JP2019526645A - シーラント製剤及びその使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、血液由来のフィブリノゲン濃縮物と、二価カチオンと、第ＸＩａ因子とを含む、保存安定性水性シーラント製剤に関する。

Description

本開示は、フィブリノゲン系シーラント又はフィブリンシーラント製剤に関する。

本開示の主題の背景として関連性があるとみなされる参照文献を以下に列記する。

本明細書において上記参照文献を承認することは、これらが本開示の主題の特許性と何らかの形で関連すると解釈することを示唆するものではない。
−米国特許第５，９８５，３１５号
−国際公開第９３／０５８２２号
−米国特許第５，７９２，８３５号
−米国特許第５，９８５，３１５号
−米国特許第６，９１６，９１１号
−米国特許第８，９６２，０３３号
−欧州特許第１ ３５１ ７０５号。

（背景技術）
生物学的糊／シーラントは、当該技術分野において記載されている。例えば、二成分糊が米国特許第５，９８５，３１５号に開示されている。具体的には、米国特許第５，９８５，３１５号は、フィブリノゲンと、水溶液中で自発的に凝固せず、カルシウムイオンを含有する成分を添加することによって凝固することができる少なくとも１つの凝固因子とを含む、血漿由来の生物学的糊を調製する方法を記載している。

更に、国際公開第９３／０５８２２号は、全血寒冷沈降物及びタンパク質分解酵素を含む組織糊を記載している。

米国特許第５，７９２，８３５号は、フィブリノゲン、第ＩＩ因子、及び少量のプラスミノゲンを含む血漿から局所用フィブリノゲン複合体を調製する方法を記載している。

米国特許第６，９１６，９１１号は、少なくとも６個のフィブリノゲン単位を有するフィブリノゲン多量体を含むフィブリンシーラントを調製する方法を記載している。

米国特許第８，９６２，０３３号は、フィブリンマトリクスの調製、具体的には、滲出性組織上にフィブリンマトリクスを塗布するための方法であって、固体フィブリンシーラントブレンドをある量当該組織上に塗布することであって、当該固体ブレンドは、フィブリノゲンと反応したときにフィブリンを形成することができるタンパク質分解性酵素を含む、塗布することと、次いで、ある量の液体フィブリンシーラントを固体フィブリンシーラント上に塗布することとを含む、方法を記載している。固体フィブリンと液体フィブリンシーラントとを組み合わせると、組織上にフィブリンマトリクスが形成される。

最後に、欧州特許第１ ３５１ ７０５号は、組換え第ＶＩＩａ因子及びフィブリノゲンの組み合わせの静脈内投与後の出血の治療に有効な当該組み合わせを記載している。

本開示は、フィブリノゲン、カルシウムイオン、及び第ＸＩａ因子（本明細書では略記によってＦＸＩａとも称される）を含む一成分／単一成分のシーラント（糊）製剤の開発に基づくものである。驚くべきことに、単一成分シーラントとしてのこれら成分の組み合わせは保存安定であるが、血液と接触すると、自発的に凝固することが見出された。

この知見に基づいて、本開示は、その第１の態様によれば、血液由来のフィブリノゲン濃縮物、二価カチオン、及び第ＸＩａ因子を含む保存安定性水性シーラント製剤であって、２０℃〜２５℃の温度で少なくとも５分間安定である、シーラント製剤を提供する。

第２の態様によれば、（ｉ）血液由来のフィブリノゲン濃縮物と、二価カチオンと、第ＸＩａ因子とを含む保存安定性水性シーラント製剤を保持する容器であって、シーラント製剤が、２０℃〜２５℃の温度で少なくとも５分間安定である、容器と、（ｉｉ）シーラント製剤を中を通して送達するための再封止可能な開口部と、を備える、アプリケータが本開示によって提供される。

更に第３の態様によれば、シーラント製剤を保持する支持マトリクスを含む創傷包帯であって、シーラント製剤が、血液由来のフィブリノゲン濃縮物と、二価カチオンと、第ＸＩａ因子とを含む保存安定性水性シーラント製剤を含み、シーラント製剤が、２０℃〜２５℃の温度で少なくとも５分間安定である、創傷包帯が本開示によって提供される。

更に、第４の態様によれば、フィブリン凝塊の形成を促進するための方法であって、血液由来のフィブリノゲン濃縮物と、二価カチオンと、第ＸＩａ因子とを含む保存安定性水性シーラント製剤を血液と接触させることを含み、シーラント製剤が、２０℃〜２５℃の温度で少なくとも５分間安定である、方法が提供される。

更に、その第５の態様によれば、本開示は、創傷の治療を必要としている対象における創傷を治療する方法であって、血液由来のフィブリノゲン濃縮物と、二価カチオンと、第ＸＩａ因子とを含む保存安定性水性シーラント製剤を含み、２０℃〜２５℃の温度で少なくとも５分間安定である、シーラント製剤をある量、創傷の少なくとも一部上に塗布することを含み、シーラント製剤の量は、創傷と接触させたときに創傷において凝固を促進するのに有効である、方法を提供する。

本開示は、血液由来のフィブリノゲン濃縮物と、二価カチオンと、第ＸＩａ因子とを含むシーラント製剤保存安定性水性シーラント製剤を含む容器を備え、シーラント製剤が、２０℃〜２５℃の温度で少なくとも５分間安定である、キットを提供する。

本開示は、血液由来のフィブリノゲン濃縮物と、二価カチオンと、第ＸＩａ因子とを含む保存安定性水性シーラント製剤を製造する方法であって、その水性シーラント製剤が、２０℃〜２５℃の温度で少なくとも５分間安定であり、方法が、
ａ）血液由来のフィブリノゲン濃縮物成分を提供する工程と、
ｂ）第ＸＩａ因子成分を提供する工程と、
ｃ）二価カチオン成分を提供する工程と、
ｄ）製剤を得るために全ての成分を混ぜ合わせる工程と、
を含む、方法を提供する。

「混ぜ合わせる」という用語は、任意の順序、任意の組み合わせ、及び／又は部分的組み合わせで成分を混合することを意味する。

また、保存安定性水性シーラント製剤について本明細書で上記及び以下に記載される全ての実施形態及び定義は、本発明に係るアプリケータ、創傷包帯、方法、及び／又はキットに関する。

本明細書に開示される主題をよりよく理解し、実際にその主題をどのように実施することができるのかを例示するために、ここで添付の図面を参照しながら単なる非限定的な例によって実施形態について説明する。
試験した製剤（バイアル内）及びＣａ^２＋の添加後の凝塊形成（バイアル１〜８並びに対照バイアル９及び１０）を示す画像である。 凝固時間に対するＣａＣｌ_２濃度及び様々なＦＸＩａ濃度の効果を示すグラフである。

本開示は、その第１の態様によれば、血液由来のフィブリノゲン濃縮物と、二価カチオンと、第ＸＩａ因子とを含む保存安定性水性シーラント製剤であって、２０℃〜２５℃の温度で少なくとも５分間安定である、シーラント製剤を提供する。

本発明の状況において、用語「シーラント製剤」は、単一成分／一成分の接着剤／糊／止血剤として理解されるべきであり、当該製剤は、組織及び／又は血液と接触すると、例えば組織に近接すると反応し、その後凝塊を形成して組織接着剤として作用し、それによって、出血を止める、構造物を接合する、及び／又は例えば脳脊髄液（ＣＳＦ）、リンパ液、胆汁、胃腸（ＧＩ）内容物、肺からの漏気などの生理学的漏出を封止する成分を有する。いくつかの実施形態では、シーラント製剤は治療薬も含み、その結果、体内で形成された凝塊が自然に分解したときに治療薬が放出される。治療薬は、抗生物質、鎮痛剤、抗炎症薬、制癌薬などの薬物、例えば、ヒト又は他の起源由来の任意の種類の幹細胞、例えば胚幹（ＥＳ）細胞、成体幹細胞、多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）などを含む細胞であってよいが、これらに限定されない。

時に、シーラント製剤は「フィブリノゲン系シーラント」と称され、本明細書に開示される状況では、フィブリン糊、フィブリンシーラント、フィブリン接着剤、フィブリン膜、フィブリン網状組織、フィブリン格子、フィブリンメッシュ、フィブリングリード（greed）、及びフィブリンゲルを形成する又は意味するものとして理解されるべきである。

シーラント製剤は、少なくともフィブリノゲン、二価カチオン、及び第ＸＩａ因子のブレンドを含む。「ブレンド」と称するとき、それは、任意の形態の混合物、少なくとも前述の三成分の均質な及び非均質な混合物として理解されるべきである。このブレンドは、以下に更に詳述されている他の成分を含んでもよい。

驚くべきことに、水性製剤中に二価カチオンが存在するにもかかわらず、シーラント製剤は不活性である、すなわち、選択された保存条件下で十分な時間にわたって自発的に凝固しないことが見出された。シーラント製剤が血漿又は血液と接触したとき、第ＸＩａ因子は凝固機構の下流の固有成分を活性化し、これは次に、製剤内のフィブリノゲンの存在下で、糊の形成をもたらす。

シーラント製剤は水性製剤である。「水性製剤」に言及するとき、それは、水分子を含有する液体又は固体の形態の成分のブレンドを包含すると理解されるべきである。いくつかの実施形態では、水性製剤は液体形態である。液体形態であるとき、液体キャリアが本質的に中性のｐＨ、例えば、ｐＨ ７．０±０．５を有するバッファであるのは、いくつかの実施形態に係る。

いくつかの他の実施形態では、製剤は固体形態である。いくつかの実施形態では、製剤は冷凍されている。使用前に、製剤を解凍することができる。

更にいくつかの他の実施形態では、製剤は粉末の形態であり、例えば凍結乾燥されており、使用前に又は標的部位（例えば組織）上への塗布中に、粉末を、水性の保存に好適な溶液又は血液で湿らせる。

シーラント製剤は、保存安定性である。用語「保存安定性」又は「安定性」は、予め選択された保存温度、予め選択された製剤の物理的状態（例えば、流体／液体、固体など）を含む、予め選択された保存条件（以下を参照されたい）下で安定である製剤に言及すると理解されるべきである。安定性は、例えば製剤が液体形態であるとき、予め選択された保存条件下で製剤中に視認できる凝集体及び／又はフィブリン凝塊が存在しないことを試験することによって判定することができる。また、安定性は、例えば、凝固アッセイ及び／又はウェスタンブロット及び／又はイムノアッセイによって、予め選択された保存条件下で製剤の保存後に製剤中のフィブリノゲン含有量を測定することによって判定することもできる。更に、本開示によれば、安定なシーラント製剤に言及するとき、それは、使用時に、製剤の保存条件にかかわらず有効な凝固時間を有すると理解されるべきであり、例えば、シーラント製剤は、室温又は低温で保存されたかどうかにかかわらず本質的に同じ期間で凝固する。

更に又はあるいは、また本開示によれば、安定なシーラント製剤に言及するとき、予め選択された保存条件下で保存した後及び使用時に、３７℃に設定されたＤｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ ＳＴＡＲＴ（商標）凝固機を使用して測定したとき、例えば、サンプルを６０秒間インキュベートし、続いて、Ｕｎｉｃａｌｉｂｒａｔｏｒを添加し、次いで、３７℃における凝固時間を測定したとき、製剤が５００秒以下の凝固時間を有すると理解されるべきである。

例えば１００〜５００秒の範囲などの５００秒以下の凝固時間は、例えば、組織（例えば、皮弁）を接合させるために（血液又は血漿成分の存在下で）有益であり得る。

一実施形態では、一成分シーラントは、出血の再発を予防するために使用されるが、その理由は生理学的血液凝固成分に基づくためである。

別の実施形態では、一成分シーラントは、例えば１００〜２００秒の時間範囲内など、２００秒以内の出血再発を停止又は予防するために使用される。

いくつかの実施形態では、予め選択された保存条件は、室温（すなわち２０℃〜２５℃）で保存することを含み、シーラント製剤は、少なくとも５分間、時には少なくとも１５分間、又は更には少なくとも１時間安定である。

更にいくつかの実施形態では、保存条件は２℃〜８℃で保存することを含み、シーラント製剤は、少なくとも１日間、少なくとも２、３、４、５、６、又は更には７日間安定である。

いくつかの実施形態では、予め選択された保存条件は、−３０℃以下で保存することを含み、シーラント製剤は、少なくとも１ヶ月間、時には少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は更には１５ヶ月間安定である。

単一成分シーラント製剤は、少なくとも以下の成分を含む：
−血液由来のフィブリノゲン濃縮物、
−二価カチオン、及び
−第ＸＩａ因子。

「血液由来のフィブリノゲン濃縮物」に言及するとき、それは、フィブリノゲンに加えて他の血液由来のタンパク質を含み、少なくともフィブリノゲンの濃度が全血中の濃度よりも高い組成物として理解されるべきである。いくつかの実施形態では、フィブリノゲン濃縮物は、全乾物のうち少なくとも５０％ｗ／ｗのフィブリノゲンを含む。

いくつかの実施形態では、フィブリノゲン濃縮物は、純粋なフィブリノゲン以外である。これは、純粋なフィブリノゲンを使用するとき、製剤が自発的に凝固するという、本明細書に提供される知見によって支持される。換言すれば、本明細書に開示される知見に基づいて、理論に束縛されるものではないが、血液由来のフィブリノゲン濃縮物中に存在する成分が製剤の安定性に必要であると結論付けられた。

したがって、いくつかの実施形態によれば、フィブリノゲンに加えて、フィブリノゲン濃縮物は、フィブロネクチン、アルブミン、並びに免疫グロブリン、プラスミン（プラスミノゲン）、ｖＷＦ、第ＶＩＩＩ因子、アンチトロンビンＩＩＩ、及びセルピンタンパク質から選択される残留タンパク質（残留タンパク質は全濃縮物組成物のうち合計１％ｗ／ｖ以下）のうちの少なくとも１つ、好ましくは、２つ以上の組み合わせを含有する。

驚くべきことに、純粋なフィブリノゲンに基づく製剤は安定ではないことが（以下の実施例に示すように）見出されたが、その理由は、カルシウムの存在下で自発的に凝固したためである。対照的に、フィブリノゲン濃縮物、すなわちＢＡＣ２（低温枯渇（cryo-depletion）プロセスを使用して生成された）に基づく製剤は、カルシウムの存在下で安定であった。理論に束縛されるものではないが、これは、フィブリノゲンの安定化に役立つ追加成分の存在によるものである可能性がある。したがって、非純粋なフィブリノゲン（例えば、血漿又は血液に由来するもの）が好適な単一成分シーラント製剤を得るために必須であると更に結論付けられた。

いくつかの実施形態では、フィブリノゲン濃縮物は、少なくとも４０ｇ／Ｌ（４％）／４０ｇ／Ｌ（４％）以上の凝固性タンパク質、すなわち、主にフィブリノゲンを含み、第ＸＩＩＩ因子−２〜９ＩＵ／ｍＬ、フィブロネクチン−０．５〜６ｍｇ／ｍＬ）、及びアルブミン−９〜３０ｍｇ／ｍＬなどの追加のタンパク質を含むタンパク質を含有する。

いくつかの実施形態では、血液由来のフィブリノゲン濃縮物は、寒冷沈降したフィブリノゲンを含む。いくつかの実施形態では、血液由来のフィブリノゲン濃縮物は、寒冷沈降したフィブリノゲンである。本開示の状況において、用語「寒冷沈降したフィブリノゲン」は、凍結血漿から得られたフィブリノゲンを指し、後者は全血から調製される。寒冷沈降物は、凍結血漿を低温、典型的には０〜４℃の温度で解凍し、その結果、当該フィブリノゲンを主に含有する沈殿物が形成されたときに得ることができる。この沈殿物は、例えば遠心分離によって収集し、１２０ｍＭの塩化ナトリウム、１０ｍＭのクエン酸三ナトリウム、１２０ｍＭのグリシン、９５ｍＭのアルギニン塩酸塩を含有するバッファなどの好適なバッファに溶解することができる。いくつかの実施形態では、フィブリノゲン溶液は、例えば、第ＸＩＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、フィブロネクチン、フォンビルブランド因子（ｖＷＦ）、ビトロネクチンなどのいずれか１つ又は組み合わせなどの追加の因子を含む。

いくつかの実施形態では、寒冷沈降したフィブリノゲンは、血漿の生物学的活性成分（biologically active component、ＢＡＣ）とみなされる。

数種類のＢＡＣが存在し、全て好ましくはウイルス不活性化されている。

一部の実施形態では、ＢＡＣは、抗線維素溶解剤としてトラネキサム酸を含有する、生物的に活性な構成成分である。トラネキサム酸を含有しているＢＡＣは、製品名Ｑｕｉｘｉｌ（Ｏｍｒｉｘ、イスラエル）によって、時として知られている。

いくつかの他の実施形態では、ＢＡＣは、トラネキサム酸を含有していない、生物的に活性な構成成分である。これは、第２世代ＢＡＣと考えられ、ＢＡＣ２と当分野では呼ばれている。ＢＡＣ２の調製中に、プラスミノゲン（フィブリノゲン及びフィブリンを分解するプラスミンの酵素前駆体）が除去される。

ＢＡＣは、それらの内容が参照により組み込まれる、米国特許第６，１２１，２３２号及び／又は国際公開第９８／０３３５３３号に記載されているとおりに調製することができる。ＢＡＣの組成物は、抗線維素溶解剤（例えばトラネキサム酸）及びアルギニン塩酸塩を含むことができる。ＢＡＣ中のトラネキサム酸などの抗線維素溶解剤の量は、約８０〜約１１０ｍｇ／ｍＬとすることができる。

ＢＡＣ２は、その内容が参照により本明細書に組み込まれる欧州特許第５３４ １７８号の開示に従って、成分Ａとして調製することができる。例えば、成分Ａは、濃縮された寒冷沈降物から調製され、溶媒界面活性剤処理及び低温殺菌によって、ウイルスの不活性化を受ける。

いくつかの実施形態では、血液由来のフィブリノゲン濃縮物は、ＢＡＣ２、すなわち、主にフィブリノゲンを含む、濃縮されたウイルス不活性化寒冷沈降物であり、プラスミノゲンが枯渇している（欧州特許第１ ３９０ ４８５号に記載されているようにプラスミノゲンの除去を行うことができる）。ＢＡＣ２は、トラネキサム酸を含まない。

いくつかの実施形態では、血液由来のフィブリノゲン濃縮物は、第ＶＩＩＩ因子の製造プロセスの副生成物であり、酸沈殿物、寒冷沈殿物、水酸化アルミニウム沈殿物（例えば、その内容が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，４５５，３００号を参照されたい）、グリシン沈殿物（例えば、その内容が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，２９７，３４４号を参照されたい）、エタノール沈殿物、及びヘパリン沈殿ペーストからなる群から選択される。第ＶＩＩＩ因子の製造プロセスの副生成物としての血液由来のフィブリノゲン濃縮物は、その内容が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，３２８，３３８号にも記載されている。

いくつかの実施形態では、寒冷沈降したフィブリノゲンは、総タンパク質−３０〜６０ｍｇ／ｍＬ、ＴＶＣ≦１０００ＣＦＵ／ｍＬ、第ＸＩＩＩ因子−２〜９ＩＵ／ｍＬ、フィブロネクチン−０．５〜６ｍｇ／ｍＬ、及び凝固性フィブリノゲン−１８〜３９ｍｇ／ｍＬを含有する遠心分離後の新鮮な凍結血漿沈殿物を意味するが、これには限定されない。

更にいくつかの他の実施形態では、血液由来のフィブリノゲン濃縮物は、時にペーストＩとも呼ばれる、懸濁又は沈殿したコーン画分Ｉを含むか又はその画分である。

コーン分画は、様々な血漿タンパク質の等電特性の違いを利用するプロセスであり、沈殿によってタンパク質を５つの「画分」（Ｉ〜Ｖ）に分離するために、ｐＨ、エタノール濃度、及び温度を変化させることを伴う一連の精製工程を含む。Ｃｏｈｎプロセスは、低温エタノール沈殿としても知られており、例えば、米国特許第２，３９０，０７４号、及びＣｏｈｎ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．６８：４５９，１９４５、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．７２：４６５〜４７４，１９５０）に記載されている。

特に、本開示の状況において、「懸濁又は沈殿したコーン画分Ｉ」に言及するとき、それは、本明細書で上記に言及されたコーンプロセスだけではなく、それによって少なくともフィブリノゲンが沈殿するエタノール分画の任意の生成物を包含すると理解されるべきである。

一般に、懸濁又は沈殿したコーン画分Ｉを得るために、血漿をエタノール濃縮に供する。具体的には、コーン沈殿物Ｉ（画分Ｉ）は、８〜１０％のエタノール濃度において−３℃〜−５℃及び中性のｐＨで沈殿させることによって、解凍されたプール血漿から得られる。遠心分離により回収されたペーストは、時に寒冷沈降物とほぼ同じタンパク質を含有するが、９０％を超えるフィブリノゲン収率を含むと考えられる［Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌａｓｍａ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｏｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｓｅ；Ｂｅｒｔｏｌｉｎｉ，Ｇｏｓｓ ａｎｄ Ｃｕｒｌｉｎｇ ２０１３，ｐａｇｅ １４１］。

純粋なフィブリノゲンではない限り、任意の他の血液由来のフィブリノゲン濃縮物を本開示に従って使用することができる。

フィブリノゲン濃縮物は、商業的に入手することもできる。フィブリノゲンの例としては、ＥＶＩＣＥＬ（すなわち、ＢＡＣ２）のフィブリノゲン成分、Ｔｉｓｓｅｅｌ（アプロチニンを含有する、抗線維素溶解剤）のフィブリノゲン成分が挙げられるが、これらに限定されない。

血漿由来のフィブリノゲン濃縮物は、その中の凝固性タンパク質の量によって定義することができる。

本開示の状況において、「凝固タンパク質」に言及するとき、それは、凝固カスケードに関与する血漿タンパク質をいずれも包含すると理解されるべきである。当該技術分野において許容可能なように、凝固性タンパク質は、主にフィブリノゲンを含むが、第ＸＩＩＩ因子、フィブロネクチン、及びアルブミンなどの追加のタンパク質も少量含む。

「凝固性タンパク質」の％は、例えば、凝固性タンパク質及び総タンパク質の定量から計算することができる。「総タンパク質」は、０．２モル／Ｌの水酸化ナトリウム及び７モル／Ｌの尿素を含有する可溶化バッファでサンプルを希釈し、２８０ｎｍにおける当該サンプルの吸光度を、世界保健機関国際規格（Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ Ｈｕｍａｎ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ ９８／６１４）に対して較正された、同様に処理されたハウス標準の吸光度と比較することによって、定量することができる。「凝固性タンパク質」は、希釈したサンプルをトロンビン（４ＩＵ／ｍｌ）で凝固させ、リン酸緩衝生理食塩水（１：２ ＰＢＳ：生理食塩水）で凝塊を洗浄し、それを濾過紙上で乾燥させることによって定量することができる。次いで、乾燥した凝塊を可溶化バッファに溶解させ、２８０ｎｍにおける吸光度を、上述の世界保健機関国際規格に対して較正された、同様に処理されたハウス標準の吸光度と比較することによって、凝固性タンパク質の％を求めることができる。

いくつかの実施形態では、血漿由来のフィブリノゲン濃縮物は、血漿由来のフィブリノゲン濃縮物中のタンパク質の総量のうち最大７９．８％の凝固性タンパク質を含む（総タンパク質１００ｍｇ／ｍＬのうち７９．８ｍｇ／ｍＬ）。

一実施形態では、血漿由来のフィブリノゲン濃縮物は、６５％〜７８％、時には６８％〜７８％、更に時には６８％〜７２％、更に時には約７０％の凝固性タンパク質を含む。

別の実施形態では、濃縮フィブリノゲンは、約９６〜約１２５ｍｇ／ｍＬの範囲の総タンパク質と、約７２〜約１１０ｍｇ／ｍＬの範囲の凝固性タンパク質とを含む。

別の実施形態では、濃縮フィブリノゲンは、約８０〜約１２０ｍｇ／ｍＬの範囲の総タンパク質と、約５０〜約９０ｍｇ／ｍＬの範囲の凝固性タンパク質とを含む。いくつかの更なる又は別の実施形態では、血漿由来のフィブリノゲン濃縮物は、フィブロネクチンの相対濃度、すなわち、フィブロネクチンのフィブリノゲンに対するモル比として定義される、フィブロネクチンのフィブリノゲンに対する割合によって特徴付けられる。

いくつかの実施形態では、フィブロネクチンのフィブリノゲンに対する比は、０．０１６以上又は０．０６５以上である。

いくつかの実施形態では、フィブロネクチンのフィブリノゲンに対する比は、約０．０６８以上（すなわち、比は０．０６８を超える）、時には約０．０７８以上（すなわち、比は０．０７８を超える）であり、時には比は、０．１以上、０．５以上、１．０以上、１．５以上である。

いくつかの実施形態では、フィブロネクチンのフィブリノゲンに対するモル比は、２以下（すなわち、比は２未満である）であり、時には１．５未満、時には１．０未満、時には０．５未満、又は時には０．１未満である。

いくつかの実施形態では、フィブロネクチンのフィブリノゲンに対するモル比は、０．１〜２．０である。

更にいくつかの他の実施形態では、フィブロネクチンのフィブリノゲンに対するモル比は、０．１〜０．２である。

また、血漿由来のフィブリノゲン濃縮物は、フィブリノゲンの絶対濃度によって特徴付けることもできる。いくつかの実施形態では、フィブリノゲン濃度は、１３〜８５ｍｇ／ｍＬ、例えば、１３〜２９ｍｇ／ｍＬ、時には１３〜２１ｍｇ／ｍＬ（４０〜６３μＭに等しい）、時には１３〜１７ｍｇ／ｍＬ、又は１４〜１８ｍｇ／ｍＬ、又は１５〜１９ｍｇ／ｍＬ、又は１６〜２０ｍｇ／ｍＬ、又は１７〜２１ｍｇ／ｍＬである。

二価カチオンは、本発明の状況において、Ｃａ^２＋、Ｍｇ^２＋、Ｆｅ^２＋、Ｍｎ^２＋が挙げられるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、二価カチオンはカルシウムカチオンである。いくつかの実施形態では、カルシウムカチオンは塩化カルシウムに由来する、すなわち、製剤は塩化カルシウムを用いて調製される。

いくつかの実施形態では、ＣａＣｌ_２の濃度は、約０．１５〜０．５ｍｇ／ｍＬ（３．７０〜１２．５０ｍＭに等しい）、時には０．１５〜０．２５ｍｇ／ｍＬ（３．７０〜６．２５ｍＭに等しい）、時には０．２５〜０．５ｍｇ／ｍＬ（１．８５〜１２．５０ｍＭに等しい）である。

いくつかの実施形態では、好ましくは二価カチオンがＣａ^２＋であるとき、濃度は約３．７５〜７．５０ｍＭの範囲である。

第ＸＩａ因子を参照すると、それは、天然の血液由来の酵素、組換え第ＸＩａ因子、又は止血中に基質である第ＩＸ因子を活性化することができるこれらの任意のアナログを包含すると理解されるべきである。

いくつかの実施形態では、ＸＩａは、０．０１〜１１０μｇ／ｍＬ、０．１１〜１１０μｇ／ｍＬの量であり、例えば、０．１１μｇ／ｍＬ超かつ１１０μｇ／ｍＬ以下の量である。

シーラント製剤は、上記３つの列挙された成分以外の追加成分を含み得る。

いくつかの実施形態では、シーラント製剤は、第ＸＩＩＩ因子、抗線維素溶解剤（例えば、アミノカプロン酸（ε−アミノカプロン酸）、アプロチニン及びトラネキサム酸）、抗生物質、安定剤、例えば、アルギニン、リシン、フィブロネクチン、フォンビルブランド因子；ＲＧＤペプチド；成長因子、軟骨誘発因子、類骨誘発因子、骨成長因子、コラーゲン成長因子；サイトカイン；インターフェロン；ホルモン；治療剤（抗微生物剤、抗炎症剤など）；抗癌薬；化学療法剤；鎮痛剤；インターロイキン；ミネラル；細胞移動、接着及び／又は増殖を刺激する分子；酵素；神経栄養因子（神経成長因子（ＮＧＦ）など）；毛様体神経栄養因子（ciliary neurotrophic factor、ＣＮＴＦ）、これらの薬学的に許容される塩、又はこれらの混合物から選択される１つ以上の追加成分を含む。シーラントの添加剤は、シーラント製剤の当業者に公知のとおり選択される。可能なシーラントの追加成分のリストは、とりわけ、その内容が本明細書に参照として組み込まれる米国特許第８，８５８，９６９号（Ｚ−Ｍｅｄｉｃａ）「Ｈｅｍｏｓｔａｔｉｃ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ，Ｄｅｖｉｃｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ」及び米国特許出願公開第２０１４／０２７１６１０号（Ｏｒｔｈｏｖｉｔａ）「Ｇｅｌａｔｉｎ ａｎｄ Ａｌｇｉｎａｔｅ Ｂａｓｅｄ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ」に見出すことができる。

シーラント添加物は、ヒト若しくは哺乳動物の血漿から単離することができるか、又は組変え体とすることができる。

いくつかの実施形態では、シーラント製剤は、ビタミンＫ依存性凝固酵素原が枯渇している／を含まない。いくつかの実施形態では、シーラント製剤は、第ＩＸ因子酵素原が枯渇している。用語「枯渇している」を使用することにより、当該酵素原を欠いている、又は活性化された場合にシーラント製剤の凝固を引き起こす効果のない量しか含まないと理解されるべきである。

いくつかの実施形態では、ビタミンＫ依存性凝固酵素原は、ＦＩＩ、ＦＶＩＩ、ＦＩＸ、及びＦＸ酵素原から選択される。Ｇｒｏｂｅｒ Ｕによって記載されているように、ビタミンＫは、多くのビタミンＫ依存性タンパク質中の特定のグルタミン酸（Ｇｌｕ）残基のｇ−カルボキシル化に必須である。得られるｇ−カルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）化合物は、カルシウムイオンの複合体結合を引き起こして、タンパク質の立体構造を変化させることができ、これは、その生理学的機能のための前提条件である。このようにして、例えば、翻訳後修飾によって、前駆体から凝固因子ＩＩ（プロトロンビン）、ＶＩＩ、ＩＸ、及びＸが生じる。［参照文献Ｇｒｏｂｅｒ Ｕ，Ｒｅｉｃｈｒａｔｈ Ｊ，Ｈｏｌｉｃｋ ＭＦ，Ｋｉｓｔｅｒｓ Ｋ．Ｖｉｔａｍｉｎ Ｋ：ａｎ ｏｌｄ ｖｉｔａｍｉｎ ｉｎ ａ ｎｅｗ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ．Ｄｅｒｍａｔｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２０１５ Ｊａｎ ２１；６（１）］。

いくつかの実施形態では、ビタミンＫ依存性凝固酵素原は、プロトロンビン（ＦＩＩ）である。

いくつかの実施形態では、シーラント製剤は、トロンビンもトロンビンの機能性アナログも含まない。本開示の状況において、「トロンビン（又はその機能性アナログ）を含まない」とは、製剤が残留トロンビンを含有していてもよいが、シーラント製剤の凝固を引き起こすには無効／不十分な量であると理解されるべきである。いくつかの実施形態では、トロンビン（又はその機能性アナログ）を含まないとは、１ＩＵ／ｍＬ以下の量のトロンビンを包含する。更にいくつかの他の実施形態では、トロンビン（又はその機能性アナログ）を含まないとは、外添されたトロンビン（又はその機能性アナログ）を欠いている、すなわち、フィブリノゲン濃縮物に由来しないトロンビン（又はその機能性アナログ）を欠いていることを指す。

本開示の状況において、「トロンビンの機能性アナログ」に言及するとき、それは少なくともフィブリノゲンを切断してフィブリンを形成することができる実体を意味すると理解されるべきである。

トロンビンの量は、トロンビン抗体を使用してＥＬＩＳＡによって決定することができる。更に又はあるいは、トロンビンは、凝固機を使用してトロンビン活性試験によって定量することができる。

シーラント製剤は、例えば、出血している創傷を治療するため、例えば脳脊髄液、リンパ液、胆汁、胃腸（ＧＩ）内容物、肺からの漏気などの生理学的漏出を封止するため、組織若しくは材料を組織に接着するため、又は例えば上述のように凝塊の自然分解の際に薬物若しくは細胞が放出される、薬物若しくは細胞の送達装置物質としての様々な用途を有し得る。

シーラント製剤の塗布については、シーラント製剤を医療装置／アプリケータ内に収容してもよい。したがって、本開示の更なる態様によれば、アプリケータは、（ｉ）本明細書に開示されるシーラント製剤を保持する容器と、（ｉｉ）シーラント製剤を中を通して送達するための再封止可能な開口部とを備える。

いくつかの実施形態では、アプリケータはシリンジの形態である。

いくつかの実施形態では、アプリケータは、（例えば、封止を必要とする標的組織上に製剤を噴霧又は滴下することによって）液体製剤を微細な液滴として塗布するネブライザ又はディスペンサの形態である。一部の実施形態では、例えば、大きな表面積を出血から封止する必要がある場合、噴霧が一般に使用される。例えば、生検後に、出血が、封止領域から起こっている場合、ドリップが一般に使用される。代替として、噴霧及びドリップは、同一手順で使用することができる。

いくつかの実施形態では、アプリケータの開口部は再封止可能である。

バレル内のシーラント製剤は、液体又は固体（凍結）の形態であってよい。いくつかの実施形態では、アプリケータは、液状形態のシーラント製剤保持するシリンジの形態にある。

アプリケータは、使い捨てであってよい、すなわち、シーラント製剤の全て又は一部が容器から排出された後に廃棄されるものであってよい。または、アプリケータは、その開口部が使用と使用との間に、再封止されるように、複数回使用向けに設計されていてもよい。

いくつかの他の実施形態では、アプリケータは、シーラント製剤を保持する支持マトリクスを含む創傷包帯の形態である。

支持マトリクスは、創傷上に塗布される絆創膏、フォームパッドなどの形態であってよい。いくつかの実施形態では、支持マトリクスは、例えばその上で製剤が吸収される、浸漬される、又は膨潤するなど、ウエットワイプに使用されるものなどの不織布であるか、又はその不織布を含む。

シーラント製剤を含む支持マトリクスは、それぞれが使用前に開封されるサシェなどの、好ましくは立体的に封止された容器内に入れてよい。

シーラント製剤の送達様式は、必要な封止のタイプ／程度、（封止を必要とする）開口部のタイプ／寸法、及び医師によって認識される他の検討事項などの様々な検討事項に基づいて決定され得る。

シーラント製剤は、生物学的糊を必要とする様々な医療方法に適用可能である。

したがって、一態様によれば、本明細書に開示されるシーラント製剤を標的組織に塗布することを含む、その場でのフィブリン凝塊／マトリクス形成を促進するための方法が提供される。

いくつかの実施形態では、方法は、創傷の治療を必要としている対象における創傷を治療するためのものであり、方法は、本明細書に開示されるシーラント製剤をある量、当該創傷の少なくとも一部に塗布することを含み、当該シーラント製剤の量は、当該創傷と接触させた後に当該創傷においてフィブリン凝塊の形成を促進するのに有効である。

理論に束縛されるものではないが、製剤の成分を使用して凝固カスケードを開始させるのは血液（例えば、創傷領域に存在する）とシーラント製剤とのその場での接触である。

したがって、いくつかの実施形態では、方法は、創傷、好ましくは血液含有創傷を治療することを含む。いくつかの実施形態では、創傷は出血している創傷である。

代用血漿とブレンドされると、〜２００秒以内に凝固が生じる（試験に列挙される濃度に応じて変化する）ことが見出された。

最後に、本明細書では、別の態様によれば、本明細書に開示されるシーラント製剤と、所望によりアプリケータとを含むキットが提供される。いくつかの実施形態では、キットは、創傷における凝固を促進するためのシーラント製剤の使用説明書も含む。使用説明書は、創傷に塗布する前にシーラント製剤を調製する工程、及び／又はシーラント製剤を創傷の少なくとも一部上に塗布する工程を含んでいてよい。いくつかの実施形態では、キットは、血液由来のフィブリノゲン濃縮物と、二価カチオンと、第ＸＩａ因子とを含む保存安定性水性シーラント製剤を含む容器であって、シーラント製剤が、２０℃〜２５℃の温度で少なくとも５分間安定である、容器を備える。いくつかの実施形態では、容器はアプリケータの形態である。いくつかの実施形態では、アプリケータは、創傷の少なくとも一部にシーラント製剤を塗布することを容易にするように構成されている。いくつかの実施形態では、アプリケータはシリンジである。いくつかの実施形態では、キットはアプリケータを更に備える。

いくつかの実施形態では、シーラント製剤は乾燥又は固体の形態であり、説明書は、製剤を湿潤させることを含む。これに関して、キットは、時には生理食塩水などの湿潤剤を含んでいてもよい。

いくつかの更なる実施形態では、シーラント製剤は乾燥形態であり、説明書は、乾燥形態で創傷上に製剤を塗布して、それにより、創傷からの排出物若しくは血液自体によって湿潤させること、又は創傷上に塗布する前に乾燥製剤を湿潤させる工程を含む。

いくつかの実施形態では、キットは、アプリケータ内に即時使用可能なシーラント製剤を備え、いくつかの他の実施形態では、シーラント製剤は、カートリッジ又は他の保持ユニット／キャリア内で供給され、使用前にアプリケータに導入される。

本明細書で使用する場合、「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」の形態は、文脈上特に明示しない限り、単数及び複数の指示物を含む。例えば、用語「二価カチオン」は、凝固カスケードに関与することができる１つ以上のこのようなカチオンを含む。

更に、本明細書で使用するとき、用語「含む（comprising）」は、製剤が列挙された成分、すなわち、フィブリノゲン、二価カチオン、及び第ＸＩａ因子を含むが、他の追加成分を除外するものではないことを意味することを意図する。用語「から実質的になる（consisting essentially of）」は、列挙された成分を含むが、凝固カスケードに対して重要であり得る他の要素を除外する製剤を定義するために使用される。したがって、「からなる（consisting of）」は、他の要素のうちの微量要素を超えるものを除外することを意味するものとする。これらの移行用語の各々によって定義される実施形態は、本発明の範囲内にある。

更に、例えば、製剤を構成している成分の量又は範囲に言及するとき、全ての数値は、指定される値の（＋）又は（−）最大２０％、時には最大１０％変動する概算値である。常に明確に記載されていない場合であっても、すべての数値の表示は、「約」という用語が先行すると理解すべきである。

ここで、本発明を、本発明に基づいて実施された実験の以下の説明文にて例示する。これらの実施例は、限定というよりも例示という性質を帯びたものであることが意図されていると理解すべきである。明らかなことに、上の教示に照らし合わせて、これらの実施例の多数の修正及び改変が可能である。したがって、添付の特許請求の範囲内において、本発明は、本明細書の以下に具体的に記載されているよりも、他の多数の可能な方法で、実施され得ることを理解すべきである。

非限定的な実施例
以下の非限定的な実施例では、以下の材料を使用した。特に断りのない限り、全ての材料は２〜８℃で保存した。

ＣａＣｌ_２（０．０２５Ｍ）、Ｓａｉｆａｎ／Ｓｔａｇｏから入手し（ロット番号１０７８９）、２〜８℃で保存した。

ヒトアルブミン２５％アリコート（ＲＤ２２１０１４−０２）、Ｔａｌｅｃｒｉｓから入手した（ロット番号１１００８１）。

ヒト血漿：プロトロンビン時間、フィブリノゲン、第ＩＩ、Ｖ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ及びＸＩＩ因子、プロテインＣ及びプロテインＳ、アンチトロンビン（ＡＴ）、プラスミノゲン、並びに抗プラスミンを含む、この試薬に好適なＳＴＡ（登録商標）ラインの分析器において凝固パラメータの機能アッセイを行うための較正血漿として使用することを意図するＳＴＡ（登録商標）Ｕｎｉｃａｌｉｂｒａｔｏｒ（Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｐｌａｓｍａ，Ｓｔａｇｏ、カタログ番号００６２５の代用品）。ＴＳＢバッファ−１ＬのＰｕＷ（ｐＨ７．４）中６．０５ｇのトリス塩基、９ｇのＮａＣｌ、及び０．２ｇのアジ化ナトリウムから調製した（「ＮＡＰＴＴ」に関して、非活性化部分トロンボプラスチン時間は、全ての関連する凝固因子を溶液に添加した後に凝塊を形成するまでの時間である。このアッセイは、血漿及び血漿画分中の活性化凝固因子の存在を評価する。それが残留物であるか意図する凝固因子であるか）

第ＸＩａ因子（１／５０００）のアリコート（ＲＤ１７１１１３−０１）、Ｔａｒｏｍ／ＨＴＩから入手し（ロット番号ＣＣ０７０９）、＜−６５℃で保存した。

ＢＡＣ２は、主にフィブリノゲン（約８５％）からなり、プラスミノゲンが枯渇しており（プラスミノゲンの除去は、典型的には、欧州特許第１，３９０，４８５号に記載されているように実施される）、抗線維素溶解剤が添加されていない、ヒト血漿の濃縮されたウイルス不活性化寒冷沈降物である（この寒冷沈降物は、典型的には、欧州特許第５３４，１７８号に記載されているように調製される）。

実施例１：最低安定期間の決定
この研究には二重の目的があった。

「保存安定性」−これら成分を７２時間インキュベートし、凝塊が形成されているかどうかを調べることによって、ＦＸＩａ及びフィブリノゲンを含有する溶液の保存安定性を判定する。

「活性」−７２時間の保存期間に続いて、（生理学的環境をシミュレートするために）Ｕｎｉｃａｌｉｂｒａｔｏｒ及びリン脂質を添加することによって測定したときの、溶液が凝塊を形成する能力を判定する。

室温又は４℃でのＦＸＩａ＋ＢＡＣ２（Ｏｍｒｉｘ−Ｅｔｈｉｃｏｎフィブリンシーラントのフィブリノゲン成分）を７２時間にわたって評価した。

安定性
表１に試験した製剤を要約する。ＢＡＣ２と第ＸＩａ因子との比は、１：１〜１０：１で変動した。

製剤をバイアルに導入し、上記の表１に従って４℃又はＲＴに７２時間置いた。この短期保存後、安定性及び活性を判定した。

ＦＸＩａとＢＡＣ２との比及び保存温度にかかわらず、いずれのバイアルにも凝塊は形成されなかった。

活性
活性試験については、表１の同じ製剤を使用し、これらを、出血部位における生理学的条件をシミュレートする凝固反応バッファと混合した。

具体的には、４００μＬのアルブミンを２．１ｍＬのＴＳＢバッファ（材料に記載）に添加することによって凝固反応バッファを調製した。

表１の各バイアルに、３０μＬのＴＳＢバッファ（アルブミン及びリン脂質を含む）を全ての他の成分と共に添加し、続いて、３０μＬのＵｎｉｃａｌｉｂｒａｔｏｒを添加した。

次いで、バイアルを３７℃で一晩インキュベートした。３７℃で一晩インキュベートした後、凝塊は形成されなかった。

次いで、各バイアルに３０μＬのＣａ^２＋０．０２５Ｍを添加し、バイアルをＲＴで２．５時間放置した。図１は、各バイアルを示し、ＦＸＩａ＋ＢＡＣ２バイアル混合物（バイアル１〜８）では沈殿物が形成されたが、対照バイアル（バイアル１０）及びＢＡＣ２＋バッファ＋Ｃａ^２＋を含有するが、事前にインキュベートしなかったバイアル（最も右のバイアル）では形成されなかった。バイアル９の底部にある白色の沈降物は、Ｃａ^２＋の沈降によるものであったことに留意されたい。

したがって、単一成分製剤として全ての成分を保存することは保存安定性であり、保存は成分の活性に影響を与えず、その結果、生理的条件をシミュレートするバッファ及びＣａ^２＋と接触するとフィブリン塊が有効に形成されると結論付けられた。

実施例２：必須反応成分の決定
この研究の目的は、Ｃａ^２＋及びセファリン（血小板リン脂質を代替する）がインビトロ反応に必須であるかどうかを判定するために、様々な製剤をスクリーニングすることであった。

必須反応成分を判定するために、Ｃａ^２＋（０．０２５Ｍ）及びセファリン（凝固カスケードに関与する血小板リン脂質の生理学的代用品を提供、原液（stroke）濃度約２７．４μｇ／ｍＬ）を含む又は含まない、ＢＡＣ２（原液濃度〜６４ｍｇ／ｍＬ）及びＦＸＩａ（原液濃度０．６５μｇ／ｍＬ「ＦＸＩａ−０．６５」又は０．４４μｇ／ｍＬ「ＦＸＩａ−０．４４」）の組み合わせを、以下の表２にも詳述されるように試験した。反応を開始するために、ＴＳＢバッファ及びアルブミンを含む凝固反応バッファ（実施例１に記載のとおり）を添加した（「ＴＳＢ−アルブミン」）。

調製した混合物を、４℃又はＲＴのいずれかで一晩インキュベートした。インキュベーション後、バイアルにＵｎｉｃａｌｉｂｒａｔｏｒを添加し、次いで、バイアルを３７℃でインキュベートして凝固時間を試験した。

インキュベーション後、バイアルを１秒間ボルテックスし、１０分間回転させ、表３（各行は単一のバイアルを表す）及び表４（各行はトリプリケートを表す）に記載されているように更にインキュベートした。

ＲＴで一晩保存されたセファリン及びＣａ^２＋を含有するバイアルは、自発的な凝塊を形成したことに予め留意されたい。

一晩インキュベートした後、表３及び表４に示されるように、サンプルの一部に５０μＬのＵｎｉｃａｌｉｂｒａｔｏｒを添加した。

全てのバイアルを３７℃でインキュベートし、以下の時点で試験した：表３及び表４に示すように、１、３、５、７、１０、１５、２０、２５、３０、４５、６０分（表３にまとめた結果）及び０、１、２、３、４、５、７．５、１０、１５、２０、２５、３０、６０分。特に、様々な成分について表４に示される濃度は、対応する国際規格に対してそれぞれ計算される。全ての成分は、凝固カスケードに関与する。

表３及び４に提示される結果は、Ｃａ^２＋なしでは重合反応が生じない、すなわち凝塊が形成されないことを示す。

Ｃａ^２＋のみの存在下、すなわちヒト血漿なしでは、製剤は液体のままであった。液体製剤にＵｎｉｃａｌｉｂｒａｔｏｒを添加すると、重合が行われた。

したがって、Ｃａ^２＋は凝塊形成に必須であり、セファリンは、自発的凝固を引き起こすので製剤に添加するべきではないと結論付けられた。具体的には、これら結果によれば、好ましい製剤は、最低限ＢＡＣ２、ＦＸＩａ、及びＣａ^２＋を含有するべきである。

実施例３：処方に対するＣａ２＋及びＦＸＩａの濃度の影響の判定
この研究の目的は、様々な濃度のＣａ２＋及びＦＸＩａ成分の効果を判定することであった。この目的のために、両成分について連続希釈を実施し、Ｕｎｉｃａｌｉｂｒａｔｏｒの添加後、凝固時間を測定した。ＢＡＣ２、Ｃａ^２＋、及びＵｎｉｃａｌｉｂｒａｔｏｒを含有する（ＦＸＩａを添加しない）製剤の凝固時間を、ベースライン（対照）として使用した。

反応混合物は、以下のように調製した：
ベースライン判定のために：１５０μＬのバッファＡ（ＦＸＩａを希釈するために使用される、４００ｍＬの純水に、２．４ｇのＨＥＰＥＳ、４．３８ｇのＮａＣｌ、及び０．５ｇのウシ血清アルブミンを含む、ｐＨは７．４に調整された）、１５０μＬのＢＡＣ２、及び１５０μＬのＣａＣｌ_２を混合した。

ＦＸＩａ及びＣａ^２＋の濃度の決定のために：１０μＬのＦＸＩａ原液を９９０μＬのバッファＡで希釈し（１／１０希釈）、１０分間回転させる（４０ＲＰＭ）。次いで、０．５ｍＬのこの調製物を４．５ｍＬのバッファＡと混合し（最終体積５ｍＬ）、５分間回転させた。０．５ｍＬ（事前に希釈）＋４．５ｍＬのバッファＡの１：１０連続希釈を繰り返して、全ての希釈液を得た。様々なＦＸＩａ希釈物を表５にまとめる。

以下の表６に従って試験サンプルを調製した。各バイアルは、以下を含有していた：
１）２１０μＬのＢＡＣ２（総タンパク質濃度８０〜１２０ｍｇ／ｍＬ；凝固性（フィブリノゲン濃度５５〜８５ｍｇ／ｍＬ）；
２）２１０μＬのＦＸＩａ（濃度は表６に従って添加される）；
３）２１０μＬのＣａＣｌ_２（濃度は表６に従って添加される）。

得られたＢＡＣ２由来のタンパク質の最終濃度は２６．７〜４０ｍｇ／ｍＬであり、凝固性フィブリノゲンの最終濃度は１８．３３〜２８．３３ｍｇ／ｍＬであった。

全ての成分を添加したら、バイアルを５分間回転させた。各サンプルから、それぞれの指定された凝固機キュベット（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ ｓｔａｇｏ ＳＴＡＲＴ）に１５０μＬの体積を加えた。サンプルごとに４つの複製物を用いた。

凝固機（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ ｓｔａｇｏ ＳＴＡＲＴ）を使用して凝固時間を測定した。５０μＬのＵｎｉｃａｌｉｂｒａｔｏｒ（３７℃まで予熱）の添加で開始して、反応時間を測定する。凝塊を形成するのにかかる秒数として（凝塊が９６０秒未満で形成されたとき）、又は凝塊がこの時間までに形成されない場合は＞９６０秒として、測定値を記録した。

様々なＦＸＩａ及びＣａ^２＋の濃度による凝塊形成までの時間（秒）を、以下の表７に提示する。Ｕｎｉｃａｌｌｉｂｒａｔｏｒの添加で時間測定を開始したことに留意されたい。重合についてのベースライン（対照−ＦＸＩａなし試験）は、７６８．１±１５．１秒であった。

表中の数字は、サンプルが調製された順序を表す。

上記の表７の結果を図２にも提示し、様々なＦＸＩａ濃度の硬化（凝塊形成）速度に対するＣａＣｌ_２濃度を示す。横線は、ベースライン（ＦＸＩａなし試験結果）を表し、表示目的のために、この図２中では＞９６０秒の結果を１０００として表した。

最高ＦＸＩａ濃度のサンプル１つだけを使用し（最終希釈１１０μｇ／ｍＬ）、最速凝固時間と称する。換言すれば、（最高濃度以外の）ＦＸＩａの全ての希釈物については、ＣａＣｌ_２濃度のマトリクスを試験し、最高濃度のＦＸＩａについては、１つのＣａＣｌ_２濃度のみを適用した。この点を、最速凝固時間の基準として使用した。ＦＸＩａ希釈物１：１００及び１：１０００（したがって、１１μｇ／ｍＬ及び１．１μｇ／ｍＬ）の両方の凝固は類似しており、１２．５〜５．０ｍＭ（最終）の範囲のＣａ^２＋濃度の変化は、凝固時間に影響を及ぼさなかった。

反応におけるＣａ^２＋濃度の減少によって凝塊形成がより遅くなったので、Ｃａ^２＋濃度と凝塊形成までの時間との間に相関がみられた。

ＦＸＩａを１：１００００に希釈すると（１１０ｎｇ／ｍＬの最終濃度）、より高いＦＸＩａ濃度と比較して、凝塊形成がより遅くなった。このより低いＦＸＩａ濃度では、Ｃａ^２＋濃度が低下したときにより強い効果が観察される。更に、１２．５ｍＭのＣａ^２＋濃度は、硬化速度に対してわずかに低い効果を示した。

１：１０００００希釈されたＦＸＩａ（１１ｎｇ／ｍＬ）は、はるかに遅い硬化速度を示し、Ｃａ^２＋濃度の効果は、１１０ｎｇ／ｍＬ希釈物と同じ傾向を示す。

上記の結果に基づいて、作用する可能性を有するＦＸＩａ希釈物は、１／１００（１１μｇ／ｍＬ）、１／１０００（１．１μｇ／ｍＬ）、１／１００００（１１０ｎｇ／ｍＬ）であると結論付けられた。好ましい作用Ｃａ^２＋濃度は、６．２５ｍＭ（０．０２５ＭのＣａ^２＋原液を使用する最終濃度）である。

既存の止血製品（局所止血剤、Ｓｅｙｅｄｎｅｊａｄ ｅｔ ａｌ ２００８）を使用することにより現行文献から推定された推定時間値である９６０秒未満の、臨床的に関連する凝塊形成速度を達成するためには、以下の製剤を使用しなければならない（ＦＸＩａ範囲０．０１〜１１０μｇ／ｍＬ及びＣａ^２＋範囲３．７５〜１２．５ｍＭ）。

実施例４：製剤の短期及び長期安定性の決定
この研究の目的は、３つの異なる温度で最長１年間にわたる製剤の安定性を判定することであった。単一成分製剤の短期及び長期安定性を判定するために、３つの異なるＦＸＩａ濃度を、３つの異なる温度（ＲＴ、２〜８℃、及び−３０℃）でインキュベートした。選択された温度でのインキュベーション期間に続いて、各バイアルを３７℃に加熱し、続いてＵｎｉｃａｌｉｂｒａｔｏｒを添加した。次いで、凝固機を用いて凝固までの時間を記録した。

具体的には、３６個のサンプルを以下のように調製した：
−１２サンプルを２〜８℃でインキュベートした。
−１２サンプルをＲＴでインキュベートした。
−１２サンプルをー３０℃でインキュベートした。

各インキュベーション温度について、デュープリケート（２本のバイアル）を７種のインキュベーション期間にわたって記録した：
１日（１ｄ）、１週間（１ｗ）、２週間（２ｗ）、１ヶ月（１ｍ）、２ヶ月（２ｍ）、６ヶ月（６ｍ）、及び１５ヶ月（１５ｍ）。

使用した体積：
ＢＡＣ２−１２０μＬ×３（処理）×３６（サンプル）＝１２．９６ｍＬ
ＣａＣｌ_２−１２０μＬ×３（処理）×３６（サンプル）＝１２．９６ｍＬ
ＦＸＩａ−１２０μＬ×１（希釈）×３６（サンプル）＝４．３２ｍＬ（各希釈について）

ＦＸＩａの希釈液を以下から調製した：１：１０希釈原液（４４０μｇ／ｍＬの原液濃度）：
１／１００：２７５μＬ（１／１０）＋２．４７５ｍＬ（バッファＡ）→２．７５ｍＬ（１／１００）＋２．５ｍＬ（１／１００、事前希釈）
１／１０００：４００μＬ（１／１００）＋３．６ｍＬ（バッファＡ）→４．０ｍＬ（１／１０００）＋８５０μＬ（１／１０００、事前希釈）
１／１０，０００：４００μＬ（１／１０００）＋３．６ｍＬ（バッファＡ）→４．０ｍＬ（１／１０，０００）＋８５０μＬ（１／１０，０００、事前希釈）

各バイアルに、２００μＬのＢＡＣ２、２００μＬのＣａＣｌ_２（混合前は０．０２５Ｍ原液濃度）、２００μＬのＦＸＩａ（規定の試験に従って）を補給した。次いで、バイアルを１秒間ボルテックスし、１０分間回転させ、続いて、選択した処理に従ってインキュベートした。各処理の２本のバイアル（独立したデュープリケート）を調製した。得られた凝固時間（秒）を表８Ａ〜８Ｃに示す。

表８Ｃに提示される結果は、０．１１μｇ／ｍＬの濃度では、ＦＸＩａは−３０℃で保存したとき少なくとも１５ヶ月間安定であり、２〜８℃で保存したとき少なくとも１日間安定であることを示す。

表８Ｂに提示される結果は、１．１μｇ／ｍＬの濃度では、ＦＸＩａは−３０℃で保存したとき少なくとも１５ヶ月間安定であり、２〜８℃で保存したとき少なくとも２週間安定であり、ＲＴで保存したとき少なくとも１日間安定であることを示す。

表８Ａに提示される結果は、１１．１μｇ／ｍＬの濃度では、ＦＸＩａは−３０℃で保存したとき少なくとも１５ヶ月間安定であり、２〜８℃で保存したとき最長２ヶ月間安定であり、ＲＴで保存したとき最長１ヶ月間安定であることを示す。

実施例５：純粋なフィブリノゲンを使用した製剤の短期及び長期安定性の判定
この研究の目的は、カルシウムを含む及び含まない製剤の短期及び長期安定性に対する純粋なフィブリノゲン（Ｈｕｍａｎ Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ Ｄｅｐｌｅｔｅｄ（Ｔａｒｏｍ Ａｐｐｌｉｅｄ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．１００．００％凝固性）の効果を判定することであった。この目的のために、２つの異なるＦＸＩａ濃度を２つの異なる温度（ＲＴ及び２〜８℃）でインキュベートした。選択された温度でのインキュベーション期間に続いて、各バイアルを３７℃に加熱し、続いてＵｎｉｃａｌｉｂｒａｔｏｒを添加した。次いで、凝固機を用いて凝固までの時間（秒）を記録した。

具体的には、凍結乾燥したフィブリノゲンを、３７℃に予熱した１５ｍＬのＤＤＷを使用して再構成し、完全に溶解するまで３７℃で混合した。

ＦＸＩａ １１μｇ／ｍＬ：９００μＬ（１／１０）＋８．１ｍＬ（バッファＡ）
ＦＸＩａ １．１μｇ／ｍＬ：９００μＬ（１／１００）＋８．１ｍＬ（バッファＡ）

試験は、１１μｇ／ｍＬ、１．１μｇ／ｍＬのＦＸＩａ濃度を含んでいた。各試験の合計３３個のサンプルを以下のように調製した：
即時試験用の３サンプル。
各処理からのインキュベート：１５サンプルを２〜８℃で一晩。
１５サンプルをＲＴで一晩。

各バイアルに、１４０μＬのフィブリノゲン、１４０μＬのＦＸＩａ、及び１４０μＬのＣａＣｌ_２（０．０２５Ｍ）を指定されたバイアルに補給した（試験に従って）。次いで、バイアルを１秒間ボルテックスし、１０分間回転させ、続いて、選択した処理に従ってインキュベートした。各処理の３本のバイアル（独立したデュープリケート）を調製した。

安定性試験パラメータは、以下のとおりであった：
フィブリノゲン濃度：〜２２ｍｇ／ｍＬ（安定性期間中）及び凝固時間試験中は〜１６．７ｍｇ／ｍＬ
ＣａＣｌ_２濃度：〜８ｍＭ（安定性期間中）及び凝固時間試験中は６．２５ｍＭ
ＦＸＩａ希釈物（及び凝固時間試験中の濃度）：１：１００（１１μｇ／ｍＬ）及び１：１０００（１．１μｇ／ｍＬ）。
温度ＲＴ、２〜８℃。
時点：１日、１週間、２週間、１ヶ月、及び２ヶ月。

凝固時間を表９Ａ〜９Ｃにまとめる。

表９Ａに提示される結果は、カルシウムを含む及び含まない１．１及び１１ｕｇ／ｍＬのＦＸＩａの両濃度において、ＲＴで保存したときシーラントが１週間未満安定であることを示す。１週間以内に、サンプルはカルシウムの存在下又は非存在下で自発的に凝固した。

表９Ｂに提示される結果は、１．１及び１１μｇ／ｍＬのＦＸＩａの両濃度において、シーラントが、カルシウムと共に１週間未満安定であったことを示す。１週間で、シーラントは、カルシウムの存在下でのみ自発的に凝固した。

保存した又は保存していない表８及び９の結果間の比較は、ＢＡＣ２成分を含むシーラント組成物が、純粋なフィブリノゲンを含む組成物と比較してより活性であることを示す。

〔実施の態様〕
（１） 血液由来のフィブリノゲン濃縮物と、二価カチオンと、第ＸＩａ因子とを含む保存安定性水性シーラント製剤であって、２０℃〜２５℃の温度で少なくとも５分間安定である、保存安定性水性シーラント製剤。
（２） 前記血液由来のフィブリノゲン濃縮物が、寒冷沈降したフィブリノゲン（cryoprecipitated fibrinogen）を含む、実施態様１に記載のシーラント製剤。
（３） 前記血液由来のフィブリノゲン濃縮物が、懸濁又は沈殿したコーン画分Ｉを含む、実施態様１に記載のシーラント製剤。
（４） 前記二価カチオンがカルシウムカチオンである、実施態様１〜３のいずれかに記載のシーラント製剤。
（５） 前記カルシウムカチオンが、塩化カルシウムによって提供されている、実施態様４に記載のシーラント製剤。

（６） ０．０７８を超えるフィブロネクチン：フィブリノゲンの相対濃度でフィブロネクチンを含む、実施態様１〜５のいずれかに記載のシーラント製剤。
（７） ０．１〜０．２のフィブロネクチン：フィブリノゲンの相対濃度でフィブロネクチンを含む、実施態様６に記載のシーラント製剤。
（８） 前記製剤中のタンパク質の総量のうち７９．８％未満の量の凝固性タンパク質を含み、前記総量には前記第ＸＩａ因子が除外されている、実施態様１〜７のいずれかに記載のシーラント製剤。
（９） 液体形態である、実施態様１〜８のいずれかに記載のシーラント製剤。
（１０） 固体凍結形態である、実施態様１〜８のいずれかに記載のシーラント製剤。

（１１） 前記フィブリノゲンが、１３〜８５ｍｇ／ｍＬ、例えば１３〜２９ｍｇ／ｍＬの量である、実施態様１〜１０のいずれかに記載のシーラント製剤。
（１２） 前記塩化カルシウムが、０．１５〜０．５ｍｇ／ｍＬの量である、実施態様５に記載のシーラント製剤。
（１３） 前記第ＸＩａ因子が、０．０１〜１１０μｇ／ｍＬの量、例えば０．１１〜１１０μｇ／ｍＬの量、及び例えば０．１１μｇ／ｍＬ超かつ１１０μｇ／ｍＬ以下の量である、実施態様１〜１２のいずれかに記載のシーラント製剤。
（１４） トロンビンを含まない、実施態様１〜１３のいずれかに記載のシーラント製剤。
（１５） 前記フィブリノゲン濃縮物が、第ＶＩＩＩ因子の製造プロセスの副生成物である、実施態様１〜１４のいずれかに記載のシーラント製剤。

（１６） ２℃〜８℃の温度で少なくとも２週間安定である、実施態様１〜１５のいずれかに記載のシーラント製剤。
（１７） −３０℃の温度で少なくとも１５ヶ月間安定である、実施態様１〜１５のいずれかに記載のシーラント製剤。
（１８） ビタミンＫ依存性凝固酵素原を含まない、実施態様１〜１７のいずれかに記載のシーラント製剤。
（１９） ＦＩＩ、ＦＶＩＩ、ＦＩＸ、及びＦＸ酵素原を含まない、実施態様１８に記載のシーラント製剤。
（２０） （ｉ）血液由来のフィブリノゲン濃縮物と、二価カチオンと、第ＸＩａ因子とを含む保存安定性水性シーラント製剤を含むシーラント製剤を保持する容器であって、前記シーラント製剤が、２０℃〜２５℃の温度で少なくとも５分間安定である、容器と、（ｉｉ）前記シーラント製剤を中を通して送達するための再封止可能な開口部と、を備える、アプリケータ。

（２１） 前記シーラント製剤が、実施態様２〜１９のいずれかに定義されたとおりである、実施態様２０に記載のアプリケータ。
（２２） 液体形態の前記シーラント製剤を保持するシリンジの形態である、実施態様２０又は２１に記載のアプリケータ。
（２３） シーラント製剤を保持する支持マトリクスを含む創傷包帯であって、前記シーラント製剤が、血液由来のフィブリノゲン濃縮物と、二価カチオンと、第ＸＩａ因子とを含む保存安定性水性シーラント製剤を含み、前記シーラント製剤が、２０℃〜２５℃の温度で少なくとも５分間安定である、創傷包帯。
（２４） 前記シーラント製剤が、実施態様２〜１９のいずれかに定義されたとおりである、実施態様２３に記載の創傷包帯。
（２５） フィブリン凝塊の形成を促進するための方法であって、血液由来のフィブリノゲン濃縮物と、二価カチオンと、第ＸＩａ因子とを含む保存安定性水性シーラント製剤を含むシーラント製剤を血液と接触させることを含み、前記シーラント製剤が、２０℃〜２５℃の温度で少なくとも５分間安定である、方法。

（２６） 前記シーラント製剤が、実施態様２〜１９のいずれかに定義されたとおりである、実施態様２５に記載の方法。
（２７） 創傷の治療を必要としている対象における創傷を治療する方法であって、血液由来のフィブリノゲン濃縮物と、二価カチオンと、第ＸＩａ因子とを含む保存安定性水性シーラント製剤を含み、２０℃〜２５℃の温度で少なくとも５分間安定である、シーラント製剤をある量、前記創傷の少なくとも一部上に塗布することを含み、前記シーラント製剤の前記量は、前記創傷と接触させたときに前記創傷において凝固を促進するのに有効である、方法。
（２８） 前記シーラント製剤が、実施態様２〜１９のいずれかに定義されたとおりである、実施態様２７に記載の方法。
（２９） 血液由来のフィブリノゲン濃縮物と、二価カチオンと、第ＸＩａ因子とを含む保存安定性水性シーラント製剤を含む容器を備え、前記シーラント製剤が、２０℃〜２５℃の温度で少なくとも５分間安定である、キット。
（３０） 前記容器がアプリケータの形態である、実施態様２９に記載のキット。

（３１） 前記アプリケータは、前記シーラント製剤を創傷の少なくとも一部上に前記塗布することを容易にするように構成されている、実施態様３０に記載のキット。
（３２） 前記アプリケータがシリンジである、実施態様３０又は３１に記載のキット。
（３３） アプリケータを更に備える、実施態様２９に記載のキット。
（３４） 創傷の治療を必要としている対象における創傷を治療するための保存安定性水性シーラント製剤の使用であって、前記製剤が、血液由来のフィブリノゲン濃縮物と、二価カチオンと、第ＸＩａ因子とを含み、前記製剤が、２０℃〜２５℃の温度で少なくとも５分間安定である、使用。

Claims (31)

1. 血液由来のフィブリノゲン濃縮物と、二価カチオンと、第ＸＩａ因子とを含む保存安定性水性シーラント製剤であって、２０℃〜２５℃の温度で少なくとも５分間安定である、保存安定性水性シーラント製剤。
2. 前記血液由来のフィブリノゲン濃縮物が、寒冷沈降したフィブリノゲンを含む、請求項１に記載のシーラント製剤。
3. 前記血液由来のフィブリノゲン濃縮物が、懸濁又は沈殿したコーン画分Ｉを含む、請求項１に記載のシーラント製剤。
4. 前記二価カチオンがカルシウムカチオンである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のシーラント製剤。
5. 前記カルシウムカチオンが、塩化カルシウムによって提供されている、請求項４に記載のシーラント製剤。
6. ０．０７８を超えるフィブロネクチン：フィブリノゲンの相対濃度でフィブロネクチンを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のシーラント製剤。
7. ０．１〜０．２のフィブロネクチン：フィブリノゲンの相対濃度でフィブロネクチンを含む、請求項６に記載のシーラント製剤。
8. 前記製剤中のタンパク質の総量のうち７９．８％未満の量の凝固性タンパク質を含み、前記総量には前記第ＸＩａ因子が除外されている、請求項１〜７のいずれか一項に記載のシーラント製剤。
9. 液体形態である、請求項１〜８のいずれか一項に記載のシーラント製剤。
10. 固体凍結形態である、請求項１〜８のいずれか一項に記載のシーラント製剤。
11. 前記フィブリノゲンが、１３〜８５ｍｇ／ｍＬ、例えば１３〜２９ｍｇ／ｍＬの量である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のシーラント製剤。
12. 前記塩化カルシウムが、０．１５〜０．５ｍｇ／ｍＬの量である、請求項５に記載のシーラント製剤。
13. 前記第ＸＩａ因子が、０．０１〜１１０μｇ／ｍＬの量、例えば０．１１〜１１０μｇ／ｍＬの量、及び例えば０．１１μｇ／ｍＬ超かつ１１０μｇ／ｍＬ以下の量である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のシーラント製剤。
14. トロンビンを含まない、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のシーラント製剤。
15. 前記フィブリノゲン濃縮物が、第ＶＩＩＩ因子の製造プロセスの副生成物である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のシーラント製剤。
16. ２℃〜８℃の温度で少なくとも２週間安定である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のシーラント製剤。
17. −３０℃の温度で少なくとも１５ヶ月間安定である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のシーラント製剤。
18. ビタミンＫ依存性凝固酵素原を含まない、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のシーラント製剤。
19. ＦＩＩ、ＦＶＩＩ、ＦＩＸ、及びＦＸ酵素原を含まない、請求項１８に記載のシーラント製剤。
20. （ｉ）血液由来のフィブリノゲン濃縮物と、二価カチオンと、第ＸＩａ因子とを含む保存安定性水性シーラント製剤を含むシーラント製剤を保持する容器であって、前記シーラント製剤が、２０℃〜２５℃の温度で少なくとも５分間安定である、容器と、（ｉｉ）前記シーラント製剤を中を通して送達するための再封止可能な開口部と、を備える、アプリケータ。
21. 前記シーラント製剤が、請求項２〜１９のいずれか一項に定義されたとおりである、請求項２０に記載のアプリケータ。
22. 液体形態の前記シーラント製剤を保持するシリンジの形態である、請求項２０又は２１に記載のアプリケータ。
23. シーラント製剤を保持する支持マトリクスを含む創傷包帯であって、前記シーラント製剤が、血液由来のフィブリノゲン濃縮物と、二価カチオンと、第ＸＩａ因子とを含む保存安定性水性シーラント製剤を含み、前記シーラント製剤が、２０℃〜２５℃の温度で少なくとも５分間安定である、創傷包帯。
24. 前記シーラント製剤が、請求項２〜１９のいずれか一項に定義されたとおりである、請求項２３に記載の創傷包帯。
25. フィブリン凝塊の形成を促進するための方法であって、血液由来のフィブリノゲン濃縮物と、二価カチオンと、第ＸＩａ因子とを含む保存安定性水性シーラント製剤を含むシーラント製剤を血液と接触させることを含み、前記シーラント製剤が、２０℃〜２５℃の温度で少なくとも５分間安定である、方法。
26. 前記シーラント製剤が、請求項２〜１９のいずれか一項に定義されたとおりである、請求項２５に記載の方法。
27. 血液由来のフィブリノゲン濃縮物と、二価カチオンと、第ＸＩａ因子とを含む保存安定性水性シーラント製剤を含む容器を備え、前記シーラント製剤が、２０℃〜２５℃の温度で少なくとも５分間安定である、キット。
28. 前記容器がアプリケータの形態である、請求項２７に記載のキット。
29. 前記アプリケータは、前記シーラント製剤を創傷の少なくとも一部上に前記塗布することを容易にするように構成されている、請求項２８に記載のキット。
30. 前記アプリケータがシリンジである、請求項２８又は２９に記載のキット。
31. アプリケータを更に備える、請求項２７に記載のキット。

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