JP2020082047A - 分離成否判定方法、粒子検出方法および粒子分離装置 - Google Patents

分離成否判定方法、粒子検出方法および粒子分離装置 Download PDF

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Abstract

【課題】分離工程の成否を判定できる分離成否判定方法、粒子検出方法および粒子分離装置を提供する。【解決手段】分離成否判定方法は、第１粒子および第２粒子を含む試料を流路に流し、試料に含まれる粒子に作用する力の大きさの違いに基づいて、試料を、第１粒子を含む第１試料と、第２粒子を含む第２試料と、に分離するステップＳ１の分離工程と、第１試料の量に関する第１情報と、第２試料の量に関する第２情報とを測定するステップＳ２の測定工程と、第１情報と第２情報とに基づいて、分離工程の成否を判定するステップＳ３の判定工程と、を含む。【選択図】図１

Description

本発明は、分離成否判定方法、粒子検出方法および粒子分離装置に関する。
細胞は、被検者の疾患の状態など、様々な生体の状態を反映しており、多様な目的で測定対象となっている。細胞を効率的に測定する上で、目的の細胞を濃縮することが求められる。たとえば、血中循環腫瘍細胞（Circulating Tumor Cell：ＣＴＣ）、血管内皮細胞、骨髄液中の造血幹細胞、妊婦の血液中に含まれる胎児赤芽球など、サンプル中の希少細胞を対象とする際には、数多くの細胞から目的の細胞を精度良く分離することが重要となる。
細胞を分離する方法として、特許文献１には、曲線流路を流れるサンプル中の細胞をディーン渦に沿って移動させ、ＣＴＣをその他の細胞から単離する方法が記載されている。図１６に示す流路の注入口にサンプルおよびシースを流すことにより、排出口においてＣＴＣが曲線流路の内側壁近傍に移動し、ＲＢＣおよび白血球がチャネルの外側半分に移動する。これにより、内側の排出口からＣＴＣが分離および収集される。
特表２０１７−５００００６号公報
上記のように試料を分離し、臨床検査に供する場合、分離工程を正しく行うことが重要となる。しかしながら、たとえば、流路内に発生する気泡、流路内を流れる血液中の成分が固まることに起因する流路のつまり、流路が形成されたチップに接続された分離装置における流体機構の異常等の要因により、分離工程が適切に行われないことが起こり得る。ここで、臨床検査において、試料の分離によって取得した希少細胞に基づいて疾患の症状を把握する場合、分離工程が正しく行われなかったことにより分離後の試料に含まれる希少細胞の数が少なくなると、偽陰性が生じるおそれがある。
そこで、本発明は、試料の分離工程が正しく行われたかを判定可能な方法および装置を提供することを目的とする。
本発明の第１の態様は、分離成否判定方法に関する。本態様に係る分離成否判定方法は、第１粒子および第２粒子を含む試料（２１）を流路（１１０）に流し、試料（２１）に含まれる粒子に作用する力の大きさの違いに基づいて、試料（２１）を、第１粒子を含む第１試料（２２）と、第２粒子を含む第２試料（２３）と、に分離する分離工程（Ｓ１）と、第１試料（２２）の量に関する第１情報と、第２試料（２３）の量に関する第２情報とを測定する測定工程（Ｓ２）と、第１情報と第２情報とに基づいて、分離工程（Ｓ１）の成否を判定する判定工程（Ｓ３）と、を含む。
第１試料の量とは、第１試料の重量や体積であり、第２試料の量とは、第２試料の重量や体積である。第１情報とは、第１情報に基づいて第１試料の量を導くことができる情報である。第１情報としては、たとえば、測定した第１試料の量そのものの値や、第１試料の量の算出に用いることができる第１試料の流速などが挙げられる。第２情報とは、第２情報に基づいて第２試料の量を導くことができる情報である。第２情報としては、たとえば、測定した第２試料の量そのものの値や、第２試料の量の算出に用いることができる第２試料の流速などが挙げられる。
発明者らは、第１試料の量に関する第１情報と、第２試料の量に関する第２情報とが、第１試料と第２試料の分離状態を反映することを見いだした。したがって、本態様に係る分離成否判定方法によれば、測定工程において測定した第１情報と第２情報とに基づいて、分離工程の成否を判定できる。
また、このように分離工程の成否を判定できると、試料が適正に第１試料および第２試料に分離された場合にのみ、後段の工程に第１試料を供給できる。試料から適正に第１試料が分離された場合にのみ第１試料が後段の工程に供されると、後段の検出工程に供される測定試料に含まれる第１粒子の個数が、分離前の試料に含まれる第１粒子の個数に近付けられる。したがって、たとえば、第１粒子が希少細胞であり、第１粒子の検出結果に基づいて疾患の状態が判断される場合、分離前の試料から適正に分離され、十分な個数の第１粒子を含む測定試料に対して検出が行われることになる。これにより、疾患の状態の判断において、分離により希少細胞が失われ、分離後の試料に含まれる希少細胞の個数が少ないために生じる偽陰性を抑制できる。
本態様に係る分離成否判定方法は、分離工程（Ｓ１）において、試料（２１）を、試料（２１）よりも第１粒子の存在比率が大きい第１試料（２２）と、試料（２１）よりも第１粒子の存在比率が小さい第２試料（２３）と、に分離する。存在比率とは、試料中の第１粒子の数／試料中の所定の種類の粒子の数である。たとえば、第１粒子が血中循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）である場合、存在比率は、試料中のＣＴＣの数／試料中の血液細胞の数である。
本態様に係る分離成否判定方法において、試料に含まれる粒子ごとに作用する力の大きさの違いは、粒子の特性の違いにより生じる。
この場合に、粒子の特性の違いは、大きさの違い、重量の違い、比重の違い、の少なくとも１つである。
本態様に係る分離成否判定方法は、分離工程（Ｓ１）において、試料（２１）をマイクロ流路（１１０）に流すことにより、試料（２１）を第１試料（２２）と第２試料（２３）とに分離する。こうすると、分離工程を行うための構成を小型化できる。
本態様に係る分離成否判定方法は、分離工程（Ｓ１）において、曲線部（１１１）を有する流路（１１０）に試料（２１）を流すことにより、試料（２１）を第１試料（２２）と第２試料（２３）とに分離する。こうすると、簡素な構成で効果的に、試料を第１試料と第２試料とに分離できる。
本態様に係る分離成否判定方法は、分離工程（Ｓ１）において、流路（１１０）内で生じる速度分布に基づいて、試料（２１）を第１試料（２２）と第２試料（２３）とに分離する。こうすると、流路に試料を流すだけで、試料を第１試料と第２試料とに分離できる。
本態様に係る分離成否判定方法は、分離工程（Ｓ１）において、流路（１１０）に検体およびシース液を含む試料（２１）を流し、第１試料（２２）および第２試料（２３）は、検体およびシース液を含む。
本態様に係る分離成否判定方法において、測定工程（Ｓ２）は、分離工程（Ｓ１）の後に行われる。これにより、分離工程後の状態を反映した第１情報および第２情報を取得できるため、判定工程において分離工程の成否を判定できるようになる。
本態様に係る分離成否判定方法は、測定工程（Ｓ２）において、第１試料（２２）が流れる第１流路（１４１）および第２試料（２３）が流れる第２流路（１４２）にそれぞれ設置された検知部（１５１、１５２）の検知信号に基づいて、第１情報および第２情報を測定する。検知部の検知信号によれば、第１流路を流れる第１試料の流速を第１情報として取得でき、第２流路を流れる第２試料の流速を第２情報として取得できる。流速として取得された第１情報は、第１情報に基づいて第１試料の量を導くことができる情報であり、流速として取得された第２情報は、第２情報に基づいて第２試料の量を導くことができる情報である。したがって、第１情報と第２情報とに基づいて、分離工程の成否を判定できる。
本態様に係る分離成否判定方法において、第１情報は、第１試料（２２）の重量または体積に関する情報であり、第２情報は、第２試料（２３）の重量または体積に関する情報である。
本態様に係る分離成否判定方法において、第１情報および第２情報は、重量または体積を導くことができる情報とされ得る。
本態様に係る分離成否判定方法において、第１情報および第２情報は、圧力または流速に関する情報とされ得る。
本態様に係る分離成否判定方法は、判定工程（Ｓ３）において、第１情報および第２情報から算出される比率に基づいて、分離工程（Ｓ１）の成否を判定する。発明者らは、第１情報および第２情報から算出される比率が、第１試料と第２試料の分離状態を反映することを見いだした。したがって、算出した比率に基づいて分離工程の成否を判定できる。
この場合に、比率は、第１情報に対する第１情報および第２情報の和の比率、第２情報に対する第１情報および第２情報の和の比率、第１情報および第２情報の和に対する第１情報の比率、第１情報および第２情報の和に対する第２情報の比率、第１情報に対する第２情報の比率、または、第２情報に対する第１情報の比率とされ得る。
本態様に係る分離成否判定方法は、判定工程（Ｓ３）において、比率と所定の閾値とを比較して、分離工程（Ｓ１）の成否を判定する。
本態様に係る分離成否判定方法は、判定工程（Ｓ３）において、比率が所定の閾値より大きいか、または、比率が所定の閾値より小さいか、に基づいて分離工程（Ｓ３）の成否を判定する。こうすると、第１粒子に相当する粒子が第１試料中に極端に多い場合または極端に少ない場合に、分離工程が正しく行われなかったことを判定できる。
本態様に係る分離成否判定方法は、判定工程（Ｓ３）において、比率が所定の範囲内であるかに基づいて、分離工程（Ｓ１）の成否を判定する。こうすると、第１粒子に相当する粒子が第１試料中に極端に多い場合および極端に少ない場合に、分離工程が正しく行われなかったことを判定できる。
本態様に係る分離成否判定方法は、判定工程（Ｓ３）において、第１情報および第２情報の和に基づいて、分離工程（Ｓ１）の成否を判定する。分離工程において不具合が生じると、取得される第１試料および第２試料の量が減少することが起こり得る。この場合、適正な量の第１試料および第２試料が取得されないため、分離工程が正しく行われないことになる。したがって、判定工程において、第１試料の量に関する第１情報と、第２試料の量に関する第２情報との和が所定の閾値よりも大きいか否かを判定することにより、さらに分離工程の成否を判定できる。
本態様に係る分離成否判定方法は、判定工程（Ｓ３）において分離工程（Ｓ１）が正しく行われなかった場合、分離工程（Ｓ１）を再度行う。こうすると、分離工程が正しく行われなかった場合に、不適正な第１試料が後段の処理に供されることを防止し、適正な第１試料を取得するために円滑に分離工程を再開できる。
本態様に係る分離成否判定方法において、試料（２１）は、血液を含む。
本態様に係る分離成否判定方法において、第１粒子は、血中循環腫瘍細胞である。
本態様に係る分離成否判定方法において、第２粒子は、赤血球、白血球および血小板より選択される少なくとも１種類の血球を含む。
本発明の第２の態様は、粒子検出方法に関する。本態様に係る粒子検出方法は、第１の態様に係る分離成否判定方法において分離工程（Ｓ１）が正しく行われたと判定された第１試料（２２）を、フローサイトメーター（１３）または顕微鏡により測定し、試料（２１）に含まれる第１粒子を検出する。
本態様に係る粒子検出方法によれば、分離工程が正しく行われたと判定された場合にのみ、第１試料に基づいてフローサイトメーターまたは顕微鏡により第１粒子が検出される。これにより、フローサイトメーターまたは顕微鏡に供される測定試料に含まれる第１粒子の個数が、分離前の試料に含まれる第１粒子の個数に近付けられる。したがって、たとえば、第１粒子が希少細胞であり、希少細胞の検出結果に基づいて疾患の状態が判断される場合、分離前の試料から適正に分離され、十分な個数の第１粒子を含む測定試料に対して検出が行われることになる。これにより、疾患の状態の判断において、分離後の試料に含まれる希少細胞の個数が少ないために生じる偽陰性を抑制できる。
本発明の第３の態様は、粒子分離装置に関する。本態様に係る粒子分離装置（１１）は、試料（２１）を流路（１１０）に流し、試料（２１）に含まれる粒子に作用する力の大きさの違いに基づいて、試料（２１）を第１試料（２２）と第２試料（２３）とに分離する分離部（１０４）と、第１試料（２２）の量に関する第１情報と、第２試料（２３）の量に関する第２情報とを測定する測定部（１０５）と、第１情報と第２情報とに基づいて、分離部（１０４）における試料（２１）の分離の成否を判定する判定部（１０１）と、を備える。
本態様に係る粒子分離装置によれば、第１の態様と同様の効果が奏される。
本態様に係る粒子分離装置（１１）において、分離部（１０４）は、試料（２１）を流路（１１０）に流すポンプ（１０４ａ）を備えるよう構成され得る。
本態様に係る粒子分離装置（１１）において、流路（１１０）は、交換可能なチップ（１００）に形成され得る。こうすると、流路を洗浄するといった煩雑な作業を行うことなく、チップを交換するだけで異なる試料の分離を行うことができる。
本態様に係る粒子分離装置（１１）において、流路（１１０）は、曲線部（１１１）を備えるよう構成され得る。こうすると、簡素な構成で効果的に、試料を第１試料と第２試料とに分離できる。
本態様に係る粒子分離装置（１１）は、判定部（１０１）による判定結果を表示する表示部（１０３）を備えるよう構成され得る。こうすると、オペレータは、試料の分離が適正に行われたか否かを視覚的に把握できる。
本発明によれば、分離工程の成否を判定できる。
図１は、実施形態に係る分離成否判定方法の工程を示すフローチャートである。 図２は、実施形態に係る分離工程を説明するための模式図である。 図３（ａ）は、実施形態に係るチップの構成を示す模式図である。図３（ｂ）は、実施形態に係るマイクロ流路の断面を示す模式図である。 図４（ａ）は、実施形態に係るマイクロ流路の出力端部側の端部を示す模式図である。図４（ｂ）は、実施形態に係る測定工程を説明するための模式図である。 図５は、実施形態の変更例に係る分離成否判定方法の工程を示すフローチャートである。 図６（ａ）は、実施形態の分離成否判定方法の検討において作成された散布図である。図６（ｂ）は、実施形態の分離成否判定方法の検証において作成された散布図である。 図７は、実施形態に係る粒子検出方法の工程を示すフローチャートである。 図８は、実施形態に係る染色工程を説明するための模式図である。 図９は、実施形態に係る濃縮工程を説明するための模式図である。 図１０は、実施形態に係る検出工程を説明するための模式図である。 図１１は、実施形態に係る粒子検出システムの構成を示す模式図である。 図１２は、実施形態に係る粒子分離装置の構成を示す模式図である。 図１３（ａ）、（ｂ）は、実施形態に係る粒子分離装置の表示入力部に表示される判定結果を含む画面を示す模式図である。 図１４は、実施形態に係る染色濃縮装置の構成を示す模式図である。 図１５は、実施形態に係るフローサイトメーターの構成を示す模式図である。 図１６は、関連技術に係る構成を説明するための模式図である。
以下の実施形態に示す分離成否判定方法、粒子検出方法および粒子分離装置は、第１粒子および第２粒子を含む試料を流路に流し、試料に含まれる粒子に作用する力の大きさの違いに基づいて、試料を、第１粒子を含む第１試料と、第２粒子を含む第２試料と、に分離する。具体的には、図３（ａ）に示すチップ１００のマイクロ流路１１０に試料を流し、マイクロ流路１１０内において、粒子の径に応じて粒子に作用する力の大きさを異ならせ、図３（ｂ）に示すように粒子の流れる位置を変化させる。これにより、試料を分離して、図３（ａ）に示す出口１３１、１３２から、それぞれ第１試料と第２試料を取得する。そして、分離した第１試料の量に関する第１情報と、第２試料の量に関する第２情報とを測定し、第１情報と第２情報とに基づいて分離工程の成否を判定する。具体的には、図４（ｂ）に示す圧力検知部１５１、１５２を用いて、出口１３１から流れ出る第１試料の流速を第１情報として取得し、出口１３２から流れ出る第２試料の流速を第２情報として取得する。その後、第１情報と第２情報に基づく比率を算出し、算出した比率に基づいて分離工程の成否を判定する。
以下の実施形態において、試料が血液を含む例を挙げて説明する。しかしながら、試料は、血液に限らず、たとえば、尿や骨髄液などでもよい。また、以下の実施形態において、第１粒子は、血中循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）であり、第２粒子は、白血球である例を挙げている。
第１粒子は、ＣＴＣに限らず、ＣＴＣ以外の細胞でもよい。第１粒子は、血管内皮細胞（Circulating Endothelial Cell：ＣＥＣ）、または造血幹細胞（Hematopoietic Stem Cell：ＨＳＣ）でもよい。第１粒子は、ナノベシクル、マイクロベシクル、赤血球、白血球、血小板、血漿を構成する粒子、または血清を構成する粒子でもよい。ナノベシクルは、たとえば、エキソソームである。血漿を構成する粒子および血清を構成する粒子は、たとえば、タンパク質や微粒子である。また、第１粒子は、異常リンパ球であってもよい。
＜分離成否判定方法＞
図１は、分離成否判定方法の工程を示すフローチャートである。
実施形態の分離成否判定方法は、分離工程（ステップＳ１）、測定工程（ステップＳ２）、および判定工程（ステップＳ３）を含む。以下、オペレータが、各工程において粒子分離装置に指示を入力し、粒子分離装置が、入力された指示に応じて各工程を実行する場合について説明する。なお、ステップＳ１〜Ｓ３の全ての工程が、粒子分離装置により自動で行われてもよく、オペレータが機器を操作することにより行われてもよい。粒子分離装置については、追って図１２を参照して説明する。
以下の説明において、第１粒子は、後述する検出工程において検出対象とされ、後述する解析工程において解析対象とされる粒子であり、標的粒子である。第１粒子、すなわちＣＴＣを「第１細胞」と称し、第２粒子、すなわち赤血球、白血球、血小板などを「第２細胞」と称する。
ステップＳ１の分離工程において、粒子分離装置は、第１細胞および第２細胞を含む試料を、第１細胞を含む第１試料と、第２細胞を含む第２試料とに分離する。詳細には、ステップＳ１の分離工程において、粒子分離装置は、第１細胞および第２細胞を含む試料を流路に流し、試料に含まれる粒子に作用する力の大きさの違いに基づいて、試料を、第１試料と第２試料とに分離する。このとき、粒子分離装置は、試料を、試料よりも第１細胞の存在比率が大きい第１試料と、試料よりも第１細胞の存在比率が小さい第２試料とに分離する。
試料に含まれる粒子ごとに作用する力の大きさの違いは、粒子の特性の違いにより生じる。この場合の粒子の特性とは、形態的特性および物性的特性のことである。形態的特性とは、たとえば、粒子の大きさである。粒子の大きさとは、たとえば、直径や半径、平面視した場合の面積や周囲の長さなどである。物性的特性とは、重量、比重などである。
図２は、ステップＳ１の分離工程を説明するための模式図である。
粒子分離装置に供される試料は、あらかじめ赤血球が溶血された試料である。被検者から採取された直後の試料は、第１状態に示すように血液であり、具体的には全血である。第１状態の試料は、第１細胞であるＣＴＣと、第２細胞である赤血球、血小板、および白血球とを含む。図２において、ＣＴＣは黒丸で示され、赤血球は丸で示され、血小板は三角で示され、白血球は四角で示されている。オペレータは、第１状態の試料において所定の試薬を用いて赤血球を溶血させ、遠心分離器を用いて遠心分離し上清を除去する。これにより、第１状態の試料から赤血球がほぼなくなった第２状態の試料が取得される。そして、第２状態の試料が、粒子分離装置に供される。
なお、粒子分離装置が、試料を第１状態から第２状態にする処理を行ってもよい。たとえば、粒子分離装置が、赤血球を溶血するための機構や遠心分離器などを備えていてもよい。また、たとえば、ステップＳ１の分離工程において、図３（ａ）を参照して後述するチップ１００により、粒子の形態的特性および物性的特性の違いを利用して赤血球をその他粒子から分離し、試料を第１状態から第２状態にする処理が行われてもよい。また、試料を第１状態から第２状態にする処理を省略して、第１状態の試料を第２状態と見なして分離工程が行われてもよい。
ステップＳ１において、粒子分離装置は、第２状態の試料において第１細胞と第２細胞とを分離する。具体的には、粒子分離装置は、ＣＴＣ、赤血球、血小板、および白血球のそれぞれに作用する力の大きさの違いに基づいて、第２状態の試料から赤血球、血小板、および白血球を分離して除去する。実施形態では、細胞に作用する力の大きさの違いが細胞の直径の違いにより生じることを利用して、試料を流路に流すことにより分離が行われる。これにより、第２状態の試料は、第１細胞を含む第１試料と、第２細胞を含む第２試料とに分離される。こうして、第３状態に示すように、第１細胞を含む第１試料が取得される。
上記のように、第１状態の血液において赤血球が溶血され除去された後で試料の分離が行われると、試料の分離時に、血液に数多く含まれる赤血球があらかじめ除かれた状態となる。これにより、試料の分離において、試料を第１試料と第２試料とに円滑に分離できるようになる。
図２の第２状態の試料を第１試料と第２試料とに分離する際には、図３（ａ）に示すチップ１００を用いている。
図３（ａ）は、チップ１００の構成を示す模式図である。
チップ１００に設けられたマイクロ流路１１０に試料が流されることにより、チップ１００は、試料を第１試料と第２試料とに分離する。このとき、チップ１００は、第１試料における第１粒子の存在比率が、試料における第１粒子の存在比率よりも大きくなるよう、試料を第１試料と第２試料とに分離する。なお、存在比率とは、試料中の第１粒子の数／試料中の所定の種類の粒子の数である。第１粒子がＣＴＣである場合、存在比率は、たとえば、試料中のＣＴＣの数／試料中の血液細胞の数、または、試料中のＣＴＣの数／試料中の白血球の数である。存在比率の分母となる試料中の所定の種類の粒子の数は任意の粒子の数であり、第１粒子の測定に不要となる任意の粒子が、分離工程後の試料中から一部でも除去されていればよい。第１粒子がエキソソームである場合、存在比率は、たとえば、試料中のエキソソーム粒子の数／試料中の血液細胞の数である。第１粒子が血漿を構成するタンパク質である場合、存在比率は、たとえば、試料中のタンパク質分子の数／試料中の血液細胞の数である。
チップ１００は、マイクロ流路１１０と、入力端部１２０と、出力端部１３０と、を備える。マイクロ流路とは、一般的に、深さおよび幅が１０μｍ〜１０００μｍの範囲の流路のことである。チップ１００は、たとえば、マイクロ流路１１０、入力端部１２０、および出力端部１３０に対応する溝が形成された薄い板状部材に、他の板状部材を重ね合わせることにより構成される。実施形態の試料の分離は、Dean Flow Fractionationと呼ばれる分離原理に基づくものである。
マイクロ流路１１０は、渦巻き形状の曲線部１１１と、直線部１１２、１１３と、を有する。曲線部１１１の形状は、チップ１００に垂直な方向に見た場合に円弧状になっている。直線部１１２、１１３の形状は、チップ１００に垂直な方向に見た場合に直線状になっている。入力端部１２０は、マイクロ流路１１０の渦巻き形状の中心側端部に設けられており、出力端部１３０は、マイクロ流路１１０の入力端部１２０とは反対側端部に設けられている。入力端部１２０は、直線部１１２を介して曲線部１１１と繋がっており、出力端部１３０は、直線部１１３を介して曲線部１１１と繋がっている。
入力端部１２０は、入口１２１、１２２を備える。入口１２１、１２２は、チップ１００を構成する部材に設けられた孔により構成される。入口１２１は、マイクロ流路１１０の渦巻き形状の外周側において、直線部１１２を介して曲線部１１１に接続されている。入口１２２は、マイクロ流路１１０の渦巻き形状の内周側において、直線部１１２を介して曲線部１１１に接続されている。出力端部１３０は、出口１３１、１３２を備える。出口１３１、１３２は、チップ１００を構成する部材に設けられた孔により構成される。出口１３１は、マイクロ流路１１０の渦巻き形状の内周側において、直線部１１３を介して曲線部１１１に接続されている。出口１３２は、マイクロ流路１１０の渦巻き形状の外周側において、直線部１１３を介して曲線部１１１に接続されている。
試料を分離する際には、入口１２１に、図２に示した第２状態の試料が注入され、入口１２２には、シース液が注入される。入口１２１に注入される第２状態の試料の量は、たとえば５ｍＬであり、入口１２２に注入されるシース液の量は、たとえば４５ｍＬである。そして、入口１２１、１２２にチューブを介して接続されたポンプ１０４ａにより、入口１２１、１２２に陽圧が加えられる。これにより、入口１２１に注入された試料と、入口１２２に注入されたシース液とが、マイクロ流路１１０内を出力端部１３０に向かって流れる。マイクロ流路１１０に試料およびシース液が流され、出口１３１から取得される第１試料および出口１３２から取得される第２試料も、試料およびシース液を含む。出口１３１から取得される第１試料の量は、たとえば１０ｍＬであり、出口１３２から取得される第２試料の量は、たとえば４０ｍＬである。
図３（ｂ）は、図３（ａ）に示すマイクロ流路１１０のＡ−Ａ’断面図である。図３（ｂ）において、右側が渦巻き形状の外周側であり、左側が渦巻き形状の内周側である。
第２状態の試料がマイクロ流路１１０に流されると、マイクロ流路１１０内において、図３（ｂ）に示すように、流路の向きに直交する方向に細胞の流れる位置を変化させる力が生じる。具体的には、細胞の径に応じて異なる大きさの揚力ＦＬとディーン抗力ＦＤとが生じる。一般的に、マイクロ流路においては、流路の断面中心の速度が大きく壁近傍の速度が小さくなるように流速が分布する。渦巻き状のマイクロ流路１１０においては、さらに上記の流速分布に起因して、図３（ｂ）において楕円状の矢印に示すように、ディーン渦と呼ばれる二次流が発生する。ディーン抗力ＦＤと揚力ＦＬは、以下の式（１）、（２）により表すことができる。
Figure 2020082047
試料内の細胞は、マイクロ流路１１０に沿って押し流されながら、揚力ＦＬとディーン抗力ＦＤにより、マイクロ流路１１０内において径の値に応じて分布するようになる。
図４（ａ）は、マイクロ流路１１０の出力端部１３０側の端部を示す模式図である。
マイクロ流路１１０においてディーン渦が発生すると、図４（ａ）に示すように、マイクロ流路１１０の出力端部１３０側の端部において、径の値に応じて細胞が分布する。こうして、出口１３１から、所定の径以上の細胞が取得される。出口１３１から取得される試料は、図２の第３状態の第１試料であり、出口１３２から取得される試料は、図２の第２試料である。
大半の白血球の直径は、１０μｍ〜１５μｍ付近の値以下であり、大半のがん細胞の直径は、１０μｍ〜１５μｍ付近の値以上である。したがって、図２の第２状態から第２細胞を除去する際には、１０μｍ〜１５μｍ付近の値をカットオフ値として、カットオフ値より小さい直径の細胞を除去して、カットオフ値以上の直径の細胞を取り出すのが好ましい。
このように、マイクロ流路１１０によれば、簡素な構成で試料を第１試料と第２試料とに分離でき、分離工程を行うための構成を小型化できる。また、曲線部１１１を有するマイクロ流路１１０に試料を流すことにより分離が行われるため、簡素な構成で効果的に、試料を第１試料と第２試料とに分離できる。また、マイクロ流路１１０によれば、曲線部１１１内で生じる速度分布に基づいて分離が行われるため、マイクロ流路１１０に試料を流すだけで、試料を第１試料と第２試料とに分離できる。
なお、マイクロ流路１１０によれば、試料から第１試料として血漿を分離させることもできる。この場合、血漿を構成するタンパク質や微粒子が第１粒子となる。第１粒子であるタンパク質や微粒子の径は小さいため、これら第１粒子は出口１３２へと導かれ、血漿は出口１３２から取得される。
図１に戻り、ステップＳ２の測定工程において、粒子分離装置は、分離工程で得られた第１試料と第２試料に基づいて、第１試料の量に関する第１情報と、第２試料の量に関する第２情報とを測定する。
第１試料の量とは、第１試料の重量や体積であり、第２試料の量とは、第２試料の重量や体積である。第１情報とは、第１情報に基づいて第１試料の量を導くことができる情報である。第１情報としては、たとえば、第１試料の量そのものの値、第１試料の量の算出に用いることができる第１試料の流速、第１試料が流れる流路の圧力、などが挙げられる。第２情報とは、第２情報に基づいて第２試料の量を導くことができる情報である。第２情報としては、たとえば、第２試料の量そのものの値、第２試料の量の算出に用いることができる第２試料の流速、第２試料が流れる流路の圧力、などが挙げられる。実施形態では、第１試料の量は、第１試料の重量であり、第１情報は、第１試料の流速である。また、第２試料の量は、第２試料の重量であり、第２情報は、第２試料の流速である。
図４（ｂ）は、ステップＳ２の測定工程を説明するための模式図である。
チップ１００の出口１３１には、第１流路１４１が接続されている。出口１３１には、第１試料を収容するための容器が、第１流路１４１を介して接続されている。第１流路１４１は、出口１３１から流出する第１試料を、第１試料を収容するための容器へと導く。第１流路１４１は、チューブである。同様に、チップ１００の出口１３２には、第２流路１４２が接続されている。出口１３２には、第２試料を収容するための容器が、第２流路１４２を介して接続されている。第２流路１４２は、出口１３２から流出する第２試料を、第２試料を収容するための容器へと導く。第２流路１４２は、チューブである。
第１流路１４１には、第１流路１４１内を流れる第１試料の流速を測定するための圧力検知部１５１が設置されている。圧力検知部１５１は、第１流路１４１内の圧力を検出する。同様に、第２流路１４２には、第２流路１４２内を流れる第２試料の流速を測定するための圧力検知部１５２が設置されている。圧力検知部１５２は、第２流路１４２内の圧力を検出する。圧力検知部１５１、１５２には、演算部１５３が接続されている。演算部１５３は、圧力検知部１５１、１５２の検知信号に基づいて、第１流路１４１内の流速および第２流路１４２内の流速を取得する。
なお、圧力検知部１５１、１５２に代えて、第１流路１４１内の圧力を検知して流速を取得する流速検知部と、第２流路１４２内の圧力を検知して流速を取得する流速検知部とが設けられてもよい。
ここで、測定された第１試料の流速は、第１試料の重量を導くことができる情報である。すなわち、第１流路１４１における第１試料の流速と、第１流路１４１の断面積と、第１流路１４１内を第１試料が流れた時間と、第１試料の比重とを乗算することにより、第１試料の重量を導くことができる。同様に、測定された第２試料の流速は、第２試料の重量を導くことができる情報である。すなわち、第２流路１４２における第２試料の流速と、第２流路１４２の断面積と、第２流路１４２内を第２試料が流れた時間と、第２試料の比重とを乗算することにより、第２試料の重量を導くことができる。
なお、測定された第１試料の流速は重量の導出に用いるだけでなく、測定された第１試料の流速と、第１流路１４１の断面積と、第１流路１４１内を第１試料が流れた時間と、を乗算することにより、第１試料の体積を導くことができる。同様に、測定された第２試料の流速は、第２試料の体積を導くことができる情報である。
圧力検知部１５１の検知信号によれば、第１流路１４１を流れる第１試料の流速を第１情報として取得でき、圧力検知部１５２の検知信号によれば、第２流路１４２を流れる第２試料の流速を第２情報として取得できる。流速として取得された第１情報は、第１情報に基づいて第１試料の量を導くことができる情報であり、流速として取得された第２情報は、第２情報に基づいて第２試料の量を導くことができる情報である。したがって、第１情報と第２情報とに基づいて、後段の判定工程において分離工程の成否を判定できる。
このような測定工程は、分離工程の後に行われる。具体的には、チップ１００において分離が終了し、出口１３１、１３２から流出する第１試料と第２試料とに対して、流速が測定される。これにより、分離工程後の状態を反映した第１情報および第２情報を取得できるため、判定工程において分離工程の成否を判定できるようになる。
図１に戻り、ステップＳ３の判定工程において、粒子分離装置は、第１情報と第２情報とに基づいて、ステップＳ１の分離工程の成否を判定する。
ここで、発明者らは、第１細胞を含む第１試料の量に関する第１情報と、第２細胞を含む第２試料の量に関する第２情報とが、第１試料と第２試料の分離状態を反映することを見いだした。したがって、ステップＳ３の判定工程において、ステップＳ２の測定工程において測定した第１情報と第２情報とに基づいて、ステップＳ１の分離工程の成否を判定できる。より詳細には、発明者らは、第１情報および第２情報から算出される比率が、第１試料と第２試料の分離状態を反映することを見いだした。したがって、第１情報および第２情報から算出される比率に基づいて、分離工程の成否を判定できる。なお、第１情報および第２情報から算出される比率が分離状態を反映することについては、追って発明者らが行った検討において説明する。
実施形態では、第１情報および第２情報から算出される比率は、第１情報に対する第１情報および第２情報の和の比率である。すなわち、実施形態の比率は、（第１情報＋第２情報）／第１情報である。
なお、算出される比率は、第２情報に対する第１情報および第２情報の和の比率、第１情報および第２情報の和に対する第１情報の比率、第１情報および第２情報の和に対する第２情報の比率などでもよい。すなわち、比率は、（第１情報＋第２情報）／第２情報、第１情報／（第１情報＋第２情報）、第２情報／（第１情報＋第２情報）でもよい。また、算出される比率は、第１情報に対する第２情報の比率、第２情報に対する第１情報の比率などでもよい。すなわち、比率は、第２情報／第１情報、第１情報／第２情報でもよい。
ステップＳ３の判定工程において、粒子分離装置は、上記のように算出された比率が所定の閾値よりも大きいか、または、上記のように算出された比率が所定の閾値より小さいか、に基づいて分離工程の成否を判定する。比率が所定の閾値よりも大きい場合に分離工程が正しく行われたと判定するか、比率が所定の閾値よりも小さい場合に分離工程が正しく行われたと判定するかは、比率の演算式によって変わる。このように判定が行われると、第１細胞に相当する粒子が第１試料中に極端に多い場合または極端に少ない場合に、分離工程が正しく行われなかったことを判定できる。
なお、粒子分離装置は、上記のように算出された比率が所定の範囲内であるかに基づいて、分離工程の成否を判定してもよい。このように判定が行われると、第１細胞に相当する粒子が第１試料中に極端に多い場合および極端に少ない場合に、分離工程が正しく行われなかったことを判定できる。
ここで、分離工程が正しく行われない要因として、たとえば、マイクロ流路１１０内に発生する気泡、マイクロ流路１１０内を流れる血液中の成分が固まることに起因するマイクロ流路１１０のつまり、マイクロ流路１１０の成形不良、チップ１００に接続された粒子分離装置における流体機構の異常等が挙げられる。これに対し、上記のように測定工程および判定工程が行われると、これらの要因によって分離工程が適切に行われなかったことを把握できる。
以上ように分離工程の成否を判定できると、試料が適正に第１試料および第２試料に分離された場合にのみ、後段の工程に第１試料を供給できる。このように、試料から適正に第１試料が分離された場合にのみ第１試料が後段の工程に供されると、たとえば、後段の検出工程に供される測定試料に含まれる第１細胞の個数が、分離前の試料に含まれる第１細胞の個数に近付けられる。したがって、たとえば、第１細胞が希少細胞であり、第１細胞の検出結果に基づいて疾患の状態が判断される場合、分離前の試料から適正に分離され、十分な個数の第１細胞を含む測定試料に対して検出が行われることになる。これにより、疾患の状態の判断において、分離により希少細胞が失われ、分離後の試料に含まれる希少細胞の個数が少ないために生じる偽陰性を抑制できる。
なお、図１に示した分離成否判定方法は、図５のように行われてもよい。
図５は、実施形態の変更例に係る分離成否判定方法の工程を示すフローチャートである。
分離成否判定方法の変更例においては、図１と比較して、ステップＳ３の代わりにステップＳ４が追加され、ステップＳ４の後段にステップＳ５が追加されている。
ステップＳ４の判定工程において、粒子分離装置は、上記と同様、第１情報と第２情報とに基づいて分離工程の成否を判定する。さらに、ステップＳ４の判定工程において、粒子分離装置は、第１情報および第２情報の和に基づいて、分離工程の成否を判定する。具体的には、粒子分離装置は、第１情報および第２情報の和が所定の閾値よりも大きいか否かを判定して、分離工程の成否を判定する。このように、ステップＳ４の判定工程では、分離工程に関する２つの判定が行われる。
ここで、分離工程においてチップ１００やチップ１００に試料を送り込むポンプ１０４ａ等の不具合が生じると、取得される第１試料および第２試料の量が減少することが起こり得る。この場合、適正な量の第１試料および第２試料が取得されないため、分離工程が正しく行われないことになる。したがって、ステップＳ４の判定工程において、第１試料の量に関する第１情報と、第２試料の量に関する第２情報との和が所定の閾値よりも大きいか否かを判定することにより、さらに分離工程の成否を判定できる。
ステップＳ５において、粒子分離装置は、ステップＳ４で行った分離工程に関する２つの判定結果から、分離工程が適正に行われたか否かを判定する。粒子分離装置は、第１情報と第２情報とに基づいて分離工程が正しく行われたと判定し、かつ、第１情報および第２情報の和が所定の閾値よりも大きいと判定した場合に、分離工程が適正に行われたと判定する。この場合、図５の処理が終了する。
他方、２つの判定の少なくとも一方で分離工程が正しく行われなかったと判定した場合、粒子分離装置は、処理をステップＳ１に戻す。この場合、チップ１００に供給可能な第２状態の試料が残っていれば、粒子分離装置は、第２状態の試料を用いてステップＳ１以降の処理を再度行う。チップ１００に供給可能な第２状態の試料がなければ、オペレータは、被検者から再度血液を取得し、第２状態の試料を精製する。そして、粒子分離装置は、精製された第２状態の試料を用いてステップＳ１以降の処理を再度行う。また、分離工程により取得された第１試料を、再度、分離工程に供給してもよい。
このように、ステップＳ５において分離工程が適正でないと判定された場合に分離工程が再度行われると、不適正な第１試料が後段の処理に供されることを防止し、適正な第１試料を取得するために円滑に分離工程を再開できる。
＜分離成否判定方法の検討＞
次に、発明者らが行った分離成否判定方法の検討について説明する。この検討は、以下に示す手順１〜６からなる。
１．試料の調製
ＣＴＣモデル細胞株から得られたＣＴＣを、所定の試薬により染色した。そして、ＣＴＣが数個〜数百個程度含まれるようにＣＴＣをＰＢＳに添加し、図２の第２状態に相当する試料を調製した。ＣＴＣのカウントは、顕微鏡を用いて目視により行われた。このような試料を１２種類調製した。
２．試料の分離
手順１で調製した１２種類の試料をそれぞれ粒子分離装置に供給し、粒子分離装置において図３（ａ）に示したチップ１００を用いて、試料を第１試料と第２試料とに分離した。ここで、１２種類の試料のうちいくつかの試料を分離する際に、粒子分離装置において第２試料を収容するための容器の設置位置を上下方向に移動させることにより、チップ１００のマイクロ流路１１０内の圧力を変化させ、意図的に分離工程に不具合を生じさせた。
３．第１試料と第２試料の重量の測定
１２種類の試料ごとに、手順２で分離された第１試料と第２試料の重量を、電子天秤を用いて測定した。したがって、この検討においては、第１情報は第１試料の重量であり、第２情報は第２試料の重量である。
４．比率の算出
第１情報および第２情報に基づく比率を（第１情報＋第２情報）／第１情報とし、１２種類の試料ごとに比率を算出した。
５．回収率の算出
１２種類の試料ごとに、第１試料に含まれるＣＴＣを、顕微鏡を用いて目視によりカウントし、第１試料に含まれるＣＴＣの個数を、上記手順１で取得した試料に含まれるＣＴＣの個数で除算することにより回収率を算出した。
６．散布図の作成および一次線形回帰式と決定係数の算出
図６（ａ）は、分離成否判定方法の検討において作成された散布図である。図６（ａ）に示すように、手順４で取得した比率と、手順５で取得した回収率との散布図を作成した。散布図には、１２種類の試料について、比率と回収率からなる点がプロットされている。図６（ａ）の散布図において、上述したようにいくつかの試料を分離する際に意図的に分離工程に不具合を生じさせたため、いくつかの試料において回収率が低くなっている。作成した散布図に基づいて、一次線形回帰式と決定係数を算出した。一次線形回帰式の傾きは−０．２５、決定係数は０．８８５１であった。
以上の手順１〜６により作成された散布図において、決定係数が１に近い値であることから、１２種類の試料についてプロットされた点は、概ね一次線形回帰式に沿って並んでいると言える。このように、発明者らは、比率と回収率との間に相関関係があることを見いだした。
さらに、発明者らは、比率と回収率との間に相関関係があることから、比率に基づいて試料の分離の精度を評価できることを見いだした。たとえば、図６（ａ）に示す例の場合、回収率が７０％程度以上を達成するためには、比率は、少なくとも６．０以下であるのが好ましいことが分かる。さらに、回収率７０％をＣＶ１０％の範囲で達成するためには、比率は５．１以下であるのが好ましいことが分かる。したがって、上述した判定工程において、比率が所定の閾値よりも小さいか否かに基づいて分離工程の成否を判定できる。そして、比率が所定の閾値よりも小さいと判定されれば、分離工程が正しく行われたと判定できる。
また、図６（ａ）に示す例の場合、回収率７０％程度を達成するためには、少なくとも比率は４．０〜６．０であるのが好ましいことが分かる。さらに、回収率７０％をＣＶ１０％の範囲で達成するためには、比率は４．６〜５．１であるのが好ましいことが分かる。したがって、上述した判定工程において、比率が所定の範囲内であるか否かが判定され、比率が所定の範囲内であると判定されれば、分離工程が正しく行われたと判定できる。ここで、回収率が高すぎる場合、第１試料に不要な細胞が数多く含まれる可能性がある。しかしながら、比率が所定の範囲内であるか否かが判定されれば、第１試料に不要な細胞が数多く含まれる場合でも、分離工程が正しく行われなかったことを適正に判定できる。
なお、第１情報および第２情報に基づく比率が第１情報／（第１情報＋第２情報）である場合、上述した判定工程において、比率が所定の閾値よりも大きいか否かに基づいて分離工程の成否を判定できる。また、比率が第１情報／（第１情報＋第２情報）である場合、判定に用いられる範囲および閾値は、図６（ａ）を参照して説明した値とは異なる。このように、判定に用いられる範囲および閾値は、比率の演算式に応じて設定される。
また、本検討においては、第１情報および第２情報は重量であったが、上述したように第１情報および第２情報が流速である場合、判定に用いられる範囲および閾値は、第１情報および第２情報が重量である場合とは異なる。すなわち、重量は、流速と、断面積と、試料が流れた時間と、試料の比重とを乗算したものである。したがって、重量の算出で乗算されるパラメータのうち所定のパラメータの値が、あらかじめ判定に用いられる範囲および閾値に反映されれば、判定に用いられる範囲および閾値は、図６（ａ）を参照して説明した値とは異なるものになる。このように、判定に用いられる範囲および閾値は、第１情報および第２情報の種類に応じて設定される。
＜分離成否判定方法の検証＞
次に、発明者らが行った分離成否判定方法の検証について説明する。この検証は、以下に示す手順１〜６からなる。
１．試料の調製
がん細胞の細胞株から得られたがん細胞を、所定の試薬により染色した。そして、がん細胞が数個〜数百個程度含まれるようにがん細胞を健康人の血液に添加し、図２の第１状態に相当する試料を調製した。がん細胞のカウントは、顕微鏡を用いて目視により行われた。このような試料を９５種類調製した。がん細胞の細胞株として、肺がん細胞株「A549TT」と、乳がん細胞株「SK-BR-3」と、乳がん細胞株「HCC1569DP」とを用いた。
２．試料の分離
手順１で調製した９５種類の試料をそれぞれ粒子分離装置に供給し、粒子分離装置において図３（ａ）に示したチップ１００を用いて、試料を第１試料と第２試料とに分離した。
３．第１試料と第２試料の重量の測定
９５種類の試料ごとに、手順２で分離された第１試料と第２試料の重量を、電子天秤を用いて測定した。したがって、この検証においては、第１情報は第１試料の重量であり、第２情報は第２試料の重量である。
４．比率の算出
第１情報および第２情報に基づく比率を（第１情報＋第２情報）／第１情報とし、９５種類の試料ごとに比率を算出した。
５．回収率の算出
９５種類の試料ごとに、第１試料に含まれるがん細胞を、顕微鏡を用いて目視によりカウントし、第１試料に含まれるがん細胞の個数を、上記手順１で取得した試料に含まれるがん細胞の個数で除算することにより回収率を算出した。
６．散布図の作成
図６（ｂ）は、分離成否判定方法の検証において作成された散布図である。図６（ｂ）に示すように、手順４で取得した比率と、手順５で取得した回収率との散布図を作成した。散布図には、９５種類の試料のうち、回収率７０％をＣＶ１０％の範囲で達成できた２３種類の試料について、比率と回収率からなる点がプロットされている。
以上の手順１〜６により作成された散布図において、閾値として上記の分離成否判定方法の検討で取得した５．１を設定した。この場合、図６（ｂ）に示すように、全ての試料において、比率が閾値よりも小さくなった。したがって、比率に対して設定された閾値によれば、適正に第１細胞を回収できた２３種類の試料に対して、分離工程が正しく行われたことを間違いなく判定できることが分かった。よって、臨床検査において実際に被検者から採取された試料に基づいて、分離工程の成否を判定できることが示唆された。
＜粒子検出方法＞
次に、粒子検出方法について説明する。
図７は、粒子検出方法の工程を示すフローチャートである。
粒子検出方法は、図１と同様のステップＳ１〜Ｓ３と、ステップＳ１１〜Ｓ１４と、を含む。以下、オペレータが、各工程において粒子検出システムの各装置に指示を入力し、粒子検出システムの各装置が、入力された指示に応じて、各工程を実行する場合について説明する。なお、ステップＳ１〜Ｓ３、Ｓ１１〜Ｓ１４の全ての工程が、粒子検出システムにより自動で行われてもよく、オペレータが機器を操作することにより行われてもよい。粒子検出システムについては、追って図１１以降を参照して説明する。
以下、ステップＳ１〜Ｓ３は、図１を参照して説明した処理と同様であるため、ステップＳ１１〜Ｓ１４について説明する。ステップＳ１１〜Ｓ１４の工程には、ステップＳ３の判定工程において試料の分離が適正に行われたと判定された場合の第１試料が供される。
ステップＳ１１の染色工程において、粒子検出システムは、フローサイトメーターにおける検出のために、第１試料に含まれる第１細胞を染色する。
図８は、ステップＳ１１の染色工程を説明するための模式図である。
ステップＳ１１において、粒子検出システムは、染色のための試薬を第３状態の第１試料に混合して、第１細胞の標的部位を染色する。具体的には、標的部位が蛍光色素により蛍光標識される。実施形態では、染色対象となる標的部位は、核、Ｈｅｒ２遺伝子、および１７番染色体のセントロメア領域（ＣＥＰ１７）である。図８の上部の図に示すように、第３状態においては、核、Ｈｅｒ２遺伝子、およびＣＥＰ１７のいずれも染色されていない。ステップＳ１１の染色工程が行われることにより、図８の下部の図に示すように、核、Ｈｅｒ２遺伝子、およびＣＥＰ１７がそれぞれ異なる蛍光色素で染色される。こうして、第１試料は、第３状態から第４状態へと移行する。
なお、上記染色工程において、染色される標的部位は、細胞の部位であればよい。染色される標的部位は、遺伝子や核に限らず、たとえば、細胞のタンパク質、細胞質、細胞膜、細胞膜上の表面抗原でもよい。標的部位の染色は、インサイチュハイブリダイゼーションや特異的な染色に基づいて行われることに限らず、抗原抗体反応に基づく免疫染色によって行われてもよい。標的部位が遺伝子の場合、Ｈｅｒ２遺伝子やＣＥＰ１７に限らず、他の遺伝子領域であってもよい。実施形態において、細胞の染色とは、上記のように、細胞の遺伝子、核、タンパク質、細胞質、細胞膜、表面抗原などを染色することを意味する。
上記染色工程において、細胞の遺伝子および核の染色に代えて、細胞のタンパク質および細胞質の染色を行ってもよい。また、細胞の遺伝子および核の染色とともに、細胞のタンパク質および細胞質の染色を行ってもよい。細胞質内に存在するタンパク質を染色する場合には、細胞質が染色されるのが好ましい。細胞質内に存在するタンパク質として、前立腺がん由来のＣＴＣに存在するＰＳＡや、肺がん由来のＣＴＣに存在するサイトケラチンなどが挙げられる。
なお、染色工程が行われなくても、後段のステップＳ１３の検出工程において第１細胞の検出が可能である場合、染色工程は省略されてもよい。
図７に戻り、ステップＳ１２の濃縮工程において、粒子検出システムは、第１試料から第１細胞の濃度が増した測定試料を得る。
図９は、ステップＳ１２の濃縮工程を説明するための模式図である。
ステップＳ１２において、粒子検出システムは、第４状態の第１試料に対して、遠心分離等の処理を行い、遠心分離後の第１試料の上清を除去する。これにより、第４状態の第１試料に含まれる細胞が残存した状態で液量が低下し、第１細胞の濃度が増加する。こうして、第４状態の第１試料は、第５状態の測定試料となる。濃縮工程では、測定試料に含まれる細胞の濃度が所定の濃度となるように、第１試料が濃縮される。
濃縮工程により、測定試料に含まれる細胞の濃度が所定の濃度となるため、後段の検出工程において、フローサイトメーターによる検出を適正かつ効率的に行うことができる。
図７に戻り、ステップＳ１３の検出工程において、粒子検出システムは、濃縮工程で得られた測定試料をフローサイトメーターに供して第１細胞を検出する。
図１０は、ステップＳ１３の検出工程を説明するための模式図である。
ステップＳ１３において、粒子検出システムは、第５状態の測定試料をフローサイトメーターに供して、フローサイトメーターに設けられた撮像部により、測定試料に含まれる細胞から生じる蛍光を撮像する。これにより、測定試料に含まれる細胞ごとに蛍光画像が取得される。また、フローサイトメーターは、取得した蛍光画像に基づいて、Ｈｅｒ２遺伝子が増幅しているか否かを判定し、Ｈｅｒ２遺伝子が増幅している陽性細胞をＣＴＣとして検出する。
なお、検出工程において、フローサイトメーターに代えて顕微鏡によりＣＴＣの検出が行われてもよい。この場合、たとえば、オペレータが顕微鏡を用いてＨｅｒ２遺伝子が増幅している陽性細胞を目視により検出する。
上述したように、ステップＳ１１〜Ｓ１４の工程には、ステップＳ３の判定工程において試料の分離が適正に行われたと判定された場合の第１試料が供される。そして、ステップＳ１３において、判定工程において試料の分離が適正に行われたと判定された場合の第１試料に基づいて、フローサイトメーターにより第１細胞が検出される。これにより、フローサイトメーターに供される測定試料に含まれる第１細胞の個数が、分離前の試料に含まれる第１細胞の個数に近付けられる。したがって、たとえば、第１細胞が希少細胞であり、第１細胞の検出結果に基づいて疾患の状態が判断される場合、分離前の試料から適正に分離され、十分な個数の第１細胞を含む測定試料に対して検出が行われることになる。これにより、疾患の状態の判断において、分離後の試料に含まれる希少細胞の個数が少ないために生じる偽陰性を抑制できる。
図７に戻り、ステップＳ１４の解析工程において、粒子検出システムは、検出工程で検出した第１細胞の解析を行う。具体的には、第１細胞の検出を行ったフローサイトメーターは、第１細胞の数や、撮像部により撮像した全細胞における第１細胞の割合などを取得する。
なお、第１細胞が血管内皮細胞（ＣＥＣ）である場合、解析工程において、ＣＥＣに含まれるタンパク質であるＮＦκＢの、細胞内における局在が解析される。具体的には、染色工程において、ＣＥＣは、ＣＥＣに発現する抗体に特異的に結合するＣＤ１４６の標識抗体を介して蛍光標識され、ＮＦκＢは、ＮＦκＢに特異的に結合する標識抗体を介して蛍光標識される。検出工程において、ＣＥＣに基づく蛍光が撮像され、ＮＦκＢに基づく蛍光が撮像される。そして、蛍光画像に基づいてＣＥＣが検出される。解析工程では、シグナル分子であるＮＦκＢが核内に局在しているか否かが判定され、ＣＥＣの活性化の有無が判定される。
また、第１細胞が肺がん由来のＣＴＣであり、標的部位がサイトケラチンである場合、検出工程において、サイトケラチンが細胞質内に存在している量に基づいて第１細胞の検出が行われる。そして、解析工程において、第１細胞の数や第１細胞の割合が取得される。
また、第１粒子がエキソソームである場合、解析工程において、エキソソームに内包されているｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、タンパク質や、エキソソーム膜を構成している脂質、タンパク質などが解析される。また、第１粒子が血漿を構成する粒子である場合、分離工程で第１試料として血漿が取得され、分離工程で取得された血漿に基づいて、検出工程において凝固検査に関する測定または免疫検査に関する測定が行われる。凝固検査に関する測定は凝固測定装置を用いて行われ、免疫検査に関する測定は免疫測定装置を用いて行われる。そして、解析工程において、測定結果に基づいて血漿の分析が行われる。
＜粒子検出システム＞
次に、図７のステップＳ１〜Ｓ３、Ｓ１１〜Ｓ１４の各工程を行うための粒子検出システム１０について説明する。
図１１は、粒子検出システム１０の構成を示す模式図である。粒子検出システム１０は、粒子分離装置１１と、染色濃縮装置１２と、フローサイトメーター１３と、を備える。
粒子分離装置１１は、容器Ｔ１に収容された第２状態の試料２１を用いてステップＳ１の分離工程、ステップＳ２の測定工程、およびステップＳ３の判定工程を行い、容器Ｔ２に収容された第１試料２２と、容器Ｔ３に収容された第２試料２３と、を得る。染色濃縮装置１２は、容器Ｔ２に収容された第１試料２２を用いてステップＳ１１の染色工程およびステップＳ１２の濃縮工程を行い、容器Ｔ４に収容された測定試料２４を得る。フローサイトメーター１３は、容器Ｔ４に収容された測定試料２４を用いてステップＳ１３の検出工程およびステップＳ１４の解析工程を行う。
なお、粒子検出システム１０は、複数の装置により構成されたが、１つの装置により構成されてもよい。
図１２は、粒子分離装置１１の構成を示す模式図である。粒子分離装置１１は、制御部１０１と、記憶部１０２と、表示入力部１０３と、分離部１０４と、測定部１０５と、を備える。
制御部１０１は、ＣＰＵにより構成される。制御部１０１は、記憶部１０２に記憶されたプログラムに基づいて各種の処理を行う。制御部１０１は、粒子分離装置１１内の各部に接続されており、各部からの信号を受信して各部を制御する。記憶部１０２は、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ハードディスク等により構成される。表示入力部１０３は、タッチパネル式のディスプレイにより構成される。なお、表示入力部１０３に代えて、液晶ディスプレイにより構成された表示部と、マウスやキーボードにより構成された入力部とが設けられてもよい。
粒子分離装置１１に供給された第２状態の試料２１は、分離部１０４に移送される。分離部１０４は、チップ１００の入力端部１２０に陽圧を加えるためのポンプ１０４ａを備える。オペレータは、試料２１の分離ごとに、チップ１００を交換して新しいチップ１００を分離部１０４にセットする。チップ１００は、交換可能な部品である。分離部１０４は、第２状態の試料２１を入口１２１に流すとともに、入口１２２にシース液を流す。このとき、分離部１０４は、ポンプ１０４ａを駆動することにより、陽圧を入口１２１、１２２に加える。これにより、マイクロ流路１１０を流れる試料２１の速度が決まり、試料２１が第１試料２２と第２試料２３とに分離される。
マイクロ流路１１０は、交換可能なチップ１００に形成されている。これにより、マイクロ流路１１０を試料２１の分離ごとに洗浄するといった煩雑な作業を行うことなく、チップ１００を交換するだけで異なる試料２１の分離を行うことができる。また、分離部１０４は、試料２１をマイクロ流路１１０に流すことにより、試料２１を第１試料２２と第２試料２３とに分離する。これにより、試料２１を分離するための構成を小型化できる。
図４（ｂ）を参照して説明したように、チップ１００の出口１３１、１３２は、それぞれ第１流路１４１と第２流路１４２に繋がっている。測定部１０５は、第１流路１４１に設けられた圧力検知部１５１と、第２流路１４２に設けられた圧力検知部１５２と、流速を算出する演算部１５３と、を備える。測定部１０５は、圧力検知部１５１、１５２に圧力を検出させ、圧力検知部１５１、１５２の検出信号に基づいて演算部１５３に流速を算出させる。これにより、測定部１０５は、第１情報と第２情報とを取得する。
制御部１０１は、測定部１０５において測定された第１情報と第２情報とに基づいて、分離部１０４における試料２１の分離の成否を判定する。そして、制御部１０１は、試料２１の判定結果を表示入力部１０３に表示させる。
図１３（ａ）、（ｂ）は、粒子分離装置１１の表示入力部１０３に表示される判定結果を含む画面を示す模式図である。
制御部１０１は、試料２１の分離が正しく行われたと判定すると、図１３（ａ）に示すように、分離工程において試料２１の分離が正しく行われた旨を含む画面を表示入力部１０３に表示させる。他方、制御部１０１は、試料２１の分離が正しく行われなかったと判定すると、図１３（ｂ）に示すように、分離工程において試料２１の分離が正しく行われなかった旨を含む画面を表示入力部１０３に表示させる。
これにより、オペレータは、試料２１の分離が適正に行われたか否かを視覚的に把握できる。また、オペレータは、分離が適正に行われていないことを把握した場合、不適正な分離で得られた第１試料２２が後段の装置に供されることを防止できる。
図１２に戻り、出口１３１から出て第１流路１４１を通った第１試料２２は、容器Ｔ２に収容される。出口１３２出て第２流路１４２を通った第２試料２３は、容器Ｔ３に収容される。実施形態の第２試料２３は、後段の処理に用いられないため廃棄される。こうして、第３状態の第１試料２２が取得され、粒子分離装置１１の処理が終了する。
図１４は、染色濃縮装置１２の構成を示す模式図である。染色濃縮装置１２は、制御部２０１と、記憶部２０２と、表示入力部２０３と、染色部２０４と、濃縮部２０５と、を備える。
制御部２０１は、ＣＰＵにより構成される。制御部２０１は、記憶部２０２に記憶されたプログラムに基づいて各種の処理を行う。制御部２０１は、染色濃縮装置１２内の各部に接続されており、各部からの信号を受信して各部を制御する。記憶部２０２は、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ハードディスク等により構成される。表示入力部２０３は、タッチパネル式のディスプレイにより構成される。
染色部２０４は、加温部２０４ａなどを備える。染色部２０４は、図８を参照して説明したように、第３状態の第１試料２２に対して染色処理を行って、第４状態の第１試料２２を取得する。染色部２０４で取得された第４状態の第１試料２２は、濃縮部２０５に移送される。濃縮部２０５は、遠心分離器２０５ａと分注部２０５ｂを備える。濃縮部２０５は、第４状態の第１試料２２を所定の容器に分注し、遠心分離器２０５ａにより第４状態の第１試料２２の遠心分離を行う。そして、濃縮部２０５は、遠心分離された容器内の上清を分注部２０５ｂにより除去する。これにより、図９を参照して説明したように、第４状態の第１試料２２が濃縮される。濃縮部２０５は、上清を除去した後の第１試料２２を、測定試料２４として容器Ｔ４に移送する。こうして、第５状態の測定試料２４が取得され、染色濃縮装置１２の処理が終了する。
図１５は、フローサイトメーター１３の構成を示す模式図である。フローサイトメーター１３は、制御部３０１と、記憶部２０２と、表示入力部３０３と、測定部３０４と、を備える。この他、フローサイトメーター１３は、容器Ｔ４内の測定試料２４を吸引するための吸引管や、吸引した測定試料２４をフローセル３１０に移送するための流路と、フローセル３１０から排出された測定試料２４を回収するための流路とを含む。
制御部３０１は、ＣＰＵにより構成される。制御部３０１は、記憶部３０２に記憶されたプログラムに基づいて各種の処理を行う。制御部３０１は、フローサイトメーター１３内の各部に接続されており、各部からの信号を受信して各部を制御する。記憶部３０２は、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ハードディスク等により構成される。表示入力部３０３は、タッチパネル式のディスプレイにより構成される。
測定部３０４は、フローセル３１０と、光源３２１〜３２４と、集光レンズ３３１〜３３４と、ダイクロイックミラー３４１〜３４３と、集光レンズ３５１と、光学ユニット３５２と、集光レンズ３５３と、撮像部３５４と、を備える。測定部３０４は、蛍光標識された複数種類の標的部位を含む測定試料２４に光を照射し、波長の異なる複数種類の蛍光を検出する。図１５の測定部３０４には、互いに直交するＸＹＺ軸が示されている。
フローセル３１０の流路３１１には、測定試料２４がＺ軸正方向に流される。光源３２１〜３２４は、フローセル３１０を流れる測定試料２４に光を照射する。光源３２１〜３２４は、半導体レーザ光源により構成される。光源３２１〜３２４から出射される光は、それぞれ、波長λ１１〜λ１４のレーザ光である。集光レンズ３３１〜３３４は、それぞれ、光源３２１〜３２４から出射された光を集光する。ダイクロイックミラー３４１は、波長λ１１の光を透過させ、波長λ１２の光を反射する。ダイクロイックミラー３４２は、波長λ１１、λ１２の光を透過させ、波長λ１３の光を反射する。ダイクロイックミラー３４３は、波長λ１１〜λ１３の光を反射させ、波長λ１４の光を透過する。こうして、波長λ１１〜λ１４の光が、フローセル３１０の流路３１１を流れる測定試料２４に対して、Ｙ軸正方向に照射される。
ここで、核と２つの遺伝子をそれぞれ標識する蛍光色素は、波長λ１１の励起光が照射されることにより波長λ２１の蛍光を生じる蛍光色素、波長λ１２の励起光が照射されることにより波長λ２２の蛍光を生じる蛍光色素、波長λ１３の励起光が照射されることにより波長λ２３の蛍光を生じる蛍光色素、の中から選択される。波長λ２１〜λ２３の蛍光がそれぞれ撮像されることにより、標的部位である核と２つの遺伝子に関する蛍光画像を取得できる。
フローセル３１０を流れる測定試料２４に波長λ１１〜λ１４の光が照射されると、ＣＴＣの標的部位を標識している蛍光色素から蛍光が生じる。また、フローセル３１０を流れる測定試料２４に波長λ１４の光が照射されると、この光は細胞を透過する。細胞を透過した波長λ１４の光は、明視野画像の生成に用いられる。
集光レンズ３５１は、測定試料２４から生じた波長λ２１〜λ２３の蛍光と、測定試料２４を透過した波長λ１４の光とを集光する。光学ユニット３５２は、４枚のダイクロイックミラーが組み合わせられた構成を有する。光学ユニット３５２の４枚のダイクロイックミラーは、波長λ２１〜λ２３の蛍光と波長λ１４の光とを、互いに僅かに異なる角度で反射し、撮像部３５４の受光面上において分離させる。集光レンズ３５３は、波長λ２１〜λ２３の蛍光と波長λ１４の光とを集光する。
撮像部３５４は、ＴＤＩ（Time Delay Integration）カメラにより構成される。撮像部３５４は、波長λ２１〜λ２３の蛍光と波長λ１４の光とを撮像して、波長λ２１〜λ２３の蛍光にそれぞれ対応した蛍光画像と、波長λ１４の光に対応した明視野画像とを生成する。制御部３０１は、撮像部３５４により生成された蛍光画像および明視野画像を記憶部３０２に記憶させる。
ここで、撮像部３５４は、ＴＤＩカメラにより構成されるため、撮像部３５４の受光面で受光した蛍光を積算して蛍光画像および明視野画像を生成する。これにより、細胞の蛍光画像および明視野画像の品質を高めることができる。
制御部３０１は、記憶部３０２に記憶された蛍光画像に基づいて、図１０を参照して説明したように陽性判定を行って、ＣＴＣを検出する。具体的には、制御部３０１は、Ｈｅｒ２遺伝子を標識する蛍光色素から生じた蛍光画像と、ＣＥＰ１７を標識する蛍光色素から生じた蛍光画像において、輝点を抽出する。制御部３０１は、細胞ごとに、Ｈｅｒ２遺伝子に基づく輝点数をＣＥＰ１７に基づく輝点数で除算し、算出した値が１より大きい場合に、この細胞においてＨｅｒ２遺伝子が増幅していると判定する。そして、制御部３０１は、Ｈｅｒ２遺伝子が増幅している陽性細胞をＣＴＣとして検出する。そして、制御部３０１は、検出したＣＴＣの数や、撮像部３５４により撮像した全細胞におけるＣＴＣの割合などを取得する。
なお、実施形態のフローサイトメーター１３は、撮像画像に基づいて細胞の検出を行う、いわゆるイメージングフローサイトメーターであるが、これに限らず、細胞から生じた光を光検出器で検出し、光検出器の検出信号に基づいて細胞を検出するフローサイトメーターでもよい。
１１ 粒子分離装置
１３ フローサイトメーター
２１ 試料
２２ 第１試料
２３ 第２試料
１００ チップ
１０１ 制御部（判定部）
１０３ 表示入力部（表示部）
１０４ 分離部
１０４ａ ポンプ
１０５ 測定部
１１０ マイクロ流路（流路）
１１１ 曲線部
１４１ 第１流路
１４２ 第２流路
１５１、１５２ 圧力検知部（検知部）

Claims (29)

  1. 第１粒子および第２粒子を含む試料を流路に流し、前記試料に含まれる粒子に作用する力の大きさの違いに基づいて、前記試料を、前記第１粒子を含む第１試料と、前記第２粒子を含む第２試料と、に分離する分離工程と、
    前記第１試料の量に関する第１情報と、前記第２試料の量に関する第２情報とを測定する測定工程と、
    前記第１情報と前記第２情報とに基づいて、前記分離工程の成否を判定する判定工程と、を含む、分離成否判定方法。
  2. 前記分離工程において、前記試料を、前記試料よりも前記第１粒子の存在比率が大きい前記第１試料と、前記試料よりも前記第１粒子の存在比率が小さい前記第２試料と、に分離する、請求項１に記載の分離成否判定方法。
  3. 前記試料に含まれる前記粒子ごとに作用する力の大きさの違いは、前記粒子の特性の違いにより生じる、請求項１または２に記載の分離成否判定方法。
  4. 前記粒子の特性の違いは、大きさの違い、重量の違い、比重の違い、の少なくとも１つである、請求項３に記載の分離成否判定方法。
  5. 前記分離工程において、前記試料をマイクロ流路に流すことにより、前記試料を前記第１試料と前記第２試料とに分離する、請求項１ないし４の何れか一項に記載の分離成否判定方法。
  6. 前記分離工程において、曲線部を有する前記流路に前記試料を流すことにより、前記試料を前記第１試料と前記第２試料とに分離する、請求項１ないし５の何れか一項に記載の分離成否判定方法。
  7. 前記分離工程において、前記流路内で生じる速度分布に基づいて、前記試料を前記第１試料と前記第２試料とに分離する、請求項１ないし６の何れか一項に記載の分離成否判定方法。
  8. 前記分離工程において、前記流路に検体およびシース液を含む前記試料を流し、前記第１試料および前記第２試料は、前記検体および前記シース液を含む、請求項１ないし７の何れか一項に記載の分離成否判定方法。
  9. 前記測定工程は、前記分離工程の後に行われる、請求項１ないし８の何れか一項に記載の分離成否判定方法。
  10. 前記測定工程において、前記第１試料が流れる第１流路および前記第２試料が流れる第２流路にそれぞれ設置された検知部の検知信号に基づいて、前記第１情報および前記第２情報を測定する、請求項１ないし９の何れか一項に記載の分離成否判定方法。
  11. 前記第１情報は、前記第１試料の重量または体積に関する情報であり、
    前記第２情報は、前記第２試料の重量または体積に関する情報である、請求項１ないし１０の何れか一項に記載の分離成否判定方法。
  12. 前記第１情報および前記第２情報は、重量または体積を導くことができる情報である、請求項１ないし１１の何れか一項に記載の分離成否判定方法。
  13. 前記第１情報および前記第２情報は、圧力または流速に関する情報である、請求項１ないし１２の何れか一項に記載の分離成否判定方法。
  14. 前記判定工程において、前記第１情報および前記第２情報から算出される比率に基づいて、前記分離工程の成否を判定する、請求項１ないし１３の何れか一項に記載の分離成否判定方法。
  15. 前記比率は、前記第１情報に対する前記第１情報および前記第２情報の和の比率、前記第２情報に対する前記第１情報および前記第２情報の和の比率、前記第１情報および前記第２情報の和に対する前記第１情報の比率、前記第１情報および前記第２情報の和に対する前記第２情報の比率、前記第１情報に対する前記第２情報の比率、または、前記第２情報に対する前記第１情報の比率である、請求項１４に記載の分離成否判定方法。
  16. 前記判定工程において、前記比率と所定の閾値とを比較して、前記分離工程の成否を判定する、請求項１４または１５に記載の分離成否判定方法。
  17. 前記判定工程において、前記比率が所定の閾値より大きいか、または、前記比率が所定の閾値より小さいか、に基づいて前記分離工程の成否を判定する、請求項１４ないし１６の何れか一項に記載の分離成否判定方法。
  18. 前記判定工程において、前記比率が所定の範囲内であるかに基づいて、前記分離工程の成否を判定する、請求項１４ないし１６の何れか一項に記載の分離成否判定方法。
  19. 前記判定工程において、前記第１情報および前記第２情報の和に基づいて、前記分離工程の成否を判定する、請求項１ないし１８の何れか一項に記載の分離成否判定方法。
  20. 前記判定工程において前記分離工程が正しく行われなかった場合、前記分離工程を再度行う、請求項１ないし１９の何れか一項に記載の分離成否判定方法。
  21. 前記試料は、血液を含む、請求項１ないし２０の何れか一項に記載の分離成否判定方法。
  22. 前記第１粒子は、血中循環腫瘍細胞である、請求項１ないし２１の何れか一項に記載の分離成否判定方法。
  23. 前記第２粒子は、赤血球、白血球および血小板より選択される少なくとも１種類の血球を含む、請求項１ないし２２の何れか一項に記載の分離成否判定方法。
  24. 請求項１ないし２３の何れか一項に記載の分離成否判定方法において前記分離工程が正しく行われたと判定された前記第１試料を、フローサイトメーターまたは顕微鏡により測定し、前記試料に含まれる前記第１粒子を検出する、粒子検出方法。
  25. 試料を流路に流し、前記試料に含まれる粒子に作用する力の大きさの違いに基づいて、前記試料を第１試料と第２試料とに分離する分離部と、
    前記第１試料の量に関する第１情報と、前記第２試料の量に関する第２情報とを測定する測定部と、
    前記第１情報と前記第２情報とに基づいて、前記分離部における前記試料の分離の成否を判定する判定部と、を備える、粒子分離装置。
  26. 前記分離部は、前記試料を前記流路に流すポンプを備える、請求項２５に記載の粒子分離装置。
  27. 前記流路は、交換可能なチップに形成されている、請求項２５または２６に記載の粒子分離装置。
  28. 前記流路は、曲線部を備える、請求項２５ないし２７の何れか一項に記載の粒子分離装置。
  29. 前記判定部による判定結果を表示する表示部を備える、請求項２５ないし２８の何れか一項に記載の粒子分離装置。
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