JP2020022449A - γδ型Ｔ細胞への遺伝子導入方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】γδ型Ｔ細胞を高純度で大量に調製し、得られたγδ型Ｔ細胞に、TCRまたはCARをコードする外来遺伝子を効率よく導入して、機能的なTCRまたはCARを発現させたγδ型Ｔ細胞集団を製造する方法の提供。【解決手段】（工程１）γδ型Ｔ細胞を、特定の薬学的に許容される塩からなる群より選ばれる１つ以上の化合物の存在下で培養する工程、（工程２）工程１で培養したγδ型Ｔ細胞を、IL-7およびIL-15の存在下で培養する工程、および、（工程３）工程２で培養したγδ型Ｔ細胞に遺伝子を導入する工程、を含む、導入遺伝子を発現するγδ型Ｔ細胞集団を製造する方法を提供する。【選択図】なし
Description
本発明は、外来遺伝子が導入されたγδ型Ｔ細胞を、高い効率で高純度に製造する方法に関する。
近年、がんに対する治療方法として、がん患者に対して、Ｔ細胞受容体（T cell receptor：TCR）またはキメラ抗原受容体（chimeric antigen receptor：CAR）をコードする外来遺伝子を導入し、新たにがん抗原特異性を付与したＴ細胞を移入するT細胞輸注療法が注目されている。実際に、がん抗原であるMAGE-A4を認識するTCR遺伝子を導入し、このTCRを発現させたTCR遺伝子改変T細胞を、食道がん患者に投与する臨床試験が行われている（非特許文献１）。また、リガンド結合ドメインに、CD19に結合する一本鎖抗体（single chain variable fragment：scFv）を組み込んだCAR遺伝子を導入し、このCAR遺伝子を発現させたCAR遺伝子改変T細胞を、再発性・難治性急性リンパ性白血病患者に投与する臨床試験が行われている（非特許文献２）。
外来遺伝子を導入する標的となる細胞として、一般的にαβ型TCRを有するＴ細胞（αβ型Ｔ細胞）が使用されてきた。その理由は次の通りである。すなわち、外来遺伝子を導入するためには主にウイルスベクターが使用されるが、その際に、通常では標的細胞を増殖刺激することが必要である。そして、標的細胞としてαβ型Ｔ細胞を使用して遺伝子導入する場合には、抗CD3抗体および抗CD28抗体を用いることにより、容易に標的細胞の増殖刺激を行うことができるためである。
γδ型TCRを有するＴ細胞（γδ型Ｔ細胞）は、従来からウイルス感染細胞やがん細胞を傷害することが示されており、抗原特異性を付与したγδ型Ｔ細胞を患者に輸注する治療法は、αβ型Ｔ細胞を使用する場合よりも効果が高いことが期待されており、実際にγδ型T細胞輸注療法が試みられている（非特許文献３）。しかしながら、γδ型T細胞の細胞機能などの細胞学的特性の解析は十分ではない。その理由として、γδ型Ｔ細胞の存在量が末梢血Ｔ細胞の約5％と少量であり（非特許文献４）、細胞の解析に必要な細胞数を確保することが困難であることが挙げられている。γδ型Ｔ細胞は、αβ型Ｔ細胞とは異なり、抗CD3抗体および抗CD28抗体では十分に増殖させることができない。そのため、骨吸収抑制剤として使用されるビスホスホン酸誘導体であるゾレドロン酸（zoledronate）およびインターロイキン-２（IL-2）を用いて、γδ型Ｔ細胞を増殖させることが試みられてきた（非特許文献５および６）。しかしながら、ゾレドロン酸およびIL-2を用いた場合であっても、拡大培養されて得られるγδ型Ｔ細胞の純度が低いことが問題点であった。
ヒト末梢血から得られた単核球を、ビスホスホン酸エステル誘導体であるテトラキスピバロイルオキシメチル ２−（チアゾール−２−イルアミノ）エチリデン−１，１−ビスホスホネートの存在下で培養し、そこへさらにIL-2を添加することにより、γδ型Ｔ細胞を高純度で増殖させる方法が報告されている（特許文献１および非特許文献７）。一方で、γδ型Ｔ細胞輸注療法を効果的に行うためには、高純度のγδ型Ｔ細胞を大量に調製し、同時に、得られたγδ型Ｔ細胞に、TCRまたはCARをコードする外来遺伝子を効率よく導入することが望まれる。
Kageyama S, et al. Adoptive transfer of MAGE-A4 T-cell receptor gene-transduced lymphocytes in patients with recurrent esophageal cancer. Clin Cancer Res. 2015 May 15;21(10):2268-2277.
Maude SL, et al. Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia. N Engl J Med. 2014 Oct 16;371(16):1507-1517.
Kobayashi H, et al. Safety profile and anti-tumor effects of adoptive immunotherapy using gamma-delta T cells against advanced renal cell carcinoma: a pilot study. Cancer Immunol Immunother. 2007 Apr;56(4):469-476.
Carding SR and Egan PJ. Gammadelta T cells: functional plasticity and heterogeneity. Nat Rev Immunol. 2002 May;2(5):336-345.
Nicol AJ, et al. Clinical evaluation of autologous gamma delta T cell-based immunotherapy for metastatic solid tumours. Br J Cancer. 2011 Sep 6;105(6):778-786.
Kobayashi H, et al. Phase I/II study of adoptive transfer of γδ T cells in combination with zoledronic acid and IL-2 to patients with advanced renal cell carcinoma. Cancer Immunol Immunother. 2011 Aug;60(8):1075-1084.
Tanaka Y, et al. Expansion of human γδ T cells for adoptive immunotherapy using a bisphosphonate prodrug. Cancer Sci. 2018 Mar;109(3):587-599.
本発明の目的は、γδ型Ｔ細胞を高純度で大量に調製し、得られたγδ型Ｔ細胞に、TCRまたはCARをコードする外来遺伝子を効率よく導入して、機能的なTCRまたはCARを発現させたγδ型Ｔ細胞集団を製造する方法を提供することにある。
本発明の目的は、以下の発明により達成される。
（１）導入遺伝子を発現するγδ型Ｔ細胞集団を製造する方法であって、
（工程１）γδ型Ｔ細胞を、２−（チアゾール−２−イルアミノ）エチリデン−１，１−ビスホスホネート、２−（３−ブロモピリジン−２−イルアミノ）エチリデン−１，１−ビスホスホネート、２−（５−フルオロピリジン−２−イルアミノ）エチリデン−１，１−ビスホスホネート、２−（ピリミジン−２−イルアミノ）エチリデン−１，１−ビスホスホネート、２−（７−アザインドール−１−イル）エチリデン−１，１−ビスホスホネート、２−（５−メチルチアゾール−２−イルアミノ）エチリデン−１，１−ビスホスホネート、２−（４−フェニルチアゾール−２−イルアミノ）エチリデン−１，１−ビスホスホネートおよび２−（ピリミジン−４−イルアミノ）エチリデン−１，１−ビスホスホネートのテトラキスピバロイルオキシメチルエステル誘導体ならびにそれらの薬学的に許容される塩からなる群より選ばれる１つ以上の化合物の存在下で培養する工程、
（工程２）工程１で培養したγδ型Ｔ細胞を、IL-7およびIL-15の存在下で培養する工程、および、
（工程３）工程２で培養したγδ型Ｔ細胞に遺伝子を導入する工程、
を含む、方法。
（２）導入遺伝子を発現するγδ型Ｔ細胞集団を製造する方法であって、
（工程１）γδ型Ｔ細胞を、テトラキスピバロイルオキシメチル ２−（チアゾール−２−イルアミノ）エチリデン−１，１−ビスホスホネートまたはその薬学的に許容される塩の存在下で培養する工程、
（工程２）工程１で培養したγδ型Ｔ細胞を、IL-7およびIL-15の存在下で培養する工程、および、
（工程３）工程２で培養したγδ型Ｔ細胞に遺伝子を導入する工程、
を含む、方法。
（３）工程１におけるテトラキスピバロイルオキシメチル ２−（チアゾール−２−イルアミノ）エチリデン−１，１−ビスホスホネートまたはその薬学的に許容される塩の濃度が0.01〜1μMである、（２）に記載の方法。
（４）前記γδ型Ｔ細胞が、哺乳動物に由来する、（１）または（２）に記載の方法。
（５）前記哺乳動物が、がん患者または非がん患者である、（４）に記載の方法。
（６）前記がんが、乳がん、肺がん、肝がん、口腔がん、上咽頭がん、頭頸部がん、胃がん、食道がん、大腸がん、皮膚がん、悪性黒色腫、腎がん、膵がん、胆管がん、脳腫瘍、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、膀胱がん、滑膜肉腫、白血病、悪性リンパ腫および多発性骨髄腫からなる群より選ばれる、（５）に記載の方法。
（７）工程３における遺伝子を導入する工程が、DNAベクターまたはRNAベクターを用いることを特徴とする、（１）または（２）に記載の方法。
（８）工程３における遺伝子を導入する工程が、プラスミドベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスおよびレトロウイルスベクターからなる群より選ばれるベクターを用いることを特徴とする、（１）または（２）に記載の方法。
（９）工程３における遺伝子を導入する工程が、レトロウイルスベクターを用いることを特徴とする、（１）または（２）に記載の方法。
（１０）前記遺伝子が、Ｔ細胞受容体（TCR）またはキメラ抗原受容体（CAR）をコードする遺伝子である、（１）または（２）に記載の方法。
（１１）前記Ｔ細胞受容体（TCR）が、NY-ESO-1p157-165／HLA-A2複合体特異的TCR、HTLV-1p40Taxp11-19／HLA-A2複合体特異的TCR、HTLV-1p40Taxp301-309／HLA-A24複合体特異的TCRおよびMAGE-A4p143-151／HLA-A24複合体特異的TCRからなる群より選ばれる、（（１０）に記載の方法。
（１２）前記キメラ抗原受容体（CAR）が、MAGE-A4p230-239／HLA-A2複合体特異的CAR、CEA特異的CAR、GD2特異的CARおよびCD19特異的CARからなる群より選ばれる、（１０）に記載の方法。
（１３）（１）〜（１２）のいずれかに記載の方法により得られる遺伝子改変γδ型Ｔ細胞集団。
（１４）（１３）に記載の遺伝子改変γδ型Ｔ細胞集団と薬学的に許容される添加剤とを含有する医薬組成物。
（１５）自家的または同種的な移植によりがん治療対象を処置するための、（１４）に記載の医薬組成物。
（１６）下記の特徴を有する、遺伝子改変γδ型Ｔ細胞集団。
（ｉ）NY-ESO-1p157-165／HLA-A2複合体、HTLV-1p40Taxp11-19／HLA-A2複合体、HTLV-1p40Taxp301-309／HLA-A24複合体またはMAGE-A4p143-151／HLA-A24複合体を特異的に認識するTCRを発現する、
（ｉｉ）CD3およびNKG2Dが陽性である、
（ｉｉｉ）IFN-γおよびTNFαを含むサイトカインおよびケモカインを産生する、ならびに
（ｉｖ）細胞傷害活性を有する。
（１７）下記の特徴を有する、遺伝子改変γδ型Ｔ細胞集団。
（ｉ）MAGE-A4p230-239／HLA-A2複合体、CEA、GD2またはCD19を特異的に認識するCARを発現する、
（ｉｉ）CD3およびNKG2Dが陽性である、
（ｉｉｉ）IFN-γおよびTNFαを含むサイトカインおよびケモカインを産生する、ならびに
（ｉｖ）細胞傷害活性を有する。
（１８）前記遺伝子改変γδ型Ｔ細胞集団が、DNAベクターまたはRNAベクターを用いて遺伝子が導入されたγδ型Ｔ細胞集団であることを特徴とする、（１６）または（１７）に記載の遺伝子改変γδ型Ｔ細胞集団。
（１９）前記遺伝子改変γδ型Ｔ細胞集団が、プラスミドベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスおよびレトロウイルスベクターからなる群より選ばれるベクターを用いて遺伝子が導入されたγδ型Ｔ細胞集団であることを特徴とする、（１６）または（１７）に記載の遺伝子改変γδ型Ｔ細胞集団。
（２０）前記遺伝子改変γδ型Ｔ細胞集団が、レトロウイルスベクターを用いて遺伝子が導入されたγδ型Ｔ細胞集団であることを特徴とする、（１６）または（１７）に記載の遺伝子改変γδ型Ｔ細胞集団。
（２１）前記遺伝子が、Ｔ細胞受容体（TCR）またはキメラ抗原受容体（CAR）をコードする遺伝子である、（１６）または（１７）に記載の遺伝子改変γδ型Ｔ細胞集団。
（２２）（１６）〜（２１）のいずれかに記載の遺伝子改変γδ型Ｔ細胞集団を含む医薬組成物。
（２３）（１６）〜（２１）のいずれかに記載の遺伝子改変γδ型Ｔ細胞集団を含む細胞製剤。
（２４）がん患者を治療するための、（１６）〜（２１）のいずれかに記載の遺伝子改変γδ型Ｔ細胞集団。
（２５）（１６）〜（２１）のいずれかに記載の遺伝子改変γδ型Ｔ細胞集団を含む抗がん剤。
（２６）（１６）〜（２１）のいずれかに記載の遺伝子改変γδ型Ｔ細胞集団を用いることを特徴とする、がん治療方法。
（２７）（１６）〜（２１）のいずれかに記載の遺伝子改変γδ型Ｔ細胞集団を含む感染症治療剤。
（２８）（１６）〜（２１）のいずれかに記載の遺伝子改変γδ型Ｔ細胞集団を用いることを特徴とする、感染症治療方法。
（１）導入遺伝子を発現するγδ型Ｔ細胞集団を製造する方法であって、
（工程１）γδ型Ｔ細胞を、２−（チアゾール−２−イルアミノ）エチリデン−１，１−ビスホスホネート、２−（３−ブロモピリジン−２−イルアミノ）エチリデン−１，１−ビスホスホネート、２−（５−フルオロピリジン−２−イルアミノ）エチリデン−１，１−ビスホスホネート、２−（ピリミジン−２−イルアミノ）エチリデン−１，１−ビスホスホネート、２−（７−アザインドール−１−イル）エチリデン−１，１−ビスホスホネート、２−（５−メチルチアゾール−２−イルアミノ）エチリデン−１，１−ビスホスホネート、２−（４−フェニルチアゾール−２−イルアミノ）エチリデン−１，１−ビスホスホネートおよび２−（ピリミジン−４−イルアミノ）エチリデン−１，１−ビスホスホネートのテトラキスピバロイルオキシメチルエステル誘導体ならびにそれらの薬学的に許容される塩からなる群より選ばれる１つ以上の化合物の存在下で培養する工程、
（工程２）工程１で培養したγδ型Ｔ細胞を、IL-7およびIL-15の存在下で培養する工程、および、
（工程３）工程２で培養したγδ型Ｔ細胞に遺伝子を導入する工程、
を含む、方法。
（２）導入遺伝子を発現するγδ型Ｔ細胞集団を製造する方法であって、
（工程１）γδ型Ｔ細胞を、テトラキスピバロイルオキシメチル ２−（チアゾール−２−イルアミノ）エチリデン−１，１−ビスホスホネートまたはその薬学的に許容される塩の存在下で培養する工程、
（工程２）工程１で培養したγδ型Ｔ細胞を、IL-7およびIL-15の存在下で培養する工程、および、
（工程３）工程２で培養したγδ型Ｔ細胞に遺伝子を導入する工程、
を含む、方法。
（３）工程１におけるテトラキスピバロイルオキシメチル ２−（チアゾール−２−イルアミノ）エチリデン−１，１−ビスホスホネートまたはその薬学的に許容される塩の濃度が0.01〜1μMである、（２）に記載の方法。
（４）前記γδ型Ｔ細胞が、哺乳動物に由来する、（１）または（２）に記載の方法。
（５）前記哺乳動物が、がん患者または非がん患者である、（４）に記載の方法。
（６）前記がんが、乳がん、肺がん、肝がん、口腔がん、上咽頭がん、頭頸部がん、胃がん、食道がん、大腸がん、皮膚がん、悪性黒色腫、腎がん、膵がん、胆管がん、脳腫瘍、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、膀胱がん、滑膜肉腫、白血病、悪性リンパ腫および多発性骨髄腫からなる群より選ばれる、（５）に記載の方法。
（７）工程３における遺伝子を導入する工程が、DNAベクターまたはRNAベクターを用いることを特徴とする、（１）または（２）に記載の方法。
（８）工程３における遺伝子を導入する工程が、プラスミドベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスおよびレトロウイルスベクターからなる群より選ばれるベクターを用いることを特徴とする、（１）または（２）に記載の方法。
（９）工程３における遺伝子を導入する工程が、レトロウイルスベクターを用いることを特徴とする、（１）または（２）に記載の方法。
（１０）前記遺伝子が、Ｔ細胞受容体（TCR）またはキメラ抗原受容体（CAR）をコードする遺伝子である、（１）または（２）に記載の方法。
（１１）前記Ｔ細胞受容体（TCR）が、NY-ESO-1p157-165／HLA-A2複合体特異的TCR、HTLV-1p40Taxp11-19／HLA-A2複合体特異的TCR、HTLV-1p40Taxp301-309／HLA-A24複合体特異的TCRおよびMAGE-A4p143-151／HLA-A24複合体特異的TCRからなる群より選ばれる、（（１０）に記載の方法。
（１２）前記キメラ抗原受容体（CAR）が、MAGE-A4p230-239／HLA-A2複合体特異的CAR、CEA特異的CAR、GD2特異的CARおよびCD19特異的CARからなる群より選ばれる、（１０）に記載の方法。
（１３）（１）〜（１２）のいずれかに記載の方法により得られる遺伝子改変γδ型Ｔ細胞集団。
（１４）（１３）に記載の遺伝子改変γδ型Ｔ細胞集団と薬学的に許容される添加剤とを含有する医薬組成物。
（１５）自家的または同種的な移植によりがん治療対象を処置するための、（１４）に記載の医薬組成物。
（１６）下記の特徴を有する、遺伝子改変γδ型Ｔ細胞集団。
（ｉ）NY-ESO-1p157-165／HLA-A2複合体、HTLV-1p40Taxp11-19／HLA-A2複合体、HTLV-1p40Taxp301-309／HLA-A24複合体またはMAGE-A4p143-151／HLA-A24複合体を特異的に認識するTCRを発現する、
（ｉｉ）CD3およびNKG2Dが陽性である、
（ｉｉｉ）IFN-γおよびTNFαを含むサイトカインおよびケモカインを産生する、ならびに
（ｉｖ）細胞傷害活性を有する。
（１７）下記の特徴を有する、遺伝子改変γδ型Ｔ細胞集団。
（ｉ）MAGE-A4p230-239／HLA-A2複合体、CEA、GD2またはCD19を特異的に認識するCARを発現する、
（ｉｉ）CD3およびNKG2Dが陽性である、
（ｉｉｉ）IFN-γおよびTNFαを含むサイトカインおよびケモカインを産生する、ならびに
（ｉｖ）細胞傷害活性を有する。
（１８）前記遺伝子改変γδ型Ｔ細胞集団が、DNAベクターまたはRNAベクターを用いて遺伝子が導入されたγδ型Ｔ細胞集団であることを特徴とする、（１６）または（１７）に記載の遺伝子改変γδ型Ｔ細胞集団。
（１９）前記遺伝子改変γδ型Ｔ細胞集団が、プラスミドベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスおよびレトロウイルスベクターからなる群より選ばれるベクターを用いて遺伝子が導入されたγδ型Ｔ細胞集団であることを特徴とする、（１６）または（１７）に記載の遺伝子改変γδ型Ｔ細胞集団。
（２０）前記遺伝子改変γδ型Ｔ細胞集団が、レトロウイルスベクターを用いて遺伝子が導入されたγδ型Ｔ細胞集団であることを特徴とする、（１６）または（１７）に記載の遺伝子改変γδ型Ｔ細胞集団。
（２１）前記遺伝子が、Ｔ細胞受容体（TCR）またはキメラ抗原受容体（CAR）をコードする遺伝子である、（１６）または（１７）に記載の遺伝子改変γδ型Ｔ細胞集団。
（２２）（１６）〜（２１）のいずれかに記載の遺伝子改変γδ型Ｔ細胞集団を含む医薬組成物。
（２３）（１６）〜（２１）のいずれかに記載の遺伝子改変γδ型Ｔ細胞集団を含む細胞製剤。
（２４）がん患者を治療するための、（１６）〜（２１）のいずれかに記載の遺伝子改変γδ型Ｔ細胞集団。
（２５）（１６）〜（２１）のいずれかに記載の遺伝子改変γδ型Ｔ細胞集団を含む抗がん剤。
（２６）（１６）〜（２１）のいずれかに記載の遺伝子改変γδ型Ｔ細胞集団を用いることを特徴とする、がん治療方法。
（２７）（１６）〜（２１）のいずれかに記載の遺伝子改変γδ型Ｔ細胞集団を含む感染症治療剤。
（２８）（１６）〜（２１）のいずれかに記載の遺伝子改変γδ型Ｔ細胞集団を用いることを特徴とする、感染症治療方法。
本発明によれば、末梢血から得られた単核球をビスホスホン酸エステル誘導体で刺激後、IL-7およびIL-15の存在下で培養することにより、IL-2の存在下で培養する従来法に比較して、多数の高純度のγδ型Ｔ細胞を製造することが可能である。さらに、ビスホスホン酸エステル誘導体の刺激により増殖するγδ型Ｔ細胞に対し、例えばレトロウイルスベクターを用いることにより、効率よく外来遺伝子を導入することができる。外来遺伝子としてTCRおよびCARを導入した場合、TCRおよびCARが機能的に発現したγδ型Ｔ細胞を得ることができる。
本発明により、採血量が少量であっても、採取した血液から多数のγδ型Ｔ細胞を取得することが可能となり、採血を必要とする被験者の負担が軽減される。さらに、遺伝子改変により抗原特異性を有するγδ型Ｔ細胞を、短期の培養期間で十分量調製することができる。得られた遺伝子改変γδ型Ｔ細胞は、強い抗腫瘍効果を示し、また凍結融解による機能低下を示さないため、凍結保存が可能である。このため、有効な遺伝子改変γδ型Ｔ細胞輸注療法の実施が容易となる。
〔ビスホスホン酸エステル誘導体〕
ビスホスホン酸は二リン酸の類似体であり、二リン酸骨格Ｐ−Ｏ−Ｐの中のＯ（酸素原子）がＣ（炭素原子）で置換された化合物（Ｐ−Ｃ−Ｐ）である。窒素含有ビスホスホン酸は、ビスホスホン酸分子中にＮ（窒素原子）を有する化合物である。本発明で用いられるビスホスホン酸エステル誘導体は、表１に記載される窒素含有ビスホスホン酸のピバロイルオキシメチル（pivaloyloxymethyl、POM）エステル、または、それらの薬学的に許容される塩、水和物もしくは溶媒和物である。これらの化合物は、特許文献１（WO2016/098904）に記載されており、その記載に基づいて製造することができるが、その他に、当業者に周知の合成方法を使用して合成することもできる。
ビスホスホン酸は二リン酸の類似体であり、二リン酸骨格Ｐ−Ｏ−Ｐの中のＯ（酸素原子）がＣ（炭素原子）で置換された化合物（Ｐ−Ｃ−Ｐ）である。窒素含有ビスホスホン酸は、ビスホスホン酸分子中にＮ（窒素原子）を有する化合物である。本発明で用いられるビスホスホン酸エステル誘導体は、表１に記載される窒素含有ビスホスホン酸のピバロイルオキシメチル（pivaloyloxymethyl、POM）エステル、または、それらの薬学的に許容される塩、水和物もしくは溶媒和物である。これらの化合物は、特許文献１（WO2016/098904）に記載されており、その記載に基づいて製造することができるが、その他に、当業者に周知の合成方法を使用して合成することもできる。
γδ型Ｔ細胞は、表１に記載された窒素含有ビスホスホン酸ピバロイルオキシメチルエステルのうち、１つ以上の化合物の存在下で培養することができるが、テトラキスピバロイルオキシメチル ２−（チアゾール−２−イルアミノ）エチリデン−１，１−ビスホスホネート（化合物７）またはその薬学的に許容される塩を用いることが好ましい。薬学的に許容される塩とは、薬理学的及び製剤学的に許容される一般的な塩であり、細胞の培養液に添加された場合であっても、細胞に毒性を示さない塩である。
骨吸収抑制剤として使用されるゾレドロン酸（zoledronic acid）などの窒素含有ビスホスホン酸は、細胞内でファルネシル二リン酸シンターゼ（farnesyl diphosphate synthase、FDPS）を阻害する（van Beek E, et al. Biochem Biophys Res Commun. 1999 Oct 14;264(1):108-111）。窒素含有ビスホスホン酸によるFDPSの阻害は、生合成経路におけるFDPSの上流の代謝物であるイソペンテニル二リン酸のレベルを上昇させ、その結果として、γδ型Ｔ細胞を刺激する（Wang H, J Immunol. 2011 Nov 15;187(10):5099-5113およびTanaka Y, Sci Rep. 2017 Jul 20;7(1):5987）。本明細書の表１に記載の化合物は、細胞に取り込まれると、細胞内のエステラーゼによりピバロイルオキシメチル基が加水分解を受けて脱離し、遊離酸となる。この遊離酸は、γδ型Ｔ細胞内においてFDPSを阻害し、その結果としてγδ型Ｔ細胞を刺激する（特許文献１、非特許文献７およびTanaka Y, Sci Rep. 2017 Jul 20;7(1):5987）。
窒素含有ビスホスホン酸は、遊離酸の状態では細胞内への透過性が低い。本明細書の表１に記載の化合物は、ピバロイルオキシメチル（POM）エステルであり、細胞への透過性が付与されている。表１に記載の化合物は、１分子当たり４個のPOM基で置換されていることが好ましいが、細胞内への透過性が維持される限り、窒素含有ビスホスホン酸１分子当たり１〜３個のPOM基であってもよい。さらに、細胞への透過性が維持され、かつ、細胞内のエステラーゼで加水分解される限り、他のエステルであってもよい。例えば、ｎ−ブチルオキシメチルエステル誘導体およびｎ−ヘプチルオキシメチルエステル誘導体が挙げられる。これらの窒素含有ビスホスホン酸エステル誘導体についても、１分子当たり１〜４個のエステル基を有すればよいが、４個のエステル基を有することが好ましい。
〔γδ型Ｔ細胞の培養〕
本発明で用いられるγδ型Ｔ細胞は、哺乳動物、特にがん患者または非がん患者の末梢血、臍帯血またはがん組織の生検組織から分離された単核球に由来する。γδ型Ｔ細胞は、好ましくは、当業者に周知である密度遠心分離法により全血から得ることができる。密度遠心分離法としては、フィコール（Ficoll）、リンホプレップ（Lymphoprep、登録商標）などのリンパ球分離溶液を用いる方法が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。さらに、FACS（fluorescence-activated cell sorting）法またはMACS（magnetic-activated cell sorting）法により細胞を分離してもよい。
本発明で用いられるγδ型Ｔ細胞は、哺乳動物、特にがん患者または非がん患者の末梢血、臍帯血またはがん組織の生検組織から分離された単核球に由来する。γδ型Ｔ細胞は、好ましくは、当業者に周知である密度遠心分離法により全血から得ることができる。密度遠心分離法としては、フィコール（Ficoll）、リンホプレップ（Lymphoprep、登録商標）などのリンパ球分離溶液を用いる方法が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。さらに、FACS（fluorescence-activated cell sorting）法またはMACS（magnetic-activated cell sorting）法により細胞を分離してもよい。
単核球を採取する対象となるがん患者のがん種としては、乳がん、肺がん、肝がん、口腔がん、上咽頭がん、頭頸部がん、胃がん、食道がん、大腸がん、皮膚がん、悪性黒色腫、腎がん、膵がん、脳腫瘍、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、膀胱がん、滑膜肉腫、脂肪肉腫、白血病、悪性リンパ腫および多発性骨髄腫が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
γδ型Ｔ細胞は、本明細書の表１に記載の窒素含有ビスホスホン酸POMエステル化合物、ならびにIL-7およびIL-15が存在する細胞培養液を用いて培養することにより、末梢血単核球、臍帯血単核球または組織由来単核球から増殖させることができる。IL-7およびIL-15は、それぞれの変異体またはフラグメントであって、それぞれの受容体に結合し、生物活性を発揮するものであれば、本発明の範囲に含まれる。細胞培養液としては、RPMI 1640培養液、Ysselの培養液などが挙げられるが、これらに限定されない。細胞培養液には、例えば、ウシ胎児血清、ヒトAB血清、自家血漿、ヒトアルブミン、血清代替品を、0.1〜20％（v/v）の量で添加することができる。前記窒素含有ビスホスホン酸POMエステルは、細胞培養液に0.01〜1μMの濃度で添加することができる。IL-7およびIL-15は、使用するロットの比活性に応じて細胞培養液に添加する濃度を変えることができるが、いずれのサイトカインとも、5〜100 ng/mLの濃度で添加することができる。
γδ型Ｔ細胞は、前記窒素含有ビスホスホン酸POMエステル存在下、5％CO2、37℃環境下で１〜７日間培養することにより刺激される。IL-7およびIL-15は、前記窒素含有ビスホスホン酸POMエステルと同時に培養液に添加してもよく、またはビスホスホン酸POMエステル添加後１〜５日に添加してもよい。
〔γδ型Ｔ細胞への遺伝子導入〕
末梢血または組織由来の単核球を、前記窒素含有ビスホスホン酸POMエステル、IL-7およびIL-15存在下で培養し、得られたγδ型Ｔ細胞には、当業者に周知の遺伝子導入法を用いて遺伝子を導入することができる。遺伝子導入は、γδ型Ｔ細胞の培養期間の任意の時点で行うことができるが、培養開始後翌日〜１４日で行うことが好ましい。γδ型Ｔ細胞に遺伝子を導入する方法としては、リポフェクション法、リン酸カルシウム共沈殿法、DEAE-デキストラン法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、プラスミドベクター法、ウイルスベクター法等を挙げることができる。ベクターとしては、DNAベクターまたはRNAベクターが用いられる。ウイルスベクターとしては、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスおよびレトロウイルスベクターが挙げられるが、レトロウイルスベクターが好ましい。
末梢血または組織由来の単核球を、前記窒素含有ビスホスホン酸POMエステル、IL-7およびIL-15存在下で培養し、得られたγδ型Ｔ細胞には、当業者に周知の遺伝子導入法を用いて遺伝子を導入することができる。遺伝子導入は、γδ型Ｔ細胞の培養期間の任意の時点で行うことができるが、培養開始後翌日〜１４日で行うことが好ましい。γδ型Ｔ細胞に遺伝子を導入する方法としては、リポフェクション法、リン酸カルシウム共沈殿法、DEAE-デキストラン法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、プラスミドベクター法、ウイルスベクター法等を挙げることができる。ベクターとしては、DNAベクターまたはRNAベクターが用いられる。ウイルスベクターとしては、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスおよびレトロウイルスベクターが挙げられるが、レトロウイルスベクターが好ましい。
ウイルスベクターを用いてγδ型Ｔ細胞に遺伝子導入する場合、ウイルス感染効率を向上させる機能性物質を使用することができる。例えば、フィブロネクチン、フィブロネクチンフラグメント、ポリペプチド等のウイルスベクターに結合する活性を有する機能性物質が挙げられる。特にレトロウイルスベクターの場合、ヘパリン結合部位を有するフィブロネクチンフラグメントであるレトロネクチン（登録商標）またはVecofusin-1（登録商標）を用いるのが好ましい。これらの機能性物質は、適切な固相（例えば、プレート、シャーレ、コニカルチューブ、マイクロチューブ等）又は担体（マイクロビーズ等）に固定化された状態で使用することができる。
γδ型Ｔ細胞に導入する遺伝子としては、NY-ESO-1特異的TCR、HTLV-1 Tax特異的TCR、MAGE-A4特異的TCR、MAGE-A4特異的CAR、CEA特異的CAR、GD2特異的CAR、CD19特異的CAR、等が挙げられるが、これらに限定されない。TCR発現用レトロウイルスベクター構造は、エンハンサー、プロモーターを含む両端のLTR（Long Terminal Repeat）の間に、それぞれの特異的TCRのα鎖遺伝子とβ鎖遺伝子が組み込まれた構造である。CAR発現用レトロウイルスベクター構造は、エンハンサー、プロモーターを含む両端のLTRの間に、リーダー配列に続いて、HLA-A2とMAGE-A4p230-239ペプチドとの複合体を特異的に認識する抗体の成分であるVHおよびVLが続き、その後にCL、CD28TMおよび細胞内ドメインが組み込まれた構造である。個々のTCRおよびCARを発現導入するためには、他の手段、例えばレンチウイルスベクターを用いて該当するTCRおよびCARを発現導入してもよい。
ベクターを用いて遺伝子をγδ型Ｔ細胞に導入した後、当該細胞の遺伝子発現は、フローサイトメトリー、RT-PCR、ノーザンブロッティング、ウエスタンブロッティング、ELISA、蛍光免疫染色等の、当業者に公知の方法により確認することができる。
TCR遺伝子またはCAR遺伝子を導入したγδ型Ｔ細胞は、対応するTCRまたはCARを細胞膜上に発現する。これらのTCRおよびCARが認識する特異的抗原が、それぞれTCRおよびCARに結合すると、遺伝子改変γδ型Ｔ細胞が活性化され、インターフェロン-γ（IFN-γ）や腫瘍壊死因子α（TNFα）などのサイトカイン産生や、CD107aなどの細胞傷害活性分子の発現が観察される。
上記のようにして得られた遺伝子改変γδ型Ｔ細胞は、該細胞が発現するTCRまたはCARに特異的に認識される抗原を発現する細胞に対して特異的な細胞傷害性を示す。このため、遺伝子改変γδ型Ｔ細胞集団は、前記抗原を発現する細胞が関与する疾患、例えば、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、原虫感染症、またはがん等の疾患の治療または予防のために、患者に投与することが可能である。患者への投与は、注射または輸注が好ましい。投与経路としては、静脈内投与が好ましいが、生体組織内への直接注射により投与してもよい。また、GVHD（graft-versus-host disease：移植片対宿主病）を誘導しないため、自家的な移植に限らず、同種的な移植も可能である。
前記抗原が、がん特異的抗原である場合、本発明の遺伝子改変γδ型Ｔ細胞集団を含む細胞製剤または医薬組成物は、抗がん剤として使用することができる。がん特異的抗原としては、NY-ESO-1、MAGE-A4、CEA（がん胎児性抗原）などが挙げられる。これらのがん特異的抗原を発現するがん種としては、例えば、乳がん、肺がん、胃がん、食道がん、胆管がん、悪性黒色腫、前立腺がん、卵巣がん、滑膜肉腫、脂肪肉腫、多発性骨髄腫が挙げられる。B細胞に発現するCD19を抗原とし、B細胞性腫瘍に対する抗がん剤とすることもできる。がん特異的抗原として、GD2（disialoganglioside2）を挙げることができる。神経芽腫に発現するGD2は、神経芽腫のみならず、脳腫瘍、網膜芽細胞腫、肺小細胞がん、悪性黒色腫など他の神経外胚葉に起源を有する悪性腫瘍にも広範囲に発現する。本願発明の医薬組成物は、これらのがんの治療または予防のために使用することができる。前記抗原が、感染症特異的抗原である場合、本発明の遺伝子改変γδ型Ｔ細胞集団を含む細胞製剤または医薬組成物は、感染症に起因する腫瘍性疾患あるいは感染症治療剤として使用することができる。感染症特異的抗原としては、HTLV-1（ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型）由来抗原Taxなどが挙げられる。これらの感染症特異的抗原を発現する感染症または腫瘍性疾患としては、例えば、HTLV-1関連脊髄症、HTLV-1ぶどう膜炎、ATL（成人Ｔ細胞白血病リンパ腫）が挙げられる。本願発明の医薬組成物は、これらの感染症治療または予防のために使用することができる。
本発明の細胞製剤または医薬組成物は、薬学的に許容される添加剤を含んでいてもよい。該添加剤としては、例えば、細胞培養液、リン酸緩衝食塩水などが挙げられる。
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
〔γδ型Ｔ細胞の増殖〕
2名の健常人の末梢血より、フィコール（Ficoll）により単核球を調製した。採血に際しては、三重大学医学部研究倫理規定に基づき、本人の同意を得た。10％ヒトAB血清を含むYsselの培養液で1.5×106 cells/mLに調整した単核球を、テトラキスピバロイルオキシメチル ２−（チアゾール−２−イルアミノ）エチリデン−１，１−ビスホスホネート（化合物７、1μM）存在下、1日間培養した後、25 ng/mLのIL-7（ミルテニーバイオテック社、カタログ番号170-076-111）および25 ng/mLのIL-15（ミルテニーバイオテック社、カタログ番号170-076-114）を添加し、さらに10日間培養した。単核球集団におけるγδ型Ｔ細胞をフローサイトメトリー（FACSCANTO II、Becton Dickinson社）で、γδT細胞の頻度解析を実施した。その結果、培養開始時（Day0）のγδ型Ｔ細胞の割合は、ドナー１（HD1）およびドナー２（HD2）について、それぞれ2.7％および1.7％であったが、化合物７、IL-7およびIL-15の存在下で培養することにより、11日目（Day 11）ではそれぞれ97.1％および94.5％となり、大部分の細胞がγδ型Ｔ細胞へと高い純度で増殖した（図１Ａ）。通常、健常人末梢血にはγδ型T細胞が１〜３％含まれるが、1.5 mLの末梢血から1×108個程度の高純度のγδ型T細胞集団の調製が可能であった。
2名の健常人の末梢血より、フィコール（Ficoll）により単核球を調製した。採血に際しては、三重大学医学部研究倫理規定に基づき、本人の同意を得た。10％ヒトAB血清を含むYsselの培養液で1.5×106 cells/mLに調整した単核球を、テトラキスピバロイルオキシメチル ２−（チアゾール−２−イルアミノ）エチリデン−１，１−ビスホスホネート（化合物７、1μM）存在下、1日間培養した後、25 ng/mLのIL-7（ミルテニーバイオテック社、カタログ番号170-076-111）および25 ng/mLのIL-15（ミルテニーバイオテック社、カタログ番号170-076-114）を添加し、さらに10日間培養した。単核球集団におけるγδ型Ｔ細胞をフローサイトメトリー（FACSCANTO II、Becton Dickinson社）で、γδT細胞の頻度解析を実施した。その結果、培養開始時（Day0）のγδ型Ｔ細胞の割合は、ドナー１（HD1）およびドナー２（HD2）について、それぞれ2.7％および1.7％であったが、化合物７、IL-7およびIL-15の存在下で培養することにより、11日目（Day 11）ではそれぞれ97.1％および94.5％となり、大部分の細胞がγδ型Ｔ細胞へと高い純度で増殖した（図１Ａ）。通常、健常人末梢血にはγδ型T細胞が１〜３％含まれるが、1.5 mLの末梢血から1×108個程度の高純度のγδ型T細胞集団の調製が可能であった。
末梢血3 mLから採取した単核球3×106個を、化合物７（1μM）、IL-7（25 ng/mL）およびIL-15（25 ng/mL）存在下13日まで培養した。培養液は、10％ヒトAB血清を含むYsselの培養液を用いた。その結果、培養後8日付近から急速な細胞増殖が認められ、培養後13日では細胞数は3×108個となり、細胞数は約5000倍となった（図１B）。化合物７によりγδ型T細胞を刺激および増殖させ、IL-7およびIL-15を含む培養液を用いて培養することにより、高純度のγδ型T細胞集団を高効率で増殖させることができることが示される。
比較として、培養液中のIL-7およびIL-15を、IL-2（PROLEUKIN、Chiron Therapeutics社）に置き換えて単核球を培養した。その結果、IL-7およびIL-15の細胞増殖促進効果は、IL-2（100 IU/mLおよび300 IU/mL）単独での細胞増殖促進効果より優れていることが示された（図１B）。また、IL-7およびIL-15による細胞増殖促進効果は、IL-2をさらに追加してもさらに増加することはなかった。
〔外来遺伝子（TCR）が導入されたγδ型T細胞集団の製造〕
Day 0に、健常人末梢血1.5 mLからFicollを用いて採取した単核球1.5×106個を、化合物７（1μM）存在下で刺激培養を開始した。Day 1に、最終濃度がそれぞれ25 ng/mLとなるように培養液にIL-7及びIL-15を加えた。Day 4およびDay 5に、レトロネクチン（登録商標、タカラバイオ）存在下にHLA-A2とNY-ESO-1p157-165ペプチド（SLLMWITQC）との複合体を特異的に認識するNY-ESO-1特異的TCR発現用レトロウイルスベクターを用いて感染導入を行った。これ以後も、IL-7およびIL-15を含む培養液により培養を継続し、Day 11に導入TCRの発現効率の検討を行った。結果を図２に示す。図２より、高い効率でTCR遺伝子が導入されたγδ型T細胞が得られたことが示された。得られたγδ型T細胞は、TCRと複合体を形成するCD3、および受容体NKG2D（natural-killer group 2, member D）が陽性であった。
Day 0に、健常人末梢血1.5 mLからFicollを用いて採取した単核球1.5×106個を、化合物７（1μM）存在下で刺激培養を開始した。Day 1に、最終濃度がそれぞれ25 ng/mLとなるように培養液にIL-7及びIL-15を加えた。Day 4およびDay 5に、レトロネクチン（登録商標、タカラバイオ）存在下にHLA-A2とNY-ESO-1p157-165ペプチド（SLLMWITQC）との複合体を特異的に認識するNY-ESO-1特異的TCR発現用レトロウイルスベクターを用いて感染導入を行った。これ以後も、IL-7およびIL-15を含む培養液により培養を継続し、Day 11に導入TCRの発現効率の検討を行った。結果を図２に示す。図２より、高い効率でTCR遺伝子が導入されたγδ型T細胞が得られたことが示された。得られたγδ型T細胞は、TCRと複合体を形成するCD3、および受容体NKG2D（natural-killer group 2, member D）が陽性であった。
NY-ESO-1特異的TCR発現レトロウイルスベクターによりTCRが導入されたγδ型T細胞は、NY-ESO-1p157-165（SLLMWITQC）ペプチドが添加されたHLA-A2陽性細胞株T2との共培養（4時間）により、サイトカインIFN-γおよびTNFαを産生し、また機能的な細胞傷害活性の指標であるCD107aを発現することが確認された（図３）。アミノ酸配列中のアミノ酸は、一文字表記により記載されている。
〔TCR遺伝子が導入されたγδ型Ｔ細胞による抗原特異的な腫瘍細胞株の認識〕
HLA-A*02:01拘束的にNY-ESO-1p157-165ペプチドを特異的に認識するTCR遺伝子が導入されたγδ型Ｔ細胞の腫瘍認識性を検討した。結果を図４に示す。NY-ESO-1陽性HLA-A*02:01陽性細胞株であるSK-MEL-37細胞株と前記γδ型Ｔ細胞とを共培養（4時間）すると、細胞内IFN-γ染色法による細胞内サイトカイン染色によりIFN-γの産生が確認されたが、NY-ESO-1陰性HLA-A*02:01陽性細胞株であるMel72との共培養では、IFN-γの産生は認められなかった。陽性コントロールとして、NY-ESO-1p157-165ペプチドを添加したHLA-A2陽性T2細胞株（T2-ESO1）を、また陰性コントロールとして、MAGE-A4p230-239ペプチドが添加されたT2細胞株（T2-MAGE）を用いた。作製したTCR導入γδ型Ｔ細胞は機能的であり、抗原特異的に腫瘍細胞を認識することが示された。
HLA-A*02:01拘束的にNY-ESO-1p157-165ペプチドを特異的に認識するTCR遺伝子が導入されたγδ型Ｔ細胞の腫瘍認識性を検討した。結果を図４に示す。NY-ESO-1陽性HLA-A*02:01陽性細胞株であるSK-MEL-37細胞株と前記γδ型Ｔ細胞とを共培養（4時間）すると、細胞内IFN-γ染色法による細胞内サイトカイン染色によりIFN-γの産生が確認されたが、NY-ESO-1陰性HLA-A*02:01陽性細胞株であるMel72との共培養では、IFN-γの産生は認められなかった。陽性コントロールとして、NY-ESO-1p157-165ペプチドを添加したHLA-A2陽性T2細胞株（T2-ESO1）を、また陰性コントロールとして、MAGE-A4p230-239ペプチドが添加されたT2細胞株（T2-MAGE）を用いた。作製したTCR導入γδ型Ｔ細胞は機能的であり、抗原特異的に腫瘍細胞を認識することが示された。
〔HTLV-1ウイルス抗原p40Tax特異的TCRが導入されたγδT細胞によるHLA-A*24:02およびp40Tax陽性細胞株の認識〕
レトロウイルスベクターを用いることにより、HLA-A*24:02拘束的にHTLV-1ウイルス抗原p40Tax由来ペプチド（SFHSLHLLF）を特異的に認識するTCRが導入されたγδ型Ｔ細胞の抗原認識性を検討した。結果を図５に示す。HLA-A*24:02陽性HTLV-1陽性細胞株であるILT-Hod細胞株と前記γδ型Ｔ細胞とを共培養(18時間)すると、培養上清中にはELISA法によりIFN-γ産生が確認されるが、HLA-A*24:02陰性HTLV-1陽性細胞株であるILT-#37細胞株との共培養では、IFN-γ産生は認められなかった（図５Ａ）。陽性コントロールとして、p40Tax由来ペプチドを添加したHLA-A24陽性T2A24細胞株（T2A24-p40）を、また陰性コントロールとして、NY-ESO-1p157-165ペプチドを添加したT2A24細胞株（T2A24-ESO）を用いた。また、前記γδ型Ｔ細胞と、ILT-Hod細胞株またはILT-#37細胞株との細胞数比率を変えて共培養すると、ILT-Hod細胞株に対してE/T ratioに依存した強い細胞傷害性が認められた（図５Ｂ）。このように、化合物７により刺激されたγδT細胞から作製したTCR導入γδ型Ｔ細胞は機能的であり、抗原特異的に腫瘍細胞を認識し、傷害することが示された。
レトロウイルスベクターを用いることにより、HLA-A*24:02拘束的にHTLV-1ウイルス抗原p40Tax由来ペプチド（SFHSLHLLF）を特異的に認識するTCRが導入されたγδ型Ｔ細胞の抗原認識性を検討した。結果を図５に示す。HLA-A*24:02陽性HTLV-1陽性細胞株であるILT-Hod細胞株と前記γδ型Ｔ細胞とを共培養(18時間)すると、培養上清中にはELISA法によりIFN-γ産生が確認されるが、HLA-A*24:02陰性HTLV-1陽性細胞株であるILT-#37細胞株との共培養では、IFN-γ産生は認められなかった（図５Ａ）。陽性コントロールとして、p40Tax由来ペプチドを添加したHLA-A24陽性T2A24細胞株（T2A24-p40）を、また陰性コントロールとして、NY-ESO-1p157-165ペプチドを添加したT2A24細胞株（T2A24-ESO）を用いた。また、前記γδ型Ｔ細胞と、ILT-Hod細胞株またはILT-#37細胞株との細胞数比率を変えて共培養すると、ILT-Hod細胞株に対してE/T ratioに依存した強い細胞傷害性が認められた（図５Ｂ）。このように、化合物７により刺激されたγδT細胞から作製したTCR導入γδ型Ｔ細胞は機能的であり、抗原特異的に腫瘍細胞を認識し、傷害することが示された。
〔外来遺伝子（CAR）が導入されたγδ型T細胞集団の製造〕
近年CAR遺伝子を用いた血液系腫瘍に対するCAR療法が臨床応用されている。このため、γδ型Ｔ細胞にCARを導入できるかどうか検討した。Day 0に健常人末梢血1.5 mLからFicollを用いて採取した単核球1.5×106個を、化合物７（1μM）存在下で刺激培養を開始した（Day 0）。Day 1に、最終濃度がそれぞれ25 ng/mLとなるように培養液にIL-7及びIL-15を加えた。Day 4およびDay 5に、レトロネクチン存在下にHLA-A*02:01とMAGE-A4p230-239ペプチド（GVYDGREHTV）との複合体を特異的に認識するCAR発現用レトロウイルスベクターを用いて感染導入を行った。これ以後も、IL-7およびIL-15を含む培養液により培養を継続し、Day 11に導入CARの発現効率の検討を行った。
近年CAR遺伝子を用いた血液系腫瘍に対するCAR療法が臨床応用されている。このため、γδ型Ｔ細胞にCARを導入できるかどうか検討した。Day 0に健常人末梢血1.5 mLからFicollを用いて採取した単核球1.5×106個を、化合物７（1μM）存在下で刺激培養を開始した（Day 0）。Day 1に、最終濃度がそれぞれ25 ng/mLとなるように培養液にIL-7及びIL-15を加えた。Day 4およびDay 5に、レトロネクチン存在下にHLA-A*02:01とMAGE-A4p230-239ペプチド（GVYDGREHTV）との複合体を特異的に認識するCAR発現用レトロウイルスベクターを用いて感染導入を行った。これ以後も、IL-7およびIL-15を含む培養液により培養を継続し、Day 11に導入CARの発現効率の検討を行った。
結果を図６に示す。図６より、高い効率でCAR遺伝子が導入されたγδ型T細胞が得られたことが示された。なお、得られたγδ型T細胞は、CD3およびNKG2Dが陽性であった。
同様にして、Day 4およびDay 5に、レトロネクチン存在下にGD2（disialoganglioside2）またはCD19を特異的に認識するCAR発現用レトロウイルスベクターを用いて感染導入を行い、その後も、IL-7およびIL-15を含む培養液により培養を継続して、Day 11に導入CARの発現効率の検討を行った。
結果を、GD2を特異的に認識するCAR遺伝子を導入した場合のGD2特異的CARの発現について図７に、また、CD19を特異的に認識するCAR遺伝子を導入した場合のCD19特異的CARの発現について図８に示す。図７および８より、対照と比較して、高い効率で、GD2またはCD19を標的とするCAR遺伝子が導入されたγδ型Ｔ細胞が得られたことが示される。GD2特異的CAR遺伝子が導入されたγδ型T細胞を、GD2陽性の標的腫瘍細胞株ASと共培養すると、GD2特異的CARを導入したγδ型Ｔ細胞で、対照と比較して、サイトカインIFN-γ産生の亢進が認められた。同様に、CD19特異的CAR遺伝子が導入されたγδ型T細胞を、CD19陽性腫瘍細胞（NALM6）と共培養すると、CD19特異的CARを導入したγδ型Ｔ細胞で、対照と比較して、サイトカインIFN-γ産生の亢進が認められた。
〔CAR遺伝子が導入されたγδ型Ｔ細胞による抗原特異的な腫瘍細胞株の認識〕
HLA-A*02:01拘束的にMAGE-A4p230-239（GVYDGREHTV）を認識するCAR遺伝子が導入されたγδ型Ｔ細胞の腫瘍認識性を検討した。結果を図９に示す。MAGE-A4陽性HLA-A*02:01陽性細胞株であるSK-MEL-37細胞株とNW-MEL-38細胞株とを共培養（4時間）すると、フローサイトメトリーによる解析により、機能的な細胞傷害活性の指標であるCD107aの発現が確認されたが、MAGE-A4陰性HLA-A*02:01陽性細胞株であるMel72細胞株とHCT116細胞株との共培養では、CD107aの発現が低いことが示された。陽性コントロールとして、MAGE-A4p230-239ペプチドを添加したHLA-A2陽性T2細胞株（T2-MAGE）を、また陰性コントロールとして、NY-ESO-1p157-165ペプチドを添加したT2細胞株（T2-ESO1）を用いた。
HLA-A*02:01拘束的にMAGE-A4p230-239（GVYDGREHTV）を認識するCAR遺伝子が導入されたγδ型Ｔ細胞の腫瘍認識性を検討した。結果を図９に示す。MAGE-A4陽性HLA-A*02:01陽性細胞株であるSK-MEL-37細胞株とNW-MEL-38細胞株とを共培養（4時間）すると、フローサイトメトリーによる解析により、機能的な細胞傷害活性の指標であるCD107aの発現が確認されたが、MAGE-A4陰性HLA-A*02:01陽性細胞株であるMel72細胞株とHCT116細胞株との共培養では、CD107aの発現が低いことが示された。陽性コントロールとして、MAGE-A4p230-239ペプチドを添加したHLA-A2陽性T2細胞株（T2-MAGE）を、また陰性コントロールとして、NY-ESO-1p157-165ペプチドを添加したT2細胞株（T2-ESO1）を用いた。
〔腫瘍特異的なTCRが導入され、かつCD8αβを発現させたγδ型Ｔ細胞による腫瘍抑制作用〕
HLA-A*02:01拘束的にNY-ESO-1p157-165ペプチドを特異的に認識するTCR（G50 TCR）遺伝子を導入したレトロウイルスベクターならびにヒトCD8α鎖およびCD8β鎖を同時発現するレトロウイルスベクターをγδ型Ｔ細胞に感染させ、TCR（G50 TCR）およびTCRの刺激を増強する副刺激分子として機能するCD8αβを発現させたγδ型Ｔ細胞を作成し、該細胞の腫瘍抑制作用を検討した。比較するために、対照細胞（NGMC, Non-Gene Modified T Cells）、G50 TCRのみを発現する細胞およびCD8αβのみを発現する細胞を作成した。これらのγδ型Ｔ細胞を、T2-ESO1細胞株、T2-MAGE細胞株、NW-MEL-38細胞株およびHCT116細胞株と共培養した場合の、IFN-γおよびCD107a産生を比較した。その結果、IFN-γおよびCD107a産生は、NY-ESO-1p157-165ペプチドを添加したT2細胞株であるT2-ESO1またはHLA-A2陽性MAGE-A4陽性細胞株であるNW-MEL-38と共培養した場合に亢進し、亢進作用はG50 TCRを単独で導入したγδ型Ｔ細胞より、G50 TCRを導入し、かつCD8αβを発現させたγδ型Ｔ細胞において強く認められた（図１０Ａ）。
HLA-A*02:01拘束的にNY-ESO-1p157-165ペプチドを特異的に認識するTCR（G50 TCR）遺伝子を導入したレトロウイルスベクターならびにヒトCD8α鎖およびCD8β鎖を同時発現するレトロウイルスベクターをγδ型Ｔ細胞に感染させ、TCR（G50 TCR）およびTCRの刺激を増強する副刺激分子として機能するCD8αβを発現させたγδ型Ｔ細胞を作成し、該細胞の腫瘍抑制作用を検討した。比較するために、対照細胞（NGMC, Non-Gene Modified T Cells）、G50 TCRのみを発現する細胞およびCD8αβのみを発現する細胞を作成した。これらのγδ型Ｔ細胞を、T2-ESO1細胞株、T2-MAGE細胞株、NW-MEL-38細胞株およびHCT116細胞株と共培養した場合の、IFN-γおよびCD107a産生を比較した。その結果、IFN-γおよびCD107a産生は、NY-ESO-1p157-165ペプチドを添加したT2細胞株であるT2-ESO1またはHLA-A2陽性MAGE-A4陽性細胞株であるNW-MEL-38と共培養した場合に亢進し、亢進作用はG50 TCRを単独で導入したγδ型Ｔ細胞より、G50 TCRを導入し、かつCD8αβを発現させたγδ型Ｔ細胞において強く認められた（図１０Ａ）。
NOGマウスの左背部および右背部の皮下に、それぞれ腫瘍細胞HCT116およびNW-MEL-38をDay 0に4×10６個移植し、腫瘍を形成させた。次に、Day 7に上記４種類のγδ型Ｔ細胞を1×10７個輸注し、腫瘍の大きさを測定した。その結果、γδ型Ｔ細胞との共培養において、IFN-γおよびCD107a産生を誘導しなかったHCT116細胞株を移植したマウスでは、いずれのγδ型Ｔ細胞を輸注しても、腫瘍抑制効果は認められなかった（図１０Ｂ左図）。しかしながら、IFN-γおよびCD107a産生を誘導したNW-MEL-38細胞株を移植したマウスでは、G50 TCRを導入し、かつCD8αβを発現させたγδ型Ｔ細胞を輸注したマウスにおいて、顕著な腫瘍抑制効果が認められ、腫瘍特異的TCRおよびCD8αβの同時発現が、腫瘍抑制において効果的であることが示される（図１０Ｂ右図）。
〔NOGマウスを用いた病態モデルの作製と、該モデルにおける腫瘍特異的TCRを導入したγδ型Ｔ細胞による腫瘍抑制作用〕
ルシフェラーゼ遺伝子を導入したHLA-A*24:02陽性HTLV-1陽性細胞株（TL-Su）を作製し、NOGマウスに接種して、腫瘍形成をバイオイメージングにより可視化した。腫瘍特異的TCRを導入したγδ型Ｔ細胞は、使用するレトロウイルスベクターが、HLA-A*24:02拘束的にHTLV-1ウイルス抗原p40Tax由来ペプチド（SFHSLHLLF）を特異的に認識するTCRを発現するレトロウイルスベクターであること以外は、実施例２に記載の方法により製造した。対照細胞として、NGM-g/d-Ｔ細胞を使用した。
ルシフェラーゼ遺伝子を導入したHLA-A*24:02陽性HTLV-1陽性細胞株（TL-Su）を作製し、NOGマウスに接種して、腫瘍形成をバイオイメージングにより可視化した。腫瘍特異的TCRを導入したγδ型Ｔ細胞は、使用するレトロウイルスベクターが、HLA-A*24:02拘束的にHTLV-1ウイルス抗原p40Tax由来ペプチド（SFHSLHLLF）を特異的に認識するTCRを発現するレトロウイルスベクターであること以外は、実施例２に記載の方法により製造した。対照細胞として、NGM-g/d-Ｔ細胞を使用した。
NOGマウスに、5×10５個のTL-Su細胞株を皮下に移植した（Day -7）。7日後に、5×10６個の上記の遺伝子改変γδ型Ｔ細胞またはNGM-g/d-Ｔ細胞を、マウスに対して静注した（Day 0）。その後、1日後（Day 1）、1週後（1w）、2週後（2w）、3週後（3w）、4週後（4w）および６週後（６w）に、バイオイメージングにより腫瘍を可視化した。結果を、図１１（Ａ）に示す。細胞の代わりにリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を投与したマウスでは、時間経過とともに腫瘍が増大することが示された。NGM-g/d-Ｔ細胞を投与した場合であっても、腫瘍は増大し、腫瘍抑制作用は認められなかった。しかしながら、上記の遺伝子改変γδ型Ｔ細胞を投与したマウスでは、腫瘍の増大はほとんど観察されず、3w以降は腫瘍がまったく観察されなかった。上記の遺伝子改変γδ型Ｔ細胞は、病態モデルNOGマウスにおいて、腫瘍の増大を抑制するとともに、腫瘍を縮退させる治療効果を示した。マウスにおける平均放射輝度（radiance）を図１１（Ｂ）に示す。PBS投与群およびNGM-g/d-Ｔ細胞投与群では、平均放射輝度が経時的に増大するが、遺伝子改変γδ型Ｔ細胞投与群ではほとんど観察されないことが分かる（図１１Ｂ）。
〔化合物７で刺激した遺伝子改変γδ型Ｔ細胞の機能に対する凍結融解の影響〕
遺伝子改変γδ型Ｔ細胞を輸注する疾患治療を容易にするには、該細胞の輸送および保存において凍結処理が必要となる。そして、輸注療法を実用的なものにするには、凍結による細胞機能の低下を避けなければならない。そこで、化合物７（表１参照）の存在下に細胞増殖を行い、さらに外来遺伝子を導入したγδ型Ｔ細胞の機能が、凍結により影響を受けるかどうかを検討した。
遺伝子改変γδ型Ｔ細胞を輸注する疾患治療を容易にするには、該細胞の輸送および保存において凍結処理が必要となる。そして、輸注療法を実用的なものにするには、凍結による細胞機能の低下を避けなければならない。そこで、化合物７（表１参照）の存在下に細胞増殖を行い、さらに外来遺伝子を導入したγδ型Ｔ細胞の機能が、凍結により影響を受けるかどうかを検討した。
Day 0に、健常人末梢血からFicollを用いて採取した単核球を、化合物７（1μM）存在下で刺激培養を開始した。Day 1に、最終濃度がそれぞれ25 ng/mLとなるように培養液にIL-7及びIL-15を加えた。Day 4およびDay 5に、レトロネクチン存在下でレトロウイルスベクターを用いて、HLA-A2とNY-ESO-1p157-165ペプチド（SLLMWITQC）との複合体を特異的に認識するNY-ESO-1特異的TCR（G50 TCR）を導入した。これ以後も、IL-7およびIL-15を含む培養液により培養を継続した。Day 12に、細胞を凍結し、翌日Day 13に融解し、細胞機能を解析した。比較のために、細胞を凍結することなく、Day 13に細胞機能を解析した。結果を図１２に示す。フローサイトメトリーにより解析した結果、凍結融解した細胞（図１２Ｂ上図）と凍結しない細胞（図１２Ａ上図）との間には、導入されたNY-ESO-1特異的TCR遺伝子の発現量にほとんど差異を認めなかった。また、遺伝子改変γδ型Ｔ細胞を、T2-ESO1細胞株、T2-MAGE細胞株、SK-MEL-37細胞株、NW-MEL-38細胞株、MEL72およびHCT116細胞株と共培養し、CD107a産生に対する遺伝子改変γδ型Ｔ細胞の凍結の影響を解析した。その結果、凍結融解した細胞（図１２Ｂ下図）と凍結しない細胞（図１２Ａ下図）との間には、HLA-A2とNY-ESO-1p157-165ペプチド（SLLMWITQC）との複合体に対する抗原特異性にほとんど差異を認めなかった。以上の結果より、化合物７で刺激培養した遺伝子改変γδ型Ｔ細胞の機能は、凍結により影響を受けないことが示される。
〔γδ型Ｔ細胞の増殖およびγδ型Ｔ細胞の純度における化合物７とゾレドロン酸との作用比較〕
ゾレドロン酸（Zometa）は下記構造を有する化合物であり、化合物７（表１参照）とは、窒素含有ビスホスホン酸として共通する。このため、γδ型Ｔ細胞の増殖および増殖後に得られるγδ型Ｔ細胞の純度を指標として、ゾレドロン酸に対する化合物７の有用性を検討した。
健常人（n=8、HD1〜HD8）から、２回の試験（各試験n=4）に分けて、末梢血単核球を採取した。採取された末梢血単核球を、24ウェルプレートの各ウェルに1.5×10６個添加し、化合物７（1μM）またはゾレドロン酸（5μM）を含む10％ヒトAB血清を含む変法yssel's培養液（1.5 mL）で刺激培養を開始した（Day 0）。次に、Day 1において、IL-2（300 U/mL）を添加した。IL-2は、既報告（非特許文献５および６）において、γδ型Ｔ細胞の増殖のために使用されたサイトカインである。Day 6において、1ウェルの細胞を2ウェルへと2倍希釈するとともに、細胞数をカウントした。Day 7において、2ウェルの細胞を4ウェルへと2倍希釈するとともに、さらにIL-2（300 U/mL）を添加した。Day 8において、半量（約3 mL）の細胞を6倍希釈して18 mLとし、T75フラスコで培養した。Day 8およびDay 11において、細胞数のカウントおよびフローサイトメトリー解析による細胞純度測定を行った。
ゾレドロン酸（Zometa）は下記構造を有する化合物であり、化合物７（表１参照）とは、窒素含有ビスホスホン酸として共通する。このため、γδ型Ｔ細胞の増殖および増殖後に得られるγδ型Ｔ細胞の純度を指標として、ゾレドロン酸に対する化合物７の有用性を検討した。
健常人（n=8、HD1〜HD8）から、２回の試験（各試験n=4）に分けて、末梢血単核球を採取した。採取された末梢血単核球を、24ウェルプレートの各ウェルに1.5×10６個添加し、化合物７（1μM）またはゾレドロン酸（5μM）を含む10％ヒトAB血清を含む変法yssel's培養液（1.5 mL）で刺激培養を開始した（Day 0）。次に、Day 1において、IL-2（300 U/mL）を添加した。IL-2は、既報告（非特許文献５および６）において、γδ型Ｔ細胞の増殖のために使用されたサイトカインである。Day 6において、1ウェルの細胞を2ウェルへと2倍希釈するとともに、細胞数をカウントした。Day 7において、2ウェルの細胞を4ウェルへと2倍希釈するとともに、さらにIL-2（300 U/mL）を添加した。Day 8において、半量（約3 mL）の細胞を6倍希釈して18 mLとし、T75フラスコで培養した。Day 8およびDay 11において、細胞数のカウントおよびフローサイトメトリー解析による細胞純度測定を行った。
それぞれの被験者から得られた末梢血単核球について、細胞増殖に対する化合物７（PTAと表記）およびゾレドロン酸（Zometa）の経時的な作用を図１３Ａに示す。Day 8では、細胞像増殖に対する化合物７およびゾレドロン酸の効果の差はほとんど認められなかった。しかしながらDay 11では、試験１（Experiment 1）の被験者HD1〜HD4のすべての細胞において、ゾレドロン酸（Zometa）に比較して、化合物７（PTA）の細胞増殖刺激作用が強く認められた。また試験２（Experiment 2）では、被験者HD8の細胞において、ゾレドロン酸（Zometa）より化合物７（PTA）の細胞増殖刺激作用が弱かったが、被験者HD5の細胞においては同等、また被験者HD6およびHD7の細胞では、化合物７（PTA）の作用がゾレドロン酸（Zometa）を上回った。Day 11における試験１および試験２の結果をまとめたものが図１３Ｂであり、平均±標準偏差（n=8）で示される。化合物７（PTA）は、ゾレドロン酸（Zometa）と比較して、γδ型Ｔ細胞の増殖において有意に優れることが分かる（p=0.008、t検定）。
次に、Day 8およびDay 11において、細胞数のカウントおよびフローサイトメトリー解析による細胞純度測定を行った。CD3陽性細胞中のγδ型Ｔ細胞頻度（Vd2/CD3）は、Day 8およびDay 11とも、ゾレドロン酸（Zometa）処理群に比較して、化合物７（PTA）処理群で有意に高いことが示された（図１４Ａ）。また、フローサイトメトリー解析におけるリンパ球分画（P1）におけるγδ型Ｔ細胞頻度（Vd2/P1）についても、Day 8およびDay 11において、ゾレドロン酸（Zometa）処理群に比較して、化合物７（PTA）処理群で有意に高いことが示された（図１４Ｂ）。以上より、化合物７（PTA）は、ゾレドロン酸（Zometa）と比較して、純度の高いγδ型Ｔ細胞を得ることにおいて優れていることが示される。なお、図１４中における有意差検定は、ｔ検定を用いた。
〔材料と方法〕
１．リンパ球の調製
ヒトリンパ球は、健康なドナーから提供を受けた血液より、Ficoll-Paque（登録商標） PLUS（GE Healthcare、カタログ番号17-1440-03）を用いて、PBMC（Peripheral Blood Mononuclear Cells）を分離することによって得た。本研究に用いたヒト末梢血等の検体の採集および解析はヘルシンキ宣言に則って行なわれ、すべて三重大学医学部研究倫理委員会において承認されたプロトコールに従い、被験者本人の書面による同意書を得て実施された。採取した検体は、本人の特定が不可能な暗号化が施され、盗難防止処置を設置した冷蔵庫および液体窒素タンクに保存した。被験者個人情報は匿名化され、個人のプライバシーおよび遺伝子解析結果が外部に漏洩しないように、厳重な注意および処置が施行された。
２．細胞への遺伝子導入
γδ型Ｔ細胞へのTCR／CAR遺伝子導入には、レトロウイルスベクターを使用した。生物学的製剤基準血液保存液A液（ACD-A液、テルモ）に20μg/mLで溶解したRetroNectin（登録商標）（タカラバイオ）により、浮遊細胞用マルチディッシュを500 mL／ウェルで4℃、16時間または25℃、2時間コーティングした。この浮遊細胞用マルチディッシュに、レトロウイルスベクターのウイルス液を1 mL／ウェルで添加し、遠心分離（2000×g、2h、32℃）により前処置（preloading）を行った。続いて、各ウェルを、1.5％ヒト血清アルブミン（HSA）を含むリン酸緩衝生理食塩水（PBS） 1 mLで2回洗浄し、そこへリンパ球を3.8×105個以下／0.95 mL／ウェルで播種し、遠心分離（1000×g、32℃、10分間）で細胞を沈降させた。その後検鏡し、指定されたサイトカイン（IL-2 100 IU/mLもしくは300 IU/mL、またはIL-7 25 ng/mLおよびIL-15 25 ng/mL）の存在下で、37℃、5％CO2環境下のインキュベータ中で1日間培養した。その24時間後に、細胞を4/3倍希釈し、全量を用いて1度目と同様の方法で2度目の遺伝子導入を行った。その後培養を継続し、4時間後に6.8 mLの培養液で希釈し、再度37℃、5％CO2環境下で培養した。非遺伝子導入細胞（NGMC, Non-Gene Modified T Cells）は、遺伝子導入細胞を調製する場合と同様の方法を適用し、同一のサイトカイン存在下で6日以上培養することにより調製した。
レトロウイルスを用いたヒト末梢血単核球への腫瘍抗原特異的TCRの導入実験は、三重大学の組換えDNA実験審査委員会および三重大学医学部研究倫理委員会において承認されている。これらの実験は、三重大学において承認を受けたP2レベルの研究室において実施された。
３．フローサイトメトリー
染色を行った細胞は、BD FACS Canto（登録商標）IIフローサイトメトリー（Becton Dickinson社）により解析を行った。化合物7の存在下で刺激したγδ型Ｔ細胞にレトロウイルスを感染させ、目的のTCRまたはCAR遺伝子を発現させた培養8〜11日後の細胞を2%ウシ胎児血清（FCS）-PBSで2回洗浄した。その後、それぞれのTCR/CARに特異的な テトラマーを2%FCS-PBSで50倍希釈したものを細胞に添加し、37℃、15分間、遮光下で反応させた。次に、FITCもしくはV500標識抗ヒトCD8抗体（Becton Dickinson社）またはFITC標識抗ヒトVδ2抗体 (Biolegend社) により、遮光下4℃、15分間で細胞を染色し、2%FCS-PBS で2回洗浄した後に、フローサイトメーターにより解析を行った。
４．ELISA
ELISAにはeBioscience社のキットを用いた。コーティング緩衝液は、10×コーティング緩衝液を蒸留水で10倍希釈することにより調製した。48μLの一次抗体を12 mLのコーティング緩衝液と混合することにより希釈した。この希釈液を96ウェル平底プレートの各ウェルに100μL添加し、4℃で一晩静置した。この後、ウェルを0.05% PBS-T（Tween 20を含むリン酸緩衝生理食塩水）で5回洗浄した。アッセイ希釈液は、5×アッセイ希釈液を蒸留水で5倍希釈することにより調製した。アッセイ希釈液を各ウェルに200μL加え、1時間、室温でブロッキングし、その後、0.05%PBS- Tで5回洗浄した。IFN-γの標準溶液は、IFN-γの最高濃度を1000 pg/mLとし、公比2で7段階希釈したものを使用した。測定試料および標準溶液をプレートの各ウェルに加え、2時間、室温で反応させた。反応後、ウェルを0.05%PBS-Tで5回洗浄した。48μLの二次抗体を12 mLのアッセイ希釈液と混合することにより希釈し、この希釈液を各ウェルに100μL加え、1時間、室温で反応させた。反応後、各ウェルを0.05%PBS-Tで5回洗浄した。48μLのストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ（horseradish peroxidase）を12 mLのアッセイ希釈液と混合することにより希釈し、この希釈液を各ウェルに100μL加え、暗所、室温で30分間反応させた。次に、各ウェルを0.05% PBS-Tで7回洗浄した後、3,3’, 5,5’−テトラメチルベンジジン（TMB）基質溶液を各ウェルに100μL加えた。これを、暗所、室温で15分反応させ、0.18M硫酸を各ウェルに50μL加えることにより反応を停止させた。直ちに、吸光度をマイクロプレートリーダー（Model 680、Bio-Rad社）により、波長450 nmで測定した。
５．細胞内サイトカイン染色
ターゲット細胞を1×105個／mL、またエフェクター細胞を1×105個／mLとなるよう調製した。APC抗ヒトCD107a抗体を1サンプルあたり0.5μL添加して、ターゲット細胞：エフェクター細胞=1：1とし、96ウェルプレート（U底）で37℃、1時間共培養を行った。その後、各ウェルに、0.7μLのGolgistop（登録商標）（Protein Transport Inhibitor、Becton Dickinson社）を添加し、37℃で4時間培養した。各ウェルの細胞をV型96ウェルプレートに移し、1200 rpmで4℃、5分間遠心を行った後、0.5%BSA/PBSにより2回洗浄した。PE-抗ヒトCD6抗体を各ウェルに0.5μL添加して、遮光して氷上に20分間静置し、0.5%BSA/PBSにより2回洗浄した。細胞固定液（Cytofix/Cytoperm（登録商標）、Becton Dickinson社）を各ウェルに100μL添加し、遮光条件下、氷上で20分間静置した後、Perm/Wash（登録商標、Becton Dickinson社）緩衝液100μLを各ウェルに添加して遠心した。その後、Perm/Wash緩衝液により、さらに2回洗浄した。各ウェルにV450 IFN-γまたはPE-Cy7 TNFαを0.5μL添加した。遮光条件下、氷上に30分間静置した後、0.5%BSA/PBSによりウェルを2回洗浄した。その後、FACSCanto IIフローサイトメーター（Becton Dickinson社）により測定を行い、FACS Divaソフトウェア（Becton Dickinson社）を用いて解析を行った。
１．リンパ球の調製
ヒトリンパ球は、健康なドナーから提供を受けた血液より、Ficoll-Paque（登録商標） PLUS（GE Healthcare、カタログ番号17-1440-03）を用いて、PBMC（Peripheral Blood Mononuclear Cells）を分離することによって得た。本研究に用いたヒト末梢血等の検体の採集および解析はヘルシンキ宣言に則って行なわれ、すべて三重大学医学部研究倫理委員会において承認されたプロトコールに従い、被験者本人の書面による同意書を得て実施された。採取した検体は、本人の特定が不可能な暗号化が施され、盗難防止処置を設置した冷蔵庫および液体窒素タンクに保存した。被験者個人情報は匿名化され、個人のプライバシーおよび遺伝子解析結果が外部に漏洩しないように、厳重な注意および処置が施行された。
２．細胞への遺伝子導入
γδ型Ｔ細胞へのTCR／CAR遺伝子導入には、レトロウイルスベクターを使用した。生物学的製剤基準血液保存液A液（ACD-A液、テルモ）に20μg/mLで溶解したRetroNectin（登録商標）（タカラバイオ）により、浮遊細胞用マルチディッシュを500 mL／ウェルで4℃、16時間または25℃、2時間コーティングした。この浮遊細胞用マルチディッシュに、レトロウイルスベクターのウイルス液を1 mL／ウェルで添加し、遠心分離（2000×g、2h、32℃）により前処置（preloading）を行った。続いて、各ウェルを、1.5％ヒト血清アルブミン（HSA）を含むリン酸緩衝生理食塩水（PBS） 1 mLで2回洗浄し、そこへリンパ球を3.8×105個以下／0.95 mL／ウェルで播種し、遠心分離（1000×g、32℃、10分間）で細胞を沈降させた。その後検鏡し、指定されたサイトカイン（IL-2 100 IU/mLもしくは300 IU/mL、またはIL-7 25 ng/mLおよびIL-15 25 ng/mL）の存在下で、37℃、5％CO2環境下のインキュベータ中で1日間培養した。その24時間後に、細胞を4/3倍希釈し、全量を用いて1度目と同様の方法で2度目の遺伝子導入を行った。その後培養を継続し、4時間後に6.8 mLの培養液で希釈し、再度37℃、5％CO2環境下で培養した。非遺伝子導入細胞（NGMC, Non-Gene Modified T Cells）は、遺伝子導入細胞を調製する場合と同様の方法を適用し、同一のサイトカイン存在下で6日以上培養することにより調製した。
レトロウイルスを用いたヒト末梢血単核球への腫瘍抗原特異的TCRの導入実験は、三重大学の組換えDNA実験審査委員会および三重大学医学部研究倫理委員会において承認されている。これらの実験は、三重大学において承認を受けたP2レベルの研究室において実施された。
３．フローサイトメトリー
染色を行った細胞は、BD FACS Canto（登録商標）IIフローサイトメトリー（Becton Dickinson社）により解析を行った。化合物7の存在下で刺激したγδ型Ｔ細胞にレトロウイルスを感染させ、目的のTCRまたはCAR遺伝子を発現させた培養8〜11日後の細胞を2%ウシ胎児血清（FCS）-PBSで2回洗浄した。その後、それぞれのTCR/CARに特異的な テトラマーを2%FCS-PBSで50倍希釈したものを細胞に添加し、37℃、15分間、遮光下で反応させた。次に、FITCもしくはV500標識抗ヒトCD8抗体（Becton Dickinson社）またはFITC標識抗ヒトVδ2抗体 (Biolegend社) により、遮光下4℃、15分間で細胞を染色し、2%FCS-PBS で2回洗浄した後に、フローサイトメーターにより解析を行った。
４．ELISA
ELISAにはeBioscience社のキットを用いた。コーティング緩衝液は、10×コーティング緩衝液を蒸留水で10倍希釈することにより調製した。48μLの一次抗体を12 mLのコーティング緩衝液と混合することにより希釈した。この希釈液を96ウェル平底プレートの各ウェルに100μL添加し、4℃で一晩静置した。この後、ウェルを0.05% PBS-T（Tween 20を含むリン酸緩衝生理食塩水）で5回洗浄した。アッセイ希釈液は、5×アッセイ希釈液を蒸留水で5倍希釈することにより調製した。アッセイ希釈液を各ウェルに200μL加え、1時間、室温でブロッキングし、その後、0.05%PBS- Tで5回洗浄した。IFN-γの標準溶液は、IFN-γの最高濃度を1000 pg/mLとし、公比2で7段階希釈したものを使用した。測定試料および標準溶液をプレートの各ウェルに加え、2時間、室温で反応させた。反応後、ウェルを0.05%PBS-Tで5回洗浄した。48μLの二次抗体を12 mLのアッセイ希釈液と混合することにより希釈し、この希釈液を各ウェルに100μL加え、1時間、室温で反応させた。反応後、各ウェルを0.05%PBS-Tで5回洗浄した。48μLのストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ（horseradish peroxidase）を12 mLのアッセイ希釈液と混合することにより希釈し、この希釈液を各ウェルに100μL加え、暗所、室温で30分間反応させた。次に、各ウェルを0.05% PBS-Tで7回洗浄した後、3,3’, 5,5’−テトラメチルベンジジン（TMB）基質溶液を各ウェルに100μL加えた。これを、暗所、室温で15分反応させ、0.18M硫酸を各ウェルに50μL加えることにより反応を停止させた。直ちに、吸光度をマイクロプレートリーダー（Model 680、Bio-Rad社）により、波長450 nmで測定した。
５．細胞内サイトカイン染色
ターゲット細胞を1×105個／mL、またエフェクター細胞を1×105個／mLとなるよう調製した。APC抗ヒトCD107a抗体を1サンプルあたり0.5μL添加して、ターゲット細胞：エフェクター細胞=1：1とし、96ウェルプレート（U底）で37℃、1時間共培養を行った。その後、各ウェルに、0.7μLのGolgistop（登録商標）（Protein Transport Inhibitor、Becton Dickinson社）を添加し、37℃で4時間培養した。各ウェルの細胞をV型96ウェルプレートに移し、1200 rpmで4℃、5分間遠心を行った後、0.5%BSA/PBSにより2回洗浄した。PE-抗ヒトCD6抗体を各ウェルに0.5μL添加して、遮光して氷上に20分間静置し、0.5%BSA/PBSにより2回洗浄した。細胞固定液（Cytofix/Cytoperm（登録商標）、Becton Dickinson社）を各ウェルに100μL添加し、遮光条件下、氷上で20分間静置した後、Perm/Wash（登録商標、Becton Dickinson社）緩衝液100μLを各ウェルに添加して遠心した。その後、Perm/Wash緩衝液により、さらに2回洗浄した。各ウェルにV450 IFN-γまたはPE-Cy7 TNFαを0.5μL添加した。遮光条件下、氷上に30分間静置した後、0.5%BSA/PBSによりウェルを2回洗浄した。その後、FACSCanto IIフローサイトメーター（Becton Dickinson社）により測定を行い、FACS Divaソフトウェア（Becton Dickinson社）を用いて解析を行った。
Claims (28)
- 導入遺伝子を発現するγδ型Ｔ細胞集団を製造する方法であって、
（工程１）γδ型Ｔ細胞を、２−（チアゾール−２−イルアミノ）エチリデン−１，１−ビスホスホネート、２−（３−ブロモピリジン−２−イルアミノ）エチリデン−１，１−ビスホスホネート、２−（５−フルオロピリジン−２−イルアミノ）エチリデン−１，１−ビスホスホネート、２−（ピリミジン−２−イルアミノ）エチリデン−１，１−ビスホスホネート、２−（７−アザインドール−１−イル）エチリデン−１，１−ビスホスホネート、２−（５−メチルチアゾール−２−イルアミノ）エチリデン−１，１−ビスホスホネート、２−（４−フェニルチアゾール−２−イルアミノ）エチリデン−１，１−ビスホスホネートおよび２−（ピリミジン−４−イルアミノ）エチリデン−１，１−ビスホスホネートのテトラキスピバロイルオキシメチルエステル誘導体ならびにそれらの薬学的に許容される塩からなる群より選ばれる１つ以上の化合物の存在下で培養する工程、
（工程２）工程１で培養したγδ型Ｔ細胞を、IL-7およびIL-15の存在下で培養する工程、および、
（工程３）工程２で培養したγδ型Ｔ細胞に遺伝子を導入する工程、
を含む、方法。 - 導入遺伝子を発現するγδ型Ｔ細胞集団を製造する方法であって、
（工程１）γδ型Ｔ細胞を、テトラキスピバロイルオキシメチル ２−（チアゾール−２−イルアミノ）エチリデン−１，１−ビスホスホネートまたはその薬学的に許容される塩の存在下で培養する工程、
（工程２）工程１で培養したγδ型Ｔ細胞を、IL-7およびIL-15の存在下で培養する工程、および、
（工程３）工程２で培養したγδ型Ｔ細胞に遺伝子を導入する工程、
を含む、方法。 - 工程１におけるテトラキスピバロイルオキシメチル ２−（チアゾール−２−イルアミノ）エチリデン−１，１−ビスホスホネートまたはその薬学的に許容される塩の濃度が0.01〜1μMである、請求項２に記載の方法。
- 前記γδ型Ｔ細胞が、哺乳動物に由来する、請求項１または２に記載の方法。
- 前記哺乳動物が、がん患者または非がん患者である、請求項４に記載の方法。
- 前記がんが、乳がん、肺がん、肝がん、口腔がん、上咽頭がん、頭頸部がん、胃がん、食道がん、大腸がん、皮膚がん、悪性黒色腫、腎がん、膵がん、脳腫瘍、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、膀胱がん、滑膜肉腫、脂肪肉腫、白血病、悪性リンパ腫および多発性骨髄腫からなる群より選ばれる、請求項５に記載の方法。
- 工程３における遺伝子を導入する工程が、DNAベクターまたはRNAベクターを用いることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
- 工程３における遺伝子を導入する工程が、プラスミドベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスおよびレトロウイルスベクターからなる群より選ばれるベクターを用いることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
- 工程３における遺伝子を導入する工程が、レトロウイルスベクターを用いることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
- 前記遺伝子が、Ｔ細胞受容体（TCR）またはキメラ抗原受容体（CAR）をコードする遺伝子である、請求項１または２に記載の方法。
- 前記Ｔ細胞受容体（TCR）が、NY-ESO-1p157-165／HLA-A2複合体特異的TCR、HTLV-1p40Taxp11-19／HLA-A2複合体特異的TCR、HTLV-1p40Taxp301-309／HLA-A24複合体特異的TCRおよびMAGE-A4p143-151／HLA-A24複合体特異的TCRからなる群より選ばれる、請求項１０に記載の方法。
- 前記キメラ抗原受容体（CAR）が、MAGE-A4p230-239／HLA-A2複合体特異的CAR、CEA特異的CAR、GD2特異的CARおよびCD19特異的CARからなる群より選ばれる、請求項１０に記載の方法。
- 請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法により得られる遺伝子改変γδ型Ｔ細胞集団。
- 請求項１３に記載の遺伝子改変γδ型Ｔ細胞集団と薬学的に許容される添加剤とを含有する医薬組成物。
- 自家的または同種的な移植によりがん治療対象を処置するための、請求項１４に記載の医薬組成物。
- 下記の特徴を有する、遺伝子改変γδ型Ｔ細胞集団。
（ｉ）NY-ESO-1p157-165／HLA-A2複合体、HTLV-1p40Taxp11-19／HLA-A2複合体、HTLV-1p40Taxp301-309／HLA-A24複合体またはMAGE-A4p143-151／HLA-A24複合体を特異的に認識するTCRを発現する、
（ｉｉ）CD3およびNKG2Dが陽性である、
（ｉｉｉ）IFN-γおよびTNFαを含むサイトカインおよびケモカインを産生する、ならびに
（ｉｖ）細胞傷害活性を有する。 - 下記の特徴を有する、遺伝子改変γδ型Ｔ細胞集団。
（ｉ）MAGE-A4p230-239／HLA-A2複合体、CEA、GD2またはCD19を特異的に認識するCARを発現する、
（ｉｉ）CD3およびNKG2Dが陽性である、
（ｉｉｉ）IFN-γおよびTNFαを含むサイトカインおよびケモカインを産生する、ならびに
（ｉｖ）細胞傷害活性を有する。 - 前記遺伝子改変γδ型Ｔ細胞集団が、DNAベクターまたはRNAベクターを用いて遺伝子が導入されたγδ型Ｔ細胞集団であることを特徴とする、請求項１６または１７に記載の遺伝子改変γδ型Ｔ細胞集団。
- 前記遺伝子改変γδ型Ｔ細胞集団が、プラスミドベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスおよびレトロウイルスベクターからなる群より選ばれるベクターを用いて遺伝子が導入されたγδ型Ｔ細胞集団であることを特徴とする、請求項１６または１７に記載の遺伝子改変γδ型Ｔ細胞集団。
- 前記遺伝子改変γδ型Ｔ細胞集団が、レトロウイルスベクターを用いて遺伝子が導入されたγδ型Ｔ細胞集団であることを特徴とする、請求項１６または１７に記載の遺伝子改変γδ型Ｔ細胞集団。
- 前記遺伝子が、Ｔ細胞受容体（TCR）またはキメラ抗原受容体（CAR）をコードする遺伝子である、請求項１６または１７に記載の遺伝子改変γδ型Ｔ細胞集団。
- 請求項１６〜２１のいずれか１項に記載の遺伝子改変γδ型Ｔ細胞集団を含む医薬組成物。
- 請求項１６〜２１のいずれか１項に記載の遺伝子改変γδ型Ｔ細胞集団を含む細胞製剤。
- がん患者を治療するための、請求項１６〜２１のいずれか１項に記載の遺伝子改変γδ型Ｔ細胞集団。
- 請求項１６〜２１のいずれか１項に記載の遺伝子改変γδ型Ｔ細胞集団を含む抗がん剤。
- 請求項１６〜２１のいずれか１項に記載の遺伝子改変γδ型Ｔ細胞集団を用いることを特徴とする、がん治療方法。
- 請求項１６〜２１のいずれか１項に記載の遺伝子改変γδ型Ｔ細胞集団を含む感染症治療剤。
- 請求項１６〜２１のいずれか１項に記載の遺伝子改変γδ型Ｔ細胞集団を用いることを特徴とする、感染症治療方法。
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