JP2020153862A - マイクロ流体チップ及び測定方法 - Google Patents

Abstract

【課題】マイクロ流体チップで検量線を描画するプロセスが煩雑である。また、免疫染色法や免疫測定法において、試料間で起こりうる温度等の反応条件の違い、人為的な誤差による影響が懸念される。【解決手段】本発明で提案するマイクロ流体チップは、検量線作成のための標準液を貯留する複数のウェルを有する検量線用流路を備えており、前記複数のウェルの深さを変化させることで所望の検量線を容易に描画することができる。【選択図】図１

Description

本開示は、試料の測定に用いるマイクロ流体チップに関する。

近年、労働安全衛生法により、ストレスチェック制度が義務化され、客観的なストレスチェック方法が必要になると考えられる。内分泌系のストレス応答として、精神的なストレス刺激は大脳皮質及び大脳辺縁系を経由して視床下部−脳下垂体−副腎皮質系（ＨＰＡ（Hypothalamic-pituitary-adrenal axis）系）によりストレスマーカー（コルチゾール等）が血液中へ分泌される。唾液や毛髪中にも血液中のストレスマーカーが移動して蓄積する事が知られている。

客観的なストレスチェック方法として、内分泌系及び自律神経系のストレス応答を分析する手法がある。例えば、唾液や毛髪等を試料として免疫測定法や液体クロマトグラフィーによってストレスマーカーを定量できることが知られている。

特許文献１では、複数の反応流路部のチャネルで反応を起こしたのち１か所の検出点で各チャネルの分析結果を測ることができる酵素免疫分析チップが開示されている。

本発明で提案するマイクロ流体チップは、ストレスマーカーの測定に限定されず、各種タンパク質（アルブミン、腫瘍マーカー（ＣＫ１８等）、アミロイドβ等）を測定する用途にも用いることが可能である。

国際公開第２００３／０６２８２３号

しかしながら、従来の測定方法では、検量線を作成するために蛍光物質を含む異なる濃度の溶液を用意する必要があり、作製した複数の濃度の蛍光物質を含む溶液をそれぞれ手作業で注入する必要がある等、手間がかかるという問題がある。

また、免疫染色法及び免疫測定法において、各試料間で、温度などの反応条件の違い、人為的な誤差等が発生するという問題が有る。

本開示の一態様は、検量線作成の手間を削減することができるマイクロ流体チップを実現することを目的とする。

上記の課題を解決するために、本開示の一態様に係るマイクロ流体チップは、検量線作成のための標準液を貯留する複数のウェルを有する検量線用流路を備え、前記複数のウェルの深さは、それぞれ異なっている。

本開示の一態様によれば、検量線作成の手間を削減することができる。

また、免疫染色法及び免疫測定法において、各試料間で、温度などの反応条件の違い、人為的な誤差等が低減する事ができる。

本開示の実施形態１に係る流体チップの構成を示す平面図である。 図１における流体チップのＡ‐Ａ’線矢視断面図である。 図１における流体チップのＢ‐Ｂ’線矢視断面図である。 試料の移動を制限する制限構造の変形例を示す断面図である。 ウェルを複数設けた場合の試料用流路の断面図である。 複数の供給口を備える試料用流路の構成を示す平面図である。 図６におけるＣ‐Ｃ’線矢視断面図である。 検量線用流路を備える流体チップの断面図である。 検量線用流路を用いた場合に作成できる検量線を説明するための図である。 （ａ）は、検量線用流路３を複数備えた流体チップの構成を示す平面図であり、（ｂ）は、（ａ）において破線で示す観察領域を拡大した図である。 流路の分岐構造を有する流体チップの構成を示す平面図である。 試料用流路側の弁の構造を示すＤ‐Ｄ’線矢視断面図である。（ａ）は、エア流路６１内に空気が供給されていない、低圧状態を示す図であり、（ｂ）は、エア流路６１内に空気が供給されている、高圧状態を示す図である。 分岐点を複数有する流体チップの構成を示す平面図である。 （ａ）は、流体チップを用いてＥＬＩＳＡ（Enzyme linked immunosorbent assay）法（サンドイッチ法）によって試料を検出する方法を示すに係る断面図であり、（ｂ）は、サンドイッチ法における抗原濃度と吸光度の関係を示す検量線のグラフである。 （ａ）は、流体チップを用いてＥＬＩＳＡ法（競合法）によって試料を検出する方法を示す断面図であり、（ｂ）は、競合法における抗原濃度と吸光度の関係を示す検量線のグラフである。 図１０に示した流体チップが備える検量線用流路を光学顕微鏡で観察したときの写真を示す図である。 流体チップが備える検量線用流路を走査型顕微鏡で観察したときの写真を示す図である。 図１７に示す検量線用流路が有するウェル３３を走査型電子顕微鏡で観察したときの写真を示す図である。 図１６から図１７に示した検量線用流路に蛍光物質を含む標準液を流し、蛍光観察したときの写真を示す図である。 図１９に示す蛍光観察の結果を示すグラフである。 蛍光体に吸収された光強度の侵入距離依存性を示すグラフである。

〔実施形態１〕
＜流体チップ１の構成＞
以下、本開示の一実施形態について、詳細に説明する。本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ〜Ｂ」は、「Ａ以上Ｂ以下」を意味する。図１は、流体チップ１の構成を示す平面図である。図１に示すように、流体チップ１は、試料用流路２と検量線用流路３とを備えたマイクロ流体チップである。なお、試料用流路２と検量線用流路３とは、共通の基板に形成されている必要はなく、それぞれが別の基板に形成されていてもよい。すなわち、流体チップ１は、試料用流路２が形成された流体チップと、検量線用流路３が形成された流体チップとのセットであってもよい。

図２は、図１における流体チップ１のＡ‐Ａ’線矢視断面図である。図１及び図２に示すように、試料用流路２は、試料５０に含まれる測定対象物質の蛍光測定を行うための流路であり、試料５０の移動を制限する制限構造としてのウェル（凹部）２３または突起部２５を少なくとも１つ有している。ウェル２３は、下面基板８に形成されている。

この試料用流路２は、試料５０を含む液体を供給するための供給口２１、及び当該液体を排出する排出口２４を有している。上面基板７と下面基板８との間の隙間として流路２２が形成されており、流路２２によって供給口２１と排出口２４とが連通されている。

試料５０を含む液体を供給口２１から供給すると、試料５０はウェル２３に溜り、その他の液体は、突起部２５と上面基板７との間の隙間２７を通って下流へ流れ、排出口２４から排出される。試料５０を洗浄する溶液についても同様に供給口２１から供給され、排出口２４から排出されるが、試料５０はウェル２３に溜ることができる。隙間２７の高さは、液体を流しつつ試料５０が流出しないよう、試料５０の短軸（例えば、体毛の直径）よりも狭くなっている。突起部２５を形成することにより試料５０の移動をより確実に制限できるが、突起部２５は必須ではなく、省略可能である。

試料５０は、例えば毛髪、髭等の体毛であり、測定対象物質は、例えばコルチゾールをはじめとするストレスマーカーである。毛髪中のストレスマーカーの定量は、免疫染色法によって行うことができる。

検量線用流路３は、検量線を作成するための、既知の濃度の測定対象物質を含む標準液の蛍光測定を行うための流路であり、図１に示すように、標準液を貯留する複数のウェル３３（３３ａ〜ｃ）を有している。検量線用流路３が有するウェル３３の数は、複数あれば、３つに限定されるものではない。

試料５０が毛髪である場合、毛髪断面内に局在するストレスマーカーの蛍光強度とウェル３３の蛍光強度とを比較するため、ウェル３３の直径は、５〜４０μｍであることが好ましい。

この検量線用流路３は、標準液を供給するための供給口３１、及び過剰な標準液を排出する排出口３４を有している。

標準液に含まれる蛍光物質は、蛍光波長が３６０〜８３０ｎｍ、より好ましくは視感度の高い４９５〜５７０ｎｍの蛍光波長を有する蛍光物質（Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 555等）を使用する。また、測定機器、例えば、ＣＣＤ（charge-coupled device）カメラなどで観察するとき、ＣＣＤカメラの感度の波長依存性において、感度の良い波長領域の蛍光を発する蛍光物質を選択することが好ましい。

なお、本開示に係る流体チップ１は、再利用することも可能である。流体チップ１を再利用する場合、洗浄液で流体チップ１を洗浄しても構わない。また、Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｓ、またはＱｕｅｎｃｈｅｒｓ等の消光物質により蛍光を消光することも可能である。

図３は、図１における流体チップ１のＢ‐Ｂ’線矢視断面図である。図１及び図３に示すように、上面基板７と下面基板８との間の隙間として流路３２が形成されており、流路３２によって供給口３１と排出口３４とが連通されている。また、検量線用流路３が有する複数のウェル３３（３３ａ〜ｃ）は、下面基板８に形成されており、それぞれ深さが異なっている。流体チップ１の製造工程において、ウェル３３ａ〜ｃの深さは１〜５００μｍ、より好ましくは１〜１００μｍの間で調節が可能である。各ウェル３３ａ〜ｃには、異なる量の標準液が貯留される。そのため、蛍光観察した場合に、ウェル３３ａ〜ｃに貯留された標準液の量に依存した蛍光強度が得られ、これら複数の蛍光強度を用いて検量線を作成できる。

また、流体チップ１の製造工程において、ウェル３３の深さを適宜変更してもよい。例えば１ｎｇ／ｍｌの精度を求める場合、ウェル３３の深さを２０μｍごとに調節し、０．１ｎｇ／ｍｌの精度を求める場合は、ウェル３３の深さを２μｍごとに調節してもよい。

なお、試料５０に含まれる測定対象物質を蛍光測定ではなく、化学発光する物質または比色測定に用いる色素等を利用して測定する場合には、検量線用流路３に供給される標準液は、蛍光物質を含むものに限定されず、当該測定対象物質の測定に用いる物質等を含んでいてもよい。すなわち、ウェル３３ａ〜ｃに貯留された標準液の量に依存した測定結果が得られるのであれば、標準液の種類は特に限定されない。

また、上面視したときのウェル３３ａ〜ｃの大きさが同一であり、また、ウェル３３ａ〜ｃの深さは、検量線を作成するための標準液が流れる方向に沿って単調に増加または減少する事が好ましい。

ウェルの深さが単調に増加する場合、ウェル３３ａ〜ｃに貯留される標準液の量も単調に増加し、当該構成により、標準液が流れる方向に沿ってウェル３３ａ〜ｃにおける蛍光強度は大きくなる。従って、検量線の作成がより簡便になる。

図１に示すように、流体チップ１を平面視したときのウェル３３及びウェル２３の大きさは、特に限定されるものではなく、蛍光測定を行うことが可能であれば構わない。また、ウェル３３ａ〜ｃ及びウェル２３が蛍光顕微鏡による観察で同一の視野の中に収まる事が好ましい。同一視野内に収まる場合、全てのウェル３３ａ〜ｃ及びウェル２３の蛍光強度を精度よく測定する事ができるためである。

ウェル３３ａ〜ｃ及びウェル２３は、観察領域４の範囲内に位置している。観察領域４の大きさは、測定に使用する顕微鏡の倍率によって異なるが、５倍の対物レンズを使用する場合、観察領域４は、上面視したときの面積が凡そ１７００μｍ×１３００μｍの領域内に位置していることが好ましい。当該対物レンズの倍率が１０倍であれば、観察領域４の範囲は８７０μｍ×６６０μｍの領域内に、２０倍であれば４４０μｍ×３３０μｍの領域内に、５０倍であれば１７４μｍ×１３０μｍの領域内に、１００倍であれば８７μｍ×６５μｍの領域内に位置していることが好ましい。左記の領域に限定されるものではない。

観察領域４が上記範囲以下であることにより、試料用流路２における測定と検量線用流路３における測定とを同時に行うことができる。また、試料５０の測定を複数回行う場合に、複数回の試料５０の測定について共通の検量線を用いるのではなく、試料５０の測定ごとに検量線を作成できる。そのため、複数の試料５０について測定する際の各試料間での温度等反応条件の違い、及び人為的な誤差の発生等を抑えることができる。

図１に示すように、流体チップ１は、マイクロシリンジポンプ９及び送液用チューブ９１を備えている。マイクロシリンジポンプ９は、送液用チューブ９１を介して、試料５０を含む液体を試料用流路２に供給するか、または標準液を検量線用流路３に供給する送液装置である。この構成により、流体チップ１へ適切な量の液体を供給することができるため、液体の量が想定と異なる等のミスが抑制され、流体チップ１における測定の安定性が向上する。なお、流体チップ１が備える送液装置は、流体チップ１へ適切な量の液体を供給することができるものであればよく、マイクロシリンジポンプ９に限られるものではない。また、マイクロシリンジポンプ９によって流体チップ１に供給される液体の流速は、各ウェル２３及びウェル３３が当該液体で満たされる流速であればよく、０．５〜５ｍｍ／秒であり、好ましくは１〜３ｍｍ／秒である。

流体チップ１の大きさは、取扱性を考慮して、１辺が１〜１０ｃｍ、好ましくは２〜５ｃｍである。また、流体チップ１が備える各流路の幅は各種溶液を流すことができればよく、特に規定されない。上記幅は、例えば０．１μｍ〜１０００μｍである。流体チップ１は、上記のような大きさであることによって、流体チップ１内の温度差を低減することができる上、測定に用いる各溶液の省量化も可能である。

図４は、試料５０の移動を制限する構造（制限構造）の変形例を示す断面図である。制限構造は、当該構造において試料５０の蛍光を観察できればよく、図４に示すように、試料用流路２が、ウェル２３を備えず、制限構造として突起部２５（堰き止め構造）のみを備えることで試料５０の移動を制限する構成としてもよい。

図５は、ウェル２３及び突起部２５を複数設けた場合の試料用流路２の断面図である。図５に示すように、ウェル２３を複数設けることにより、複数の試料５０について同時に蛍光強度を得ることができる。

図６は、複数の供給口２１ａ、流路２２ａ、及びウェル２３ａを備える試料用流路２ａの構成を示す平面図である。流路２２と流路２２ａとの交点を交点２６とする。図７は、図６におけるＣ‐Ｃ’線矢視断面図である。

図６に示すように、試料用流路２ａにおいて複数のウェル２３ａごとに試料等を供給する複数の供給口２１ａ及び流路２２ａを設けることにより試料用流路２ａを実現してもよい。流路２２ａを設ける際、流路２２と流路２２ａのなす角度は直角であっても鉛直であっても構わないが、供給口２１、交点２６、及び供給口２１ａのなす角度は鋭角である事がより好ましい。上記角度が鋭角であることにより、流路２２に投入された試料等が交点２６から供給口２１方向へ逆流する事を効率的に防ぐことができる。

なお、少なくとも一部のウェル２３ａに対して流路２２ａ及び供給口２１ａが設けられていればよく、全てのウェル２３ａに対して設けられていなくともよい。複数の供給口２１ａを設けることにより、複数種類の試料５０について測定を行う際、図７に示すように、複数の供給口２１ａそれぞれから流路２２ａを介してウェル２３ａに試料５０を供給することができるため、試料５０が所望のウェル２３ａ以外に入ることを防ぐことができる。

＜流体チップ１における測定の流れ＞
本開示に係る流体チップ１を用いて、免疫染色測定法により、試料５０が含む測定対象物質の定量を行うことができる。以下、流体チップ１における測定の流れの一例について説明する。ここでは、図１に示した流体チップ１を用いた例について説明する。

（１）まず、測定対象物質の検量線を作成する。複数の毛髪等の試料５０を用意し、試料５０から測定対象物質を抽出した後ＥＬＩＳＡ等の方法により試料５０が含む測定対象物質の濃度を測定する。一方、同一または同時期の試料５０を用いて、試料５０の断面に含まれる測定対象物質を、当該測定対象物質を特異的に認識する一次抗体、及び蛍光物質で標識された二次抗体を用いて検出し、当該試料５０が含む測定対象物質の蛍光強度を測定する。測定された測定対象物質の濃度及び蛍光強度を用いて、測定対象物質の濃度と蛍光強度との関係を示す検量線を作成することができる。

（２）次に、流体チップ１及び（１）で作成した検量線を用いて濃度不明の測定対象物質を含む試料５０についての測定を行う。

まず、試料５０を含む液体を試料用流路２の供給口２１から供給する。この時、試料５０は試料用流路２が備える制限構造によって移動を制限され、ウェル２３に溜まる一方、余分な液体は排出口２４から排出される。

次にブロッキング剤、及び一次抗体を含む溶液を、供給口２１を介してウェル２３に順に供給し、試料５０が含む測定対象物質を標識する。その後、洗浄液を供給口３１に供給し、試料５０に結合していない一次抗体を洗浄して取り除く。

続いて蛍光色素で標識した二次抗体を含む溶液を供給口２１に供給し、ウェル２３に貯留されている一次抗体を標識する。その後、洗浄液を供給口２１に供給し、一次抗体に結合していない二次抗体を洗浄して取り除く。

一方、検量線を作成するために、検量線用流路３の供給口３１を介して、ブロッキング剤、及び一次抗体を含む溶液を各ウェル３３ａ〜ｃに順に供給する。続いて蛍光色素で標識した二次抗体を含む溶液を各ウェル３３ａ〜ｃに供給する。検量線用流路３については、二次抗体の洗浄は行わない。

なお、蛍光色素で標識した二次抗体を含む溶液の代わりに既知の濃度の蛍光物質を含む溶液を検量線用流路３の供給口３１を介して各ウェル３３ａ〜ｃに供給してもよい。

また、一次抗体の為のブロッキング剤及び蛍光色素で標識された二次抗体の為のブロッキング剤など目的に応じた複数のブロッキング剤を使用しても良い。この場合は、一次抗体を含む溶液を供給する前に、一次抗体の為のブロッキング剤を供給し、二次抗体を含む溶液を供給する前に、二次抗体の為のブロッキング剤を供給すればよい。なお、一次抗体の為のブロッキング剤を供給した後、一次抗体を供給する前に二次抗体の為のブロッキング剤を供給してもよい。

最後に、ウェル２３及びウェル３３ａ〜ｃを同時に励起した後、ウェル３３ａ〜ｃのそれぞれが、蛍光色素で標識した二次抗体を含む溶液で満たされた状態で、観察領域４を観察し、試料用流路２の制限構造において測定対象物質の蛍光強度を、検量線用流路３のウェル３３ａ〜ｃにおいて蛍光物質の蛍光強度を測定する。当該蛍光強度の測定結果は、ウェル２３、及びウェル３３ａ〜ｃを上面視したときの各ウェルに対応する画像領域における蛍光度の積算値によって求められる。

ここで、検量線用流路３に供給された標準液に含まれる蛍光物質の濃度は一定であるため、各ウェル３３ａ〜ｃにおいて測定される蛍光強度は当該ウェル３３ａ〜ｃの深さに依存して大きくなる。

また、ウェル２３及びウェル３３ａ〜ｃは、観察領域４内に存在するため、全てのウェルを同時に観察することが可能である。また、上記（２）に示す工程において、試料用流路２及び検量線用流路３に同様の溶液を供給する作業をほぼ同時に行ってもよい。

なお、ウェル２３及び３３を励起する際に使用される励起光は、蛍光物質によって吸収されるため、吸収された励起光の強度を考慮して得られた蛍光強度の測定結果を補正することが好ましい。ただし、蛍光物質としてルミノール等を使用する場合は、励起が不要となるため、当該補正を行う必要はない。

（１）で作成した検量線を用いて、測定された測定対象物質の蛍光強度から、当該測定対象物質の濃度を定量することができる。例えば、（１）において測定された濃度の内、最低値が０．１ｐｇ／μｍ^３であり、最高値が１．０ｐｇ／μｍ^３であり、上記最低値の時の蛍光強度が１ＲＬＵであり、上記最高値の時の蛍光強度が１０ＲＬＵであるとすると、０．１〜１．０ｐｇ／μｍ^３間の検量線が作成される。

ここで、手順（２）において、ウェル３３の数が１０個であり、これらウェル３３の深さが１０μｍ〜１００μｍの間で１０μｍごとに変化しているとする。また、既知の濃度として０．１ｐｇ／μｍ^３の標準液を用いており、測定された蛍光強度の最低値が２ＲＬＵであり、最高値が８ＲＬＵとする。この場合、最低値である２ＲＬＵが事前に作成された検量線の１ＲＬＵに相当し、最高値である８ＲＬＵが同じく１０ＲＬＵに相当する。上記のように定められた上で、手順（２）において得られた試料５０の蛍光強度が３．２ＲＬＵであるとすると、これは事前に作成された検量線の２．８ＲＬＵに相当するため、当該検量線を用いて測定対象物質の濃度を定量することができる。

一度（１）に示す手順によって検量線を作成すれば、次回以降は同じ構造を持つ流体チップ１を使用し、（２）に示す手順を行うだけで測定対象物質の濃度を定量することができる。

検量線用流路３が備える複数のウェル３３ａ〜ｃはそれぞれ高さが異なる。そのため蛍光物質を含む均一な濃度の標準液を流せば検量線作成に必要な複数点の発光強度を測定することができる。よって本開示に係る測定方法では、蛍光物質の希釈系列を調製する必要がない。

＜流体チップ１の作製方法＞
以下、本開示に係る流体チップ１の作製方法の一例について説明する。流体チップ１は、公知のマイクロチップ作成技術、例えばフォトリソグラフィによる積層方法によって作製することができる。

まず、Ｓｉウエハー上にフォトリソグラフィによってレジストを積層して鋳型を作製する。この時積層するレジストの厚みによりウェル２３及びウェル３３の深さを設定する。次に作製した鋳型にＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン：Polydimethylsiloxane）を流し込んでモールディングする。以上の工程により、流体チップ１が作製される。なお、流体チップ１の材料はＰＤＭＳに限られずＰＭＭＡ（ポリメチルメタアクリレート：Polymethyl methacrylate）、合成石英、またはパイレックス（登録商標）ガラスであってもよい。

〔実施形態２〕
本開示の他の実施形態について、以下に説明する。なお、説明の便宜上、上記実施形態にて説明した部材と同じ機能を有する部材については、同じ符号を付記し、その説明を繰り返さない。

図８は、検量線用流路３０を備える流体チップ１０の断面図である。図９は、検量線用流路３０を用いた場合に作成できる検量線を説明するための図である。図８に示すように、検量線用流路３０は、５つのウェル３３（３３ａ〜３３ｅ）を有している。

図９の（ａ）と（ｂ）とを比較すると、検量線を形成する測定点の数は同じであるが、（ｂ）の方が、測定点の濃度範囲（ダイナミックレンジ）が狭まっている。そのため、当該濃度範囲において精度の高い検量線を作成できる。この効果を得るためには、ウェル３３ａ〜３３ｅの深さの変化幅を小さく設定すればよい。逆にダイナミックレンジを拡げるためには、ウェル３３ａ〜３３ｅの深さの変化幅を大きく設定すればよい。

また、図９の（ｂ）と（ｃ）とを比較すると、測定点の濃度範囲は同じであるが、（ｃ）の方が測定点の数が増加している。換言すれば、検量線の分解能が高まっている。そのため、当該濃度範囲において、より精度の高い検量線を作成できる。この効果を得るためには、ウェル３３ａ〜３３ｅの深さの変化幅を小さく設定した上で、ウェル３３の数を増加させればよい。

〔変形例〕
図１０の（ａ）は、検量線用流路３を複数備えた流体チップ２０の構成を示す平面図である。図１０の（ａ）に示すように、流体チップ２０は、検量線用流路３（３ａ〜３ｄ）を複数備えている構成としてもよい。

図１０の（ｂ）は、図１０の（ａ）において破線で示す観察領域３５を拡大した図である。検量線用流路３ａ〜３ｄのそれぞれは、４つのウェル３３（３３ａ〜３３ｄ）を備えている。このうち、破線で囲ったウェル３３ｄについては、同じ深さを有している。その他のウェル３３ａ〜３３ｃは、検量線用流路３ａ〜３ｄごとに異なる深さを有している。

ウェル３３ａ〜３３ｄは、観察領域３５の範囲内に位置している。観察領域３５の範囲は、観察領域４の範囲と同様に定めることができる。また、図示していないが、観察領域３５の範囲内に、試料用流路２のウェル２３を含めてもよい。供給口３１及び排出口３４の配置は特に限定されない。

例えば、検量線用流路３ａのウェル３３ａ〜３３ｄは、直線的な検量線を作成するために、ウェル３３ａ〜３３ｄの深さが直線的に変化するように形成されていてもよい。検量線用流路３ｂのウェル３３ａ〜３３ｄは、指数関数的な検量線を作成するために、ウェル３３ａ〜３３ｄの深さが指数関数的に変化するように形成されていてもよい。また、上述のダイナミックレンジおよび／または分解能が異なる検量線に対応する深さを有する複数の検量線用流路３を形成してもよい。上記のような複数の検量線用流路３を形成することにより、一度の観察で複数の検量線を作成するための蛍光強度を得ることができる。また、多重染色を行う際、複数の検量線用流路３を形成することで、各検量線用流路３において異なる蛍光体色素に関する検量線を作成することができるため好適である。

なお、複数の検量線用流路３が備えるウェル３３は、同数である必要はなく、必要に応じて異なる数のウェル３３をそれぞれ備えていてもよい。

〔実施形態３〕
本開示の他の実施形態について、以下に説明する。図１１は、流路の分岐構造を有する流体チップ３００の構成を示す平面図である。図１１に示すように、流体チップ３００では、供給口２１が供給口３１を兼ねており、共通の流路の途中から試料用流路２及び検量線用流路３が分岐している。すなわち、試料用流路２及び検量線用流路３は、共通の供給口を有する共通の流路から分岐している。分岐点、または分岐点より下流かつウェル２３またはウェル３３ａよりも上流の位置にはエア流路６１によって開放状態と閉鎖状態とを切り替える弁６が設けられている。弁６によって、供給口２１から供給された液体が、試料用流路２及び検量線用流路３のいずれに流れるかを切り替えることができる。

図１２は、試料用流路２側の弁６の構造を示すＤ‐Ｄ’線矢視断面図である。なお、検量線用流路３側の弁６も同様の構造である。図１２に示すように、弁６は、上面基板７と、下面基板８及び流路２２との間の隙間であるエア流路６１、及びエア流路６１と流路２２とを隔てるシート６２を備えており、空気圧によって流路２２の開放と閉鎖とを切り替える。弁６を開放状態にする場合は、図１２の（ａ）に示すように、エア流路６１内に空気が供給されず、低圧状態である。弁６を閉鎖状態にする場合は、図１２の（ｂ）に示すように、エア流路６１内に空気が供給され、高圧状態となり、シート６２に圧力がかかる。シート６２はＰＤＭＳ等の素材でできており、エア流路６１から圧力がかかると流路２２側に膨らみ、流路２２を閉鎖する。

流体チップ３００は、上記弁６を設けることにより、試料５０の逆流、及び溶液が目的としない流路に流れ込むことを防ぐことができる。なお、弁６は、さらに各ウェル２３及び３３の上流側に設けられていてもよく、その場合はより確実に試料５０及び溶液の逆流等を防ぐことができる。

〔変形例〕
図１３は、分岐点を複数有する流体チップ４０の構成を示す平面図である。図１３に示すように、流体チップ４０は、２つの試料用流路２及び２つの検量線用流路３を備え、それぞれの流路が共通の供給口２１を有する共通の流路から分岐している。それぞれの分岐点には弁６が設けられている。

上記の構成により、流体チップ４０では、複数の試料５０及び検量線についての測定を行うことができる。なお、上記流路は同数である必要はなく、例えば試料用流路２が１つであり、検量線用流路３が２つ以上であり、それぞれの流路が共通の供給口２１を有する構成としてもよい。

〔実施形態４〕
本開示の他の実施形態について、以下に説明する。図１４の（ａ）は、流体チップ１を用いてＥＬＩＳＡ（Enzyme linked immunosorbent assay）法（サンドイッチ法）によって試料５１を検出する方法を示す試料用流路２の断面図である。以下、流体チップ１にＥＬＩＳＡ法（サンドイッチ法）を適用する方法について説明する。図１４（ａ）に示すように、ウェル２３には抗体１０１が固定化されている。試料５１を含む溶液を試料用流路２に供給すると、試料５１が抗体１０１に結合する。

試料５１は、毛髪から抽出したストレスマーカーであってもよいし、各種のタンパク質など、一次抗体と二次抗体それぞれで認識でき、一次抗体と二次抗体の間に挟むことが出来る程度に分子量が比較的大きい物質であればどのような物質であってもよい。

次に洗浄液を供給し、抗体１０１に結合していない試料５１を洗い流す。続いて抗体１０１と抗原認識部位の異なる、ＨＲＰ（Horseradish peroxidase）によって標識された酵素標識抗体１０２を含む溶液を供給すると、ウェル２３に残っている試料５１に酵素標識抗体１０２が結合する。ウェル２３を遮光し、１時間以上反応させることにより、ウェル２３内の物質は平衡状態へ至る。その後洗浄液を供給し、余分な酵素標識抗体１０２を洗い流し、次にＴＭＢ（Tetramethylbenzidine）溶液を供給しインキュベーションを行う。この反応によりＴＭＢはＨＲＰによって酸化され、青色に呈色する。その後、強酸を供給することで反応を停止させる。この際に、酸性の溶液中ではＴＭＢは黄色の呈色を示すもの及び透明のもの２種類が同時に生成されるため、ウェル２３自体は黄色く呈色する。

一方、検量線用流路３には蛍光色素または蛍光標識された二次抗体試薬を供給し、最後に、ウェル２３及びウェル３３の吸光度を測定する。

図１４の（ｂ）は、サンドイッチ法による抗原濃度と吸光度の関係を示す検量線のグラフである。図１４の（ｂ）に示すように、サンドイッチ法により作成される検量線は、試料５１の濃度が上昇するに従って吸光度が上昇する検量線となる。

図１５の（ａ）は、流体チップ１を用いてＥＬＩＳＡ法（競合法）によって試料５１を検出する方法を示す試料用流路２の断面図である。以下、流体チップ１に競合法を適用する方法について説明する。図１５（ａ）に示すように、ウェル２３には、抗体１０１が固定化されている。試料５１を含む溶液及び酵素標識抗原１０３を含む溶液を供給する。遮光して１時間反応させた後、洗浄液を供給し、余分な試料５１及び酵素標識抗原１０３を洗い流し、次にＴＭＢ溶液を供給した後インキュベーションを行う。この反応によりＴＭＢはＨＲＰによって酸化され、青色に呈色する。その後、強酸を供給し、反応を停止させる。この際に、酸性の溶液中ではＴＭＢは黄色の呈色を示すもの及び透明のもの２種類が同時に生成されるため、ウェル２３自体は黄色く呈色する。

一方、検量線用流路３には、蛍光色素または蛍光標識された二次抗体試薬を供給し、最後にウェル２３及びウェル３３の吸光度を測定する。

図１５の（ｂ）は、競合法による抗原濃度と吸光度の関係を示す検量線のグラフである。図１５の（ｂ）に示すように、競合法により作成される検量線は、試料５１の濃度が上昇するに従って、吸光度が減少する検量線となる。

上記のように、ＥＬＩＳＡ法を適用させる場合は、流体チップ１に所望の抗体を物理吸着好ましくは共有結合で固定化する。

以下、流体チップ１に抗体を固定化する方法を説明する。まず、流体チップ１の固相にアミノ基またはカルボキシル基を付与する。次に、所望の抗体のカルボキシル基またはアミノ基を流体チップ１に供給することで、流体チップ１の固相に吸着しているアミノ基またはカルボキシル基に、上記抗体がアミド結合等により共有結合する。

なお、流体チップ１がガラスである場合、シランカップリング剤である３-アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ：Aminopropyltriethoxysilane）中のアミノ基を固相に付与し、カップリング試薬を供給することで、抗体中のカルボキシル基と共有結合させて固定化する。

流体チップ１をＥＬＩＳＡ法に適用する場合にも、実施形態１で説明したように、既知の濃度の測定対象物質及び既知の濃度の蛍光色素を用いて検量線を作成する。

本開示は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本開示の技術的範囲に含まれる。さらに、各実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を組み合わせることにより、新しい技術的特徴を形成することができる。

本開示の一実施例について以下に説明する。図１６は、図１０に示した流体チップ２０が備える検量線用流路３を光学顕微鏡で観察したときの写真を示す図である。図１７は、流体チップ２０が備える検量線用流路３を走査型顕微鏡で観察したときの写真を示す図である。図１８は、図１７に示す検量線用流路３が有するウェル３３ａ〜ｄを走査型顕微鏡で観察したときの写真を示す図である。ウェル３３ａ〜ｄの直径は、２０μｍであり、ウェル３３ａの深さは６．６μｍ、ウェル３３ｂの深さは１０μｍ、ウェル３３ｃの深さは１３μｍ、ウェル３３ｄの深さは１５μｍであった。

検量線用流路３を用いて蛍光強度を測定した。蛍光色素標識二次抗体として、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８標識二次抗体の原液を、１０ｗｔ％（重量パーセント）濃度のゼラチン−ＰＢＳ（Phosphate buffered saline）を用いて１００倍に希釈したものを使用した。

蛍光色素標識二次抗体を検量線用流路３に供給し、４８８ｎｍの波長を持つ光で励起し、５２０ｎｍ付近の発光を観測した。

図１９は、図１６から図１７に示した検量線用流路３に蛍光物質を含む標準液を流し、各ウェル３３ａ〜ｄについて蛍光観察したときの写真を示す図である。図２０は、図１９に示す蛍光観察の結果を示すグラフである。なお、図２０に示しているプロットＡ〜Ｄは、それぞれウェルの深さ、６．６μｍ、１０μｍ、１３μｍ、１５μｍのウェルにおける蛍光強度を示す。図１９及び図２０に示すように、ウェル３３の深さが大きくなるほど蛍光強度は増加した。また、蛍光強度は、ウェル３３の深さに依存する結果グラフとなった。

検量線用ウェルに注入する溶液として蛍光色素を用いる場合、励起光の吸収量が、ウェルの深さによってどの様に変化するかを検討した。

蛍光強度を測定するための蛍光色素として、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８標識二次抗体ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（ヤギ抗マウス抗体）を使用した。

ここで、４９４ｎｍ付近の波長におけるＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８のモル吸光係数はε=７１０００／ｃｍ・Ｍであり、ヤギ抗マウス抗体単体の分子量は平均１５０ｋＤａであり、試薬の原液濃度は２ｍｇ／ｍｌであるため、モル濃度は、１．３３×１０^−８ｍｏｌ／ｍｌとなる。また上記試薬を１００倍に希釈したものを使用したため、実際に使用した試薬のモル濃度は、１．３３×１０^−１０ｍｏｌ／ｍｌとなった。また、一次抗体当たりに結合しているＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８の分子数は、平均５分子であるので、試薬に含まれる蛍光色素のモル濃度は、６．６７×１０^−１０ｍｏｌ／ｍｌとなる。

図２１は、モル濃度１．３３×１０^−１０ｍｏｌ／ｍｌの溶液の、モル吸光係数が７１０００／ｃｍ・Ｍの時に、励起光が蛍光体を含む溶液に入射して、蛍光体に吸収された光強度の侵入距離依存性を示すグラフである。ただし、吸収量は、励起光強度によって規格化されている。なお、侵入距離とは、励起光がウェル内を通過する距離、つまりウェルの深さを示す。

実施例１において使用した流体チップ２０が備えるウェル３３の深さは、６．６〜１５μｍであり、実施例１において測定された結果は、図２１に示す破線の範囲内である。図２０及び図２１の破線内の範囲に示すように、実施例１において測定された蛍光強度及び本実施例において測定された、蛍光体に吸収される光強度は、どちらも単調増加の傾向を示した。

１ 流体チップ（マイクロ流体チップ）
２ 試料用流路
３、３ａ〜ｄ 検量線用流路
４ 観察領域
６ 弁
７ 上面基板
８ 下面基板
９ マイクロシリンジポンプ
２１、２１ａ 供給口
２２、２２ａ 流路
２３、２３ａ ウェル
２４ 排出口
２５ 突起部
２６ 交点
２７ 隙間
３０ 検量線用流路
３１ 供給口
３２ 流路
３３、３３ａ〜ｅ ウェル
３４ 排出口
３５ 観察領域
５０ 試料
５１ 試料
６１ エア流路
６２ シート
９１ 送液用チューブ
１０１ 抗体
１０２ 酵素標識抗体
１０３ 酵素標識抗原

Claims (9)

1. 検量線作成のための標準液を貯留する複数のウェルを有する検量線用流路を備え、
   前記複数のウェルの深さは、それぞれ異なることを特徴とするマイクロ流体チップ。
2. 前記検量線用流路を複数備え、各検量線用流路が有する複数のウェルの深さの範囲は、前記検量線用流路ごとに異なっていることを特徴とする請求項１に記載のマイクロ流体チップ。
3. 前記検量線用流路を複数備え、各検量線用流路が有する複数のウェルの数は、前記検量線用流路ごとに異なっていることを特徴とする請求項１に記載のマイクロ流体チップ。
4. 試料の移動を制限する凹部または突起部を少なくとも１つ有する試料用流路をさらに備えることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載のマイクロ流体チップ。
5. 前記複数のウェル及び前記凹部または突起部は、上面視したときの面積が１７００μｍ×１３００μｍの領域内に位置していることを特徴とする請求項４に記載のマイクロ流体チップ。
6. 前記検量線用流路及び前記試料用流路は、共通の供給口を有する共通の流路から分岐しており、分岐点には弁が設けられていることを特徴とする請求項４に記載のマイクロ流体チップ。
7. 前記試料用流路は、複数の前記凹部または突起部を有し、各凹部または突起部に試料を供給するための流路が、少なくとも一部の凹部または突起部について、当該凹部または突起部ごとに設けられていることを特徴とする請求項４から５のいずれか１項に記載のマイクロ流体チップ。
8. 前記複数のウェルの深さは、前記検量線作成のための前記標準液が流れる方向に沿って単調に増加または減少することを特徴とする、請求項１から７のいずれか１項に記載のマイクロ流体チップ。
9. 請求項１から８のいずれか１項に記載のマイクロ流体チップを用いて、蛍光強度を測定する方法であって、
   前記検量線用流路に蛍光色素を含む溶液を供給する工程と、
   前記複数のウェルのそれぞれが前記溶液で満たされた状態で、各ウェルの蛍光強度を測定する工程とを含む測定方法。