CN112469820A - 将基因导入到γδ型T细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种通过使用双膦酸酯衍生物刺激γδ型T细胞后，在存在IL‑7和IL‑15的条件下进行培养，接着导入基因，从而高效率、高纯度地制造导入外来基因的γδ型T细胞的方法。在作为外来基因导入T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)时，可得到功能地表达TCR和CAR的γδ型T细胞。
Description
技术领域
本发明涉及一种高效率、高纯度地制造导入了外来基因的γδ型T细胞的方法。
背景技术
近年，作为癌症的治疗方法，向癌症患者导入编码T细胞受体(T cell receptor：TCR)或嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor：CAR)的外来基因，导入重新赋予癌抗原特异性的T细胞的T细胞输注疗法受到瞩目。实际上，现正进行导入识别作为癌抗原的MAGE-A4的TCR基因，向食道癌患者施予表达该TCR的TCR基因修饰T细胞的临床试验(非专利文献1)。另外，现正进行向配体结合域导入插入有结合CD19的单链抗体(单链可变片段，scFV)的CAR基因，向复发性·难治性急性淋巴性白血病患者施予表达该CAR基因的CAR基因修饰T细胞的临床试验(非专利文献2)。
作为导入外来基因的目标细胞，一般使用具有αβ型TCR的T细胞(αβ型T细胞)。其理由如下所述。即，导入外来基因主要使用病毒载体，但此时通常需要对目标细胞进行增殖刺激。并且，在作为目标细胞使用αβ型T细胞导入基因时，通过使用抗CD3抗体和抗CD28抗体，可容易地对目标细胞进行增殖刺激。
迄今表明了具有γδ型TCR的T细胞(γδ型T细胞)损伤病毒感染细胞和癌细胞，向患者输注赋予抗原特异性的γδ型T细胞的治疗方法被期待比使用αβ型T细胞的效果更好，实际上也尝试了γδ型T细胞输注疗法(非专利文献3)。但是，γδ型T细胞的细胞功能等细胞学特征还没有被充分解析。其原因可举例γδ型T细胞的存在量少，为外周血T细胞的约5％(非专利文献4)，难以保证细胞解析所需要的细胞数。γδ型T细胞与αβ型T细胞不同，用抗CD3抗体和抗CD28抗体不能使其充分增殖。因此，尝试了使用用作骨吸收抑制剂的双膦酸衍生物唑来膦酸(zoledronate)和白细胞介素-2(IL-2)使γδ型T细胞增殖(非专利文献5和6)。但是，即使使用唑来膦酸和IL-2，也存在扩大培养得到的γδ型T细胞的纯度低的问题。
有报告通过在存在作为双膦酸酯衍生物的2-(噻唑-2-基氨基)亚乙基-1,1-双膦酸四特戊酰氧基甲基酯的条件下培养从人外周血得到的单核细胞，向其中进一步添加IL-2，使γδ型T细胞高纯度增殖的方法(专利文献1和非专利文献7)。另一方面，为了有效地进行γδ型T细胞输注疗法，期待大量制备高纯度的γδ型T细胞，同时向得到的γδ型T细胞高效率地导入编码TCR或CAR的外来基因。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：WO2016/098904
非专利文献
非专利文献1：Kageyama S,et al.Adoptive transfer of MAGE-A4 T-cellreceptor gene-transduced lymphocytes in patients with recurrent esophagealcancer.Clin Cancer Res.2015May 15；21(10):2268-2277.
非专利文献2：Maude SL，et al.Chimeric antigen receptor T cells forsustained remissions in leukemia.N Engl J Med.2014Oct 16；371(16):1507-1517.
非专利文献3：Kobayashi H,et al.Safety profile and anti-tumor effectsof adoptive immunotherapy using gamma-delta T cells against advanced renalcell carcinoma:a pilot study.Cancer Immunol Immunother.2007Apr；56(4):469-476.
非专利文献4：Carding SR and Egan PJ.Gammadelta T cells:functionalplasticity and heterogeneity.Nat Rev Immunol.2002May；2(5):336-345.
非专利文献5：Nicol AJ,et al.Clinical evaluation of autologousgammadelta T cell-based immunotherapy for metastatic solid tumours.Br JCancer.2011Sep 6；105(6):778-786.
非专利文献6：Kobayashi H,et al.Phase I/II study of adoptive transferofγδT cells in combination with zoledronic acid and IL-2to patients withadvanced renal cell carcinoma.Cancer Immunol Immunother.2011Aug；60(8):1075-1084.
非专利文献7：Tanaka Y,et al.Expansion of humanγδT cells for adoptiveimmunotherapy using a bisphosphonate prodrug.Cancer Sci.2018Mar；109(3):587-599.
发明内容
发明要解决的课题
本发明的目的是提供一种高纯度且大量地制备γδ型T细胞，高效率地向得到的γδ型T细胞导入编码TCR或CAR的外来基因，制造表达功能性TCR或CAR的γδ型T细胞群体的方法。
解决课题的方法
通过以下发明达成本发明的目的。
(1)一种制造表达导入基因的γδ型T细胞群体的方法，包括
(步骤1)在存在选自2-(噻唑-2-基氨基)亚乙基-1,1-双膦酸酯、2-(3-溴吡啶-2-基氨基)亚乙基-1,1-双膦酸酯、2-(5-氟吡啶-2-基氨基)亚乙基-1,1-双膦酸酯、2-(嘧啶-2-基氨基)亚乙基-1,1-双膦酸酯、2-(7-氮杂吲哚-1-基)亚乙基-1,1-双膦酸酯、2-(5-甲基噻唑-2-基氨基)亚乙基-1,1-双膦酸酯、2-(4-苯基噻唑-2-基氨基)亚乙基-1,1-双膦酸酯和2-(嘧啶-4-基氨基)亚乙基-1,1-双膦酸酯的四特戊酰氧基甲基酯衍生物及其药学上可接受的盐的1种以上化合物的条件下培养γδ型T细胞的步骤，
(步骤2)在存在IL-7和IL-15的条件下培养已在步骤1中培养的γδ型T细胞的步骤，以及
(步骤3)向已在步骤2中培养的γδ型T细胞导入基因的步骤。
(2)一种制造表达导入基因的γδ型T细胞群体的方法，包括
(步骤1)在存在2-(噻唑-2-基氨基)亚乙基-1,1-双膦酸四特戊酰氧基甲基酯或其在药学上可接受的盐的条件下培养γδ型T细胞的步骤，
(步骤2)在存在IL-7和IL-15的条件下培养已在步骤1中培养的γδ型T细胞的步骤，
(步骤3)向已在步骤2中培养的γδ型T细胞导入基因的步骤。
(3)根据(2)所述的方法，其中步骤1中的2-(噻唑-2-基氨基)亚乙基-1,1-双膦酸四特戊酰氧基甲基酯或其在药学上可接受的盐的浓度是0.01～1μM。
(4)根据(1)或(2)所述的方法，其中所述γδ型T细胞来自哺乳动物。
(5)根据(4)所述的方法，其中所述哺乳动物是癌症患者或非癌症患者。
(6)根据(5)所述的方法，其中所述癌症选自乳腺癌、肺癌、肝癌、口腔癌、鼻咽癌、头颈部癌、胃癌、食道癌、大肠癌、皮肤癌、恶性黑色素瘤、肾癌、胰脏癌、胆管癌、脑肿瘤、前列腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、结肠直肠癌、膀胱癌、滑膜肉瘤、白血病、恶性淋巴瘤和多发性骨髓瘤。
(7)根据(1)或(2)所述的方法，其特征在于，步骤3中的导入基因的步骤使用DNA载体或RNA载体。
(8)根据(1)或(2)所述的方法，其特征在于，步骤3中的导入基因的步骤使用从质粒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体和逆转录病毒载体中选择的载体。
(9)根据(1)或(2)所述的方法，其特征在于，步骤3中的导入基因的步骤使用逆转录病毒载体。
(10)根据(1)或(2)所述的方法，其中所述基因是编码T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)的基因。
(11)根据(10)所述的方法，其中所述T细胞受体(TCR)从NY-ESO-1p157-165/HLA-A2复合体特异性TCR、HTLV-1p40Taxp11-19/HLA-A2复合体特异性TCR、HTLV-1p40Tax p301-309/HLA-A24复合体特异性TCR和MAGE-A4 p143-151/HLA-A24复合体特异性TCR中选择。
(12)根据(10)所述的方法，其中所述嵌合抗原受体(CAR)从MAGE-A4p230-239/HLA-A2复合体特异性CAR、CEA特异性CAR、GD2特异性CAR和CD19特异性CAR中选择。
(13)一种基因修饰γδ型T细胞群体，其通过(1)至(12)任一项所述的方法得到。
(14)一种医药组合物，其含有(13)所述的基因修饰γδ型T细胞群体和药学上可接受的添加剂。
(15)根据(14)所述的医药组合物，其用于通过自体或同种移植治疗癌症治疗对象。
(16)一种基因修饰γδ型T细胞群体，其具有下述特征，
(ⅰ)表达特异性识别NY-ESO-1p157-165/HLA-A2复合体、HTLV-1p40Taxp11-19/HLA-A2复合体、HTLV-1p40Taxp301-309/HLA-A24复合体或MAGE-A4p143-151/HLA-A24复合体的TCR；
(ⅱ)CD3和NKG2D为阳性；
(ⅲ)产生包含IFN-γ和TNFα的细胞因子和趋化因子；并且
(ⅳ)具有细胞毒活性。
(17)一种基因修饰γδ型T细胞群体，其具有下述特征，
(ⅰ)表达特异性识别MAGE-A4p230-239/HLA-A2复合体、CEA、GD2或CD19的CAR；
(ⅱ)CD3和NKG2D为阳性；
(ⅲ)产生包含IFN-γ和TNFα的细胞因子和趋化因子；并且
(ⅳ)具有细胞毒活性。
(18)根据(16)或(17)所述的基因修饰γδ型T细胞群体，其特征在于所述基因修饰γδ型T细胞群体是使用DNA载体或RNA载体导入了基因的γδ型T细胞群体。
(19)根据(16)或(17)所述的基因修饰γδ型T细胞群体，其特征在于所述基因修饰γδ型T细胞群体是使用从质粒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体和逆转录病毒载体中选择的载体导入了基因的γδ型T细胞群体。
(20)根据(16)或(17)所述的基因修饰γδ型T细胞群体，其特征在于所述基因修饰γδ型T细胞群体是使用逆转录病毒载体导入了基因的γδ型T细胞群体。
(21)根据(16)或(17)所述的基因修饰γδ型T细胞群体，其中所述基因是编码T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)的基因。
(22)一种医药组合物，其包含(16)至(21)任一项所述的基因修饰γδ型T细胞群体。
(23)一种细胞制剂，其包含(16)至(21)任一项所述的基因修饰γδ型T细胞群体。
(24)一种用于治疗癌症患者的(16)至(21)任一项所述的基因修饰γδ型T细胞群体。
(25)一种抗癌剂，其包含(16)至(21)任一项所述的基因修饰γδ型T细胞群体。
(26)一种癌症治疗方法，其特征在于使用(16)至(21)任一项所述的基因修饰γδ型T细胞群体。
(27)一种感染症治疗剂，其包含(16)至(21)任一项所述的基因修饰γδ型T细胞群体。
(28)一种感染症治疗方法，其特征在于使用(16)至(21)任一项所述的基因修饰γδ型T细胞群体。
发明的效果
通过本发明，将从外周血得到的单核细胞用双膦酸酯衍生物刺激后，通过在存在IL-7和IL-15的条件下培养，与在存在IL-2的条件下培养的现有方法相比，可制造大量高纯度的γδ型T细胞。进一步，对通过双膦酸酯衍生物刺激而增殖的γδ型T细胞，例如可使用逆转录病毒载体高效率地导入外来基因。在作为外来基因导入TCR和CAR时，可得到功能性地表达TCR和CAR的γδ型T细胞。
根据本发明，即使少量采血，也可从采取的血液中获得大量的γδ型T细胞，减轻需进行采血的受试者的负担。进一步，可在短期培养中制备足量的通过基因修饰而具有抗原特异性的γδ型T细胞。得到的基因修饰γδ型T细胞示出了较强的抗肿瘤效果，另外未表现出因冻结融化而功能下降，因此可冻结保存。因此，可容易地实施有效的基因修饰γδ型T细胞输注疗法。
附图说明
[图1]是示出将健康人2例(HD1和HD2)的外周血单核细胞分别在存在2-(噻唑-2-基氨基)亚乙基-1,1-双膦酸四特戊酰氧基甲基酯(化合物7)(1μM)、IL-7(25ng/mL)和IL-15(25ng/mL)的条件下培养11天时，γδ型T细胞增殖的图。(A)示出开始培养时(第0天，Day0)和培养11天后(第11天，Day11)，使用流式细胞术对各自的细胞群体进行解析，培养前仅占外周血单核细胞百分之几的γδ型T细胞在培养后高纯度增殖的结果。(B)示出从3X106个外周血单核细胞开始培养，随着时间推移测定细胞数量的结果。作为比较，代替L-7和IL-15，添加IL-2(100IU/mL或300IU/mL)进行培养。
[图2]将健康人2例(HD1和HD2)的外周血单核细胞分别在第0天用化合物7(1μM)刺激，接着在第4和第5天使用逆转录病毒载体导入特异性识别HLA-A2和NY-ESO-1p157-165肽(SLLMWITQC)的复合体的NY-ESO-1特异性TCR，在存在IL-7(25ng/mL)和IL-15(25ng/mL)的条件下培养11天。本图示出使用特异四聚体用流式细胞术解析得到的γδ型T细胞中导入TCR的表达率的结果。
[图3]是示出测定由导入了NY-ESO-1特异性TCR的γδ型T细胞产生细胞因子(IFN-γ和TNFα)和表达CD107a的结果的图。作为目标细胞，使用向HLA-A2阳性T2细胞株添加NY-ESO-1p157-165肽的细胞。示出导入了TCR的γδ型T细胞抗原特异性表达I FN-γ、TNFα和CD107a的结果。
[图4]是示出导入了特异性识别HLA-A2和NY-ESO-1p157-165肽的复合体的NY-ESO-1特异性TCR的γδ型T细胞识别HLA-A2阳性NY-ESO-1抗原阳性细胞株SK-MEL-37，产生细胞因子IFN-γ的结果的图。作为比较的HLA-A2阳性NY-ESO-1抗原阴性细胞株MEL72没有产生细胞因子。
[图5A]是示出导入了特异性识别HLA-A24和来自HTLV-1病毒抗原p40Tax的肽(SFHSLHLLF)的复合体(HTLV-1p40Taxp301-309/HLA-A24复合体)的TCR的γδT细胞不识别HLA-A24阴性HTLV-1阳性细胞株ILT-#37，而特异性识别HLA-A24阳性HTLV-1阳性细胞株ILT-Hod的图。图5A是示出测定IFN-γ产生量的结果的图。作为阳性对照，使用添加了来自p40Tax的肽的HLA-A24阳性细胞株T2A24(T2A24-p40)，另外，作为阴性对照，使用添加了NY-ESO-1p157-165肽的T2A24细胞株(T2A24-ESO)。
[图5B]是示出导入了特异性识别HLA-A24和来自HTLV-1病毒抗原p40Tax的肽(SFHSLHLLF)的复合体(HTLV-1p40Taxp301-309/HLA-A24复合体)的TCR的γδT细胞不识别HLA-A24阴性HTLV-1阳性细胞株ILT-#37，而特异性识别HLA-A24阳性HTLV-1阳性细胞株ILT-Hod的图。图5B是示出测定细胞毒活性的结果的图。相对于作为目标的ILT-Hod细胞株或ILT-#37细胞株1X104个，加入1X105个、3X104个，1X104个或3.3X103个(E/T比分别为10:1、3:1、1:1或0.3：1)TCR导入γδT细胞进行共培养。
[图6]将健康人外周血单核细胞在第0天用化合物7(1μM)刺激，接着在第4天和第5天使用逆转录病毒载体，导入特异性识别HLA-A2和MAGE-A4p230-239肽(GVYDGREHTV)的复合体的CAR，在存在IL-7(25ng/mL)和IL-15(25ng/mL)的条件下培养11天。本图示出使用特异四聚体用流式细胞术解析得到的γδ型T细胞中导入的CAR的表达率的结果。
[图7]将健康人外周血单核细胞在第0天用化合物7(1μM)刺激，接着在第4天和第5天使用逆转录病毒载体，导入特异性识别GD2(二唾液酸神经节苷脂2，disialoganglioside2)的CAR，在存在IL-7(25ng/mL)和IL-15(25ng/mL)的条件下培养11天。本图示出使用特异四聚体用流式细胞术解析得到的γδ型T细胞中导入的CAR的表达率的结果，以及共培养导入了GD2特异性CAR基因的γδ型T细胞和GD2阳性目标肿瘤细胞株AS，解析IFN-γ产生的结果。本图的上图示出对照γδ型T细胞的相关结果，本图的下图示出导入了GD2特异性CAR基因的γδ型T细胞的相关结果。
[图8]将健康人外周血单核细胞在第0天用化合物7(1μM)刺激，接着在第4天和第5天使用逆转录病毒载体，导入特异性识别CD19的CAR，在存在IL-7(25ng/mL)和IL-15(25ng/mL)的条件下培养11天。本图示出使用特异四聚体用流式细胞术解析得到的γδ型T细胞中导入的CAR的表达率的结果，以及共培养导入了CD19特异性CAR基因的γδ型T细胞和CD19阳性肿瘤细胞(NALM6)，解析IFN-γ产生的结果。本图的上图示出对照γδ型T细胞的相关结果，本图的下图示出导入了GD2特异性CAR基因的γδ型T细胞的相关结果。
[图9]是示出导入了特异性识别HLA-A2和MAGE-A4p230-239肽(GVYDGREHTV)的复合体的CAR的γδ型T细胞抗原特异性识别肿瘤细胞株的图。是示出特异性识别HLA-A2阳性MAGE-A4阳性细胞株(SK-MEL-37和NW-MEL-38)的图。作为阳性对照，使用添加了MAGE-A4p230-239肽的HLA-A2阳性T2细胞株(T2-MAGE)，另外作为阴性对照，使用添加了NY-ESO-1p157-165肽的T2细胞株(T2-ESO1)。[图10A]是示出同时表达肿瘤特异性TCR和CD8αβ的γδ型T细胞的抑制肿瘤作用的图。图10A是示出γδ型T细胞与肿瘤细胞共培养一晚，通过细胞内染色(intracellular staining，ICS)测定IFN-γ和CD107a产生的结果的图。(B)是示出在移植了肿瘤细胞的NOG小鼠中，将同时表达肿瘤特异性TCR和CD8αβ的γδ型T细胞通过输注产生的抑制肿瘤效果以肿瘤体积测定的结果的图。
[图10B]是示出同时表达肿瘤特异性TCR和CD8αβ的γδ型T细胞的抑制肿瘤作用的图。图10B是示出在移植了肿瘤细胞的NOG小鼠中，将通过输注同时表达肿瘤特异性TCR和CD8αβ的γδ型T细胞产生的抑制肿瘤效果以肿瘤体积测定的结果的图。
[图11A]是示出导入了肿瘤特异性TCR的γδ型T细胞产生抑制肿瘤作用的图。图11A是示出通过生物成像使NOG小鼠中的肿瘤形成可视化的结果的图。
[图11B]是示出导入了肿瘤特异性TCR的γδ型T细胞产生抑制肿瘤作用的图。图11B是用平均辐射亮度示出NOG小鼠中的肿瘤形成的图。
[图12]是示出解析冻结融化对经化合物7刺激的基因修饰γδ型T细胞的功能的影响的图。(A)是示出没有冻结的细胞的结果的图。(B)是示出进行了冻结融化的细胞的结果的图。
[图13A]是示出化合物7对γδ型T细胞增殖的作用与唑来膦酸相比较的结果的图。图13A是示出对来自各受试者的外周血单核细胞的作用的图。
[图13B]是示出化合物7对γδ型T细胞增殖的作用与唑来膦酸相比较的结果的图。图13B是示出平均值的图。
[图14]是示出化合物7对γδ型T细胞纯度的作用与唑来膦酸相比较的结果的图。(A)是示出CD3阳性细胞中的γδ型T细胞频度(Vd2/CD3)的图。(B)是示出淋巴细胞部分(P1)中的γδ型T细胞频度(Vd2/P1)的图。
具体实施方式
〔双膦酸酯衍生物〕
双膦酸是焦磷酸的类似物，是焦磷酸骨架P-O-P中的O(氧原子)用C(碳原子)置换后的化合物(P-C-P)。含氮双膦酸是双膦酸分子中具有N(氮原子)的化合物。本发明中使用的双膦酸酯衍生物是表1记载的含氮双膦酸的特戊酰氧基甲基(pivaloyloxymethyl，POM)酯或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物。这些化合物记载于专利文献1(WO2016/098904)中，可基于该记载进行制造，但除此之外，也可使用本领域技术人员已知的合成方法进行合成。
[表1]
γδ型T细胞可在存在表1所记载的含氮双膦酸特戊酰氧基甲基酯中的1种以上化合物的条件下进行培养，但优选使用2-(噻唑-2-基氨基)亚乙基-1,1-双膦酸四特戊酰氧基甲基酯(化合物7)或其药学上可接受的盐。药学上可接受的盐是药理学和制剂学上可接受的一般的盐，是即使添加至细胞培养液，对细胞也不示出毒性的盐。
作为骨吸收抑制剂使用的唑来膦酸(zoledronic acid)等含氮双膦酸在细胞内阻碍法尼基焦磷酸合酶(farnesyl diphosphate synthase，FDPS)(van Beek E,etal.Biochem Biophys Res Commun.1999Oct 14；264(1):108-111)。含氮双膦酸对FDPS的阻碍使作为生物合成途径中的FDPS上游代谢物的异戊烯基焦磷酸的水平上升，其结果会刺激γδ型T细胞(Wang H,J Immunol.2011Nov 15；187(10):5099-5113和Tanaka Y,SciRep.2017Jul 20；7(1):5987)。本说明书表1所列的化合物被细胞吸收后，通过细胞内的酯酶，特戊酰氧基甲基被水解而脱离，成为游离酸。该游离酸在γδ型T细胞内阻碍FDPS，其结果是会刺激γδ型T细胞(专利文献1，非专利文献7和Tanaka Y,Sci Rep.2017Jul 20；7(1):5987)。
含氮双膦酸在游离酸的状态下向细胞内的渗透性低。本说明书表1所列的化合物是特戊酰氧基甲基(POM)酯，赋予向细胞的渗透性。表1所列的化合物优选每1分子被4个POM基取代，但只要可维持向细胞内的渗透性，可以每1分子含氮双膦酸被1～3个POM基取代。进一步，只要维持向细胞的渗透性，且通过细胞内的酯酶水解，可以是其他酯。例如，可举例正丁氧基甲基酯衍生物和正庚氧基甲基酯衍生物。上述含氮双膦酸酯衍生物可以每1分子具有1～4个酯基，但优选具有4个酯基。
〔γδ型T细胞的培养〕
本发明使用的γδ型T细胞来自从哺乳动物，特别是癌症患者或非癌症患者的外周血、脐带血或癌组织的活检组织分离的单核细胞。γδ型T细胞优选可通过本领域技术人员周知的密度离心分离法从全血中得到。密度离心分离法可举例使用Ficoll、Lymphoprep(注册商标)等淋巴细胞分离溶液的方法，但不限于此。进一步，可以通过FACS(荧光活化细胞分选，fluorescence-activated cell sorting)法或MACS(磁性细胞分选，magnetic-activated cell sorting)法分离细胞。
作为采集单核细胞的对象的癌症患者所患癌症种类，可以举例乳腺癌、肺癌、肝癌、口腔癌、鼻咽癌、头颈部癌、胃癌、食道癌、大肠癌、皮肤癌、恶性黑色素瘤、肾癌、胰脏癌、脑肿瘤、前列腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、结肠直肠癌、膀胱癌、滑膜肉瘤、脂肪肉瘤、白血病、恶性淋巴瘤及多发性骨髓瘤，但不限于此。
γδ型T细胞通过使用存在本说明书表1所列的含氮双膦酸POM酯化合物、以及IL-7和IL-15的细胞培养液进行培养，从而使其从外周血单核细胞、脐带血单核细胞或来自组织的单核细胞增殖。IL-7和IL-15只要是其各自的变体或片段，与各自的受体结合而发挥生物活性，则包括在本发明的范围内。细胞培养液可举例RPMI 1640培养液，Yssel培养液等，但不限于此。细胞培养液中例如可以以0.1～20％(v/v)的量添加胎牛血清、人AB血清、自体血浆、人血白蛋白、血清替代品。可以向细胞培养液中以0.01～1μM的浓度添加所述含氮双膦酸POM酯。可根据使用的批次的比活性改变向细胞培养液中添加IL-7和IL-15的浓度，但任一细胞因子都可以以5～100ng/mL的浓度添加。
通过在存在所述含氮双膦酸POM酯的条件下，在5％CO2，37℃环境下培养1～7天来刺激γδ型T细胞。IL-7和IL-15可以与所述含氮双膦酸POM酯同时添加至培养液，或也可以在添加含氮双膦酸POM酯1～5天后添加。
〔向γδ型T细胞导入基因〕
可在存在所述含氮双膦酸POM酯、IL-7和IL-15的条件下培养来自外周血或组织的单核细胞，对所得到的γδ型T细胞使用本领域技术人员周知的基因导入法导入基因。可在培养γδ型T细胞期间的任意时间点进行基因导入，但优选在开始培养后的翌日～14天进行。向γδ型T细胞导入基因的方法可举例脂质体转染法、磷酸钙共沉淀法、DEAE-右旋糖酐法、电穿孔法、显微注射法、质粒载体法、病毒载体法等。作为载体可使用DNA载体或RNA载体。病毒载体可举例慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体，但优选逆转录病毒载体。
在使用病毒载体向γδ型T细胞导入基因时，可使用提高病毒感染效率的功能性物质。例如，可举例具有与纤连蛋白、纤连蛋白片段、多肽等病毒载体结合的活性的功能性物质。特别是在使用逆转录病毒载体时，优选使用作为具有肝素结合部位的纤连蛋白片段的RetroNectin(注册商标)或Vecofusin-1(注册商标)。上述功能性物质可以在固定于适当的固相(例如板、培养皿、离心管、微型管等)或载体(微珠等)上的状态下使用。
导入γδ型T细胞的基因可举例NY-ESO-1特异性TCR、HTLV-1Tax特异性TCR、MAGE-A4特异性TCR、CEA特异性CAR、GD2特异性CAR、CD19特异性CAR等，但不限于此。用于TCR表达的逆转录病毒载体构造是在包含增强子、启动子的两端的LTR(长末端重复序列，LongTerminal Repeat)之间插入各特异性TCR的α链基因和β链基因的构造。用于表达CAR的逆转录病毒载体构造是在包含增强子、启动子的两端的LTR之间，继前导序列后，连接作为特异性识别HLA-A2和MAGE-A4p230-239肽的复合体的抗体成分的VH和VL，其后插入CL、CD28TM和胞内段的构造。为了表达导入每个TCR和CAR，可以使用其他手段，例如可以使用慢病毒载体表达导入相应的TCR和CAR。
在使用载体将基因导入γδ型T细胞后，该细胞的基因表达可以通过流式细胞术、RT-PCR、Northern杂交、蛋白质印迹法、ELISA、荧光免疫染色等本领域技术人员所公知的方法进行确认。
导入了TCR基因或CAR基因的γδ型T细胞在细胞膜上表达对应的TCR或CAR。若这些TCR和CAR识别的特异性抗原分别与TCR和CAR结合，则基因修饰γδ型T细胞被激活，观察到干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNFα)等细胞因子产生和CD107a等细胞毒活性分子表达等。
如上所述得到的基因修饰γδ型T细胞对表达特异性识别被该细胞表达的TCR或CAR的抗原的细胞表现出特异性的细胞毒性。因此，可以向患者施予基因修饰γδ型T细胞群体以治疗或预防与表达所述抗原的细胞相关的疾患，例如病毒感染症、细菌感染症、真菌感染症、原虫感染症、或癌症等疾患。向患者的施予优选注射或输注。施予路径优选静脉内施予，但也可以通过向生物体组织内直接注射而施予。另外，为了不诱发GVHD(graft-versus-host disease：移植物抗宿主病)，不限于自体移植，可以同种移植。
在所述抗原是癌特异性抗原时，包含本发明的基因修饰γδ型T细胞群体的细胞制剂或医药组合物可以作为抗癌剂使用。癌特异性抗原可举例NY-ESO-1、MAGE-A4、CEA(癌胚抗原)等。上述表达癌特异性抗原的癌的种类例如可举例乳腺癌、肺癌、胃癌、食道癌、胆管癌、恶性黑色素瘤、前列腺癌、卵巢癌、滑膜肉瘤、脂肪肉瘤、多发性骨髓瘤。B细胞中表达的CD19可以作为抗原，也可以作为对B细胞肿瘤的抗癌药。癌特异性抗原可举例GD2(二唾液酸神经节苷脂2，disialoganglioside2)。在神经母细胞瘤中表达的GD2不限于在神经母细胞瘤中，而是在脑肿瘤、视网膜母细胞瘤、肺小细胞癌、恶性黑色素瘤等起源于其他神经外胚层的恶性肿瘤中也广泛地表达。本发明的医药组合物可用于治疗或预防上述癌症。在所述抗原是感染症特异性抗原时，包含本发明的基因修饰γδ型T细胞群体的细胞制剂或医药组合物可作为感染症引起的肿瘤性疾患或感染症治疗剂使用。感染症特异性抗原可举例来自HTLV-1(人类T细胞白血病病毒1型)的抗原Tax等。表达上述感染症特异性抗原的感染症或肿瘤性疾患例如可举例HTLV-1相关的脊髓病、HTLV-1葡萄膜炎、ATL(成人T细胞白血病淋巴瘤)。本发明的医药组合物可用于治疗或预防上述感染症。
本发明的细胞制剂或医药组合物可以包含药学上允许的添加剂。该添加剂例如可举例细胞培养液、磷酸缓冲食盐水等。
实施例
接下来举出实施例对本发明进行详细说明，但本发明不限于此。
实施例1
〔γδ型T细胞的增殖〕
通过菲可(Ficoll)从2名健康人的外周血制备单核细胞。在进行采血时，基于三重大学医学部研究伦理的规定，征得了本人的同意。将在包含10％人AB血清的Yssel培养液中调整为1.5×106个细胞/mL的单核细胞在存在2-(噻唑-2-基氨基)亚乙基-1,1-双膦酸四特戊酰氧基甲基酯(化合物7，1μM)的条件下培养1天后，添加25ng/mL的IL-7(MiltenyiBiotec社，产品编号170-076-111)和25ng/mL的IL-15(Miltenyi Biotec社，产品编号170-076-114)，进一步培养10天。对单核细胞群体中的γδ型T细胞用流式细胞术(FACSCANTOⅡ，Becton Dickinson社)进行γδT细胞的频度解析。其结果表明，就供体1(HD1)和供体2(HD2)而言，开始培养时(第0天)的γδ型T细胞的比例分别为2.7％和1.7％，但通过在存在化合物7、IL-7和IL-15的条件下培养，在第11天(第11天)分别为97.1％和94.5％，大部分的细胞高纯度地增殖为γδ型T细胞(图1A)。一般而言，健康人外周血中含有1～3％的γδ型T细胞，但可从1.5mL的外周血制备1×108个左右的高纯度γδ型T细胞群体。
将从3mL外周血中采集的3×106个单核细胞在存在化合物7(1μM)、IL-7(25ng/mL)和IL-15(25ng/mL)的条件下培养13天。培养液使用包含10％人AB血清的Yssel培养液。其结果是确认了在培养后约8天起细胞急速增殖，培养后13天细胞数为3×108个，细胞数变为约5000倍(图1B)。明确了通过用化合物7刺激γδ型T细胞使其增殖，并使用包含IL-7和IL-15的培养液培养，可使高纯度的γδ型T细胞群体高效率地增殖。
作为比较，将培养液中的IL-7和IL-15换为IL-2(PROLEUKIN，ChironTherapeutics社)培养单核细胞。其结果表明，IL-7和IL-15促进细胞增殖的效果比单独使用IL-2(100IU/mL和300IU/mL)的促进细胞增殖的效果好(图1B)。另外，即使进一步追加IL-2也没有进一步增加IL-7和IL-15的促进细胞增殖的效果。
实施例2
〔制造导入了外来基因(TCR)的γδ型T细胞群体〕
在第0天，将使用菲可从1.5mL健康人外周血中采集的单核细胞1.5×106个在存在化合物7(1μM)的条件下开始刺激培养。在第1天，向培养液添加IL-7和IL-15以使最终浓度分别为25ng/mL。在第4天和第5天，在存在RetroNectin(注册商标，Takara Bio)的条件下，使用用于特异性识别HLA-A2和NY-ESO-1p157-165肽(SLLMWITQC)的复合体的NY-ESO-1特异性TCR的表达的逆转录病毒载体进行感染导入。之后也使用包含IL-7和IL-15的培养液继续培养，探讨第11天时导入TCR的表达效率。图2示出了结果。图2显示，高效率地得到了导入了TCR基因的γδ型T细胞。得到的γδ型T细胞为与TCR形成复合体的CD3和受体NKG2D(自然杀伤细胞2族成员D，natural-killer group 2，member D)阳性。
确认了通过NY-ESO-1特异性TCR表达逆转录病毒载体导入了TCR的γδ型T细胞通过与添加了NY-ESO-1p157-165(SLLMWITQC)肽的HLA-A2阳性细胞株T2的共培养(4小时)，产生细胞因子IFN-γ和TNFα，并且表达作为功能性细胞毒活性的指标的CD107a(图3)。氨基酸序列中的氨基酸以一个字母表示。
实施例3
〔导入了TCR基因的γδ型T细胞抗原特异性识别肿瘤细胞株〕
探讨了导入了HLA-A*02:01限制性特异性识别NY-ESO-1p157-165肽的TCR基因的γδ型T细胞的肿瘤识别性。图4示出了结果。将作为NY-ESO-1阳性HLA-A*02:01阳性细胞株的SK-MEL-37细胞株和所述γδ型T细胞共培养(4小时)后，由细胞内IFN-γ染色法进行细胞内细胞因子染色确认了产生IFN-γ，但在与作为NY-ESO-1阴性HLA-A*02:01阳性细胞株的Mel72的共培养中，未观察到产生IFN-γ。作为阳性对照，使用添加了NY-ESO-1p157-165肽的HLA-A2阳性T2细胞株(T2-ESO1)，另外作为阴性对照，使用添加了MAGE-A4p230-239肽的T2细胞株(T2-MAGE)。表明制备的导入了TCR的γδ型T细胞是功能性的，抗原特异性识别肿瘤细胞。
实施例4
〔导入了HTLV-1病毒抗原p40Tax特异性TCR的γδT细胞识别HLA-A*24:02和p40Tax阳性细胞株〕
探讨了通过使用逆转录病毒载体，导入了HLA-A*24:02限制性特异性识别来自HTLV-1病毒抗原p40Tax的肽(SFHSLHLLF)的TCR的γδ型T细胞的抗原识别性。图5示出了结果。将作为HLA-A*24:02阳性HTLV-1阳性细胞株的ILT-Hod细胞株和所述γδ型T细胞共培养(18小时)后，通过ELISA法确认了培养上清中产生了IFN-γ，但在与作为HLA-A*24:02阴性HTLV-1阳性细胞株的ILT-#37细胞株的共培养中，未观察到产生IFN-γ(图5A)。作为阳性对照，使用添加了来自p40Tax的肽的HLA-A24阳性T2A24细胞株(T2A24-p40)，另外作为阴性对照，使用添加了NY-ESO-1p157-165肽的T2A24细胞株(T2A24-ESO)。另外，改变所述γδ型T细胞和ILT-Hod细胞株或ILT-#37细胞株的细胞数比例进行共培养后，确认了对于ILT-Hod细胞株，依赖于E/T比的强细胞毒性(图5B)。由此，表明从用化合物7刺激的γδT细胞制备的导入TCR的γδ型T细胞是功能性的，抗原特异性识别并损伤肿瘤细胞。
实施例5
〔制造导入了外来基因(CAR)的γδ型T细胞群体〕
近年来，使用CAR基因的针对血液类肿瘤的CAR疗法被应用于临床。因此，探讨了CAR是否可导入γδ型T细胞。在第0天将使用菲可从1.5mL健康人外周血中采集的1.5×106个单核细胞在存在化合物7(1μM)的条件下开始刺激培养(第0天)。在第1天，向培养液中添加IL-7和IL-15以使最终浓度分别为25ng/mL。在第4天和第5天，在存在RetroNectin的条件下，使用用于特异性识别HLA-A*02:01和MAGE-A4p230-239肽(GVYDGREHTV)的复合体的CAR的表达的逆转录病毒载体进行感染导入。之后也使用包含IL-7和IL-15的培养液继续培养，探讨第11天时导入CAR的表达效率。
图6示出了结果。由图6可知，高效率地得到了导入了CAR基因的γδ型T细胞。另外，得到的γδ型T细胞为CD3和NKG2D阳性。
同样地，在第4天和第5天，在存在RetroNectin的条件下，使用用于特异性识别GD2(二唾液酸神经节苷脂2，disialoganglioside2)或CD19的CAR的表达的逆转录病毒载体进行感染导入，之后也使用包含IL-7和IL-15的培养液继续培养，探讨第11天时导入CAR的表达效率。
图7示出在导入了特异性识别GD2的CAR基因时，GD2特异性CAR的表达的结果，图8示出在导入了特异性识别CD19的CAR基因时，CD19特异性CAR的表达的结果。由图7和图8可知，与对照相比，高效率地得到导入了作为目标的GD2或CD19的CAR基因的γδ型T细胞。将导入了GD2特异性CAR基因的γδ型T细胞与GD2阳性的目标肿瘤细胞株AS共培养后，与对照相比，确认了导入了GD2特异性CAR的γδ型T细胞中加剧产生细胞因子IFN-γ。同样地，将导入了CD19特异性CAR基因的γδ型T细胞与CD19阳性肿瘤细胞(NALM6)共培养后，与对照相比，确认了导入了CD19特异性CAR的γδ型T细胞中加剧产生细胞因子IFN-γ。
实施例6
〔导入了CAR基因的γδ型T细胞抗原特异性识别肿瘤细胞株〕
探讨了导入了HLA-A*02:01限制性识别MAGE-A4p230-239(GVYDGREHTV)的CAR基因的γδ型T细胞的肿瘤识别性。图9示出了结果。将作为MAGE-A4阳性HLA-A*02:01阳性细胞株的SK-MEL-37细胞株和NW-MEL-38细胞株共培养(4小时)后，通过流式细胞术进行解析，确认了作为功能性细胞毒活性指标的CD107a的表达，但在作为MAGE-A4阴性HLA-A*02:01阳性细胞株的Mel72细胞株和HCT116细胞株的共培养中，示出CD107a的表达低。作为阳性对照，使用添加了MAGE-A4p230-239肽的HLA-A2阳性T2细胞株(T2-MAGE)，另外作为阴性对照，使用添加了NY-ESO-1p157-165肽的T2细胞株(T2-ESO1)。
实施例7
〔导入了肿瘤特异性TCR且表达CD8αβ的γδ型T细胞的抑制肿瘤作用〕
利用导入了HLA-A*02:01限制性特异性识别NY-ESO-1p157-165肽的TCR(G50 TCR)基因的逆转录病毒载体和同时表达人CD8α链和CD8β链的逆转录病毒载体感染γδ型T细胞，制备表达TCR(G50 TCR)和作为增强TCR刺激的共刺激分子起作用的CD8αβ的γδ型T细胞，探讨该细胞抑制肿瘤的作用。为了进行比较，制备了对照细胞(NGMC，非基因修饰T细胞，Non-Gene Modified T Cells)、仅表达G50 TCR的细胞和仅表达CD8αβ的细胞。比较将这些γδ型T细胞与T2-ESO1细胞株、T2-MAGE细胞株、NW-MEL-38细胞株和HCT116细胞株共培养时IFN-γ和CD107a的产生。其结果是，IFN-γ和CD107a的产生在与作为添加了NY-ESO-1p157-165肽的T2细胞株的T2-ESO1或作为HLA-A2阳性MAGE-A4阳性细胞株的NW-MEL-38共培养时加剧，与仅导入G50TCR的γδ型T细胞相比，在导入了G50 TCR且表达CD8αβ的γδ型T细胞中观察到了更强的加剧作用(图10A)。
在第0天向NOG小鼠的左背部和右背部的皮下分别移植4×106个肿瘤细胞HCT116和NW-MEL-38，形成肿瘤。接着，在第7天输注1×107个上述4种γδ型T细胞，测定肿瘤的大小。其结果是，在移植了与γδ型T细胞的共培养中未诱导IFN-γ和CD107a产生的HCT116细胞株的小鼠中，无论输注何种γδ型T细胞，也未观察到抑制肿瘤的效果(图10B左图)。但是，就移植了诱导了IFN-γ和CD107a产生的NW-MEL-38细胞株的小鼠而言，在输注了导入了G50TCR且表达CD8αβ的γδ型T细胞的小鼠中，确认了显著的抑制肿瘤的效果，表明肿瘤特异性TCR和CD8αβ的同时表达对抑制肿瘤是有效的(图10B右图)。
实施例8
〔使用NOG小鼠的病态模型的制作和该模型中导入了肿瘤特异性TCR的γδ型T细胞的抑制肿瘤作用〕
制备导入了荧光素酶基因的HLA-A*24:02阳性HTLV-1阳性细胞株(TL-Su)，接种至NOG小鼠，通过生物成像使肿瘤形成可视化。导入了肿瘤特异性TCR的γδ型T细胞除了使用的逆转录病毒载体是表达HLA-A*24:02限制性特异性识别来自HTLV-1病毒抗原p40Tax的肽(SFHSLHLLF)的TCR的逆转录病毒载体外，通过实施例2所述的方法进行制造。作为对照细胞，使用了NGM-g/d-T细胞。
向NOG小鼠的皮下移植5×105个TL-Su细胞株(第-7天)。7天后，向小鼠静注5×106个上述基因修饰γδ型T细胞或NGM-g/d-T细胞(第0天)。之后，在1天后(第1天)、1周后(1周)、2周后(2周)、3周后(3周)、4周后(4周)及6周后(6周)通过生物成像使肿瘤可视化。图11(A)示出了结果。示出在代替细胞施予磷酸缓冲生理食盐水(PBS)的小鼠中，随着时间推移肿瘤增大。即使是在施予NGM-g/d-T细胞的情况下，肿瘤也增大，未观察到抑制肿瘤的作用。但是，在施予了上述基因修饰γδ型T细胞的小鼠中，几乎没有观察到肿瘤的增大，3周以后完全没有观察到肿瘤。上述基因修饰γδ型T细胞在病态模型NOG小鼠中，示出了抑制肿瘤增大的同时，使肿瘤缩小的治疗效果。图11(B)示出小鼠中的平均辐射亮度(radiance)。可知在PBS施予群和NGM-g/d-T细胞施予群中，平均辐射亮度随时间推移而增大，但基因修饰γδ型T细胞施予群中几乎没有观察到平均辐射亮度(图11B)。
实施例9
〔冻结融化对用化合物7刺激的基因修饰γδ型T细胞的功能的影响〕
为了便于进行输注基因修饰γδ型T细胞的疾患治疗，在输送和保存该细胞时需冻结处理。并且，为了使输注疗法具有实用性，就必须避免由于冻结导致的细胞功能下降。因此，探讨在存在化合物7(参见表1)的条件下进行细胞增殖，并进一步导入了外来基因的γδ型T细胞的功能是否受到冻结的影响。
在第0天，在存在化合物7(1μM)的条件下开始刺激培养使用菲可从健康人外周血采集的单核细胞。在第1天，向培养液中加入IL-7和IL-15以使最终浓度分别为25ng/mL。在第4天和第5天，在存在RetroNectin的条件下，使用逆转录病毒载体导入特异性识别HLA-A2和NY-ESO-1p157-165肽(SLLMWITQC)的复合体的NY-ESO-1特异性TCR(G50 TCR)。之后也使用包含IL-7和IL-15的培养液继续培养。在第12天冻结细胞，在次日第13天融化，分析细胞功能。为了进行比较，不冻结细胞，在第13天解析细胞功能。图12示出了结果。通过流式细胞术进行解析的结果表明，在进行了冻结融化的细胞(图12B上图)和未进行冻结的细胞(图12A上图)之间，导入的NY-ESO-1特异性TCR基因的表达量的几乎没有差异。另外，将基因修饰γδ型T细胞与T2-ESO1细胞株、T2-MAGE细胞株、SK-MEL-37细胞株、NW-MEL-38细胞株、MEL72和HCT116细胞株进行共培养，解析基因修饰γδ型T细胞的冻结对产生CD107a的影响。其结果表明，在进行了冻结融化的细胞(图12B下图)和未进行冻结的细胞(图12A下图)之间，针对HLA-A2和NY-ESO-1p157-165肽(SLLMWITQC)的复合体的抗原特异性几乎没有差异。通过以上结果，表明用化合物7刺激培养的基因修饰γδ型T细胞的功能不受冻结的影响。
实施例10
〔在γδ型T细胞的增殖及γδ型T细胞的纯度上化合物7和唑来膦酸的作用比较〕
唑来膦酸(Zometa)是具有下述结构的化合物，在含氮双膦酸方面与化合物7(参见表1)相同。因此，探讨了以γδ型T细胞的增殖和增殖后得到的γδ型T细胞的纯度作为指标，化合物7相对于对唑来膦酸的有用性。
从健康人(n＝8，HD1～HD8)分2次试验(各试验n＝4)采集外周血单核细胞。向24孔板的各孔添加1.5×106个采集的外周血单核细胞，用包含含有化合物7(1μM)或唑来膦酸(5μM)的10％人AB血清的改良yssel’s培养液(1.5mL)开始刺激培养(第0天)。接着，在第1天添加IL-2(300U/mL)。IL-2在既有报告(非专利文献5和6)中是用于γδ型T细胞增殖的细胞因子。在第6天，将1孔的细胞作2倍稀释至2孔，同时计数细胞数。在第7天，将2孔的细胞作2倍稀释至4孔，同时进一步添加IL-2(300U/mL)。在第8天，将一半(约3mL)的细胞作6倍稀释至18mL，在T75烧瓶中培养。在第8天和第11天，计数细胞数以及通过流式细胞术的解析对细胞纯度进行测定。
图13A示出了就从各受试者得到的外周血单核细胞而言，化合物7(记为PTA)和唑来膦酸(Zometa)对细胞增殖随时间变化的作用。确认了在第8天，化合物7和唑来膦酸对细胞像增殖的效果几乎没有差异。但是，在第11天，确认了在试验1(Experiment 1)的受试者HD1～HD4的所有细胞中，与唑来膦酸(Zometa)相比，化合物7(PTA)的细胞增殖刺激作用更强。另外，在试验2(Experiment 2)中，在受试者HD8的细胞中，化合物7(PTA)的细胞增殖刺激作用比唑来膦酸(Zometa)弱，但在受试者HD5的细胞中相等，另外在受试者HD6和HD7的细胞中，化合物7(PTA)的作用优于唑来膦酸(Zometa)。图13B总结了在第11天的试验1和试验2的结果，示出平均±标准偏差(n＝8)。表明化合物7(PTA)与唑来膦酸(Zometa)相比，在γδ型T细胞的增殖上显著地优异(p＝0.008，t检验)。
接着，在第8天和第11天，通过计数细胞数以及流式细胞术的解析对细胞纯度进行测定。表明就CD3阳性细胞中的γδ型T细胞频度(Vd2/CD3)而言，在第8天和第11天，与唑来膦酸(Zometa)处理群相比，化合物7(PTA)处理群均显著地较高(图14A)。另外，关于通过流式细胞术解析的淋巴细胞部分(P1)中的γδ型T细胞频度(Vd2/P1)，在第8天和第11天，与唑来膦酸(Zometa)处理群相比，化合物7(PTA)处理群显著地较高(图14B)。综上，表明化合物7(PTA)与唑来膦酸(Zometa)相比，在得到纯度高的γδ型T细胞方面更优异。另外，图14中的显著性检验使用了t检验。
试验例
〔材料和方法〕
1.淋巴细胞的制备
人体淋巴细胞是通过从来自健康供体提供的血液，使用Ficoll-Paque(注册商标)PLUS(GE Healthcare，商品编号17-1440-03)分离PMBC(外周血单个核细胞，PeripheralBlood Mononuclear Cells)得到的。本研究使用的人体外周血等送检样品的采集和解析遵循赫尔辛基宣言进行，全部按照三重大学医学部研究伦理委员会批准的方案，征得受试者本人的书面同意而实施。采集的送检样品进行了加密以无法识别特定本人，并保存于装有防盗措施的冰箱和液氮罐中。受试者个人信息被匿名化，为了不向外部泄露个人隐私和基因解析结果，实施了严格的措施和处置。
2.向细胞导入基因
使用逆转录病毒载体向γδ型T细胞导入TCR/CAR基因。通过以20μg/mL溶解于生物学制剂基准血液保存液A液(ACD-A液，TERUMO)中的RetroNectin(注册商标)(Takara Bio)，以500mL/孔并在4℃下涂布悬浮细胞用多孔盘16小时或在25℃下涂布2小时。向该悬浮细胞用多孔盘以1mL/孔添加逆转录病毒载体的病毒液，通过离心分离(2000×g，2h，32℃)进行预处理(preloading)。接着，用包含1.5％人血清白蛋白(HSA)的磷酸缓冲生理食盐水(PBS)1mL 2次洗涤各孔，以3.8×105个以下/0.95mL/孔向其播种淋巴细胞，通过离心分离(1000×g，32℃，10分钟)使细胞沉降。之后进行显微镜检查，在存在指定的细胞因子(IL-2100IU/mL或300IU/mL，或IL-7 25ng/mL和IL-15 25ng/mL)的条件下，在37℃、5％CO2的环境下的培养器中培养1天。24小时后，将细胞稀释4/3倍，使用全量，以与第1次相同的方法进行第2次的基因导入。之后继续培养，4小时后用6.8mL培养液稀释，再次在37℃、5％CO2的环境下培养。非基因修饰细胞(NGMC，Non-Gene Modified T Cells)适用与制备基因导入细胞时相同的方法，通过在同样的细胞因子存在的条件下，培养6日以上进行制备。
向使用了逆转录病毒的人体外周血单核细胞导入肿瘤抗原特异性TCR的试验得到了三重大学重组DNA实验审查委员会和三重大学医学部研究伦理委员会的批准。上述试验在三重大学认可的P2级研究室中进行。
3.流式细胞术
通过BD FACS Canto(注册商标)Ⅱ流式细胞仪(Becton Dickinson社)对染色后的细胞进行解析。使用逆转录病毒感染在存在化合物7的条件下刺激的γδ型T细胞，表达了目标TCR或CAR基因的培养8～11天后的细胞用2％胎牛血清(FCS)-PBS洗涤2次。之后，将各TCR/CAR特异性四聚体用2％FCS-PBS进行50倍稀释后，添加至细胞，在37℃、15分钟、遮光的条件下进行反应。接着，通过FITC或V500标记抗人CD8抗体(Becton Dickinson社)或FITC标记抗人Vδ2抗体(Biolegend社)，在遮光下于4℃对细胞进行15分钟染色，用2％FCS-PBS进行2次洗涤后，使用流式细胞仪进行解析。
4.ELISA
ELISA使用了eBioscience社的试剂盒。涂布缓冲液通过使用蒸馏水10倍稀释10×涂布缓冲液来制备。通过混合48μL一抗和12mL涂布缓冲液进行稀释。向96孔平底板的各孔添加100μL该稀释液，在4℃下静置一晚。之后，用0.05％PBS-T(包含Tween 20的磷酸缓冲生理食盐水)洗涤孔5次。检测稀释液通过用蒸馏水5倍稀释5×检测稀液来制备。向各孔添加200μL检测稀释液，在室温下封闭(blocking)1小时，之后用0.05％PBS-T洗涤5次。IFN-γ的标准溶液使用将IFN-γ的最高浓度设为1000pg/mL，以公比2作7个等级稀释的溶液。向板的各孔加入测定样品和标准溶液，在室温下反应2小时。反应后，用0.05％PBS-T洗涤孔5次。通过将48μL二抗与12mL检测稀释液混合而进行稀释，向各孔添加100μL该稀释液，在室温下反应1小时。反应后，用0.05％PBS-T洗涤各孔5次。通过将48μL链霉亲和素-过氧化物酶(辣根过氧化物酶，horseradish peroxidase)和12ml检测稀释液混合而进行稀释，向各孔加入100μL该稀释液，在暗处、室温下进行30分钟反应。接着，用0.05％PBS-T洗涤各孔7次后，向各孔添加100μL的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)基质溶液。使其在暗处、室温下进行15分钟反应，通过向各孔加入50μL的0.18M硫酸使反应停止。立即使用酶标仪(Model 680，Bio-Rad社)在波长450nm下测定吸光度。
5.细胞内细胞因子染色
调配以使目标细胞为1×105个/mL，效应细胞为1×105个/mL。每1个样品添加0.5μLAPC抗人CD107a抗体，使目标细胞：效应细胞＝1:1，在96孔板(U形底)中，在37℃下共培养1小时。之后，向各孔添加0.7μL的Golgistop(注册商标)(蛋白转运抑制剂，ProteinTransport Inhibitor，Becton Dickinson社)，在37℃下培养4小时。将各孔的细胞移至V型96孔板，在4℃下以1200rpm离心5分钟后，使用0.5％BSA/PBS进行2次洗涤。向各孔添加0.5μL的PE-抗人CD6抗体，遮光并在冰上静置20分钟，使用0.5％BSA/PBS进行2次洗涤。向各孔添加100μL细胞固定液(Cytofix/Cytoperm(注册商标)，Becton Dickinson社)，在遮光的条件下，在冰上静置20分钟后，向各孔添加Perm/Wash(注册商标，Becton Dickinson社)缓冲液100μL，进行离心。之后，使用Perm/Wash缓冲液进一步洗涤2次。向各孔添加0.5μL的V450IFN-γ或PE-Cy7 TNFα。在遮光的条件下，在冰上静置30分钟后，使用0.5％BSA/PBS洗涤孔2次。之后，使用FACSCantoⅡ流式细胞分析仪(Becton Dickinson社)进行测定，使用FACSDiva软件(Becton Dickinson社)进行解析。
序列表
<110> Mie university
<120> 将基因导入到γδ型T细胞的方法
<130> MIE-PCT05
<150> JP2018-143207
<151> 2018-07-31
<160> 3
<210> 1
<211> 9
<213> NY-ESO-1p157-165 肽
<400> 1
Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln Cys
1 5
<210> 2
<211> 9
<213> 来自HTLV-I 病毒抗原 p40Tax的肽
<400> 2
Ser Phe His Ser Leu His Leu Leu Phe
1 5
<210> 3
<211> 9
<213> MAGE-A4p230-239 肽
<400> 3
Gly Val Tyr Asp Gly Arg Glu His Thr Val
1 5
Claims (28)
1.一种制造表达导入基因的γδ型T细胞群体的方法，包括
(步骤1)在存在选自2-(噻唑-2-基氨基)亚乙基-1,1-双膦酸酯、2-(3-溴吡啶-2-基氨基)亚乙基-1,1-双膦酸酯、2-(5-氟吡啶-2-基氨基)亚乙基-1,1-双膦酸酯、2-(嘧啶-2-基氨基)亚乙基-1,1-双膦酸酯、2-(7-氮杂吲哚-1-基)亚乙基-1,1-双膦酸酯、2-(5-甲基噻唑-2-基氨基)亚乙基-1,1-双膦酸酯、2-(4-苯基噻唑-2-基氨基)亚乙基-1,1-双膦酸酯和2-(嘧啶-4-基氨基)亚乙基-1,1-双膦酸酯的四特戊酰氧基甲基酯衍生物及其药学上可接受的盐的1种以上化合物的条件下培养γδ型T细胞的步骤，
(步骤2)在存在IL-7和IL-15的条件下培养已在步骤1中培养的γδ型T细胞的步骤，以及
(步骤3)向已在步骤2中培养的γδ型T细胞导入基因的步骤。
2.一种制造表达导入基因的γδ型T细胞群体的方法，包括
(步骤1)在存在2-(噻唑-2-基氨基)亚乙基-1,1-双膦酸四特戊酰氧基甲基酯或其在药学上可接受的盐的条件下培养γδ型T细胞的步骤，
(步骤2)在存在IL-7和IL-15的条件下培养已在步骤1中培养的γδ型T细胞的步骤，
(步骤3)向已在步骤2中培养的γδ型T细胞导入基因的步骤。
3.根据权利要求2所述的方法，其中步骤1中的2-(噻唑-2-基氨基)亚乙基-1,1-双膦酸四特戊酰氧基甲基酯或其在药学上可接受的盐的浓度是0.01～1μM。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述γδ型T细胞来自哺乳动物。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述哺乳动物是癌症患者或非癌症患者。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述癌症选自乳腺癌、肺癌、肝癌、口腔癌、鼻咽癌、头颈部癌、胃癌、食道癌、大肠癌、皮肤癌、恶性黑色素瘤、肾癌、胰脏癌、脑肿瘤、前列腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、结肠直肠癌、膀胱癌、滑膜肉瘤、脂肪肉瘤、白血病、恶性淋巴瘤和多发性骨髓瘤。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤3中的导入基因的步骤使用DNA载体或RNA载体。
8.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤3中的导入基因的步骤使用从质粒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体和逆转录病毒载体中选择的载体。
9.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤3中的导入基因的步骤使用逆转录病毒载体。
10.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述基因是编码T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)的基因。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述T细胞受体(TCR)从NY-ESO-1p157-165/HLA-A2复合体特异性TCR、HTLV-1p40Taxp11-19/HLA-A2复合体特异性TCR、HTLV-1p40Taxp301-309/HLA-A24复合体特异性TCR和MAGE-A4p143-151/HLA-A24复合体特异性TCR中选择。
12.根据权利要求10所述的方法，其中所述嵌合抗原受体(CAR)从MAGE-A4p230-239/HLA-A2复合体特异性CAR、CEA特异性CAR、GD2特异性CAR和CD19特异性CAR中选择。
13.一种基因修饰γδ型T细胞群体，其通过权利要求1至12中任一项所述的方法得到。
14.一种医药组合物，其含有权利要求13所述的基因修饰γδ型T细胞群体和药学上可接受的添加剂。
15.根据权利要求14所述的医药组合物，其用于通过自体或同种移植治疗癌症治疗对象。
16.一种基因修饰γδ型T细胞群体，其具有下述特征
(ⅰ)表达特异性识别NY-ESO-1p157-165/HLA-A2复合体、HTLV-1p40Taxp11-19/HLA-A2复合体、HTLV-1p40Taxp301-309/HLA-A24复合体或MAGE-A4p143-151/HLA-A24复合体的TCR；
(ⅱ)CD3和NKG2D为阳性；
(ⅲ)产生包含IFN-γ和TNFα的细胞因子和趋化因子；并且
(ⅳ)具有细胞毒活性。
17.一种基因修饰γδ型T细胞群体，其具有下述特征
(ⅰ)表达特异性识别MAGE-A4p230-239/HLA-A2复合体、CEA、GD2或CD19的CAR；
(ⅱ)CD3和NKG2D为阳性；
(ⅲ)产生包含IFN-γ和TNFα的细胞因子和趋化因子；并且
(ⅳ)具有细胞毒活性。
18.根据权利要求16或17所述的基因修饰γδ型T细胞群体，其特征在于所述基因修饰γδ型T细胞群体是使用DNA载体或RNA载体导入了基因的γδ型T细胞群体。
19.根据权利要求16或17所述的基因修饰γδ型T细胞群体，其特征在于所述基因修饰γδ型T细胞群体是使用从质粒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体和逆转录病毒载体中选择的载体导入了基因的γδ型T细胞群体。
20.根据权利要求16或17所述的基因修饰γδ型T细胞群体，其特征在于所述基因修饰γδ型T细胞群体是使用逆转录病毒载体导入了基因的γδ型T细胞群体。
21.根据权利要求16或17所述的基因修饰γδ型T细胞群体，其中所述基因是编码T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)的基因。
22.一种医药组合物，其包含权利要求16至21中任一项所述的基因修饰γδ型T细胞群体。
23.一种细胞制剂，其包含权利要求16至21中任一项所述的基因修饰γδ型T细胞群体。
24.权利要求16至21中任一项所述的基因修饰γδ型T细胞群体，其用于治疗癌症患者。
25.一种抗癌剂，其包含权利要求16至21中任一项所述的基因修饰γδ型T细胞群体。
26.一种癌症治疗方法，其特征在于使用权利要求16至21中任一项所述的基因修饰γδ型T细胞群体。
27.一种感染症治疗剂，其包含权利要求16至21中任一项所述的基因修饰γδ型T细胞群体。
28.一种感染症治疗方法，其特征在于使用权利要求16至21中任一项所述的基因修饰γδ型T细胞群体。
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