JP2019525896A - プロテアソーム阻害薬 - Google Patents
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Abstract
Description
Xは、C=O、C=S又はB−OHであり;
Yは求電子試薬であり、Zは脱離基であるか、又は
R1は、
(a)(i)プロテアソームのタンパク質分解部位に結合する第一の基(前記第一の基はXに結合している);及び
(ii)任意に送達を増強する第二の基;
又は
(b)プロテアソームのサブユニットβ1とβ2の間に結合する基
を含み、又はそれらからなり、
R2及びR3は、H、メチル、メトキシ、エチル、エテニル、エチニル及びシアノから独立に選ばれ、メチル及びエチルはOH又はハロゲンで置換されていてもよい]
の化合物に関する。
この技術的問題は、添付の特許請求の範囲の主題によって解決された。
Xは、C=O、C=S又はB−OHであり;
Yは求電子試薬であり、Zは脱離基であるか、又は
R1は、
(a)(i)プロテアソームのタンパク質分解部位に結合する第一の基(前記第一の基はXに結合している);及び
(ii)任意に送達を増強する第二の基;
又は
(b)プロテアソームのサブユニットβ1とβ2の間に結合する基
を含み、又はそれらからなり、
R2及びR3は、H、メチル、メトキシ、エチル、エテニル、エチニル及びシアノから独立に選ばれ、メチル及びエチルはOH又はハロゲンで置換されていてもよい]
の化合物に関する。
部分R2及びR3は、二つの求電子試薬の間に介在する化合物の部分を規定する。
R1は、前述した標的指向部分である。標的指向部分は当該技術分野で公知である。多くの場合、標的指向部分はペプチド性である。これは、例えば、エポキソミシン、オプロゾミブ(Oprozomib)、カルフィルゾミブ、ジヒドロエポノマイシン(Dihydroeponomycin)、エポネマイシン及びONX−0914に当てはまる。プロテアソームの活性部位はタンパク質分解活性を示すので、ペプチドは一般的に前記活性部位に結合し、従って標的指向に有用である。
ペプチド性の第一の基を想定したが、標的指向基の特定構造は本発明にとって主要なことではない。基本的に、プロテアソームのタンパク質分解部位又はその近傍への標的指向を提供するいずれの化学基も、本発明による適切な基R1である。標的指向基がタンパク質分解部位を直接標的にはしないが、タンパク質分解部位近傍のプロテアソームの別の部位を標的にする限り、適切な長さのリンカーを用いて、標的指向基R1を第一の側面の化合物の活性要素に連結できる。前記活性要素は、基X、Y及びZを含む。
用語“薬学的に許容可能な塩”とは、本発明の化合物の塩のことを言う。適切な薬学的に許容可能な塩は、例えば、本発明の化合物の溶液を、塩酸、硫酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酢酸、安息香酸、クエン酸、酒石酸、炭酸又はリン酸などの薬学的に許容可能な酸の溶液と混合することによって形成できる酸付加塩を含む。さらに、化合物が酸性部分を持っている場合、その適切な薬学的に許容可能な塩は、アルカリ金属塩(例えばナトリウム又はカリウム塩);アルカリ土類金属塩(例えばカルシウム又はマグネシウム塩);及び適切な有機リガンド(例えば、ハライド、ヒドロキシド、カルボキシレート、スルフェート、ホスフェート、ニトレート、アルキルスルホネート及びアリールスルホネートなどの対アニオンを用いて形成されるアンモニウム、第四級アンモニウム及びアミンカチオン)を用いて形成される塩などでありうる。薬学的に許容可能な塩の例示的実例は、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、炭酸水素塩、硫酸水素塩、酒石酸水素塩、ホウ酸塩、臭化物、酪酸塩、エデト酸カルシウム、樟脳酸塩、樟脳スルホン酸塩、カンシル酸塩、炭酸塩、塩化物、クエン酸塩、クラブラン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ジヒドロクロリド、ドデシル硫酸塩、エデト酸塩、エジシル酸塩、エストレート、エシレート、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルセプト酸塩、グルコヘプトン酸塩、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、グリセロリン酸塩、グリコリルアルサニル酸塩、ヘミスルフェート、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ヘキシルレゾルシン酸塩、ヒドラバミン、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、2−ヒドロキシ−エタンスルホン酸塩、ヒドロキシナフトエ酸、ヨウ化物、イソチオネート(isothionate)、乳酸塩、ラクトビオン酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、マンデル酸塩、メシル酸塩、メタンスルホン酸塩、メチル硫酸塩、ムチン酸塩、2−ナフタレンスルホン酸塩、ナプシル酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、N−メチルグルカミンアンモニウム塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩(エンボン酸塩)、パルミチン酸塩、パントテン酸塩、ペクチン酸塩(pectinate)、過硫酸塩、3−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩/二リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、ポリガラクツロン酸塩、プロピオン酸塩、サリチル酸塩、ステアリン酸塩、硫酸塩、塩基性酢酸塩、コハク酸塩、タンニン酸塩、酒石酸塩、テオクル酸塩、トシル酸塩、トリエチオジド、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などであるが、これらに限定されない(例えば、S.M.Bergeら,“Pharmaceutical Salts”,J.Pharm.Sci.,66,pp.1−19(1977)参照)。
本発明による化合物が正味荷電を保持する限りにおいて、化合物は電気的中性形で提供されると理解される。これは一つ又は複数の対イオンによって達成され、好適な対イオンは、上記において、用語“塩”との関連で定義されている。
更なる好適な態様において、β−アミノ酸をペプチド基の一つ又は複数の位置に使用することもできる。同じく好適なのは、一つ又は複数の位置にD−アミノ酸を使用することである。
(a)Mタイプのジェファーミン。R1=−H(エチレンオキシド(EO)の場合)又は−CH3(プロピレンオキシド(PO)の場合)。PO/EOのモル比は、ジェファーミンM2005の場合29/6、ジェファーミンM2070の場合10/31及びジェファーミンM600の場合9/1。(b)ペンタエリトリトールエトキシレート。(c)ペンタエリトリトールプロポキシレート。(d)ポリビニルピロリドン。(e)ポリプロピレングリコール。(f)ポリビニルアルコール。(g)ポリアクリレート。(h)セルロース系ポリマー。R1 =−H、−CH3又は−CH2CHOHCH3(ヒドロキシプロピルメチルセルロース)、−H又はCH2CO2H(カルボキシメチルセルロース)。(i)ポリ(エチレンイミン)。(j)ジ[ポリ(エチレングリコール)]アジペート。(k)ジェファーミンED2003。(l)ジェファーミンD2000。(m)ジェファーミンSD2001。(n)Tタイプのジェファーミン。(o)ポリアクリルアミド。(p)グリセロールエトキシレート。(q)アクリル酸/マレイン酸コポリマー。(r)ビニルピロリドン/ビニルイミダゾールコポリマー。x、y、z及びwの各添え字は、少なくとも2個、好ましくは3個のビルディングブロックの最小長が得られる限り、整数0、1、2、3、4、5、6、7、8、9及び10から独立に選ばれる。(b)及び(c)に描かれているような分岐主鎖は除外されないが、分岐していない主鎖が好適である。従って、(b)及び(c)のような分岐主鎖の式において、x、y及びzから選ばれる二つの添え字は0であることが好適である。アミノ酸側鎖の可能性ある位置は、図中に楕円として示されている。これらの位置はペプチド中のCα原子に対応する。
活性エステルの合成:A)Boc−L−アミノ酸からのベータ−ケト酸形成、ベータ−カルボキシル部分の保護のためのエステル化。B)メチル化反応。C)Boc脱保護。D)ペプチドカップリング。E)エステルからベータ−ケト酸への鹸化(部分不安定)。F)N−ヒドロキシスクシンイミドを用いた活性エステルの製造。
これまで、基
更なる好適な態様において、R2及びR3は同一で、好ましくはメチル、H、メトキシ又は−CH2OHである。特に好適なのは、R2及びR3ともメチルであるか又はR2及びR3ともHである。特別に好適なのは、R2及びR3ともメチルである。
好適なのは、
特に好適なのは、XがC=Oで、
特に好適なのは、XがC=Oで、
以下の好適な態様は、標的指向部分R1の好適な実施のために捧げられる。R1の好適な態様のいずれも、X、Y、Z、R2及びR3の好適な態様のいずれとも組み合わせることができる。
更なる好適な態様において、送達を増強する前記基が存在し、R11−CO、R11−CS−、又はR11−SO2−であり、R11は以下の置換又は非置換基から選ばれ、基は、カルボシクリル、ヘテロカルボシクリル、カルボシクリルアルキル、ヘテロカルボシクリルアルキル、アルキルヘテロカルボシクリルアルコキシヘテロカルボシクリル、アルコキシアルキルヘテロカルボシクリル、ヘテロカルボシクリルアミノ、ヘテロカルボシクリルアルキルヘテロカルボシクリル、及びアルキルヘテロカルボシクリルアルキルヘテロカルボシクリルであり、アルキルは、C1〜C4アルキル、好ましくはメチルであり、置換基は、C1〜C4アルキル、好ましくはメチル又はエチル、C1〜C4アルコキシ、好ましくはメトキシ又はエトキシ、ヒドロキシ及び/又はハロゲン、好ましくはCl、Br又はIであり、そしてヘテロ原子は、O、N及び/又はSである。
R11はヘテロカルボシクリルであるのが特に好適である。
用語“カルボシクリル”は、環が炭素原子を含む環分子を指す。環は炭素原子だけによって形成されうるが、そうである必要はない。従って、1個、2個又は3個以上のヘテロ原子が存在してもよい。環は飽和していてもよく、その場合は環状アルカンということになろうが、任意に1個又は複数個のヘテロ原子を含んでいてもよい。環は、一つ、二つ又は三つ以上の二重結合を含有していてもよい。前記二重結合が共役している場合、カルボシクリルはアリール部分である。
特に好適な態様において、R11は、2−メチルチアゾール−5−イル;4−モルホリニルメチル;1,4−ジクロロ 2−フェニル;6−フェニルピリジン−2−イル;ピラジン−2−イル;3−フリル;2−チエニル;5−オキサゾリル;5−イソオキサゾリル;(5−Me)−3−イソオキサゾリル;(5−iPr)−3−イソオキサゾリル;(5−MeOCH2)−3−イソオキサゾリル;3−ピラゾリル;2−イミダゾリル;(N−Me)−3−ピラゾリル;(N−Me)−2−イミダゾリル;(5−Me)−3−ピラゾリル;4−ピリジニル;4−ピリダジニル;2−(R)−テトラヒドロフラニル;2−(S)−テトラヒドロフラニル;(5−Me)−3−イソオキサゾリル−NH−;ピラジン−2−イル;ナフタ−2−イル;キノリン−2−イル;4−ビフェニル;3−ビフェニル; 4−フェニルピリジン−2−イル;3−フェニル−ピリジン−2−イル;5−フェニルピラジン−2−イル;6−フェニルピラジン−2−イル;2−フェニル−チアゾール−4−イル;及び5−R111−イソオキサゾール−3−イルから選ばれ;
式中、R111は、メチル、4−モルホリニルメチル、1,2,4−トリアゾリルメチル、イミダゾリルメチル及びN−メチルピペラジニルメチルから選ばれる。
第一の側面の特に好適な化合物は、式(IIa)及び(IIb):
第一の側面による一つ又は複数の化合物が使用できる。
好適なプロテアソーム活性アッセイは次の通りである。活性アッセイは、ペプチド主鎖にN末端で融合された発蛍光団AMCからなる7−アミノ−4−メチル−クマリン(AMC)基質の切断に基づく。これらの基質は、切断されたAMCが蛍光を示すので、蛍光発生性である(発光波長:380nm;発光波長:460nm)。活性部位ごとに特定の基質が使用される(キモトリプシン様部位の場合LLVY−AMC、カスパーゼ様部位の場合LLE−AMC、及びトリプシン様部位の場合RLR−AMC)。プロテアソーム活性は、最初に阻害薬と基質を同時にアッセイ緩衝液中で混合し、37℃で3分間インキュベーションすることによりモニターされる。50nMのプロテアソームの添加及び混合後、蛍光の増大(励起波長:380nm;発光波長:460nm)を蛍光分光計を用いてモニターする。DMSO濃度は全測定とも≦2%に維持される。蛍光読み出しはプロテアソーム活性と相関する。この手順は、阻害の一次速度定数を決定するのに利用される。酵素活性を50%低減するのに必要な阻害薬濃度であるIC50は、様々な阻害薬濃度でプロテアソーム活性を測定することによって決定できる。
“医薬(medicament)”及び“医薬組成物(pharmaceutical composition)”という用語は本明細書においては同等に使用される。本発明による医薬組成物は、薬学的に許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤を含みうる。
リード化合物の薬理学的性質の最適化法は当該技術分野で公知であり、(i)改変された作用部位、活性スペクトル、臓器特異性、及び/又は(ii)改良された効能、及び/又は(iii)低減された毒性(改良された治療指数)、及び/又は(iv)低減された副作用、及び/又は(v)改変された治療効果の開始、効果の期間、及び/又は(vi)改変された薬物動態パラメーター(再吸収、分布、代謝及び排出)、及び/又は(vii)改変された物理化学パラメーター(溶解度、吸湿性、色、味、匂い、安定性、状態)、及び/又は(viii)改良された全般的特異性、臓器/組織特異性、及び/又は(ix)最適化された適用形態及び経路を達成するために、リード化合物を(i)カルボキシル基のエステル化、又は(ii)カルボン酸によるヒドロキシル基のエステル化、又は(iii)ヒドロキシル基の、例えばホスフェート、ピロホスフェート又はスルフェート又はヘミスクシネートへのエステル化、又は(iv)薬学的に許容可能な塩の形成、又は(v)薬学的に許容可能な錯体の形成、又は(vi)薬理学的に活性なポリマーの合成、又は(vii)親水性部分の導入、又は(viii)アロメート(aromates)又は側鎖上の置換基の導入/交換、置換基パターンの変更、又は(ix)イソステリック又はバイオイソステリック部分の導入による修飾、又は(x)同族化合物の合成、又は(ix)分岐側鎖の導入、又は(xii)アルキル置換基の環状類似体への変換、又は(xiii)ヒドロキシル基のケタール、アセタールへの誘導体化、又は(xiv)アミド、フェニルカルバメートへのN−アセチル化、又は(xv)マンニッヒ塩基、イミンの合成、又は(xvi)ケトン又はアルデヒドから、シッフ塩基、オキシム、アセタール、ケタール、エノールエステル、オキサゾリジン、チアゾリジン又はそれらの組合せへの変換によって修飾する方法を含む。
好適な態様において、前記がんは、好ましくは、多発性骨髄腫(MM)(再発性及び難治性MMを含む);非ホジキンリンパ腫、例えばマントル細胞リンパ腫(MCL)及びびまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)を含むB細胞リンパ腫、及びワルデンストレームマクログロブリン血症から選ばれるリンパ性悪性疾患である。
第六の側面において、本発明は、プロテアソームを阻害できる化合物の同定法を提供し、前記方法は、式(III):
従って、前記方法はハイスループット形式で実施できる。ハイスループットアッセイは一般的にマイクロタイタープレートのウェル中で実施できる。各プレートは、96、384又は1,536個のウェルを有しうる。周囲温度以外の温度でのインキュベーションを含むプレートの取扱い、及びこれらの化合物とアッセイ混合物との接触は、好ましくは、分注装置を含む一つ又は複数のコンピュータ制御ロボットシステムによって実施される。大きなライブラリーの試験化合物をスクリーニングしなければならない場合及び/又はスクリーニングを短時間以内に実施しなければならない場合、例えば10、20、30、40、50又は100個の試験化合物の混合物を各ウェルに加えることができる。ウェルが生物活性を示した場合(この場合プロテアソームの阻害)、前記試験化合物の混合物を解析して、前記活性を生じた前記混合物中の一つ又は複数の試験化合物を同定すればよい。
阻害は、好ましくは、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%又は少なくとも90%の活性の低下になる。さらに好ましくは、活性の102倍、103倍、104倍、105倍、106倍、107倍、108倍又は109倍の低下である。
好適な態様において、前記活性は、好ましくはカスパーゼ様活性、トリプシン様活性及びキモトリプシン様活性から選ばれるタンパク質分解活性である。
好適な細胞アッセイは次の通りである。細胞(例えばHEK293)に、プロテアソーム活性のレポーター遺伝子構築物であるpZsProSensor−1ベクター(Clontech Laboratories,Inc.社製)をトランスフェクトする。このベクターは、プロテアソームによる認識と分解を媒介する特定の分解モチーフにC末端で融合された不安定型緑色蛍光タンパク質変異体(ZsGreen)をコードしている。発現されたZsGreenの蛍光読み出し(励起波長:493nm;発光波長:505nm)を使用してプロテアソーム活性をモニターする。プロテアソームの阻害は、GFPチャンネルにおける増大した蛍光シグナルと相関するZsGreenの蓄積を起こす。
X、Y、Z、R2及びR3は上記定義の通りである]の化合物を提供する。
第八の側面において、本発明は、式(IV):
X、Y、Z、R2及びR3は上記定義の通りである]の化合物の、プロテアソーム阻害薬の合成、薬学的に活性な薬剤の合成又は薬学的に活性な薬剤の開発のためのリード化合物の合成における使用を提供する。前記薬学的に活性な薬剤は、好ましくは、がん又は自己免疫疾患の治療又は予防法に使用するためのものである。
一般的に言えば、Aは反応性基である。当該技術分野で確立された反応性基が使用できる。Aの目的は、上に定義されたR1のような標的指向部分への頑健で不可逆的なカップリングを提供することである。反応性基Aは、任意の標的指向部分への結合カップリングのために使用できる。標的指向部分へのカップリングにより、第一の側面による化合物が得られる。
実施例1
結晶学
ヒト20Sプロテアソームの初期位相をマウス20S構造(PDB ID:3UNE)を用いて分子置換により決定した。次いで、モデルを、Cootでの双方向手動式モデル構築とRefmac5での精密化を数回行うことにより、最適化した。得られた構造は、Rwork=18%及びRfree=21%の典型的な値を有する優れた立体化学を示し、全6724残基の素晴らしい電子密度を明らかにし、そして精製及び結晶化に使用された緩衝液中に存在するいくつかのリガンドも明らかにしている。
合成
A)N−Boc−L−フェニルアラニン(1)のCH2Cl2中溶液に、EDC(1当量)、DMAP(1当量)及びメルドラム酸(1当量)を加える。反応を室温で17時間撹拌した後、1MのHClに注ぐ。層が分離するので、水性層をCH2Cl2で3回抽出する。有機層を合わせ、ブラインで洗浄し、MgSO4上で乾燥させ、真空下で濃縮する。残渣をトルエン中で80℃に加熱し、ベンジルアルコール(1当量)の添加後、4時間加熱する。溶媒を真空中で除去し、残渣をフラッシュクロマトグラフィーと酢酸エチルによる溶離により精製し、(2)を得る。
D)CH2Cl2及びトリエチルアミン(0.001当量)中(4)(1当量)に、(19)(1当量)、HOBT(0.2当量)及びEDC(2当量)を加える。溶液を25℃で24時間撹拌した後、飽和炭酸水素ナトリウム溶液で3回、脱イオン水及びブラインで1回ずつ洗浄し、有機層をMgSO4上で乾燥させる。溶媒を真空中で除去し、残渣をフラッシュクロマトグラフィーにより、1:1の酢酸エチル:n−ヘキサンで溶離して精製し、(5)を得る。
J)CH2Cl2及びトリエチルアミン(0.001当量)中(10)(1当量)に、(19)(1当量)、HOBT(0.2当量)及びEDC(2当量)を加える。溶液を25℃で24時間撹拌した後、飽和炭酸水素ナトリウム溶液で3回、脱イオン水及びブラインで1回ずつ洗浄し、有機層をMgSO4上で乾燥させる。溶媒を真空中で除去し、残渣をフラッシュクロマトグラフィーにより、1:1の酢酸エチル:n−ヘキサンで溶離して精製し、(11)を得る。
プロテアソームアッセイ
活性測定
好適なインビトロアッセイ
すべての動力学的測定は、FluoroMax(登録商標)−4 蛍光分光光度計(Horiba Scientific社)を用いて実施した。スクシニル−ロイシン−ロイシン−バリン−チロシン−7−アミド−4−メチルクマリン(Suc−LLVY−AMC,Bachem社)を基質として用い、ヒト20Sプロテアソームのβ5触媒活性部位のキモトリプシン様活性を測定した(R.L.Stein,F.Melandri,L.Dick,20Sプロテアソームのキモトリプシン活性の動力学的特徴付け(Kinetic characterization of the chymotryptic activity of the 20S proteasome).Biochemistry 35,3899−3908(1996))。加水分解AMCの蛍光発光を460nmで連続的にモニターした(λex=380nM)。反応温度はすべての測定で37℃に維持し、表S1に規定された酵素アッセイ用の反応緩衝液を使用した。Suc−LLVY−AMC及び阻害薬(例えば、オプロゾミブ、ジヒドロエポネマイシン、Z−LLY−ケトアルデヒド;“Suc”はスクシニルを表し、“Z”はベンジルオキシカルボニルを表す)をDMSO中に溶解し、使用するまで−80℃で保管した。DMSO濃度はいずれの測定でも2%(v/v)を超えなかった。Suc−LLVY−AMC変換の動力学的特徴付けの場合、反応緩衝液中0.035mg/mL(50nM)のヒト20Sプロテアソームを37℃で3分間プレインキュベートした。反応は基質の添加により開始され、蛍光シグナルは連続的に測定された。各阻害薬の阻害の一次速度定数を決定する場合、反応緩衝液、150μMの基質、及びオプロゾミブ(50μM)、ジヒドロエポネマイシン(50μM)又はZ−LLY−ケトアルデヒド(15μM)のいずれかを含有する反応混合物を37℃で3分間プレインキュベートした。次に、反応をヒト20Sプロテアソームの添加によって開始した(最終濃度50nM)。蛍光シグナルを連続的に測定した。
阻害薬結合の初期傾向を得るために、活性アッセイの時点測定を実施する。各活性部位について異なる濃度の20Sプロテアソームを使用する。すなわち、CL(キモトリプシン様活性)及びPGPH(ペプチジル−グルタミルペプチド加水分解活性)については0.05mg/ml、及びTL(トリプシン様活性)については0.075mg/ml。最終反応体積は30μl/ウェルである。ブランク及び100%初期活性反応を含め、合計5回の繰り返しを実施して平均二乗偏差(RMSD)を得る。手順は次の通りである。
(1)マスターミックスを製造する:それぞれの量のプロテアソーム(PGPH、TL、又はCL活性測定に従って)。
(2)エッペンドルフ管に分析される各阻害薬の量を用意する;例えば、30μl中に500μM濃度のリガンドは、アッセイあたり10mM阻害薬ストック溶液1.5μlである。
(3)28.5μlのマスターミックスを各エッペンドルフ管に加える。この溶液を室温で15分間インキュベートし、96ウェルプレートの各ウェルに移す。
(4)インキュベーション後、カスパーゼ、キモトリプシン又はトリプシン部位用の基質の7.5mMストック溶液1μlを加え、最終基質濃度250μMを得る。プレートを遠心分離し、RTで1時間インキュベートする。
(5)300μlの緩衝液を反応に加え、その後、残存するプロテアソーム活性を、Ex(励起波長)360nm−Em(発光波長)460nmの蛍光により記録する。
(6)ブランク及び100%初期活性を用いて残存活性を計算する。
活性アッセイの説明は、Gallastegui,N.,& Groll,M.(2012)、動力学的研究及びX線結晶学研究を用いたプロテアソーム阻害薬の性質の分析(Analysing Properties of Proteasome Inhibitors Using Kinetic and X-Ray Crystallographic Studies),Methods in Molecular Biology(Vol.832,pp.373−390).doi:10.1007/978−1−61779−474−2_26に見出すことができる。
更なる実施例は、Takara/Clontech社のZセンサープロテアソームアッセイである。ZsProSensor−1は、プロテアソーム感受性蛍光レポーターである。それは、明るい緑色蛍光タンパク質(Exmax=496nm、Emmax=506nm)と、プロテアソームによる迅速分解のためのタンパク質を標的とする分解ドメインとの融合物である。プロテアソーム活性の低下があると細胞は緑色蛍光を発する。
Proteasome−GloTM キモトリプシン様、トリプシン様及びカスパーゼ様細胞ベースアッセイ(Promega)。
蛍光発生性インビトロアッセイ(免疫プロテアソーム):(Basler,M.,& Groettrup,M.(2012).免疫プロテアソーム特異的阻害薬及びそれらの適用(Immunoproteasome-Specific Inhibitors and Their Application).Methods in Molecular Biology(Vol.832,pp.391−401).doi:10.1007/978−1−61779−474−2_27)。
IP阻害薬が細胞透過性であるかどうかを試験するために、プロテアソーム免疫沈降に基づく以下の方法及びインビトロ活性アッセイが使用できる。手順は次の通りである。
(1)細胞培養培地中37℃で、細胞を所望濃度のIP阻害薬と共に2時間インキュベートする。我々は通常、マウスの脾細胞(サンプルあたり1個の脾臓)を使用する。対照として、阻害薬なしで同数の細胞を使用する。
(2)細胞をPBSで3回洗浄し、非結合阻害薬を除去する。
(3)細胞を500μlの細胞溶解液で溶解し、氷上で20分間インキュベートする。
(4)溶解物(ライセート)を20,800×gで10分間遠心分離し、デブリを除去する。
(5)ペレットを廃棄し、3μlのポリクローナルウサギ抗マウスプロテアソーム抗体及び50μlのプロテインAマイクロビーズを上清に加え、氷上で30分間インキュベートする。
(6)μカラムをマグネットに挿入する。
(7)μカラムを1mlのNET−TON緩衝液で平衡化する。
(8)ライセートをμカラムに装填し、フロースルーを廃棄する。
(9)カラムを1mlのNET−TON緩衝液で2回、NET−T緩衝液で3回洗浄する。
(10)50μlの蛍光発生性基質を加え、カラムを37℃で30分間インキュベートする。
(11)200μlの細胞溶解液を加え、溶出液を回収する。
(12)100μlの溶出液中の蛍光を測定する(96ウェルプレート、平底、黒)。溶出液中の蛍光は、カラムに保持されたプロテアソームの活性に対応する。
多数のMHC−I拘束性CD8+T細胞エピトープは、IPサブユニットに依存性であることが記載されている。そのようなT細胞エピトープのプロセシングを調べることで、IP阻害薬の特異性を試験することができる。LMP−7選択的阻害薬PR−957を分析するために、我々は、LMP7依存性であると報告されている雄のHY由来CTLエピトープUTY 246−254を調べた。そこで、我々は、雄の脾細胞をPR−957で処理し、lacZアッセイでUTY 246−254特異的T細胞ハイブリドーマの助けを借りて、MHC−I提示UTY 246−254ペプチドを検出した。
(1)1匹の雄及び1匹の雌マウスの脾臓を取り出し、5mlのRPMI 10%FCS中に取る。
(2)脾臓をグリッドを通してプレスすることにより単一細胞懸濁液を製造する。
(3)細胞を347×gで5分間遠心分離し、上清を廃棄する。
(4)細胞を5mlの予熱された1.66%(w/v)のNH4Cl溶液に再懸濁することにより(15ml管)、赤血球を溶解する。
(5)室温で2分間インキュベートする。
(6)RPMI 10%FCSで15mlまで満たし、細胞を347×gで5分間遠心分離し、上清を廃棄する。
(7)細胞を15mlのPBSで洗浄し、細胞を347×gで5分間遠心分離し、上清を廃棄する。
(8)細胞を5mlのRPMI 10%FCS中に取り、Neubauerチャンバを用いて細胞をカウントする。
(9)ウェルあたり3mlのRPMI 10%FCS中で10 7脾細胞をインキュベートする(6ウェル組織培養プレート)。
(10)所望量の阻害薬を加える。未処理及び処理サンプルの比較のために、阻害薬なしの雄脾細胞1ウェルが必要である。雌脾細胞の場合、阻害薬なしの1ウェルだけが必要である。
(11)37℃で一晩インキュベートする。
(12)脾細胞を採取し、細胞を15mlのPBSで2回洗浄し、脾細胞をカウントする。
(13)RPMI 10%FCS中に107/mlで細胞を再懸濁する。
(14)96ウェル丸底組織培養プレートを使用し、ウェルA1−D1にウェルあたり150μlを加える。脾細胞の4回連続3倍希釈を行う(100μl/ウェル)。
(15)T細胞ハイブリドーマを採取し、カウントし、RPMI 10%FCS中に106/mlで再懸濁する(我々はUTY 246−254特異的T細胞ハイブリドーマ(5)を使用する)。
(16)ウェルあたり100μlのT細胞ハイブリドーマを加える(A1−A4;B1−B4)。バックグラウンド対照として、サンプルの半分に(C1−C4;D1−D4)100μlのRPMI 10%FCSを加える。
(17)雌脾細胞を陰性対照として使用し、未処理の雄脾細胞を陽性対照及び比較用として使用する。雌脾細胞に合成ペプチド(我々は10−7Mの濃度でUTY 246−254ペプチドを使用する)を加えて追加の陽性対照を作ることもできる。
(18)37℃で一晩インキュベートする。
(19)プレートを541×gで90秒間遠心分離し、上清を廃棄する。
(20)100μlのlacZ緩衝液を加え、37℃でインキュベートする。
(21)色の変化が見えたら(およそ1〜3時間後)、570/620nmで吸光度を測定する。
代替合成
トリペプチド28584の合成
トリペプチド28584の合成は、文献の手順に従って首尾よく実施された。ベンジルエステル28579の形成は、4gの規模で実施され、4.6gの生成物が得られた(1H−NMRによる純度>95%、LC/MSによる純度98%、収率82%)。
ペプチドカップリングが2g規模で実施され、1.8gの28581が得られた(LC/MSによる純度95%、1H−NMRによる純度90%、収率73%)。
2−メチル−5−チアゾールカルボン酸の28582とのアミド形成後、1.5gの28583が得られた(収率80%、1H−NMRによる純度93%;LC/MSでは>95%)。
メルドラム酸中間体28864の形成は、文献に報告されているように、DCM中でN−Boc−L−Leu−OH及びEDC/DMAPを用いて実施された。これらの反応条件下では、副産物の複合混合物を伴う生成物が形成されることが観察された。一つの主要な副産物はLC/MSにより環化ロイシン誘導体と確認された。反応粗製物は1H−NMRによる測定でおよそ30〜40%の純度を有している。
メルドラム酸ビルディングブロック開環のために28864をベンジルアルコールで処理したところ、所望生成物28865が得られた。6.7gの反応から1.7gの28865が得られた(収率26%、1H−NMRによる純度85%)。
脱保護は、28878のアミドカップリングの直前に実施された。28877の400mgの反応を実施し、反応粗製物(LC/MSによる純度85%)を次の反応工程に直ちに使用した。
Claims (15)
- 式(I):
Xは、C=O、C=S又はB−OHであり;
Yは求電子試薬であり、Zは脱離基であるか、又は
R1は、
(a)(i)プロテアソームのタンパク質分解部位に結合する第一の基(前記第一の基はXに結合している);及び
(ii)任意に送達を増強する第二の基;
又は
(b)プロテアソームのサブユニットβ1とβ2の間に結合する基
を含み、又はそれらからなり、
R2及びR3は、H、メチル、メトキシ、エチル、エテニル、エチニル及びシアノから独立に選ばれ、メチル及びエチルはOH又はハロゲンで置換されていてもよい]
の化合物。 - 前記第一の基が、少なくとも2個のアミノ酸を含む又は少なくとも2個のアミノ酸からなるペプチド基、又は対応するペプチド模倣物であり、Xは、前記ペプチド基のC末端アミノ酸のカルボニル基又はα炭素の代わりをし、前記第二の基は、存在する場合、前記ペプチド基のN末端に結合している、請求項1(a)に記載の化合物。
-
(a)CH=O、CH2−I、CH2−Br、CH2−Cl、CH2−OPO(OH)2、CH2−OTs、CO−NHS又はCH=CH2[式中、OTsはp−トルエンスルホニルオキシであり、NHSはN−オキシ−スクシンイミドである];又は
(b)O−I、O−Br、O−Cl、S−I、S−Br又はS−I
である、請求項1又は2に記載の化合物。 - R2及びR3が同一で、好ましくはメチル、メトキシ又は−CH2OHである、請求項1〜3のいずれか1項に記載の化合物。
- XがC=Oであり、
- 前記ペプチド基が3個のα−アミノ酸からなり、好ましくは、
(a)N末端アミノ酸は、Ser(OMe)、Leu、Phe及びAlaから選ばれ;中央のアミノ酸は、Ser(OMe)、Leu、Phe及びAlaから選ばれ;及び/又はC末端アミノ酸は、Phe、Tyr、Leu、Ser(OMe)及びAlaから選ばれるか;又は
(b)前記ペプチド基は、Ser(OMe)−Ser(OMe)−Phe、Leu−Leu−Tyr又はAla−Ala−Alaからなる、
請求項1〜5に記載の化合物。 - 前記化合物が、式(IIa)又は(IIb):
- 請求項1〜7のいずれか1項に定義された化合物のプロテアソーム阻害薬としての使用。
- プロテアソームの阻害法であって、前記方法は、プロテアソームと請求項1〜7のいずれか1項に定義の化合物とを接触させることを含み、ただし、療法によるヒト又は動物身体の治療法及びヒト又は動物身体に実施される診断法は除外される及び/又は前記方法はインビトロ又はエクスビボで実施される方法。
- 請求項1〜7のいずれか1項において定義された化合物を含む又はその化合物からなる医薬又は医薬を開発するためのリード化合物。
- がん、自己免疫疾患、筋ジストロフィー、肺気腫、又はがんもしくはAIDSに随伴する悪液質の治療、改善又は予防法に使用するための請求項1〜7のいずれか1項に定義の化合物。
- (a)前記がんが、好ましくは、多発性骨髄腫(MM)(再発性及び難治性MMを含む);非ホジキンリンパ腫、例えばマントル細胞リンパ腫(MCL)及びびまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)を含むB細胞リンパ腫、及びワルデンストレームマクログロブリン血症から選ばれるリンパ性悪性疾患であるか;又は
(b)前記自己免疫疾患が、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群又は強皮症である、
請求項11に記載されている使用のための化合物。 - プロテアソームを阻害できる化合物の同定法であって、前記方法は、式(III):
- 前記活性が、好ましくは、カスパーゼ様活性、トリプシン様活性及びキモトリプシン様活性から選ばれるタンパク質分解活性である、請求項13に記載の方法。
- 式(IV):
X、Y、Z、R2及びR3は、請求項1又は3〜5のいずれか1項に定義の通りである]の化合物。
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