JP2020150793A - 腸内有用菌の増殖及び有機酸産生増強剤 - Google Patents
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Abstract
【課題】腸内有用菌、好ましくは、乳酸菌及び/又はビフィズス菌を増殖させる剤、及びビフィドバクテリウム・ロンガム菌によって、そのような腸内有用菌の有機酸産生能を向上させる剤の提供。【解決手段】ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum)菌を含有することを特徴とする、腸内有用菌の増殖及び有機酸産生増強剤。腸内有用菌が乳酸菌及び/又はビフィズス菌であってよい。ビフィドバクテリウム・ロンガム菌が、ビフィドバクテリウム・ロンガムMM−2株(Bifidobacterium longum MM-2、受託番号:NITE BP-818)であってよい。【選択図】なし
Description
本発明は、ビフィドバクテリウム ロンガム菌を含有することを特徴とする、腸内有用菌の増殖及び有機酸産生増強剤に関する。
乳酸菌やビフィズス菌は、古くから、発酵食品や酒類、漬物の発酵食品の製造等に広く用いられてきた。これらの乳酸菌やビフィズス菌には、乳糖やオリゴ糖などを分解して乳酸を産生するホモ発酵を行うものや乳酸及び酢酸を産生するヘテロ発酵を行うもの等がいる。乳酸菌やビフィズス菌は、乳糖やオリゴ糖などを分解して乳酸や酢酸を産生し、腸内のpHを顕著に低下させ、善玉菌として腸内環境を整える作用等を有することから、腸内有用菌として知られている。
特許文献1には、乳酸菌と納豆菌の混合物によりビフィズス菌の増殖が増大することが記載されている。しかしながら、ビフィドバクテリウム ロンガム菌によって、腸内有用菌の有機酸産生能や、腸内有用菌の増殖が増強されることは、これまでに知られていない。
本発明は、腸内有用菌、好ましくは、乳酸菌及び/又はビフィズス菌を増殖させる剤、及びビフィドバクテリウム ロンガム菌によって、そのような腸内有用菌の有機酸産生能を向上させる剤の提供を課題とする。
本発明者らは、上記課題の解決について鋭意研究を重ねた結果、ビフィドバクテリウム ロンガム菌を生体内に投与することによって、腸内有用菌、好ましくは、乳酸菌及び/又はビフィズス菌の増殖を、効率よく、工業的有利に行うことが出来ること、腸内有用菌の有機酸産生能が向上されることを見出した。本発明者らは、このような知見に基づいてさらに研究を進め、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、上記課題を解決するために、以下の各発明を包含する。
[1] ビフィドバクテリウム ロンガム(Bifidobacterium longum)菌を含有することを特徴とする、腸内有用菌の増殖及び有機酸産生増強剤。
[2] 腸内有用菌が乳酸菌及び/又はビフィズス菌であることを特徴とする、前記[1]に記載の剤。
[3] ビフィドバクテリウム ロンガム菌が、ビフィドバクテリウム ロンガム MM−2株(Bifidobacterium longum MM-2、受託番号:NITE BP-818)であることを特徴とする、[1]又は[2]に記載の剤。
[4] 乳酸菌が、ラクトバシラス(Lactobacillus)属、ストレプトコッカス(Streptococcus)属、エンテロコッカス (Enterococcus)属、ラクトコッカス(Lactococcus)属、テトラジェノコッカス(Tetragenococcus)属、ペディオコッカス(Pediococcus)属及びオエノコッカス(Oenococcus)属の菌からなる群から選択される1種以上であること、及び/又は
ビフィズス菌が、ビフィドバクテリウム(Bifidobacterium)属から選択される1種以上であることを特徴とする、[2]又は[3]に記載の剤。
[5] ビフィドバクテリウム ロンガム(Bifidobacterium longum)菌及びプロバイオティクスを含有することを特徴とする、腸内有用菌の増殖及び有機酸産生増強剤。
[6] プロバイオティクスが乳酸菌及び/又はビフィズス菌であることを特徴とする、前記[5]に記載の剤。
[7] 乳酸菌が、ラクトバシラス(Lactobacillus)属、ストレプトコッカス(Streptococcus)属、エンテロコッカス(Enterococcus)属、ラクトコッカス(Lactococcus)属、テトラジェノコッカス(Tetragenococcus)属、ペディオコッカス(Pediococcus)属及びオエノコッカス(Oenococcus)属の菌からなる群から選択される1種以上であること、及び/又は
ビフィズス菌が、ビフィドバクテリウム(Bifidobacterium)属から選択される1種以上であることを特徴とする、前記[6]に記載の剤。
[8] 前記[1]〜[7]に記載の剤の、腸内有用菌増殖用薬及び/又は有機酸産生用薬を製造するための使用。
[1] ビフィドバクテリウム ロンガム(Bifidobacterium longum)菌を含有することを特徴とする、腸内有用菌の増殖及び有機酸産生増強剤。
[2] 腸内有用菌が乳酸菌及び/又はビフィズス菌であることを特徴とする、前記[1]に記載の剤。
[3] ビフィドバクテリウム ロンガム菌が、ビフィドバクテリウム ロンガム MM−2株(Bifidobacterium longum MM-2、受託番号:NITE BP-818)であることを特徴とする、[1]又は[2]に記載の剤。
[4] 乳酸菌が、ラクトバシラス(Lactobacillus)属、ストレプトコッカス(Streptococcus)属、エンテロコッカス (Enterococcus)属、ラクトコッカス(Lactococcus)属、テトラジェノコッカス(Tetragenococcus)属、ペディオコッカス(Pediococcus)属及びオエノコッカス(Oenococcus)属の菌からなる群から選択される1種以上であること、及び/又は
ビフィズス菌が、ビフィドバクテリウム(Bifidobacterium)属から選択される1種以上であることを特徴とする、[2]又は[3]に記載の剤。
[5] ビフィドバクテリウム ロンガム(Bifidobacterium longum)菌及びプロバイオティクスを含有することを特徴とする、腸内有用菌の増殖及び有機酸産生増強剤。
[6] プロバイオティクスが乳酸菌及び/又はビフィズス菌であることを特徴とする、前記[5]に記載の剤。
[7] 乳酸菌が、ラクトバシラス(Lactobacillus)属、ストレプトコッカス(Streptococcus)属、エンテロコッカス(Enterococcus)属、ラクトコッカス(Lactococcus)属、テトラジェノコッカス(Tetragenococcus)属、ペディオコッカス(Pediococcus)属及びオエノコッカス(Oenococcus)属の菌からなる群から選択される1種以上であること、及び/又は
ビフィズス菌が、ビフィドバクテリウム(Bifidobacterium)属から選択される1種以上であることを特徴とする、前記[6]に記載の剤。
[8] 前記[1]〜[7]に記載の剤の、腸内有用菌増殖用薬及び/又は有機酸産生用薬を製造するための使用。
本発明は、ビフィドバクテリウム ロンガム菌を含有することを特徴とする、腸内有用菌の増殖及び有機酸産生増強剤を提供する。本発明の剤を工業的発酵に用いること、又はヒト又は哺乳動物等の生体に経口投与することにより、効率よく、工業的有利に、あるいは活性の高い状態で腸内有用菌を得ることが出来る。
〔ビフィドバクテリウム ロンガム菌〕
本発明において用いられるビフィドバクテリウム ロンガム菌は、好ましくは、ビフィドバクテリウム ロンガム MM−2株(Bifidobacterium longum MM-2、受託番号:NITE BP-818)であるが、これに限定されない。
なお、本発明の剤において、ビフィドバクテリウム ロンガム菌が含まれる割合は、例えば、剤が液体である場合は、例えば、約104〜1010cfu/mL、好ましくは、約106〜109cfu/mL等であってよく、剤が固体である場合は、例えば、剤全体に対して、ビフィドバクテリウム ロンガム菌が105〜1010cfu/g質量%、好ましくは、剤全体に対して、106〜109cfu/g質量%等含まれてよいが、これらに限定されない。
本発明において用いられるビフィドバクテリウム ロンガム菌は、好ましくは、ビフィドバクテリウム ロンガム MM−2株(Bifidobacterium longum MM-2、受託番号:NITE BP-818)であるが、これに限定されない。
なお、本発明の剤において、ビフィドバクテリウム ロンガム菌が含まれる割合は、例えば、剤が液体である場合は、例えば、約104〜1010cfu/mL、好ましくは、約106〜109cfu/mL等であってよく、剤が固体である場合は、例えば、剤全体に対して、ビフィドバクテリウム ロンガム菌が105〜1010cfu/g質量%、好ましくは、剤全体に対して、106〜109cfu/g質量%等含まれてよいが、これらに限定されない。
〔腸内有用菌〕
本発明で用いられる腸内有用菌は特に限定されず、例えば、乳酸桿菌、乳酸球菌等の乳酸菌やビフィズス菌、すなわち、ビフィドバクテリウム(Bifidobacterium)属に属する菌を好ましく用いることが出来るが、これらに限定されない。本発明において、腸内有用菌は、好ましくは、乳酸菌及び/又はビフィズス菌である。特に好ましくは、乳酸菌とビフィズス菌の両方を含む。なお、当分野においては、ビフィズス菌は、広義の乳酸菌に含むとする考えもあるが、本発明においては、これらを区別する。
本発明で用いられる腸内有用菌は特に限定されず、例えば、乳酸桿菌、乳酸球菌等の乳酸菌やビフィズス菌、すなわち、ビフィドバクテリウム(Bifidobacterium)属に属する菌を好ましく用いることが出来るが、これらに限定されない。本発明において、腸内有用菌は、好ましくは、乳酸菌及び/又はビフィズス菌である。特に好ましくは、乳酸菌とビフィズス菌の両方を含む。なお、当分野においては、ビフィズス菌は、広義の乳酸菌に含むとする考えもあるが、本発明においては、これらを区別する。
本明細書において、「腸内」とは、動物体内の盲腸、大腸、小腸、空腸、回腸、十二指腸、結腸などの腸管内部又はその表面を指し、好ましくは、大腸、小腸又は盲腸であるが、これらに限定されない。また、腸管を有する動物は、好ましくは、哺乳動物である。哺乳動物は、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、サル等が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明において、腸内有用菌が、乳酸菌である場合、そのような乳酸菌は、例えば、Lactobacillus acidophilus、L. casei、L. gasseri、L. plantarum、L. delbrueckii subsp bulgaricus、L. delbrueckii subsp lactis、L. fermentum、L. helveticus、L. johnsonii、L. paracasei subsp. paracasei、L. reuteri、L. rhamnosus、L. salivarius、L. brevis等のラクトバチルス(Lactobacillus)属の乳酸桿菌;例えば、Leuconostoc mesenteroides等のリューコノストック属、Streptococcus (Enterococcus) faecalis、Streptococcus (Enterococcus) faecium、Streptococcus (Enterococcus) hirae、Streptococcus thermophilus等のストレプトコッカス(Streptococcus)属(現在の分類学上、エンテロコッカス (Enterococcus)属に分類される)、Lactococcus lactis、L. cremoris等のラクトコッカス(Lactococcus)属、Tetragenococcus halophilus等のテトラジェノコッカス(Tetragenococcus)属、Lactococcus lactis、L. cremoris、Tetragenococcus halophilus、Pediococcus acidilactici、P. pentosaceus等のペディオコッカス(Pediococcus)属、Oenococcus oeni等のオエノコッカス(Oenococcus)属等の乳酸球菌等を好ましく用いることが出来るが、これらに限定されない。なお、本明細書中においては、現在の分類学に従い菌の分類をしているが、過去の分類に従い、ストレプトコッカス(Streptococcus)属は、ストレプトコッカス(Streptococcus)属及びエンテロコッカス(Enterococcus)属を包含することもある。
上記乳酸菌としては、ラクトバチルス属が好ましく、さらに、ラクトバチルス アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus)、ラクトバチルス ガセリ(L. gasseri)、ラクトバチルス ジョンソニイ(L. johnsonii)、ラクトバチルス パラカゼイ サブスピーシーズ パラカゼイ(L. paracasei subsp. paracasei)、ラクトバチルス ロイテリ(Lactobacillus reuteri)、ラクトバチルス ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)、ラクトバチルス サリバリウス(Lactobacillus salivarius)、又はラクトバチルス ブレビス(Lactobacillus brevis)であることが好ましく、特に、ラクトバチルス アシドフィルス KS−13(Lactobacillus acidophilus KS-13)等であることが好ましいが、これらに限定されない。また、ストレプトコッカス フェーカリスであることも好ましく、特に、ストレプトコッカス フェーカリス 129 BIO3B(Streptococcus faecalis 129 BIO3B)を用いることが好ましいが、これらに限定されない。
乳酸菌は単独であってもよく、複数の乳酸菌の混合物であってもよい。本発明において、好ましくは、腸内有用菌には、乳酸菌が1〜5種含まれる。より好ましくは、乳酸菌が1〜3種含まれる。特に好ましくは、乳酸菌が1種又は2種含まれる。
乳酸菌は単独であってもよく、複数の乳酸菌の混合物であってもよい。本発明において、好ましくは、腸内有用菌には、乳酸菌が1〜5種含まれる。より好ましくは、乳酸菌が1〜3種含まれる。特に好ましくは、乳酸菌が1種又は2種含まれる。
本発明において、腸内有用菌が、ビフィズス菌である場合、そのようなビフィズス菌は、例えば、ビフィドバクテリウム ロンガム(Bifidobacterium longum)、ビフィドバクテリウム ビフィダム(Bifidobacterium bifidum)、ビフィドバクテリウム ブレーベ(Bifidobacterium breve)、ビフィドバクテリウム インファンティス(Bifidobacterium infantis)、ビフィドバクテリウム アドレセンティス(Bifidobacterium adolescentis)、ビフィドバクテリウム シュードロンガム(Bifidobacterium pseudolongum)、及びビフィドバクテリウム サーモフィルム(Bifidobacterium thermophilum)等が挙げられるが、これらに限定されない。
上記ビフィズス菌としては、ビフィドバクテリウム ビフィダム、ビフィドバクテリウム ロンガムを用いることが好ましく、特に、ビフィドバクテリウム ビフィダム G9−1(Bifidobacterium bifidum G9-1)であることが好ましいが、これらに限定されない。
なお、ビフィズス菌は単独で用いてもよく、複数のビフィズス菌を混合して用いてもよい。本発明において、好ましくは、腸内有用菌に、ビフィズス菌が1〜5種含まれる。より好ましくは、ビフィズス菌が1〜3種含まれる。特に好ましくは、ビフィズス菌が1種又は2種含まれる。
なお、ビフィズス菌は単独で用いてもよく、複数のビフィズス菌を混合して用いてもよい。本発明において、好ましくは、腸内有用菌に、ビフィズス菌が1〜5種含まれる。より好ましくは、ビフィズス菌が1〜3種含まれる。特に好ましくは、ビフィズス菌が1種又は2種含まれる。
本発明において、好ましくは、腸内有用菌として、上記した乳酸菌とビフィズス菌の両方が含まれる。乳酸菌とビフィズス菌は、例えば、腸内有用菌に合計で1〜10種含まれる。好ましくは、合計で1〜5種含まれる。特に好ましくは、合計で1〜3種含まれる。
〔プロバイオティクス〕
本発明において、ビフィドバクテリウム ロンガム菌を含む剤は、プロバイオティクスを含んでもよい。「プロバイオティクス」とは、通常は、体に良い作用をもたらす生きた細菌、あるいはそのような細菌の調製物であって、有効量で投与される際に、対象の健康又は健康状態への有益な作用を提供することができるものを意味する。
本発明においては、剤に含まれるものとして、動物の腸内に存在している腸内有用菌と区別されるが、プロバイオティクスの菌種としては、上記したビフィドバクテリウム ロンガム菌や腸内有用菌等と同じであってもよく、または異なっていてもよい。
好ましくは、本発明において、プロバイオティクスは、乳酸菌及び/又はビフィズス菌である。このような乳酸菌及びビフィズス菌の例としては、上記の腸内有用菌として挙げたものと同じ菌種を同様に好ましく使用できるが、上記と、異なる菌種であってもよい。
本発明において、腸内有用菌とプロバイオティクスが異なる菌種である場合、例えば、プロバイオティクスは、糖化菌、酪酸菌等の公知の有用菌であってもよい。例えば、Bacillus subtilis、Bacillus mesentericus、Bacillus polyformenticus等の糖化菌;例えば、Bacillus coagulans等の有胞子性乳酸菌; Bacillus toyoi、B. licheniformis、Clostridium butyricum等の酪酸菌;その他の有用菌であってもよい。
なお、プロバイオティクスは、通常、非病原性である。
本発明において、ビフィドバクテリウム ロンガム菌を含む剤は、プロバイオティクスを含んでもよい。「プロバイオティクス」とは、通常は、体に良い作用をもたらす生きた細菌、あるいはそのような細菌の調製物であって、有効量で投与される際に、対象の健康又は健康状態への有益な作用を提供することができるものを意味する。
本発明においては、剤に含まれるものとして、動物の腸内に存在している腸内有用菌と区別されるが、プロバイオティクスの菌種としては、上記したビフィドバクテリウム ロンガム菌や腸内有用菌等と同じであってもよく、または異なっていてもよい。
好ましくは、本発明において、プロバイオティクスは、乳酸菌及び/又はビフィズス菌である。このような乳酸菌及びビフィズス菌の例としては、上記の腸内有用菌として挙げたものと同じ菌種を同様に好ましく使用できるが、上記と、異なる菌種であってもよい。
本発明において、腸内有用菌とプロバイオティクスが異なる菌種である場合、例えば、プロバイオティクスは、糖化菌、酪酸菌等の公知の有用菌であってもよい。例えば、Bacillus subtilis、Bacillus mesentericus、Bacillus polyformenticus等の糖化菌;例えば、Bacillus coagulans等の有胞子性乳酸菌; Bacillus toyoi、B. licheniformis、Clostridium butyricum等の酪酸菌;その他の有用菌であってもよい。
なお、プロバイオティクスは、通常、非病原性である。
〔菌体の取得方法〕
上記したビフィドバクテリウム ロンガム菌、乳酸菌、ビフィズス菌、その他の有用菌、プロバイオティクス等の菌体は、例えばATCC(登録商標)又はIFO等の機関や財団法人 日本ビフィズス菌センター、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター等などから容易に入手することができる。また、市販されているものを適宜使用することもできる。なお、これらの培養前の菌体は凍結状態保存されたものであってもよい。
上記したビフィドバクテリウム ロンガム菌、乳酸菌、ビフィズス菌、その他の有用菌、プロバイオティクス等の菌体は、例えばATCC(登録商標)又はIFO等の機関や財団法人 日本ビフィズス菌センター、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター等などから容易に入手することができる。また、市販されているものを適宜使用することもできる。なお、これらの培養前の菌体は凍結状態保存されたものであってもよい。
〔ビフィドバクテリウム ロンガム(Bifidobacterium longum)菌と腸内有用菌の培養〕
通常、ビフィドバクテリウム ロンガム菌及び/又は腸内有用菌を培地に接種し培養する。これらの菌を培養するために用いる培地の基本組成は、例えば、栄養性の高い汎用増殖培地である、MRS培地、LBS培地、ロガサ培地等の公知の乳酸菌培養用培地を参考にしてよい。
また、嫌気性菌用の培地も好ましく用いることが出来る。例えば、GAMブイヨンや変法GAMブイヨン等のGAM液体培地等を好ましく用いることが出来るが、これらに限定されない。
通常、ビフィドバクテリウム ロンガム菌及び/又は腸内有用菌を培地に接種し培養する。これらの菌を培養するために用いる培地の基本組成は、例えば、栄養性の高い汎用増殖培地である、MRS培地、LBS培地、ロガサ培地等の公知の乳酸菌培養用培地を参考にしてよい。
また、嫌気性菌用の培地も好ましく用いることが出来る。例えば、GAMブイヨンや変法GAMブイヨン等のGAM液体培地等を好ましく用いることが出来るが、これらに限定されない。
本発明の培地は、炭素源、窒素源、アミノ酸、ビタミン、ミネラル、動植物タンパク質又はそのエキス並びに分解物、無機塩類、緩衝剤、界面活性剤、抗生物質、安定化剤、水又はそれらの任意の組み合わせ等を含有していてもよいが、これらに限定されない。培地中の各成分については、市販品を入手して適宜使用することができる。
窒素源としては、例えば、動物性又は植物性のペプトンや硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム等のアンモニウム塩及びこれらの水和物、アンモニア等が挙げられる。ペプトンは、例えば、大豆ペプトンやプロテオーゼペプトン、カゼインペプトン、心筋ペプトン、獣肉ペプトン等を好ましく用いることが出来るがこれらに限定されない。培地中の窒素源の含有割合は、培地全体に対して、例えば、0.1〜1質量%であってもよく、0.1〜0.5質量%であってもよいが、これらに限定されない。
炭素源としては、例えば、単糖類、二糖類、三糖類、四糖類、オリゴ糖、又は多糖等が挙げられる。単糖類としては、グルコース、キシロース、アラビノース、マンノース、ガラクトース又はそれらの任意の組み合わせが例示される。また、二糖類としては、マルトース、セロビオース、トレハロース、スクロース、ラクツロース、ラクトース又はそれらの任意の組み合わせが例示される。培地中の炭素源の含有割合は、培地全体に対して、例えば、0.1〜1質量%であってもよく、0.1〜0.5質量%であってもよいが、これらに限定されない。
本発明の培地においては、生育因子として、アミノ酸やビタミン等の成分を含むことが好ましい。アミノ酸としては、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、ピロリシン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、トレオニン、セレノシステイン、バリン、トリプトファン、チロシン又はこれらの任意の組み合わせ又はこれらの塩等が例示されるが、これらに限定されない。これらのアミノ酸は、通常はL型である。培地中のアミノ酸の含有割合は、培地全体に対して、例えば、0.01〜0.1質量%であってよく、0.01〜0.05質量%であってもよいが、これらに限定されない。
ビタミンとしては、ビタミンA、B、C、D、E、K等のビタミン類又はそれらの誘導体、若しくはそれらの塩類、ビオチン、リボフラビン、チアミン又はこれらの任意の組み合わせが好ましく用いられるが、これらに限定されない。培地中のビタミンの含有割合は、培地全体に対して、例えば、0.01〜0.1質量%であってもよく、0.01〜0.05質量%であってもよいが、これらに限定されない。
また、ミネラルとしては、マグネシウム、カリウム、カルシウム、リン、亜鉛、鉄等を好ましく用いることが出来るが、これらに限定されない。培地中のミネラルの含有割合は、培地全体に対して、例えば、0.01〜0.1質量%であってもよく、0.01〜0.05質量%であってもよいが、これらに限定されない
動植物タンパク質又はそのエキス並びにその分解物として、例えば、植物エキス、肉エキス、肝臓エキス又は酵母エキスを好ましく用いることが出来る。培地中のこのようなエキス又はその分解物の含有割合は、培地全体に対して、例えば、0.1〜1質量%であってもよく、0.1〜0.5質量%であってもよいが、これらに限定されない。
無機塩類は、例えば、リン酸塩や、塩化ナトリウム、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、硫酸マンガン水和物、硫酸マグネシウム水和物等が挙げられるが、これらに限定されない。培地中の無機塩類の含有割合は、培地全体に対して、例えば、0.01〜0.1質量%であってもよく、0.01〜0.05質量%であってもよいが、これらに限定されない。
緩衝剤は、例えば、PBS、HBSS、HEPES、HANKS等が挙げられるが、これらに限定されない。界面活性剤としては、例えば、ポリソルベート20、ポリソルベート60、ポリソルベート65、ポリソルベート80等のポリソルベート類や、マクロゴール、ラウリル硫酸ナトリウム等を好ましく用いることが出来るが、これらに限定されない。抗生物質としては、例えば、ペニシリンや、ストレプトマイシン、カナマイシン等のマイシン系抗生物質等が挙げられるが、これらに限定されない。
その他の培地成分又は添加剤としては、炭酸塩、炭酸水素塩、アルブミン、インスリン、トランスフェリン、セレニウム、ホルモン、サイトカイン、L−システイン塩酸塩、チオグリコール酸ナトリウム、ヘミン、溶性デンプン、消化血清末、ビタミン類、短鎖脂肪酸類等を含んでもよいが、これらに限定されない。
上記例示した各成分を混合して、高圧蒸気滅菌器を用いて加熱滅菌して、培地を調製することができる。
上記例示した各成分を混合して、高圧蒸気滅菌器を用いて加熱滅菌して、培地を調製することができる。
培地の液性は中性(例えば、pH6〜8、pH7〜8)であることが好ましく、中性にするために、公知のpH調整剤や上記した緩衝剤を使用してもよい。
ビフィドバクテリウム ロンガム菌を培地や動物体内に接種する際の、培地に対するビフィドバクテリウム属の菌の割合は、例えば、101〜108cfu/mLであってもよく、105〜108cfu/mLであってもよいが、これらに限定されない。なお、接種用(種培養用)培地と増殖用(本培養用)培地は同じでもよく、異なっていてもよい。動物体内に対するビフィドバクテリウム属の菌の割合は、例えば、ヒトに対しては105〜1012cfu/ヒトであってもよく、好ましくは106〜109cfu/ヒトであってもよいが、これらに限定されない。なお、ヒトは成人であっても小児であってもよい。
上記培養の温度は、例えば、25〜45℃であることが好ましく、36〜38℃であることがより好ましい。また、上記培養の時間は、例えば、4〜72時間であることが好ましく、12〜24時間であることがより好ましい。これら培養の温度又は培養の時間の範囲内であれば、ビフィドバクテリウム属の菌が増殖しやすくなる。
なお、嫌気下でビフィドバクテリウム属の菌を培養するために、嫌気ボックス又は嫌気チャンバーを使用してもよい。嫌気ボックス又は嫌気チャンバーは、市販されているものを用いてよい。
なお、嫌気下でビフィドバクテリウム属の菌を培養するために、嫌気ボックス又は嫌気チャンバーを使用してもよい。嫌気ボックス又は嫌気チャンバーは、市販されているものを用いてよい。
本発明において使用される菌体の形態は、特に制限されず、生菌体、湿菌体、乾燥菌等、任意の形態のものを用いることができる。
また、生菌体、湿菌体、乾燥菌等をさらに処理した菌の処理物を用いてもよい。菌の処理物とは、乳酸菌に何らかの処理を加えたものをいい、その処理は特に限定されない。該処理物として具体的には、該菌体の超音波などによる破砕液、該菌体の培養液又は培養上清、それらを濾過又は遠心分離など固液分離手段によって分離した固体残渣などが挙げられる。また、細胞壁を酵素又は機械的手段により除去した処理液、トリクロロ酢酸処理又は塩析処理などして得られるタンパク質複合体(タンパク質、リポタンパク質、糖タンパク質など)又はペプチド複合体(ペプチド、糖ペプチド等)なども該処理物として挙げられる。さらに、これらの濃縮物、これらの希釈物又はこれらの乾燥物なども該処理物に含まれる。培養液から菌体を摂取して、菌体からどのようにして非処理物を得るのかは、本技術分野において、従来充分に確立されているので、本発明において、それらに従ってよい。また、該菌体の超音波などによる破砕液、該細胞の培養液又は培養上清などに対し、例えば各種クロマトグラフィーによる分離などの処理をさらに加えたものも、本発明における処理物に含まれる。
なお、死菌体も本発明における菌の処理物に含まれる。死菌体は、例えば、酵素処理、加熱処理、抗生物質などの薬物による処理、ホルマリンなどの化学物質による処理、γ線などの放射線による処理などにより、得ることができる。これらの技術は従来充分に確立されていて、本発明において、そのような技術に従ってよい。
また、生菌体、湿菌体、乾燥菌等をさらに処理した菌の処理物を用いてもよい。菌の処理物とは、乳酸菌に何らかの処理を加えたものをいい、その処理は特に限定されない。該処理物として具体的には、該菌体の超音波などによる破砕液、該菌体の培養液又は培養上清、それらを濾過又は遠心分離など固液分離手段によって分離した固体残渣などが挙げられる。また、細胞壁を酵素又は機械的手段により除去した処理液、トリクロロ酢酸処理又は塩析処理などして得られるタンパク質複合体(タンパク質、リポタンパク質、糖タンパク質など)又はペプチド複合体(ペプチド、糖ペプチド等)なども該処理物として挙げられる。さらに、これらの濃縮物、これらの希釈物又はこれらの乾燥物なども該処理物に含まれる。培養液から菌体を摂取して、菌体からどのようにして非処理物を得るのかは、本技術分野において、従来充分に確立されているので、本発明において、それらに従ってよい。また、該菌体の超音波などによる破砕液、該細胞の培養液又は培養上清などに対し、例えば各種クロマトグラフィーによる分離などの処理をさらに加えたものも、本発明における処理物に含まれる。
なお、死菌体も本発明における菌の処理物に含まれる。死菌体は、例えば、酵素処理、加熱処理、抗生物質などの薬物による処理、ホルマリンなどの化学物質による処理、γ線などの放射線による処理などにより、得ることができる。これらの技術は従来充分に確立されていて、本発明において、そのような技術に従ってよい。
さらに、乾燥菌や湿菌体の好ましい製造方法について説明する。上記菌体を溶媒に分散して菌体液とする。菌体を分散して菌体液とする溶媒は、当分野で用いられる公知の溶媒を用いてよいが、水やPBS等の緩衝液が好ましい。また、所望により、エタノールなどを加えてもよい。さらに、菌体液は、懸濁液であってもよく、溶媒は上記で示したものと同じでよい。また、懸濁させる際、懸濁剤、例えばアルギン酸ナトリウム等を使用してもよい。
また、上記菌体液には、公知技術に従ってさらに賦形剤、結合剤、崩壊剤、静電気防止剤など当業界で一般に用いられている添加剤を通常の配合割合で添加してもよい。
賦形剤としては、例えば、乳糖、白糖、D−マンニトール、トウモロコシデンプン、粉末セルロース、リン酸水素カルシウム、炭酸カルシウム等が挙げられる。結合剤としては、例えばヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、キサンタンガム等が挙げられる。崩壊剤としては、例えば、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルメロースカルシウム、部分アルファー化デンプン、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、カルボキシメチルスターチ等が挙げられる。静電気防止剤としては、例えば微粉又は非微粉タルク、コロイド状シリカ、加工シリカ、沈降シリカ等が挙げられる。
また、上記菌体液には、公知技術に従ってさらに賦形剤、結合剤、崩壊剤、静電気防止剤など当業界で一般に用いられている添加剤を通常の配合割合で添加してもよい。
賦形剤としては、例えば、乳糖、白糖、D−マンニトール、トウモロコシデンプン、粉末セルロース、リン酸水素カルシウム、炭酸カルシウム等が挙げられる。結合剤としては、例えばヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、キサンタンガム等が挙げられる。崩壊剤としては、例えば、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルメロースカルシウム、部分アルファー化デンプン、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、カルボキシメチルスターチ等が挙げられる。静電気防止剤としては、例えば微粉又は非微粉タルク、コロイド状シリカ、加工シリカ、沈降シリカ等が挙げられる。
さらに、滅菌されてもよく、滅菌は、例えば、フィルター濾過により行うことが好ましいが、その他の公知の滅菌方法、例えば、湿熱滅菌法、乾熱滅菌法、高周波滅菌法等の加熱法、酸化エチレンガス滅菌法、過酸化水素による滅菌法等のガス法、ガンマ線照射滅菌法、電子線照射滅菌法等の放射線法等により滅菌を行ってもよい。
上記菌体液を、菌体乾燥物を製造するために噴霧乾燥装置による乾燥操作に付することにより、乾燥菌を得ることが出来る。噴霧乾燥装置は、シングルミクロンの噴霧液滴を形成できる微粒化装置を備えた噴霧乾燥装置が好ましい。非常に粒径の小さな噴霧液滴にすると、噴霧液滴の単位質量あたりの表面積が大きくなり、乾燥温風との接触が効率よく行われるため、生産性が向上する。
ここでシングルミクロンの液滴とは、好ましくは噴霧液滴の粒径が小数第1位を四捨五入して1〜10μmであるものをいう。
ここでシングルミクロンの液滴とは、好ましくは噴霧液滴の粒径が小数第1位を四捨五入して1〜10μmであるものをいう。
噴霧乾燥装置には、微粒化装置が、例えばロータリーアトマイザー(回転円盤)、加圧ノズル、又は圧縮気体の力を利用した2流体ノズルや4流体ノズルである噴霧乾燥装置が挙げられる。
噴霧乾燥装置は、シングルミクロンの噴霧液滴を形成できるものであれば、上記形式のいずれの噴霧乾燥装置であってもよいが、4流体ノズルを有する噴霧乾燥装置を使用するのが好ましい。
噴霧乾燥装置は、シングルミクロンの噴霧液滴を形成できるものであれば、上記形式のいずれの噴霧乾燥装置であってもよいが、4流体ノズルを有する噴霧乾燥装置を使用するのが好ましい。
4流体ノズルを有する噴霧乾燥装置では、例えば4流体ノズルの構造としては、好ましくは気体流路と液体流路とを1系統として、これを2系統ノズルエッジにおいて対称に設けたもので、ノズルエッジに流体流動面となる斜面を構成している。
また、ノズルエッジの先端の衝突焦点に向かって、両サイドから圧縮気体と液体を一点に集合させる外部混合方式の装置がよい。この方式であれば、ノズル詰まりがなく長時間噴霧することが可能となる。
また、ノズルエッジの先端の衝突焦点に向かって、両サイドから圧縮気体と液体を一点に集合させる外部混合方式の装置がよい。この方式であれば、ノズル詰まりがなく長時間噴霧することが可能となる。
4流路ノズルを有する噴霧乾燥装置について図1を用いてさらに詳しく説明する。4流路ノズルのノズルエッジにおいて、液体流路3又は4から湧き出るように出た菌体液が、気体流路1又は2から出た高速気体流により流体流動面5で薄く引き伸ばされ、引き伸ばされた液体はノズルエッジ先端の衝突焦点6で発生する衝撃波で微粒化させることにより、シングルミクロンの噴霧液滴7を形成する。
圧縮気体としては、例えば、空気、炭酸ガス、窒素ガス又はアルゴンガス等の不活性ガス等を用いることができる。とくに、酸化されやすいもの等を噴霧乾燥させる場合は、炭酸ガス、窒素ガス又はアルゴンガス等の不活性ガスを用いるのが好ましい。
圧縮気体の圧力としては、通常約1〜15kg重/cm2、好ましくは約3〜8kg重/cm2である。ノズルにおける気体量は、ノズルエッジ1mmあたり、通常約1〜100L/分、好ましくは約10〜20L/分である。
圧縮気体の圧力としては、通常約1〜15kg重/cm2、好ましくは約3〜8kg重/cm2である。ノズルにおける気体量は、ノズルエッジ1mmあたり、通常約1〜100L/分、好ましくは約10〜20L/分である。
通常、その後、乾燥室において、その噴霧液滴に乾燥温風を接触させることで水分を蒸発させ菌体乾燥物を得る。
乾燥室の入り口温度は、通常約2〜400℃、好ましくは約5〜250℃、より好ましくは約5〜150℃である。入り口温度が約200〜400℃の高温であっても、水分の蒸発による気化熱により乾燥室内の温度はそれほど高くならず、また、乾燥室内の滞留時間を短くすることにより、生菌の死滅や損傷をある程度抑えることができる。
出口温度は、通常約0〜120℃、好ましくは約5〜90℃、より好ましくは約5〜70℃である。
乾燥室の入り口温度は、通常約2〜400℃、好ましくは約5〜250℃、より好ましくは約5〜150℃である。入り口温度が約200〜400℃の高温であっても、水分の蒸発による気化熱により乾燥室内の温度はそれほど高くならず、また、乾燥室内の滞留時間を短くすることにより、生菌の死滅や損傷をある程度抑えることができる。
出口温度は、通常約0〜120℃、好ましくは約5〜90℃、より好ましくは約5〜70℃である。
上記のように菌体乾燥物の粒径を小さくすることにより、生菌率が上がり、生菌率の多い製剤を提供できるという利点がある。すなわち、シングルミクロンの菌体乾燥物を得るためにはシングルミクロンの噴霧液滴を噴霧するのが好ましい。噴霧液滴の粒径を小さくすると、噴霧液滴の単位質量あたりの表面積が大きくなるので、乾燥温風との接触が効率よく行われ、乾燥温風の熱による菌体の死滅又は損傷を極力抑えることができる。その結果として、生菌率が上がり生菌数の多い菌体乾燥物が得られる。
湿菌体は、培養液から遠心処理により菌体を採取し、リン酸緩衝液等により洗浄し、再度遠心処理により得られた菌体を凍結保存する方法等、当分野で公知の方法により、得ることができる。
本発明の剤は、通常、ビフィドバクテリウム ロンガム菌とその他の成分を混合することにより容易に製造され得る。他の成分は、本発明の効果を奏する限り特に限定されない。本発明の剤は、医薬品、医薬部外品、飲食品、飼料等の形態として用いることができる。このような、本発明の剤を含む医薬品も、本発明の好ましい実施態様の1つである。
なお、本発明の剤を含有した組成物を提供することも可能である。そのような組成物には当分野で通常用いられる公知の添加剤を用いることができ、例えば、水、溶剤、pH調整剤、保湿剤、着香剤、甘味剤、増粘剤、矯味剤、ゲル化剤、溶解剤、着色剤、防腐剤、界面活性剤、懸濁化剤、乳化剤及び安定化剤等が挙げられるが、これらに限定されない。
なお、本発明の剤や本発明の剤を用いた組成物には、プレバイオティクスが含まれてもよい。「プレバイオティクス」とは、通常、宿主による消化に対する耐性を有し、プロバイオティクス細菌の資化性の条件を満たす摂食可能な化合物であり、通常、腸管などにおけるプロバイオティクス細菌の増殖を促進するものである。
なお、ビフィドバクテリウム ロンガム菌及び腸内有用菌(例えば、乳酸菌やビフィズス菌)は、一般に嫌気性で乾燥状態では空気又は酸素に対して弱く、また、高温と湿気に弱いため、組成物の製剤化に際しては出来るだけ、不活性ガスの存在下又は真空、低温下で、処理することが好ましい。
本発明の剤は、ヒト又は非ヒト動物に投与されてもよい。本発明の投与形態は特に限定されないが、経口投与、非経口投与(静脈内投与、経皮投与、眼局所投与等)などが挙げられる。本発明の投与剤型としては、経口剤の場合、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤等が挙げられ、非経口剤としては、挿入剤等が挙げられる。投与量は、剤型、患者の症状、年齢、体重等に応じて適宜選択できる。例えば、経口投与の場合、体重1kg当たりかつ1日当たり0.05〜5000mg、好ましくは0.1〜2000mg、特に好ましくは1〜1000mgを1日1回〜数回に分けて投与することができるが、これらに限定されない。
〔腸内有用菌が産生する有機酸〕
本発明の腸内有用菌が産生する有機酸として、好ましくは、短鎖の脂肪酸、例えば、乳酸、酢酸、コハク酸、ギ酸、プロピオン酸、ピルビン酸、イソ酪酸、n-酪酸、イソ吉草酸、n-吉草酸などやこれらの混合物が挙げられ、乳酸及び/又は酢酸が好ましいが、これらに限定されない。
これらの有機酸は、培地中、植物体内又は動物体内等における乳糖やオリゴ糖などをビフィドバクテリウム ロンガム菌や腸内有用菌が分解することにより、生成されるものと考えられているが、詳細は分かっていない。
なお、本発明において、ビフィドバクテリウム ロンガム菌も有機酸を産生する。有機酸については上記した通りである。
本発明の腸内有用菌が産生する有機酸として、好ましくは、短鎖の脂肪酸、例えば、乳酸、酢酸、コハク酸、ギ酸、プロピオン酸、ピルビン酸、イソ酪酸、n-酪酸、イソ吉草酸、n-吉草酸などやこれらの混合物が挙げられ、乳酸及び/又は酢酸が好ましいが、これらに限定されない。
これらの有機酸は、培地中、植物体内又は動物体内等における乳糖やオリゴ糖などをビフィドバクテリウム ロンガム菌や腸内有用菌が分解することにより、生成されるものと考えられているが、詳細は分かっていない。
なお、本発明において、ビフィドバクテリウム ロンガム菌も有機酸を産生する。有機酸については上記した通りである。
〔有機酸製造方法〕
本発明は、腸内有用菌の併存下においてビフィドバクテリウム ロンガム菌を培養する工程を含むことを特徴とする、有機酸製造方法も包含する。
ビフィドバクテリウム ロンガム菌及び腸内有用菌の培養は、上記した菌体の取得方法に従って行うことが出来る。本発明の有機酸製造方法では、腸内有用菌の増殖能及び/又は有機酸産生能が増強されていること、さらには、ビフィドバクテリウム ロンガム菌も有機酸を産生することから、効率よく有機酸を得ることが出来る。
本発明は、腸内有用菌の併存下においてビフィドバクテリウム ロンガム菌を培養する工程を含むことを特徴とする、有機酸製造方法も包含する。
ビフィドバクテリウム ロンガム菌及び腸内有用菌の培養は、上記した菌体の取得方法に従って行うことが出来る。本発明の有機酸製造方法では、腸内有用菌の増殖能及び/又は有機酸産生能が増強されていること、さらには、ビフィドバクテリウム ロンガム菌も有機酸を産生することから、効率よく有機酸を得ることが出来る。
〔ビフィドバクテリウム ロンガム菌による腸内有用菌の有機酸産生能の向上〕
本発明のビフィドバクテリウム ロンガム菌を含有する剤は、腸内有用菌の有機酸産生能を向上させることが出来る。
具体的には、培地中又は動物体内において、ビフィドバクテリウム ロンガム菌を含有しない状態で腸内有用菌を培養する場合に比べ、本発明のロンガム菌を含有する状態で腸内有用菌を培養した場合、腸内有用菌が産生した有機酸の量が、例えば、1〜10倍であることが好ましく、1.05〜5倍であることがより好ましく、1.1〜4倍であることがさらに好ましいが、これらに限定されない。
本発明のビフィドバクテリウム ロンガム菌を含有する剤は、腸内有用菌の有機酸産生能を向上させることが出来る。
具体的には、培地中又は動物体内において、ビフィドバクテリウム ロンガム菌を含有しない状態で腸内有用菌を培養する場合に比べ、本発明のロンガム菌を含有する状態で腸内有用菌を培養した場合、腸内有用菌が産生した有機酸の量が、例えば、1〜10倍であることが好ましく、1.05〜5倍であることがより好ましく、1.1〜4倍であることがさらに好ましいが、これらに限定されない。
〔ビフィドバクテリウム ロンガム菌による腸内有用菌の増殖〕
本発明のビフィドバクテリウム ロンガム菌を含有する剤は、腸内有用菌を効率よく増殖させることが出来る。
具体的には、培地中又は動物体内において、本発明のビフィドバクテリウム ロンガム菌を含有する剤を添加しない状態で腸内有用菌を培養した場合に比べ、本発明のビフィドバクテリウム ロンガム菌を含有する剤を添加した状態で腸内有用菌を培養した場合に、培養液又は動物体内における菌数が、例えば、1〜1000倍となることが好ましく、2〜100倍となることがより好ましく、5〜50倍となることがさらに好ましいが、これらに限定されない。
本発明のビフィドバクテリウム ロンガム菌を含有する剤は、腸内有用菌を効率よく増殖させることが出来る。
具体的には、培地中又は動物体内において、本発明のビフィドバクテリウム ロンガム菌を含有する剤を添加しない状態で腸内有用菌を培養した場合に比べ、本発明のビフィドバクテリウム ロンガム菌を含有する剤を添加した状態で腸内有用菌を培養した場合に、培養液又は動物体内における菌数が、例えば、1〜1000倍となることが好ましく、2〜100倍となることがより好ましく、5〜50倍となることがさらに好ましいが、これらに限定されない。
本発明は、本発明の効果を奏する限り、本発明の技術的範囲内において、上記の構成を種々組み合わせた態様を含む。
以下、参考例及び実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。なお以下の参考例及び実施例では特定の菌株について言及しているが、本発明の適用範囲をこれに限定する趣旨ではなく、これらの菌株が属する菌種を含め、ビフィドバクテリウム ロンガム(Bifidobacterium longum)菌又は腸内有用菌(好ましくは、乳酸菌、ビフィズス菌)と称されるもの全般に広く適用可能である。
[参考例]in vitroでの各菌株の有機酸測定試験
(被検菌株)
ビフィドバクテリウム ロンガム菌として、Bifidobacterium longum MM-2(以下、単に「MM-2」とも呼ぶ。)を用いた。また、腸内有用菌(乳酸菌)として、Lactobacillus acidophilus KS-13(以下、単に「KS-13」とも呼ぶ。)およびStreptococcus faecalis 129 BIO3B(以下、単に「3B」とも呼ぶ。)を用いた。また、腸内有用菌(ビフィズス菌)として、Bifidobacterium bifidum G9-1(以下、単に「G9-1」とも呼ぶ。)を用いた。
(被検菌株)
ビフィドバクテリウム ロンガム菌として、Bifidobacterium longum MM-2(以下、単に「MM-2」とも呼ぶ。)を用いた。また、腸内有用菌(乳酸菌)として、Lactobacillus acidophilus KS-13(以下、単に「KS-13」とも呼ぶ。)およびStreptococcus faecalis 129 BIO3B(以下、単に「3B」とも呼ぶ。)を用いた。また、腸内有用菌(ビフィズス菌)として、Bifidobacterium bifidum G9-1(以下、単に「G9-1」とも呼ぶ。)を用いた。
(測定方法)
MM-2、KS-13、3BおよびG9-1の凍結保存菌株の保存液0.2mL(約106〜108cfu)を0.7 % グルコース(富士フイルム和光純薬株式会社)および0.1%ポリソルベート80(純正化学株式会社)添加GAM液体培地(GAMブイヨン、日水製薬株式会社)10 mLに添加し、試験管(容量42 mL、IWAKI製)にて37℃、18時間、インキュベーターで培養した。各培養液中に含まれる乳酸および酢酸は、FキットD-乳酸/L-乳酸およびFキット酢酸(株式会社プラクティカル)により測定し、乳酸および酢酸の総量を有機酸量とした。
MM-2、KS-13、3BおよびG9-1の凍結保存菌株の保存液0.2mL(約106〜108cfu)を0.7 % グルコース(富士フイルム和光純薬株式会社)および0.1%ポリソルベート80(純正化学株式会社)添加GAM液体培地(GAMブイヨン、日水製薬株式会社)10 mLに添加し、試験管(容量42 mL、IWAKI製)にて37℃、18時間、インキュベーターで培養した。各培養液中に含まれる乳酸および酢酸は、FキットD-乳酸/L-乳酸およびFキット酢酸(株式会社プラクティカル)により測定し、乳酸および酢酸の総量を有機酸量とした。
(結果)
各菌株をそれぞれ単独で培養した際の培地中の有機酸産生量を図2に示した。MM-2は7.18 mg/mL、KS-13は8.22 mg/mL、3Bは7.80 mg/mL、G9-1は4.09 mg/mL、(このうち、乳酸の量は、MM-2は3.33mg/mL、KS-13は8.20mg/mL、3Bは7.80mg/mL、G9-1は1.78mg/mL、酢酸の量は、MM-2は3.85mg/mL、KS-13は0.02mg/mL、3Bは0.00mg/mL、G9-1は2.31mg/mL)であった。
さらに、これらの菌株を培地や植物体又は動物体内等で同時に培養した際に、それぞれの菌株が相互に影響しないと仮定した場合に想定される有機酸産生量を単純加算することにより算出し、図3に示した。
図3から明らかなように、MM-2を含まない場合、すなわち、KS-13、3BおよびG9-1の3種の菌株の有機酸産生量を単純加算した有機酸量は20.11 mg/mL(このうち、乳酸の量は、17.79mg/mL、酢酸の量は、2.33mg/mL)であった。そして、MM-2を含む場合、すなわちMM-2、KS-13、3BおよびG9-1の4種の菌株の有機酸産生量を単純加算した有機酸量は27.29 mg/mL(このうち、乳酸の量は、21.12mg/mL、酢酸の量は、6.17mg/mL)であった。
本実験から、MM-2を添加することにより、培地や動物体内の有機酸産生量は1.36倍程度増加すると考えられた(このうち、乳酸の増加量は、1.19倍、酢酸の増加量は、2.65倍)。
各菌株をそれぞれ単独で培養した際の培地中の有機酸産生量を図2に示した。MM-2は7.18 mg/mL、KS-13は8.22 mg/mL、3Bは7.80 mg/mL、G9-1は4.09 mg/mL、(このうち、乳酸の量は、MM-2は3.33mg/mL、KS-13は8.20mg/mL、3Bは7.80mg/mL、G9-1は1.78mg/mL、酢酸の量は、MM-2は3.85mg/mL、KS-13は0.02mg/mL、3Bは0.00mg/mL、G9-1は2.31mg/mL)であった。
さらに、これらの菌株を培地や植物体又は動物体内等で同時に培養した際に、それぞれの菌株が相互に影響しないと仮定した場合に想定される有機酸産生量を単純加算することにより算出し、図3に示した。
図3から明らかなように、MM-2を含まない場合、すなわち、KS-13、3BおよびG9-1の3種の菌株の有機酸産生量を単純加算した有機酸量は20.11 mg/mL(このうち、乳酸の量は、17.79mg/mL、酢酸の量は、2.33mg/mL)であった。そして、MM-2を含む場合、すなわちMM-2、KS-13、3BおよびG9-1の4種の菌株の有機酸産生量を単純加算した有機酸量は27.29 mg/mL(このうち、乳酸の量は、21.12mg/mL、酢酸の量は、6.17mg/mL)であった。
本実験から、MM-2を添加することにより、培地や動物体内の有機酸産生量は1.36倍程度増加すると考えられた(このうち、乳酸の増加量は、1.19倍、酢酸の増加量は、2.65倍)。
[実施例1]無菌動物盲腸内容物中での有機酸量測定試験
(被検菌株)
参考例と同様に、Bifidobacterium longum MM-2(MM-2)、Lactobacillus acidophilus KS-13(KS-13)、Streptococcus faecalis 129 BIO3B(3B)及びBifidobacterium bifidum G9-1(G9-1)を用いた。
(被検菌株)
参考例と同様に、Bifidobacterium longum MM-2(MM-2)、Lactobacillus acidophilus KS-13(KS-13)、Streptococcus faecalis 129 BIO3B(3B)及びBifidobacterium bifidum G9-1(G9-1)を用いた。
(動物)
7週齢のBALB/cAJcl[GF]雄性無菌マウス(日本クレア)を無菌アイソレーター(日本クレア)内にて飼育し、1週間の馴化期間後、実験に供した。飼料は、CE-2飼料(日本クレア)を自由に与え、上水道水を給水瓶により自由に摂取させた。
7週齢のBALB/cAJcl[GF]雄性無菌マウス(日本クレア)を無菌アイソレーター(日本クレア)内にて飼育し、1週間の馴化期間後、実験に供した。飼料は、CE-2飼料(日本クレア)を自由に与え、上水道水を給水瓶により自由に摂取させた。
(試験方法)
KS-13、3BおよびG9-1、ならびにMM-2、KS-13、3BおよびG9-1の凍結保存菌株を、各湿菌株が2.0×108 CFUずつとなるように、それぞれ0.2 mL PBSに懸濁したもののいずれかを、各無菌マウスに単回強制経口投与した。以下、MM-2を投与していない処置群を「G9-1/KS-13/3B群」、MM-2を投与した処置群を「G9-1/KS-13/3B/MM-2群」とも呼ぶ。投与24時間後にイソフルラン麻酔下で盲腸を摘出し、内容物中の有機酸量をNaganoらの方法 (Adv Microbiol 5: 531-540、2015) に従って測定した。
KS-13、3BおよびG9-1、ならびにMM-2、KS-13、3BおよびG9-1の凍結保存菌株を、各湿菌株が2.0×108 CFUずつとなるように、それぞれ0.2 mL PBSに懸濁したもののいずれかを、各無菌マウスに単回強制経口投与した。以下、MM-2を投与していない処置群を「G9-1/KS-13/3B群」、MM-2を投与した処置群を「G9-1/KS-13/3B/MM-2群」とも呼ぶ。投与24時間後にイソフルラン麻酔下で盲腸を摘出し、内容物中の有機酸量をNaganoらの方法 (Adv Microbiol 5: 531-540、2015) に従って測定した。
(結果)
無菌動物における各群の盲腸内有機酸量を図4に示した。G9-1/KS-13/3B群は0.33 mg/g (このうち、乳酸の量は、0.113 mg/mL、酢酸の量は、0.215 mg/mL)、G9-1/KS-13/3B/MM-2群は1.02 mg/g (このうち、乳酸の量は、0.623 mg/mL、酢酸の量は、0.401 mg/mL)であり、MM-2を添加することにより3.09倍の有機酸増加が認められた(このうち、乳酸の増加量は、5.51倍、酢酸の増加量は、1.87倍)。
上記した参考例に基づけば、MM-2を添加した場合には、KS-13、3BおよびG9-1から1.35倍程の有機酸産生量の増加が見込めると考えられるところ、実際には、MM-2を添加することにより、KS-13、3BおよびG9-1の盲腸での有機酸産生量が3.09倍になっていたので、MM-2の添加により、KS-13、3BおよびG9-1、すなわち、腸内有用菌の盲腸内有機酸産生量が相乗的に増加することが示された。
以上の結果により、ビフィドバクテリウム ロンガム菌(MM-2)を添加することにより、KS-13、3BおよびG9-1、すなわち、腸内有用菌の有機酸産生量が増強されることが示された。
無菌動物における各群の盲腸内有機酸量を図4に示した。G9-1/KS-13/3B群は0.33 mg/g (このうち、乳酸の量は、0.113 mg/mL、酢酸の量は、0.215 mg/mL)、G9-1/KS-13/3B/MM-2群は1.02 mg/g (このうち、乳酸の量は、0.623 mg/mL、酢酸の量は、0.401 mg/mL)であり、MM-2を添加することにより3.09倍の有機酸増加が認められた(このうち、乳酸の増加量は、5.51倍、酢酸の増加量は、1.87倍)。
上記した参考例に基づけば、MM-2を添加した場合には、KS-13、3BおよびG9-1から1.35倍程の有機酸産生量の増加が見込めると考えられるところ、実際には、MM-2を添加することにより、KS-13、3BおよびG9-1の盲腸での有機酸産生量が3.09倍になっていたので、MM-2の添加により、KS-13、3BおよびG9-1、すなわち、腸内有用菌の盲腸内有機酸産生量が相乗的に増加することが示された。
以上の結果により、ビフィドバクテリウム ロンガム菌(MM-2)を添加することにより、KS-13、3BおよびG9-1、すなわち、腸内有用菌の有機酸産生量が増強されることが示された。
[実施例2]無菌動物消化管内での菌数測定試験
(被検菌株)
参考例及び実施例1と同様に、Bifidobacterium longum MM-2(MM-2)、Lactobacillus acidophilus KS-13(KS-13)、Streptococcus faecalis 129 BIO3B(3B)及びBifidobacterium bifidum G9-1(G9-1)を用いた。
(被検菌株)
参考例及び実施例1と同様に、Bifidobacterium longum MM-2(MM-2)、Lactobacillus acidophilus KS-13(KS-13)、Streptococcus faecalis 129 BIO3B(3B)及びBifidobacterium bifidum G9-1(G9-1)を用いた。
(動物)
実施例1と同様に、7週齢のBALB/cAJcl[GF]雄性無菌マウス(日本クレア)を無菌アイソレーター(日本クレア)内にて飼育し、1週間の馴化期間後、実験に供した。飼料は、CE-2飼料(日本クレア)を自由に与え、上水道水を給水瓶により自由に摂取させた。
実施例1と同様に、7週齢のBALB/cAJcl[GF]雄性無菌マウス(日本クレア)を無菌アイソレーター(日本クレア)内にて飼育し、1週間の馴化期間後、実験に供した。飼料は、CE-2飼料(日本クレア)を自由に与え、上水道水を給水瓶により自由に摂取させた。
(試験方法)
KS-13、3BおよびG9-1、ならびにMM-2、KS-13、3BおよびG9-1の冷凍保存菌株を、各湿菌株が2.0×108 CFUずつとなるように0.2 mL PBSに懸濁した後、いずれかを、各無菌マウスに単回強制経口投与した。投与24時間後にイソフルラン麻酔下で大腸を摘出し、大腸内容物中の菌数を、定量PCR法を用いて測定した。大腸内容物のDNA抽出は、Matsukiらの方法 (APPL. ENVIRON. MICROBIOL. Dec. 2004, p. 7220-7228) に従って行った。定量 PCR法は、PowerUp SYBR Green Master Mix を使用し、QuantStudio 3 Real-Time PCR System(Applied Biosystems TM; Thermo Fisher Scientific、Inc.)を用いて大腸における菌数を測定した。使用した各菌の特異的プライマーの塩基配列は、表1に示した。
KS-13、3BおよびG9-1、ならびにMM-2、KS-13、3BおよびG9-1の冷凍保存菌株を、各湿菌株が2.0×108 CFUずつとなるように0.2 mL PBSに懸濁した後、いずれかを、各無菌マウスに単回強制経口投与した。投与24時間後にイソフルラン麻酔下で大腸を摘出し、大腸内容物中の菌数を、定量PCR法を用いて測定した。大腸内容物のDNA抽出は、Matsukiらの方法 (APPL. ENVIRON. MICROBIOL. Dec. 2004, p. 7220-7228) に従って行った。定量 PCR法は、PowerUp SYBR Green Master Mix を使用し、QuantStudio 3 Real-Time PCR System(Applied Biosystems TM; Thermo Fisher Scientific、Inc.)を用いて大腸における菌数を測定した。使用した各菌の特異的プライマーの塩基配列は、表1に示した。
(結果)
大腸における各菌株の菌数は、G9-1/KS-13/3B群とG9-1/KS-13/3B/MM-2群を比較するとG9-1/KS-13/3B/MM-2群の方が、G9-1/KS-13/3B群より菌数が多い結果となった(図5)。
以上の結果より、ビフィドバクテリウム ロンガム菌(MM-2)を添加することにより、KS-13、3BおよびG9-1、すなわち、腸内有用菌の大腸での菌数が増加することから、MM-2により、腸内有用菌の増殖が増強されることが示された。
大腸における各菌株の菌数は、G9-1/KS-13/3B群とG9-1/KS-13/3B/MM-2群を比較するとG9-1/KS-13/3B/MM-2群の方が、G9-1/KS-13/3B群より菌数が多い結果となった(図5)。
以上の結果より、ビフィドバクテリウム ロンガム菌(MM-2)を添加することにより、KS-13、3BおよびG9-1、すなわち、腸内有用菌の大腸での菌数が増加することから、MM-2により、腸内有用菌の増殖が増強されることが示された。
本発明の方法は、効率よく、工業的有利に腸内有用菌を得ることが出来、また、有機酸産生能の向上等により、腸内有用菌の働きを向上させることが出来るため、腸内有用菌、特に、乳酸菌及び/又はビフィズス菌の培養に有用である。特に、医薬又は食品の分野で有用な腸内有用菌を、効率よく、機能の高い状態で得ることが出来るため、有用である。
Claims (8)
- ビフィドバクテリウム ロンガム(Bifidobacterium longum)菌を含有することを特徴とする、腸内有用菌の増殖及び有機酸産生増強剤。
- 腸内有用菌が乳酸菌及び/又はビフィズス菌であることを特徴とする、請求項1に記載の剤。
- ビフィドバクテリウム ロンガム菌が、ビフィドバクテリウム ロンガム MM−2株(Bifidobacterium longum MM-2、受託番号:NITE BP-818)であることを特徴とする、請求項1又は2に記載の剤。
- 乳酸菌が、ラクトバシラス(Lactobacillus)属、ストレプトコッカス(Streptococcus)属、エンテロコッカス (Enterococcus)属、ラクトコッカス(Lactococcus)属、テトラジェノコッカス(Tetragenococcus)属、ペディオコッカス(Pediococcus)属及びオエノコッカス(Oenococcus)属の菌からなる群から選択される1種以上であること、及び/又は
ビフィズス菌が、ビフィドバクテリウム(Bifidobacterium)属から選択される1種以上であることを特徴とする、請求項2又は3に記載の剤。 - ビフィドバクテリウム ロンガム(Bifidobacterium longum)菌及びプロバイオティクスを含有することを特徴とする、腸内有用菌の増殖及び有機酸産生増強剤。
- プロバイオティクスが乳酸菌及び/又はビフィズス菌であることを特徴とする、請求項5に記載の剤。
- 乳酸菌が、ラクトバシラス(Lactobacillus)属、ストレプトコッカス(Streptococcus)属、エンテロコッカス(Enterococcus)属、ラクトコッカス(Lactococcus)属、テトラジェノコッカス(Tetragenococcus)属、ペディオコッカス(Pediococcus)属及びオエノコッカス(Oenococcus)属の菌からなる群から選択される1種以上であること、及び/又は
ビフィズス菌が、ビフィドバクテリウム(Bifidobacterium)属から選択される1種以上であることを特徴とする、請求項6に記載の剤。 - 請求項1〜7に記載の剤の、腸内有用菌増殖用薬及び/又は有機酸産生用薬を製造するための使用。
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---|---|---|---|---|
WO2022203379A1 (ko) * | 2021-03-26 | 2022-09-29 | 서울대학교산학협력단 | 유산균의 생리활성 효능 증진용 조성물 |
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WO2016103699A1 (ja) * | 2014-12-26 | 2016-06-30 | 株式会社明治 | 有機酸の産生促進剤、並びに炎症性腸疾患の予防及び/又は改善剤 |
WO2018074514A1 (ja) * | 2016-10-20 | 2018-04-26 | ビオフェルミン製薬株式会社 | 腸管のイオン経細胞輸送体への作用剤、クロライドチャネル活性化剤、腎疾患の予防もしくは治療剤、又は排便促進剤 |
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-
2019
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2020
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