WO2020189228A1 - 腸内有用菌の増殖及び有機酸産生増強剤 - Google Patents

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WO2020189228A1
WO2020189228A1 PCT/JP2020/008438 JP2020008438W WO2020189228A1 WO 2020189228 A1 WO2020189228 A1 WO 2020189228A1 JP 2020008438 W JP2020008438 W JP 2020008438W WO 2020189228 A1 WO2020189228 A1 WO 2020189228A1
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WO
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bacteria
bifidobacterium longum
useful
bifidobacterium
organic acid
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PCT/JP2020/008438
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English (en)
French (fr)
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彩子 前田
寛 巻▲崎▼
田中　良紀
中島　淳二
Original Assignee
ビオフェルミン製薬株式会社
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K10/00—Animal feeding-stuffs
    • A23K10/10—Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes
    • A23K10/16—Addition of microorganisms or extracts thereof, e.g. single-cell proteins, to feeding-stuff compositions
    • A23K10/18—Addition of microorganisms or extracts thereof, e.g. single-cell proteins, to feeding-stuff compositions of live microorganisms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/135—Bacteria or derivatives thereof, e.g. probiotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/741—Probiotics
    • A61K35/744—Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
    • A61K35/745—Bifidobacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor

Definitions

  • the present invention relates to an agent for enhancing the growth of useful intestinal bacteria and organic acid production, which is characterized by containing Bifidobacterium Longum bacterium.
  • Lactic acid bacteria and bifidobacteria have long been widely used in the production of fermented foods, alcoholic beverages, and fermented pickles.
  • these lactic acid bacteria and bifidobacteria there are those that perform homofermentation that produces lactic acid by decomposing lactose and oligosaccharides, and those that perform heterofermentation that produces lactic acid and acetic acid.
  • Lactic acid bacteria and bifidobacteria are useful in the intestine because they decompose lactose and oligosaccharides to produce lactic acid and acetic acid, significantly lower the pH in the intestine, and have the effect of adjusting the intestinal environment as good bacteria.
  • a fungus Known as a fungus.
  • Patent Document 1 describes that the growth of bifidobacteria is increased by a mixture of lactic acid bacteria and natto bacteria.
  • Bifidobacterium longum bacterium enhances the organic acid-producing ability of the intestinal useful bacterium and the growth of the intestinal useful bacterium.
  • the present invention provides an agent for growing intestinal useful bacteria, preferably lactic acid bacteria and / or bifidobacteria, and an agent for improving the organic acid-producing ability of such intestinal useful bacteria by Bifidobacterium longum. Is the subject.
  • the present inventors by administering Bifidobacterium longum bacterium in vivo, proliferate useful intestinal bacteria, preferably lactic acid bacteria and / or bifidobacteria. It was found that it can be efficiently and industrially advantageous, and that the organic acid producing ability of intestinal useful bacteria is improved. The present inventors further proceeded with research based on such findings, and came to complete the present invention.
  • the present invention includes the following inventions in order to solve the above problems.
  • An agent for enhancing the growth of useful intestinal bacteria and organic acid production which comprises Bifidobacterium longum.
  • Bifidobacterium longum is a Bifidobacterium longum MM-2 strain (accession number: NITE BP-818), [1] or [2]. The agent described in.
  • Lactobacillus includes the genera Lactobacillus, Streptococcus, Enterococcus, Lactococcus, Tetragenococcus, Pediococcus and Pediococcus.
  • One or more species selected from the group consisting of bacteria of the genus, and / or Bifidobacterium is one or more species selected from the genus Bifidobacterium, [2. ] Or the agent according to [3].
  • An agent for enhancing the growth of useful intestinal bacteria and organic acid production which comprises Bifidobacterium longum bacteria and probiotics.
  • Lactobacillus is Lactobacillus, Streptococcus, Enterococcus, Lactococcus, Tetragenococcus, Tetragenococcus, Pediococcus and Pediococcus.
  • Lactobacillus is Lactobacillus, Streptococcus, Enterococcus, Lactococcus, Tetragenococcus, Tetragenococcus, Pediococcus and Pediococcus.
  • / or Bifidobacterium is one or more selected from the genus Bifidobacterium. 6].
  • [8] Use of the agent according to the above [1] to [7] for producing a drug for growing useful intestinal bacteria and / or a drug for producing an organic acid.
  • [8-2] The use according to the above [8], wherein the useful intestinal bacteria are lactic acid bacteria and / or bifidobacteria.
  • the Bifidobacterium longum MM-2 strain (Bifidobacterium longum MM-2, accession number: NITE BP-818) is characterized by [8] or [ 8-2].
  • a method for increasing the growth of useful intestinal bacteria and enhancing the production of organic acids which comprises a step of administering Bifidobacterium longum bacteria to humans or animals other than humans.
  • the present invention provides an agent for enhancing the growth of useful intestinal bacteria and organic acid production, which is characterized by containing Bifidobacterium Longum bacterium.
  • a useful intestinal bacterium can be obtained efficiently, industrially advantageously, or in a highly active state. ..
  • FIG. 1 is a diagram showing an outline of a spray drying device.
  • FIG. 2 shows the amount of organic acid produced in the medium when each strain was cultured.
  • FIG. 3 shows the total amount of organic acid produced by each strain.
  • FIG. 4 shows the amount of organic acid produced in the cecum of each group in germ-free animals.
  • FIG. 5 shows the number of bacteria in the large intestine of each group in germ-free animals.
  • the Bifidobacterium longum bacterium used in the present invention is preferably, but is not limited to, Bifidobacterium longum MM-2 strain (accession number: NITE BP-818).
  • the proportion of Bifidobacterium longum bacterium contained is, for example, about 10 4 to 10 10 cfu / mL, preferably about 10 6 to 10 when the agent is a liquid.
  • Bifidobacterium longum bacterium is 10 5 to 10 10 cfu / g mass%, preferably the entire agent, based on the whole agent.
  • 10 6 to 10 9 cfu / g mass% and the like may be contained, but the content is not limited thereto.
  • the intestinal useful bacteria used in the present invention are not particularly limited, and for example, lactic acid bacteria such as lactic acid bacilli and lactic acid cocci and bifidobacteria, that is, bacteria belonging to the genus Bifidobacterium can be preferably used. Not limited to these.
  • the intestinal useful bacteria are preferably lactic acid bacteria and / or bifidobacteria. Particularly preferably, it contains both lactic acid bacteria and bifidobacteria.
  • bifidobacteria are included in lactic acid bacteria in a broad sense, but in the present invention, these are distinguished.
  • the term "intestine” refers to the inside or surface of the intestine such as the cecum, large intestine, small intestine, jejunum, ileum, duodenum, and colon in an animal body, preferably the large intestine, small intestine, or cecum. Not limited to these.
  • the animal having an intestinal tract is preferably a mammal. Mammals include, but are not limited to, humans, mice, rats, rabbits, dogs, cats, cows, horses, pigs, monkeys and the like.
  • such lactic acid bacterium is, for example, Lactobacillus acidophilus, L. casei, L. gasseri, L. plantarum, L. delbrueckii subsp bulgaricus, L. delbrueckii subsp lactis, Lactobacillus genus Lactobacillus lactic acid rods such as L. fermentum, L. helveticus, L. johnsonii, L. paracasei subsp. Paracasei, L. reuteri, L.
  • cremoris Tetragenococcus halophilus, Pediococcus Lactobacillus of the genus (Pediococcus), Lactobacillus of the genus Oenococcus such as Oenococcus oeni, etc.
  • the bacteria are classified according to the current taxonomy, but according to the past classification, the genus Streptococcus includes the genus Streptococcus and the genus Enterococcus. There is also.
  • the genus Lactobacillus is preferable, and moreover, Lactobacillus acidophilus, L. gasseri, L. johnsonii, Lactobacillus paracasei subspecies paracasei (L. paracasei) .paracasei), Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus salivarius, or Lactobacillus brevis, especially Lactobacillus K (Lactobacillus acidophilus KS-13) and the like are preferable, but the present invention is not limited thereto.
  • Lactobacillus K Lactobacillus acidophilus KS-13
  • Streptococcus faecalis and in particular, Streptococcus faecalis 129 BIO3B (Streptococcus faecalis 129 BIO3B) is preferably used, but is not limited thereto.
  • the lactic acid bacterium may be a single substance or a mixture of a plurality of lactic acid bacteria.
  • the useful intestinal bacteria include 1 to 5 types of lactic acid bacteria. More preferably, 1 to 3 types of lactic acid bacteria are contained. Particularly preferably, one or two types of lactic acid bacteria are contained.
  • bifidobacteria when the intestinal useful bacterium is bifidobacteria, such bifidobacteria are, for example, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve. (Bifidobacterium breve), Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium pseudolongum, and Bifidobacterium thermofilm (Bifidobacterium thermofilm) ), Etc., but are not limited to these.
  • the bifidobacteria it is preferable to use Bifidobacterium bifidum and Bifidobacterium longum, and in particular, Bifidobacterium bifidum G9-1 (accession number: NITE BP-817).
  • the bifidobacteria may be used alone, or a plurality of bifidobacteria may be mixed and used.
  • the intestinal useful bacteria include 1 to 5 types of bifidobacteria. More preferably, 1 to 3 types of bifidobacteria are contained. Particularly preferably, one or two types of bifidobacteria are contained.
  • both the above-mentioned lactic acid bacteria and bifidobacteria are preferably included as useful intestinal bacteria.
  • Lactic acid bacteria and bifidobacteria are contained in, for example, 1 to 10 kinds in total in useful intestinal bacteria.
  • a total of 1 to 5 types are included.
  • Particularly preferably, 1 to 3 types are contained in total.
  • the agent containing Bifidobacterium longum may include probiotics.
  • a "probiotic” is usually a living bacterium that has a positive effect on the body, or a preparation of such a bacterium, which, when administered in an effective amount, to the health or health condition of the subject. It means something that can provide a beneficial effect.
  • it is distinguished from useful intestinal bacteria existing in the intestine of animals as contained in the agent, but as the bacterial species of probiotics, the above-mentioned Bifidobacterium longum bacterium and intestine are used. It may be the same as or different from the internal useful bacteria.
  • the probiotics are lactic acid bacteria and / or bifidobacteria.
  • the same bacterial species as those listed as useful intestinal bacteria can be similarly preferably used, but different bacterial species may be used.
  • the probiotics may be known useful bacteria such as saccharifying bacteria and butyrate-producing bacteria.
  • saccharifying bacteria such as Bacillus subtilis, Bacillus mesentericus, Bacillus polyformenticus; spore-forming lactic acid bacteria such as Bacillus coagulans; butyric acid bacteria such as Bacillus toyoi, B. licheniformis, Clostridium butyricum; and other useful bacteria.
  • probiotics are usually non-pathogenic.
  • bifidobacteria longum bacterium, lactic acid bacterium, bifidobacteria, other useful bacteria, probiotics and other bacterial cells are, for example, ATCC (registered trademark) or IFO, etc., Japan Bifidobacterium Center, Independent Administrative Institution It can be easily obtained from the Patented Microorganisms Depositary Center, etc.
  • ATCC registered trademark
  • IFO Independent Administrative Institution
  • commercially available products can be used as appropriate.
  • these cells before culturing may be stored in a frozen state.
  • Streptococcus faecalis 129 BIO3B Streptococcus faecalis 129 BIO3B
  • Lactobacillus acidophilus KS-13 Lactobacillus acidophilus KS-13
  • Bifidobacterium bifidum G9-1 from Bifidobacterium bifidum G9-1
  • Bifidobacterium longum MM-2 strain (Bifidobacterium longum MM-2) is a National Institute of Technology and Evaluation Patent Microorganisms Depositary Center (NPMD) (Address: 292-0818 Kisarazu, Chiba Prefecture, Japan). It has been internationally deposited in Kazusakamatari City, Room 2-5-8 122) on September 30, 2009 (original deposit date: September 17, 2009) under the accession number NITE BP-818.
  • Bifidobacterium bifidum G9-1 is a National Institute of Technology and Evaluation Patent Microorganisms Depositary Center (NPMD) (Address: 292-0818 Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan). It has been internationally deposited in Kazusakamatari Room 2-5-8 122) on September 30, 2009 (original deposit date: September 17, 2009) under the accession number NITE BP-817.
  • Bifidobacterium Longum and / or useful intestinal bacteria are inoculated into a medium and cultured.
  • a known medium for culturing lactic acid bacteria such as MRS medium, LBS medium, and Logasa medium, which is a highly nutritious general-purpose growth medium, may be referred to.
  • a medium for anaerobic bacteria can also be preferably used.
  • a GAM liquid medium such as GAM bouillon or modified GAM bouillon can be preferably used, but the present invention is not limited thereto.
  • the medium of the present invention contains carbon sources, nitrogen sources, amino acids, vitamins, minerals, animal and plant proteins or extracts thereof and decomposition products, inorganic salts, buffers, surfactants, antibiotics, stabilizers, water or any of them. Combinations and the like may be contained, but the present invention is not limited to these.
  • a commercially available product can be obtained and used as appropriate.
  • the nitrogen source examples include animal or vegetable peptone, ammonium salts such as ammonium nitrate, ammonium sulfate, ammonium chloride and ammonium acetate, hydrates thereof, ammonia and the like.
  • peptone for example, soybean peptone, proteose peptone, casein peptone, myocardial peptone, meat peptone and the like can be preferably used, but the peptone is not limited thereto.
  • the content ratio of the nitrogen source in the medium may be, for example, 0.1 to 1% by mass or 0.1 to 0.5% by mass with respect to the entire medium, but is limited thereto. Not done.
  • Examples of the carbon source include monosaccharides, disaccharides, trisaccharides, tetrasaccharides, oligosaccharides, polysaccharides and the like.
  • Examples of monosaccharides include glucose, xylose, arabinose, mannose, galactose or any combination thereof.
  • Examples of the disaccharide include maltose, cellobiose, trehalose, sucrose, lactulose, lactose, or any combination thereof.
  • the content ratio of the carbon source in the medium may be, for example, 0.1 to 1% by mass or 0.1 to 0.5% by mass with respect to the entire medium, but is limited to these. Not done.
  • the medium of the present invention preferably contains components such as amino acids and vitamins as growth factors.
  • Amino acids include alanine, cysteine, aspartic acid, glutamic acid, phenylalanine, glycine, histidine, isoleucine, lysine, leucine, methionine, aspartic acid, pyrrolysine, proline, glutamine, arginine, serine, threonine, selenocysteine, valine, tryptophan, tyrosine or Any combination of these, salts thereof, etc. are exemplified, but not limited thereto. These amino acids are usually L-shaped.
  • the content ratio of amino acids in the medium may be, for example, 0.01 to 0.1% by mass or 0.01 to 0.05% by mass with respect to the entire medium, but is limited thereto. Not done.
  • vitamins such as vitamins A, B, C, D, E and K or derivatives thereof, or salts thereof, biotin, riboflavin, thiamine or any combination thereof are preferably used, but are limited thereto. Not done.
  • the content ratio of vitamins in the medium may be, for example, 0.01 to 0.1% by mass or 0.01 to 0.05% by mass with respect to the whole medium. Not limited.
  • the mineral magnesium, potassium, calcium, phosphorus, zinc, iron and the like can be preferably used, but the minerals are not limited thereto.
  • the content ratio of minerals in the medium may be, for example, 0.01 to 0.1% by mass or 0.01 to 0.05% by mass with respect to the entire medium. Not limited.
  • a plant extract, a meat extract, a liver extract or a yeast extract can be preferably used as the animal and plant protein or its extract and its decomposition product.
  • the content ratio of such an extract or a decomposition product thereof in the medium may be, for example, 0.1 to 1% by mass or 0.1 to 0.5% by mass with respect to the entire medium. Good, but not limited to these.
  • inorganic salts include, but are not limited to, phosphates, sodium chloride, sodium nitrate, potassium nitrate, manganese sulfate hydrate, magnesium sulfate hydrate, and the like.
  • the content ratio of the inorganic salts in the medium may be, for example, 0.01 to 0.1% by mass or 0.01 to 0.05% by mass with respect to the entire medium. Not limited to.
  • buffering agent examples include, but are not limited to, PBS, HBSS, HEPES, HANKS, and the like.
  • surfactant for example, polysorbates such as polysorbate 20, polysorbate 60, polysorbate 65, and polysorbate 80, macrogol, sodium lauryl sulfate, and the like can be preferably used, but the surfactant is not limited thereto.
  • antibiotic examples include, but are not limited to, penicillin and mycin antibiotics such as streptomycin and kanamycin.
  • medium components or additives include carbonates, bicarbonates, albumin, insulin, transferrin, selenium, hormones, cytokines, L-cysteine hydrochloride, sodium thioglycolate, hemin, soluble starch, digested serum powder, vitamins. , Short chain fatty acids and the like may be included, but the present invention is not limited thereto.
  • Each of the above-exemplified components can be mixed and heat sterilized using a high-pressure steam sterilizer to prepare a medium.
  • the liquidity of the medium is preferably neutral (for example, pH 6 to 8, pH 7 to 8), and a known pH adjuster or the above-mentioned buffer may be used to make the medium neutral.
  • the proportion of bacteria of the Bifidobacterium genus to medium for example, be a 10 1 ⁇ 10 8 cfu / mL , 10 5 ⁇ 10 It may be 8 cfu / mL, but is not limited to these.
  • the medium for inoculation (for seed culture) and the medium for growth (for main culture) may be the same or different.
  • the ratio of Bifidobacterium to the animal body may be, for example, 10 5 to 10 12 cfu / human, preferably 10 6 to 10 9 cfu / human for humans. However, it is not limited to these.
  • the human may be an adult or a child.
  • the temperature of the culture is preferably, for example, 25 to 45 ° C, more preferably 36 to 38 ° C.
  • the culture time is preferably, for example, 4 to 72 hours, more preferably 12 to 24 hours.
  • Bifidobacterium is likely to grow within the range of these culture temperatures or culture times.
  • An anaerobic box or an anaerobic chamber may be used for culturing bifidobacteria under anaerobic conditions.
  • As the anaerobic box or anaerobic chamber a commercially available one may be used.
  • the form of the bacterial cells used in the present invention is not particularly limited, and any form such as live bacterial cells, wet bacterial cells, and dried bacteria can be used. Further, a treated product of bacteria further treated with live cells, wet cells, dried bacteria and the like may be used.
  • the processed product of the bacterium is a product obtained by applying some treatment to lactic acid bacteria, and the treatment is not particularly limited. Specific examples of the treated product include a crushed solution of the cells by ultrasonic waves, a culture solution or culture supernatant of the cells, and a solid residue separated by a solid-liquid separation means such as filtration or centrifugation. Be done.
  • a treatment solution in which the cell wall is removed by an enzyme or mechanical means a protein complex (protein, lipoprotein, glycoprotein, etc.) or a peptide complex (peptide, glycopeptide, etc.) obtained by trichloroacetic acid treatment or salting treatment, etc. ) And the like as the processed product. Further, these concentrates, dilutions thereof, dried products thereof and the like are also included in the treated product. How to ingest the cells from the culture solution and obtain the untreated product from the cells has been well established in the art, and may be followed in the present invention.
  • the processed product of the present invention also includes a crushed solution of the cells by ultrasonic waves, a culture solution of the cells, a culture supernatant, or the like, which is further subjected to a treatment such as separation by various chromatographies. .. Killed cells are also included in the processed product of the bacteria in the present invention. Killed cells can be obtained by, for example, enzyme treatment, heat treatment, treatment with a drug such as an antibiotic, treatment with a chemical substance such as formalin, treatment with radiation such as ⁇ -rays, or the like. These techniques are well established in the past and may follow such techniques in the present invention.
  • the above cells are dispersed in a solvent to prepare a cell fluid.
  • a solvent for dispersing the cells to obtain the cell solution a known solvent used in the art may be used, but a buffer solution such as water or PBS is preferable. Further, if desired, ethanol or the like may be added.
  • the cell fluid may be a suspension and the solvent may be the same as shown above. Further, when suspending, a suspending agent such as sodium alginate may be used.
  • additives generally used in the art such as excipients, binders, disintegrants, and antistatic agents may be further added to the cell fluid in a normal blending ratio according to known techniques.
  • excipient examples include lactose, sucrose, D-mannitol, corn starch, powdered cellulose, calcium hydrogen phosphate, calcium carbonate and the like.
  • binder examples include hydroxypropyl cellulose, polyvinylpyrrolidone, xanthan gum and the like.
  • disintegrant examples include low-degree-of-substitution hydroxypropyl cellulose, carmellose calcium, partially pregelatinized starch, croscarmellose sodium, crospovidone, carboxymethyl starch and the like.
  • antistatic agent examples include fine powder or non-fine powder talc, colloidal silica, processed silica, precipitated silica and the like.
  • sterilization is preferably performed by, for example, filter filtration, but other known sterilization methods such as a heating method such as a moist heat sterilization method, a dry heat sterilization method, and a high frequency sterilization method, ethylene oxide Sterilization may be performed by a gas method such as a gas sterilization method or a sterilization method using hydrogen peroxide, a radiation method such as a gamma ray irradiation sterilization method, or an electron beam irradiation sterilization method.
  • a heating method such as a moist heat sterilization method, a dry heat sterilization method, and a high frequency sterilization method
  • ethylene oxide Sterilization may be performed by a gas method such as a gas sterilization method or a sterilization method using hydrogen peroxide, a radiation method such as a gamma ray irradiation sterilization method, or an electron beam irradiation sterilization method.
  • Dried bacteria can be obtained by subjecting the above-mentioned cell fluid to a drying operation using a spray drying device in order to produce a dried cell solution.
  • the spray drying device is preferably a spray drying device provided with an atomizing device capable of forming single micron spray droplets.
  • the single micron droplet means that the particle size of the spray droplet is preferably 1 to 10 ⁇ m rounded to the first decimal place.
  • the spray dryer examples include a rotary atomizer (rotary disk), a pressure nozzle, and a spray dryer which is a two-fluid nozzle or a four-fluid nozzle utilizing the power of a compressed gas.
  • the spray drying device may be any of the above types of spray drying devices as long as it can form single micron spray droplets, but it is preferable to use a spray drying device having a four-fluid nozzle.
  • the structure of the four-fluid nozzle preferably has a gas flow path and a liquid flow path as one system, which are provided symmetrically at the two-system nozzle edge. It constitutes a slope that serves as a fluid flow surface.
  • an external mixing type device that collects the compressed gas and the liquid at one point from both sides toward the collision focus at the tip of the nozzle edge is preferable. With this method, it is possible to spray for a long time without clogging the nozzle.
  • a spray drying device having a 4-channel nozzle will be described in more detail with reference to FIG.
  • the bacterial cell liquid that springs out from the liquid flow path 3 or 4 is thinly stretched and stretched on the fluid flow surface 5 by the high-speed gas flow that emerges from the gas flow path 1 or 2.
  • the liquid is atomized by a shock wave generated at the collision focal point 6 at the tip of the nozzle edge to form a single-micron spray droplet 7.
  • an inert gas such as air, carbon dioxide gas, nitrogen gas or argon gas
  • an inert gas such as carbon dioxide gas, nitrogen gas or argon gas
  • the pressure of the compressed gas is usually about 1 to 15 kg weight / cm 2 , preferably about 3 to 8 kg weight / cm 2 .
  • the amount of gas in the nozzle is usually about 1 to 100 L / min, preferably about 10 to 20 L / min, per 1 mm of nozzle edge.
  • the inlet temperature of the drying chamber is usually about 2 to 400 ° C, preferably about 5 to 250 ° C, more preferably about 5 to 150 ° C. Even if the inlet temperature is as high as about 200 to 400 ° C, the temperature in the drying chamber does not rise so much due to the heat of vaporization due to the evaporation of water, and by shortening the residence time in the drying chamber, live bacteria can be killed. Damage can be suppressed to some extent.
  • the outlet temperature is usually about 0 to 120 ° C., preferably about 5 to 90 ° C., more preferably about 5 to 70 ° C.
  • the viable cell rate can be increased and a preparation having a high viable cell rate can be provided. That is, in order to obtain a single micron dried cell, it is preferable to spray a single micron spray droplet.
  • the particle size of the spray droplets is reduced, the surface area per unit mass of the spray droplets increases, so that contact with the dry warm air is efficiently performed, and the cells are killed or damaged by the heat of the dry warm air as much as possible. It can be suppressed. As a result, a dried cell product having an increased viable cell rate and a large viable cell count can be obtained.
  • Wet cells can be obtained by a method known in the art, such as a method of collecting cells from a culture solution by centrifugation, washing with a phosphate buffer solution or the like, and cryopreserving the cells obtained by centrifugation again. Obtainable.
  • the agent of the present invention can usually be easily produced by mixing Bifidobacterium Longum bacterium with other components.
  • the other components are not particularly limited as long as the effects of the present invention are exhibited.
  • the agent of the present invention can be used in the form of pharmaceuticals, quasi-drugs, foods and drinks, feeds and the like. Such a pharmaceutical product containing the agent of the present invention is also one of the preferred embodiments of the present invention.
  • compositions containing the agent of the present invention can be provided a composition containing the agent of the present invention.
  • additives commonly used in the art can be used in such compositions, such as water, solvents, pH regulators, moisturizers, flavoring agents, sweeteners, thickeners, flavoring agents, etc. Examples include, but are not limited to, gelling agents, dissolving agents, coloring agents, preservatives, surfactants, suspending agents, emulsifiers and stabilizers.
  • agent of the present invention and the composition using the agent of the present invention may contain prebiotics.
  • prebiotics are edible compounds that are usually resistant to digestion by the host and satisfy the conditions for assimilation of probiotics bacteria, and usually the growth of probiotics bacteria in the intestinal tract or the like. It promotes.
  • Bifidobacterium longum and useful intestinal bacteria are generally anaerobic and weak against air or oxygen in a dry state, and are weak against high temperature and humidity. When formulating, it is preferable to treat in the presence of an inert gas or in a vacuum or at a low temperature as much as possible.
  • the agent of the present invention may be administered to humans or non-human animals.
  • the administration form of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include oral administration, parenteral administration (intravenous administration, transdermal administration, topical ocular administration, etc.).
  • Examples of the dosage form of the present invention include tablets, capsules, granules, powders and the like in the case of oral preparations, and inserts and the like as parenteral preparations.
  • the dose can be appropriately selected according to the dosage type, patient's symptoms, age, body weight and the like.
  • 0.05 to 5000 mg per 1 kg of body weight and preferably 0.1 to 2000 mg, particularly preferably 1 to 1000 mg can be administered once to several times a day. , Not limited to these.
  • Organic acids produced by useful intestinal bacteria As the organic acid produced by the intestinal useful bacteria of the present invention, short-chain fatty acids such as lactic acid, acetic acid, succinic acid, formic acid, propionic acid, pyruvate, isobutyric acid, n-butyric acid, and isovaleric acid are preferable. Examples thereof include n-valeric acid and mixtures thereof, with lactic acid and / or acetic acid being preferred, but not limited to these. These organic acids are thought to be produced by the decomposition of lactose, oligosaccharides, etc. in the medium, plants, animals, etc. by Bifidobacterium longum bacteria and useful intestinal bacteria. Details are unknown. In the present invention, Bifidobacterium longum also produces an organic acid. The organic acid is as described above.
  • the present invention also includes a method for producing an organic acid, which comprises a step of culturing Bifidobacterium longum bacterium in the presence of useful intestinal bacterium.
  • Bifidobacterium Longum bacterium and useful intestinal bacterium can be cultured according to the above-mentioned method for obtaining bacterial cells.
  • the growth ability and / or the ability to produce an organic acid of useful intestinal bacteria is enhanced, and further, the Bifidobacterium longum bacterium also produces an organic acid, so that it is efficient. Organic acids can be obtained.
  • the agent containing the Bifidobacterium longum bacterium of the present invention can improve the organic acid producing ability of the intestinal useful bacterium.
  • the intestinal useful bacteria are cultivated in the state of containing the longum bacterium of the present invention.
  • the amount of organic acid produced by the intestinal useful bacteria is, for example, preferably 1 to 10 times, more preferably 1.05 to 5 times, and 1.1 to 4 times. Is more preferable, but the present invention is not limited to these.
  • the agent containing Bifidobacterium longum of the present invention can efficiently grow useful intestinal bacteria.
  • the Bifidobacterium longum bacterium of the present invention is compared with the case where the useful intestinal bacterium is cultured in the medium or in the animal body without adding the agent containing the Bifidobacterium longum bacterium of the present invention.
  • the number of bacteria in the culture medium or in the animal body is preferably 1 to 1000 times, more preferably 2 to 100 times. Preferably, it is 5 to 50 times more preferably, but is not limited to these.
  • the present invention includes various combinations of the above configurations within the technical scope of the present invention as long as the effects of the present invention are exhibited.
  • Bifidobacterium longum MM-2 (hereinafter, also simply referred to as "MM-2") was used as Bifidobacterium longum bacterium.
  • Lactobacillus acidophilus KS-13 (hereinafter, also simply referred to as “KS-13”) and Streptococcus faecalis 129 BIO3B (hereinafter, also simply referred to as “3B”) were used as useful intestinal bacteria (lactic acid bacteria).
  • Bifidobacterium bifidum G9-1 (hereinafter, also simply referred to as "G9-1”) was used as a useful intestinal bacterium (Bifidobacterium).
  • Lactic acid and acetic acid contained in each culture solution were measured by F kit D-lactic acid / L-lactic acid and F kit acetic acid (Practical Co., Ltd.), and the total amount of lactic acid and acetic acid was taken as the amount of organic acid.
  • MM-2 The amount of organic acid produced in the medium when each strain was independently cultured is shown in FIG. MM-2 is 7.18 mg / mL
  • KS-13 is 8.22 mg / mL
  • 3B is 7.80 mg / mL
  • G9-1 is 4.09 mg / mL (of which, the amount of lactic acid is 3.33 mg / mL for MM-2).
  • Example 1 Organic acid content measurement test in germ-free animal cecum contents (test strain) Similar to the reference example, Bifidobacterium longum MM-2 (MM-2), Lactobacillus acidophilus KS-13 (KS-13), Streptococcus faecalis 129 BIO3B (3B) and Bifidobacterium bifidum G9-1 (G9-1) were used.
  • the amount of organic acid in the cecum of each group in germ-free animals is shown in FIG.
  • the G9-1 / KS-13 / 3B group was 0.33 mg / g (of which the amount of lactic acid was 0.113 mg / mL and the amount of acetic acid was 0.215 mg / mL), G9-1 / KS-13 / 3B /
  • the MM-2 group had 1.02 mg / g (of which the amount of lactic acid was 0.623 mg / mL and the amount of acetic acid was 0.401 mg / mL), and the addition of MM-2 increased the organic acid by 3.09 times.
  • Example 2 Bacterial count measurement test in germ-free animal digestive tract (test strain) Bifidobacterium longum MM-2 (MM-2), Lactobacillus acidophilus KS-13 (KS-13), Streptococcus faecalis 129 BIO3B (3B) and Bifidobacterium bifidum G9-1 (G9-1), as in Reference and Example 1. Was used.
  • Example 2 (animal) In the same manner as in Example 1, a 7-week-old BALB / cAJcl [GF] male sterile mouse (Claire Japan) was bred in a sterile isolator (Claire Japan), and after a habituation period of 1 week, it was subjected to an experiment. As the feed, CE-2 feed (Claire Japan) was freely given, and tap water was freely ingested by a water bottle.
  • the number of strains in the large intestine is G9-1 / KS-13 / 3B / MM-2 when comparing the G9-1 / KS-13 / 3B group and the G9-1 / KS-13 / 3B / MM-2 group.
  • the result was that the number of bacteria in the group was higher than that in the G9-1 / KS-13 / 3B group (Fig. 5).
  • the addition of Bifidobacterium longum bacterium (MM-2) increases the number of KS-13, 3B and G9-1, that is, useful intestinal bacteria in the large intestine. It was shown that MM-2 enhances the growth of useful intestinal bacteria.
  • the method of the present invention can efficiently and industrially obtain useful intestinal bacteria, and can improve the function of useful intestinal bacteria by improving the ability to produce organic acids and the like. It is useful for culturing useful bacteria, especially lactic acid bacteria and / or bifidobacteria. In particular, it is useful because it is possible to efficiently obtain useful intestinal bacteria in the field of medicine or food in a highly functional state.

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Abstract

本発明は、腸内有用菌の増殖及び有機酸産生能を増強する、新規なビフィドバクテリウム　ロンガム（Bifidobacterium longum）菌を含有する剤の提供を課題とする。　ビフィドバクテリウム　ロンガム（Bifidobacterium longum）菌を含有することを特徴とする、腸内有用菌の増殖及び有機酸産生増強剤により解決する。

Description

腸内有用菌の増殖及び有機酸産生増強剤
　本発明は、ビフィドバクテリウム　ロンガム菌を含有することを特徴とする、腸内有用菌の増殖及び有機酸産生増強剤に関する。
　乳酸菌やビフィズス菌は、古くから、発酵食品や酒類、漬物の発酵食品の製造等に広く用いられてきた。これらの乳酸菌やビフィズス菌には、乳糖やオリゴ糖などを分解して乳酸を産生するホモ発酵を行うものや乳酸及び酢酸を産生するヘテロ発酵を行うもの等がいる。乳酸菌やビフィズス菌は、乳糖やオリゴ糖などを分解して乳酸や酢酸を産生し、腸内のｐＨを顕著に低下させ、善玉菌として腸内環境を整える作用等を有することから、腸内有用菌として知られている。
　特許文献１には、乳酸菌と納豆菌の混合物によりビフィズス菌の増殖が増大することが記載されている。しかしながら、ビフィドバクテリウム　ロンガム菌によって、腸内有用菌の有機酸産生能や、腸内有用菌の増殖が増強されることは、これまでに知られていない。
特許第３４７８７７３号公報
　本発明は、腸内有用菌、好ましくは、乳酸菌及び／又はビフィズス菌を増殖させる剤、及びビフィドバクテリウム　ロンガム菌によって、そのような腸内有用菌の有機酸産生能を向上させる剤の提供を課題とする。
　本発明者らは、上記課題の解決について鋭意研究を重ねた結果、ビフィドバクテリウム　ロンガム菌を生体内に投与することによって、腸内有用菌、好ましくは、乳酸菌及び／又はビフィズス菌の増殖を、効率よく、工業的有利に行うことが出来ること、腸内有用菌の有機酸産生能が向上されることを見出した。本発明者らは、このような知見に基づいてさらに研究を進め、本発明を完成するに至った。
　即ち、本発明は、上記課題を解決するために、以下の各発明を包含する。
［１］　ビフィドバクテリウム　ロンガム（Bifidobacterium longum）菌を含有することを特徴とする、腸内有用菌の増殖及び有機酸産生増強剤。
［２］　腸内有用菌が乳酸菌及び／又はビフィズス菌であることを特徴とする、前記［１］に記載の剤。
［３］　ビフィドバクテリウム　ロンガム菌が、ビフィドバクテリウム　ロンガム　ＭＭ－２株（Bifidobacterium longum MM-2、受託番号：NITE BP-818）であることを特徴とする、［１］又は［２］に記載の剤。
［４］　乳酸菌が、ラクトバシラス（Lactobacillus）属、ストレプトコッカス（Streptococcus）属、エンテロコッカス (Enterococcus)属、ラクトコッカス（Lactococcus）属、テトラジェノコッカス（Tetragenococcus）属、ペディオコッカス（Pediococcus）属及びオエノコッカス（Oenococcus）属の菌からなる群から選択される１種以上であること、及び／又は
　ビフィズス菌が、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属から選択される１種以上であることを特徴とする、［２］又は［３］に記載の剤。
［５］　ビフィドバクテリウム　ロンガム（Bifidobacterium longum）菌及びプロバイオティクスを含有することを特徴とする、腸内有用菌の増殖及び有機酸産生増強剤。
［６］　プロバイオティクスが乳酸菌及び／又はビフィズス菌であることを特徴とする、前記［５］に記載の剤。
［７］　乳酸菌が、ラクトバシラス（Lactobacillus）属、ストレプトコッカス（Streptococcus）属、エンテロコッカス（Enterococcus）属、ラクトコッカス（Lactococcus）属、テトラジェノコッカス（Tetragenococcus）属、ペディオコッカス（Pediococcus）属及びオエノコッカス（Oenococcus）属の菌からなる群から選択される１種以上であること、及び／又は
　ビフィズス菌が、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属から選択される１種以上であることを特徴とする、前記［６］に記載の剤。
［８］　前記［１］～［７］に記載の剤の、腸内有用菌増殖用薬及び／又は有機酸産生用薬を製造するための使用。
［８－２］　腸内有用菌が乳酸菌及び／又はビフィズス菌であることを特徴とする、前記［８］に記載の使用。
［８－３］　ビフィドバクテリウム　ロンガム菌が、ビフィドバクテリウム　ロンガム　ＭＭ－２株（Bifidobacterium longum MM-2、受託番号：NITE BP-818）であることを特徴とする、［８］又は［８－２］に記載の使用。
［９］　ビフィドバクテリウム　ロンガム（Bifidobacterium longum）菌をヒト又はヒト以外の動物に投与する工程を含むことを特徴とする、腸内有用菌の増殖及び有機酸産生増強方法。
［９－２］　腸内有用菌が乳酸菌及び／又はビフィズス菌であることを特徴とする、前記［９］に記載の方法。
［９－３］　ビフィドバクテリウム　ロンガム菌が、ビフィドバクテリウム　ロンガム　ＭＭ－２株（Bifidobacterium longum MM-2、受託番号：NITE BP-818）であることを特徴とする、［９］又は［９－２］に記載の方法。
　本発明は、ビフィドバクテリウム　ロンガム菌を含有することを特徴とする、腸内有用菌の増殖及び有機酸産生増強剤を提供する。本発明の剤を工業的発酵に用いること、又はヒト又は哺乳動物等の生体に経口投与することにより、効率よく、工業的有利に、あるいは活性の高い状態で腸内有用菌を得ることが出来る。
図１は、噴霧乾燥装置の概略を示す図である。 図２は、各菌株をそれぞれ培養した場合の培地中有機酸産生量を示す。 図３は、各菌株の有機酸産生量の合計量を示す。 図４は、無菌動物における各群の盲腸内の有機酸産生量を示す。 図５は、無菌動物における各群の大腸における菌数を示す。
〔ビフィドバクテリウム　ロンガム菌〕
　本発明において用いられるビフィドバクテリウム　ロンガム菌は、好ましくは、ビフィドバクテリウム　ロンガム　ＭＭ－２株（Bifidobacterium longum MM-2、受託番号：NITE BP-818）であるが、これに限定されない。
　なお、本発明の剤において、ビフィドバクテリウム　ロンガム菌が含まれる割合は、例えば、剤が液体である場合は、例えば、約１０４～１０１０ｃｆｕ／ｍＬ、好ましくは、約１０６～１０９ｃｆｕ／ｍＬ等であってよく、剤が固体である場合は、例えば、剤全体に対して、ビフィドバクテリウム　ロンガム菌が１０５～１０１０ｃｆｕ／ｇ質量％、好ましくは、剤全体に対して、１０６～１０９ｃｆｕ／ｇ質量％等含まれてよいが、これらに限定されない。
〔腸内有用菌〕
　本発明で用いられる腸内有用菌は特に限定されず、例えば、乳酸桿菌、乳酸球菌等の乳酸菌やビフィズス菌、すなわち、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属に属する菌を好ましく用いることが出来るが、これらに限定されない。本発明において、腸内有用菌は、好ましくは、乳酸菌及び／又はビフィズス菌である。特に好ましくは、乳酸菌とビフィズス菌の両方を含む。なお、当分野においては、ビフィズス菌は、広義の乳酸菌に含むとする考えもあるが、本発明においては、これらを区別する。
　本明細書において、「腸内」とは、動物体内の盲腸、大腸、小腸、空腸、回腸、十二指腸、結腸などの腸管内部又はその表面を指し、好ましくは、大腸、小腸又は盲腸であるが、これらに限定されない。また、腸管を有する動物は、好ましくは、哺乳動物である。哺乳動物は、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、サル等が挙げられるが、これらに限定されない。
　本発明において、腸内有用菌が、乳酸菌である場合、そのような乳酸菌は、例えば、Lactobacillus acidophilus、L. casei、L. gasseri、L. plantarum、L. delbrueckii subsp bulgaricus、L. delbrueckii subsp lactis、L. fermentum、L. helveticus、L. johnsonii、L. paracasei subsp. paracasei、L. reuteri、L. rhamnosus、L. salivarius、L. brevis等のラクトバチルス（Lactobacillus）属の乳酸桿菌；例えば、Leuconostoc mesenteroides等のリューコノストック属、Streptococcus (Enterococcus) faecalis、Streptococcus (Enterococcus) faecium、Streptococcus (Enterococcus) hirae、Streptococcus thermophilus等のストレプトコッカス（Streptococcus）属（現在の分類学上、エンテロコッカス (Enterococcus)属に分類される）、Lactococcus lactis、L. cremoris等のラクトコッカス（Lactococcus）属、Tetragenococcus halophilus等のテトラジェノコッカス（Tetragenococcus）属、Lactococcus lactis、L. cremoris、Tetragenococcus halophilus、Pediococcus acidilactici、P. pentosaceus等のペディオコッカス（Pediococcus）属、Oenococcus oeni等のオエノコッカス（Oenococcus）属等の乳酸球菌等を好ましく用いることが出来るが、これらに限定されない。なお、本明細書中においては、現在の分類学に従い菌の分類をしているが、過去の分類に従い、ストレプトコッカス（Streptococcus）属は、ストレプトコッカス（Streptococcus）属及びエンテロコッカス(Enterococcus)属を包含することもある。
　上記乳酸菌としては、ラクトバチルス属が好ましく、さらに、ラクトバチルス　アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバチルス　ガセリ（L. gasseri）、ラクトバチルス　ジョンソニイ（L. johnsonii）、ラクトバチルス　パラカゼイ　サブスピーシーズ　パラカゼイ（L. paracasei subsp. paracasei）、ラクトバチルス　ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ラクトバチルス　ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）、ラクトバチルス　サリバリウス（Lactobacillus salivarius）、又はラクトバチルス　ブレビス（Lactobacillus brevis）であることが好ましく、特に、ラクトバチルス　アシドフィルス　ＫＳ－１３（Lactobacillus acidophilus KS-13）等であることが好ましいが、これらに限定されない。また、ストレプトコッカス　フェーカリスであることも好ましく、特に、ストレプトコッカス　フェーカリス　１２９　ＢＩＯ３Ｂ(Streptococcus faecalis 129 BIO3B）を用いることが好ましいが、これらに限定されない。
　乳酸菌は単独であってもよく、複数の乳酸菌の混合物であってもよい。本発明において、好ましくは、腸内有用菌には、乳酸菌が１～５種含まれる。より好ましくは、乳酸菌が１～３種含まれる。特に好ましくは、乳酸菌が１種又は２種含まれる。
　本発明において、腸内有用菌が、ビフィズス菌である場合、そのようなビフィズス菌は、例えば、ビフィドバクテリウム　ロンガム（Bifidobacterium longum）、ビフィドバクテリウム　ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）、ビフィドバクテリウム　ブレーベ（Bifidobacterium breve）、ビフィドバクテリウム　インファンティス（Bifidobacterium infantis）、ビフィドバクテリウム　アドレセンティス（Bifidobacterium adolescentis）、ビフィドバクテリウム　シュードロンガム（Bifidobacterium pseudolongum）、及びビフィドバクテリウム　サーモフィルム（Bifidobacterium thermophilum）等が挙げられるが、これらに限定されない。
　上記ビフィズス菌としては、ビフィドバクテリウム　ビフィダム、ビフィドバクテリウム　ロンガムを用いることが好ましく、特に、ビフィドバクテリウム　ビフィダム　Ｇ９－１（Bifidobacterium bifidum G9-1、受託番号：NITE BP-817）であることが好ましいが、これらに限定されない。
　なお、ビフィズス菌は単独で用いてもよく、複数のビフィズス菌を混合して用いてもよい。本発明において、好ましくは、腸内有用菌に、ビフィズス菌が１～５種含まれる。より好ましくは、ビフィズス菌が１～３種含まれる。特に好ましくは、ビフィズス菌が１種又は２種含まれる。
　本発明において、好ましくは、腸内有用菌として、上記した乳酸菌とビフィズス菌の両方が含まれる。乳酸菌とビフィズス菌は、例えば、腸内有用菌に合計で１～１０種含まれる。好ましくは、合計で１～５種含まれる。特に好ましくは、合計で１～３種含まれる。
〔プロバイオティクス〕
　本発明において、ビフィドバクテリウム　ロンガム菌を含む剤は、プロバイオティクスを含んでもよい。「プロバイオティクス」とは、通常は、体に良い作用をもたらす生きた細菌、あるいはそのような細菌の調製物であって、有効量で投与される際に、対象の健康又は健康状態への有益な作用を提供することができるものを意味する。
　本発明においては、剤に含まれるものとして、動物の腸内に存在している腸内有用菌と区別されるが、プロバイオティクスの菌種としては、上記したビフィドバクテリウム　ロンガム菌や腸内有用菌等と同じであってもよく、または異なっていてもよい。
　好ましくは、本発明において、プロバイオティクスは、乳酸菌及び／又はビフィズス菌である。このような乳酸菌及びビフィズス菌の例としては、上記の腸内有用菌として挙げたものと同じ菌種を同様に好ましく使用できるが、上記と、異なる菌種であってもよい。
　本発明において、腸内有用菌とプロバイオティクスが異なる菌種である場合、例えば、プロバイオティクスは、糖化菌、酪酸菌等の公知の有用菌であってもよい。例えば、Bacillus subtilis、Bacillus mesentericus、Bacillus polyformenticus等の糖化菌；例えば、Bacillus coagulans等の有胞子性乳酸菌； Bacillus　toyoi、B. licheniformis、Clostridium　butyricum等の酪酸菌；その他の有用菌であってもよい。
　なお、プロバイオティクスは、通常、非病原性である。
〔菌体の取得方法〕
　上記したビフィドバクテリウム　ロンガム菌、乳酸菌、ビフィズス菌、その他の有用菌、プロバイオティクス等の菌体は、例えばＡＴＣＣ（登録商標）又はＩＦＯ等の機関や財団法人　日本ビフィズス菌センター、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター等などから容易に入手することができる。また、市販されているものを適宜使用することもできる。なお、これらの培養前の菌体は凍結状態保存されたものであってもよい。
　なお、ストレプトコッカス　フェーカリス　１２９　ＢＩＯ３Ｂ(Streptococcus faecalis 129 BIO3B）、ラクトバチルス　アシドフィルス　ＫＳ－１３（Lactobacillus acidophilus KS-13）及びビフィドバクテリウム　ビフィダム　Ｇ９－１（Bifidobacterium bifidum G9-1）は、本件出願日より前から市販されている、新ビオフェルミンＳ錠（製造販売元：ビオフェルミン製薬株式会社）に含まれており、当該市販品から入手することが可能である。
　そして、例えば、ビフィドバクテリウム　ロンガム　ＭＭ－２株（Bifidobacterium longum MM-2）は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（住所：郵便番号２９２－０８１８　日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８　１２２号室）に、２００９年９月３０日（原寄託日：２００９年９月１７日）付で、受託番号　ＮＩＴＥ　ＢＰ－８１８として、国際寄託されている。
　また、例えば、ビフィドバクテリウム　ビフィダム　Ｇ９－１（Bifidobacterium bifidum G9-1）は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（住所：郵便番号２９２－０８１８　日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８　１２２号室）に、２００９年９月３０日（原寄託日：２００９年９月１７日）付で、受託番号　ＮＩＴＥ　ＢＰ－８１７として、国際寄託されている。
〔ビフィドバクテリウム　ロンガム（Bifidobacterium longum）菌と腸内有用菌の培養〕
　通常、ビフィドバクテリウム　ロンガム菌及び／又は腸内有用菌を培地に接種し培養する。これらの菌を培養するために用いる培地の基本組成は、例えば、栄養性の高い汎用増殖培地である、ＭＲＳ培地、ＬＢＳ培地、ロガサ培地等の公知の乳酸菌培養用培地を参考にしてよい。
　また、嫌気性菌用の培地も好ましく用いることが出来る。例えば、ＧＡＭブイヨンや変法ＧＡＭブイヨン等のＧＡＭ液体培地等を好ましく用いることが出来るが、これらに限定されない。
　本発明の培地は、炭素源、窒素源、アミノ酸、ビタミン、ミネラル、動植物タンパク質又はそのエキス並びに分解物、無機塩類、緩衝剤、界面活性剤、抗生物質、安定化剤、水又はそれらの任意の組み合わせ等を含有していてもよいが、これらに限定されない。培地中の各成分については、市販品を入手して適宜使用することができる。
　窒素源としては、例えば、動物性又は植物性のペプトンや硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム等のアンモニウム塩及びこれらの水和物、アンモニア等が挙げられる。ペプトンは、例えば、大豆ペプトンやプロテオーゼペプトン、カゼインペプトン、心筋ペプトン、獣肉ペプトン等を好ましく用いることが出来るがこれらに限定されない。培地中の窒素源の含有割合は、培地全体に対して、例えば、０．１～１質量％であってもよく、０．１～０．５質量％であってもよいが、これらに限定されない。
　炭素源としては、例えば、単糖類、二糖類、三糖類、四糖類、オリゴ糖、又は多糖等が挙げられる。単糖類としては、グルコース、キシロース、アラビノース、マンノース、ガラクトース又はそれらの任意の組み合わせが例示される。また、二糖類としては、マルトース、セロビオース、トレハロース、スクロース、ラクツロース、ラクトース又はそれらの任意の組み合わせが例示される。培地中の炭素源の含有割合は、培地全体に対して、例えば、０．１～１質量％であってもよく、０．１～０．５質量％であってもよいが、これらに限定されない。
　本発明の培地においては、生育因子として、アミノ酸やビタミン等の成分を含むことが好ましい。アミノ酸としては、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、ピロリシン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、トレオニン、セレノシステイン、バリン、トリプトファン、チロシン又はこれらの任意の組み合わせ又はこれらの塩等が例示されるが、これらに限定されない。これらのアミノ酸は、通常はＬ型である。培地中のアミノ酸の含有割合は、培地全体に対して、例えば、０．０１～０．１質量％であってよく、０．０１～０．０５質量％であってもよいが、これらに限定されない。
　ビタミンとしては、ビタミンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｋ等のビタミン類又はそれらの誘導体、若しくはそれらの塩類、ビオチン、リボフラビン、チアミン又はこれらの任意の組み合わせが好ましく用いられるが、これらに限定されない。培地中のビタミンの含有割合は、培地全体に対して、例えば、０．０１～０．１質量％であってもよく、０．０１～０．０５質量％であってもよいが、これらに限定されない。
　また、ミネラルとしては、マグネシウム、カリウム、カルシウム、リン、亜鉛、鉄等を好ましく用いることが出来るが、これらに限定されない。培地中のミネラルの含有割合は、培地全体に対して、例えば、０．０１～０．１質量％であってもよく、０．０１～０．０５質量％であってもよいが、これらに限定されない。
　動植物タンパク質又はそのエキス並びにその分解物として、例えば、植物エキス、肉エキス、肝臓エキス又は酵母エキスを好ましく用いることが出来る。培地中のこのようなエキス又はその分解物の含有割合は、培地全体に対して、例えば、０．１～１質量％であってもよく、０．１～０．５質量％であってもよいが、これらに限定されない。
　無機塩類は、例えば、リン酸塩や、塩化ナトリウム、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、硫酸マンガン水和物、硫酸マグネシウム水和物等が挙げられるが、これらに限定されない。培地中の無機塩類の含有割合は、培地全体に対して、例えば、０．０１～０．１質量％であってもよく、０．０１～０．０５質量％であってもよいが、これらに限定されない。
　緩衝剤は、例えば、ＰＢＳ、ＨＢＳＳ、ＨＥＰＥＳ、ＨＡＮＫＳ等が挙げられるが、これらに限定されない。界面活性剤としては、例えば、ポリソルベート20、ポリソルベート60、ポリソルベート65、ポリソルベート80等のポリソルベート類や、マクロゴール、ラウリル硫酸ナトリウム等を好ましく用いることが出来るが、これらに限定されない。抗生物質としては、例えば、ペニシリンや、ストレプトマイシン、カナマイシン等のマイシン系抗生物質等が挙げられるが、これらに限定されない。
　その他の培地成分又は添加剤としては、炭酸塩、炭酸水素塩、アルブミン、インスリン、トランスフェリン、セレニウム、ホルモン、サイトカイン、Ｌ－システイン塩酸塩、チオグリコール酸ナトリウム、ヘミン、溶性デンプン、消化血清末、ビタミン類、短鎖脂肪酸類等を含んでもよいが、これらに限定されない。
　上記例示した各成分を混合して、高圧蒸気滅菌器を用いて加熱滅菌して、培地を調製することができる。
　培地の液性は中性（例えば、ｐＨ６～８、ｐＨ７～８）であることが好ましく、中性にするために、公知のｐＨ調整剤や上記した緩衝剤を使用してもよい。
　ビフィドバクテリウム　ロンガム菌を培地や動物体内に接種する際の、培地に対するビフィドバクテリウム属の菌の割合は、例えば、１０１～１０８ｃｆｕ／ｍＬであってもよく、１０５～１０８ｃｆｕ／ｍＬであってもよいが、これらに限定されない。なお、接種用（種培養用）培地と増殖用（本培養用）培地は同じでもよく、異なっていてもよい。動物体内に対するビフィドバクテリウム属の菌の割合は、例えば、ヒトに対しては１０５～１０１２ｃｆｕ／ヒトであってもよく、好ましくは１０６～１０９ｃｆｕ／ヒトであってもよいが、これらに限定されない。なお、ヒトは成人であっても小児であってもよい。
　上記培養の温度は、例えば、２５～４５℃であることが好ましく、３６～３８℃であることがより好ましい。また、上記培養の時間は、例えば、４～７２時間であることが好ましく、１２～２４時間であることがより好ましい。これら培養の温度又は培養の時間の範囲内であれば、ビフィドバクテリウム属の菌が増殖しやすくなる。
　なお、嫌気下でビフィドバクテリウム属の菌を培養するために、嫌気ボックス又は嫌気チャンバーを使用してもよい。嫌気ボックス又は嫌気チャンバーは、市販されているものを用いてよい。
　本発明において使用される菌体の形態は、特に制限されず、生菌体、湿菌体、乾燥菌等、任意の形態のものを用いることができる。
　また、生菌体、湿菌体、乾燥菌等をさらに処理した菌の処理物を用いてもよい。菌の処理物とは、乳酸菌に何らかの処理を加えたものをいい、その処理は特に限定されない。該処理物として具体的には、該菌体の超音波などによる破砕液、該菌体の培養液又は培養上清、それらを濾過又は遠心分離など固液分離手段によって分離した固体残渣などが挙げられる。また、細胞壁を酵素又は機械的手段により除去した処理液、トリクロロ酢酸処理又は塩析処理などして得られるタンパク質複合体（タンパク質、リポタンパク質、糖タンパク質など）又はペプチド複合体（ペプチド、糖ペプチド等）なども該処理物として挙げられる。さらに、これらの濃縮物、これらの希釈物又はこれらの乾燥物なども該処理物に含まれる。培養液から菌体を摂取して、菌体からどのようにして非処理物を得るのかは、本技術分野において、従来充分に確立されているので、本発明において、それらに従ってよい。また、該菌体の超音波などによる破砕液、該細胞の培養液又は培養上清などに対し、例えば各種クロマトグラフィーによる分離などの処理をさらに加えたものも、本発明における処理物に含まれる。
　なお、死菌体も本発明における菌の処理物に含まれる。死菌体は、例えば、酵素処理、加熱処理、抗生物質などの薬物による処理、ホルマリンなどの化学物質による処理、γ線などの放射線による処理などにより、得ることができる。これらの技術は従来充分に確立されていて、本発明において、そのような技術に従ってよい。
　さらに、乾燥菌や湿菌体の好ましい製造方法について説明する。上記菌体を溶媒に分散して菌体液とする。菌体を分散して菌体液とする溶媒は、当分野で用いられる公知の溶媒を用いてよいが、水やＰＢＳ等の緩衝液が好ましい。また、所望により、エタノールなどを加えてもよい。さらに、菌体液は、懸濁液であってもよく、溶媒は上記で示したものと同じでよい。また、懸濁させる際、懸濁剤、例えばアルギン酸ナトリウム等を使用してもよい。
　また、上記菌体液には、公知技術に従ってさらに賦形剤、結合剤、崩壊剤、静電気防止剤など当業界で一般に用いられている添加剤を通常の配合割合で添加してもよい。
　賦形剤としては、例えば、乳糖、白糖、Ｄ－マンニトール、トウモロコシデンプン、粉末セルロース、リン酸水素カルシウム、炭酸カルシウム等が挙げられる。結合剤としては、例えばヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、キサンタンガム等が挙げられる。崩壊剤としては、例えば、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルメロースカルシウム、部分アルファー化デンプン、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、カルボキシメチルスターチ等が挙げられる。静電気防止剤としては、例えば微粉又は非微粉タルク、コロイド状シリカ、加工シリカ、沈降シリカ等が挙げられる。
　さらに、滅菌されてもよく、滅菌は、例えば、フィルター濾過により行うことが好ましいが、その他の公知の滅菌方法、例えば、湿熱滅菌法、乾熱滅菌法、高周波滅菌法等の加熱法、酸化エチレンガス滅菌法、過酸化水素による滅菌法等のガス法、ガンマ線照射滅菌法、電子線照射滅菌法等の放射線法等により滅菌を行ってもよい。
　上記菌体液を、菌体乾燥物を製造するために噴霧乾燥装置による乾燥操作に付することにより、乾燥菌を得ることが出来る。噴霧乾燥装置は、シングルミクロンの噴霧液滴を形成できる微粒化装置を備えた噴霧乾燥装置が好ましい。非常に粒径の小さな噴霧液滴にすると、噴霧液滴の単位質量あたりの表面積が大きくなり、乾燥温風との接触が効率よく行われるため、生産性が向上する。
　ここでシングルミクロンの液滴とは、好ましくは噴霧液滴の粒径が小数第１位を四捨五入して１～１０μｍであるものをいう。
　噴霧乾燥装置には、微粒化装置が、例えばロータリーアトマイザー（回転円盤）、加圧ノズル、又は圧縮気体の力を利用した２流体ノズルや４流体ノズルである噴霧乾燥装置が挙げられる。
　噴霧乾燥装置は、シングルミクロンの噴霧液滴を形成できるものであれば、上記形式のいずれの噴霧乾燥装置であってもよいが、４流体ノズルを有する噴霧乾燥装置を使用するのが好ましい。
　４流体ノズルを有する噴霧乾燥装置では、例えば４流体ノズルの構造としては、好ましくは気体流路と液体流路とを１系統として、これを２系統ノズルエッジにおいて対称に設けたもので、ノズルエッジに流体流動面となる斜面を構成している。
　また、ノズルエッジの先端の衝突焦点に向かって、両サイドから圧縮気体と液体を一点に集合させる外部混合方式の装置がよい。この方式であれば、ノズル詰まりがなく長時間噴霧することが可能となる。
　４流路ノズルを有する噴霧乾燥装置について図１を用いてさらに詳しく説明する。４流路ノズルのノズルエッジにおいて、液体流路３又は４から湧き出るように出た菌体液が、気体流路１又は２から出た高速気体流により流体流動面５で薄く引き伸ばされ、引き伸ばされた液体はノズルエッジ先端の衝突焦点６で発生する衝撃波で微粒化させることにより、シングルミクロンの噴霧液滴７を形成する。
　圧縮気体としては、例えば、空気、炭酸ガス、窒素ガス又はアルゴンガス等の不活性ガス等を用いることができる。とくに、酸化されやすいもの等を噴霧乾燥させる場合は、炭酸ガス、窒素ガス又はアルゴンガス等の不活性ガスを用いるのが好ましい。
　圧縮気体の圧力としては、通常約１～１５ｋｇ重／ｃｍ２、好ましくは約３～８ｋｇ重／ｃｍ２である。ノズルにおける気体量は、ノズルエッジ１ｍｍあたり、通常約１～１００Ｌ／分、好ましくは約１０～２０Ｌ／分である。
　通常、その後、乾燥室において、その噴霧液滴に乾燥温風を接触させることで水分を蒸発させ菌体乾燥物を得る。
　乾燥室の入り口温度は、通常約２～４００℃、好ましくは約５～２５０℃、より好ましくは約５～１５０℃である。入り口温度が約２００～４００℃の高温であっても、水分の蒸発による気化熱により乾燥室内の温度はそれほど高くならず、また、乾燥室内の滞留時間を短くすることにより、生菌の死滅や損傷をある程度抑えることができる。
　出口温度は、通常約０～１２０℃、好ましくは約５～９０℃、より好ましくは約５～７０℃である。
　上記のように菌体乾燥物の粒径を小さくすることにより、生菌率が上がり、生菌率の多い製剤を提供できるという利点がある。すなわち、シングルミクロンの菌体乾燥物を得るためにはシングルミクロンの噴霧液滴を噴霧するのが好ましい。噴霧液滴の粒径を小さくすると、噴霧液滴の単位質量あたりの表面積が大きくなるので、乾燥温風との接触が効率よく行われ、乾燥温風の熱による菌体の死滅又は損傷を極力抑えることができる。その結果として、生菌率が上がり生菌数の多い菌体乾燥物が得られる。
　湿菌体は、培養液から遠心処理により菌体を採取し、リン酸緩衝液等により洗浄し、再度遠心処理により得られた菌体を凍結保存する方法等、当分野で公知の方法により、得ることができる。
　本発明の剤は、通常、ビフィドバクテリウム　ロンガム菌とその他の成分を混合することにより容易に製造され得る。他の成分は、本発明の効果を奏する限り特に限定されない。本発明の剤は、医薬品、医薬部外品、飲食品、飼料等の形態として用いることができる。このような、本発明の剤を含む医薬品も、本発明の好ましい実施態様の１つである。
　なお、本発明の剤を含有した組成物を提供することも可能である。そのような組成物には当分野で通常用いられる公知の添加剤を用いることができ、例えば、水、溶剤、ｐＨ調整剤、保湿剤、着香剤、甘味剤、増粘剤、矯味剤、ゲル化剤、溶解剤、着色剤、防腐剤、界面活性剤、懸濁化剤、乳化剤及び安定化剤等が挙げられるが、これらに限定されない。
　なお、本発明の剤や本発明の剤を用いた組成物には、プレバイオティクスが含まれてもよい。「プレバイオティクス」とは、通常、宿主による消化に対する耐性を有し、プロバイオティクス細菌の資化性の条件を満たす摂食可能な化合物であり、通常、腸管などにおけるプロバイオティクス細菌の増殖を促進するものである。
　なお、ビフィドバクテリウム　ロンガム菌及び腸内有用菌（例えば、乳酸菌やビフィズス菌）は、一般に嫌気性で乾燥状態では空気又は酸素に対して弱く、また、高温と湿気に弱いため、組成物の製剤化に際しては出来るだけ、不活性ガスの存在下又は真空、低温下で、処理することが好ましい。
　本発明の剤は、ヒト又は非ヒト動物に投与されてもよい。本発明の投与形態は特に限定されないが、経口投与、非経口投与（静脈内投与、経皮投与、眼局所投与等）などが挙げられる。本発明の投与剤型としては、経口剤の場合、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤等が挙げられ、非経口剤としては、挿入剤等が挙げられる。投与量は、剤型、患者の症状、年齢、体重等に応じて適宜選択できる。例えば、経口投与の場合、体重１ｋｇ当たりかつ１日当たり０．０５～５０００ｍｇ、好ましくは０．１～２０００ｍｇ、特に好ましくは１～１０００ｍｇを１日１回～数回に分けて投与することができるが、これらに限定されない。
〔腸内有用菌が産生する有機酸〕
　本発明の腸内有用菌が産生する有機酸として、好ましくは、短鎖の脂肪酸、例えば、乳酸、酢酸、コハク酸、ギ酸、プロピオン酸、ピルビン酸、イソ酪酸、n-酪酸、イソ吉草酸、n-吉草酸などやこれらの混合物が挙げられ、乳酸及び／又は酢酸が好ましいが、これらに限定されない。
　これらの有機酸は、培地中、植物体内又は動物体内等における乳糖やオリゴ糖などをビフィドバクテリウム　ロンガム菌や腸内有用菌が分解することにより、生成されるものと考えられているが、詳細は分かっていない。
　なお、本発明において、ビフィドバクテリウム　ロンガム菌も有機酸を産生する。有機酸については上記した通りである。
〔有機酸製造方法〕
　本発明は、腸内有用菌の併存下においてビフィドバクテリウム　ロンガム菌を培養する工程を含むことを特徴とする、有機酸製造方法も包含する。
　ビフィドバクテリウム　ロンガム菌及び腸内有用菌の培養は、上記した菌体の取得方法に従って行うことが出来る。本発明の有機酸製造方法では、腸内有用菌の増殖能及び／又は有機酸産生能が増強されていること、さらには、ビフィドバクテリウム　ロンガム菌も有機酸を産生することから、効率よく有機酸を得ることが出来る。
〔ビフィドバクテリウム　ロンガム菌による腸内有用菌の有機酸産生能の向上〕
　本発明のビフィドバクテリウム　ロンガム菌を含有する剤は、腸内有用菌の有機酸産生能を向上させることが出来る。
　具体的には、培地中又は動物体内において、ビフィドバクテリウム　ロンガム菌を含有しない状態で腸内有用菌を培養する場合に比べ、本発明のロンガム菌を含有する状態で腸内有用菌を培養した場合、腸内有用菌が産生した有機酸の量が、例えば、１～１０倍であることが好ましく、１．０５～５倍であることがより好ましく、１．１～４倍であることがさらに好ましいが、これらに限定されない。
〔ビフィドバクテリウム　ロンガム菌による腸内有用菌の増殖〕
　本発明のビフィドバクテリウム　ロンガム菌を含有する剤は、腸内有用菌を効率よく増殖させることが出来る。
　具体的には、培地中又は動物体内において、本発明のビフィドバクテリウム　ロンガム菌を含有する剤を添加しない状態で腸内有用菌を培養した場合に比べ、本発明のビフィドバクテリウム　ロンガム菌を含有する剤を添加した状態で腸内有用菌を培養した場合に、培養液又は動物体内における菌数が、例えば、１～１０００倍となることが好ましく、２～１００倍となることがより好ましく、５～５０倍となることがさらに好ましいが、これらに限定されない。
　本発明は、本発明の効果を奏する限り、本発明の技術的範囲内において、上記の構成を種々組み合わせた態様を含む。
　以下、参考例及び実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。なお以下の参考例及び実施例では特定の菌株について言及しているが、本発明の適用範囲をこれに限定する趣旨ではなく、これらの菌株が属する菌種を含め、ビフィドバクテリウム　ロンガム（Bifidobacterium longum）菌又は腸内有用菌（好ましくは、乳酸菌、ビフィズス菌）と称されるもの全般に広く適用可能である。
［参考例］in vitroでの各菌株の有機酸測定試験
（被検菌株）
　ビフィドバクテリウム　ロンガム菌として、Bifidobacterium longum MM-2(以下、単に「MM-2」とも呼ぶ。)を用いた。また、腸内有用菌（乳酸菌）として、Lactobacillus acidophilus KS-13(以下、単に「KS-13」とも呼ぶ。)およびStreptococcus faecalis 129 BIO3B(以下、単に「3B」とも呼ぶ。)を用いた。また、腸内有用菌（ビフィズス菌）として、Bifidobacterium bifidum G9-1(以下、単に「G9-1」とも呼ぶ。)を用いた。
（測定方法）
　MM-2、KS-13、3BおよびG9-1の凍結保存菌株の保存液0.2ｍL（約106～108cfu）を0.7 % グルコース（富士フイルム和光純薬株式会社）および0.1%ポリソルベート80（純正化学株式会社）添加GAM液体培地（GAMブイヨン、日水製薬株式会社）10 mLに添加し、試験管(容量42 mL、IWAKI製）にて37℃、18時間、インキュベーターで培養した。各培養液中に含まれる乳酸および酢酸は、FキットD-乳酸/L-乳酸およびFキット酢酸（株式会社プラクティカル）により測定し、乳酸および酢酸の総量を有機酸量とした。
（結果）
　各菌株をそれぞれ単独で培養した際の培地中の有機酸産生量を図２に示した。MM-2は7.18 mg/mL、KS-13は8.22 mg/mL、3Bは7.80 mg/mL、G9-1は4.09 mg/mL、(このうち、乳酸の量は、MM-2は3.33mg/mL、KS-13は8.20mg/mL、3Bは7.80mg/mL、G9-1は1.78mg/mL、酢酸の量は、MM-2は3.85mg/mL、KS-13は0.02mg/mL、3Bは0.00mg/mL、G9-1は2.31mg/mL)であった。
　さらに、これらの菌株を培地や植物体又は動物体内等で同時に培養した際に、それぞれの菌株が相互に影響しないと仮定した場合に想定される有機酸産生量を単純加算することにより算出し、図３に示した。
　図３から明らかなように、MM-2を含まない場合、すなわち、KS-13、3BおよびG9-1の３種の菌株の有機酸産生量を単純加算した有機酸量は20.11 mg/mL(このうち、乳酸の量は、17.79mg/mL、酢酸の量は、2.33mg/mL)であった。そして、MM-2を含む場合、すなわちMM-2、KS-13、3BおよびG9-1の４種の菌株の有機酸産生量を単純加算した有機酸量は27.29 mg/mL(このうち、乳酸の量は、21.12mg/mL、酢酸の量は、6.17mg/mL)であった。
　本実験から、MM-2を添加することにより、培地や動物体内の有機酸産生量は1.36倍程度増加すると考えられた(このうち、乳酸の増加量は、1.19倍、酢酸の増加量は、2.65倍)。
［実施例１］無菌動物盲腸内容物中での有機酸量測定試験
（被検菌株）
　参考例と同様に、Bifidobacterium longum MM-2(MM-2)、Lactobacillus acidophilus KS-13(KS-13)、Streptococcus faecalis 129 BIO3B(3B)及びBifidobacterium bifidum G9-1(G9-1)を用いた。
（動物）
　7週齢のBALB/cAJcl[GF]雄性無菌マウス（日本クレア）を無菌アイソレーター（日本クレア）内にて飼育し、１週間の馴化期間後、実験に供した。飼料は、CE-2飼料（日本クレア）を自由に与え、上水道水を給水瓶により自由に摂取させた。
（試験方法）
　KS-13、3BおよびG9-1、ならびにMM-2、KS-13、3BおよびG9-1の凍結保存菌株を、各湿菌株が2.0×108 CFUずつとなるように、それぞれ0.2 mL PBSに懸濁したもののいずれかを、各無菌マウスに単回強制経口投与した。以下、MM-2を投与していない処置群を「G9-1/KS-13/3B群」、MM-2を投与した処置群を「G9-1/KS-13/3B/MM-2群」とも呼ぶ。投与24時間後にイソフルラン麻酔下で盲腸を摘出し、内容物中の有機酸量をNaganoらの方法 (Adv Microbiol 5: 531-540、2015) に従って測定した。
（結果）
　無菌動物における各群の盲腸内有機酸量を図４に示した。G9-1/KS-13/3B群は0.33 mg/g (このうち、乳酸の量は、0.113 mg/mL、酢酸の量は、0.215 mg/mL)、G9-1/KS-13/3B/MM-2群は1.02 mg/g (このうち、乳酸の量は、0.623 mg/mL、酢酸の量は、0.401 mg/mL)であり、MM-2を添加することにより3.09倍の有機酸増加が認められた(このうち、乳酸の増加量は、5.51倍、酢酸の増加量は、1.87倍)。
　上記した参考例に基づけば、MM-2を添加した場合には、KS-13、3BおよびG9-1から1.35倍程の有機酸産生量の増加が見込めると考えられるところ、実際には、MM-2を添加することにより、KS-13、3BおよびG9-1の盲腸での有機酸産生量が3.09倍になっていたので、MM-2の添加により、KS-13、3BおよびG9-1、すなわち、腸内有用菌の盲腸内有機酸産生量が相乗的に増加することが示された。
　以上の結果により、ビフィドバクテリウム　ロンガム菌（MM-2）を添加することにより、KS-13、3BおよびG9-1、すなわち、腸内有用菌の有機酸産生量が増強されることが示された。
［実施例２］無菌動物消化管内での菌数測定試験
（被検菌株）
　参考例及び実施例１と同様に、Bifidobacterium longum MM-2(MM-2)、Lactobacillus acidophilus KS-13(KS-13)、Streptococcus faecalis 129 BIO3B(3B)及びBifidobacterium bifidum G9-1(G9-1)を用いた。
（動物）
　実施例１と同様に、7週齢のBALB/cAJcl[GF]雄性無菌マウス（日本クレア）を無菌アイソレーター（日本クレア）内にて飼育し、１週間の馴化期間後、実験に供した。飼料は、CE-2飼料（日本クレア）を自由に与え、上水道水を給水瓶により自由に摂取させた。
（試験方法）
　KS-13、3BおよびG9-1、ならびにMM-2、KS-13、3BおよびG9-1の冷凍保存菌株を、各湿菌株が2.0×108 CFUずつとなるように0.2 mL PBSに懸濁した後、いずれかを、各無菌マウスに単回強制経口投与した。投与24時間後にイソフルラン麻酔下で大腸を摘出し、大腸内容物中の菌数を、定量PCR法を用いて測定した。大腸内容物のDNA抽出は、Matsukiらの方法 (APPL. ENVIRON. MICROBIOL. Dec. 2004, p. 7220-7228) に従って行った。定量 PCR法は、PowerUp SYBR Green Master Mix を使用し、QuantStudio 3 Real-Time PCR System（Applied Biosystems TM; Thermo Fisher Scientific、Inc.）を用いて大腸における菌数を測定した。使用した各菌の特異的プライマーの塩基配列は、表１に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（結果）
　大腸における各菌株の菌数は、G9-1/KS-13/3B群とG9-1/KS-13/3B/MM-2群を比較するとG9-1/KS-13/3B/MM-2群の方が、G9-1/KS-13/3B群より菌数が多い結果となった（図５）。
　以上の結果より、ビフィドバクテリウム　ロンガム菌（MM-2）を添加することにより、KS-13、3BおよびG9-1、すなわち、腸内有用菌の大腸での菌数が増加することから、MM-2により、腸内有用菌の増殖が増強されることが示された。
　本発明の方法は、効率よく、工業的有利に腸内有用菌を得ることが出来、また、有機酸産生能の向上等により、腸内有用菌の働きを向上させることが出来るため、腸内有用菌、特に、乳酸菌及び／又はビフィズス菌の培養に有用である。特に、医薬又は食品の分野で有用な腸内有用菌を、効率よく、機能の高い状態で得ることが出来るため、有用である。

Claims (8)

  1. 　ビフィドバクテリウム　ロンガム（Bifidobacterium longum）菌を含有することを特徴とする、腸内有用菌の増殖及び有機酸産生増強剤。
  2. 　腸内有用菌が乳酸菌及び／又はビフィズス菌であることを特徴とする、請求項１に記載の剤。
  3. 　ビフィドバクテリウム　ロンガム菌が、ビフィドバクテリウム　ロンガム　ＭＭ－２株（Bifidobacterium longum MM-2、受託番号：NITE BP-818）であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の剤。
  4. 　乳酸菌が、ラクトバシラス（Lactobacillus）属、ストレプトコッカス（Streptococcus）属、エンテロコッカス (Enterococcus)属、ラクトコッカス（Lactococcus）属、テトラジェノコッカス（Tetragenococcus）属、ペディオコッカス（Pediococcus）属及びオエノコッカス（Oenococcus）属の菌からなる群から選択される１種以上であること、及び／又は
    　ビフィズス菌が、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属から選択される１種以上であることを特徴とする、請求項２又は３に記載の剤。
  5. 　ビフィドバクテリウム　ロンガム（Bifidobacterium longum）菌及びプロバイオティクスを含有することを特徴とする、腸内有用菌の増殖及び有機酸産生増強剤。
  6. 　プロバイオティクスが乳酸菌及び／又はビフィズス菌であることを特徴とする、請求項５に記載の剤。
  7. 　乳酸菌が、ラクトバシラス（Lactobacillus）属、ストレプトコッカス（Streptococcus）属、エンテロコッカス（Enterococcus）属、ラクトコッカス（Lactococcus）属、テトラジェノコッカス（Tetragenococcus）属、ペディオコッカス（Pediococcus）属及びオエノコッカス（Oenococcus）属の菌からなる群から選択される１種以上であること、及び／又は
    　ビフィズス菌が、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属から選択される１種以上であることを特徴とする、請求項６に記載の剤。
  8. 　請求項１～７に記載の剤の、腸内有用菌増殖用薬及び／又は有機酸産生用薬を製造するための使用。
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