡萄糖限制层36还允许氧气行进到酶膜35。葡萄糖检测的关键化学过程发生在酶膜35内。通常，酶膜35具有分散在酶膜35内的一个或多个葡萄糖氧化酶(GOx)。当一个葡萄糖分子和一个氧(O2)分子在存在葡萄糖氧化酶的情况下结合时，形成一个葡糖酸盐分子和一个过氧化氢分子。然后过氧化氢通常既分散在酶膜35内又分散到干扰膜34(其在本公开中也可称为干扰层)中。在传感器30中，酶膜35通过提供酶固定化网络来稳定。在通常实施方案中，酶固定化网络具有交联的分子以提供增强的酶稳定性。例如，连续生物传感器诸如连续葡萄糖监测器的工作导线包括具有导电表面的基底和形成在所述导电表面上的酶层。酶层具有生物酶和交联剂诸如聚合物交联剂和/或非聚合物交联剂，所述交联剂使酶和固定化基质交联，从而形成酶固定化网络。在一些实施方案中，固定化分子在酶周围形成基质。酶层上包括保护层。
将描述两种特定类型的酶固定化网络。第一种类型的稳定化网络使用基于聚合物的固定化基质，诸如选自以下项中的一者或多者：聚氨酯(PU)、聚丙烯酸、聚丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙二醇(PEG)或聚乙烯醇(PA)及其共聚物、或N-(2-羟丙基)-甲基丙烯酰胺的共聚物、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚酰胺、聚丙烯酸酯、聚乙烯、聚碳酸酯或其组合。在一些实施方案中，固定化网络包含选自聚氨酯(PU)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或聚乙二醇(PEG)或其组合的聚合物的交联分子。例如，PVP可用于增厚材料以实现浸渍涂层，改善流动性以增强活性诸如酶与葡萄糖的反应，并且改善酶层葡萄糖灵敏度。第二种类型的稳定网络使用基于蛋白质的固定化基质，诸如选自以下中的一者或多者：牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、羧甲基纤维素(CMC)、胶原或其组合。
然后使用交联剂使选定的固定化基质(无论是聚合物还是蛋白质)固定化成酶固定化网络。交联剂可以是聚合物交联剂、非聚合物交联剂、或聚合物交联剂和非聚合物交联剂的组合。非聚合物交联剂的示例可选自戊二醛(GA)、多官能氮丙啶、双官能碳二亚胺、二环己基碳二亚胺、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基磺基琥珀酰亚胺、乙二醇双(琥珀酰亚胺基琥珀酸酯)(EGS)、乙二醇双(磺基琥珀酰亚胺基琥珀酸酯)(SEGS)、三-(琥珀酰亚胺基)氨基三乙酸酯(TSAT)、庚二亚氨酸二甲酯(DMP)、辛二亚氨酸二甲酯(DMS)、1，5-二氟-2，4-二硝基苯(DFDNB)、3，3’-二硫代双丙亚氨酸二甲酯(DTBP)、NHS-膦、NHS-PEG-叠氮化物、NHS-叠氮化物或其组合。例如，可一起使用这些剂中的多于一种。
在一些实施方案中，非聚合物交联剂可选自戊二醛(GA)、双官能碳二亚胺或其组合。戊二醛可能对酶层有极强的影响并且可以少量使用。例如，酶与戊二醛之比可以是80比1或75-82比1。双官能碳二亚胺也可以少量(诸如总溶液的1％或总溶液的0.8％至1.5％)组合。
一些实施方案可包括选自聚乙二醇(PEG)二醛、双官能PEG碳二亚胺、聚乙二醇化双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯或其组合的水溶性聚合物交联剂。在一些实施方案中，可使用大交联剂(例如，高分子量)。这些水溶性交联剂有效地将GOx酶包裹在其链内部，以保护GOx酶远离污染物。在一些实施方案中，将聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和水性聚氨酯分散溶液溶解在水中并与GOx混合。
在一些实施方案中，聚合物交联剂和非聚合物交联剂可一起使用，诸如对于聚合物交联剂，聚乙二醇(PEG)二醛，并且对于非聚合物交联剂，戊二醛。例如，水溶性聚合物交联剂(诸如聚乙二醇(PEG)二醛连同非聚合物交联剂试剂戊二醛)与酶以及固定化基质(诸如聚合物或蛋白质)交联。交联剂使酶稳定，从而将酶保持在原位诸如在酶层中。继而，葡萄糖灵敏度几乎没有随时间推移而损失。例如，在诸如通过使用EtO气体进行气体灭菌过程期间和之后，葡萄糖灵敏度几乎没有损失。测试的数据和结果在本文中讨论并呈现在图5A至图7中。相反，在常规方法中，酶既不与酶交联也不与固定化基质(或分子)交联，因此酶是可移动的并表现出移动。例如，在常规方法中，酶可结合在聚氨酯中。在这些系统中，外层诸如干扰层或葡萄糖限制层仅将酶“捕获”在酶层中，但酶仍然在层中四处自由移动。此外，在本文所公开的实施方案中，交联剂使酶稳定，同时仍允许它们发挥功能。例如，戊二醛使酶固定化，但通过使用聚乙二醇(PEG)二醛作为“间隔物”，它允许酶围绕交联键旋转。因此，在稳定性与仍然使酶能够与葡萄糖反应之间实现了平衡。
在一些实施方案中，交联剂可以是聚合物交联剂和非聚合物交联剂的组合，并且可选自聚乙二醇(PEG)双醛、双官能PEG碳二亚胺、聚乙二醇化双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯、戊二醛(GA)、多官能氮丙啶、双官能碳二亚胺、二环己基碳二亚胺、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基磺基琥珀酰亚胺、乙二醇双(琥珀酰亚胺基琥珀酸酯)(EGS)、乙二醇双(磺基琥珀酰亚胺基琥珀酸酯)(SEGS)、三-(琥珀酰亚胺基)氨基三乙酸酯(TSAT)、庚二亚氨酸二甲酯(DMP)、辛二亚氨酸二甲酯(DMS)、1，5-二氟-2，4-二硝基苯(DFDNB)、3，3’-二硫代双丙亚氨酸二甲酯(DTBP)、NHS-膦、NHS-PEG-叠氮化物、NHS-叠氮化物或其组合。对于一种交联剂或交联剂的组合，交联剂在混合物中的比例可以是10％至90％。
图4是根据一些实施方案的用于制造连续生物传感器的工作导线的方法的流程图。制造连续生物传感器的工作导线的方法40包括具有固定化网络的酶层。在一个示例中，方法40用于制造如参考图3所述的酶膜35。如下文将根据本公开所述，用于制造连续生物传感器诸如连续葡萄糖监测器的工作导线的方法40包括将酶与溶剂结合，从而形成酶混合物。将固定化基质与所述酶混合物混合。在所述混合之后，将聚合物交联剂与所述酶混合物和所述固定化基质结合，从而形成交联混合物。使所述交联混合物稳定。将所稳定的交联混合物施加到所述工作导线，并且使所述工作导线上的所施加的混合物固化。
如框41所示，通过将酶与溶剂混合以形成酶混合物来制备酶配方。选择恰当的溶剂，诸如用于制备浸渍碗酶配方的水。应理解，可使用其他溶剂，这取决于所使用的特定酶、聚合物、蛋白质或交联剂。当传感器旨在检测葡萄糖时，选择特定的酶诸如GOx。应理解，将选择用于其他类型的分析物检测的其他酶，诸如用于监测乳酸的乳酸氧化酶或用于监测酮的羟基丁酸脱氢酶。在框42处，如果已选择基于聚合物的稳定网络，则将酶与固定化基质结合或混合，所述固定化基质是聚合物，或者如果已选择基于蛋白质的稳定网络，则将酶与蛋白质混合。固定化分子可在酶周围形成基质。
在框43处，在混合之后，将交联剂混合到酶混合物和固定化基质中，从而形成交联混合物。例如，一旦酶已与选定的分子充分混合，则将交联剂结合到混合物中，从而形成交联混合物。交联剂可以是聚合物交联剂、非聚合物交联剂或其组合。在一些实施方案中，交联剂是聚合物交联剂。组合还可包括将非聚合物交联剂与酶混合物和固定化基质结合，从而形成交联混合物。在框44处，使交联混合物稳定。例如，一旦已将一种或多种交联剂彻底混合到配方中，就使配方稳定到稳定状态。这可通过随时间推移没有进一步显著的粘度变化来指示，使得一种或多种交联剂能够与酶和分子协作以形成酶固定化网络。
在一些实施方案中，由于交联剂的高浓度超过1 0重量％，通过高剪切混合来执行结合或混合。交联剂具有快速反应速率，并且将与最近的活性位点发生反应，这导致交联不均匀。随时间推移，交联的不均匀分布导致不稳定的网络和性能。高剪切混合通过向系统添加能量以跨添加的材料重新分布表面活性剂或交联剂诸如聚乙二醇(PEG)二醛来形成具有均匀分散体的均质溶液。在一些实施方案中，可使用其他混合技术诸如搅拌或叶轮。
在框45处，将所稳定的交联混合物施加到工作导线。例如，一旦交联酶配方已稳定，则就可在制造过程中使用它来涂覆传感器导线。传感器导线将具有已涂覆有干扰膜的导电基底。以此方式，将所稳定的交联混合物施加到干扰膜，但是应理解可进行其他布置。在一些实施方案中，将传感器导线浸入存放所稳定的交联混合物的容器中。用于将酶层施加到导线的其他技术可包括例如喷涂或印刷。工作电极可浸渍或浸没到所稳定的交联混合物中。
在框45的一些实施方案中，将工作电极存放在酶配方中达一定时间段诸如10秒至60秒。应理解，有若干个因素会影响粘附到工作导线的所稳定的交联混合物的厚度。例如，因素包括工作导线下降到所稳定的交联混合物中的速率、工作导线浸没在所稳定的交联混合物中的时间量、从所稳定的交联混合物移除工作导线的速率、环境条件像浸渍过程期间的温度、湿度、气流，以及传感器导线的平直度。此外，所稳定的交联混合物本身的方面诸如温度、粘度、蒸发、均质性和由于混合引起的任何移动也会影响施加的酶层的厚度。
此外，浸渍或浸没可进行一次，或者可根据需要重复进行以实现充分吸收GOx至期望深度和浓度。在一些情况下，制造过程将具有针对酶层的预定义目标厚度。在这种情况下，制造过程将具有用于确定每次浸渍之后的厚度的测量过程，并且然后继续浸渍工作导线直到已达到目标厚度。在框46处，使工作导线上的所稳定的交联混合物固化。例如，一旦已达到目标厚度，就使工作导线固化。固化可涉及例如在升高的温度(例如在大约40℃至60℃，诸如50℃)下干燥酶层。此固化过程使酶固定化网络进一步稳定，从而进一步提高了酶层的整体稳定性。在框47处，可施加保护层。例如，一旦酶层已完全固化，工作导线就可进入下一个制造过程，所述制造过程通常在酶层周围添加保护层或膜。在一些情况下，此保护层可以是葡萄糖限制层，并且在其他情况下它可以是生物保护层。应理解，其他类型的保护层可囊封酶层。
酶固定化网络充当用于保护GOx或其他酶分子或用于减少酶在酶层内迁移的趋势的包裹物或屏蔽物。在一些情况下，固定化网络还可充当用于与其他分子诸如EtO气体相互作用的牺牲屏障，而不是使EtO气体与酶本身相互作用并对酶本身产生负面影响。例如，当在固定化网络中使用蛋白质时，EtO气体可能首先与蛋白质发生反应，其中它在层中是均匀的。这减少了EtO气体对酶的影响。
图5A是示出根据一些实施方案的连续葡萄糖监测器的灵敏度结果的曲线图。曲线图50示出了由于未灭菌传感器中的酶固定化网络而改善稳定性的实际结果。所有传感器都在环境室温下储存在一起，直到它们被选择用于测试。曲线图50描绘了体外/工作台上有源传感器的信号响应，以模拟超过21天的真实生活性能。传感器放置在葡萄糖溶液中，从而导致酶层生成产生电化学响应的过氧化氢(H2O2)。这被测量为信号变化以确定传感器的性能。曲线图50具有示出以小时为单位的时间进展的x轴51和示出天数的标注。y轴52示出以nA/mg/dL为单位测量的电灵敏度。
曲线图50具有针对七个不同传感器的测量结果。第一组传感器53包括三个传感器，其中每个传感器具有不含交联剂的酶层。换句话讲，第一组传感器53中的每个传感器的酶层不具有酶固定化网络。第二组传感器54包括四个传感器。第二组传感器54中的每个传感器具有含交联剂(也称为交联剂)的酶层，使得酶层具有酶固定化网络。第二组传感器54使用以下酶配方：1)GOx作为酶，2)聚合物作为具有聚乙烯吡咯烷酮的水性聚氨酯分散体，和3)聚乙二醇二醛作为交联剂。样本或者说第一组传感器53和第二组传感器54包括导线、酶层(含有或不含交联剂)和外层以在一定测试时间内测试功能。通过具有外层，可在0nA/mg/dL至0.080nA/mg/dL的范围内测量灵敏度。
一般来讲，所有七个传感器的灵敏度在第零天以接近相同范围开始，并且第一组传感器53(每个都不含交联剂)的灵敏度通常随时间推移稳步下降。如图所示，第一组传感器53的灵敏度在14天内大大下降，并且在五天内示出了显著的灵敏度损失。相比之下，第二组传感器54(每个都含有交联剂)在前200小时内示出了改善的灵敏度，并且然后以异常的灵敏度持续到测试停止时的21天。具有交联剂的第二组传感器54不仅表现出优于不含交联剂的第一组传感器53的改善的灵敏度，而且它们还具有改善的稳定性并且在整整21天内表现出更好的线性度。凭借更好的灵敏度、显著更长的稳定性(例如，电灵敏度保持稳定超过21天)和改善的线性度，第二组传感器54在患者体内具有长得多的使用寿命，同时需要更少的更换和更少的现场校准或不需要现场校准。
图5B是示出根据一些实施方案的传感器的灵敏度结果的图表。总结图表55示出了由于酶层具有交联剂或酶固定化网络而在21天内改善稳定性的实际结果。样本包括导线和酶层(含有和不含交联剂)以测试不具有限制层屏障的酶层的性能。因此，灵敏度读数在0nA/mg/dL至30nA/mg/dL的范围内。图表55具有示出以nA/mg/dL为单位测量的灵敏度的y轴56。x轴示出了不含交联剂的第一组传感器53和含有交联剂的第二组传感器54的数据。第一条柱57表示来自图5A的不含有交联剂的第一组传感器53的测量结果，并且第二条柱58表示来自图5A的具有交联剂的第二组传感器54的测量结果。如图所示，第一条柱57中的不含交联剂的第一组传感器53示出了21天测试周期内的约10nA/mg/dL的平均灵敏度，而第二条柱58中的含有交联剂的第二组传感器54示出了约22nA/mg/dL的平均灵敏度。因此，使用交联剂以形成酶固定化网络使不含任何交联剂的酶层的灵敏度增大一倍以上。
图5C是示出根据一些实施方案的连续葡萄糖监测器的灵敏度结果的曲线图。曲线图70示出了对传感器执行的实际加速老化测试。样本在测试前灭菌。y轴示出以微安为单位测量的灵敏度电流，而x轴示出以小时为单位的时间。在大约50℃下对传感器执行测试，以便模拟传感器和酶随时间推移的老化。在传感器上使用高温加热作为预测老化性能的方式在本领域中是众所周知且确立已久的。曲线图70中的底线71示出了不具有交联剂并且因此缺乏酶固定化网络的第一组传感器73的灵敏度。一般来讲，灵敏度在20,000秒或约5.6小时内从0.025μA降低至接近0μA。相比之下，顶线72示出含有交联剂从而具有酶固定化网络的第二组传感器74的灵敏度。测试开始时的灵敏度为约0.038μA，并且在20,000秒或约5.6小时内仅略微降低至约0.035μA。
此测试说明了两个非常重要的特征。首先，含有交联剂和酶固定化网络的第二组传感器74在整个老化测试周期内具有极稳定的灵敏度。其次，在测试开始时，含有交联剂的第二组传感器74表现出几乎是不含交联剂的第一组传感器73的灵敏度的两倍的灵敏度，并且含有交联剂的第二组传感器74的相对优势随着时间的推进而增大。
图6是示出根据一些实施方案的连续葡萄糖监测器的灵敏度结果的曲线图。通过已知的现有技术传感器确立已久的是，用气体诸如EtO气体对CGM传感器进行灭菌会导致灵敏度和稳定性的劣化。曲线图60示出了对结合酶固定化网络的传感器进行灭菌实际上消除了气体灭菌的所有负面影响，并且已进行测试和测量以示出气体灭菌之后的灵敏度的改善。现在参考曲线图60，y轴61示出了以nA/mg/dL为单位测量的灵敏度。x轴示出了10个不同传感器的灵敏度数据。第一组编号为1至5的五个传感器62指示不具有交联剂并且因此不具有酶固定化网络的传感器。第二组编号6至10的传感器63指示确实具有交联剂并且因此在其酶层中具有酶固定化网络的传感器。1至10的传感器中的每一个都具有两个信息数据条柱。每个传感器的左条柱64指示所述传感器在已完成制造之后但在用EtO气体进行气体灭菌之前(例如，EtO前)的灵敏度。每个传感器的右条柱65指示所述传感器在所述传感器已用EtO气体消毒之后(例如，EtO后)的灵敏度。
如图所示，对于不具有交联剂的第一组传感器62中的每个传感器1至5，用EtO气体对传感器进行灭菌大大降低了灵敏度，如通过当比较每个传感器1至5的每个左条柱64与每个右条柱65时的灵敏度降低所观察到的。线68示出了每个传感器1至10的从左条柱64的灭菌前数据到右条柱65的灭菌后数据的灵敏度的百分比变化。曲线图60右手侧的y轴69以百分比指示灵敏度的变化。对于传感器2、3和4，灵敏度降低近一半，而传感器1的灵敏度降低近三分之二。传感器5示出了降低三分之一以上。平均来讲，对不具有交联剂的传感器1至5进行灭菌使灵敏度平均降低约50％。形成鲜明对比的是，第二组传感器63中的传感器6至10示出了EtO气体灭菌不仅没有使灵敏度劣化，而且实际上在约2％至超过10％之间改善灵敏度。这在曲线图60中通过查看线68以及通过比较每个传感器(6至10)的左条柱64和右条柱65来说明。以此方式，添加为酶固定化网络的形成提供支持的交联剂实现了每个测试传感器在气体灭菌后的改善的灵敏度。
在一些实施方案中，具有酶固定化网络(例如，交联剂)的连续葡萄糖传感器在气体灭菌之前具有第一测量电酶灵敏度并且在气体灭菌之后具有第二测量电酶灵敏度。气体灭菌可通过环氧乙烷(EtO)灭菌进行。当将第一测量电酶灵敏度与第二测量电酶灵敏度进行比较时，第二测量电酶灵敏度大于第一测量电酶灵敏度，如图6的曲线图60所证实(参见具有交联剂数据的第二组传感器63)。
参考图3，干扰膜34层叠在工作电极31中的导电线33与酶膜35(也称为膜层)之间。一般来讲，干扰膜34作为单体与选定的添加剂一起施加，并且然后聚合。干扰膜34可以非常一致且共形的方式电沉积到导电线33上，由此降低制造成本以及提供更可控且可重复的层形成。干扰膜34不传导电子，但是可以预选速率传递离子和过氧化氢。此外，干扰膜34可被配制为对于特定分子选择渗透。在一个示例中，干扰膜34以限制活性分子传递的方式配制和沉积，所述活性分子可充当污染物使导电线33劣化或者可干扰电检测和传输过程。
在一些实施方案中，干扰膜34不传导电子，但是传导离子。在实践中，可使用例如聚邻氨基苯酚(POAP)来构造特别有效的干扰膜。可使用电沉积工艺将POAP沉积到导电线33上，其厚度可被精确控制以使得可预测水平的过氧化氢能够通过干扰膜34传递到导电线33。此外，可调节POAP的pH水平以设定干扰膜34的期望选择渗透性。例如，可有利地调节pH值以显著阻挡较大分子诸如对乙酰氨基酚的传递，从而减少可到达导电线33的污染物。应理解，可使用其他材料。例如，干扰层可包含已电聚合的聚合物，选自以下项：聚苯胺、萘酚或苯二胺、2-氨基苯酚、3-氨基苯酚、4-氨基苯酚、间苯二胺、邻苯二胺、对苯二胺，吡咯、衍生吡咯、氨基苯基硼酸、噻吩、卟啉、苯胺、苯酚、苯硫酚或其共混物。
当工作电极31暴露于EtO气体时，EtO气体穿过葡萄糖限制层36(如果存在)并接触酶膜35并可能穿透所述酶膜。然而，酶膜35中的固定化网络抵抗EtO气体的负面影响，并且起到改善所得生物传感器的稳定性和灵敏度的作用。可提供进一步的保护，因为干扰膜34可充当物理屏蔽物以降低穿过酶层、可到达导电线33的EtO水平，从而降低EtO的负面氧化影响。
已详细参考所公开发明的实施方案，其一个或多个示例已在附图中示出。每个示例已通过解释本技术的方式而不是作为对本技术的限制来提供。事实上，尽管已相对于本发明的具体实施方案来详细描述本说明书，但应理解的是，本领域技术人员在理解前述内容之后可容易构想出这些实施方案的替代物、变化和等同物。例如，作为一个实施方案的一部分示出或描述的特征可与另一个实施方案一起使用以得到又一个实施方案。因此，意在本主题涵盖在所附权利要求及其等同物的范围之内的所有此类修改和变化。本领域普通技术人员可实践本发明的这些和其他修改和变化，而不背离在所附权利要求中更具体阐述的本发明的范围。此外，本领域普通技术人员将理解的是，前述描述仅作为示例，并且不旨在限制本发明。
Claims (20)
1.一种连续生物传感器的工作导线，其包括：
基底，所述基底具有导电表面；
在所述导电表面上的酶层，所述酶层包括：
酶；
固定化基质；以及
聚合物交联剂，所述聚合物交联剂使所述酶和所述固定化基质交联，从而形成酶固定化网络；以及
在所述酶层之上的保护层。
2.根据权利要求1所述的工作导线，其还包括：在所述酶固定化网络中的非聚合物交联剂，所述非聚合物交联剂使所述酶和所述固定化基质交联。
3.根据权利要求2所述的工作导线，其中所述非聚合物交联剂选自戊二醛、多官能氮丙啶、双官能碳二亚胺、二环己基碳二亚胺、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基磺基琥珀酰亚胺、乙二醇双(琥珀酰亚胺基琥珀酸酯)(EGS)、乙二醇双(磺基琥珀酰亚胺基琥珀酸酯)(SEGS)、三-(琥珀酰亚胺基)氨基三乙酸酯(TSAT)、庚二亚氨酸二甲酯(DMP)、辛二亚氨酸二甲酯(DMS)、1，5-二氟-2，4-二硝基苯(DFDNB)、3，3’-二硫代双丙亚氨酸二甲酯(DTBP)、NHS-膦、NHS-PEG-叠氮化物、NHS-叠氮化物或其组合。
4.根据权利要求2所述的工作导线，其中所述聚合物交联剂和所述非聚合物交联剂是聚乙二醇(PEG)二醛和戊二醛的组合。
5.根据权利要求1所述的工作导线，其中所述聚合物交联剂选自聚乙二醇(PEG)二醛、双官能PEG碳二亚胺、聚乙二醇化双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯或其组合。
6.根据权利要求1所述的工作导线，其中所述固定化基质是选自以下项的聚合物：聚氨酯(PU)、聚丙烯酸、聚丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙二醇(PEG)或聚乙烯醇(PA)及其共聚物、或N-(2-羟丙基)-甲基丙烯酰胺的共聚物、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚酰胺、聚丙烯酸酯、聚乙烯、聚碳酸酯或其组合。
7.根据权利要求1所述的工作导线，其中所述固定化基质是选自以下项的蛋白质：牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、羧甲基纤维素(CMC)、胶原或其组合。
8.根据权利要求1所述的工作导线，其中所述酶是葡萄糖氧化酶(GOx)。
9.根据权利要求1所述的工作导线，其中所述保护层是葡萄糖限制层。
10.一种制造连续生物传感器的工作导线的方法，其包括：
将酶与溶剂结合，从而形成酶混合物；
将固定化基质与所述酶混合物混合；
在所述混合之后，将聚合物交联剂与所述酶混合物和所述固定化基质结合，从而形成交联混合物；
使所述交联混合物稳定；
将所稳定的交联混合物施加到所述工作导线；以及
使所述工作导线上的所施加的混合物固化。
11.根据权利要求10所述的方法，其还包括：
在所述混合之后，将非聚合物交联剂与所述酶混合物和所述固定化基质结合，从而形成交联混合物。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述非聚合物交联剂选自戊二醛(GA)、多官能氮丙啶、双官能碳二亚胺、二环己基碳二亚胺、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基磺基琥珀酰亚胺、乙二醇双(琥珀酰亚胺基琥珀酸酯)(EGS)、乙二醇双(磺基琥珀酰亚胺基琥珀酸酯)(SEGS)、三-(琥珀酰亚胺基)氨基三乙酸酯(TSAT)、庚二亚氨酸二甲酯(DMP)、辛二亚氨酸二甲酯(DMS)、1，5-二氟-2，4-二硝基苯(DFDNB)、3，3’-二硫代双丙亚氨酸二甲酯(DTBP)、NHS-膦、NHS-PEG-叠氮化物、NHS-叠氮化物或其组合。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述聚合物交联剂和所述非聚合物交联剂是聚乙二醇(PEG)二醛和戊二醛的组合。
14.根据权利要求10所述的方法，其中所述聚合物交联剂选自聚乙二醇(PEG)二醛、双官能PEG碳二亚胺、聚乙二醇化双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯或其组合。
15.根据权利要求10所述的方法，其中所述固定化基质是选自以下项的聚合物：聚氨酯(PU)、聚丙烯酸、聚丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙二醇(PEG)或聚乙烯醇(PA)及其共聚物、或N-(2-羟丙基)-甲基丙烯酰胺的共聚物、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚酰胺、聚丙烯酸酯、聚乙烯、聚碳酸酯或其组合。
16.根据权利要求10所述的方法，其中所述固定化基质是选自以下项的蛋白质：牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、羧甲基纤维素(CMC)、胶原或其组合。
17.根据权利要求10所述的方法，其中所述混合包括高剪切混合。
18.根据权利要求10所述的方法，其中所述酶是葡萄糖氧化酶(GOx)。
19.根据权利要求10所述的方法，其中所述连续生物传感器在气体灭菌之前具有第一测量电酶灵敏度，在所述气体灭菌之后具有第二测量电酶灵敏度，并且所述第二测量电酶灵敏度大于所述第一测量电酶灵敏度。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述气体灭菌是通过环氧乙烷(EtO)灭菌进行的。
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