JP2020005536A - 凍結コンテナ装置及びそれを用いた凍結システム - Google Patents

Abstract

【課題】細胞を凍結させる際に、細胞へのダメージを最小限に抑えることができる適切な温度及び速度で凍結させることができる凍結コンテナ装置を提供する。【解決手段】凍結コンテナ装置１０は、台座１１と、台座１１から突出して台座１１の上に細胞容器１２を支持する複数の支持部材とを備える。複数の支持部材は、所定の熱伝導率を有する伝熱ロッド１３と、伝熱ロッド１３よりも熱伝導率の低い支持ピン１４、１５、１６とを有する。【選択図】図１

Description

本発明は、例えば血液細胞や培養細胞等の細胞を凍結させる凍結コンテナ装置及びそれを用いた凍結システムに関する。

この種の細胞を凍結させる装置として、冷却室と、一端で冷却室内の凍結対象物の中央部分と接触するとともに、他端でペルチェ素子の冷却部と接触し、ペルチェ素子の冷熱を凍結対象物の中央部分に伝え、凍結対象物を局部冷却して植氷する植氷部材と、ペルチェ素子の排熱部と冷却室内の空気の双方に冷熱を伝える伝熱部材と、冷凍機とを有するものが開示されている（特許文献１参照）。

特開２０１２−３４６６７号公報

しかしながら、特許文献１に記載の装置は、凍結対象物の中央部分を局部的に冷却して植氷しているので、凍結対象物の凍結する温度及び速度が、周囲の温度環境に影響を受けやすく、制御が難しい。したがって、凍結対象物の生存率、即ち、凍結前に生存している凍結対象の細胞に対して、凍結および解凍を行った後に生存している細胞の割合が低下し、全体として細胞の生存率が低下するおそれがある。

本発明は、このような問題を解決するためになされたもので、細胞を凍結させる際に、細胞へのダメージを最小限に抑えて解凍後の細胞の生存率を向上させることができる凍結コンテナ装置及びそれを用いた凍結システムを提供することを課題とする。

（１）本発明に係る凍結コンテナ装置は、細胞を含む凍結保護溶液が貯留された細胞容器を収容し、低温の恒温槽庫内において前記細胞容器を冷却して前記細胞を凍結させる凍結コンテナ装置であって、台座と、該台座から突出して前記台座の上に前記細胞容器を支持する複数の支持部材と、を備え、前記複数の支持部材は、所定の熱伝導率を有する第１支持部材と、該第１支持部材よりも熱伝導率の低い第２支持部材と、を有することを特徴とする。

（２）本発明に係る凍結コンテナ装置は、上記（１）に記載の凍結コンテナ装置であって、前記複数の支持部材により前記細胞容器を支持した状態で前記台座と前記細胞容器との間に介在される第１断熱部材を備えていることを特徴とする。

（３）本発明に係る凍結コンテナ装置は、上記（２）に記載の凍結コンテナ装置であって、前記複数の支持部材により支持された前記細胞容器を覆い、前記台座との間に前記細胞容器を収容する室内空間を形成する第２断熱部材を備えていることを特徴とする。

（４）本発明に係る凍結コンテナ装置は、上記（１）から上記（３）のいずれか一つに記載の凍結コンテナ装置であって、前記複数の支持部材は、一以上の前記第１支持部材と、二以上の前記第２支持部材を有し、前記第１支持部材の少なくとも一つと前記第２支持部材の少なくとも一つが、前記細胞容器の底面でかつ該底面に沿った方向一方側と他方側に離間した位置を支持するように配置されていることを特徴とする。

（５）本発明に係る凍結コンテナ装置は、上記（１）から上記（４）のいずれか一つに記載の凍結コンテナ装置であって、前記台座及び前記第１支持部材は、金属材料により構成され、前記第２支持部材は、合成樹脂材により構成されていることを特徴とする。

（６）本発明に係る凍結コンテナ装置は、上記（３）に記載の凍結コンテナ装置であって、前記細胞容器とともに前記室内空間に収容される予め設定された熱容量を有する蓄熱体を備えることを特徴とする。

（７）本発明に係る凍結コンテナ装置は、上記（６）に記載の凍結コンテナ装置であって、前記蓄熱体は、前記細胞容器の上に載置される金属ブロックからなることを特徴とする。

（８）本発明に係る凍結システムは、上記（１）から上記（７）のいずれか一つに記載の凍結コンテナ装置と、該凍結コンテナ装置を収容する恒温槽庫と、該恒温槽庫の庫内を冷却する冷却装置と、前記恒温槽庫の庫内において温度を計測する温度計測装置と、該温度計測装置により計測された温度に基づいて前記冷却装置を制御する制御装置と、を備えることを特徴とする。

上記（１）に記載した本発明に係る凍結コンテナ装置は、細胞を含む凍結保護溶液が貯留された細胞容器を収容し、低温の恒温槽庫内において前記細胞容器を冷却して前記細胞を凍結させる凍結コンテナ装置であって、台座と、該台座から突出して前記台座の上に前記細胞容器を支持する複数の支持部材と、を備え、前記複数の支持部材は、所定の熱伝導率を有する第１支持部材と、該第１支持部材よりも熱伝導率の低い第２支持部材と、を有する。

この構成によれば、第２支持部材の方が第１支持部材よりも熱伝導率が低いので、低温の恒温槽庫内に配置された際に、第１支持部材から細胞容器に伝えられる冷熱の量と、第２支持部材から細胞容器に伝えられる冷熱の量との間に意図的に差を設けて、細胞容器内の凍結保護溶液に所定の温度勾配を生じさせることができる。

したがって、第１支持部材によって支持される細胞容器の第１接触箇所を、第２支持部材によって支持される第２接触箇所よりも先に冷却して、細胞容器内の凍結保護溶液全体が過度の過冷却になる前に、凍結保護溶液の第１接触箇所に対応する部分に氷晶核を局所的に発生させることができる。そして、その局所的に発生させた氷晶核を、第２接触箇所に向けて緩速に成長させる植氷操作を行うことができ、凍結保護溶液内において氷晶核を成長させる方向及び速度を精密に制御することができる。

これにより、例えば第１支持部材と第２支持部材の間を離してそれぞれ細胞容器に接触させることによって、凍結保護溶液中において氷晶核が緩速に成長する距離を長く確保することができる。したがって、細胞の生存率が低くなる範囲を、最初に氷晶核を局所的に発生させる箇所である第１接触箇所に限定し、そこから第２接触箇所までの範囲を細胞の生存率が高い領域とすることができる。したがって、細胞を凍結させる際に細胞へのダメージを最小限に抑えて解凍後の細胞の生存率を向上させることができる。

上記（２）に記載した本発明に係る凍結コンテナ装置は、複数の支持部材により細胞容器を支持した状態で台座と細胞容器との間に介在される第１断熱部材を備えている。この構成によれば、支持部材を通じて細胞容器に伝えられる冷熱が支持部材の途中で放熱されるのを抑制できる。

上記（３）に記載した本発明に係る凍結コンテナ装置は、複数の支持部材により細胞容器を支持した状態で台座の上から被せられて台座との間に細胞容器を収容する室内空間を形成する第２断熱部材を備えている。この構成によれば、細胞容器に対して冷熱を伝えるルートを、物理的に接触する支持部材のみに限定することができる。したがって、低温の恒温槽庫内における配置位置などの周囲環境から外乱を受けることなく、細胞容器を冷却することにより凍結保護溶液及び細胞を安定して凍結することができる。

上記（４）に記載した本発明に係る凍結コンテナ装置は、複数の支持部材が、一以上の前記第１支持部材と、二以上の前記第２支持部材を有し、前記第１支持部材の少なくとも一つと前記第２支持部材の少なくとも一つが、前記細胞容器の底面でかつ該底面に沿った方向一方側と他方側に離間した位置を支持するように配置されている構成を有しているので、第１接触箇所から第２接触箇所までの距離を長く確保でき、細胞容器の凍結保護溶液中に局所的に発生させた氷晶核を第２接触箇所に向けて緩速に成長させることができる。したがって、凍結保護溶液のより多くの部分が過冷却状態となるのを防ぎ、細胞の生存率を高く保ちながら凍結保管することができる。

上記（５）に記載した本発明に係る凍結コンテナ装置は、台座及び第１支持部材は、金属材料により構成され、第２支持部材は、合成樹脂材により構成されているので、台座及び第１支持部材の熱伝導率が高く、第２支持部材の熱伝導率が低くなり、冷熱を、第２支持部材よりも確実に速く第１支持部材から細胞容器の凍結保護溶液に伝えることができる。したがって、細胞容器の第１接触箇所を局所的に冷却して凍結保護溶液の対応する部分に氷晶核を局所的に発生させ、その局所的に発生させた氷晶核を、第２接触箇所に向けて緩速に成長させて溶液全体を凍結させることができる。

上記（６）に記載した本発明に係る凍結コンテナ装置は、細胞容器とともに室内空間に収容される予め設定された熱容量を有する蓄熱体を備えるので、細胞容器内の対象物を凍結させる際の温度降下を、対象物の仕様条件に合わせた緩慢凍結の温度降下となるように調整することができる。

上記（７）に記載した本発明に係る凍結コンテナ装置は、蓄熱体が細胞容器の上に載置される金属ブロックからなることが好ましい。蓄熱体の好ましい一形態を規定したものであり、簡単に用意して実施することができる。

上記（８）に記載した本発明に係る凍結システムは、恒温槽庫の庫内において計測された温度に基づき冷却装置を制御するので、恒温槽庫内を所定の冷却速度で冷却することができる。したがって、凍結初期の過冷却解除の発生や凍結速度などの細胞容器内の凍結状態を把握することができる。そして、細胞容器内の細胞を凍結させる際の温度降下の速度を、細胞の仕様条件に合わせた緩慢凍結の温度降下の速度となるように調整することができる。したがって、緩慢凍結により確実に細胞の凍結が行われ、解凍後の細胞の生存率が高められるという効果が得られる。

本発明によれば、比較的に小型で高い生存率を確保することができる凍結コンテナ装置を提供することができる。

本発明の第１実施形態に係る凍結コンテナ装置の構成を示す図であり、図１（ａ）は、凍結コンテナ装置の一部を破断した部分断面図を示し、図１（ｂ）は、凍結コンテナ装置の底面図を示す。 本発明の第１実施形態に係る凍結コンテナ装置の図であり、図２（ａ）は、細胞容器の断面図を示し、図２（ｂ）は、伝熱ロッドの側面図および正面図を示し、図２（ｃ）は、支持ピンの側面図および正面図を示す。 本発明の第１実施形態に係る凍結コンテナ装置における温度分布を示す模式図。 本発明の第１実施形態に係る凍結コンテナ装置における温度測定方法を説明する図であり、図４（ａ）は、細胞容器の温度測定位置を説明する模式図であり、図４（ｂ）は、細胞容器の温度測定位置を含む、凍結コンテナ装置の各部における経過時間と温度との関係を表すグラフを示す。 本発明の第１実施形態に係る凍結コンテナ装置における温度履歴のグラフであり、図５（ａ）は、植氷時の凍結コンテナ装置の各部における経過時間と温度との関係を表すグラフを示し、図５（ｂ）は、植氷なしの凍結コンテナ装置の各部における経過時間と温度との関係を表すグラフを示す。 本発明の第１実施形態に係る凍結コンテナ装置に適用される細胞を顕微鏡で見た図であり、図６（ａ）は、未凍結の植氷時の細胞の状態を示し、図６（ｂ）は、植氷時の細胞の生存率の状態を示し、図６（ｃ）は、植氷なしの細胞の生存率の状態を示す。 本発明の第２実施形態に係る凍結コンテナ装置を示す図であり、図７（ａ）は、凍結コンテナ装置の一部を破断した部分断面図を示し、図７（ｂ）は、凍結コンテナ装置の底面図を示す。 本発明の第３実施形態に係る凍結システムの構成を概略的に示す図である。

本発明に係る凍結コンテナ装置を適用した第１実施形態に係る細胞の凍結コンテナ装置１０および第２実施形態に係る細胞の凍結コンテナ装置２０について図面を参照して説明する。

（第１実施形態）
第１実施形態に係る凍結コンテナ装置１０は、細胞を含む凍結保護溶液１２ｄが貯留された細胞容器１２を収容し、低温の恒温槽庫内において細胞容器１２を冷却して細胞を凍結させる構成を有している。凍結コンテナ装置１０は、図１（ａ）、図１（ｂ）に示すように、台座１１と、伝熱ロッド１３と、支持ピン１４、１５、１６と、収容容器１７と、断熱部材２１、２２、２３を備えている。伝熱ロッド１３と支持ピン１４、１５、１６は、台座１１から突出して台座１１の上に細胞容器１２を支持する複数の支持部材を構成する。

凍結コンテナ装置１０は、例えば−８０℃の低温の恒温槽庫に収容され、恒温槽庫内の冷熱が台座１１に伝わり、台座１１から伝熱ロッド１３および支持ピン１４、１５、１６を介して細胞容器１２に伝わり、細胞容器１２内の凍結保護溶液１２ｄ中の細胞を凍結保護溶液１２ｄとともに凍結させる構成を有している。凍結コンテナ装置１０は、１分間に−０．５℃から−２℃ずつ低下する緩慢凍結により細胞を凍結させるように構成されている。

第１実施形態に係る凍結コンテナ装置１０における台座１１は、本発明に係る凍結コンテナ装置における台座に対応し、伝熱ロッド１３および支持ピン１４、１５、１６は、本発明に係る凍結コンテナ装置における複数の支持部材に対応し、伝熱ロッド１３は、本発明に係る凍結コンテナ装置における第１支持部材に対応し、同様に、支持ピン１４、１５、１６は、本発明に係る凍結コンテナ装置における第２支持部材に対応する。

細胞容器１２は、例えばプラスチックシャーレにより構成することができ、図２（ａ）に示すように、合成樹脂材からなる上皿１２ａおよび下皿１２ｂを有している。上皿１２ａは、外径Ｄ２、高さｈ１、厚みｔ２の一端が開口する有底円筒形を有している。下皿１２ｂは、上皿１２ａの内部に挿入され、上皿１２ａと同様に一端が開口する有底円筒形を有している。下皿１２ｂは、伝熱ロッド１３および複数の支持ピン１４、１５、１６の上に載せられる平坦な底面を有している。下皿１２ｂの底面は、第１接触箇所１２ｃで伝熱ロッド１３と接触し、第２接触箇所１２ｆ、１２ｇ、１２ｈで支持ピン１４、１５、１６と接触する。

細胞容器１２を構成する合成樹脂材としては、例えば透明のポリスチレン（ＰＳ）が挙げられる。上皿１２ａの外径Ｄ２は、例えば４０ｍｍ程度、高さｈ１は１３ｍｍ程度、厚みｔ２は、２ｍｍ程度で形成されている。下皿１２ｂは、細胞を入れた凍結保護溶液１２ｄを貯留できるように構成されており、底面は所定の収容面積（ｍｍ^２）を有している。

下皿１２ｂには、所定量の凍結保護溶液１２ｄが貯留されている。凍結保護溶液１２ｄは、例えば１．５ｍｌが貯留され、深さが１．５ｍｍ程度になっている。凍結保護溶液１２ｄは、細胞容器１２内の細胞の凍結過程で細胞内に氷晶が形成されて細胞が損傷を受けてしまう細胞内凍結を抑制する機能を有している。凍結保護溶液１２ｄとしては、例えば極東製薬工業製のＣＰ−５Ｅが挙げられる。本明細書において、「凍結保護溶液」は、凍結中に細胞を保護する物質を含有している溶液を指す。凍結保護溶液の種類は限定されず、例えばDMSO、プロピレングリコール、グリセロール、プロパンジオール、ポリエチレングリコール、エチレングリコール、ホルムアミド、ソルビトール及びマンニトール等の糖、CP-5E等の市販の凍結保護溶液、並びにそれらの混合物からなる群から選択されてもよい。

細胞には、細胞を培養して人工的に作られた多能性の幹細胞、いわゆるｉＰＳ細胞や、受精卵が数回分裂した段階で得られる胚性幹細胞、いわゆるＥＳ細胞などの生体細胞が含まれる。ｉＰＳ細胞は、人工で合成された人工基質上で単層に成長させる接着培養やいわゆるフィーダーフリー培養で培養された細胞が用いられる。

台座１１は、高い熱伝導率を有する金属材料からなり、直径Ｄ１、厚みｔ１の円盤形状を有している。台座１１の中央部分には、４個の貫通孔１１ａが形成されており、各貫通孔１１ａに固定ねじ２４、２５、２６、２７が挿入されて、伝熱ロッド１３および支持ピン１４、１５、１６が固定されている。台座１１を構成する金属材料としては、例えば熱伝導率が約２３６Ｗ／（ｍ・Ｋ）のアルミニウムＡ５０５６が挙げられる。また、例えば直径Ｄ１は、９５ｍｍ程度、厚みｔ１は、３ｍｍ程度で形成される。

伝熱ロッド１３は、高い熱伝導率を有する金属材料からなり、図１（ａ）、図２（ｂ）に示すように、外径Ｄ３、長さＬ１の丸棒で形成されており、両端部には面取りＣが施されている。一端には、ねじ穴１３ａが形成されている。伝熱ロッド１３は、台座１１に基端が当接した状態で固定され、台座１１からの冷熱が伝わるようになっている。また、伝熱ロッド１３は、先端が細胞容器１２の底面の第１接触箇所１２ｃに物理的に接触して、細胞容器１２の底面を支持しかつ細胞容器１２に冷熱を伝えるように構成されており、所定の接触面積（ｍｍ^２）を有している。この接触面積は、下皿１２ｂの収容面積よりも極めて小さく形成されている。

伝熱ロッド１３の金属材料には、台座１１と同様の熱伝導率が約２３６Ｗ／（ｍ・Ｋ）のアルミニウムＡ５０５６を用いることができる。伝熱ロッド１３は、例えば外径Ｄ３が６ｍｍ程度、長さＬ１が３５ｍｍ程度で形成されている。

支持ピン１４は、伝熱ロッド１３よりも熱伝導率が低い合成樹脂材からなり、図１（ａ）、図２（ｃ）に示すように、外径Ｄ４、長さＬ２の丸棒で形成されており、基端には、ねじ穴１４ａが形成されている。支持ピン１４の先端は、傾斜角θで形成されたテーパ部１４ｂを有しており、テーパ部１４ｂの先端は半球状に形成され、下皿１２ｂの底面に点接触し、細胞容器１２を支持するように構成されている。

また、支持ピン１４は、伝熱ロッド１３と同様に、固定ねじ２５によって基端が台座１１に固定されている。支持ピン１４を構成する合成樹脂材としては、例えば、熱伝導率が約０．２３３Ｗ／（ｍ・Ｋ）のポリアセタール（ＰＯＭ）が挙げられる。支持ピン１４は、例えば外径Ｄ４が６ｍｍ程度、長さＬ２が３５ｍｍ程度で形成されている。

支持ピン１５、１６は、支持ピン１４と同様に構成されている。本実施形態では、支持ピンを支持ピン１４、１５、１６の３本で構成し、伝熱ロッド１３を含めて細胞容器１２を４本で支持する４点支持で構成した場合について説明した。

収容容器１７は、伝熱ロッド１３および支持ピン１４、１５、１６により支持された細胞容器１２を覆い、台座１１との間に細胞容器１２を収容する室内空間を形成する構成を有する。収容容器１７は、例えば合成樹脂材からなり、図１（ａ）に示すように、台座１１との間に形成される室内空間には、細胞容器１２、伝熱ロッド１３、支持ピン１４、１５、１６および断熱部材２１、２２が収容されるようになっている。収容容器１７は、一端で開口し、外径Ｄ５、内径Ｄ６、厚みｔ３、高さｈ２を有する有底筒状に形成されており、厚みｔ３の内部は、空洞で形成されている。

収容容器１７は、厚みｔ３の内部の空洞に、組織名が２−プロパノール、慣用名がイソプロピルアルコールのいわゆるイソプロパノールからなる液体および空気が充填され密閉された構成を有しており、収容容器１７の内部と外部との間を断熱する構成を有している。合成樹脂材としては、例えば、ポリプロピレン（ＰＰ）が挙げられる。収容容器１７は、例えば、外径Ｄ５が６８ｍｍ程度、内径Ｄ６が４９ｍｍ程度、厚みｔ３が９．５ｍｍ程度、高さｈ２が９０ｍｍ程度で形成されている。具体的には、日本フリーザー製の凍結処理容器バイセルを使用してもよい。

収容容器１７は、細胞容器１２を室内空間に収容して外部から熱的に隔離し、細胞容器１２に対して冷熱を伝えるルートを、物理的に接触する伝熱ロッド１３および支持ピン１４、１５、１６のみに限定することができる。これにより、凍結コンテナ装置１０は、恒温槽庫内における配置位置などの周囲環境から外乱を受けることなく、細胞容器１２に対して冷熱を安定して供給することができる。

断熱部材２１および断熱部材２２は、伝熱ロッド１３および支持ピン１４、１５、１６により細胞容器１２を支持した状態で台座１１と細胞容器１２との間に介在される構成を有している。断熱部材２１及び断熱部材２２は、例えば合成樹脂材からなり、外径Ｄ７、厚みｔ４の円盤状で形成されており、伝熱ロッド１３、支持ピン１４、１５、１６がそれぞれ挿入される４個の貫通孔２１ａ、２２ａがそれぞれ形成されている。合成樹脂材としては、例えば熱伝導率が約０．０４６１Ｗ／（ｍ・Ｋ）の発泡ポリエチレン（ＥＰＥ）が挙げられる。

断熱部材２１および断熱部材２２は、それぞれ外径Ｄ７が４８ｍｍ程度、厚みｔ４が１０ｍｍ程度で形成されており、互いに積み重ねた状態で収容容器１７の内部空間の下方に配置されている。断熱部材２１および断熱部材２２は、

断熱部材２１および断熱部材２２は、収容容器１７の内部空間の下方に位置し、外径Ｄ７が収容容器１７の内径Ｄ６とほぼ同じ寸法となっているので、断熱部材２１および断熱部材２２が収容容器１７に収まった状態で、収容容器１７が移動しないよう保持する機能および収容容器１７の着脱の際の位置決めの機能も有している。

断熱部材２３は、合成樹脂材からなり、外径Ｄ８、厚みｔ４の円盤状で形成されており、伝熱ロッド１３、支持ピン１４、１５、１６がそれぞれ挿入される４個の貫通孔２３ａが形成されている。合成樹脂材としては、断熱部材２１と同様、熱伝導率が約０．０４６１Ｗ／（ｍ・Ｋ）の発泡ポリエチレン（ＥＰＥ）が挙げられる。

断熱部材２３は、外径Ｄ８が８５ｍｍ程度、厚みｔ４が１０ｍｍ程度で形成されており、収容容器１７の開口の下方に位置し、台座１１と収容容器１７との間に設けられている。

断熱部材２１、２２、２３は、台座１１から伝熱ロッド１３を介して細胞容器１２の第１接触箇所１２ｃに冷熱が伝えられる際に侵入熱や過度の冷却を抑制する機能を有している。断熱部材２１、２２、２３は、互いに向かい合う面で接着されており、一体化されている。したがって、収容容器１７を取り外す際に、断熱部材２１および断熱部材２２が収容容器１７に付着し、収容容器１７とともに取り外されることはなく、収容容器１７のみを取り外すことができる。

なお、第１実施形態に係る凍結コンテナ装置１０における断熱部材２１、２２、２３は、本発明に係る凍結コンテナ装置における第１断熱部材に対応し、第１実施形態に係る凍結コンテナ装置１０における収容容器１７は、本発明に係る凍結コンテナ装置における第２断熱部材に対応している。

固定ねじ２４は、台座１１から伝熱ロッド１３に冷熱が効率よく伝わるよう熱伝導率の高い金属材料で形成されている。固定ねじ２５、２６、２７は、金属材料でもよく合成樹脂材でもよい。

次いで、本実施形態に係る凍結コンテナ装置１０における冷熱を細胞容器１２に伝える作用について説明する。

本実施形態に係る凍結コンテナ装置１０の構成は、熱解析することで最適化されていることが確認された。即ち、図３に示すように、凍結コンテナ装置１０を−８０℃の図示しない恒温槽庫に入れると、恒温槽庫内の−８０℃の雰囲気温度、即ち収容容器１７の外部の−８０℃の空気の温度が台座１１に伝わり、台座１１から伝熱ロッド１３に伝わる。図３は、−８０℃の恒温槽庫内に凍結コンテナ装置１０を配置して６００秒後の温度分布を示す図である。図３では、台座１１および断熱部材２３の一部と伝熱ロッド１３が−８０℃になっている。

このとき、伝熱ロッド１３よりも熱伝導率の低い支持ピン１５は、台座１１に接触している部分については−８０℃になっているものの、細胞容器１２に接触している部分については１５℃となっており、伝熱ロッド１３と比較して熱の伝導が極めて遅いことが分かる。

また、伝熱ロッド１３に伝わった−８０℃の冷熱は、細胞容器１２の底面の第１接触箇所１２ｃから細胞容器１２に伝わり、第１接触箇所１２ｃにおける温度は−７５℃となっている。これに対して、支持ピン１５の先端が接触している第２接触箇所１２ｇは、ほぼ２０℃となっており、−８０℃の冷熱が伝わっていないことが分かる。

また、細胞容器１２の第１接触箇所１２ｃに伝わった冷熱は、第１接触箇所１２ｃから徐々に細胞容器１２の底面中央部に伝わることが分かる。さらに冷熱は、第１接触箇所１２ｃの反対側の端部である第２接触箇所１２ｇに伝えられることが推定される。このような凍結コンテナ装置１０の熱解析により、凍結コンテナ装置１０は、細胞容器１２内の凍結保護溶液１２ｄの第１接触箇所１２ｃに対応する部分に局所的に氷晶核を形成することができ、植氷させることができることが分かる。

次いで、本実施形態に係る凍結コンテナ装置１０における各構成要素の温度履歴について図面を参照して説明する。

まず、凍結コンテナ装置１０における各構成要素の温度測定位置は、図４（ａ）に示すように、細胞容器１２内の凍結保護溶液１２ｄの表面部分における１〜６のポイント、庫内と表示された恒温槽庫の内部、プレートと表示された台座１１、ロッドと表示された伝熱ロッド１３、気相と表示された収容容器１７の室内空間の総計１０箇所となっている。

なお、温度測定位置の１〜６までの間で、測定点２−３、３−４、４−５、５−６については、界面進行速度（ｍｍ／ｍｉｎ）を測定しており、凝固界面の進行する速さを観察している。これによると、測定点２−３は１．１（ｍｍ／ｍｉｎ）、測定点３−４は５．３（ｍｍ／ｍｉｎ）、測定点４−５は３．２（ｍｍ／ｍｉｎ）、測定点５−６は３．８（ｍｍ／ｍｉｎ）となっている。

図４（ｂ）のグラフは、各構成要素の経過時間ｍｉｎに対する温度変化を表している。例えば、庫内と表示された恒温槽庫の内部の温度は、図４（ｂ）の最も下に位置する破線で表されており、経過時間数ｍｉｎ後から８０ｍｉｎまでの間、−８０℃よりもやや高い温度でほぼ一定に保たれていることが確認できる。

プレートと表示された台座１１の温度は、図４（ｂ）の実線で表されており、経過時間０のときに２０℃で、１０ｍｉｎ後で約−６５℃、２０ｍｉｎ後で約−７５℃、その後−８０℃よりもやや高い温度でほぼ一定に保たれており、各構成要素のなかで最も急速に−８０℃に近づいている。

ロッドと表示された伝熱ロッド１３の温度は、図４（ｂ）の細かな破線で表されており、経過時間０のときに約２０℃で、１０ｍｉｎ後で約−３５℃、２０ｍｉｎ後で約−４５℃、その後徐々に低下し６０ｍｉｎ後で、−８０℃よりもやや高い温度でほぼ一定に保たれている。

凍結保護溶液１２ｄの表面部分における１のポイントは、伝熱ロッド１３の次に温度の低下が速くなっており、図４（ｂ）の下から４番目の一点鎖線で表されている。１のポイントでは、経過時間１０ｍｉｎ後の−６℃で、急に温度が上昇し、再び温度が低下し、２０ｍｉｎ後で−２０℃、３０ｍｉｎ後から６０ｍｉｎ後まで徐々に低下し、それ以降は、−８０℃よりもやや高い温度でほぼ一定に保たれている。

１のポイントにおいて、−６℃で、急に温度が上昇したのは、過冷却解除による潜熱の影響である。したがって、０℃から−６℃までは、凍結が起きない過冷却の状態となっている。−６℃で、過冷却解除がされて、氷晶核が凍結保護溶液１２ｄの表面部分における１のポイント付近で形成され、植氷がされたことが分かる。

図４（ｂ）の最も上側の破線が、凍結保護溶液１２ｄの表面部分における６のポイントであり、他のポイントと比較して、最も冷熱の伝わりが遅くなっていることが分かる。凍結保護溶液１２ｄの表面部分における他のポイントも、６のポイントよりは、温度低下が速いものの、同様の曲線となっている。

図４（ｂ）のグラフから、冷熱は、細胞容器１２の第１接触箇所１２ｃから周辺に伝えられ、細胞容器１２の第２接触箇所１２ｆ、１２ｇ、１２ｈに伝えられることが分かる。そして、伝えられた冷熱により、凍結保護溶液１２ｄが第１接触箇所１２ｃから第２接触箇所１２ｆ、１２ｇ、１２ｈに向かって順次冷却され、凍結される。凍結保護溶液１２ｄは、第１接触箇所１２ｃに対応する部分が過冷却状態となり、その過冷却状態が解除されて氷晶核が局所的に発生する。そして、局所的に発生した氷晶核は、第２接触箇所１２ｆ、１２ｇ、１２ｈに向けて緩速に成長する。このように、凍結保護溶液１２ｄは、氷晶核の成長する方向及び速度が精密に制御される。

凍結保護溶液１２ｄに含まれる細胞は、伝熱ロッド１３が接触する細胞容器１２の第１接触箇所１２ｃにおける解凍後の生存率よりも、底面中央部および第２接触箇所の方が比較的に解凍後の生存率が高い。したがって、細胞を凍結させる際に細胞へのダメージを最小限に抑えて、全体として解凍後の細胞の生存率を向上させることができる。

次いで、植氷の有無による細胞の生存率について図５（ａ）、図５（ｂ）を参照して説明する。

図５（ａ）、図５（ｂ）のグラフは、各構成要素の経過時間ｍｉｎに対する温度変化を表しており、図５（ａ）は本実施形態の凍結コンテナ装置を用いて植氷操作をおこなったときのグラフ、図５（ｂ）は、植氷操作なしのグラフとなっている。
庫内と表示された恒温槽庫の内部は、図５（ａ）の最も下に位置する破線で表されており、経過時間数ｍｉｎ後から１３０ｍｉｎまでの間、−８０℃よりもやや高い温度でほぼ一定に保たれていることが確認できる。

本実施形態の凍結コンテナ装置１０を用いた場合、アルミプレートと表示された台座１１の温度は、図５（ａ）の実線で表されており、経過時間０のときに２０℃で、１０ｍｉｎ後で約−６５℃、２０ｍｉｎ後で約−７０℃、その後−８０℃よりもやや高い温度でほぼ一定に保たれており、各構成要素のなかで最も急速に−８０℃に近づいている。

アルミ棒と表示された伝熱ロッド１３の温度は、図５（ａ）の細かな破線で表されており、経過時間０のときに約２０℃で、１０ｍｉｎ後で約−３０℃、２０ｍｉｎ後で約−４０℃、その後徐々に低下し１２０ｍｉｎ後で、−８０℃よりもやや高い温度でほぼ一定に保たれている。

液中（アルミ棒真上）と表示された凍結保護溶液１２ｄの第１接触箇所１２ｃに対応する部分は、伝熱ロッド１３の次に温度の低下が速くなっており、図５（ａ）の下から４番目の一点鎖線で表されている。その温度は、経過時間１０ｍｉｎ後の−２０℃を過ぎたところで、急に上昇し、再び低下し、２０ｍｉｎ後で−３０℃、４０ｍｉｎ後から１３０ｍｉｎ後まで徐々に低下している。

−２０℃で、急に温度が上昇したのは、過冷却解除による潜熱の影響である。したがって、０℃から−２０℃までは数分間、凍結が起きない過度の過冷却状態となっている。−２０℃で、過冷却解除がされて、氷晶核が細胞容器１２の第１接触箇所１２ｃ付近の凍結保護溶液１２ｄの表面部分で形成され、植氷がされたことが分かる。

そして、液中（アルミ棒右側）と表示された凍結保護溶液１２ｄの第２接触箇所１２ｇに対応する部分は、凍結保護溶液１２ｄの第１接触箇所１２ｃに対応する部分よりも温度の低下が遅くなっており、図５（ａ）において二点鎖線で表されている。

図５（ａ）のグラフから、冷熱は、細胞容器１２の第１接触箇所１２ｃから周辺に伝えられ、細胞容器１２の第２接触箇所１２ｆ、１２ｇ、１２ｈに伝えられることが分かる。そして、伝えられた冷熱により、凍結保護溶液１２ｄが第１接触箇所１２ｃから第２接触箇所１２ｆ、１２ｇ、１２ｈに向かって順次冷却され、凍結される。凍結保護溶液１２ｄに含まれる細胞は、伝熱ロッド１３が接触する細胞容器１２の第１接触箇所１２ｃに対応する部分における解凍後の生存率は低いが、底面中央部および第２接触箇所の方は比較的に解凍後の生存率が高いので、全体として細胞の解凍後の生存率が高められ、結果として生存率が４６％と高くなっている。

なお、生存率は、図６（ａ）に示すように、細胞塊からなるコロニーが多数生成され、凍結前に生存している細胞を１００％とし、凍結した後に解凍した際、生存している細胞の割合を表している。解凍は、例えば、３７℃の金属ブロックの上で凍結した細胞を２分程度の短時間で急速に解凍する方法で行われる。

生存率は、解凍後の細胞を顕微鏡で観察し細胞数やコロニーなどの生存状態を確認することで求められる。生存率が４６％の状態は、図６（ｂ）に示されている。図６（ａ）に示す細胞の状態と比較して、生存率が４６％の状態は、コロニーが少なくなっており細胞数も少なくなっている。

図５（ｂ）は、植氷操作なしの場合、つまり、本実施形態の凍結コンテナ装置を用いず、細胞容器を恒温槽庫内にそのまま直接配置した場合の温度変化を示すグラフである。図５（ｂ）に示す植氷なしの場合、庫内と表示された恒温槽庫の内部は、図５（ａ）の場合と同様、最も下に位置する破線で表されており、経過時間数ｍｉｎ後から１３０ｍｉｎまでの間−８０℃よりもやや高い温度でほぼ一定に保たれていることが確認できる。

しかしながら、液中と表示された細胞容器１２内の凍結保護溶液１２ｄは、点線で表されるように、４５ｍｉｎ後で、急に温度が上昇し、再び温度が低下し、１００ｍｉｎ後まで徐々に低下している。

−２０℃で、急に温度が上昇したのは、過冷却解除による潜熱の影響であり、０℃から−２０℃までは、凍結が起きない過冷却の状態が４５ｍｉｎと、比較的に長い間続いている。この場合、過冷却解除により細胞が損傷する範囲は広範囲に拡大して、生存率が２％となっている。生存率が２％の状態は、図７（ｃ）に示されるように、コロニーが極端に少なくなっており細胞数も極端に少なくなっている。

以下、本実施形態に係る凍結コンテナ装置１０の効果について説明する。

本実施形態に係る凍結コンテナ装置１０は、台座１１と、台座１１から突出して台座１１の上に細胞容器１２を支持する複数の支持部材を備え、その複数の支持部材は、所定の熱伝導率を有する伝熱ロッド１３と、伝熱ロッド１３よりも熱伝導率の低い支持ピン１４、１５、１６を有している。細胞容器１２には、細胞を含む凍結保護溶液１２ｄが貯留されている。

本実施形態に係る凍結コンテナ装置１０によれば、支持ピン１４、１５、１６の熱伝導率が伝熱ロッド１３の熱伝導率よりも低いので、恒温槽庫内に配置された際に、伝熱ロッド１３により細胞容器１２を冷却する冷熱の量と、支持ピン１４、１５、１６により細胞容器１２を冷却する冷熱の量との間に意図的に差を設けることができ、細胞容器１２内の凍結保護溶液１２ｄに所定の温度勾配を生じさせることができる。

したがって、細胞容器１２の第１接触箇所１２ｃを第２接触箇所１２ｆ、１２ｇ、１２ｈよりも速く冷却して、凍結保護溶液１２ｄ全体が過度の過冷却になる前に、凍結保護溶液１２ｄの第１接触箇所１２ｃに対応する部分に氷晶核を局所的に発生させる。そして、その局所的に発生させた氷晶核を、第２接触箇所１２ｆ、１２ｇ、１２ｈに向けて緩速に成長させる植氷操作を行うことができ、氷晶核を成長させる方向及び速度を精密に制御することができる。

従来は、凍結対象物の中央部分にペルチェ素子の冷熱を伝える構成であったので、氷晶核を成長させる方向及び速度を精密に制御することができず、細胞の生存率が低下するおそれがあった。これに対して、本実施形態に係る凍結コンテナ装置１０は、熱伝導率の高い伝熱ロッド１３と熱伝導率の低い支持ピン１４で細胞容器１２を支持することにより、氷晶核を成長させる方向及び速度を精密に制御することができる。

これにより、例えば細胞容器１２の底面中央部を間に介して離間する第１接触箇所１２ｃと第２接触箇所１２ｇのように、伝熱ロッド１３と支持ピン１４との間を離してそれぞれ細胞容器１２の底面に接触させることによって、凍結保護溶液１２ｄ中において氷晶核が緩速に成長する距離を長く確保することができる。したがって、細胞の生存率が低くなる範囲を、最初に氷晶核を局所的に発生させる箇所である第１接触箇所１２ｃに限定し、そこから第２接触箇所までの範囲を細胞の生存率が高い領域とすることができる。したがって、細胞を凍結させる際に細胞へのダメージを最小限に抑えて解凍後の細胞の生存率を向上させることができる。また、冷熱が、伝熱ロッド１３を介して細胞容器１２の第１接触箇所１２ｃに伝えられるので、比較的に小型の凍結コンテナ装置とすることができる。

また、本実施形態に係る凍結コンテナ装置１０は、伝熱ロッド１３および支持ピン１４、１５、１６を囲む断熱部材２１、２２、２３を有しているので、台座１１から伝熱ロッド１３を介して細胞容器１２の第１接触箇所１２ｃに冷熱が伝えられる際に侵入熱や過度の冷却を抑制されるという効果が得られる。また、このような構成により、緩慢凍結により確実に細胞の凍結が行われ、解凍後の細胞の生存率が高められるという効果が得られる。

また、本実施形態に係る凍結コンテナ装置１０は、細胞容器１２の収容面積に対して伝熱ロッド１３と細胞容器１２との接触面積が小さい面積となるように伝熱ロッド１３が構成されている。したがって、細胞の生存率が低くなる範囲を小さくし、細胞を凍結させる際に細胞へのダメージを最小限に抑えて解凍後の細胞の生存率を向上させることができる。

また、本実施形態に係る凍結コンテナ装置１０は、伝熱ロッド１３が、１本であり金属材料で形成され、支持ピン１４、１５、１６が、３本であり合成樹脂で形成されている。この構成により、伝熱ロッド１３の熱伝導率が高く、支持ピン１４、１５、１６の熱伝導率が低くなり、冷熱が、支持ピン１４、１５、１６よりも確実に速く伝熱ロッド１３から細胞容器１２の第１接触箇所１２ｃに伝えられる。したがって、凍結保護溶液１２ｄの第１接触箇所１２ｃに対応する部分を急冷し、それ以外の部分については徐冷することができる。

また、本実施形態に係る凍結コンテナ装置１０では、細胞容器１２を伝熱ロッド１３および支持ピン１４、１５、１６により４点で支持しているので、伝熱ロッド１３および支持ピン１４、１５、１６により細胞容器１２が、確実に支持されるという効果が得られる。なお、本実施形態に係る凍結コンテナ装置１０においては、他の支持構造で構成するようにしてもよい。例えば、支持ピン２本、伝熱ロッド１本の３本で支持する３点支持で構成してもよい。３点支持の場合、伝熱ロッドと支持ピンの両方を確実に下皿１２ｂの底面に接触させることができ、冷熱を確実に伝達しかつ安定して支持することができる。

また、本実施形態に係る凍結コンテナ装置１０では、複数の支持部材が伝熱ロッド１３と支持ピン１４、１５、１６により構成される場合について説明したが、細胞容器１２を乗せて支持し、凍結保護溶液に温度勾配を形成できる構成を有するものであればよい。したがって、例えば、一以上の伝熱ロッドと、二以上の支持ピンを有しており、一以上の伝熱ロッドの少なくとも一つと、二以上の支持ピンの少なくとも一つが、細胞容器１２の底面でかつ底面に沿った方向一方側と他方側に離間した位置を支持するように配置されている構成としてもよい。

（第２実施形態）
次に、本発明の第２実施形態に係る凍結コンテナ装置２０について図面を参照して説明する。本実施形態において特徴的なことは、凍結コンテナ装置２０が、細胞容器１２の上に載置される蓄熱体２８を備えることである。

本実施形態に係る凍結コンテナ装置２０は、蓄熱体２８以外の構成要素が第１実施形態に係る凍結コンテナ装置１０と同様に構成されている。したがって、第１実施形態に係る凍結コンテナ装置１０と同一の構成要素については、凍結コンテナ装置１０と同一の符号を付して説明を省略し、主に異なる構成要素について説明する。

凍結コンテナ装置２０は、図７（ａ）、図７（ｂ）に示すように、台座１１と、細胞容器１２と、伝熱ロッド１３と、支持ピン１４、１５、１６と、収容容器１７Ａと、断熱部材２１Ａ、２２Ａ、２３Ａと、固定ねじ２４、２５、２６、２７と、金属ブロック２８と、カバー２９とにより構成されている。凍結コンテナ装置２０は、第１実施形態に係る凍結コンテナ装置１０と同様、−８０℃の恒温槽庫に入れられることにより、恒温槽庫内の冷熱が台座１１に伝わり、台座１１から伝熱ロッド１３を介して細胞容器１２に伝わり、細胞容器１２内の凍結保護溶液と細胞が凍結されるように構成されている。

金属ブロック２８は、細胞容器１２とともに収容容器１７Ａ内に収容される。金属ブロック２８は、予め設定された熱容量を有する蓄熱体を構成し、対象物の仕様条件に合わせた緩慢凍結の温度降下となるように調整する機能を有する。凍結コンテナ装置２０は、１分間に−０．５℃から−２℃ずつ低下する緩慢凍結により細胞を凍結させるように構成されている。

収容容器１７Ａは、伝熱ロッド１３および支持ピン１４、１５、１６により支持された細胞容器１２を、細胞容器１２の上に載置された金属ブロック２８とともに覆い、収容容器１７Ａと台座１１との間に細胞容器１２及び金属ブロック２８を収容する室内空間を形成する構成を有する。収容容器１７Ａは、例えば合成樹脂材からなり、図７（ａ）に示すように、台座１１との間に形成される室内空間には、細胞容器１２、伝熱ロッド１３、支持ピン１４、１５、１６、断熱部材２１Ａ、２２Ａ、２３Ａ、金属ブロック２８およびカバー２９が収容される。収容容器１７Ａは、一端で開口し、外径Ｄ１１、内径Ｄ１２、厚みｔ１１、高さｈ１１を有する有底筒状に形成されており、厚みｔ１１の内部は、空洞で形成されている。

厚みｔ１１の内部の空洞には、組織名が２−プロパノール、慣用名がイソプロピルアルコールのいわゆるイソプロパノールからなる液体および空気が充填され密閉されている。合成樹脂材としては、例えば、ポリプロピレン（ＰＰ）が挙げられる。収容容器１７Ａは、例えば、外径Ｄ１１が１１５ｍｍ程度、内径Ｄ１２が９５ｍｍ程度、厚みｔ１１が９．５ｍｍ程度、高さｈ１１が８０ｍｍ程度で形成されている。

断熱部材２１Ａは、合成樹脂材からなり、外径が収容容器１７Ａの内径Ｄ１２と同様の寸法で、厚みｔ１２の円盤状で形成されており、伝熱ロッド１３、支持ピン１４、１５、１６がそれぞれ挿入される４個の貫通孔が形成されている。合成樹脂材としては、例えば熱伝導率が約０．０４６１Ｗ／（ｍ・Ｋ）の発泡ポリエチレン（ＥＰＥ）が挙げられる。

断熱部材２１Ａは、厚みｔ１２が１０ｍｍ程度で形成されており、収容容器１７Ａの内部空間の下方に位置している。断熱部材２１Ａは、台座１１から伝熱ロッド１３を介して細胞容器１２の第１接触箇所１２ｃに冷熱が伝えられる際に侵入熱や過度の冷却を抑制する機能を有しており、細胞容器１２が、１分間に−０．５℃から−２℃ずつ低下する緩慢凍結作用に寄与している。断熱部材２２Ａ、２３Ａも、断熱部材２１Ａと同様に構成されている。

断熱部材２１Ａ、２２Ａ、２３Ａは、収容容器１７Ａの内部空間の下方に位置し、外径が収容容器１７Ａの内径Ｄ１２とほぼ同じ寸法となっているので、断熱部材２１Ａ、２２Ａ、２３Ａが収容容器１７Ａに収まった状態で、収容容器１７Ａが移動しないよう保持する機能および収容容器１７Ａの着脱の際の位置決めの機能を有している。

なお、断熱部材２１Ａ、２２Ａ、２３Ａは、互いに向かい合う面で接着されており、一体化されている。したがって、収容容器１７Ａを台座１１から取り外す際に、断熱部材２１Ａ、２２Ａ、２３Ａが収容容器１７Ａに付着して収容容器１７Ａとともに取り外されるということはなく、収容容器１７Ａのみを取り外すことができる。

金属ブロック２８は、細胞容器１２の上に載置された状態で収容容器１７Ａと台座１１との間の室内空間に収容される。金属ブロック２８は、高い熱伝導率を有する金属材料からなり、直径Ｄ１３、厚みｔ１３を有する円盤状で形成されている。金属材料としては、例えば熱伝導率が約２３６Ｗ／（ｍ・Ｋ）のアルミニウムＡ５０５６が挙げられる。また、直径Ｄ１３は、例えば６０ｍｍ程度、厚みｔ１３は、９ｍｍ程度で形成される。

カバー２９は、金属材料または合成樹脂材からなる、両端で開口する円筒部材で構成されており、細胞容器１２の側面の周囲に所定の厚みの気相が形成されるように構成されている。

以下、本実施形態に係る凍結コンテナ装置２０の効果について説明する。

本実施形態に係る凍結コンテナ装置２０は、台座１１と、細胞容器１２と、伝熱ロッド１３と、支持ピン１４、１５、１６と、金属ブロック２８と、カバー２９と、各構成要素を収容する収容容器１７Ａとを備えている。

この構成により、冷熱は台座１１から伝熱ロッド１３に伝えられ、伝熱ロッド１３を介して細胞容器１２の第１接触箇所１２ｃに伝えられる。支持ピン１４、１５、１６は伝熱ロッド１３の熱伝導率よりも低い熱伝導率を有しているので、冷熱は支持ピン１４、１５、１６よりも速く伝熱ロッド１３から細胞容器１２の第１接触箇所１２ｃに伝えられる。これにより、凍結保護溶液１２ｄの第１接触箇所１２ｃに対応する部分が急冷され、それ以外の部分については徐冷される。

冷熱は、細胞容器１２の第１接触箇所１２ｃから周辺に伝えられ第２接触箇所１２ｆ、１２ｇ、１２ｈに伝えられる。伝えられた冷熱により細胞が順次冷却され、凍結される。細胞容器１２の上に載置されている金属ブロック２８は、細胞容器１２の冷熱がカバー２９を通じて収容容器１７の室内空間の気相１００に伝えられ、その気相１００の冷熱が金属ブロック２８に伝えられることによって冷却される。金属ブロック２８は、予め設定された熱容量を有する蓄熱体であり、細胞容器１２とともに室内空間に収容されるので、細胞容器１２内の対象物である細胞を凍結させる際の温度降下の速度を、細胞の仕様条件に合わせた緩慢凍結の温度降下の速度となるように調整することができる。したがって、凍結保護溶液の第１接触箇所１２ｃに対応する部分以外については１分間に−０．５℃から−２℃ずつ低下する緩慢凍結を確実に実現することができる。したがって、より確実に細胞の凍結が行われ、解凍後の細胞の生存率が高められるという効果が得られる。

本実施形態の凍結コンテナ装置２０によれば、複数種類の金属ブロックの中から、細胞容器１２内の対象物に応じて最適な熱容量を有する金属ブロックを選択して用いることができる。したがって、細胞容器１２内の対象物を凍結させる際の温度降下の速度を、対象物の仕様条件に合わせた緩慢凍結の温度降下の速度に簡単に調整することができる。したがって、細胞容器１２内の対象物に応じて収容容器１７Ａの厚さや恒温槽庫の庫内温度を調整する作業を省略することができる。

従来は、細胞を凍結する順、すなわち凍結のルートは定まっておらずランダムに起きていたので、細胞の生存率が低下していた。これに対して、本実施形態に係る凍結コンテナ装置２０では、定まったルートで凍結が行われるという効果が得られる。凍結された細胞は、伝熱ロッド１３が接触する細胞容器１２の第１接触箇所１２ｃにおける解凍後の生存率よりも、第２接触箇所１２ｆ、１２ｇ、１２ｈの方が比較的に解凍後の生存率が高いので、全体として細胞の解凍後の生存率が高められるという効果が得られる。

また、本実施形態に係る凍結コンテナ装置２０は、伝熱ロッド１３および支持ピン１４、１５、１６を囲む断熱部材２１Ａ、２２Ａ、２３Ａを有しているので、台座１１から伝熱ロッド１３を介して細胞容器１２の第１接触箇所１２ｃに冷熱が伝えられる際に侵入熱や過度の冷却が抑制されるという効果が得られる。また、このような構成により、凍結保護溶液の第１接触箇所１２ｃに対応する部分以外については、１分間に−０．５℃から−２℃ずつ低下する緩慢凍結により確実に細胞の凍結が行われ、解凍後の細胞の生存率が高められるという効果が得られる。

また、本実施形態に係る凍結コンテナ装置２０においても、伝熱ロッド１３が、細胞容器１２の収容面積に対して伝熱ロッド１３と細胞容器１２との接触面積が小さい面積となるように構成されている。したがって、細胞の生存率が低くなる範囲を小さくし、細胞を凍結させる際に細胞へのダメージを最小限に抑えて解凍後の細胞の生存率を向上させることができる。

また、本実施形態に係る凍結コンテナ装置２０は、伝熱ロッド１３が１本であり、金属材料で形成され、支持ピン１４、１５、１６が３本であり、合成樹脂で形成されている。この構成により、伝熱ロッド１３の熱伝導率が高く、支持ピン１４、１５、１６の熱伝導率が低くなり、冷熱が、支持ピン１４、１５、１６よりも確実に速く伝熱ロッド１３から細胞容器１２の第１接触箇所１２ｃに伝えられる。したがって、凍結保護溶液の第１接触箇所１２ｃに対応する部分を急冷し、それ以外の部分については徐冷することができる。また、細胞容器１２が、伝熱ロッド１３および支持ピン１４、１５、１６による４点支持となり、伝熱ロッド１３および支持ピン１４、１５、１６により細胞容器１２が、確実に支持されるという効果が得られる。

第１実施形態に係る凍結コンテナ装置１０および第２実施形態に係る凍結コンテナ装置２０においては、細胞が、人工で合成された人工基質上で単層に成長させる接着培養の場合について説明した。しかしながら、本発明に係る凍結コンテナ装置においては、接着培養以外の細胞で構成するようにしてもよい。例えば、細胞は、細胞の栄養素の供給源や細胞の増殖に必要な足場や液相を与える培地の中で細胞を自由に浮遊させて成長させる浮遊培養であってもよい。

この場合、細胞が、接着培養または浮遊培養によって成長させた細胞に適用されるので、接着培養だけでなく浮遊培養にも適用される。その結果、細胞の培養の種類が増大し凍結コンテナ装置の汎用性が高められるという効果が得られる。

第１実施形態に係る凍結コンテナ装置１０および第２実施形態に係る凍結コンテナ装置２０においては、伝熱ロッド１３が、細胞容器１２の第１接触箇所１２ｃと接触し、第１接触箇所１２ｃを介して冷熱を凍結保護溶液に伝える構造で構成した場合について説明した。しかしながら、本発明に係る凍結コンテナ装置においては、伝熱ロッド１３が、細胞容器１２の第１接触箇所１２ｃと接触する構造以外の構造で構成してもよい。例えば、伝熱ロッド１３が細胞容器１２の外周側面の一部に接触する構造で構成するようにしてもよい。

（第３実施形態）
次に、本発明の第３実施形態について図面を参照して説明する。図８は、本発明の第３実施形態に係る凍結システムの構成を概略的に示す図である。本実施形態は、第１実施形態または第２実施形態に係る凍結コンテナ装置を用いた凍結システムについてのものである。以下では、第１実施形態の凍結コンテナ装置１０を用いた場合について説明するが、第２実施形態の凍結コンテナ装置２０を用いてもよい。

凍結システムは、図８に示すように、凍結コンテナ装置１０を収容する恒温槽庫４００と、恒温槽庫４００の庫内を冷却する冷却装置４０１と、恒温槽庫４００の庫内において温度を計測する温度計測装置と、温度計測装置により計測された温度に基づいて冷却装置４０１を制御する制御装置４０２を備える。

恒温槽庫４００は、少なくとも１個以上の凍結コンテナ装置１０を収納することができ、庫内の温度を例えば−８０℃の低温状態に保つことができる構造を有する。冷却装置４０１は、恒温槽庫４００に取り付けられており、例えばコンプレッサにより冷媒を圧縮して熱交換器に供給することより庫内を冷却する構造を有する。

温度計測装置は、例えば熱電対などの温度計測センサを有しており、庫内における各部の温度を計測する。温度計測センサは、収容容器１７の容器内の気相部１０９ｄと、伝熱ロッド１３の上部１０９ｅと、細胞容器１２の底面部１０９ｈと、台座１１（１０９ｆ）と、恒温槽庫４０の庫内気相部１０９ｇの温度を計測する。

制御装置４０２は、温度計測装置１０９による各部１０９ｄ〜１０９ｇの温度に基づいて所定の冷却速度が得られるように冷却装置４０１の運転制御を行う。また、制御装置４０２は、凍結対象物と温度履歴に基づいてプログラムされた冷却装置４０１の運転方法を記憶し、そのプログラムされた運転方法に基づいて冷却装置４０１の運転制御を行ってもよい。冷却装置４０１は、必要に応じて、記憶手段や表示手段などの各種手段に接続してもよい。

上記した凍結システムによれば、各部１０９ｄ〜１０９ｇの温度に基づいて冷却装置４０１を制御し、恒温槽庫４００の庫内を所定の冷却速度で冷却することができる。したがって、例えば凍結初期の過冷却解除の発生や凍結速度などの細胞容器１２内の凍結状態を把握することができる。そして、細胞容器１２内の対象物である細胞を凍結させる際の温度降下の速度を、細胞の仕様条件に合わせた緩慢凍結の温度降下の速度となるように調整することができる。したがって、緩慢凍結により確実に細胞の凍結が行われ、解凍後の細胞の生存率が高められるという効果が得られる。

以上、本発明の第１実施形態から第３実施形態について詳述したが、本発明は、前記の第１実施形態から第３実施形態に限定されるものではなく、特許請求の範囲に記載された本発明の精神を逸脱しない範囲で、種々の設計変更を行うことができるものである。

１０、２０・・・凍結コンテナ装置
１１・・・台座
１１ａ、２１ａ、２２ａ、２３ａ・・・・貫通孔
１２・・・細胞容器
１２ａ・・・上皿
１２ｂ・・・下皿
１２ｃ・・・第１接触箇所
１２ｄ・・・凍結保護溶液
１２ｆ、１２ｇ、１２ｈ・・・第２接触箇所
１３・・・伝熱ロッド（支持部材:第１支持部材）
１３ａ、１４ａ・・・ねじ穴
１４、１５、１６・・・支持ピン（支持部材:第２支持部材）
１４ｂ・・・テーパ部
１７、１７Ａ・・・収容容器（第２断熱部材）
２１、２１Ａ、２２、２２Ａ、２３、２３Ａ・・・断熱部材（第１断熱部材）
２４、２５、２６、２７・・・固定ねじ
２８・・・金属ブロック
２９・・・カバー
４００・・・恒温槽庫
４０１・・・冷却装置
４０２・・・制御装置

Claims (8)

1. 細胞を含む凍結保護溶液が貯留された細胞容器を収容し、低温の恒温槽庫内において前記細胞容器を冷却して前記細胞を凍結させる凍結コンテナ装置であって、
   台座と、
   該台座から突出して前記台座の上に前記細胞容器を支持する複数の支持部材と、
   を備え、
   前記複数の支持部材は、
   所定の熱伝導率を有する第１支持部材と、
   該第１支持部材よりも熱伝導率の低い第２支持部材と、
   を有することを特徴とする凍結コンテナ装置。
2. 前記複数の支持部材により前記細胞容器を支持した状態で前記台座と前記細胞容器との間に介在される第１断熱部材を備えていることを特徴とする請求項１に記載の凍結コンテナ装置。
3. 前記複数の支持部材により支持された前記細胞容器を覆い、前記台座との間に前記細胞容器を収容する室内空間を形成する第２断熱部材を備えていることを特徴とする請求項２に記載の凍結コンテナ装置。
4. 前記複数の支持部材は、一以上の前記第１支持部材と、二以上の前記第２支持部材を有し、前記第１支持部材の少なくとも一つと前記第２支持部材の少なくとも一つが、前記細胞容器の底面でかつ該底面に沿った方向一方側と他方側に離間した位置を支持するように配置されていることを特徴とする請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の凍結コンテナ装置。
5. 前記台座及び前記第１支持部材は、金属材料により構成され、前記第２支持部材は、合成樹脂材により構成されていることを特徴とする請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の凍結コンテナ装置。
6. 前記細胞容器とともに前記室内空間に収容される予め設定された熱容量を有する蓄熱体を備えることを特徴とする請求項３に記載の凍結コンテナ装置。
7. 前記蓄熱体は、前記細胞容器の上に載置される金属ブロックからなることを特徴とする請求項６に記載の凍結コンテナ装置。
8. 請求項１から請求項７のいずれか一項に記載の凍結コンテナ装置と、
   該凍結コンテナ装置を収容する恒温槽庫と、
   該恒温槽庫の庫内を冷却する冷却装置と、
   前記恒温槽庫の庫内において温度を計測する温度計測装置と、
   該温度計測装置により計測された温度に基づいて前記冷却装置を制御する制御装置と、
   を備えることを特徴とする凍結システム。

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