JP2020182494A - 支持細胞を用いない赤血球の生産方法 - Google Patents
支持細胞を用いない赤血球の生産方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2020182494A JP2020182494A JP2020129086A JP2020129086A JP2020182494A JP 2020182494 A JP2020182494 A JP 2020182494A JP 2020129086 A JP2020129086 A JP 2020129086A JP 2020129086 A JP2020129086 A JP 2020129086A JP 2020182494 A JP2020182494 A JP 2020182494A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- medium
- type
- hematopoietic
- cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0641—Erythrocytes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/36—Lipids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/105—Insulin-like growth factors [IGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/125—Stem cell factor [SCF], c-kit ligand [KL]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/14—Erythropoietin [EPO]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/145—Thrombopoietin [TPO]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/23—Interleukins [IL]
- C12N2501/2303—Interleukin-3 (IL-3)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/23—Interleukins [IL]
- C12N2501/2311—Interleukin-11 (IL-11)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/26—Flt-3 ligand (CD135L, flk-2 ligand)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/90—Polysaccharides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/998—Proteins not provided for elsewhere
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/03—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from non-embryonic pluripotent stem cells
Abstract
Description
づいて優先権を主張し、該特許仮出願の内容は全て参照によって本明細書中に引用される
ものとする。
本明細書では、全体として、造血細胞集団(例えばCD34+細胞集団)を増殖させる
方法、および当該細胞集団から投与可能な赤血球のユニット(units)を生産する方法を
提供する。また、本明細書では、上記増殖および分化を達成するバイオリアクターを提供
する。
米国では毎年、およそ1300万ユニットの血液が、輸血、または血小板等の救命用血
液製剤の生産のために用いられている。赤十字および他の機関によって、約500mL〜
約1000mLの全血サンプルを得るために、自発的な献血が利用される。HIVおよび
他の外来病原体(adventitious pathogen)の発生率が比較的低い米国および西欧では、
自発的な献血のセルフスクリーニングは比較的安全かつ効果的である。しかし、HIVお
よび肝炎が蔓延している国では、輸血用の安全な血液の獲得は、大いに問題になり得る。
自発的な献血に代わるものとして、多くのグループが、長期の保存に耐えうる安全な人工
代用血液を発達させようと試みている。これらの人工代用血液のいくつかは、外傷性失血
の応急手当において大いに有望である一方、長期にわたって赤血球の機能の代わりになる
ようには作られていない。戦場または世界中に設置されている民間の病院の患者に投与可
能である、安全かつ豊富な赤血球の供給を発達させる必要性が高まっている。
的な現地での生産を可能にするにはあまりに面倒であるかのどちらかである。従来のディ
ッシュまたはフラスコをベースとした培養系は、断続的な培地の交換がつきものであり、
一般的なディッシュベースの培養系は、109個を超える細胞を1バッチ(single batche
s)として扱うために用いることはできない。ディッシュからの論理的なさらなる発展は
、バッグ技術(例えば、ウェーブバイオリアクター)である。バッグ技術においては、バ
ッグを用いることで培地の体積を大幅に増加させ、浮遊性担体を用いることで細胞の付着
面積を増加させることができる。しかし、バッグ型のリアクターは、一般的に2×106
〜約6×106細胞/ml培地で運転され、培養中の大幅な培地の希釈および煩雑な10
〜100倍のデバルキング(debulking)が必要である。さらに、バッグ技術、および一
般的な全ての大型攪拌槽型バイオリアクターは、「通常の」細胞増殖および分化を促す組
織のような生理的環境を提供するものではない。
本明細書において、増殖した造血細胞を投与可能な赤血球に分化させるため、および赤
血球を含む細胞の投与可能なユニットの生産のために、造血細胞(例えば造血幹細胞また
は造血前駆細胞)を増殖する方法を提供する。
記方法は、ヒト胎盤灌流液由来の造血細胞を赤血球に分化させることを含み、上記方法は
、支持細胞層の非存在下で造血細胞集団を増殖させること;および造血細胞を赤血球また
は赤血球前駆体に分化させることを含む。
めのバイオリアクターを提供する。上記バイオリアクターは、バッチ法に比べて継続的な
赤血球の生産を容易にすることで、現在の赤血球生産方法と同等の多数の赤血球を、より
小さい体積で生産することができる。特定の実施形態では、上記バイオリアクターは、細
胞培養部材、細胞分離部材、ガス供給部材、および/または培地供給部材を備える。上記
バイオリアクターの特定の実施形態では、赤血球は、磁気ビーズによる分離によって集め
られる。上記方法の別の側面では、赤血球は、上記赤血球中のヘモグロビンを部分的また
は完全に脱酸素化し、磁場を用いて赤血球を表面に引き寄せることで集められる。
が、本明細書中で提供される。特定の実施形態では、本明細書に記載される複数のバイオ
リアクターを用いて赤血球を生産することを含む、赤血球の生産方法が本明細書中で提供
される。
させる工程であって、当該増殖させる工程の間に、上記造血細胞集団中の複数の造血細胞
が赤血球へ分化する工程と、上記培地から上記赤血球を単離する工程と、を含む、赤血球
を生産する方法であって、上記培地は、約10〜約10,000ng/mLの濃度である
SCF、約0.01〜約500ng/mLの濃度であるIL−3、および、約0.1〜約
10IU/mLの濃度であるEpoを含み、上記SCF、IL−3およびEpoは、上記
培地の定義されていない成分(例えば血清)の中には含まれていないことを特徴とする、
赤血球を生産する方法を提供する。上記方法の特定の実施形態では、上記培地は、Flt
−3L、IL−11、トロンボポエチン(Tpo)、ホメオボックス−B4(HoxB4
)またはメチルセルロースのうち、1つ以上、またはいずれも含まない。他の特定の実施
形態では、上記培地は、約20〜約2000ng/mL;約50〜約1000ng/mL
;または約100ng/mLの濃度でSCFを含む。他の特定の実施形態では、上記培地
は、約0.1〜約100ng/mL;約1〜約50ng/mL;または約5ng/mLの
濃度でIL−3を含む。他の特定の実施形態では、上記培地は、約1〜約5IU/mL;
または約2〜約3IU/mLの濃度でEpoを含む。
濃度であるインスリン様増殖因子1(IGF−1)、および、約1〜約1000μg/m
Lの濃度である脂質を含み、上記脂質はたんぱく質とコレステロールとの混合物を含み;
上記培地は、約0.01〜約100μMの濃度であるヒドロコルチゾン、または、約0.
01〜約100μMの濃度であるデキサメタゾンを含む。さらに特定の実施形態では、上
記培地は、約10〜約500ng/mL;または約20〜約100ng/mLの濃度でI
GF−1を含む。他のさらに特定の実施形態では、上記培地は、約10〜約500ng/
mL;または約20〜約100ng/mLの濃度で脂質を含む。他のさらに特定の実施形
態では、上記培地は、約0.1〜約50μM;または約0.5〜約10μMの濃度でヒド
ロコルチゾンを含む。他のさらに特定の実施形態では、上記培地は、約0.05〜約20
μM;または約0.1〜約10μMの濃度でデキサメタゾンを含む。
のEpo、約40ng/mLのIGF−1、約5ng/mLのIL−3、約1μMのデキ
サメタゾン、および40μg/mLの脂質を含み、上記脂質は、たんぱく質とコレステロ
ールとの混合物を含む。別のさらに特定の実施形態では、上記培地は、約100ng/m
LのSCF、約2U/mLのEpo、約40ng/mLのIGF−1、約5ng/mLの
IL−3、約1μMのヒドロコルチゾン、および50ng/mLの脂質を含み、上記脂質
は、たんぱく質とコレステロールとの混合物を含む。
脂質;並びに、ヒドロコルチゾンまたはデキサメタゾンのどちらかを含む培地中において
、継続的な方法で増殖および分化し、上記脂質は、たんぱく質とコレステロールとの混合
物(例えば、Lipids Cholesterol Rich from adult
bovine serum;Cat.No.C7305−1G, Sigma, St
Louis, MO)を含む。特定の実施形態では、上記培地は、約10〜約10,0
00ng/mL;約20〜約2000ng/mL;約50〜約1000ng/mL;約1
00ng/mL;または約100ng/mLの濃度であるSCFを含む。他の特定の実施
形態では、上記培地は、約1〜約5IU/mL;または約2〜約3IU/mLの濃度であ
るEpoを含む。他の特定の実施形態では、上記培地は、約1〜約1000ng/mL;
約10〜約500ng/mL;約20〜約100ng/mL;または約40ng/mLの
濃度であるIGF−1を含む。他の特定の実施形態では、上記培地は、約1〜約1000
μg/mL;約10〜約500ng/mL;約20〜約100ng/mL;または約40
ng/mLの濃度である脂質を含む。他の特定の実施形態では、上記培地は、約0.1μ
M〜約10μM;約0.5μM〜約5μM;または約1μMの濃度であるヒドロコルチゾ
ンを含む。他の特定の実施形態では、上記培地は、約0.1μM〜約10μM;約0.5
μM〜約5μM;または約1μMの濃度であるデキサメタゾンを含む。
、上記免疫調節化合物が存在しない状態で増殖した複数の造血細胞に比べて、造血細胞の
数を増加させるものである。
別の特定の実施形態では、上記造血細胞は、Thy−1+、CXCR4+、CD133+ま
たはKDR+である。別の特定の実施形態では、上記造血細胞は、CD34-CD133+
またはCD34-CD117+である。別の特定の実施形態では、上記造血細胞は、CD4
5-である。別の特定の実施形態では、造血細胞は、CD2-、CD3-、CD11b-、C
D11c-、CD14-、CD16-、CD19+、CD24-、CD56-、CD66b-お
よび/またはグリコフォリンA-である。
胞または誘導された多能性細胞から得られる。別の特定の実施形態では、上記造血細胞は
、胎盤灌流液から得られる。別の特定の実施形態では、上記造血細胞は、臍帯血および胎
盤灌流液から得られる。さらに特定の実施形態では、上記胎盤灌流液は、胎盤の脈管構造
のみを通る灌流液のパッセージ(passage)によって得られる。別の特定の実施形
態では、上記造血細胞は、ヒトの造血細胞である。
型の血液型;Rh陽性またはRh陰性;M型、N型、S型、またはs型の血液型;P1型
の血液型;Lua型、Lub型、またはLu(a)型の血液型;K(Kell)型、k(
cellano)型、Kpa型、Kpb型、K(a+)型、Kp(a−b−)型またはK
−k−Kp(a−b−)型の血液型;Le(a−b−)型、Le(a+b−)型またはL
e(a−b+)型の血液型;Fy a型、Fy b型またはFy(a−b−)型の血液型
;Jk(a−b−)型、Jk(a+b−)型、Jk(a−b+)型またはJk(a+b+
)型の血液型である。さらに特定の実施形態では、上記造血細胞は、O型、Rh陽性;O
型、Rh陰性;A型、Rh陽性;A型、Rh陰性;B型、Rh陽性;B型、Rh陰性;A
B型、Rh陽性またはAB型、Rh陰性である。上記方法の他の特定の実施形態では、上
記造血細胞のうちの90%、95%、98%もしくは99%を超える割合、またはそれぞ
れがA型、O型、AB型、O型の血液型;Rh陽性またはRh陰性;M型、N型、S型、
またはs型の血液型;P1型の血液型;Lua型、Lub型、またはLu(a)型の血液
型;K(Kell)型、k(cellano)型、Kpa型、Kpb型、K(a+)型、
Kp(a−b−)型またはK−k−Kp(a−b−)型の血液型;Le(a−b−)型、
Le(a+b−)型またはLe(a−b+)型の血液型;Fy a型、Fy b型または
Fy(a−b−)型の血液型;Jk(a−b−)型、Jk(a+b−)型、Jk(a−b
+)型またはJk(a+b+)型の血液型である。さらに特定の実施形態では、上記造血
細胞は、O型、Rh+;O型、Rh陰性;A型、Rh陽性;A型、Rh陰性;B型、Rh
陽性;B型、Rh陰性;AB型、Rh陽性またはAB型、Rh陰性である。
が、本明細書中で提供される。上記組成物の特定の実施形態では、上記組成物中の、ヘモ
グロビンを有する細胞の総数に対する胎児型ヘモグロビンを有する細胞の割合が約70〜
約99%である。特定の実施形態では、ヘモグロビンを有する細胞の総数に対する成体型
ヘモグロビンを有する細胞の割合が約5〜約40%である。
れる。他の特定の実施形態では、赤血球を単離する工程が、上記造血細胞が増殖および分
化する工程の間に、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、2
5、30、35、40、45、50、55、もしくは60分ごと、または、1、1.5、
2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7.0、7.5、8.
0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12、13、
14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、もしくは24時間ごと
、またはそれ以上で、定期的に行われる。別の特定の実施形態では、例えば、特定の細胞
密度での培養の達成;1ミリリットルあたりの特定の細胞数が、ある赤血球マーカー(例
えばCD36もしくはグリコフォリンA)を発現する培養の達成等、1つ以上の培養条件
が満たされた場合に、上記赤血球の単離が定期的に行われる。
、約0.01〜約500ng/mLの濃度であるIL−3、および約0.1〜約10IU
/mLの濃度であるEpoを含む、造血細胞の成長または分化のための培地であって、上
記SCF、IL−3およびEpoは、上記培地の定義されていない成分の中に含まれてい
ないことを特徴とする培地が、本明細書中で提供される。特定の実施形態では、上記培地
は、Flt−3L、IL−11、トロンボポエチン(Tpo)、ホメオボックス−B4(
HoxB4)またはメチルセルロースのうち、1つ以上を含まない。他の特定の実施形態
では、上記培地は、約20〜約2000ng/mL;約50〜約1000ng/mL;ま
たは約100ng/mLの濃度であるSCFを含む。他の特定の実施形態では、上記培地
は、約0.1〜約100ng/mL;約1〜約50ng/mL;または約5ng/mLの
濃度であるIL−3を含む。他の特定の実施形態では、上記培地は、約1〜約5IU/m
L;約2〜約3IU/mLの濃度であるEpoを含む。
るインスリン様増殖因子1(IGF−1)、および、約1〜約1000μg/mLの濃度
である脂質を含み、上記脂質は、たんぱく質とコレステロールとの混合物を含み、上記培
地は、約0.01〜約100μMの濃度であるヒドロコルチゾン、または、約0.01〜
約100μMの濃度であるデキサメタゾンを含む。さらに特定の実施形態では、上記培地
は、約10〜約500ng/mL;または約20〜約100ng/mLの濃度であるIG
F−1を含む。さらに特定の実施形態では、上記培地は、約10〜約500ng/mL;
または約20〜約100ng/mLの濃度である脂質を含む。他のさらに特定の実施形態
では、上記培地は、約0.1〜約50μM;約0.5〜約10μMの濃度であるヒドロコ
ルチゾンを含む。他のさらに特定の実施形態では、上記培地は、約0.05〜約20μM
;約0.1〜約10μMの濃度であるデキサメタゾンを含む。
o、約40ng/mLのIGF−1、約5ng/mLのIL−3、約1μMのデキサメタ
ゾン、および40μg/mLの脂質を含み、上記脂質は、たんぱく質とコレステロールと
の混合物を含む。別のさらに実施形態では、上記培地は、約100ng/mLのSCF、
約2U/mLのEpo、約40ng/mLのIGF−1、約5ng/mLのIL−3、約
1μMのヒドロコルチゾン、および50ng/mLの脂質を含み、上記脂質は、たんぱく
質とコレステロールとの混合物を含む。
含み、さらに、1%ウシ血清アルブミン;10μg/mLの組み換えヒトインスリン;1
00μg/mLのヒトトランスフェリン(鉄飽和);および0.1μMの2−メルカプト
エタノール;2mMのL−グルタミンが追加されている。
ドロコルチゾンまたはデキサメタゾンのどちらかを含み、上記脂質は、たんぱく質とコレ
ステロールとの混合物(例えば、Lipids Cholesterol Rich f
rom adult bovine serum;Cat.No.C7305−1G,
Sigma, St Louis, MO)を含む。特定の実施形態では、上記培地は、
約10〜約10,000ng/mL;約20〜約2000ng/mL;約50〜約100
0ng/mL;約100ng/mL;または約100ng/mLの濃度であるSCFを含
む。他の特定の実施形態では、上記培地は、約1〜約5IU/mL;または約2〜約3I
U/mLの濃度であるEpoを含む。他の特定の実施形態では、上記培地は、約1〜約1
000ng/mL;約10〜約500ng/mL;約20〜約100ng/mL;または
約40ng/mLの濃度であるIGF−1を含む。他の特定の実施形態では、上記培地は
、約1〜約1000μg/mL;約10〜約500ng/mL;約20〜約100ng/
mL;または約40ng/mLの濃度である脂質を含む。他の特定の実施形態では、上記
培地は、約0.1μM〜約10μM;約0.5〜約5μM;または約1μMの濃度である
ヒドロコルチゾンを含む。他の特定の実施形態では、上記培地は、約0.1μM〜約10
μM;約0.5μM〜約5μM;または約1μMの濃度であるデキサメタゾンを含む。
わち赤血球に分化することができる血球を包含する。
は、細胞マーカーが、蛍光活性化セルソーターにおいて、アイソタイプコントロールを超
えて検出可能に存在する、または、定量的もしくは半定量的RT−PCRにおいて、バッ
クグラウンドを超えて検出可能である、ということを意味する。
は、細胞マーカーが、蛍光活性化セルソーターにおいて、アイソタイプコントロールを超
えて検出可能には存在しない、または、定量的もしくは半定量的RT−PCRにおいて、
バックグラウンドを超えて検出可能ではない、ということを意味する。
図1:HPP由来のCD34+/CD45-およびCD34+/CD45+細胞のフローサ
イトメトリー分析。
34+細胞;(B)単離後のCD34+細胞。
:全有核細胞(TNC)の増殖倍率。図3B:CD34+細胞の増殖倍率。
D34+細胞の増殖倍率。図4C:細胞数で表したCD34+細胞の増殖。「化合物1」は
ポマリドマイドである。
平均(population mean)に対して計算した標準偏差を表す。
は3人のドナーの集団平均に対して計算した。
B)HbA産物。標準偏差は3反復の平均に対して計算した。
design of experiment)。全要因実験計画。
細胞分化への要因の効果を示すキューブプロット(図12A);細胞増殖および分化にお
けるSCF(図12B)およびEpo(図12C)の相互作用プロット。
図13A:細胞増殖および分化への因子の効果を示すキューブプロット;低細胞密度、高
SCF濃度(図13B)または高細胞密度、低SCF濃度(図13C)での細胞増殖およ
び分化におけるSCFおよび細胞密度の相互作用プロット。
)および側方散乱(SSC)を用いて他の未熟な集団(P2およびP3)と区別できる。
本明細書では、増殖した造血細胞(例えば、造血幹細胞および/または造血前駆細胞)
から赤血球を生産する方法を提供する。一実施形態では、造血細胞は、例えば胎盤灌流液
、臍帯血、胎盤血、末梢血、および/または骨髄等の細胞供給源から集められる。上記造
血細胞は、支持細胞を用いることなしに、継続的に増殖および分化される。当該単離、増
殖および分化は中央施設内で行われ、当該中央施設は、使用する場所で増殖および分化が
行えるように輸送するために、増殖された造血細胞を提供する。上記使用する場所とは、
例えば、病院、軍隊の基地、軍隊の前線等である。上記方法で生産された赤血球の採集は
、例えば分化の間に、継続的または定期的に行われる。上記方法において継続的または定
期的に分離できることにより、例えばバッチ法を用いる場合に比べ、実質的により小さな
空間で赤血球の生産を行うことができる。造血細胞の採集および増殖にかかる時間は、お
よそ5〜10日であり、典型的には約7日であった。上記造血細胞の増殖および赤血球へ
の分化にかかる時間は、およそ21〜28日であった。ある実施形態では、赤血球はその
後、その場で精製され、投与可能なユニットに包装される。
せ、上記造血細胞集団中の複数の造血細胞が上記増殖の間に赤血球へと分化すること、お
よび上記培地から上記赤血球を単離することを含み、上記培地は約10〜約10,000
ng/mLの濃度であるSCF、約0.01〜約500ng/mLの濃度であるIL−3
、および約0.1〜約10IU/mLの濃度であるEpoを含み、上記SCF、IL−3
およびEpoは上記培地の定義を与えられていない成分(例えば血清)中には含まれない
ことを特徴とする、赤血球を生産する方法を提供する。特定の実施形態では、ステップ(
c)における上記赤血球の単離は継続的に行われる。他の特定の実施形態では、ステップ
(c)における上記赤血球の単離は、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10
、15、20、25、30、35、40、45、50、55もしくは60分ごとに、また
は1、1.5、2、2.5、3、3・5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7.0
、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5
、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、もしく
は24時間ごと、またはそれ以上で、定期的に行われる。別の特定の実施形態では、ステ
ップ(c)における上記赤血球の単離は、1つ以上の培養条件が満たされたときに、定期
的に行われる。当該培養条件とは、例えば、特定の細胞密度での培養の達成、ある赤血球
マーカー(例えば、CD36またはグリコフォリンA)で表現されるミリリットルあたり
の特定の細胞数の培養の達成、等である。造血細胞の増殖および分化の方法は、後述のセ
クション5.2.2でより詳細に記載される。
本明細書で開示される方法に役立つ造血細胞は、赤血球に分化することができるあらゆ
る造血細胞を含み、例えば、前駆細胞、造血前駆細胞、造血幹細胞等が挙げられる。造血
細胞は、骨髄、臍帯血、胎盤血、末梢血等、またはそれらの組み合わせの組織供給源から
得られる。造血細胞は胎盤からも得ることができる。特定の実施形態では、上記造血細胞
は胎盤灌流液から得られる。胎盤灌流液由来の造血細胞は、胎児の造血細胞と母体の造血
細胞との混合物を含み得る。当該混合物は、例えば母体の造血細胞を造血細胞の総数の5
%よりも多く含んでいる。胎盤灌流液由来の造血細胞は少なくとも約90%、95%、9
8%、99%または99.5%の胎児型細胞を含んでいることが好ましい。
形態では、細胞マーカーCD38を発現または欠失していてもよい。従って、特定の実施
形態では、本明細書で開示される方法に役立つ造血細胞は、CD34+CD38+またはC
D34+CD38-である。さらに特定の実施形態では、上記造血細胞はCD34+CD3
8-Lin-である。別の特定の実施形態では、上記造血細胞は、CD2-、CD3-、CD
11b-、CD11c-、CD14-、CD16-、CD19-、CD24-、CD56-、C
D66b-およびグリコフォリンA-のうちの1つ以上である。別の特定の実施形態では、
上記造血細胞は、CD2-、CD3-、CD11b-、CD11c-、CD14-、CD16-
、CD19-、CD24-、CD56-、CD66b-およびグリコフォリンA-である。別
の特定の実施形態では、上記造血細胞はCD34+およびCD133+;CD34+および
CD133-;CD34+およびCD117+;またはCD34+およびCD117-である
。別のさらに特定の実施形態では、上記造血細胞はCD34+CD38-CD33-CD1
17-である。別のさらに特定の実施形態では、上記造血細胞はCD34+CD38-CD
33-CD117-CD235-CD36-である。
細胞はCD34+CD45-である。別の特定の実施形態では、上記造血細胞はCD34+
CD45+である。
血細胞はCD34+Thy−1+である。別の実施形態では、上記造血細胞はCD133+
である。特定の実施形態では、上記造血細胞はCD34+CD133+またはCD133+
Thy−1+である。別の特定の実施形態では、上記CD34+造血細胞はCXCR4+で
ある。別の特定の実施形態では、上記CD34+造血細胞はCXCR4-である。別の実施
形態では、上記造血細胞はKDR(血管増殖因子受容体2)に対して陽性である。特定の
実施形態では、上記造血細胞はCD34+KDR+、CD133+KDR+またはThy−1
+KDR+である。ある他の実施形態では、上記造血細胞はアルデヒド脱水素酵素に対して
陽性(ALDH+)であり、例えばCD34+ALDH+である。
の自由さ(developmental naivete)を欠く。例えば、別の実施形態では、上記造血細胞
はHLA−DR-である。特定の実施形態では、上記造血細胞はCD34+HLA−DR-
、CD133+HLA−DR-、Thy−1+HLA−DR-またはALDH+HLA−DR-
である。別の実施形態では、上記造血細胞は細胞系統マーカーCD2、CD3、CD11
b、CD11c、CD14、CD16、CD24、CD56、CD66bおよびグリコフ
ォリンAのうちの1つ以上、好ましくは全て、に対して陰性である。
は少なくともいくつかの系列分化が起こることを示す細胞系統マーカーが存在しないこと
に基づいて、本明細書で開示される方法に使用するために選択されてもよい。特定のマー
カーの存在または非存在に基づいて細胞を単離する方法は、例えば、後述するセクション
5.1.2で詳細に述べる。
織供給源由来の造血細胞を少なくとも約95%、少なくとも約98%、もしくは少なくと
も約99%含む集団、または同一の造血細胞関連細胞マーカーを示す造血細胞を含む集団
であってもよい。例えば、種々の実施形態では、上記造血細胞は、骨髄、臍帯血、胎盤血
、末梢血、または胎盤(例えば胎盤灌流液)に由来する造血細胞を、少なくとも約95%
、98%、99%含んでいてもよい。
)、もしくは複数の個体から得たものであってもよく、または、例えば、プールされたも
のであってもよい。上記造血細胞を複数の個体から得てプールした場合、上記造血細胞は
同じ組織供給源から得ることが好ましい。従って、種々の実施形態では、上記プールされ
た造血細胞は、全て胎盤由来(例えば胎盤灌流液由来)、全て胎盤血由来、全て臍帯血由
来、全て末梢血由来等である。
細胞を含んでいてもよい。好ましくは、2つ以上の組織供給源由来の造血細胞を本明細書
の方法で用いるために組み合わせる場合、赤血球を生産するために用いられる上記造血細
胞の複数は、胎盤(例えば胎盤灌流液)由来の造血細胞を含む。種々の実施形態では、赤
血球を生産するために用いられる上記造血細胞は、胎盤由来および臍帯血由来;胎盤由来
および末梢血由来;胎盤由来および胎盤血由来、または胎盤由来および骨髄由来の造血細
胞を含む。好ましい実施形態では、上記造血細胞は、臍帯血由来の造血細胞と組み合わせ
られた胎盤灌流液由来の造血細胞を含み、上記臍帯血および胎盤は同一の個人由来である
。すなわち、上記灌流液および臍帯血は相性がよい。上記造血細胞が2つの組織供給源由
来の造血細胞を含む実施形態では、上記供給源由来の造血細胞は例えば、1:10、2:
9、3:8、4:7、5:6、6:5、7:4、8:3、9:2、1:10、1:9、1
:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4
:1、5:1、6:1、7:1、8:1または9:1の割合で組み合わせてもよい。
液型に関して同一である。例えば当該赤血球は、細胞表面マーカーまたは抗原等に関して
同一である。当該同質性は、例えば、所望の血液型を有する単一の個体から造血細胞を得
ることによって達成できる。造血細胞が複数の個体からプールされる実施形態では、それ
ぞれの個体が少なくとも1つ、少なくとも2つ、もしくは少なくとも3つ、またはそれ以
上の抗原血液決定基を共有することが好ましい。種々の実施形態では、例えば、上記造血
細胞を得た個体、または上記造血細胞を得た複数の個体のそれぞれは、O型、A型、B型
、またはAB型の血液型である。他の実施形態では、上記造血細胞を得た個体、または上
記造血細胞を得た複数の個体のそれぞれは、Rh陽性またはRh陰性である。特定の実施
形態では、上記造血細胞を得た個体、または上記造血細胞を得た複数の個体のそれぞれは
、O陽性かつRh陰性である。さらに特定の実施形態では、上記造血細胞を得た個体、ま
たは上記造血細胞を得た複数の個体のそれぞれは、O陽性、O陰性、A陽性、A陰性、B
陽性、B陰性、AB陽性、またはAB陰性である。他の特定の実施形態では、上記造血細
胞を得た個体、または上記造血細胞を得た複数の個体のそれぞれは、M型、N型、S型、
またはs型の血液型である。他の特定の実施形態では、上記造血細胞を得た個体、または
上記造血細胞を得た複数の個体のそれぞれは、P1型の血液型である。他の特定の実施形
態では、上記造血細胞を得た個体、または上記造血細胞を得た複数の個体のそれぞれは、
Lua型、Lub型、またはLu(a)型の血液型である。他の特定の実施形態では、上
記造血細胞を得た個体、または上記造血細胞を得た複数の個体のそれぞれは、K(Kel
l)型、k(cellano)型、Kpa型、Kpb型、K(a+)型、Kp(a−b−
)型またはK−k−Kp(a−b−)型の血液型である。他の特定の実施形態では、上記
造血細胞を得た個体、または上記造血細胞を得た複数の個体のそれぞれは、Le(a−b
−)型、Le(a+b−)型またはLe(a−b+)型の血液型である。他の特定の実施
形態では、上記造血細胞を得た個体、または上記造血細胞を得た複数の個体のそれぞれは
、Fy a型、Fy b型またはFy(a−b−)型の血液型である。他の特定の実施形
態では、上記造血細胞を得た個体、または上記造血細胞を得た複数の個体のそれぞれは、
Jk(a−b−)型、Jk(a+b−)型、Jk(a−b+)型またはJk(a+b+)
型の血液型である。他の特定の実施形態では、上記造血細胞を得た個体は、Diego、
Cartwright、Xgm Scianna、Bombrock、Colton、L
ansteiner−Weiner、Chido/Rogers、Hh、Kx、Gerg
ich、Cromer、Knops、Indian、Ok、Raph、またはJMHの血
液型に分類することができる。他の特定の実施形態では、上記造血細胞を得た複数の個体
のそれぞれは、血液分類系または抗原決定基のグループが同一の血液型であり、上記血液
分類系または抗原決定基のグループは、Diego、Cartwright、Xgm S
cianna、Bombrock、Colton、Lansteiner−Weiner
、Chido/Rogers、Hh、Kx、Gergich、Cromer、Knops
、Indian、Ok、Raph、またはJMHである。
ある実施形態では、本明細書で提供される方法に用いられる造血細胞は、胎盤造血細胞
である。本明細書で用いられる場合、「胎盤造血細胞」は胎盤血または臍帯血ではなく、
胎盤そのものから得られた造血細胞を意味する。一実施形態では、胎盤造血細胞はCD3
4+である。特定の実施形態では、上記胎盤造血細胞は、大部分(例えば、少なくとも約
50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%ま
たは98%)がCD34+CD38-細胞である。別の特定の実施形態では、上記胎盤造血
細胞は、大部分(例えば、少なくとも約50%、55%、60%、65%、70%、75
%、80%、85%、90%、95%または98%)がCD34+CD38+細胞である。
胎盤造血細胞は、当業者に公知のあらゆる方法、例えば灌流によって、分娩後の哺乳類(
例えばヒト)の胎盤から得られるものであってもよい。
胎盤造血細胞はCD34+CD45-である。他の特定の実施形態では、上記胎盤造血細胞
はCD34+CD45+である。
胎盤造血細胞は灌流を利用して得てもよい。胎盤造血細胞を含む細胞を得るために哺乳
類の胎盤を灌流する方法は、米国特許第7,045,148号(タイトル「Method
of Collecting placental Stem Cells」)、米国
特許第7,255,879号(タイトル「Post−Partum Mammalian
Placenta, Its Use and Placental Stem Ce
lls Therefrom」)、および米国特許出願第2007/0190042号(
タイトル「Improved Medium for Collecting Plac
ental Stem Cells and Preserving Organs」)
に開示されており、開示の内容は全て参照によって本明細書中に引用されるものとする。
)、培地または器官保存溶液を灌流溶液として用いて、例えば胎盤脈管構造(placental
vasculature)を介して灌流によって集めてもよい。一実施形態では、哺乳類の胎盤は、
臍帯動脈および臍帯静脈の両方またはどちらかに灌流溶液を通過させることで灌流される
。胎盤を通る灌流溶液の流れは、例えば重力による胎盤への流れを利用して達成される。
好ましくは、灌流溶液は、ポンプ(例えば蠕動ポンプ)を用いて胎盤へと流される。臍帯
静脈は、例えばカニューレ(例えばTEFLON(登録商標)またはプラスチック製のカ
ニューレ)が挿入されていてもよい。当該カニューレは、例えば滅菌された管等の滅菌さ
れた接続装置と接続されており、もう一方の端部は灌流連結管(perfusion manifold)と
接続されている。
位置するように配向される(例えば吊るされる)ことが好ましい。胎盤は胎盤脈管構造お
よび周囲の組織に灌流液を通過させることによって灌流されてもよい。また、胎盤は、臍
帯静脈および複数の臍帯動脈に灌流液を通過させること、または臍帯動脈および複数の臍
帯静脈に灌流液を通過させることによって灌流されてもよい。
灌流溶液の貯蔵部と接続されたピペットに同時に接続されている。灌流溶液は臍帯動脈お
よび臍帯静脈を通過する。灌流溶液は、血管の壁から胎盤の周囲の組織へと滲出および/
または通過して、妊娠期間中に母体の子宮と接着している胎盤表面から、適切な開放され
た容器(例えば滅菌された皿)の中に集められる。灌流溶液は、臍帯の開口部を介して導
入されてもよく、母体の子宮の壁と連結している胎盤の壁中の開口部から流出または浸透
させることができる。「パン」法と呼ばれる上記方法によって集められた胎盤細胞は、一
般的に胎児の細胞と母体の細胞との混合物である。
および複数の臍帯静脈中を通過する。「閉鎖循環」法と呼ばれる上記方法によって集めら
れた胎盤細胞は、一般的にほぼ全て胎児由来のものである。
産後約48時間以内に得られる。臍帯はクランプし、クランプの上部で切断する。臍帯は
廃棄してもよく、または、例えば臍帯幹細胞を得るため、および/もしくは生体適合材料
の生産のために臍帯膜を加工するために処理してもよい。羊膜は灌流の間保持されていて
もよく、または、例えば指による鈍的切開(blunt dissection)によって絨毛膜から分離
してもよい。灌流前に羊膜が絨毛膜から分離される場合、羊膜は、例えば廃棄されてもよ
く、または例えば酵素の消化作用によって幹細胞を得るため、もしくは例えば羊膜生体適
合材料を生産するために処理されてもよい。例えば上記生体適合材料は米国特許出願公報
第2004/0048796号に開示されており、開示の内容は全て参照によって本明細
書中に引用されるものとする。
取り除いた後、例えば臍帯の断面を露出させるために臍帯膜を部分的に切ることで、臍帯
の管を露出させる。例えば閉じたわに口クランプを管の切断した一端から挿入することで
、管は確認され、開かれる。その後、装置(例えば、灌流装置または蠕動ポンプに接続さ
れたプラスチック製の管)がそれぞれの胎盤動脈に挿入される。ポンプは目的に適してい
ればいずれのポンプであってもよく、例えば蠕動ポンプが挙げられる。その後、滅菌され
た採集貯蔵器(例えば、250mL採集バッグ等の血液バッグ)に接続された管が胎盤静
脈に挿入される。または、ポンプに接続された管が胎盤静脈に挿入され、貯蔵器に接続さ
れた管が胎盤動脈のうちの一つもしくは両方に挿入される。その後、胎盤には、一定量の
灌流溶液(例えば、約750mLの灌流溶液)が灌流される。その後、灌流液中の細胞は
、例えば遠心分離によって採集される。
が胎盤に入り込んだ4〜5cm(センチメートル)の部位の中でクランプされる。
または胎盤血の残った赤血球で染まる。灌流が進行し、残りの臍帯血の赤血球が胎盤から
取り除かれるにつれて、灌流液はより無色に近くなる。一般的に30から100ml(ミ
リリットル)の灌流液が、最初に胎盤から全採血を行うために適切であるが、観察結果に
よって用いられる灌流液の量が多くなったり少なくなったりしてもよい。
盤のサイズ、一つの胎盤から作られるコレクションの数に応じて変化してもよい。種々の
実施形態で灌流液の体積は、50mL〜5000mL、50mL〜4000mL、50m
L〜3000mL、100mL〜2000mL、250mL〜2000mL、500mL
〜2000mL、750mL〜2000mL、であってもよい。一般的に、全採血後に7
00mL〜800mLの灌流液で胎盤に灌流を行う。
もよい。胎盤に複数回の灌流を行う場合、胎盤は、コンテナまたは他の適切な容器中に無
菌状態で維持または培養されてもよい。上記胎盤は、幹細胞集合組成物(stem ce
ll colleciton composition)(米国特許出願公報第2007
/0190042号参照。開示の内容は全て参照によって本明細書中に引用されるものと
する。)、または標準灌流溶液(例えば、リン酸緩衝塩(PBS)等の通常の塩溶液)を
用いて灌流される。上記標準灌流溶液は、抗凝血薬(例えばヘパリン、ワルファリンナト
リウム、クマリン、ビスヒドロキシクマリン)および/または抗真菌薬(例えばβ−メル
カプトエタノール(0.1mM);ストレプトマイシン(例えば40〜100μg/ml
)、ペニシリン(例えば40U/ml)、アンフォテリシンB(例えば0.5μg/ml
))とともに用いてもよいし、ともに用いなくてもよい。一実施形態では、単離された胎
盤は灌流液を採集せずに、ある期間維持または培養される。上記胎盤は、例えば灌流およ
び灌流液の採集の前に、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13
、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、もしくは24時間、
または、2、3日、もしくはそれ以上の期間、維持または培養される。灌流された胎盤は
、さらに追加で1回以上維持されてもよく、時間は例えば1、2、3、4、5、6、7、
8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、
22、23、24、またはそれ以上の時間であり、二回目は例えば700〜800mLの
灌流液を用いて灌流される。胎盤は、1、2、3、4、5、またはそれ以上の回数で灌流
されてもよく、例えば1、2、3、4、5または6時間ごとに1回灌流されてもよい。好
ましい実施形態では、胎盤の灌流、および、灌流溶液(例えば幹細胞集合組成物)の採集
は、回収される有核細胞の数が100細胞/ml以下に低下するまで繰り返される。異な
る時点での灌流液は、さらに、時間に依存する細胞集団(例えば胎盤造血細胞集団)を回
収するために、個別に処理される。また、異なる時点での灌流液はプールされてもよい。
造血細胞は、1つ以上のプロテアーゼまたは他の組織破壊酵素(例えばトリプシン、コ
ラゲナーゼ、パパイン、キモトリプシン、サブチリシン、ヒアルロニダーゼ;カテプシン
、カスパーゼ、カルパイン、キモシン、プラズメプシン、またはペプシン等)を含む溶液
を灌流することによって胎盤から単離されてもよい。特定の実施形態では、胎盤または胎
盤の一部(羊膜の膜、羊膜および絨毛膜、胎盤小葉または胎盤葉、臍帯、または上記のあ
らゆる組み合わせ)を25℃〜37℃の状態にし、1つ以上の組織破壊酵素とともに20
0mLの培地中で30分間培養する。灌流液由来の細胞を採集し、4℃の状態にし、5m
MのEDTA、2mMのジチオスレイトールおよび2mMのベータ−メルカプトエタノー
ルを含む冷たい阻害因子混合物で洗浄する。幹細胞は数分後、冷たい(例えば4℃)幹細
胞採集組成物で洗浄する。
る、さいの目に切る、または切り刻む等の方法によって)破壊されてもよい。胎盤は、全
体を用いてもよいし、または、物理的破壊および/もしくは酵素による消化、並びに造血
細胞の回収の前に構成要素に解剖してもよい。例えば、造血細胞は、羊膜の膜、絨毛膜、
臍帯、胎盤葉、または上記のあらゆる組み合わせから得てもよい。
、サブチリシン、ヒアルロニダーゼ;カテプシン、カスパーゼ、カルパイン、キモシン、
プラスメプシン、またはペプシン等の組織破壊酵素を用いて胎盤を破壊することによって
得てもよい。酵素による消化では、好ましくは酵素の組み合わせ、例えばマトリックスメ
タロプロテアーゼと中性プロテアーゼとの組み合わせ、例えばコラゲナーゼとディスパー
ゼとの組み合わせ、を用いる。一実施形態では、酵素による胎盤組織の消化には、ヒアル
ロン酸を消化するためにマトリックスメタロプロテアーゼ、中性プロテアーゼおよびムコ
多糖類加水分解酵素(mucolytic enzyme)の組み合わせを用いる。上記
組み合わせは、例えばコラゲナーゼ、ディスパーゼおよびヒアルロニダーゼの組み合わせ
、または、LIBERASE(Boehringer Mannheim Corp.,
Indianapolis, Ind.)およびヒアルロニダーゼの組み合わせである
。胎盤組織を破壊するために用いることができる他の酵素には、パパイン、デオキシリボ
ヌクレアーゼ、セリンプロテアーゼ(トリプシン、キモトリプシンまたはエラスターゼ)
が挙げられる。セリンプロテアーゼは、血清中のアルファ2ミクログロブリンによって阻
害され得るので、消化に用いる培地には通常、血清は含まれない。EDTAおよびDNa
seは、細胞回収効率を上げるため、酵素消化処理に一般的に用いられる。粘性のある消
化物中に幹細胞が捉えられることを避けるために、消化物は希釈されることが好ましい。
ては、例えばコラゲナーゼIおよびコラゲナーゼIVは50〜200U/mL、ディスパ
ーゼは1〜10U/mL、並びにエラスターゼは10〜100U/mLが含まれる。プロ
テアーゼは組み合わせて、すなわち2つ以上のプロテアーゼを同一の消化反応で用いても
よいし、または胎盤幹細胞を遊離するために連続して用いてもよい。例えば、一実施形態
では、胎盤または胎盤の一部を、まず約2mg/mlのコラゲナーゼIを用いて30分間
消化し、次に0.25%のトリプシンを用いて37℃で10分間消化を行う。セリンプロ
テアーゼは、好ましくは他の酵素の使用後に連続して用いる。
,N,N’,N’−四酢酸(EGTA)またはエチレンジアミン四酢酸を、幹細胞を含む
幹細胞採集組成物、または、胎盤造血細胞の単離前に組織を破壊および/もしくは消化し
た溶液に加えることで、組織をさらに破壊してもよい。
の一部が絨毛膜または胎盤葉を含む場合)、採集された胎盤造血細胞は、胎児および母体
の両方の供給源に由来する胎盤幹細胞の混合物であることが好ましい。胎盤の一部が母体
の細胞(例えば羊膜)を全く含んでいない、またはごくわずかな数しか含んでいない場合
、採集された胎盤幹細胞は、ほぼ胎児由来の胎盤幹細胞のみを含んでいる。
あらゆる供給源(例えば哺乳類の胎盤)に由来する造血細胞を含む細胞は、初めに、例
えばフィコール密度勾配遠心分離法、ヘタスターチ処理または塩化アンモニウム処理によ
って他の細胞から精製(すなわち、単離)されていてもよい。遠心分離機、例えばフィコ
ール遠心分離機(例えばGE Healthcare製、Cat.No.17−1440
−03)は、遠心分離速度等について、いかなる標準プロトコルに従ってもよい。一実施
形態では、例えば、胎盤から採集された細胞は、室温で15分、150 x gで遠心分
離を行うことで灌流液から回収される。当該遠心分離は、例えば混入している残骸および
血小板から細胞を分離する。別の実施形態では、胎盤灌流液は約200mlに濃縮され、
緩やかにフィコール上に層を形成する。そして約22℃で20分間、約1100 × g
で遠心分離され、低密度の細胞の中間層が更なる工程のために採集される。
Cell Technologies製、カタログ No.07906)処理は、1部
(1 part)のヘタスターチ溶液を5部(5 parts)の、例えば適切なサイズのチューブ中
のヒト胎盤灌流液(HPP:human placental perfusate)ま
たは臍帯血に加えることで行ってもよい。十分に混合した後、サンプルを、血漿/RBC
の界面が総量のおよそ50%になるまで安定させる。任意で、当該ステップのためにチュ
ーブを37℃のインキュベーター中に設置して沈降速度を増加させる。明確な界面が、R
BC画分とRBCが消耗された(有核細胞が豊富な)画分との間に、ヘタスターチ溶液を
介してRBC沈殿物として形成される。その後、白血球が豊富な層を回収し、50mLの
チューブ中に入れる。当該画分は、例えば少なくとも4倍の体積の適切な培地によって、
一度洗浄される。血小板を除去するために、例えば室温(15〜25℃)で10分間、1
20 × gでブレーキなしで遠心分離することによって、ゆっくりしたスピンを行う。
ある他の実施形態では、塩化アンモニウム(例えばStem Cell Technol
ogies製、カタログ No.07850)処理を、例えば緩衝化した塩化アンモニウ
ム溶液をHPPまたは臍帯血に、例えば体積の割合が4:1になるように加えることで行
ってもよい。細胞懸濁液をボルテックスにかけ、赤血球を溶解させるために10分間氷上
に置く。細胞は、使用する前に任意で、適切な培地で二度洗浄される。
/mlのヘパリンおよび2mMのEDTA(GibcoBRL、NY)を含むIMDM無
血清培地)の中で再び懸濁してもよい。全ての単核細胞画分を、例えばLYMPHOPR
EP(登録商標)(Nycomed Pharma、Oslo、Norway)を用いて
、製造者の推奨する処理に従って、単離してもよい。
胞を「単離する」とは、単離された細胞が実際の組織(例えば哺乳類の胎盤)の中で通常
結合している細胞の少なくとも約20%、30%、40%、50%、60%、70%、8
0%、90%、95%または99%を除去することを意味する。細胞が、幹細胞が実際の
器官中で通常結合している細胞の50%よりも少ない数を含む細胞集団中に存在する場合
、組織由来の細胞が「単離された」といえる。
フローサイトメトリー、セルソーティング、免疫細胞化学的方法(例えば組織特異的また
は細胞マーカー特異的な抗体を用いた染色)、蛍光活性化セルソーティング(FACS:
fluorescence activated cell sorting)、磁気活
性化細胞選別(MACS:magnetic activated cell sort
ing)等の標準的な細胞検出技術を用いた細胞表面マーカーの測定、光学顕微鏡もしく
は共焦点顕微鏡を用いた細胞の形態の検査、並びに/または、例えばPCRおよび遺伝子
発現プロファイル等の当業者によく知られた技術を用いた遺伝子発現の変化の測定によっ
て、観察することができる。これらの技術は、1つ以上の特定のマーカーに対して陽性で
ある細胞を特定するためにも、用いることができる。例えば、CD34を用いれば、上述
の技術を用いて、ELISA、もしくはRIA等のアッセイで、またはFACSによって
、細胞がCD34を検出可能の量で含んでいるかどうか測定することができ、検出可能で
あればCD34+であると判断できる。同様に、細胞が、例えばOCT−4をコードする
RNAを、RT−PCRによって検出するために十分な量で含んでいれば、当該細胞はO
CT−4+である。細胞表面マーカー(例えばCD34等のCDマーカー)に対する抗体
、および、OCT−4等の幹細胞に特異的な配列は、当業者にとって周知である。
差次接着法(differential adherence)、またはそれらの組み合わせによって単離される
細胞は、蛍光活性化セルソーティング(FACS:fluorescence acti
vated cell sorting)を用いて選別することができる。FACSは、
細胞を含む粒子を、当該粒子の蛍光特性に基づいて分離する、周知の方法である(Kam
arch,1987, Methods Enzymol, 151:150−165)
。個々の粒子の蛍光成分をレーザー励起することで、小さな電荷が生み出され、混合物か
ら正の粒子および負の粒子を電磁分離することができる。一実施形態では、細胞表面マー
カーに特異的な抗体またはリガンドは、識別できる蛍光ラベルによって標識されている。
細胞を細胞選別器によって処理することで、使用した抗体と結合する能力に基づいて、細
胞の分離を行うことができる。FACSによって選別した粒子は、分離およびクローニン
グを促進するために、96ウェルプレートまたは384ウェルプレートの個々のウェルに
直接配置されてもよい。
D73、CD105、CD117、CD200、OCT−4および/またはHLA−Gの
うち、一つ以上のマーカーの発現に基づいて、選別され、例えば、単離される。
る造血細胞は、未分化の造血細胞のマーカー特性に基づいて、選別され、例えば、単離さ
れる。当該選別工程は、例えば、選別されていない細胞集団であって、例えば、灌流液ま
たは組織消化物に由来する細胞集団であって、CD34+細胞が集団に存在する細胞の中
で少数である細胞集団に対して、行われてもよい。また、上記選別工程は、大半(例えば
、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%または99%を超える数)
が造血細胞である細胞集団に対して、例えば精製工程において行われてもよい。例えば、
特定の実施形態では、CD34+細胞、KDR+細胞、Thy−1+細胞、および/または
CD133+細胞は、未分化造血細胞集団を生産するために、選抜工程の間、維持される
。
別され、例えば排除される。例えば、CD2+、CD3+、CD11b+、CD14+、CD
16+、CD19+、CD24+、CD56+、CD66b+および/またはグリコフォリン
A+である、造血細胞集団中の細胞は、未分化造血細胞集団を生産するために、造血細胞
集団から選別する工程の間、排除される。
選別され、例えば単離される。特定の実施形態では、造血細胞(例えばCD34+細胞)
は、例えば、細胞がCD2-、CD3-、CD11b-、CD11c-、CD14-、CD1
6-、CD19-、CD24-、CD56-、CD66b-および/またはグリコフォリンA-
のうちの1つ以上であるという判定に基づいて、単離されてもよい。
rogen))を、細胞を分離するために用いてもよい。上記細胞が磁気ビーズ(直径0
.5〜100μm)と結合する能力に基づいて、粒子を選別する方法である、磁気活性化
細胞選別(MACS)技術を用いて選別してもよい。磁気ミクロスフェアにおいて、種々
の有用な修正が行われてもよく、上記修正には、特定の細胞表面分子またはハプテンを特
異的に認識する抗体の共有結合付加が含まれる。上記ビーズはその後、結合のために細胞
と混合される。その後、細胞は磁場を通過し、特定の細胞マーカーを有する細胞が分離さ
れる。一実施形態では、その後、上記細胞を単離し、さらなる細胞表面マーカーに対する
抗体と結合している磁気ビーズと再度混合してもよい。上記細胞は、再度、磁場を通過し
、両方の抗体と結合している細胞が単離される。上記細胞を、その後、クローン単離のた
めのマイクロタイター皿等の分離皿に希釈してもよい。
ニー形成ユニットアッセイによって識別および特定してもよい。コロニー形成ユニットア
ッセイは当業者に一般的に知られており、MECENCULTTM培地(Stem Cel
l Technologies, Inc., Vancouver British
Columbia)等が挙げられる。
について評価してもよい。上記技術には、トリパンブルー排除アッセイ、フルオレセイン
二酢酸取り込みアッセイ、ヨウ化プロビジウム取り込みアッセイ(生存率を評価する);
およびチミヂン取り込みアッセイ、MTT細胞増殖アッセイ(増殖を評価する)等が挙げ
られる。寿命は、増殖した培養物における集団倍加(population doubling)の最大数を
測定すること等の、当業者によく知られた方法によって測定してもよい。
。上記技術には、例えば、所望の細胞の選択的増殖(正の選択)、不要な細胞の選択的破
壊(負の選択);例えば、大豆凝集素を用いた、混合集団において区別できる細胞凝集能
に基づく分離;凍結融解処理;ろ過;従来のゾーン遠心分離;遠心溶出法(逆流遠心分離
);単位重力分離;向流分配;電気泳動等が挙げられる。
一度、造血細胞集団を得られれば、集団を増殖させることができる。赤血球の一つのユ
ニットは、約1〜2×1012個の赤血球を含むとされる。造血幹細胞の集団倍加には、お
よそ36時間が必要である。従って、標準の方法に従って、約5×107個の造血細胞か
ら開始し、増殖および分化における効率が100%であると仮定すると、赤血球のユニッ
トの生産には、およそ14回の造血細胞の集団倍加、すなわち、およそ3週間が必要であ
る。以下で詳細に説明する方法は、造血細胞の培養条件を改善し、増殖の間の、単位時間
あたりの造血細胞の数を増加させることで、標準の方法を改善するものである。
造血細胞を含む細胞は、細胞周期調節機構を備えており、当該機構は、細胞分裂の速度
を調節するサイクリンおよびサイクリン依存性キナーゼ(CDK)を含んでいる。細胞で
は、細胞周期の進行を監視および制御するために、細胞周期チェックポイントが用いられ
ている。細胞が、ある段階での要件を満たさなければ、当該要件を満たされるまでは次の
段階に進行することができない。細胞が、細胞周期の異なる段階に進行する条件に関連す
る過程(チェックポイント制御)は比較的ゆっくりであり、最適なin vitro培養
条件下でさえ哺乳類の細胞で観察される、比較的穏やかな細胞分裂速度の一因となってい
る。
造血細胞が用いられる。特定の実施形態では、上記造血細胞は、細胞周期活性化因子を通
常より高いレベルで発現するように、または、細胞周期阻害因子を通常より低いレベルで
発現するように改変されており、上記設計された細胞は、改変されていない造血細胞に比
べて、検出可能な程度に短い倍加時間を有する。さらに特定の実施形態では、上記造血細
胞は、細胞周期活性化因子であるサイクリンT2(CCNT2)、サイクリンT2B(C
CNT2B)、CDC7L1、CCN1、サイクリンG(CCNG2)、サイクリンH(
CCNH)、CDKN2C、CDKN2D、CDK4、サイクリンD1、サイクリンA、
サイクリンB、Hes1、Hox遺伝子および/またはFoxOのうち1つ以上を通常よ
り高いレベルで発現するように改変されている。
び/またはTReP−132を通常より低いレベルで発現する。CDK阻害因子の発現の
低減は、当業者に知られたあらゆる方法によって達成できる。上記方法には、例えば、低
分子阻害剤、p21、p27および/またはTReP−132のDNAを標的とするアン
チセンスオリゴヌクレオチド、mRNA前駆体またはmRNA配列、RNAi等の使用が
挙げられる。
、複製することができないので、治療上安全であると考えられる。
で発現するように改変されており、上記設計された細胞は、改変されていない造血細胞に
比べて、検出可能な程度に短い倍加時間、または検出可能な程度に増加した増殖速度を有
し、上記細胞周期活性化因子の発現の増加は誘導可能である。上記改変された造血細胞を
構築するために、当業者に知られたあらゆる誘導性プロモーターを用いることができ、上
記誘導性プロモーターには、CMVプロモーターの制御下で安定的に発現する、リバース
テトラサイクリン制御性トランス活性化因子(rtTA)を用いたテトラサイクリン誘導
遺伝子発現系(例えばREVTET−ON(登録商標)System、Clontech
Laboratories, Palo Alto, Calif.);米国特許出願
公報第2007/0166366号「Autologous Upregulation
Mechanism Allowing Optimized Cell Type−
Specific and Regulated Gene Expression C
ells」;および米国特許出願公報第2007/0122880号「Vector f
or the Inducible Expression of Gene Sequ
ences」が挙げられ、それぞれの開示の内容は全て参照によって本明細書中に引用さ
れるものとする。
標準的方法を用いた相同組み換え、または非相同組み換えによって、造血細胞中で阻害し
てもよい。細胞周期阻害因子または負の細胞周期制御因子の発現の阻害は、例えばp21
、p27および/またはTReP−132に対するアンチセンス分子を用いて、行っても
よい。
tch 1 ligand)を発現するように改変する。上記ノッチ1リガンドの発現によって、上記
造血細胞の老化が、改変されていない造血細胞に比べて、検出可能な程度に低減される。
Berstein et al.,米国特許出願第2004/0067583「Meth
ods for Immortalizing Cells」を参照されたい。開示の内
容は全て参照によって本明細書中に引用されるものとする。
する。例えば、上記培地は、一つ以上の酸化防止剤を含む。
産され、単離された赤血球の最終的な集団から、あらゆる改変された造血細胞、または前
赤血球前駆体を排除する工程を含む。上記分離は、本明細書にあらゆる箇所に開示される
ように、赤血球に十分に分化していない造血細胞を特徴づける、一つ以上のマーカーに基
づいて、達成することができる。上記排除工程は、赤血球特異的マーカー(例えばCD3
6および/またはグリコフォリンA)に基づいて赤血球を選択する単離工程に続いて行わ
れる。
ある実施形態では、本明細書で提供される方法に用いられる造血細胞(例えば幹細胞、
または前駆細胞)は、支持細胞を用いない培地で増殖および分化する。本明細書で提供さ
れる造血細胞の培養によって、造血細胞の継続的な増殖、および上記細胞からの赤血球の
分化がもたらされる。
あらゆる容器中で行うことができ、当該容器には、例えば、フラスコ、試験管、ビーカー
、シャーレ、複数のウェルを有するプレート、バッグ等が挙げられる。特定の実施形態で
は、支持細胞に依存しない造血細胞の増殖は、バッグ(例えば、柔軟性を有するガス透過
性のフルオロカーボン培養バッグ(例えば、American Fluoroseal製
))中で行われる。特定の実施形態では、上記造血細胞が増殖する容器は、例えば病院ま
たは戦地等の場所への輸送に好適であり、上記増殖した造血細胞は、例えば後述するバイ
オリアクターを用いることで、さらに増殖および分化する。
ポエチン(Epo)、およびインターロイキン−3(IL−3)を含む培地において、継
続的な方法で増殖および分化する。
分化させる工程であって、当該増殖させる工程の間に、上記造血細胞集団中の複数の造血
細胞が赤血球へ分化する工程と、上記培地から上記赤血球を単離する工程と、を含む、赤
血球を生産する方法であって、上記培地は、約10〜約10,000ng/mLの濃度で
あるSCF、約0.01〜約500ng/mLの濃度であるIL−3、および、約0.1
〜約10IU/mLの濃度であるEpoを含み、上記SCF、IL−3およびEpoは、
上記培地の定義されていない成分(例えば、血清)の中には含まれていないことを特徴と
する、赤血球を生産する方法が、本明細書で提供される。上記方法の特定の実施形態では
、上記培地は、Flt−3L、IL−11、トロンボポエチン(Tpo)、ホメオボック
ス−B4(HoxB4)またはメチルセルロースのうち、1つ以上、またはいずれも含ま
ない。他の特定の実施形態では、上記培地は、約20〜約2000ng/mL;約50〜
約1000ng/mL;または約100ng/mLの濃度でSCFを含む。他の特定の実
施形態では、上記培地は、約0.1〜約100ng/mL;約1〜約50ng/mL;ま
たは約5ng/mLの濃度でIL−3を含む。他の特定の実施形態では、上記培地は、約
1〜約5IU/mL;または約2〜約3IU/mLの濃度でEpoを含む。
増殖を促進し、上記細胞は5×105個/mL以下、2.75×104個/mL以下、また
は5×104個/mL以下で播種され、Epoは5IU/mL以下、3IU/mL以下、
または1IU/mL以下で存在し(例えば、培地に含まれる)、SCFは1ng/mL以
上、50ng/mL以上、または100ng/mL以上で存在する(例えば、培地に含ま
れる)。特定の実施形態では、上記細胞は5×104個/mL以下で播種され、上記培地
は、1IU/mL以下のEpoおよび100ng/mL以上のSCFを含む。
濃度であるインスリン様増殖因子1(IGF−1)、および、約1〜約1000μg/m
Lの濃度である脂質を含み、上記脂質はたんぱく質とコレステロールとの混合物(例えば
、Lipids Cholesterol Rich from adult bovi
ne serum;Cat.No.C7305−1G, Sigma, St Loui
s, MO)を含み;上記培地は、約0.01〜約100μMの濃度であるヒドロコルチ
ゾン、または、約0.01〜約100μMの濃度であるデキサメタゾンを含む。さらに特
定の実施形態では、上記培地は、約10〜約500ng/mL;または約20〜約100
ng/mLの濃度でIGF−1を含む。他のさらに特定の実施形態では、上記培地は、約
10〜約500ng/mL;または約20〜約100ng/mLの濃度で脂質を含む。他
のさらに特定の実施形態では、上記培地は、約0.1〜約50μM;または約0.5〜約
10μMの濃度でヒドロコルチゾンを含む。他のさらに特定の実施形態では、上記培地は
、約0.05〜約20μM;または約0.1〜約10μMの濃度でデキサメタゾンを含む
。
3U/mLのEpo、約40ng/mLのIGF−1、約5ng/mLのIL−3、約1
μMのデキサメタゾン、および40μg/mLの脂質を含み、上記脂質は、たんぱく質と
コレステロールとの混合物を含む。上記方法の別のさらに特定の実施形態では、上記培地
は、約100ng/mLのSCF、約2U/mLのEpo、約40ng/mLのIGF−
1、約5ng/mLのIL−3、約1μMのヒドロコルチゾン、および50ng/mLの
脂質を含み、上記脂質は、たんぱく質とコレステロールとの混合物を含む。
脂質;並びに、ヒドロコルチゾンまたはデキサメタゾンのどちらかを含む培地中において
、継続的な方法で増殖および分化し、上記脂質は、たんぱく質とコレステロールとの混合
物(例えば、Lipids Cholesterol Rich from adult
bovine serum;Cat.No.C7305−1G, Sigma, St
Louis, MO)を含む。特定の実施形態では、上記培地は、約10〜約10,0
00ng/mL;約20〜約2000ng/mL;約50〜約1000ng/mL;約1
00ng/mL;または約100ng/mLの濃度であるSCFを含む。他の特定の実施
形態では、上記培地は、約1〜約5IU/mL;または約2〜約3IU/mLの濃度であ
るEpoを含む。他の特定の実施形態では、上記培地は、約1〜約1000ng/mL;
約10〜約500ng/mL;約20〜約100ng/mL;または約40ng/mLの
濃度であるIGF−1を含む。他の特定の実施形態では、上記培地は、約1〜約1000
μg/mL;約10〜約500ng/mL;約20〜約100ng/mL;または約40
ng/mLの濃度である上記脂質を含む。他の特定の実施形態では、上記培地は、約0.
1μM〜約10μM;約0.5μM〜約5μM;または約1μMの濃度であるヒドロコル
チゾンを含む。他の特定の実施形態では、上記培地は、約0.1μM〜約10μM;約0
.5μM〜約5μM;または約1μMの濃度であるデキサメタゾンを含む。
明細書で提供されるあらゆる方法または組成物のある実施形態では、上記培地は、無血清
培地、例えばSTEMSPAN(登録商標)(Cat.No.09650,Stem C
ell Technologies, Vancouver, Canada)であって
もよい。
した状態で、当該細胞を培養することで、増殖する。当該細胞は、免疫調節化合物と接し
ていない同数の造血細胞と比べて、与えられた時間内の造血細胞の増殖が検出可能な程度
で増加するために十分な時間および量で、免疫調節化合物と接する。例えば、米国特許出
願公報第2003/0235909号を参照されたい。当該開示の内容は全て参照によっ
て本明細書中に引用されるものとする。好ましい実施形態では、上記免疫調節化合物は、
3−(4−アミノ−1−オキソ−1,3−ジヒドロイソインドル−2−yl)−ピペリジ
ン−2,6−ジオン;3−(4’アミノイソリンドリン−1’−オン)−1−ピペリジン
−2,6−ジオン;4−(アミノ)−2−(2,6−ジオキソ(3−ピペリジル))−イ
ソインドリン−1,3−ジオン;4−アミノ−2−[(3RS)−2,6−ジオキソピペ
リジン−3−イル]−2H−イソインドール−1,3−ジオン;α−(3−アミノフタル
イミド)グルタルイミド;ポマリドマイド、レナリドマイド、またはサリドマイドである
。別の実施形態では、上記免疫調節化合物は、以下の構造を有し、
であり、R2は水素もしくは低級アルキルである化合物であり、またはそれらの薬学的に
許容可能な塩、水和物、溶媒和物、クラスレート、光学異性体、ジアステレオマー、ラセ
ミ化合物、もしくは立体異性体の混合物である。別の実施形態では、上記免疫調節化合物
は、以下の構造を有し、
R1は、水素、(C1−C8)アルキル、(C3−C7)シクロアルキル、(C2−C8)ア
ルケニル、(C2−C8)アルキニル、ベンジル、アリール、(C0−C4)アルキル−(C
1−C6)ヘテロシクロアルキル、(C0−C4)アルキル−(C2−C5)ヘテロアリール、
C(O)R3、C(S)R3、C(O)OR4、(C1−C8)アルキル−N(R6)2、(C1
−C8)アルキル−OR5、(C1−C8)アルキル−C(O)OR5、C(O)NHR3、C
(S)NHR3、C(O)NR3R3’、C(S)NR3R3’、または(C1−C8)アルキ
ル−O(CO)R5であり、
R2は、H、F、ベンジル、(C1−C8)アルキル、(C2−C8)アルケニル、または
(C2−C8)アルキニルであり、
R3およびR3’は独立して、(C1−C8)アルキル、(C3−C7)シクロアルキル、(
C2−C8)アルケニル、(C2−C8)アルキニル、ベンジル、アリール、(C0−C4)ア
ルキル−(C1−C6)ヘテロシクロアルキル、(C0−C4)アルキル−(C2−C5)ヘテ
ロアリール、(C0−C8)アルキル−N(R6)2、(C1−C8)アルキル−OR5、(C1
−C8)アルキル−C(O)OR5、(C1−C8)アルキル−O(CO)R5、またはC(
O)OR5であり、
R4は、(C1−C8)アルキル、(C2−C8)アルケニル、(C2−C8)アルキニル、
(C1−C4)アルキル−OR5、ベンジル、アリール、(C0−C4)アルキル−(C1−C
6)ヘテロシクロアルキル、または(C0−C4)アルキル−(C2−C5)ヘテロアリール
であり、
R5は、(C1−C8)アルキル、(C2−C8)アルケニル、(C2−C8)アルキニル、
ベンジル、アリール、または(C2−C5)ヘテロアリールであり、
それぞれに存在するR6は独立して、H、(C1−C8)アルキル、(C2−C8)アルケ
ニル、(C2−C8)アルキニル、ベンジル、アリール、(C2−C5)ヘテロアリール、も
しくは(C0−C8)アルキル−C(O)OR5であるか、または、上記R6基はヘテロシク
ロアルキル基を形成していてもよく、
nは0または1であり、
*は不斉炭素中心を表す、化合物、
または、それらの薬学的に許容可能な塩、水和物、溶媒和物、クラスレート、光学異性
体、ジアステレオマー、ラセミ化合物、もしくは立体異性体の混合物である。別の実施形
態では、上記免疫調節化合物は、以下の構造を有し、
Rは、HまたはCH2OCOR’であり、
(i)R1、R2、R3、またはR4のそれぞれは、他とは独立して、ハロ、炭素原子数1
〜4のアルキル、もしくは炭素原子数1〜4のアルコキシであるか、または(ii)R1
、R2、R3、またはR4のうちの一つがニトロ、もしくは−NHR5であり、残りのR1、
R2、R3、またはR4が水素であり、
R5は、水素、または炭素原子数1〜8のアルキルであり、
R6は、水素、炭素原子数1〜8のアルキル、ベンゾ、クロロ、またはフルオロであり
、
R’は、R7−CHR10−N(R8R9)であり、
R7は、m−フェニレンもしくはp−フェニレン、または−(CnH2n)−であって、n
は0〜4の値であり、
R8およびR9のそれぞれは、他方とは独立して、水素、もしくは炭素原子数1〜8のア
ルキルであるか、または、R8およびR9はともに、テトラメチレン、ペンタメチレン、ヘ
キサメチレン、または−CH2CH2X1CH2CH2−であって、X1は−O−、−S−、ま
たは−NH−であり、
R10は、水素、炭素原子数8までのアルキル、またはフェニルであり、
*は不斉炭素中心を表す、化合物、
または、それらの薬学的に許容可能な塩、水和物、溶媒和物、クラスレート、光学異性
体、ジアステレオマー、ラセミ化合物、もしくは立体異性体の混合物である。
スリンおよびトランスフェリン)、SCF、Flt−3リガンド、IL−3、4−(アミ
ノ)−2−(2,6−ジオキソ(3−ピペリジル))−イソインドリン−1,3−ジオン
(0.05%DMSO中で10μM)が追加されたIMDM中で行われる。さらに特定の
実施形態では、約5×107個の造血細胞(例えばCD34+細胞)は、培地中で、約5×
1010個〜約5×1012個に増殖し、増殖された造血細胞集団を生産するために、100
mLのIMDM中に再び懸濁される。増殖された造血細胞集団は、好ましくは輸送を容易
にするために低温保存される。
ば本明細書中のあらゆる箇所で実証されているバイオリアクター)の中で行われる。
70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、または99%は、
赤血球および/または多染赤血球に分化する。
合物(例えば上述したTNF−α阻害化合物)と接した状態で、当該細胞を培養すること
で、達成してもよい。当該細胞は、免疫調節化合物と接していない同数の造血細胞と比べ
て、与えられた時間内の造血細胞の増殖が検出可能な程度で増加するために十分な時間お
よび量で、免疫調節化合物と接する。例えば、米国特許出願公報第2003/02359
09号を参照されたい。当該開示の内容は全て参照によって本明細書中に引用されるもの
とする。
うに、増殖および分化の間に、1ミリリットルあたり約2×104個から約2×105個の
間で細胞が維持されるように上記造血細胞を含む細胞集団を維持する工程を含む。ある他
の実施形態では、上記造血細胞の増殖および分化の方法は、本明細書で記載されるように
、1ミリリットルあたり約1×105個以下の細胞が維持されるように上記造血細胞を含
む細胞集団を維持する工程を含む。
異的マーカーを検出することで、評価することができる。赤血球特異的マーカーは、限定
されるものではないが、CD36およびグリコフォリンAが挙げられる。分化は、顕微鏡
下での細胞の目視検査によって評価してもよい。典型的な両凹面(biconcave)の細胞の
存在によって、赤血球の存在を確認できる。赤血球(網状赤血球を含む)の存在は、Ho
echst 33342、TO−PRO(登録商標)−3、DRAG5等の、デオキシリ
ボ核酸(DNA)の染色によって確認できる。赤血球の有核前駆体は、DNA検出染色で
一般的に陽性であるが、一方、赤血球および網状赤血球は、一般的に陰性である。造血細
胞から赤血球への分化は、分化の間の、トランスフェリン受容体(CD71)の発現、お
よび/または色素レーザースチリル染色の進行的消失によって評価することもできる。例
えば、Bessis M and Mohandas N, “A Diffracto
metric Method for the Measurement of Cel
lular Deformability,” Blood Cells 1:307(
1975);Mohandas N. et al., “Analysis of F
actors Regulating Erythrocyte Deformabil
ity,” J. Clin. Invest. 66:563(1980);Gron
er W et al., “New Optical Technique for
Measuring Erythrocyte Deformability with
the Ektacytometer,” Clin. Chem. 26:1435
(1980)を参照されたい。十分に分化した赤血球は、約80〜約108fL(フェム
トリットル)の平均赤血球容積(MCV)、約17〜約31pgの平均赤血球ヘモグロビ
ン量(MCH)、および約23%〜約36%の平均赤血球ヘモグロビン濃度(MCHC)
を有する。
態では、上記分化時間は、約7日〜約35日である。別の実施形態では、上記分化時間は
、約14日〜約28日である。
上述した方法によって生産された赤血球は、好ましくは、造血細胞から分離され、ある
実施形態では、赤血球の前駆体から分離される。上記分離は、例えば、CD36および/
またはグリコフォリンAに対する抗体を用いることで、達成することができる。分離は、
既知の方法によって達成してもよく、例えば、抗体を介した磁気ビーズ分離、蛍光活性化
セルソーティング、CD36および/またはグリコフォリンAに対する抗体を含む表面ま
たはカラムに対する細胞の通過等が挙げられる。別の実施形態では、赤血球を含む培地か
ら酸素を除去し、続いて脱酸素された赤血球を他の細胞から磁気分離することで、赤血球
の分離を達成する。
続的に分離することができ、または、周期的に分離することができる。ある実施形態では
、例えば、赤血球の単離は、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、
20、25、30、35、40、45、50、55、もしくは60分ごと、または、1、
1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7.0、7.
5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12
、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、もしくは24
時間ごと、またはそれ以上、または例えば、特定の細胞密度での培養の達成;1ミリリッ
トルあたりの特定の細胞数が、ある赤血球マーカー(例えばCD36、もしくはグリコフ
ォリンA)を発現する培養の達成等、1つ以上の培養条件が満たされた場合に、行われる
。細胞集団からの赤血球の分離は、好ましくは、後述するようなバイオリアクターを用い
て行われる。
赤血球の生産方法の別の側面では、造血細胞は、支持細胞の存在しないバイオリアクタ
ー中で増殖および分化する。造血細胞が分化するバイオリアクターは、造血細胞が増殖す
るバイオリアクターと同じであってもよいし、または別のバイオリアクターでもよい。別
の実施形態では、上記バイオリアクターは、造血細胞の増殖を完全にバイオリアクター中
で促進するように構築される。別の実施形態では、上記バイオリアクターは、支持細胞を
用いずに造血細胞の増殖を行えるように構築される。
現し、分化した赤血球をバイオリアクター中の残りの細胞から継続的に分離することを可
能にするように構築される。上記継続的な流れおよび細胞の分離によって、上記バイオリ
アクターを、赤血球を生産するバッチ法を用いるバイオリアクターと比べて、大幅に小さ
い体積で構築することができる。別の実施形態では、上記バイオリアクターは、培地中の
細胞の、周期的な流れ(例えば断続的な流れ)を実現し、分化した赤血球をバイオリアク
ター中の残りの細胞から周期的に分離することを可能にするように構築される。上記周期
的な流れおよび細胞の分離によって、上記バイオリアクターを、赤血球を生産するバッチ
法を用いるバイオリアクターと比べて、大幅に小さい体積で構築することが好ましい。特
定の実施形態では、赤血球の単離は、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10
、15、20、25、30、35、40、45、50、55、もしくは60分ごと、また
は、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7.
0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.
5、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、もし
くは24時間ごと、またはそれ以上で行われる。別の特定の実施形態では、例えば、特定
の細胞密度での培養の達成;1ミリリットルあたりの特定の細胞数が、ある赤血球マーカ
ー(例えばCD36、もしくはグリコフォリンA)を発現する培養の達成等、1つ以上の
培養条件が満たされた場合に、赤血球の単離が行われる。
の実施形態では、上記バイオリアクターは、培地ガス供給部材を備える。別の実施形態で
は、上記バイオリアクターは、一つ以上の生物活性化合物を含む細胞因子部材を備える。
別の実施形態では、上記バイオリアクターの部材は、モジュール式であり、例えば、お互
いから分離することができ、および/または、独立して使用できる。一実施形態では、上
記バイオリアクターの容量は、約100mL、200mL、300mL、400mL、5
00mL、600mL、700mL、800mL、もしくは約900mL、または1、2
、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、25、30、3
5、40、45、もしくは50リットルである。別の実施形態では、上記バイオリアクタ
ーは、全ての部品を含むと、約47立方フィート以下である。別の実施形態では、上記バ
イオリアクターは、例えば造血細胞を、約1010個、1011個、または約1012個、培養
することができる。
ことができる区画を備える。上記培養部材は、培養のために、培地および/または造血細
胞を導入することができるポートを備える。上記ポートは、上記装置のための、技術的に
許容可能なポートであれば、いかなるポートであってもよく、例えばルアーロックシール
ポートが挙げられる。また、上記培養部材は、培地を上記細胞分離部材へと通すために一
つ以上のポートを備える。上記培養部材は、任意でさらに、生物活性化合物を上記培養部
材の内部に導入するためのポートを備えており、当該ポートには、例えば、上記細胞因子
部材と上記培養部材との接続を容易にするポートが挙げられる。特定の実施形態では、分
化している造血細胞を含む、上記培養部材中の造血細胞は、赤血球、および/または網状
赤血球、および/または他の赤血球前駆体を単離するために、細胞分離部材(下記参照)
へと培地中で継続的に循環される。
部表面または内部構造には、例えば、チューブ、シリンダー、中空糸、多孔性物質等が挙
げられる。上記表面は、細胞の培養に好適なあらゆる材料から構築することができ、当該
材料には、例えば、組織培養プラスチック、可塑医薬品グレードプラスチック、ヒドロキ
シアパタイト、ポリ乳酸(PLA)、ポリグリコール酸共重合体(PLGA)、ポリウレ
タン、ポリヒドロキシエチルメタクリル樹脂等が挙げられる。中空糸は、一般的に直径約
10μm〜約1000μmであり、一般的に、約5kDa、10kDa、15kDa、2
0kDa、30kDa、40kDa、50kDa、60kDa、70kDa、80kDa
、90kDa、100kDa、125kDa、150kDa、175kDa、200kD
a、150kDa、300kDa、350kDa、400kDa、450kDa、または
500kDa以下の分子を通過させることができる孔を備える。
も一つのポートを備える。上記細胞分離部材は、少なくとも一つの種類の細胞(例えば赤
血球)を、上記培養部材由来の培地中の細胞から分離することを容易にする、または可能
にする、一つ以上の部品を備える。当該分離は、例えば、CD36および/またはグリコ
フォリンAに対する抗体を用いることで達成される。分離は、既知の方法によって達成し
てもよく、例えば、抗体を介した磁気ビーズ分離、蛍光活性化セルソーティング、CD3
6および/またはグリコフォリンAに対する抗体を含む表面またはカラムに対する細胞の
パッセージ等が挙げられる。分離は、細胞サイズまたは細胞密度に基づいて達成してもよ
い。特定の実施形態では、上記細胞分離部材は、上記細胞培養部材と接続されており、培
地は造血細胞を含み、分化している造血細胞および赤血球は、細胞(例えば赤血球)を上
記培地から継続的に取り除くために、上記細胞分離部材を継続的に通過する。
を用いて、脱酸素された赤血球を、例えば採集物の表面または他の部分へ引き寄せること
で、達成される。
材は、培地中の赤血球から、一つ以上の非赤血球系細胞(例えば、未分化の、または、分
化が終わっていない造血細胞)を分離することができる部品を備えていてもよい。ある実
施形態では、上記細胞分離部材は、生産された赤血球のおよその数を計算することができ
るか、または、ユーザーが事前に設定したパラメータに従って、あるユニットを構成する
ために十分な数の赤血球が生産されたことをユーザーに知らせることができる。
るガス供給部材を備え、例えば、当該ガス供給部材は、上記培地を、80%の空気と15
%のO2と5%のCO2との混合物、または、空気中の5%のCO2等に接触させる。別の
実施形態では、上記バイオリアクターは、上記培地、上記バイオリアクター、またはその
両方を、一定の温度(例えば、約35℃〜約39℃、または約37℃)に維持する、温度
部材を備える。別の実施形態では、上記バイオリアクターは、上記培地を、一定のpH(
例えば約pH7.2〜pH7.6、または約pH7.4)に維持する、pHモニタリング
部材を備える。特定の実施形態では、上記温度部材および/またはpHモニタリング部材
は、温度および/またはpHが、設定されたパラメータを超えるか、または設定されたパ
ラメータ以下になったときに作動する警報装置を備える。他の特定の実施形態では、上記
温度部材および/またはpHモニタリング部材は、ある範囲から外れた温度および/また
はpHを補正することができる。
ガスを供給するガス供給部材を備えることによって、上記ガス供給部材が、赤血球の部分
的または完全な脱酸素化を可能にし、赤血球に含まれるヘモグロビンの磁気的特性に基づ
いた赤血球の分離を可能にする。さらに特定の側面では、上記バイオリアクターは、当該
バイオリアクター中で生産された赤血球を規則的に、または、繰り返し脱酸素化すること
ができる部材を備え、上記赤血球の磁気的採集を容易にする。
ーで制御される。上記コンピューターは例えば、デスクトップパーソナルコンピューター
、ラップトップコンピューター、Handspring、PALM(登録商標)、または
同様の手持ちサイズの装置、ミニコンピューター、メインフレームコンピューター等であ
ってもよい。
上記のように詳細に説明した方法に従って生産された赤血球のユニットは、あらゆる利
用しやすい数の遺伝的背景、または遺伝的背景の組み合わせを含んでいてもよい。
は、少なくとも、多くとも、または約1×108、5×108、1×109、5×109、1
×1010、5×1010、1×1011、5×1011、1×1012個の赤血球である。種々の
他の実施形態では、上記赤血球のユニットは、少なくとも10%、15%、20%、25
%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、また
は99%の完全に分化した赤血球を含む。種々の他の実施形態では、上記赤血球のユニッ
トは、60%、50%、40%、30%、20%、10%、5%、2%、または1%より
少ない、あらゆる種類の赤血球前駆体を含む。ある実施形態では、本明細書で提供される
方法によって生産された赤血球のユニットは、約60%、約50%、約40%、約30%
、約20%、約19%、約18%、約17%、約16%、約15%、約14%、約14%
、約12%、約11%、約10%、約9%、約8%、約7%、約6%、約5%より少ない
、網状赤血球、または他の非赤血球系造血細胞を含む。別の実施形態では、上記ユニット
は、単一の個体に由来する造血細胞に由来する赤血球を含む。別の実施形態では、上記ユ
ニットは、複数の個体に由来する造血細胞から分化した赤血球を含む。別の実施形態では
、上記ユニットは、調和したヒト胎盤灌流液および臍帯血に由来する造血細胞に由来する
赤血球を含む。別の実施形態では、赤血球のユニット中の赤血球のほぼ全て(例えば99
%を超える)は、O型である。別の実施形態では、赤血球のユニット中の赤血球のほぼ全
て(例えば99%を超える)は、A型である。別の実施形態では、赤血球のユニット中の
赤血球のほぼ全て(例えば99%を超える)は、B型である。別の実施形態では、赤血球
のユニット中の赤血球のほぼ全て(例えば99%を超える)は、AB型である。別の実施
形態では、赤血球のユニット中の赤血球のほぼ全て(例えば99%を超える)は、Rh陽
性である。別の実施形態では、赤血球のユニット中の赤血球のほぼ全て(例えば99%を
超える)は、Rh陰性である。
ている。例えば、凝集体中の赤血球は、非ニュートン流動を示し、例えば、血液の粘性は
、せん断速度に大きく依存する。通常の赤血球は、変形しやすく、凝集体/連銭を形成す
る。赤血球の変形能は、血液中の寿命(約100〜120日)に関連していると考えられ
、血液からの赤血球の除去には、変形能の喪失が関連していると考えられる。赤血球の通
常の凝集能は、毛細血管における細胞の流れを容易にするが、一方、異常に増加または減
少した凝集能は、流れを低減させる。従って、好ましい実施形態では、本明細書で開示さ
れる方法によって生産された赤血球のユニットは、品質管理の一部として、例えば、天然
由来の赤血球の一つ以上の特性について、分析される。ある実施形態では、本明細書で開
示される方法によって生産された赤血球のサンプルを、天然または人工の血漿中に懸濁し
、粘性、粘弾性、緩和時間、変形能、凝集能、血液/赤血球懸濁液降伏応力、および機械
的脆弱性について、通常の血液または通常の赤血球をコントロールまたはコンパレーター
(comparator)として用いて測定する。ある他の実施形態では、酸素運搬容量および酸素
放出容量について、本明細書で開示される方法によって生産された赤血球のサンプルを、
通常の血液または同数の天然の赤血球をコントロールとして分析する。
<6.1.実施例1:ヒト胎盤灌流液(HPP)および臍帯血(UCB)由来のCD3
4+細胞の特性>
臍帯血(UCB)を、インフォームドコンセントの下で、分娩後の胎盤から除去した。
その後、放血した胎盤を灌流し、HPPを得た。当該方法は、米国特許第7,045,1
48号に記載されており、開示の内容は全て参照によって本明細書中に引用されるものと
する。赤血球(RCB)を除去した後、全有核細胞(TNC)を採集し、凍結した。UC
Bから単離されるTNCが約5億個であるのに対し、当該方法によれば、一般的には、約
1〜2.5×109個のTNCが採集できる。
血(UCB)から得られた細胞産物に比べ、高い割合のCD34+細胞集団が示される。
UCB中のTNCでは、約0.3%〜1%のCD34+細胞を含むのに対し、上記の方法
で採集した、HPP由来のTNCは、約2%〜6%のCD34+細胞を含む。
4+細胞集団は、CD45-であることが示される(図1)。
コロニー形成細胞(CFU−E)に対する赤芽球バースト形成細胞(BFU−E)の割合
(%)を、顆粒球マクロファージコロニー形成細胞(CFU−GM)、および顆粒球、赤
血球、単球コロニー形成細胞(CFU−GEMM)とともに測定した(表1)。また、コ
ロニー形成能についても評価した(表1)。
ll Technologies,Inc.)。端的に言えば、幹細胞因子(SCF)、
顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM
−CSF)、インターロイキン3(IL−3)、インターロイキン6(IL−6)、およ
びエリスロポエチン(Epo)を追加したメチルセルロース培地に、プレートあたり細胞
100個、300個、および1000個で、CD34+細胞懸濁液を加えた。それぞれの
細胞密度において、3反復のアッセイを行い、その後、2〜3週間培養した。コロニーの
評価および計数は、光学顕微鏡を用いて行った。
CFU−E)の割合は、それぞれ46%および30%であった(3人のドナーに対する平
均値に基づいている)。
性が増加した、多数のCD34+細胞を含むことを示唆している。
HPPおよびUCB由来の細胞は、一般的に、全有核細胞(TNC)を得るために、フ
ィコール、ヘタスターチ、または塩化アンモニウムのいずれかを用いて、実施例1に記載
したように精製される。その後、TNCを用いて、CD34+細胞を単離するための正の
選択処理を行った。当該処理には、製造者(StemCell Technologie
s,Inc.)によって提供されるプロトコルに従って、抗CD34ビーズおよびRob
osepを用いた。当該実験では、CD34+細胞が、90%を超える精製度で単離され
た(図2)。また、EASYSEP(登録商標)Human Progenitor C
ell Enrichment Kit(StemCell Technologies
,Inc.)を用いて、負の選択処理を行い、Human Progenitor Ce
ll Enrichment Cocktailをモノクローナル抗体とともに用いて、
系列決定済みの細胞を除去した。上記モノクローナル抗体は以下のヒト細胞表面抗原に対
する抗体である:CD2、CD3、CD11b、CD11c、CD14、CD16、CD
19、CD24、CD56、CD66bおよび/またはグリコフォリンA。負の選択工程
を利用して、90%のCD34+細胞を原料から回収した。回収したHSCの細胞組成を
、表2に要約する。
たHSCのコロニー形成頻度は、正の選択をされたHSCと同程度であり、負の選択をさ
れたHSCのBFU−E形成頻度は、正の選択されたHSCの形成頻度より高いことが示
された。
ヒト臍帯血(UCB)ユニットにおけるCD34+細胞の含有量は、多くの場合、成人
患者に対して造血細胞の移植を行うには十分ではない。UCB由来のCD34+細胞のe
x−vivoでの増殖は、上記のCD34+細胞の投与の制限を克服するための一つのア
プローチである。本実施例では、特定の免疫調節薬剤、4−(アミノ)−2−(2,6−
ジオキソ(3−ピペリジル))−イソインドリン−1,3−ジオン(本実施例では、ポマ
リドマイドと呼ぶ)を用いたCD34+細胞の増殖について、実証する。
ヒトUCB由来CD34+細胞の増殖を促進する能力を評価した。CD34+前駆細胞を、
低温保存したUSBユニットから90%を超える精製度で濃縮し、SCF(50ng/m
L)、Flt−3リガンド(50ng/mL)、およびIL−3(10ng/mL)の存
在下で、1mLの培地中に播種した(104個のCD34+細胞)。当該培地は、IMD
Mおよび代替血清BIT(BSA、組み換えヒトインスリン、およびトランスフェリン、
20%)を含む。ポマリドマイドは、DMSO中に溶解させ、2.7μg/mLで追加し
た。上記培養物を37℃、5%CO2で12日間培養し、7日目に新鮮な培地を加えた。
DMSO(0.05%v/v)とポマリドマイドとを含む培養物、および、DMSOを含
まず、かつポマリドマイドを含まない培養物、をコントロールとして用いた。
となく、増殖した集団中でのCD34+の発現を大幅に高めることができた(200〜3
50倍)。CD34+の表現型は、コントロールでは10〜30%であったのに比べて、
ポマリドマイドを加えて増殖した集団中では、40〜60%であった。さらに、ポマリド
マイドは、培養細胞におけるCD38の発現を抑制すると考えられた。ポマリドマイドを
加えて増殖したCD34+細胞は、主にCD38に対して陰性であり(95%)、CD1
33を低レベルで発現した(コントロールで40%であったのに対し、15%)。ポマリ
ドマイドを加えて増殖したCD34+細胞は、増殖したコントロールと比較して、累積コ
ロニー形成ユニットにおいて十分な改善が見られることが証明された。別の同様な実験で
は、ポマリドマイドの追加によって、全有核細胞の増殖に影響を与えることなく、増殖し
た集団中でのCD34+の発現を大幅に高めることが確かめられた。(200〜350倍
)。CD34+の表現型は、コントロールでは10〜30%であったのに比べて、ポマリ
ドマイドを加えて増殖した集団中では、40〜60%であった(図3)。さらに、ポマリ
ドマイドは、培養細胞におけるCD38の発現を抑制すると考えられた。ポマリドマイド
を加えて増殖したCD34+細胞は、主にCD38に対して陰性であり(97%)、CD
133を低レベルで発現した(コントロールで32.3%であったのに対し、11.5%
)。ポマリドマイドを加えて増殖したCD34+細胞は、増殖したコントロールと比較し
て、累積コロニー形成ユニットにおいて十分な改善が見られることが証明された。
胞の増殖工程の規模を拡大した。CD34+細胞を、柔軟性を有するガス透過性のフルオ
ロカーボン培養バッグ(例えば、American Fluoroseal製)中で、1
04/mLのポマリドマイド追加培地中に播種した。7日間培養した後、当該培養物を遠
心分離し、当初の体積になるように未使用のポマリドマイド追加培地と3回交換した。1
2日目までのTNCおよびCD34+の増殖は、それぞれ350倍(幅:250〜700
)および200倍(幅:100〜450)であった(図4)。トリパンブルーによって評
価した生存率は86%(幅:80〜90%)であった。全部で2000万個のCD34+
細胞を採集した。これらの結果から、ポマリドマイドは、胎盤由来のCD34+前駆体の
ex−vivoでの増殖を大幅に促進すること、および、上記工程により、赤血球の分化
に十分な量のCD34+細胞を生産できることが証明された。
への分化>
本実施例では、SCF、IL−3、およびEpoを含み、Fms様チロシンキナーゼ3
リガンド(FLT−3L)、トロンボポエチン(Tpo)、およびIL−11を含まない
培地を用いた、造血幹細胞または前駆細胞の継続的な増殖、および造血幹細胞または前駆
細胞の赤血球への継続的な分化について実証する。
)を、細胞計数、細胞生存率、および赤血球分化の評価に用いた。
mLの鉄飽和ヒトトランスフェリン(Cat# T0665, Sigma)、900n
g/mLの硫酸鉄(Cat# F8048, Sigma)、90ng/mLの硝酸酸化
鉄(Cat# F8508, Sigma)および10μg/mLのインスリン(Cat
# I0908, Sigma)、100ng/mLのSCF、1μMのヒドロコルチゾ
ン(Cat# H0135, Sigma)、5ng/mLのIL−3、および3IU/
mLのEpo(Cat# 287−TC, R&D System)を追加したIMDM
培地。
ex Cat# D4902, Sigma, St Louis, MO)、40ng
/mLのインスリン様増殖因子1(IGF−1 Cat# 291−G1−250, R
&D System,Minneapolis, MN)、100ng/mLのSCF、
および40μg/mLの脂質(コレステロールに富んだ脂質混合物、Cat# C730
5−1G, Sigma, St Louis, MO)を追加した無血清培地(STE
MSPAN(登録商標)、Cat# 09650,Stem Cell Technol
ogies, Vancouver,Canada)。
F−1、100ng/mLのSCF、および40μg/mLの脂質を追加した無血清培地
STEMSPAN(登録商標)。
00ng/mLのSCF、5ng/mLのIL−3、および40μg/mLの脂質を追加
した無血清培地STEMSPAN(登録商標)。
F−1、100ng/mLのSCF、5ng/mLのIL−3、および40μg/mLの
脂質を追加した無血清培地STEMSPAN(登録商標)。
培地における細胞増殖のレベルは、最高2.5×105倍であり、平均7.0×104倍で
あった(n=13)。また、C培地におけるCD235A+細胞のレベルは、最高37.
6%であり、除核のレベルは、最高28.1%であった。E培地における細胞増殖のレベ
ルは、最高2.6×105倍であり、平均1.0×105倍であった(n=10)。また、
E培地におけるCD235A+細胞のレベルは、最高92.9%であり、除核のレベルは
、最高48.2%であった。C培地およびE培地において増殖した細胞は、全て90%を
超える生存率を示した。E1培地において増殖した細胞は、CD235A+細胞および除
核細胞の高い割合で示されるように、最も大幅な赤血球の分化を示した。
培養物が21日目に達し、さらに28日目に達した時、E1培地およびE2培地中の細胞
は、増殖安定期(growth plateau)を示しており、一方、E3培地およびE4培地におい
ては、大幅な細胞増殖が見られた。21日間培養した細胞について、免疫表現型の特性、
FACSに基づいた、除核(TO−PRO−3、Cat# T3605、Invitro
gen)、並びに、胎児型ヘモグロビン(HbF−PE、Cat# 560041、BD
Biosciences)および成体型ヘモグロビン(HbA−FITC、Cat#
sc−21757、Santa Cruz)の生産の分析を行った(表3)。
表3A、3B。21日間培養された細胞の特性。(A)免疫表現型の特性、(B)除核、
HbFおよびHbAの特性。標準偏差は3人のドナーの母集団平均に対して計算された。
血球マーカー(CD235A、CD36、およびCD71を含む)のFACS分析を、E
3培地中の培養物において連続的な時間間隔で、培養物のアリコートを用いて行った。赤
血球の系列決定は、7日目までに、CD117+およびCD133+細胞集団とともに、C
D34+細胞集団における未熟な前駆体マーカーの発現が減少し、一方、増殖した細胞の
56%はCD235A+であったことから、明らかになった。続く最終分化は、7日目、
14日目、21日目および28日目を通してのCD235Aの発現の継続的な増加、特に
14日目と21日目との間における除核細胞の存在の増加、並びに、7日目、14日目、
21日目および28日目を通してのHbFおよびHbAの両方の生産の増加によって、実
証された。21日目の培養物において、増殖した細胞の50%近くが除核されており、8
0%がHbF+、30%がHbA+であった。
殖性および分化を調べた(表4)。正の選択を受けた細胞は、2.2×104±2.0×
104の平均増殖倍率を示し、CD235+細胞の割合は、32.2%±14.8%であり
、除核細胞の割合は23.9%±7%であった。負の選択を受けた細胞は、4.0×10
4±3.8×104の平均増殖倍率を示し、CD235+細胞の割合は、40.9%±11
.0%であり、除核細胞の割合は19.1%±4.8%であった。上記の結果に基づくと
、正の選択処理および負の選択処理に由来する細胞間では、増殖倍率および分化について
大きな差異は観察されなかった。
HSCは、実施例1に記載したように、臍帯血から得た。HSCの培養は、実施例4に
記載したように、濃縮したCB由来のHSCを含むE3培地を培養することによって開始
した。3〜4日ごとに、培養細胞について、細胞計数および特性付けを行った。その後、
培養細胞を、新鮮な培地を用いて、所望の密度になるまで希釈した。
を調べた(図7および表5)。2〜5×104個/mLの範囲で維持された細胞は、最も
大幅な増殖を示した。5×105個/mLを超える値で保たれた細胞は、緩やかな増殖を
示した。
CD34+細胞>
本実施例では、E3培地中で、CB由来のCD34+細胞と骨髄(BM)由来のCD3
4+細胞との間の、細胞増殖および分化ポテンシャルの比較を行った。実施例1に記載さ
れているように、BMまたはCBの3ユニットに由来する細胞を、評価実験に用いた。C
B由来のCD34+細胞は、BM由来のCD34+細胞に比べて、高い増殖ポテンシャルを
示したが(図8)、一方、分化ポテンシャルは同等であった(表6A)。成体型ヘモグロ
ビン(HbA)および胎児型ヘモグロビン(HbF)を含む細胞の割合を表6Bに示す(
ヘモグロビンを含む細胞の総数と比較した)。
表6A、6B。BM由来のCD34+細胞とCB由来のCD34+細胞における分化ポテン
シャルの比較。標準偏差は3人のドナーの母集団平均に対して計算された。
本実験では、E3培地(上述の実施例4参照)、並びに、単一のドナーおよび混合ドナ
ーに由来するCD34+細胞を用いて、長期にわたる細胞増殖を行った。高いRBC成熟
効率を伴う、最高63日間にわたる継続した細胞増殖が実証された(図9)。63日目に
は、混合ドナー細胞では1×109倍の増殖、単一ドナー細胞では1.8×109倍の増殖
が、それぞれ観察され、単一ドナーでは、77%のCD235A+、および56%の除核
が達成された(表7)。
LISA分析を、末梢血(PB)RBCにおけるHbFおよびHbAの生産と比較して示
している。本実験では、示された時点において採集された2×105個の細胞を、PBS
で洗浄し、2500 × gで10分間、スピンさせた。細胞の沈殿物を、100LM−
PER Mammalian Protein Extraction Reagent
(Cat# 78501、Thermo Scientific)を用いて溶解させ、混
合物を10分間穏やかに混合し、続いて、14,000 × gで15分間遠心分離させ
た。その後、ELISAキットを用いたヘモグロビン分析のために、上清を新しいチュー
ブに移した。ELISAキットには、ヒトヘモグロビンELISA定量セット(Cat#
E80−135)およびヒト胎児型ヘモグロビンELISA定量セット(Cat# E
80−136)が含まれる。100万個のPB赤血球から245ngのHbAが生産され
た一方、培養細胞は、培養14日目から開始して、1.3μgHbAを生産した。
ルタイムPCR(qRT−PCR)分析を示している。細胞のアリコートを様々な時点で
採集し、qRT−PCR分析を行った。qRT−PCR分析には、7900HT Fas
t Real−Time PCR System(Applied Biosystem
s)およびTaqMan(登録商標)Gene Expression Assays
of EKLF(Applied Biosystems、Cat# Hs006105
92_m1)、GATA1(Applied Biosystems、Cat# Hs0
0231112_m1)、GATA2、HBβ(Applied Biosystems
、Cat# Hs00758889_s1)、HBγ(Applied Biosyst
ems、Cat# Hs00361131_g1)、LMO2(Applied Bio
systems、Cat# Hs00277106_m1)、およびZFPM1(App
lied Biosystems、Cat# Hs00419119_m1)を用いた。
qRT−PCR分析の結果によって、継続的な増殖および赤血球への分化は、HBβ、H
Bγ、並びに、EKLF、GATA1、LMO2およびZFPM1を含む、赤血球の分化
に重要ないくつかの転写因子の発現の増加と相関があることが示された。
表8。単一ドナーに由来する長期の培養物におけるqRT−PCR分析。(A)遺伝子発
現の変化倍率。(B)遺伝子の説明。標準偏差は2反復の変化倍率の平均に対して計算さ
れた。
本実施例では、HSCの増殖および赤血球への分化を改善するために、3水準(3要因
:SCF、Epo、およびIL−3)全要因実験計画(3-level full factorial experim
ent design)を用いて、E3培地をさらに最適化した(図11)。CD34+細胞を、図
1で記載したように得て、E3培地には、表9に示すSCF、IL−3およびEpoを追
加した。細胞計数、生存率、CD235A+細胞の割合、および除核細胞の割合について
、表10に示す時点で調べた。一つの組成(#7、65ng/mLのSCF、7ng/m
LのIL−3、および3IU/mLのEpo)では、E3培地組成に比べて、CD235
A+細胞の割合の増加、および除核細胞の割合の増加が見られた。
おける、SCFおよびEpoの異なる効果が特定された(図12A−12C)。Epoは
、SCFが高レベルである場合、初期の増殖を増加させるように相乗的に働くが、SCF
が低レベルである場合、増殖を抑制させる。SCFが低レベルである場合、Epoは、C
D235Aの発現の増加に対してより効果的であり、一方、SCFが高レベルである場合
、Epoは、赤血球の分化を抑制させる。
用を評価するために、3水準(SCF、Epo、および細胞密度)全要因実験計画を利用
した(図13A)。CD34+細胞を、図1で記載したように得て、E3培地には、表1
1に示す異なる細胞密度で、SCFおよびEpoを追加した。低Epo条件(最高3倍)
、低細胞密度、および高SCF濃度において、増殖の大幅な促進(約10倍)が達成され
ることが実証された(図13B)。さらに、赤血球の分化は、高細胞播種密度および低S
CF濃度で、改善されることが実証された(図13C)。
>
本実施例では、赤血球の生産方法、および、成熟した赤血球のユニットの生産を可能に
するバイオリアクターを提供する。特定の実施例では、バイオリアクターは、5段階の工
程によって、投与可能な赤血球のユニットの生産を可能にする。最初の工程では、造血細
胞(例えばCD34+細胞)を単離する。二番目の工程では、CD34+細胞を、免疫調節
化合物(例えばポマリドマイド)を用いて、増殖させる。三番目の工程では、本明細書に
例示するバイオリアクター中で、付着胎盤幹細胞との共培養で、系列決定済み細胞の除去
と同時に、CD34+細胞を増殖させる。四番目には、残った未分化の造血細胞を赤血球
に分化させる。最後に、五番目の工程で、赤血球を単離し、投与可能なユニットに採集す
る。
4に記載されたように達成される。
胎盤幹細胞(2)が播種された中空糸チャンバー(1)、および培地へのガス供給のため
の部材(3)を備える。上記バイオリアクターは、さらに、系列決定済の造血細胞、完全
に分化した赤血球、またはその両方を継続的に分離することができる、連結した細胞選別
/分離部材(4)を備える。上記細胞分離部材は、例えば、磁気細胞分離または蛍光活性
化セルソーティング技術を用いて、細胞を造血細胞から分離することができる。
)を、上記バイオリアクターに植えつける。
本実施例では、赤血球を他の系列決定済み細胞から分離する、いくつかの方法を例示す
る。
集された赤血球)およびヘタスターチ溶液をバクスター採集バッグ中で3:1(v/v)
で混合し、血漿抽出器(plasma extractor)上に直立位置で配置する。
赤血球は50〜70分後に堆積する。堆積していない細胞は、血漿抽出器によって強制排
出する。バッグに残った堆積した赤血球を、さらに、400 × gで10分間の遠心分
離によって採集する。上清を取り除いた後、赤血球を適切な量の所望の培地に再び懸濁す
る。
オリアクターの細胞分離部材から採集された赤血球)を、グリコフォリンA(CD235
a)マイクロビーズ(Miltenyi Biotech)によって磁気的に標識する。
その後、細胞懸濁液をチューブに入れ、EASYSEP(登録商標)マグネットの磁場の
中に配置する。磁気的に標識されたグリコフォリンA+細胞はチューブの内側に残り、一
方、標識されていない細胞は、チューブの外へ流れ出る。チューブを磁場から取り除いた
後、磁気的に維持されたグリコフォリンA+細胞を磁気ビーズから分離し、適切な量の所
望の培地に再び懸濁することができる。
リアクターの細胞分離部材から採集された赤血球)を、1μLのFc Block(1/
500)を含む500μLのPBS/FBSに加える。150μLの細胞懸濁液を、96
ウェルV底ディッシュの各ウェルに加える。50μLの1°Ab Master Mix
(当該混合物は、PBS/FBSにそれぞれの一次Abを1/25で希釈したものである
。)を上記細胞に加える。1つのウェルには、補正を設定するための単一のポジティブコ
ントロールとしてそれぞれの一次Abが含まれるのと同様に、電圧を設定するためのアイ
ソタイプコントロールの組み合わせが含まれる。上記細胞を4℃で60分間培養し、その
後、1500RPMで2分間遠心分離する。上清は捨てる。ウェルはそれぞれ、200μ
LのPBS/FBSで洗浄し、ピペットを用いて混合する。その後、上記細胞を即座に、
1500RPMで2分間スピンさせ、上清を捨てる。150μLの二次Ab(すなわち、
ストレプトアビジン−TC)Master Mixを加え、4℃で30分間培養し、その
後、1500RPMで5分間遠心分離する。堆積物は、200〜500μLのPBS/F
BSに再び懸濁し、5mLの流管に移す。その後、細胞を、フローサイトメーターを用い
て分離する。
で、ガス供給部材からの酸素の供給を低減または停止させることによって、脱酸素化し、
細胞分離部材中で磁石を作動させる。培地を、細胞分離部材を介して、十分な時間、磁石
の磁場を通過させ、細胞分離部材の表面に赤血球を集める。一旦、所定の数の赤血球が集
まるか、または採集が所定の時間行われれば、培地に酸素が送り込まれ、赤血球は表面か
ら解放される。
遠心分離を行い、中断することで行うことができる。白血球(一番上の白い層)、未熟な
赤血球(中間のピンクの層)、および赤血球(一番下の赤い層)を分離できる。その後、
赤血球を底から採集し、適切な量の所望の培地に再び懸濁する。
本実施例では、フローサイトメトリーを用いた、赤血球の採集を実証する。
riaを用いた細胞選別法では、光散乱を利用した細胞サイズによる赤血球の選択(前方
散乱および側方散乱、図14および表12)、またはDRAQ5標識を利用した除核の選
択(リニアAPCチャンネル蛍光、図15および表13)を行う。
)された細胞について、フローサイトメトリーによってHbA+、除核、およびCD23
5A+の割合を評価した。最も小さい細胞サイズを示すP1細胞が、HbA+、除核、およ
びCD235A+について最も高い割合を示し、そのため、大部分が赤血球であった。
aling、カタログNo.#4084)によって染色し、その後、FACSAriaを
用いた細胞選別を行い、Q1およびQ2によってゲートされた細胞について、フローサイ
トメトリーによってHbA+、除核、およびCD235A+の割合を評価する。DRAQ染
色では陰性であったQ1細胞は、Q2細胞に比べて、HbA+、除核、およびCD235
A+について高い割合を示し、そのため、大部分が赤血球であった。
色した。FACSAriaによる細胞選別の後、QP1、P2およびQP3によってゲー
トされた細胞について、フローサイトメトリーによってHbA+、除核、およびCD23
5A+の割合を評価した。DRAQ染色では陰性であり、最も小さい細胞サイズを示すQ
P1細胞は、Q2細胞に比べて、HbA+、除核、およびCD235A+について高い割合
を示し、そのため、大部分が赤血球であった。
本実施例では、造血細胞からの赤血球の生産を改善することができるバイオリアクター
の設計について説明する。上記バイオリアクターは、造血細胞を培養する中空糸を有する
培養部材を備える。造血細胞(例えば造血前駆細胞)を、5×105個/投与量でバッグ
中に追加する。上記1回の投与量は、1ユニットの血液をもたらす。上記細胞を、第一の
ポートを介して加えられた50ng/mLのSCF、3units/mLのEpo、50
ng/mLのIGF−1を含むIMDM培地の存在下で増殖させる。造血細胞が培養され
ている上記培地に、2.7μg/mLのポマリドマイドを追加する。培養の間、培養部材
中のガス、培地の代謝産物、および培地のpHを継続的にモニタリングし、必要に応じて
、プログラム可能な制御装置を用いて、補充または交換できる。培養部材中の培地のpH
はおよそ7で維持され、培養温度は約37℃で維持される。系列決定済みの細胞(例えば
分化した細胞)は、細胞分離部材を用いて、培地から継続的に分離および回収される。上
記バイオリアクターは、遠隔地、例えば、造血細胞を初めに得る場所から離れた場所にお
いて動作できるように、独立した電源を備えている。
囲に限定されるものではない。実際には、本明細書の記載に加えて種々の変更が可能であ
ることが、当業者であれば上記の説明から理解できるであろう。そのような変更も、添付
の特許請求の範囲内に含まれるものである。
的に、かつ個別に、全ての目的について全体が参照によって引用されるのと同じ程度に、
全ての目的について全体が参照によって本明細書中に引用されるものとする。
由として、本開示が上記刊行物に先行する資格がないことを認めたと解釈されるべきでは
ない。
Claims (29)
- (a)支持細胞が存在しない第1の培地中で、第1の造血細胞集団を増殖させて、増殖
した造血細胞集団を得る工程であって、
上記第1の造血細胞集団の当初の細胞密度は、5×104個/mL以下であり、
上記第1の培地は、Epoを1IU以下の濃度で含んでおり、かつ、SCFを100
ng/mL以上の濃度で含んでいる、工程と、
(b)上記増殖した造血細胞集団を、第2の培地に接触させることによって、上記増殖
した造血細胞集団中の複数の造血細胞を、赤血球へ分化させる工程であって、
上記増殖した造血細胞集団の当初の細胞密度は、2.75×105個/mL超であり
、
上記第2の培地は、Epoを3IU/mL以上の濃度で含んでおり、かつ、SCFを
50ng/mL以下の濃度で含んでいる、工程と、
(c)上記培地から上記赤血球を単離する工程と、
を含む、赤血球を生産する方法であって、
上記SCF、IL−3およびEpoは、上記第1の培地または第2の培地の定義されて
いない成分の中には含まれていないことを特徴とする、赤血球を生産する方法。 - 上記第1の培地および第2の培地は、Flt−3L、IL−11、トロンボポエチン(
Tpo)、ホメオボックス−B4(HoxB4)またはメチルセルロースのうち、1つ以
上を含まない、請求項1に記載の方法。 - 上記SCFは、上記第1の培地中に、100ng/mLの濃度で存在することを特徴と
する請求項1に記載の方法。 - 上記IL−3は、上記第1の培地中に、0.1〜100ng/mLの濃度で存在するこ
とを特徴とする請求項1に記載の方法。 - 上記IL−3は、上記第1の培地中に、1〜50ng/mLの濃度で存在することを特
徴とする請求項1に記載の方法。 - 上記IL−3は、上記第1の培地中に、5ng/mLの濃度で存在することを特徴とす
る請求項1に記載の方法。 - 上記第2の培地は、免疫調節化合物を含み、
上記免疫調節化合物は、上記免疫調節化合物が存在しない状態で増殖した複数の造血細
胞に比べて、造血細胞の数を増加させるものであることを特徴とする請求項1に記載の方
法。 - 上記造血細胞が、CD34+であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 上記造血細胞が、Thy−1+、CXCR4+、CD133+またはKDR+であることを
特徴とする請求項1に記載の方法。 - 上記造血細胞が、CD34-CD133+またはCD34-CD117+であることを特徴
とする請求項1に記載の方法。 - 上記造血細胞が、CD45-であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 上記造血細胞が、HLA−DR-、CD71-、CD2-、CD3-、CD11b-、CD
11c-、CD14-、CD16-、CD24-、CD56-、CD66b-および/またはグ
リコフォリンA-であることを特徴とする請求項1に記載の方法。 - 上記造血細胞は、臍帯血、胎盤血、末梢血、骨髄、胚性幹細胞または誘導された多能性
細胞から得られることを特徴とする請求項1に記載の方法。 - 上記造血細胞は、胎盤灌流液から得られることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 上記造血細胞は、臍帯血および胎盤灌流液から得られることを特徴とする請求項1に記
載の方法。 - 上記胎盤灌流液は、胎盤の脈管構造のみを通る灌流液のパッセージによって得られるこ
とを特徴とする請求項14に記載の方法。 - 上記胎盤灌流液は、胎盤の脈管構造のみを通る灌流液のパッセージによって得られるこ
とを特徴とする、請求項15に記載の方法。 - 上記造血細胞は、ヒトの造血細胞であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 上記第1の培地は、さらに、1〜1000ng/mLの濃度であるインスリン様増殖因
子1(IGF−1)、および、1〜1000μg/mLの濃度である脂質を含み、
上記脂質は、たんぱく質とコレステロールとの混合物を含み、
上記第2の培地は、0.01〜100μMの濃度であるヒドロコルチゾン、または、0
.01〜100μMの濃度であるデキサメタゾンを含むことを特徴とする請求項1に記載
の方法。 - 上記IGF−1は、上記第1の培地中に、10〜500ng/mLの濃度で存在するこ
とを特徴とする請求項19に記載の方法。 - 上記IGF−1は、上記第1の培地中に、20〜100ng/mLの濃度で存在するこ
とを特徴とする請求項19に記載の方法。 - 上記脂質は、上記第1の培地中に、10〜500ng/mLの濃度で存在することを特
徴とする請求項19に記載の方法。 - 上記脂質は、上記第1の培地中に、20〜100ng/mLの濃度で存在することを特
徴とする請求項19に記載の方法。 - 上記ヒドロコルチゾンは、上記第2の培地中に、0.1〜50μMの濃度で存在するこ
とを特徴とする請求項19に記載の方法。 - 上記ヒドロコルチゾンは、上記第2の培地中に、0.5〜10μMの濃度で存在するこ
とを特徴とする請求項19に記載の方法。 - 上記デキサメタゾンは、上記第2の培地中に、0.05〜20μMの濃度で存在するこ
とを特徴とする請求項19に記載の方法。 - 上記デキサメタゾンは、上記第2の培地中に、0.1〜10μMの濃度で存在すること
を特徴とする請求項19に記載の方法。 - 上記造血細胞のうちの複数は、A型、O型、AB型、O型の血液型;Rh陽性またはR
h陰性;M型、N型、S型、またはs型の血液型;P1型の血液型;Lua型、Lub型
、またはLu(a)型の血液型;K(Kell)型、k(cellano)型、Kpa型
、Kpb型、K(a+)型、Kp(a−b−)型またはK−k−Kp(a−b−)型の血
液型;Le(a−b−)型、Le(a+b−)型またはLe(a−b+)型の血液型;F
y a型、Fy b型またはFy(a−b−)型の血液型;Jk(a−b−)型、Jk(
a+b−)型、Jk(a−b+)型またはJk(a+b+)型の血液型を作る能力を有す
ることを特徴とする請求項1に記載の方法。 - 上記造血細胞は、O型、Rh陽性;O型、Rh陰性;A型、Rh陽性;A型、Rh陰性
;B型、Rh陽性;B型、Rh陰性;AB型、Rh陽性またはAB型、Rh陰性を作る能
力を有することを特徴とする請求項28に記載の方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2022081214A JP2022110097A (ja) | 2009-07-02 | 2022-05-18 | 支持細胞を用いない赤血球の生産方法 |
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US22293009P | 2009-07-02 | 2009-07-02 | |
US61/222,930 | 2009-07-02 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2018098578A Division JP2018148913A (ja) | 2009-07-02 | 2018-05-23 | 支持細胞を用いない赤血球の生産方法 |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2022081214A Division JP2022110097A (ja) | 2009-07-02 | 2022-05-18 | 支持細胞を用いない赤血球の生産方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2020182494A true JP2020182494A (ja) | 2020-11-12 |
Family
ID=42537451
Family Applications (6)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2012518604A Pending JP2012531916A (ja) | 2009-07-02 | 2010-07-01 | 支持細胞を用いない赤血球の生産方法 |
JP2015078743A Pending JP2015146816A (ja) | 2009-07-02 | 2015-04-07 | 支持細胞を用いない赤血球の生産方法 |
JP2016186243A Pending JP2017038603A (ja) | 2009-07-02 | 2016-09-23 | 支持細胞を用いない赤血球の生産方法 |
JP2018098578A Pending JP2018148913A (ja) | 2009-07-02 | 2018-05-23 | 支持細胞を用いない赤血球の生産方法 |
JP2020129086A Withdrawn JP2020182494A (ja) | 2009-07-02 | 2020-07-30 | 支持細胞を用いない赤血球の生産方法 |
JP2022081214A Pending JP2022110097A (ja) | 2009-07-02 | 2022-05-18 | 支持細胞を用いない赤血球の生産方法 |
Family Applications Before (4)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2012518604A Pending JP2012531916A (ja) | 2009-07-02 | 2010-07-01 | 支持細胞を用いない赤血球の生産方法 |
JP2015078743A Pending JP2015146816A (ja) | 2009-07-02 | 2015-04-07 | 支持細胞を用いない赤血球の生産方法 |
JP2016186243A Pending JP2017038603A (ja) | 2009-07-02 | 2016-09-23 | 支持細胞を用いない赤血球の生産方法 |
JP2018098578A Pending JP2018148913A (ja) | 2009-07-02 | 2018-05-23 | 支持細胞を用いない赤血球の生産方法 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2022081214A Pending JP2022110097A (ja) | 2009-07-02 | 2022-05-18 | 支持細胞を用いない赤血球の生産方法 |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US8586360B2 (ja) |
EP (2) | EP3190179A1 (ja) |
JP (6) | JP2012531916A (ja) |
AR (2) | AR077369A1 (ja) |
AU (5) | AU2010266263B2 (ja) |
CA (1) | CA2767014C (ja) |
IL (2) | IL217257A (ja) |
MX (2) | MX353489B (ja) |
NZ (2) | NZ619359A (ja) |
WO (1) | WO2011002959A1 (ja) |
ZA (2) | ZA201200031B (ja) |
Families Citing this family (43)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20080152629A1 (en) * | 2000-12-06 | 2008-06-26 | James Edinger | Placental stem cell populations |
EP1349918B1 (en) * | 2000-12-06 | 2014-08-06 | Anthrogenesis Corporation | Method of collecting placental stem cells |
US7311905B2 (en) | 2002-02-13 | 2007-12-25 | Anthrogenesis Corporation | Embryonic-like stem cells derived from post-partum mammalian placenta, and uses and methods of treatment using said cells |
ES2522526T3 (es) | 2001-02-14 | 2014-11-14 | Anthrogenesis Corporation | Placenta post-parto de mamíferos, su uso y células troncales placentarias de la misma |
US7498171B2 (en) * | 2002-04-12 | 2009-03-03 | Anthrogenesis Corporation | Modulation of stem and progenitor cell differentiation, assays, and uses thereof |
CN1717177A (zh) * | 2002-11-26 | 2006-01-04 | 人类起源公司 | 细胞治疗剂、细胞治疗单元及其用于治疗的方法 |
NZ550027A (en) * | 2004-03-26 | 2009-03-31 | Celgene Corp | Systems and methods for providing a stem cell bank |
WO2007047465A1 (en) * | 2005-10-13 | 2007-04-26 | Anthrogenesis Corporation | Production of oligodendrocytes from placenta-derived stem cells |
PE20070771A1 (es) | 2005-10-13 | 2007-08-11 | Anthrogenesis Corp | Inmunomodulacion mediante el uso de celulas madres de la placenta |
CA2633775A1 (en) * | 2005-12-29 | 2007-07-12 | Anthrogenesis Corporation | Co-culture of placental stem cells and stem cells from a second source |
EP2471904B1 (en) * | 2005-12-29 | 2018-10-24 | Celularity, Inc. | Placental stem cell populations |
US7993918B2 (en) * | 2006-08-04 | 2011-08-09 | Anthrogenesis Corporation | Tumor suppression using placental stem cells |
PL2084268T3 (pl) | 2006-10-23 | 2019-08-30 | Celularity, Inc. | Sposoby i kompozycje do leczenia ubytków kości z użyciem populacji komórek łożyska |
NZ597779A (en) | 2007-02-12 | 2013-07-26 | Anthrogenesis Corp | Treatment of inflammatory diseases using placental stem cells |
CN101688177A (zh) * | 2007-02-12 | 2010-03-31 | 人类起源公司 | 来自贴壁胎盘干细胞的肝细胞和软骨细胞;以及cd34+、cd45-胎盘干细胞富集的细胞群 |
US20100172830A1 (en) * | 2007-03-29 | 2010-07-08 | Cellx Inc. | Extraembryonic Tissue cells and method of use thereof |
US9200253B1 (en) | 2007-08-06 | 2015-12-01 | Anthrogenesis Corporation | Method of producing erythrocytes |
AU2008305516A1 (en) * | 2007-09-26 | 2009-04-02 | Anthrogenesis Corporation | Angiogenic cells from human placental perfusate |
SI2203176T1 (sl) * | 2007-09-28 | 2015-04-30 | Anthrogenesis Corporation | Tumorska supresija z uporabo humanega perfuzata placente in intermediarnih naravnih celic ubijalk, pridobljenih iz humane placente |
NZ591292A (en) * | 2008-08-20 | 2012-10-26 | Anthrogenesis Corp | Improved cell composition and methods of making the same |
CA2743573C (en) * | 2008-11-21 | 2021-04-27 | Anthrogenesis Corporation | Treatment of diseases, disorders or conditions of the lung using placental cells |
MX353489B (es) | 2009-07-02 | 2018-01-16 | Anthrogenesis Corp | Metodo para producir eritrocitos sin celulas alimentadoras. |
WO2011094181A1 (en) * | 2010-01-26 | 2011-08-04 | Anthrogenesis Corporation | Treatment of bone-related cancers using placental stem cells |
PT2556145T (pt) | 2010-04-07 | 2016-10-25 | Anthrogenesis Corp | Angiogénese usando células estaminais placentárias |
WO2011127113A1 (en) | 2010-04-08 | 2011-10-13 | Anthrogenesis Corporation | Treatment of sarcoidosis using placental stem cells |
US9634855B2 (en) | 2010-05-13 | 2017-04-25 | Alexander Poltorak | Electronic personal interactive device that determines topics of interest using a conversational agent |
US10130736B1 (en) | 2010-05-14 | 2018-11-20 | Musculoskeletal Transplant Foundation | Tissue-derived tissuegenic implants, and methods of fabricating and using same |
US9352003B1 (en) | 2010-05-14 | 2016-05-31 | Musculoskeletal Transplant Foundation | Tissue-derived tissuegenic implants, and methods of fabricating and using same |
US8883210B1 (en) | 2010-05-14 | 2014-11-11 | Musculoskeletal Transplant Foundation | Tissue-derived tissuegenic implants, and methods of fabricating and using same |
JP5996533B2 (ja) | 2010-07-13 | 2016-09-21 | アントフロゲネシス コーポレーション | ナチュラルキラー細胞を生成させる方法 |
WO2012092485A1 (en) | 2010-12-31 | 2012-07-05 | Anthrogenesis Corporation | Enhancement of placental stem cell potency using modulatory rna molecules |
AU2012262273B2 (en) | 2011-06-01 | 2017-09-14 | Celularity Inc. | Treatment of pain using placental stem cells |
WO2013055476A1 (en) | 2011-09-09 | 2013-04-18 | Anthrogenesis Corporation | Treatment of amyotrophic lateral sclerosis using placental stem cells |
US20150118265A1 (en) | 2012-03-13 | 2015-04-30 | Anthrogenesis Corporation | Modified erythrocyte precursor cells and uses thereof |
US9664671B2 (en) | 2012-07-24 | 2017-05-30 | Nissan Chemical Industries, Ltd. | Culture medium composition and method of culturing cell or tissue using thereof |
US10017805B2 (en) | 2012-08-23 | 2018-07-10 | Nissan Chemical Industries, Ltd. | Enhancing ingredients for protein production from various cells |
US20150329639A1 (en) * | 2012-12-12 | 2015-11-19 | University Of Virginia Patent Foundation | Compositions and methods for regulating erythropoiesis |
WO2014113593A1 (en) * | 2013-01-18 | 2014-07-24 | Advanced Diagnostic Technologies, Llc | Methods and compositions for preparing blood substitutes |
EP2953635A4 (en) | 2013-02-05 | 2016-10-26 | Anthrogenesis Corp | NATURAL KILLER CELLS FROM PLAZENTA |
JP6319304B2 (ja) * | 2013-04-17 | 2018-05-09 | 日産化学工業株式会社 | 培地組成物及び当該培地組成物を用いた赤血球の製造方法 |
WO2016187413A1 (en) | 2015-05-21 | 2016-11-24 | Musculoskeletal Transplant Foundation | Modified demineralized cortical bone fibers |
WO2017205667A1 (en) * | 2016-05-25 | 2017-11-30 | Terumo Bct, Inc. | Cell expansion |
US11708559B2 (en) | 2017-10-27 | 2023-07-25 | The Children's Hospital Of Philadelphia | Engineered red blood cells having rare antigen phenotypes |
Family Cites Families (154)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3862002A (en) | 1962-05-08 | 1975-01-21 | Sanfar Lab Inc | Production of physiologically active placental substances |
US4829000A (en) | 1985-08-30 | 1989-05-09 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Reconstituted basement membrane complex with biological activity |
US5902741A (en) | 1986-04-18 | 1999-05-11 | Advanced Tissue Sciences, Inc. | Three-dimensional cartilage cultures |
US5192553A (en) | 1987-11-12 | 1993-03-09 | Biocyte Corporation | Isolation and preservation of fetal and neonatal hematopoietic stem and progenitor cells of the blood and methods of therapeutic use |
US5605822A (en) | 1989-06-15 | 1997-02-25 | The Regents Of The University Of Michigan | Methods, compositions and devices for growing human hematopoietic cells |
US5635386A (en) | 1989-06-15 | 1997-06-03 | The Regents Of The University Of Michigan | Methods for regulating the specific lineages of cells produced in a human hematopoietic cell culture |
US5464764A (en) | 1989-08-22 | 1995-11-07 | University Of Utah Research Foundation | Positive-negative selection methods and vectors |
US5272071A (en) | 1989-12-22 | 1993-12-21 | Applied Research Systems Ars Holding N.V. | Method for the modification of the expression characteristics of an endogenous gene of a given cell line |
US5061620A (en) | 1990-03-30 | 1991-10-29 | Systemix, Inc. | Human hematopoietic stem cell |
US5837539A (en) | 1990-11-16 | 1998-11-17 | Osiris Therapeutics, Inc. | Monoclonal antibodies for human mesenchymal stem cells |
US5733542A (en) | 1990-11-16 | 1998-03-31 | Haynesworth; Stephen E. | Enhancing bone marrow engraftment using MSCS |
US5197985A (en) | 1990-11-16 | 1993-03-30 | Caplan Arnold I | Method for enhancing the implantation and differentiation of marrow-derived mesenchymal cells |
US5226914A (en) | 1990-11-16 | 1993-07-13 | Caplan Arnold I | Method for treating connective tissue disorders |
US6010696A (en) | 1990-11-16 | 2000-01-04 | Osiris Therapeutics, Inc. | Enhancing hematopoietic progenitor cell engraftment using mesenchymal stem cells |
US5811094A (en) | 1990-11-16 | 1998-09-22 | Osiris Therapeutics, Inc. | Connective tissue regeneration using human mesenchymal stem cell preparations |
WO1992014455A1 (en) | 1991-02-14 | 1992-09-03 | The Rockefeller University | METHOD FOR CONTROLLING ABNORMAL CONCENTRATION TNF α IN HUMAN TISSUES |
US5744361A (en) | 1991-04-09 | 1998-04-28 | Indiana University | Expansion of human hematopoietic progenitor cells in a liquid medium |
US5750376A (en) | 1991-07-08 | 1998-05-12 | Neurospheres Holdings Ltd. | In vitro growth and proliferation of genetically modified multipotent neural stem cells and their progeny |
JPH07502404A (ja) | 1991-12-23 | 1995-03-16 | ブリティッシュ バイオ−テクノロジー リミテッド | 幹細胞阻害タンパク質 |
US6120735A (en) | 1992-02-26 | 2000-09-19 | The Ohio States University | Fractional cell sorter |
AU685743B2 (en) * | 1992-03-04 | 1998-01-29 | Regents Of The University Of Michigan, The | Methods, compositions and devices for maintaining and growing human stem and/or hematopoietic cells |
WO1993020228A1 (en) | 1992-03-31 | 1993-10-14 | Toray Industries, Inc. | Novel, physiologically active protein and hemopoietic stem cell growth promoter |
US5460964A (en) | 1992-04-03 | 1995-10-24 | Regents Of The University Of Minnesota | Method for culturing hematopoietic cells |
AU4543193A (en) | 1992-06-22 | 1994-01-24 | Henry E. Young | Scar inhibitory factor and use thereof |
US5849553A (en) | 1992-07-27 | 1998-12-15 | California Institute Of Technology | Mammalian multipotent neural stem cells |
US5672346A (en) | 1992-07-27 | 1997-09-30 | Indiana University Foundation | Human stem cell compositions and methods |
US5928947A (en) | 1992-07-27 | 1999-07-27 | California Institute Of Technology | Mammalian multipotent neural stem cells |
AU5603894A (en) | 1992-11-16 | 1994-06-08 | Applied Immune Sciences, Inc. | Pluripotential quiescent stem cell population |
US5772992A (en) | 1992-11-24 | 1998-06-30 | G.D. Searle & Co. | Compositions for co-administration of interleukin-3 mutants and other cytokines and hematopoietic factors |
JPH08510997A (ja) | 1993-03-31 | 1996-11-19 | プロ−ニューロン,インコーポレイテッド | 幹細胞増殖インヒビターおよびその使用 |
GB9308271D0 (en) | 1993-04-21 | 1993-06-02 | Univ Edinburgh | Method of isolating and/or enriching and/or selectively propagating pluripotential animal cells and animals for use in said method |
US5709854A (en) | 1993-04-30 | 1998-01-20 | Massachusetts Institute Of Technology | Tissue formation by injecting a cell-polymeric solution that gels in vivo |
US5599705A (en) | 1993-11-16 | 1997-02-04 | Cameron; Robert B. | In vitro method for producing differentiated universally compatible mature human blood cells |
US5591625A (en) | 1993-11-24 | 1997-01-07 | Case Western Reserve University | Transduced mesenchymal stem cells |
US6288030B1 (en) | 1993-12-22 | 2001-09-11 | Amgen Inc. | Stem cell factor formulations and methods |
US6001654A (en) | 1994-01-28 | 1999-12-14 | California Institute Of Technology | Methods for differentiating neural stem cells to neurons or smooth muscle cells using TGT-β super family growth factors |
US5942496A (en) | 1994-02-18 | 1999-08-24 | The Regent Of The University Of Michigan | Methods and compositions for multiple gene transfer into bone cells |
JPH09510108A (ja) | 1994-03-14 | 1997-10-14 | クリオライフ,インコーポレイティド | 移植用処理組織及び調製方法 |
DE4422667A1 (de) | 1994-06-30 | 1996-01-04 | Boehringer Ingelheim Int | Verfahren zur Herstellung und Züchtung hämatopoetischer Vorläuferzellen |
US6103522A (en) | 1994-07-20 | 2000-08-15 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Human marrow stromal cell lines which sustain hematopoiesis |
US5516532A (en) | 1994-08-05 | 1996-05-14 | Children's Medical Center Corporation | Injectable non-immunogenic cartilage and bone preparation |
US5914268A (en) | 1994-11-21 | 1999-06-22 | National Jewish Center For Immunology & Respiratory Medicine | Embryonic cell populations and methods to isolate such populations |
US5789147A (en) | 1994-12-05 | 1998-08-04 | New York Blood Center, Inc. | Method for concentrating white cells from whole blood by adding a red cell sedimentation reagent to whole anticoagulated blood |
US5736396A (en) | 1995-01-24 | 1998-04-07 | Case Western Reserve University | Lineage-directed induction of human mesenchymal stem cell differentiation |
US6011000A (en) | 1995-03-03 | 2000-01-04 | Perrine; Susan P. | Compositions for the treatment of blood disorders |
US5906934A (en) | 1995-03-14 | 1999-05-25 | Morphogen Pharmaceuticals, Inc. | Mesenchymal stem cells for cartilage repair |
US5716616A (en) | 1995-03-28 | 1998-02-10 | Thomas Jefferson University | Isolated stromal cells for treating diseases, disorders or conditions characterized by bone defects |
US5925567A (en) | 1995-05-19 | 1999-07-20 | T. Breeders, Inc. | Selective expansion of target cell populations |
US5908782A (en) | 1995-06-05 | 1999-06-01 | Osiris Therapeutics, Inc. | Chemically defined medium for human mesenchymal stem cells |
AU6223296A (en) | 1995-06-07 | 1996-12-30 | Novartis Ag | Methods for obtaining compositions enriched for hematopoieti c stem cells and antibodies for use therein |
US5654381A (en) | 1995-06-16 | 1997-08-05 | Massachusetts Institute Of Technology | Functionalized polyester graft copolymers |
US5877299A (en) | 1995-06-16 | 1999-03-02 | Stemcell Technologies Inc. | Methods for preparing enriched human hematopoietic cell preparations |
US5858782A (en) | 1995-11-13 | 1999-01-12 | Regents Of The University Of Michigan | Functional human hematopoietic cells |
WO1997018298A1 (en) | 1995-11-14 | 1997-05-22 | Regents Of The University Of Minnesota | Ex vivo culture of stem cells |
EP0868505B1 (en) | 1995-11-16 | 2005-02-02 | Case Western Reserve University | In vitro chondrogenic induction of human mesenchymal stem cells |
JP2000507812A (ja) * | 1996-03-12 | 2000-06-27 | ライフ テクノロジーズ,インコーポレイテッド | 造血細胞培養栄養補充成分 |
US5716794A (en) | 1996-03-29 | 1998-02-10 | Xybernaut Corporation | Celiac antigen |
US5919176A (en) | 1996-05-14 | 1999-07-06 | Children's Hospital Medical Center Of Northern California | Apparatus and method for collecting blood from an umbilical cord |
US5827740A (en) | 1996-07-30 | 1998-10-27 | Osiris Therapeutics, Inc. | Adipogenic differentiation of human mesenchymal stem cells |
US5916202A (en) | 1996-08-30 | 1999-06-29 | Haswell; John N. | Umbilical cord blood collection |
US6227202B1 (en) | 1996-09-03 | 2001-05-08 | Maulana Azad Medical College | Method of organogenesis and tissue regeneration/repair using surgical techniques |
US5969105A (en) | 1996-10-25 | 1999-10-19 | Feng; Yiqing | Stem cell factor receptor agonists |
US5968820A (en) | 1997-02-26 | 1999-10-19 | The Cleveland Clinic Foundation | Method for magnetically separating cells into fractionated flow streams |
US6152142A (en) | 1997-02-28 | 2000-11-28 | Tseng; Scheffer C. G. | Grafts made from amniotic membrane; methods of separating, preserving, and using such grafts in surgeries |
US6231880B1 (en) | 1997-05-30 | 2001-05-15 | Susan P. Perrine | Compositions and administration of compositions for the treatment of blood disorders |
US6077708A (en) | 1997-07-18 | 2000-06-20 | Collins; Paul C. | Method of determining progenitor cell content of a hematopoietic cell culture |
US5879318A (en) | 1997-08-18 | 1999-03-09 | Npbi International B.V. | Method of and closed system for collecting and processing umbilical cord blood |
US5968829A (en) | 1997-09-05 | 1999-10-19 | Cytotherapeutics, Inc. | Human CNS neural stem cells |
US6093531A (en) | 1997-09-29 | 2000-07-25 | Neurospheres Holdings Ltd. | Generation of hematopoietic cells from multipotent neural stem cells |
US6248587B1 (en) | 1997-11-26 | 2001-06-19 | University Of Southern Cailfornia | Method for promoting mesenchymal stem and lineage-specific cell proliferation |
US6059968A (en) | 1998-01-20 | 2000-05-09 | Baxter International Inc. | Systems for processing and storing placenta/umbilical cord blood |
US6300314B1 (en) | 1998-05-04 | 2001-10-09 | Point Therapeutics, Inc. | Hematopoietic stimulation |
PT1084230E (pt) | 1998-06-08 | 2008-01-25 | Osiris Therapeutics Inc | Regulação da diferenciação de células estaminais hematopoiéticas através da utilização de células estaminais mesenquimatosas humanas |
WO1999067360A2 (en) * | 1998-06-25 | 1999-12-29 | Hemosol Inc. | Media and methods for expansion of erythroid stem cells for the production of hemoglobin |
US5958767A (en) | 1998-08-14 | 1999-09-28 | The Children's Medical Center Corp. | Engraftable human neural stem cells |
JP3517359B2 (ja) | 1998-09-14 | 2004-04-12 | テルモ株式会社 | 細胞分離・回収装置および細胞の分離・回収方法 |
US6184035B1 (en) | 1998-11-18 | 2001-02-06 | California Institute Of Technology | Methods for isolation and activation of, and control of differentiation from, skeletal muscle stem or progenitor cells |
US6328765B1 (en) | 1998-12-03 | 2001-12-11 | Gore Enterprise Holdings, Inc. | Methods and articles for regenerating living tissue |
IN191359B (ja) | 1999-04-20 | 2003-11-29 | Nat Inst Immunology | |
US7629360B2 (en) | 1999-05-07 | 2009-12-08 | Celgene Corporation | Methods for the treatment of cachexia and graft v. host disease |
US6467630B1 (en) | 1999-09-03 | 2002-10-22 | The Cleveland Clinic Foundation | Continuous particle and molecule separation with an annular flow channel |
WO2001051928A1 (en) | 2000-01-12 | 2001-07-19 | Ventana Medical Systems, Inc. | Method for quantitating a protein by image analysis |
WO2001075094A1 (en) | 2000-04-04 | 2001-10-11 | Thomas Jefferson University | Application of myeloid-origin cells to the nervous system |
US6455306B1 (en) | 2000-06-09 | 2002-09-24 | Transcyte, Inc. | Transfusable oxygenating composition |
WO2002059285A1 (en) | 2000-10-27 | 2002-08-01 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Methods for immortalizing cells |
US7311905B2 (en) | 2002-02-13 | 2007-12-25 | Anthrogenesis Corporation | Embryonic-like stem cells derived from post-partum mammalian placenta, and uses and methods of treatment using said cells |
US20080152629A1 (en) | 2000-12-06 | 2008-06-26 | James Edinger | Placental stem cell populations |
EP1349918B1 (en) | 2000-12-06 | 2014-08-06 | Anthrogenesis Corporation | Method of collecting placental stem cells |
ES2522526T3 (es) | 2001-02-14 | 2014-11-14 | Anthrogenesis Corporation | Placenta post-parto de mamíferos, su uso y células troncales placentarias de la misma |
CA2856986C (en) | 2001-02-14 | 2019-08-13 | Anthrogenesis Corporation | Post-partum mammalian placental stem cells for use in the treatment of neurological or renal diseases and disorders |
US20020132343A1 (en) | 2001-03-19 | 2002-09-19 | Clark Lum | System and method for delivering umbilical cord-derived tissue-matched stem cells for transplantation |
WO2003018780A1 (en) | 2001-08-27 | 2003-03-06 | Advanced Cell Technology, Inc. | De-differentiation and re-differentiation of somatic cells and production of cells for cell therapies |
EP1442115B9 (en) | 2001-11-15 | 2009-12-16 | Children's Medical Center Corporation | Methods of isolation, expansion and differentiation of fetal stem cells from chorionic villus, amniotic fluid, and placenta and therapeutic uses thereof |
US7799324B2 (en) | 2001-12-07 | 2010-09-21 | Geron Corporation | Using undifferentiated embryonic stem cells to control the immune system |
MXPA04007732A (es) | 2002-02-13 | 2004-10-15 | Anthrogenesis Corp | Celulas madre similares a las embrionarias, derivadas de la placenta de mamiferos despues del parto y usos y metodos de tratamiento usando dichas celulas. |
US20030187515A1 (en) | 2002-03-26 | 2003-10-02 | Hariri Robert J. | Collagen biofabric and methods of preparing and using the collagen biofabric |
JP2005536189A (ja) | 2002-04-12 | 2005-12-02 | セルジーン・コーポレーション | 血管新生のモジュレーターの同定方法、それにより見出された化合物および該化合物を使用する治療方法 |
US7498171B2 (en) | 2002-04-12 | 2009-03-03 | Anthrogenesis Corporation | Modulation of stem and progenitor cell differentiation, assays, and uses thereof |
US20050118715A1 (en) | 2002-04-12 | 2005-06-02 | Hariri Robert J. | Modulation of stem and progenitor cell differentiation, assays, and uses thereof |
WO2003102151A2 (en) | 2002-05-30 | 2003-12-11 | Celgene Corporation | Modulating cell differentiation and treating myeloprolifertive disorders with jnk/mkk inhibitors |
CN1717177A (zh) | 2002-11-26 | 2006-01-04 | 人类起源公司 | 细胞治疗剂、细胞治疗单元及其用于治疗的方法 |
CN1770976A (zh) | 2003-02-13 | 2006-05-10 | 人类起源公司 | 利用脐带血治疗患有疾病、紊乱或状况的个体的用途 |
EP1625220A2 (en) | 2003-05-01 | 2006-02-15 | MUSC Foundation For Research Development | An autologous upregulation mechanism allowing optimized cell type-specific and regulated gene expression cells |
CN1913896B (zh) | 2003-12-02 | 2010-12-01 | 细胞基因公司 | 用于治疗和控制血红蛋白病和贫血病的方法和组合物 |
US20050266391A1 (en) | 2004-01-15 | 2005-12-01 | Bennett Brydon L | Methods for preserving tissue |
EP2298862B1 (en) | 2004-03-22 | 2017-08-30 | Mesoblast International Sàrl | Mesenchymal stem cells and uses therefor |
NZ550027A (en) | 2004-03-26 | 2009-03-31 | Celgene Corp | Systems and methods for providing a stem cell bank |
EP1735429A4 (en) * | 2004-03-31 | 2008-06-11 | Newlink Genetics Corp | METHOD AND COMPOSITIONS FOR OBTAINING EMBRYONAL STEM CELLS OF ABSTINENT HEMATOPOETIC STEM CELLS AND USES THEREOF |
US7244759B2 (en) | 2004-07-28 | 2007-07-17 | Celgene Corporation | Isoindoline compounds and methods of making and using the same |
US7909806B2 (en) | 2004-09-23 | 2011-03-22 | Anthrogenesis Corporation | Cord blood and placenta collection kit |
US7147626B2 (en) | 2004-09-23 | 2006-12-12 | Celgene Corporation | Cord blood and placenta collection kit |
US7850960B2 (en) | 2004-12-30 | 2010-12-14 | University Of Washington | Methods for regulation of stem cells |
CN101237898A (zh) | 2005-06-10 | 2008-08-06 | 细胞基因公司 | 人胎盘胶原组合物、其制备方法、使用方法以及包含该组合物的试剂盒 |
EP1901789A2 (en) | 2005-06-30 | 2008-03-26 | Anthrogenesis Corporation | Repair of tympanic membrane using placenta derived collagen biofabric |
EP1919365A2 (en) | 2005-07-13 | 2008-05-14 | Anthrogenesis Corporation | Ocular plug formed from placenta derived collagen biofabric |
EP1919500A2 (en) | 2005-07-13 | 2008-05-14 | Anthrogenesis Corporation | Treatment of leg ulcers using placenta derived collagen biofabric |
WO2007047465A1 (en) | 2005-10-13 | 2007-04-26 | Anthrogenesis Corporation | Production of oligodendrocytes from placenta-derived stem cells |
PE20070771A1 (es) | 2005-10-13 | 2007-08-11 | Anthrogenesis Corp | Inmunomodulacion mediante el uso de celulas madres de la placenta |
US20070122880A1 (en) | 2005-10-19 | 2007-05-31 | Institut Curie | Vector for the inducible expression of gene sequences |
CA2633775A1 (en) | 2005-12-29 | 2007-07-12 | Anthrogenesis Corporation | Co-culture of placental stem cells and stem cells from a second source |
KR20080097190A (ko) | 2005-12-29 | 2008-11-04 | 안트로제네시스 코포레이션 | 태반 줄기세포의 수집과 보존을 위한 개선된 조성물과 이조성물의 이용 방법 |
EP2471904B1 (en) | 2005-12-29 | 2018-10-24 | Celularity, Inc. | Placental stem cell populations |
EP2377925A1 (en) | 2006-04-14 | 2011-10-19 | Advanced Cell Technology, Inc. | Hemangio-colony forming cells |
US20110190166A1 (en) * | 2006-05-26 | 2011-08-04 | Susan Wong | Erythroid progenitor cells and methods for producing parvovirus b19 therein |
US20080044848A1 (en) | 2006-06-09 | 2008-02-21 | Heidaran Mohammad A | Placental niche and use thereof to culture stem cells |
US7993918B2 (en) | 2006-08-04 | 2011-08-09 | Anthrogenesis Corporation | Tumor suppression using placental stem cells |
US8105634B2 (en) | 2006-08-15 | 2012-01-31 | Anthrogenesis Corporation | Umbilical cord biomaterial for medical use |
WO2008042441A1 (en) | 2006-10-03 | 2008-04-10 | Anthrogenesis Corporation | Use of umbilical cord biomaterial for ocular surgery |
US8071135B2 (en) | 2006-10-04 | 2011-12-06 | Anthrogenesis Corporation | Placental tissue compositions |
EP2664341A3 (en) | 2006-10-06 | 2014-01-08 | Anthrogenesis Corporation | Native (telopeptide) placental collagen compositions |
PL2084268T3 (pl) | 2006-10-23 | 2019-08-30 | Celularity, Inc. | Sposoby i kompozycje do leczenia ubytków kości z użyciem populacji komórek łożyska |
CN101688177A (zh) | 2007-02-12 | 2010-03-31 | 人类起源公司 | 来自贴壁胎盘干细胞的肝细胞和软骨细胞;以及cd34+、cd45-胎盘干细胞富集的细胞群 |
NZ597779A (en) | 2007-02-12 | 2013-07-26 | Anthrogenesis Corp | Treatment of inflammatory diseases using placental stem cells |
US20100172830A1 (en) | 2007-03-29 | 2010-07-08 | Cellx Inc. | Extraembryonic Tissue cells and method of use thereof |
AU2008305516A1 (en) | 2007-09-26 | 2009-04-02 | Anthrogenesis Corporation | Angiogenic cells from human placental perfusate |
SI2203176T1 (sl) | 2007-09-28 | 2015-04-30 | Anthrogenesis Corporation | Tumorska supresija z uporabo humanega perfuzata placente in intermediarnih naravnih celic ubijalk, pridobljenih iz humane placente |
RU2010123002A (ru) | 2007-11-07 | 2011-12-20 | Антродженезис Корпорейшн (Us) | Лечение осложнений преждевременных родов |
US8828376B2 (en) | 2008-08-20 | 2014-09-09 | Anthrogenesis Corporation | Treatment of stroke using isolated placental cells |
NZ591292A (en) | 2008-08-20 | 2012-10-26 | Anthrogenesis Corp | Improved cell composition and methods of making the same |
US8728805B2 (en) | 2008-08-22 | 2014-05-20 | Anthrogenesis Corporation | Methods and compositions for treatment of bone defects with placental cell populations |
RU2015130665A (ru) | 2008-11-19 | 2018-12-24 | Антродженезис Корпорейшн | Амниотические адгезивные клетки |
CA2743573C (en) | 2008-11-21 | 2021-04-27 | Anthrogenesis Corporation | Treatment of diseases, disorders or conditions of the lung using placental cells |
WO2010141654A1 (en) | 2009-06-05 | 2010-12-09 | Anthrogenesis Corporation | Improved method of collecting placental cells |
MX353489B (es) | 2009-07-02 | 2018-01-16 | Anthrogenesis Corp | Metodo para producir eritrocitos sin celulas alimentadoras. |
WO2011094181A1 (en) | 2010-01-26 | 2011-08-04 | Anthrogenesis Corporation | Treatment of bone-related cancers using placental stem cells |
US20110280849A1 (en) | 2010-03-26 | 2011-11-17 | Anthrogenesis Corporation | Tumor suppression using human placenta-derived intermediate natural killer cells and immunomodulatory compounds |
PT2556145T (pt) | 2010-04-07 | 2016-10-25 | Anthrogenesis Corp | Angiogénese usando células estaminais placentárias |
WO2011127113A1 (en) | 2010-04-08 | 2011-10-13 | Anthrogenesis Corporation | Treatment of sarcoidosis using placental stem cells |
JP5996533B2 (ja) | 2010-07-13 | 2016-09-21 | アントフロゲネシス コーポレーション | ナチュラルキラー細胞を生成させる方法 |
US20120171161A1 (en) | 2010-12-30 | 2012-07-05 | Sascha Abramson | Compositions comprising placental stem cells and platelet rich plasma, and methods of use thereof |
US20120171180A1 (en) | 2010-12-30 | 2012-07-05 | Sascha Abramson | Compositions comprising amnion derived adherent cells and platelet-rich plasma |
CA2823540A1 (en) | 2010-12-30 | 2012-07-05 | Anthrogenesis Corporation | Methods for cryopreserving and encapsulating cells |
WO2012092485A1 (en) | 2010-12-31 | 2012-07-05 | Anthrogenesis Corporation | Enhancement of placental stem cell potency using modulatory rna molecules |
AU2012262273B2 (en) | 2011-06-01 | 2017-09-14 | Celularity Inc. | Treatment of pain using placental stem cells |
-
2010
- 2010-07-01 MX MX2013012849A patent/MX353489B/es unknown
- 2010-07-01 CA CA2767014A patent/CA2767014C/en active Active
- 2010-07-01 US US12/829,326 patent/US8586360B2/en active Active
- 2010-07-01 EP EP16201418.7A patent/EP3190179A1/en not_active Withdrawn
- 2010-07-01 AU AU2010266263A patent/AU2010266263B2/en not_active Ceased
- 2010-07-01 EP EP10730018A patent/EP2449095A1/en not_active Withdrawn
- 2010-07-01 NZ NZ619359A patent/NZ619359A/en unknown
- 2010-07-01 JP JP2012518604A patent/JP2012531916A/ja active Pending
- 2010-07-01 NZ NZ597436A patent/NZ597436A/en unknown
- 2010-07-01 AR ARP100102362A patent/AR077369A1/es active IP Right Grant
- 2010-07-01 WO PCT/US2010/040707 patent/WO2011002959A1/en active Application Filing
- 2010-07-01 MX MX2012000110A patent/MX2012000110A/es active IP Right Grant
-
2011
- 2011-12-28 IL IL217257A patent/IL217257A/en active IP Right Grant
-
2012
- 2012-01-03 ZA ZA2012/00031A patent/ZA201200031B/en unknown
-
2013
- 2013-10-11 US US14/052,524 patent/US9255248B2/en active Active
-
2015
- 2015-02-02 ZA ZA2015/00754A patent/ZA201500754B/en unknown
- 2015-04-07 JP JP2015078743A patent/JP2015146816A/ja active Pending
- 2015-12-22 US US14/979,327 patent/US10041043B2/en active Active
-
2016
- 2016-08-12 AU AU2016213843A patent/AU2016213843A1/en not_active Abandoned
- 2016-09-23 JP JP2016186243A patent/JP2017038603A/ja active Pending
-
2017
- 2017-12-19 IL IL256430A patent/IL256430A/en unknown
-
2018
- 2018-05-10 AR ARP180101236A patent/AR111785A2/es unknown
- 2018-05-23 JP JP2018098578A patent/JP2018148913A/ja active Pending
- 2018-09-18 AU AU2018232905A patent/AU2018232905A1/en not_active Abandoned
-
2020
- 2020-07-30 JP JP2020129086A patent/JP2020182494A/ja not_active Withdrawn
-
2021
- 2021-04-28 AU AU2021202607A patent/AU2021202607A1/en not_active Abandoned
-
2022
- 2022-05-18 JP JP2022081214A patent/JP2022110097A/ja active Pending
-
2023
- 2023-10-16 AU AU2023251392A patent/AU2023251392A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
IL217257A (en) | 2017-12-31 |
MX2012000110A (es) | 2012-04-02 |
US20160362659A1 (en) | 2016-12-15 |
AR111785A2 (es) | 2019-08-21 |
US20110003387A1 (en) | 2011-01-06 |
US8586360B2 (en) | 2013-11-19 |
AU2018232905A1 (en) | 2018-10-04 |
IL217257A0 (en) | 2012-02-29 |
CA2767014A1 (en) | 2011-01-06 |
EP3190179A1 (en) | 2017-07-12 |
JP2017038603A (ja) | 2017-02-23 |
ZA201500754B (en) | 2021-07-28 |
NZ597436A (en) | 2014-08-29 |
US10041043B2 (en) | 2018-08-07 |
EP2449095A1 (en) | 2012-05-09 |
NZ619359A (en) | 2015-07-31 |
US9255248B2 (en) | 2016-02-09 |
JP2022110097A (ja) | 2022-07-28 |
MX353489B (es) | 2018-01-16 |
AU2010266263B2 (en) | 2016-05-19 |
AU2023251392A1 (en) | 2023-11-02 |
JP2012531916A (ja) | 2012-12-13 |
AU2021202607A1 (en) | 2021-05-27 |
AR077369A1 (es) | 2011-08-24 |
IL256430A (en) | 2018-02-28 |
JP2018148913A (ja) | 2018-09-27 |
CA2767014C (en) | 2022-01-25 |
WO2011002959A1 (en) | 2011-01-06 |
AU2016213843A1 (en) | 2016-09-01 |
AU2010266263A1 (en) | 2012-02-02 |
US20140256042A1 (en) | 2014-09-11 |
JP2015146816A (ja) | 2015-08-20 |
ZA201200031B (en) | 2015-04-29 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2020182494A (ja) | 支持細胞を用いない赤血球の生産方法 | |
CN109536446B (zh) | 单核细胞增殖剂、单核细胞增殖用培养基、及单核细胞的制造方法 | |
US20190194620A1 (en) | Human Extensively Self-Renewing Erythroblasts (ESRE) | |
EP1366144A2 (en) | A device for preparing cells | |
US20210032596A1 (en) | Method of producing erythrocytes | |
WO2008056963A1 (en) | Method for proliferating stem cells with leptin | |
US20220127577A1 (en) | Xeno-free generation of tissue-specific progenitor cells | |
US20080311625A1 (en) | Immortal Pluripotent Stem Cell Line, Cell Lines Derived Therefrom, Methods of Preparing Thereof and Their Uses | |
Bany-Laszewicz et al. | The activity of alpha1, 6-fucosyltransferase during human megakaryocytic differentiation | |
US20210254010A1 (en) | Isolation of Mesenchymal Stromal Cells | |
JPH11180877A (ja) | 巨核球前駆細胞を含む細胞製剤及びその製造方法 | |
Summers | Identification, isolation and ex vivo expansion of haemopoietic progenitor and stem cells |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200826 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20200826 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20210629 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20210927 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20211217 |
|
A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20211217 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20220119 |
|
C60 | Trial request (containing other claim documents, opposition documents) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C60 Effective date: 20220518 |
|
C116 | Written invitation by the chief administrative judge to file amendments |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C116 Effective date: 20220531 |
|
C22 | Notice of designation (change) of administrative judge |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C22 Effective date: 20220531 |
|
A761 | Written withdrawal of application |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A761 Effective date: 20220624 |