CN109563126B - 蛋白酶体抑制剂 - Google Patents
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Abstract
Description
本发明涉及式(I)的化合物
其中
X是C＝O、C＝S或B-OH；
Y是亲电体且Z是离去基团，或
是亲电体；
R1包含以下或由以下组成
(a)(i)与蛋白酶体的蛋白水解位点结合的第一基团，所述第一基团与X结合；和
(ii)任选存在的增强递送的第二基团；
或
(b)在蛋白酶体亚基β1和β2之间结合的基团；
R2和R3独立地选自H、甲基、甲氧基、乙基、乙烯基、乙炔基和氰基，其中甲基和乙基可以被OH或卤素取代。
在本说明书中，引用了许多文献，包括专利申请和制造商手册。这些文献的公开内容在此整体援引加入，但不被认为与本发明的专利性相关。更具体地，所有参考文献均援引加入，其程度如同每个单独的文献被具体和单独地指出援引加入。
近年来，蛋白酶体已被证实是抗癌治疗的治疗靶标，第一个蛋白酶体抑制剂硼替佐米在2008年已被批准用于治疗多发性骨髓瘤和套细胞淋巴瘤。目前的努力集中于开发具有改善的药理学特性的第二代抑制剂。
蛋白酶体的环氧酮抑制剂是理想的癌症治疗剂。引发抑制所需的剂量大大低于硼酸蛋白酶体抑制剂硼替佐米。另外，许多用硼替佐米治疗的患者通过β-亚基(即，蛋白酶体的活性位点亚基)的突变获得对该剂的耐药性。近年来已经认识到硼替佐米耐药的患者对卡非佐米(其是现在批准用于临床使用的唯一的环氧酮抑制剂)有反应。这进一步突出了开发另外的环氧酮抑制剂和/或表现出与环氧酮抑制剂类似的抑制特性的抑制剂的重要性。为了追求这一目标，现在大多数方法都集中在环氧酮抑制剂的肽骨架的修饰上。这些修饰包括引入天然和非天然氨基酸以增加对给定蛋白酶体活性位点的特异性、环氧酮抑制剂的溶解度、口服给药癌症治疗剂的生物利用度和可能性。此外，药物化学方法集中于在S4位置添加封端剂，其增加环氧酮抑制剂的吸收特性和/或保护它们免受胃肠道的严酷酸性环境的影响。
这类环氧酮蛋白酶体抑制剂的母体分子环氧酶素首先被分离，作为由放线菌属(Actinomyces)菌株合成的天然产物。之后，发现了这类的另一种分子，也就是eponemycin，这些分子的几种合成变体(图1)目前在临床试验中作为癌症治疗剂(Bennett和Kirk,Curr.Opin.Drug Discov.Devel.,11,616-625(2008)；Demo等,Cancer Res.,67,6383-6391(2007))。
环氧酮抑制剂的功效是环氧酮基团的双亲电体性质的结果。基于环氧酮抑制剂与酵母、小鼠和人20S蛋白酶体的几种共晶结构，已经描述了蛋白酶体活性位点催化苏氨酸的
-羟基与酮基团的反应，而Thr1的N-末端氨基以不可逆的方式与抑制剂的环氧化物的碳原子反应，其在酮的α-位。如路线1中所示，该提出的化学过程导致形成1,4-吗啉环产物，其通过活性位点催化苏氨酸和环氧酮抑制剂形成(Groll等,Journal of the AmericanChemical Society,122,1237-1238(2000))。
路线1：环氧酮抑制剂抑制蛋白酶体活性位点的提出的化学反应机制(Groll等,loc.cit.)。最初，活性位点催化苏氨酸氨基酸侧链的
-羟基通过亲核攻击酯化环氧酮抑制剂的酮基(左边)。亲核加成反应导致形成半缩酮中间体，其中活性位点催化苏氨酸的/>
-羟基可逆地与环氧酮抑制剂结合(中间)。然后，活性位点催化苏氨酸的N-末端氨基与酮的α-位的亲电碳原子反应，形成共价修饰的蛋白酶体活性位点(右边)。由蛋白酶体活性位点和抑制剂两者形成的该1,4-吗啉环结构导致蛋白酶体活性位点的不可逆抑制。
该提出的抑制路线是基于晶体结构阐释的，其中20S蛋白酶体活性位点中的电子密度的分辨率和质量不足，无法在原子细节中明确地模拟抑制状态。然而，普遍认为，通过环氧酮不可逆的蛋白酶体抑制产生六原子环加合物，其在本领域是公认的；例如，参见Kubiczkova等人关于蛋白酶体抑制剂的综述中专门卡非佐米的部分和其中引用的参考文献(J.Cell.Mol.Med.,18,947-961(2014))。
仍然非常需要开发新的蛋白酶体抑制剂，特别是改进的蛋白酶体抑制剂，改进包括在较低剂量下的活性和较少的副作用。
该技术问题通过所附权利要求的主题解决。
因此，本发明的第一方面涉及式(I)的化合物
其中
X是C＝O、C＝S或B-OH；
Y是亲电体且Z是离去基团，或
是亲电体；
R1包含以下或由以下组成
(a)(i)与蛋白酶体的蛋白水解位点结合的第一基团，所述第一基团与X结合；和
(ii)任选存在的增强递送的第二基团；
或
(b)在蛋白酶体亚基β1和β2之间结合的基团；
R2和R3独立地选自H、甲基、甲氧基、乙基、乙烯基、乙炔基和氰基，其中甲基和乙基可以被OH或卤素取代。
除非另有说明，应理解，在整个本说明书中术语“化合物”包含其药学上可接受的盐、溶剂化物、多晶型物、前药、共药物、共晶、互变异构体、外消旋体、对映异构体或非对映异构体或混合物。
式(I)的化合物具有两部分结构。R1，本文也被称为“靶向基团”，负责将式(I)的化合物靶向蛋白酶体的蛋白水解位点。化合物的该部分可以建立在既定知识的基础上；详见下文。所述化合物的剩下部分更详细地显示于式(I)中。该部分在本文中也被称为“首基”或“弹头(warhead)”。它负责不可逆抑制蛋白酶体。首基需要相对于官能团X的β-位的亲电体(Y或
)。这样的设计与普遍认为的蛋白酶体的蛋白水解位点的不可逆抑制产生吗啉环相反。为了进一步解释，在上文所示的路线1中可以看到，预期的机制涉及Thr1的氨基在环氧酮抑制剂的酮的α-位上的亲核攻击。环氧基团适合于这样的亲核攻击，注意到酮的α-位的碳是亲电体。
本发明人确定了改进的分辨率范围
的人20S蛋白酶体的20多种晶体结构。这些人20S蛋白酶体的新晶体结构提供了在原子分辨率下抑制状态的深入了解。与先前描述的对环氧酮蛋白酶体抑制剂的6-元1,4-吗啉环结构的形成相反，现在可看出在抑制状态下形成7-元1,4-氧杂氮杂环庚烷环结构，涉及蛋白酶体活性位点的催化苏氨酸残基和抑制剂。这样的1,4-氧杂氮杂环庚烷抑制状态的形成是通过抑制剂上的双亲电反应基团实现的，其中两个亲电体彼此之间的距离为两个原子。
该发现允许提出通过环氧酮抑制剂抑制20S蛋白酶体的新的化学机制。在该反应机制中，最初，蛋白酶体活性位点催化苏氨酸的
-羟基与酮基团反应，其类似于形成1,4-吗啉环(6元环)结构的情况。与已确立的理论相反，为使得形成1,4-氧杂氮杂环庚烷7元环，Thr1的N-末端氨基以不可逆的方式与抑制剂的环氧化物的碳原子反应，其在酮的β-位(路线2)。与酮的β-位中的环氧化物的碳原子的反应显示是有利的，因为它是较少取代的中心。
路线2：根据本发明和基于人20S蛋白酶体的高分辨率共晶结构的由环氧酮抑制剂抑制蛋白酶体活性位点的化学反应机制。最初，活性位点催化苏氨酸氨基酸侧链的
-羟基通过亲核攻击酯化环氧酮抑制剂的酮基(左边)。亲核攻击导致形成半缩酮中间体，其中活性位点催化苏氨酸的/>
-羟基可逆地与环氧酮抑制剂结合(中间)。直到该步骤，以前假定的1,4-吗啉和新证明的1,4-氧杂氮杂环庚烷结构的抑制状态下的反应机制是相同的。然而，对于1,4-氧杂氮杂环庚烷结构的形成，活性位点催化苏氨酸的N-末端氨基然后与酮的β-位中的环氧化物的亲电碳原子反应以形成共价修饰的蛋白酶体活性位点(右边)。由蛋白酶体活性位点和抑制剂两者形成的该1,4-氧杂氮杂环庚烷环结构导致蛋白酶体活性位点的不可逆抑制。
从理论的角度来看，环氧酮抑制剂能够形成任一类型的加合物，即6元环或7元环。然而，从未考虑过形成7元环加合物。相反，现有技术一致于会形成吗啉环。本发明人的工作首先是建立形成7元环加合物。因此，本发明人第一个公开了式(I)中规定的特定分子结构，其特别适合于形成7元环加合物。本领域确立的环氧酮的抑制活性完全不能提示这种机制。仅鉴于高分辨率晶体结构，本发明人能够发现蛋白酶体的活性位点苏氨酸残基的亲核攻击的β-区域专一性。
不希望受具体理论束缚，本发明人进一步认为七元环加合物的形成在动力学上是有利的。因此，提供本发明第一方面的化合物，其特别适合于所述动力学上有利的反应机制，会使得使用较低的剂量。因此，预期有较少的副作用。
X是提供亲电体的官能团。它可以是酮基、硫酮基或硼酸基。例如，在硼替佐米中存在的硼酸基团的变体，式(I)的化合物要求硼是主链的一部分。如路线2中所示，蛋白酶体的活性位点苏氨酸残基的羟基的氧与基团X中的亲电体原子(碳原子或硼原子)结合。
基团
定义为第二亲电体。Y本身或/>
整体是亲电体；对于优选实施，进一步参见下文。
基团R2和R3定义为两个亲电体之间的化合物的中间(intervening)部分。
R1是上面提及的靶向部分。靶向部分是本领域已知的。在许多情况下，靶向部分本质上是肽。例如，这适用于环氧酶素、奥泼佐米、卡非佐米、Dihydroeponomycin、Eponemycin和ONX-0914。由于蛋白酶体的活性位点表现出蛋白水解活性，肽通常与所述活性位点结合，因此可用于靶向。
所述第一基团可任选地与第二基团结合，其中第二基团增强递送。如果第一基团本质上是肽并且由三个氨基酸或其衍生物组成，所述第二基团可以占据第四位置，其在本领域中也被称为S4位置。Dorsey等人(J.Med.Chem.,51,1068-1072(2008))和Zhou等人(J.Med.Chem.,52,3028-3038(2009))探索了连接于肽第一基团的N-末端的几种合适的基团。如这两篇出版物中所述，连接于肽第一基团的N-末端的这些基团均构成根据本发明的合适的第二基团。
所述第二基团的替代术语是“N-cap”。
虽然设想了肽第一基团，但靶向基团的特定结构不是本发明的关键。基本上，提供靶向蛋白酶体中蛋白水解位点或靶向其附近的任何化学基团都是根据本发明的合适的基团R1。如果靶向基团不直接靶向蛋白水解位点，而是靶向蛋白水解位点附近的蛋白酶体的另一位点，则可以使用合适长度的连接基将靶向基团R1连接至第一方面的化合物的活性元件，所述活性元件包括基团X、Y和Z。
举一个替代的靶向基团的实例，Beck等人(Angew.Chem.Int.Ed.54,11275-11278(2015))描述了与蛋白酶体的β1和β2亚基之间的缝隙结合的分子。该化合物如下所示。
替换与所述化合物的苯基结合的乙氧基基团的乙基是使该分子为合适的基团R1的方式。这在下面进一步详细说明。
术语“药学上可接受的盐”指本发明的化合物的盐。合适的药学上可接受的盐包括酸加成盐，例如，其可以通过将本发明的化合物的溶液与药学上可接受的酸的溶液(诸如，盐酸、硫酸、延胡索酸、马来酸、琥珀酸、乙酸、苯甲酸、柠檬酸、酒石酸、碳酸或磷酸)混合而形成。此外，当化合物带有酸性基团时，其合适的药学上可接受的盐可包括碱金属盐(例如，钠盐或钾盐)；碱土金属盐(例如，钙盐或镁盐)；和与合适的有机配体形成的盐(例如，使用反荷阴离子诸如卤化物、氢氧化物、羧酸盐、硫酸盐、磷酸盐、硝酸盐、烷基磺酸盐和芳基磺酸盐形成的铵、季铵和胺阳离子)。药学上可接受的盐的示例性实例包括但不限于，乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、碳酸氢盐、硫酸氢盐、酒石酸氢盐、硼酸盐、溴化物、丁酸盐、依地酸钙、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、右旋樟脑磺酸盐、碳酸盐、氯化物、柠檬酸盐、克拉维酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、二盐酸盐、十二烷基硫酸盐、依地酸盐、乙二磺酸盐、丙酸酯月桂硫酸盐(estolate)、乙磺酸盐、乙烷磺酸盐、甲酸盐、延胡索酸盐、葡庚糖酸盐(gluceptate)、葡庚糖酸盐(glucoheptonate)、葡糖酸盐、谷氨酸盐、甘油磷酸盐、glycolylarsanilate、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、己基间苯二酚盐、海巴明盐(hydrabamine)、氢溴酸盐、盐酸盐、氢碘酸盐、2-羟基-乙烷磺酸盐、羟基萘甲酸盐、碘化物、异硫代硫酸盐、乳酸盐、乳糖酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲烷磺酸盐、甲基硫酸盐、粘酸盐、2-萘磺酸盐、萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、N-甲基葡糖胺铵盐、油酸盐、草酸盐、双羟萘酸盐(恩波酸盐)、棕榈酸盐、泛酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐/二磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、聚半乳糖醛酸盐、丙酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、硫酸盐、碱式乙酸盐、琥珀酸盐、丹宁酸盐、酒石酸盐、茶氯酸盐、甲苯磺酸盐、三乙基碘盐(triethiodide)、十一酸盐、戊酸盐等(参见，例如，S.M.Berge等,"Pharmaceutical Salts",J.Pharm.Sci.,66,pp.1-19(1977))。
当本发明的化合物以结晶形式提供时，该结构可含有溶剂分子。溶剂通常是药学上可接受的溶剂，尤其包括水(水合物)或有机溶剂。可能的溶剂化物的实例包括乙醇化物和异丙醇化物。
术语“共药物”指通过共价化学键结合的两种或更多种治疗性化合物。详细定义可在例如N.Das等,European Journal of Pharmaceutical Sciences,41,2010,571–588中找到。
术语“共晶”指多组分晶体，其中所有组分在其纯形式下在环境条件下是固体。这些组分以化学计量或非化学计量比率的靶分子或离子(即，本发明的化合物)与一种或多种中性分子共晶形成剂共存在。详细讨论可在例如Ning Shan等,Drug Discovery Today,13(9/10),2008,440-446和D.J.Good等,Cryst.Growth Des.,9(5),2009,2252–2264中找到。
本发明的化合物还可以以前药的形式提供，也就是在体内代谢成活性代谢物的化合物。合适的前药例如是酯。合适的基团的具体实例尤其在US 2007/0072831的第[0082]至[0118]段中的标题前药和保护基团下给出。
如果本发明的化合物表现出pH依赖性带电状态，应理解所有可能的带电状态都包含在内。在这方面，优选的pH范围为0至14。
如果根据本发明的化合物带有净电荷，应理解该化合物以电中性形式提供。这通过一种或多种反荷离子实现，优选的反荷离子的定义与上文中的术语“盐”有关。
在优选的实施方案中，所述第一基团是肽基团，其包含至少两个氨基酸或由至少两个氨基酸组成，或是相应的肽模拟物，其中X代替所述肽基团的C-末端氨基酸的羰基或α-碳，所述第二基团如果存在与所述肽基团的N-末端结合。
优选的氨基酸是α-氨基酸。优选的α-氨基酸是20种蛋白质氨基酸。还优选的是所述蛋白质氨基酸的衍生物，例如，丝氨酸的甲酯，也表示为“Ser(OMe)”。也可以使用蛋白质氨基酸的其他衍生物，例如在Zhou等loc.cit.中描述的那些，包括4-二唑基丙氨酸、高丝氨酸甲酯、吡啶基丙氨酸(诸如2-吡啶基丙氨酸、3-吡啶基丙氨酸和4-吡啶基丙氨酸)；3-噻吩基丙氨酸、环己基丙氨酸、氰基丙氨酸和甲基丝氨酸。
也可以使用其他的α-氨基酸，诸如2-氨基丁酸。
在进一步优选的实施方案中，β-氨基酸可用于肽基团的一个或多个位置。还优选的是在一个或多个位置上使用D-氨基酸。
作为肽键的替代，可以使用替代的官能团。这可适用于单个肽键或两个或更多的肽键。如果所有肽键都被其他官能团取代，则其整体的骨架化学会变化。替代的骨架是本领域已知的，包括聚乳酸(PLA)、烷基胺、聚醚胺和下面所示的那些((a)至(r))，以及Grimm等(Acta Cryst D(2010),66,685-697)中描述的那些。
以上显示的骨架如下。
(a)M型聚醚胺。对于环氧乙烷(EO)，R1＝-H，或对于环氧丙烷(PO)，R1＝-CH3。对于聚醚胺M2005，PO/EO摩尔比为29/6，对于聚醚胺M2070，PO/EO摩尔比为10/31，对于聚醚胺M600，PO/EO摩尔比为9/1。(b)季戊四醇乙氧基化物。(c)季戊四醇丙氧基化物。(d)聚乙烯吡咯烷酮。(e)聚丙二醇。(f)聚乙烯醇。(g)聚丙烯酸酯。(h)基于纤维素的聚合物。R1＝-H、-CH3或-CH2CHOHCH3(羟丙基甲基纤维素)、-H或CH2CO2H(羧甲基纤维素)。(i)聚(乙烯亚胺)。(j)二[聚(乙二醇)]己二酸酯。(k)聚醚胺ED2003。(l)聚醚胺D2000。(m)聚醚胺SD2001。(n)T型聚醚胺。(o)聚丙烯酰胺。(p)甘油乙氧基化物。(q)丙烯酸/马来酸共聚物。(r)乙烯基吡咯烷酮/乙烯基咪唑共聚物。指数x、y、z和w各自独立地选自整数0、1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，条件是得到至少两个，优选三个结构单元的最小长度。虽然不排除如(b)和(c)中描述的那些支链骨架，但优选不是支链的骨架。因此，在如(b)和(c)的支链骨架式中，优选选自x、y和z的两个指数为0。氨基酸侧链的可能位置在图中表示为椭圆。这些位置相当于肽中的Cα原子。
更一般地说，肽基团可以被相应的肽模拟物替代。在该上下文中术语“相应的”指与肽基团相比肽模拟物具有相似的大小。因此，由两个氨基酸组成的肽基团和由三个氨基酸组成的肽基团，其各自分别对相应的肽模拟物施加大小限制。根据本发明的肽模拟物，可以使用上述替代的骨架和/或任何所提及的非蛋白质氨基酸，注意的是，为了考虑所提及的替代骨架，任何非蛋白质氨基酸的氨基和/或羧基可以进一步被修饰。
在二级结构方面，优选肽基团、相应的肽模拟物或骨架能够呈现β-折叠结构。能够呈现β-折叠结构的特定骨架包括肽键和上述替代物。
如上所公开，X可以代替所述肽基团的C-末端氨基酸的α碳的羰基。换句话说，假设X是CO(这是优选的)，则X是所述C-末端氨基酸的羰基。或者，α-碳可以被X代替。在该情况下，所述肽基团的C-末端氨基酸可以被视为截短的氨基酸。尽管如此，它被正式地视为单独的结构单元，并也被称为蛋白酶体抑制剂的S1位点。
术语“肽(peptidic)”指连接所述基团的氨基酸的肽键。肽基团的C-末端是与X连接的末端。如果肽键是反向的，即，是NHCO而不是CONH，这是落入术语“肽模拟物”的优选实施方案。
在实施例中给出了两种优选化合物的详细示例性合成操作。在下文中，公开了一般的合成操作。
活性酯的合成：A)由Boc-L-氨基酸形成β-酮酸，酯化以保护β-羧基基团。B)甲基化反应。C)Boc-脱保护。D)肽偶联。E)酯皂化成β-酮酸(部分地不稳定)。F)用N-羟基琥珀酰亚胺制备活性酯。
β-酮醛的合成：G)由Boc-L-氨基酸制备Weinreb-酰胺。H)Gringard反应以获得α-二氧杂环戊基酮。甲基化反应。I)Boc-脱保护。J)肽偶联。K)氧化成β-酮醛。
三肽合成：L)通过酯化保护Boc-L-氨基酸的羧基。M)Boc-脱保护。N)用Boc-L-氨基酸肽偶联。O)Boc-脱保护。P)用N-cap酸偶联。Q)酯皂化成酸。
作为肽基团或肽模拟物的R1的替代，可以使用结合蛋白酶体的亚基β1和β2之间的基团。优选地，所述基团是芳基磺酰胺，芳基优选为苯基，芳基与R12如下所述连接。在所述芳基磺酰胺和R12之间可以存在另外的基团，所述另外的基团优选是与如下所公开的结合于亚基β1和β2之间的特别优选的基团的相应的基团电子等排的。特别优选的是所述结合于亚基β1和β2之间的基团是4-[2-(4-R12-氧基-苯基)喹啉-4-基甲酰氨基]苯N-乙酰基磺酰胺。R12是将所述结合于亚基β1和β2之间的基团连接至X的连接基，优选为C5至C10烷基、C5至C10烯基或-[O-(CH2)2]1-5，其中所述连接基中的一个或多个C原子可以被O和/或N代替。
所述烯基可包含一个、两个或更多个双键。
到目前为止，基团
被显示为双键，其中包含于双键中的两个键中的一个是虚线。这表明Y和Z可以通过双键或单键连接。
在优选的实施方案中，
是Y＝Z，优选地选自CH＝O或CH＝CH2。或者，/>
是Y-Z，优选地选自CH2-I、CH2-Br、CH2-Cl、CH2-OPO(OH)2、CH2-OTs或CO-NHS，其中OTs是对甲苯磺酰氧基且NHS是N-氧基-琥珀酰亚胺。作为NHS活化酯的替代物，也可以使用本领域已知的其他活化酯。
在进一步替代的优选实施方案中，
是Y-Z并优选地选自O-I、O-Br、O-Cl、S-I、S-Br和S-I。
在进一步优选的实施方案中，R2和R3是相同的，并优选甲基、H、甲氧基或-CH2OH。特别优选是R2和R3两者都是甲基或R2和R3两者都是H。尤其优选的是R2和R3两者都是甲基。
优选X是CO。
优选
是CH＝O。还优选/>
是CO-NHS。
特别优选X是C＝O，且
是CH＝O或CO-NHS。
特别优选X是C＝O，且
是CH＝O或CO-NHS，且R2和R3两者都是甲基。
以下优选实施方案致力于靶向基团R1的优选实施。R1的任何优选实施方案可以与X、Y、Z、R2和R3的任何优选实施方案组合。
在优选的实施方案中，所述肽基团由三个α-氨基酸组成，其中优选(a)N-末端氨基酸选自Ser(OMe)、Leu、Phe和Ala；中间氨基酸选自Ser(OMe)、Leu、Phe和Ala；和/或C-末端氨基酸选自Phe、Tyr、Leu、Ser(OMe)和Ala；或(b)所述肽基团由Ser(OMe)-Ser(OMe)-Phe、Leu-Leu-Tyr或Ala-Ala-Ala组成。
所述N-末端氨基酸也被称为抑制剂的定义S3位点的基团。所述中间氨基酸定义S2位点。所述C-末端氨基酸定义S1位点。
在进一步优选实施方案中，存在增强递送的所述基团，为R11-CO、R11-CS-或R11-SO2-，R11选自以下取代或未取代的基团，基团为碳环基、杂碳环基、碳环基烷基、杂碳环基烷基、烷基杂碳环基烷氧基杂碳环基、烷氧基烷基杂碳环基、杂碳环基氨基、杂碳环基烷基杂碳环基和烷基杂碳环基烷基杂碳环基，其中烷基是C1至C4烷基，优选甲基，取代基是C1至C4烷基，优选甲基或乙基，C1-C4烷氧基，优选甲氧基或乙氧基，羟基和/或卤素，优选Cl、Br或I，杂原子是O、N和/或S。
R11-CO是特别优选的。
R11为杂碳环基，是特别优选的。
术语“碳环基”表示环分子，其中环包含碳原子。环可以仅由碳原子形成，但不必如此。因此，可存在一个、两个或更多个杂原子。环可以是饱和的，在这种情况下它可以是环烷烃，任选地包含一个或多个杂原子。环可以含有一个、两个或更多个双键。如果所述双键是共轭的，则碳环基是芳基基团。
在特别优选的实施方案中，(a)所述碳环基是芳基或联芳，芳基是单环或双环，优选苯基或萘基；和(b)所述杂碳环基是杂芳基，杂芳基是单环或双环、双杂芳基、芳基杂芳基、杂芳基芳基或杂环烷基，杂芳基优选呋喃基、噻吩基、噁唑基、异噁唑基、吡唑基、咪唑基、噻唑基、吡啶基、吡嗪基、哒嗪基或喹啉基，芳基优选苯基，杂环烷基优选吗啉基或四氢呋喃基。
特别优选杂碳环基是杂芳基，特别是单环杂芳基。
在特别优选的实施方案中，R11选自2-甲基噻唑-5-基；4-吗啉基甲基；1,4-二氯2-苯基；6-苯基吡啶-2-基；吡嗪-2-基；3-呋喃基；2-噻吩基；5-噁唑基；5-异噁唑基；(5-Me)-3-异噁唑基；(5-iPr)-3-异噁唑基；(5-MeOCH2)-3-异噁唑基；3-吡唑基；2-咪唑基；(N-Me)-3-吡唑基；(N-Me)-2-咪唑基；(5-Me)-3-吡唑基；4-吡啶基；4-哒嗪基；2-(R)-四氢呋喃基；2-(S)-四氢呋喃基；(5-Me)-3-异噁唑基-NH-；吡嗪-2-基；萘-2-基；喹啉-2-基；4-联苯基；3-联苯基；4-苯基吡啶-2-基；3-苯基-吡啶-2-基；5-苯基吡嗪-2-基；6-苯基吡嗪-2-基；2-苯基-噻唑-4-基；和5-R111-异噁唑-3-基；其中R111选自甲基、4-吗啉基甲基、1,2,4-三唑基甲基、咪唑基甲基和N-甲基哌嗪基甲基。
特别优选R11是2-甲基噻唑-5-基。
特别优选第一方面的化合物是式(IIa)和式(IIb)的化合物：
其中R1是R11-CO-Ser(OMe)-Ser(OMe)-NH-CH(CH2-C6H5)，R11如上所定义，其中最优选R1是2-甲基噻唑-5-基羰基Ser(OMe)-Ser(OMe)-NH-CH(CH2-C6H5)。
在第二方面，本发明提供如第一方面所定义的化合物作为蛋白酶体抑制剂的用途。
可以使用根据第一方面的一个或多个化合物。
优选地，所述蛋白酶体是蛋白酶体核心颗粒(CP)，其也称为20S蛋白酶体。在优选的实施方案中，使用组成型核心颗粒(cCP)。或者，可以使用组织特异性蛋白酶体亚型，诸如免疫蛋白酶体(iCP)或胸腺蛋白酶体(tCP)。
根据本发明的蛋白酶体抑制剂是化合物，其抑制蛋白酶体的一种或多种蛋白水解活性。蛋白酶体包含多个蛋白水解位点。优选地，所述蛋白水解位点如下：具有胱天蛋白酶样蛋白水解活性的位点、具有胰蛋白酶样蛋白水解活性的位点和具有糜蛋白酶样蛋白水解活性的位点。根据本发明的蛋白酶体抑制剂能够抑制这些位点中的至少一个。优选能够抑制这些位点中的两个或全部三个的化合物。
与此相关，在第三方面，本发明提供抑制蛋白酶体的方法，所述方法包括使蛋白酶体和如第一方面所定义的化合物接触，条件是排除通过对人体或动物体实施的治疗和诊断方法治疗人体或动物体的方法，和/或所述方法在体外或离体进行。
还提供抑制蛋白酶体的方法，所述方法包括使蛋白酶体和如第一方面所定义的化合物接触。所述方法可在体内进行。
应理解，所述使接触是在允许所述化合物和蛋白酶体之间的物理接触的条件下实现的。合适的条件包括水溶液，诸如缓冲水溶液。示例性条件可在随附的实施例中找到。
实施例还包括根据本发明的蛋白酶体活性测定。
优选的蛋白酶体活性测定如下。活性测定基于7-氨基-4-甲基-香豆素(AMC)底物的裂解，所述底物由融合N-末端至肽骨架的荧光团AMC组成。这些底物是荧光的，因为裂解的AMC展现出荧光(发射波长：380nm；发射波长：460nm)。对于每个活性位点使用特定底物(LLVY-AMC用于糜蛋白酶样位点，LLE-AMC用于胱天蛋白酶样位点，且RLR-AMC用于胰蛋白酶样位点)。蛋白酶体活性的监测首先通过在测定缓冲液中同时混合抑制剂和底物，并在37℃下孵育3分钟。加入50nM蛋白酶体并混合后，用荧光分光光度计监测荧光增加(激发波长：380nm；发射波长：460nm)。所有测量的DMSO浓度保持≤2％。荧光读数与蛋白酶体活性相关。该操作用于确定抑制的一级速率常数。IC50，其指将酶活性减少50％所需的抑制剂浓度，可以通过测量不同抑制剂浓度下的蛋白酶体活性来确定。
在第四方面，本发明提供包含如第一方面所定义的化合物或由如第一方面所定义的化合物组成的药物或用于开发药物的先导化合物。
术语“药物”和“药物组合物”在本文中等同使用。根据本发明的药物组合物可包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
合适的药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂的实例是本领域公知的，包括磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液(诸如油/水乳液)、各种类型的润湿剂、无菌溶液等。包含这样的载体的组合物可以通过已知的常规方法配制。这些药物组合物可以合适的剂量给药至个体。合适组合物的给药可以通过不同方式实现，例如，通过静脉内、腹膜内、皮下、肌内、局部、皮内、鼻内、或支气管内给药。特别优选所述给药通过注射进行。组合物还可以直接给药于靶位点，例如，通过基因枪递送至外部或内部靶位点。剂量方案会由主治医生和临床因素确定。如在医学领域中公知的，任何一名患者的剂量取决于许多因素，包括患者的体型、体表面积、年龄、待给药的特定化合物、性别、给药时间和途径、总体健康状况、以及同时给药的其他药物。药物活性物质可以以每剂量1ng至10mg/kg体重的量存在；然而，预想了低于或高于该示例性范围的剂量，特别是考虑到上述因素。如果方案是连续输注，则其还应在每分钟每千克体重1μg至10mg单位。优选的剂量为约10至约40mg/m2体表，其相当于约0.25至约1mg/kg体重。
根据本发明第一方面的一种或多种化合物可以是包含于根据本发明的药物中的唯一药物活性剂。或者，可以存在一种、两种或更多种其他药物活性剂。所述其他药物活性剂优选地选自用于治疗多发性骨髓瘤的已知的蛋白酶体抑制剂和/或治疗剂。上面讨论了已知的蛋白酶体抑制剂，包括硼替佐米、卡非佐米、伊沙佐米、marizomib、奥泼佐米、delanzomib、环氧酶素、dihydroeponemycin。用于治疗多发性骨髓瘤的示例性剂是来那度胺和地塞米松以及后两者的组合。
将先导化合物开发成药物也称为先导优化。
用于优化先导化合物药理学特性的方法是本领域已知的，包括修饰先导化合物以实现以下的方法：(i)改进的作用位点、活性谱、器官特异性，和/或(ii)改善的效力，和/或(iii)减少的毒性(改善的治疗指数)，和/或(iv)减少的副作用，和/或(v)改进的治疗作用发生、效果的持续时间，和/或(vi)改进的药代动力学参数(吸收、分布、代谢和排泄)，和/或(vii)改进的理化参数(溶解度、吸湿性、颜色、味道、气味、稳定性、状态)，和/或(viii)改善的一般特异性、器官/组织特异性，和/或(ix)优化的应用形式和通过以下的途径：(i)羧基的酯化，或(ii)羟基与羧酸的酯化，或(iii)羟基酯化成，例如，磷酸酯、焦磷酸酯或硫酸酯或半琥珀酸酯，或(iv)药学上可接受的盐的形成，或(v)药学上可接受的复合物的形成，或(vi)药理活性聚合物的合成，或(vii)亲水基团的引入，或(viii)芳香族或侧链上的取代基的引入/交换，改变取代基模式，或(ix)通过引入电子等排或生物电子等排的基团的改进，或(x)同源化合物的合成，或(xi)支链侧链的引入，或(xii)烷基取代基转化为环状类似物，或(xiii)羟基衍生化为缩酮、缩醛，或(xiv)N-乙酰化成酰胺、苯基氨基甲酸酯，或(xv)曼尼希碱、亚胺的合成，或(xvi)将酮或醛转化成席夫碱、肟、缩醛、缩酮、烯醇酯、噁唑烷、噻唑烷或其组合。
以上列举的各种步骤是本领域通常已知的。其包括或依赖于定量构效关系(QSAR)分析(Kubinyi,"Hausch-Analysis and Related Approaches",VCH Verlag,Weinheim,1992)、组合生物化学、经典化学等(参见，例如，Holzgrabe和Bechtold,DeutscheApotheker Zeitung 140(8),813-823,2000)。
在第五方面，本发明提供如第一方面所定义的化合物，其用于治疗、改善或预防癌症、自身免疫疾病、肌营养不良症、肺气肿或伴随癌症或AIDS的恶病质的方法。
更一般地说，根据本发明的化合物可用于治疗、改善或预防任何适合通过抑制蛋白酶体治疗、预防或改善的任何病状的方法。
在优选的实施方案中，所述癌症是淋巴恶性肿瘤，优选地选自多发性骨髓瘤(MM)，其包括复发性和难治性MM；非霍奇金淋巴瘤，诸如B细胞淋巴瘤，其包括套细胞淋巴瘤(MCL)和弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)；和
巨球蛋白血症。
在进一步优选的实施方案中，所述自身免疫疾病是类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、
综合征或硬皮病。
在第六方面，本发明提供鉴定能够抑制蛋白酶体的化合物的方法，所述方法包括使式(III)的测试化合物与蛋白酶体接触，
其中R4是有机基团，且X、Y、Z、R2和R3如根据第一方面或其优选实施方案所定义，其中存在所述测试化合物与不存在其相比蛋白酶体降低的活性表明所述测试化合物是能够抑制蛋白酶体的化合物。
该方面涉及筛选方法。筛选可以是生物化学筛选或细胞筛选。一般而言，各种测定设计可用于鉴定能够抑制给定靶分子(此处为蛋白酶体)的活性的化合物的目的。已确定的区别之一在细胞试验和生物化学试验之间。细胞试验有时被视为模拟更接近体内的情况，然而，它们有任何候选化合物通常必须在第一步中通过细胞膜的缺点。生物化学试验在这方面更简单。靶标，此处为蛋白酶体，可以在水溶液中以富集或纯化形式存在。在这样的试验方案中，没有膜屏障。然而，该条件可能进一步远离要经受治疗的生物体中的环境。
筛选的阴性对照是不存在如上公开的任何测试化合物。作为阳性对照，可以使用根据第一方面的一种或多种化合物或如本文公开的已知蛋白酶体抑制剂。
如本领域已知的，筛选方法可以以高通量方式实施。
因此，所述方法可以在高通量形式中起作用。通常可以在微量滴定板的孔中进行高通量测定，其中每个板可以含有96、384或1,536个孔。处理板，包括在不是环境温度的温度下孵育，使这些化合物与测定混合物的接触优选地通过一个或多个计算机控制的机器人系统(包括移液装置)实现。在筛选测试化合物的大型库和/或在短时间内进行筛选的情况下，例如，可以向每个孔中加入10、20、30、40、50或100种测试化合物的混合物。在孔中表现出生物活性的情况下，在本发明的情况抑制蛋白酶体，可以对所述测试化合物的混合物去卷积，以鉴定产生所述活性的所述混合物中的一种或多种测试化合物。
能够抑制蛋白酶体的化合物也指蛋白酶体抑制剂。
抑制优选活性减少至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的量。进一步优选的是活性降低102倍、103倍、104倍、105倍、106倍、107倍、108倍或109倍。
本领域确立的抑制活性的测量是IC50值，其指发生50％抑制的抑制剂浓度。优选地，通过本发明的鉴定方法鉴定的蛋白酶体抑制剂以及根据第一方面的化合物表现出IC50值在一位数的μM范围内，优选低于1μM，更优选低于100nM、低于10nM、低于1nM或低于100pM。IC50值优选使用如上所述的蛋白酶体活性测定来确定。
根据第六方面的方法，R4没有特别地限制。事实上，该方法的一个应用是鉴定其他靶向基团，该靶向基团可不同于关于本发明第一方面定义的靶向基团。
如上所述，R4是有机基团，它可具有200至1,000Da的分子量。
在优选的实施方案中，所述活性是蛋白水解活性，优选地选自胱天蛋白酶样活性、胰蛋白酶样活性和糜蛋白酶样活性。
在进一步优选的实施方案中，所述蛋白酶体包含在体外或离体细胞中。该优选的实施方案指细胞测定。
优选的细胞测定如下。用pZsProSensor-1载体(蛋白酶体活性的报道基因构建体)(Clontech Laboratories,Inc.)转染细胞(例如，HEK 293)。该载体编码不稳定的绿色荧光蛋白变体(ZsGreen)，其在C-末端与特定的降解模体(其介导通过蛋白酶体的识别和降解)融合。表达的ZsGreen的荧光读数(激发波长：493nm；发射波长：505nm)用于监控蛋白酶体活性。蛋白酶体的抑制导致与GFP通道中荧光信号的增加关联的ZsGreen的积累。
在第七方面，本发明提供式(IV)的化合物
其中
A选自NH-NH2、N3和点击化学官能团；
X、Y、Z、R2和R3如上所定义。
在第八方面，本发明提供式(IV)的化合物在合成蛋白酶体抑制剂、药物活性剂或用于开发药物活性剂的先导化合物中的用途，所述药物活性剂优选用于治疗或预防癌症或自身免疫疾病的方法，
其中
A选自NH-NH2、N3和点击化学官能团；
X、Y、Z、R2和R3如上所定义。
本发明的后两个方面涉及根据本发明的蛋白酶体抑制剂的首基或弹头。
一般而言，A是反应性基团。可以使用本领域确立的反应性基团。A的目的是提供与靶向基团(诸如上文定义的R1)的稳固不可逆的偶联。反应性基团A可以用于偶联至任何靶向基团。经与靶向基团偶联，可以获得根据第一方面的化合物。
“点击化学”是本领域确立的术语；参见，例如，Kolb等(2001)Click chemistry:diverse chemical function from a few good reactions.Angew.Chem.Int.Ed.40(11):2004；Sletten等(2009)Bioorthogonal Chemistry:Fishing for Selectivity in a Seaof Functionality.Angew.Chem.Int.Ed.48:6998；Jewett等(2010)Cu-free clickcycloaddition reactions in chemical biology.Chem.Soc.Rev.39(4):1272；Best等(2009)Click Chemistry and Bioorthogonal Reactions:Unprecedented Selectivityin the Labeling of Biological Molecules.Biochemistry.48:6571；和Lallana等(2011)Reliable and Efficient Procedures for the Conjugation of Biomoleculesthrough Huisgen Azide–Alkyne Cycloadditions.Angew.Chem.Int.Ed.50:8794。
关于在本说明书中描述特征的实施方案，特别是在权利要求中，其旨在从属权利要求中提到的每个实施方案与所述从属权利要求从属于的每个权利要求(独立的或从属的)的每个实施方案组合。例如，当独立权利要求1列出了3个替代方案A、B和C，从属权利要求2列出了3个替代方案D、E和F，权利要求3从属于权利要求1和2并且列出了3个替代方案G、H和I，应理解，本说明书明确地公开了相应的以下组合的实施方案：A、D、G；A、D、H；A、D、I；A、E、G；A、E、H；A、E、I；A、F、G；A、F、H；A、F、I；B、D、G；B、D、H；B、D、I；B、E、G；B、E、H；B、E、I；B、F、G；B、F、H；B、F、I；C、D、G；C、D、H；C、D、I；C、E、G；C、E、H；C、E、I；C、F、G；C、F、H；C、F、I，除非另有特别说明。
类似地，同样在当独立和/或从属权利要求没有列出替代方案的那些情况下，应当理解，如果从属权利要求回引多个前述权利要求，则认为由此涵盖的主题的任何组合是被明确公开的。例如，在独立权利要求1的情况下，从属权利要求2回引权利要求1，从属权利要求3回引权利要求2和1两者，其得出权利要求3和1的主题的组合是被清楚和明确地公开的，权利要求3、2和1的主题的组合一样。在存在进一步的引用权利要求1至3中任一项的从属权利要求4的情况下，其得出权利要求4和1，权利要求4、2和1，权利要求4、3和1以及权利要求4、3、2和1的主题的组合是被清楚和明确公开的。
附图显示：
图1：环氧酮类蛋白酶体抑制剂的代表性成员的化学结构。显示了从细菌菌株中分离的天然产物环氧酶素(右上)和dihydroeponemycin(右下)。还描述了母体天然产物分子的合成衍生物。卡非佐米(左上)最近被批准用于治疗多发性骨髓瘤并且目前正处于治疗其他癌症的临床试验中。奥泼佐米目前正在进行临床试验，其作为口服多效抑制剂用于治疗多种癌症。
图2：与环氧酮抑制剂复合的人20S蛋白酶体的共晶结构的晶体结构。2Fo-Fc电子密度图显示被卡非佐米(左上)、奥泼佐米(左下)、环氧酶素(右上)和dihydroeponemycin(右下)抑制的蛋白酶体活性位点1.5σ轮廓。注意，电子密度图揭示另外的碳原子的密度。在所有情况下，模型的环状环结构与通过环氧酮抑制剂与活性位点催化苏氨酸侧链的反应形成的1,4-氧杂氮杂环庚烷结构一致。
图3：确认7-元1,4-氧杂氮杂环庚烷环结构是经用环氧酮抑制剂抑制蛋白酶体形成的。显示了奥泼佐米(左上)和dihydroeponemycin(右上)的化学结构。椭圆形分别突出显示，在酮的α-位的碳原子上，奥泼佐米含有甲基，dihydroeponemycin含有甲醇基(methanolic group)。下图说明了被奥泼佐米(左下)和Dihydroeponemycin(右下)抑制的β5活性位点，以及抑制剂、环状连接和β5Thr2的4σ轮廓的省略图。β5残基2、19-21、33、45-50、129-131、169、170和β6 125、126的主链区段与Thr2、Thr23、Lys33、Ser130的β5侧链以及β6Asp125、Pro126的侧链一起表示为棒。虚线表示氢键(
距离)。在分别的右下图中，显示了抑制剂-Thr1连接的特写视图以及6σ轮廓的省略图。注意，在含有甲基和甲醇基的环氧酶素的情况下，电子密度图不支持手性中心，其会是所提出的1,4-吗啉环形成的机制的结果(左下)(Groll等,loc.cit.)。dihydroeponemycin结构不显示与两个甲醇基的存在相一致的电子密度，同样也证明1,4-吗啉环形成是错误的(右下)。
图4：尝试模拟在环氧酮抑制剂和蛋白酶体活性位点苏氨酸1之间发生的连接中的1,4-吗啉环结构。显示了由1,4-氧杂氮杂环庚烷连接和尝试的1,4-吗啉连接抑制蛋白酶体活性位点(主链)的叠加。尝试的1,4-吗啉精制揭示了抑制剂的甲基与R19和Y169的主链羰基原子发生的范德瓦耳斯碰撞。另外，在1,4-吗啉连接的C5甲醇原子处可见5σ的强负差异密度。在1,4-氧杂氮杂环庚烷连接的4位和5位处可见正密度。这些发现完全排除了在环氧酮抑制的蛋白酶体活性位点中形成1,4-吗啉环的形成。
图5：蛋白酶体催化活性的酶学表征。如方法中所述进行测量。左图描绘了典型的动力学实验，其中通过蛋白水解裂解释放的AMC的荧光信号的增加对时间作图。左侧窗口表示酶促肽裂解中的激活阶段，而右侧窗口代表稳态阶段。在右图中，通过我们的方法纯化的人20S蛋白酶体的具体活性分别指示前稳态(激活前)或稳态阶段。右图所示的等式用于对实验数据进行拟合。F0表示初始荧光，ΔFss：测量的稳态部分的荧光增加，kact：速率常数。具有速率常数kact的指数项用于描述反应的激活阶段。
实施例说明本发明。
实施例1
晶体学
人20S蛋白酶体的初始相通过使用鼠20S结构(PDB ID:3UNE)分子置换来确定。然后通过在Coot中的几轮交互式手动模型构建和在Refmac5中精制来优化该模型。所获得的结构显示出优异的立体化学，具有Rwork＝18％和Rfree＝21％的典型值，揭示了所有6724个残基的极好的电子密度，并揭示了用于纯化和结晶的缓冲液中存在的几种配体。
使用数据集
分辨率，我们创建了一个参考模型。通过该用于人20S蛋白酶体的优异模型的可用性，现在对相关晶体的集成的(integrated)和缩放的(scaled)X射线数据，通过参考模型的自动精制进行结构确定需要几分钟。然后结合的配体可以在差异密度图中快速识别，并在Coot中交互式建模。
用图1中所示的环氧酮抑制剂浸泡天然晶体。解决了与这些抑制剂复合的人20S蛋白酶体在
分辨率(比现有可获得的结构的分辨率更优/>
)的共晶结构。令人惊讶的是，在精制这些共晶结构(其允许以原子分辨率对人20S蛋白酶体的所有部分进行建模)后，不可能看出假定的1,4-吗啉环结构在抑制状态下。在所有情况下，新的环氧酮/人20S蛋白酶体共晶结构中的电子密度图与形成1,4-吗啉6元环不一致。相反，另一个原子的密度变得清晰可见，其与7元环结构相一致。事实上，建模通过环氧酮抑制剂与活性位点催化苏氨酸氨基酸反应形成的抑制状态下可见的环状分子，揭示了它代表1,4-氧杂氮杂环庚烷7元环结构(图2)。
1,4-氧杂氮杂环庚烷结构的观察与先前假定的环氧酮对20S蛋白酶体的化学抑制机制截然不同。因此，进行对照实验以确保观察到的该7元环结构是真实的，在抑制的蛋白酶体活性位点中1,4-氧杂氮杂环庚烷结构的建模是合理的。另外，该对照实验应提供对经蛋白酶体抑制形成7元环结构的化学抑制机制的深入了解。对于该对照实验，比较了使用环氧酮抑制剂环氧酶素和dihydroeponemycin确定的共晶结构。环氧酶素含有在碳原子上具有甲基配体的环氧基团，假定在该碳原子发生亲核攻击以形成假定的1,4-吗啉抑制的环结构(图3，左上)。另外，在假定的1,4-吗啉结构形成(环氧化物在酮的α-位的碳原子开环)后，应产生立体中心，其含有甲基和甲醇基两者(图3，右图)(Groll等,loc.cit.)。Dihydroeponemycin相反在该碳原子上已经含有甲醇配体，假定在该碳原子发生亲核攻击以形成所提出的1,4-吗啉抑制的环结构(图3，右上)。因此，在所提出的1,4-吗啉结构形成(环氧化物在酮的α-位的碳原子开环)后，应产生非手性中心，其含有两个甲醇基。在确定两种共晶结构的分辨率下(1.9和
)，可以验证是否是这种情况。然而，令人惊讶的是，两种结构的电子密度图揭示，抑制状态是由共价攻击酮的β-位的亲电碳原子形成的(图3，下图)，通过不存在与在环氧酶素的情况下的甲醇基和dihydroeponemycin的两个甲醇基一致的电子密度，排除在抑制状态下形成1,4-吗啉环结构的可能性。
尝试通过1,4-吗啉环结构连接模拟dihydroeponemycin复合物的活性位点中的电子密度没有成功(图4)。1,4-吗啉连接精制导致严重扭曲的分子几何结构，其特征在于N4-碳键伸长
C5-醇碳键缩短/>
且甲基-C5-醇键的角比预期值偏差-20度。另外，甲基碳表现出的与精氨酸19和酪氨酸169主链氧原子的范德瓦耳斯距离为/>
其太接近。此外，在1,4-吗啉环模型的C5甲醇氧的5σ水平轮廓的差异图中的强负差异密度峰值，以及在我们的1,4-氧杂氮杂环庚烷环模型的靠近位置4和5的4.5σ水平轮廓的正密度峰值，在该1,4-吗啉环精制后继续存在。相反，在精制的1,4-氧杂氮杂环庚烷连接中在高于2.3σ轮廓的密度图中，没有残余差异(既不是负的也不是正的)。
实施例2
合成
路线3：NHS-酯的合成。详细如下；参见步骤A至F。
路线4：β-酮醛的合成。详细如下；参见步骤G至K。
路线5：三肽的合成。详细如下；参见步骤L至Q。
A)向N-Boc-L-苯丙氨酸(1)的CH2Cl2溶液中加入EDC(1当量)、DMAP(1当量)和米氏酸(1当量)。将反应物在室温下搅拌17小时，然后倒入1M HCl中。分离层，含水层用CH2Cl2萃取三次。合并有机层，用盐水洗涤，用MgSO4干燥并真空浓缩。加入苯甲醇(1当量)后4小时将残余物在甲苯中加热至80℃。真空除去溶剂，残余物经快速色谱法纯化并用乙酸乙酯洗脱以产生(2)。
B)将(2)、甲基碘(3当量)和碳酸钾(2当量)的丙酮溶液在回流下加热17小时。加入2体积当量的水，用2体积当量的乙酸乙酯萃取所得混合物三次。合并有机物，用MgSO4干燥并真空浓缩。将残余物经制备型HPLC在0.1％甲酸水溶液中纯化，梯度至0.1％甲酸的乙腈溶液以得到(3)。
C)将(3)的溶液在10％TFA的CH2Cl2溶液中在室温下搅拌17小时。随后在真空中除去溶剂以产生(4)。
D)向(4)(1当量)的CH2Cl2和三乙胺(0.001当量)溶液中加入(19)(1当量)、HOBT(0.2当量)和EDC(2当量)。将溶液在25℃下搅拌24小时，然后用饱和碳酸氢钠溶液洗涤三次，每次用去离子水和盐水洗涤一次，有机层用MgSO4干燥。真空除去溶剂，残余物经快速色谱法纯化，用1:1的乙酸乙酯:正己烷洗脱以产生(5)。
E)在氢气氛(1atm)下在含有10％Pd/C的甲醇中搅拌(5)。2小时后，将混合物通过硅藻土过滤，真空除去溶剂以得到产物(6)。
F)向(6)的CH2Cl2溶液中加入EDC(2当量)和N-羟基琥珀酰亚胺(2当量)，将混合物搅拌2小时。然后真空除去溶剂，残余物经快速色谱法纯化，用1:5的乙酸乙酯:正己烷洗脱以产生(7)。
G)向搅拌的Boc-L-苯丙氨酸的CH2Cl2溶液中加入O,N-二甲基羟胺盐酸盐(1当量)、三乙胺(2当量)和BOP(1当量)。3.5小时后，将溶液用CH2Cl2稀释4倍，用3M HCL洗涤三次，用饱和碳酸氢钠洗涤三次，并用盐水洗涤三次。然后将有机层用MgSO4干燥，真空除去溶剂，并将残余物经快速色谱法用1:3的乙酸乙酯:正己烷纯化以产生(8)。
H)在氩气氛下将Weinreb酰胺(8)的THF溶液冷却至0℃，并滴加入THF中的1,3-二氧杂环戊基-2-溴化镁(5当量)。允许反应达到25℃，搅拌4小时后，用1M HCl淬灭形成沉淀物。过滤除去沉淀物，用乙酸乙酯洗涤三次。然后将合并的有机物用盐水洗涤，用MgSO4干燥并真空除去溶剂。然后将残余物经快速色谱法纯化，其使用1:4的乙酸乙酯:正己烷作为洗脱剂，以产生(9)。
I)将(9)的溶液在10％TFA的CH2Cl2溶液中在室温下搅拌17小时。随后真空除去溶剂以产生(10)。
J)向(10)(1当量)的CH2Cl2和三乙胺(0.001当量)的溶液中加入(19)(1当量)、HOBT(0.2当量)和EDC(2当量)。将溶液在25℃下搅拌24小时，然后用饱和碳酸氢钠溶液洗涤三次，每次用去离子水和盐水洗涤一次，有机层用MgSO4干燥。真空除去溶剂，残余物经快速色谱法纯化，用1:1的乙酸乙酯:正己烷洗脱以产生(11)。
K)将(11)和p-TsOH(0.1当量)的乙醛(0.5当量)溶液在氩气氛下在15℃下搅拌23小时。然后真空除去溶剂，残余物经快速色谱法纯化，用1:5的乙酸乙酯:正己烷洗脱以产生(12)。
L)向Boc-甲基丝氨酸(13)的DCM(二氯甲烷)和TEA(三乙胺)溶液中加入DMAP(4-二甲基氨基吡啶)。将所得溶液冷却至-5℃，然后在氩气氛下通过加料漏斗缓慢加入氯甲酸苄基酯。将反应在相同温度下保持3小时，然后用盐水稀释。分离层，含水层用DCM萃取。合并有机层，用Na2SO4干燥。过滤除去Na2SO4，减压除去挥发物。所得残余物经快速色谱法使用己烷和乙酸乙酯的混合物纯化，以提供中间体(14)，为白色固体。
M)通过加料漏斗向0℃的中间体(14)的DCM溶液中缓慢加入TFA(三氟乙酸)。将反应在相同温度下保持1小时，浓缩，并高真空干燥过夜。所得的残留TFA盐(15)无需进一步纯化用于下一步骤。
N)通过加料漏斗向-5℃的上述TFA盐、Boc-甲基丝氨酸(13)、HOBt(羟基苯并三唑)和HBTU(2-(1H-苯并三唑-1基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐)在THF(四氢呋喃)(600mL)中的混合物中缓慢加入DIEA。将反应在相同温度下保持4小时，然后用EtOAc(乙酸乙酯)和盐水稀释。分离层，含水层用EtOAc(2×300mL)萃取。合并有机层并用Na2SO4干燥。过滤除去Na2SO4，并减压除去挥发物。所得残余物经快速色谱法使用己烷和乙酸乙酯的混合物纯化，以提供二肽(16)，为白色固体。
O)通过加料漏斗向0℃的上述中间体(16)的DCM溶液中缓慢加入TFA。将反应在相同温度下保持2小时，浓缩，并高真空干燥过夜。所得的残留TFA盐(17)无需进一步纯化用于下一步骤。
P)向-5℃的TFA盐(17)、2-甲基噻唑-5-羧酸、HOBt和HBTU在THF中的混合物中缓慢加入DIEA。将反应在相同温度下保持4小时，然后用EtOAc和盐水稀释。分离层，含水层用EtOAc萃取。合并有机层并用Na2SO4干燥。过滤除去Na2SO4，并减压除去挥发物。所得残余物经快速色谱法使用己烷和乙酸乙酯的混合物纯化，以提供苄基酯(18)，为白色固体。
Q)将(18)在含有10％Pd/C的甲醇中在氢气氛(1atm)下搅拌。2小时后，将混合物通过硅藻土过滤，真空除去溶剂以得到产物(19)。
实施例3
蛋白酶体测定
活性测量
优选体外测定。
使用
-4荧光分光光度计(Horiba Scientific)进行所有动力学测量。琥珀酰-亮氨酸-亮氨酸-缬氨酸-酪氨酸-7-酰胺基-4-甲基香豆素(Suc-LLVY-AMC，Bachem)用作底物以确定人20S蛋白酶体β5催化活性位点的糜蛋白酶样活性(R.L.Stein,F.Melandri,L.Dick,Kinetic characterization of the chymotryptic activity of the 20Sproteasome.Biochemistry 35,3899-3908(1996))。在460nm(λex＝380nM)连续监测水解的AMC的荧光发射。所有测量的反应温度都保持在37℃，使用表S1中指定的反应缓冲液用于酶测定。将Suc-LLVY-AMC和抑制剂(诸如奥泼佐米、Dihydroeponemycin、Z-LLY-酮醛；“Suc”表示琥珀酰基，“Z”表示卞氧羰基)溶解在DMSO中并储存在-80℃直至使用。在任何测量中DMSO浓度均不超过2％(v/v)。对于Suv-LLVY-AMC转化的动力学表征，将反映缓冲液中的0.035mg/mL(50nM)人20S蛋白酶体在37℃下预孵育3分钟。通过加入底物开始反应，并连续测量荧光信号。为了确定各抑制剂的一级速率抑制常数，将含有反应缓冲液、150μM底物和或者奥泼佐米(50μM)、或者Dihydroeponemycin(150μM)或者Z-LLY-酮醛(15μM)的反应混合物在37℃下预孵育3分钟。然后通过加入人20S蛋白酶体至终浓度50nM开始反应。连续测量荧光信号。
分析数据并使用OriginPro 9.1和KaleidaGraph 4.03进行拟合。使用图5中所示的等式来分析糜蛋白酶样催化活性和20S蛋白酶体的催化活性。为了确定一级失活速率常数，使用的方程式在Z-LLY-酮醛的情况下含有两个指数项，或者对于环氧酮(奥泼佐米和Dihydroeponemycin)两个指数项加上线性项。两个指数项中的第一个说明催化激活，而第二个指数项代表通过抑制作用的催化失活。在使用环氧酮的情况下，线性项用于说明失活后蛋白酶体的残余活性。
替代的动力学测定。
进行活性测定的时间点测量以获得抑制剂结合的初始趋势。对于每个活性位点使用不同浓度的20S蛋白酶体：对于CL(糜蛋白酶样活性)和PGPH(肽基-谷氨酰基肽水解活性)为0.05mg/ml，对于TL(胰蛋白酶样活性)为0.075mg/ml。最终反应体积为30μl/孔。总共进行五次重复以获得均方根偏差(RMSD)，其包括空白和100％初始活性反应。步骤如下。
(1)制备主混合物：各自的蛋白酶体量(根据PGPH、TL或CL活性确定)。
(2)准备Eppendorf管，具有待分析各抑制剂的量；例如，30μl的500μM浓度的配体，其是1.5μl每次测定10mM抑制剂储备溶液。
(3)将28.5μl主混合物加入每个Eppendorf管中。将该溶液在室温下孵育15分钟并转移至96孔板的各孔中。
(4)孵育后，加入1μl的胱天蛋白酶位点、糜蛋白酶位点或胰蛋白酶位点的7.5mM底物储备溶液，得到250μM的最终底物浓度。将板离心并在室温下孵育1小时。
(5)向反应中加入300μl缓冲液，随后通过在Ex(激发波长)360nm-Em(发射波长)460nm下的荧光记录剩余的蛋白酶体活性。
(6)使用空白和100％初始活性计算剩余的活性。
一旦通过时间点测量观察到蛋白酶体抑制，就可以进行半数最大抑制浓度(IC50)测量。然后将剩余活性的百分比相对于各抑制剂的对数浓度作图。获得的数据用常规统计程序拟合，例如在以下中所述：Groll M,Gallastegui N,Maréchal X等(2010)20SProteasome Inhibition:Designing Non-Covalent Linear Peptide Mimics of theNatural Product TMC-95A.ChemMedChem 5:1701–1705。
测定参考：
活性测定的描述可见于Gallastegui,N.,&Groll,M.(2012).AnalysingProperties of Proteasome Inhibitors Using Kinetic and X-Ray CrystallographicStudies.In Methods in Molecular Biology(Vol.832,pp.373–390).doi:10.1007/978-1-61779-474-2_26。
细胞测定。
另一个实施例是来自Takara/Clontech的Z-Sensor蛋白酶体测定。ZsProSensor-1是蛋白酶体敏感的荧光报道分子。它是亮绿色荧光蛋白(Exmax＝496nm，Emmax＝506nm)与降解结构域(其靶向蛋白用于通过蛋白酶体的快速降解)的融合。当蛋白酶体活性下降时，细胞发出绿色荧光。
替代的方法：
Proteasome-GloTM糜蛋白酶样、胰蛋白酶样和胱天蛋白酶样基于细胞的测定(Promega)。
GFP-测定：Bence N,Bennett E,Kopito R,Deshaies R.Application andanalysis of the GFP(u)family of ubiquitin-proteasome systemreporters.Ubiquitin and Protein Degradation,Pt B.2005；399:481–490。
免疫蛋白酶体的细胞测定如下：
荧光体外试验(免疫蛋白酶体)：(Basler,M.,&Groettrup,M.(2012).Immunoproteasome-Specific Inhibitors and Their Application.In Methods inMolecular Biology(Vol.832,pp.391–401).doi:10.1007/978-1-61779-474-2_27)
为了测试IP抑制剂是否是细胞渗透的，可以使用基于蛋白酶体免疫沉淀和体外活性测定的以下方法。步骤如下。
(1)在37℃下在细胞培养基中用期望浓度的IP抑制剂孵育细胞2小时。我们通常使用小鼠脾细胞(每个样品一个脾脏)。作为对照，使用相同数量的不用抑制剂的细胞。
(2)用PBS洗涤细胞三次以除去未结合的抑制剂。
(3)在500μl裂解缓冲液中裂解细胞并在冰上孵育20分钟。
(4)将裂解液以20,800×g离心10分钟以除去碎片。
(5)弃去沉淀(pellet)，向上清液中加入3μl多克隆兔-抗-小鼠蛋白酶体抗体和50μl蛋白A微珠，并在冰上孵育30分钟。
(6)将μ柱插入磁铁。
(7)用1ml NET-TON缓冲液平衡μ柱。
(8)将裂解液加到μ柱上并丢弃流经的。
(9)用1ml NET-TON缓冲液洗涤柱两次，用NET-T缓冲液洗涤三次。
(10)加入50μl荧光底物并在37℃下孵育柱30分钟。
(11)加入200μl裂解缓冲液并收集洗脱液。
(12)在100μl洗脱液(96孔板，平底，黑色)中测量荧光。洗脱液中的荧光对应于柱中保留的蛋白酶体的活性。
LacZ测定(免疫蛋白酶体)；参见Basler,M.,&Groettrup,M.(2012).Immunoproteasome-Specific Inhibitors and Their Application.In Methods inMolecular Biology(Vol.832,pp.391–401).doi:10.1007/978-1-61779-474-2_27。
已经描述了许多MHC-I限制性CD8+T细胞表位是依赖于IP亚基的。研究这样的T-细胞表位的加工可以检验IP抑制剂的特异性。为了分析LMP7选择性抑制剂PR-957，我们研究了雄性HY衍生的CTL-表位UTY 246-254，据报道其是LMP7依赖性的。因此，我们用PR-957处理雄性脾细胞，并在lacZ测定中借助于UTY 246-254-特异性T-细胞杂交瘤检测MHC-I呈递的UTY 246-254肽。
(1)取出一只雄性和一只雌性小鼠的脾脏，并将脾脏置于5ml RPMI 10％FCS中。
(2)通过按压脾脏穿过网格制备单细胞悬液。
(3)将细胞以347×g离心5分钟并丢弃上清液。
(4)通过将细胞重悬于5ml预热的1.66％(w/v)NH4Cl溶液(在15ml管中)来裂解红细胞。
(5)在室温下孵育2分钟。
(6)用RPMI 10％FCS填充至15ml，以347×g离心细胞5分钟并丢弃上清液。
(7)用15ml PBS洗涤细胞，以347×g离心细胞5分钟并丢弃上清液。
(8)将细胞置于5ml RPMI 10％FCS中并用Neubauer室计数细胞。
(9)在每孔3ml RPMI 10％FCS中孵育107个脾细胞(6孔组织培养板)。
(10)加入期望量的抑制剂。需要一个没有抑制剂的雄性脾细胞的孔来比较未处理的和处理的样品。对于雌性脾细胞，仅需要一个没有抑制剂的孔。
(11)在37℃下孵育过夜。
(12)收集脾细胞，用15ml PBS洗涤细胞两次，并计数脾细胞。
(13)在RPMI 10％FCS中以107/ml重悬细胞。
(14)使用96孔圆底组织培养板，加入150μl每孔至孔A1-D1。制备四个系列三倍稀释的脾细胞(100μl/每孔)。
(15)收集T细胞杂交瘤，计数并以106/ml重悬于RPMI 10％FCS中。(我们使用UTY246-254特异性T-细胞杂交瘤(5)。)
(16)每孔加入100μl T细胞杂交瘤(A1-A4；B1-B4)。向一半样品(C1-C4；D1-D4)加入100μl RPMI10％FCS作为背景对照。
(17)雌性脾细胞用作阴性对照，未处理的雄性脾细胞用作阳性对照并用于比较。可以将合成肽(我们使用浓度为10-7M的UTY 246-254肽)添加到雌性脾细胞中来制作额外的阳性对照。
(18)在37℃孵育o/n。
(19)将板以541×g离心90秒并丢弃上清液。
(20)加入100μl lacZ缓冲液并在37℃孵育。
(21)当可见颜色变化时(约1-3小时后)测量570/620nm处的吸光度。
实施例4
替代的合成
三肽28584的合成
路线1：三肽28584的合成路线。
根据文献操作成功地进行了三肽28584的合成。以4g的规模进行苄基酯28579的形成，获得4.6g产物(通过1H-NMR确定的纯度>95％，通过LC/MS确定的纯度为98％，产率为82％)。
以下28579的Boc-脱保护导致4.8g的28580的定量产率，通过1H-NMR确定的纯度>95％，通过LC/MS确定的纯度为86％。
以2g的规模进行肽偶联，获得1.8g的28581(通过LC/MS确定的纯度为95％，通过1H-NMR确定的纯度为90％，产率为73％)。
以1.7g的规模进行28582的合成，获得1.7g的产物(28582)为TFA盐(定量产率，通过1H-NMR确定的纯度为90％)。
2-甲基-5-噻唑甲酸与28582形成酰胺后，获得1.5g的28582(产率为80％，通过1H-NMR确定的纯度为93％；通过LC/MS确定的纯度>95％)。
以1.5g的规模用10％Pd/C进行28583的苄基酯脱保护，获得1.0g 28584(产率为79％，通过1H-NMR和LC/MS确定的纯度为95％)。发现苄基酯脱保护需要更多的催化量10％Pd/C。为了快速脱保护，需要与28583的使用量相比至少等量的Pd/C。
NHS-酮酯28880和硫酯29502、29865的合成
路线2：NHS-酮酯28880或硫酯29502和29865的合成。
如文献中报道的，通过使用DCM中的N-Boc-L-Leu-OH和EDC/DMAP进行米氏酸中间体28864的形成。观察到在这些反应条件下，形成了具有副产物的复杂混合物的产物。一种主要的副产物通过LC/MS鉴定为环化亮氨酸衍生物。反应粗产物的纯度通过1H-NMR确定为约30-40％。
路线3：N-Boc-L-Leu-OH至28864的反应和观察到的环化副产物的形成。
当用苯甲醇处理28864以使米氏酸的结构单元打开，获得所需产物28865。6.7g反应获得1.7g的28865(产率为26％，通过1H-NMR确定的纯度为85％)。
通过在丙酮中在K2CO3存在下使用过量的甲基碘进行28865的双烷基化，其导致形成28895，产率为30-38％。最后，3.7g规模反应中，获得1.3g的28895(产率为38％，通过1H-NMR确定的纯度为95％)。
使用10％TFA的DCM溶液进行28877的N-Boc脱保护，并如文献中报道的那样操作。进行1H-NMR后清楚地显示了化合物的混合物。进行另一反应，发现反应在2小时内而不是在文献中报道的17小时内完成。
将反应混合物在室温下浓缩。
在28878的酰胺偶联之前不久进行脱保护。进行400mg 28877的反应，并将反应粗产物(通过LC/MS确定的纯度为85％)立即用于下一反应步骤。
HATU成功地用作合成28878的偶联剂。进行1H-NMR后表明发生了差向异构化(通过1H-NMR确定为15％)。这与报道的文献相一致。通过使用HATU作为偶联剂，以100mg和300mg的规模成功地进行了28878的合成。纯化后，获得65mg(产率为36％，通过LC/MS确定的纯度为95％)和298mg(产率为55％，通过LC/MS确定的纯度为95％)的产物28878。在两种情况下，差向异构体的存在从15mol％减少至8mol％。
使用N,N-二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的THF/DMF溶液作为溶剂体系进行28879的合成。通过LC/MS确定，观察到具有正确质量的峰形成。
在二环己基脲在DCM中沉淀并通过用水洗涤除去过量NHS后，获得25mg(通过LC/MS确定的纯度为48％)。尝试在反相柱上通过制备型HPLC纯化粗化合物。通过DCM萃取级分以避免水解/脱羧。获得0.7mg，纯度93％，在LC/MS中具有正确产物质量的峰。由于样本少量，CDCl3中的1H-NMR没有提供清楚的指示。
对于结构说明，通过使用N,N-二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的EtOAc/DMF溶液作为溶剂体系，以140mg的规模进行28880的反应。LC/MS分析显示具有正确产物质量的峰的形成。在二环己基脲在DCM中沉淀并通过用水洗涤除去过量NHS后，获得120mg(通过LC/MS确定的纯度为48％)。尝试通过制备型HPLC纯化粗品。
为了提高偶联效率，使用PyBOP作为偶联剂。使用1.3当量PyBOP、2.0当量DIPEA和3.0当量NHS，还观察到具有正确产物质量的非常突出的峰，其强度比之前高得多。
为了证明在LC/MS中观察到的具有正确产物质量的峰是否是人工制品或是否属于所期望的化合物28880，将其用MeOH处理以形成28880的甲酯。LC/MS分析显示具有预期的NHS-酯质量的峰消失，并观察到具有甲酯的正确质量的峰形成。
通过两次短塞过滤柱色谱法进行纯化。在第一种情况下，反应混合物直接通过二氧化硅垫过滤，反应后没有去除任何溶剂。THF用作洗脱剂。浓缩上述级分后，使用DCM/THF混合物作为洗脱液，通过短柱色谱法再次纯化化合物。获得9.8mg产物(通过LC/MS确定的纯度为62％)。由于量非常小，产品的纯度无法进一步改善。但是，1H-NMR与产物相一致。对于更大规模，通过使用环己烷/THF作为溶剂混合物优化柱色谱法来改善纯化。
通过使用1.3当量PyBOP、2.0当量DIPEA和3.0当量NHS作为偶联条件进行另外的100mg反应。通过短塞过滤柱色谱法进行纯化。在第一种情况下，将反应混合物通过二氧化硅垫过滤而没有任何浓缩。THF用作洗过液。浓缩上述级分后，使用环己烷/THF混合物作为洗脱液，通过柱色谱法纯化化合物。获得47mg所期望的标题化合物28880，通过1H-NMR确定的纯度为88％，含有13.5mol％的脱酸的28879。
总之，成功地获得了通过1H-NMR确定的纯度为88％的47mg的28880。
Claims (25)
1.式(I)的化合物
其中
X是C＝O、C＝S或B-OH；
(a)CH＝O、CH2-I、CH2-Br、CH2-Cl、CH2-OPO(OH)2、CH2-OTs、CO-NHS或CH＝CH2，其中OTs是对甲苯磺酰氧基且NHS是N-氧基-琥珀酰亚胺；或
(b)O-I、O-Br、O-Cl、S-I、S-Br或S-I；
R1由以下组成
(a)(i)第一基团，其为与蛋白酶体的蛋白水解位点结合的肽基团，所述第一基团与X结合；其中所述肽基团由三个α-氨基酸组成，其中N-末端氨基酸选自Ser(OMe)、Leu、Phe和Ala；
中间氨基酸选自Ser(OMe)、Leu、Phe和Ala；和/或C-末端氨基酸选自Phe、Tyr、Leu、Ser(OMe)和Ala；并且X代替所述肽基团的C-末端氨基酸的羰基或α-碳；和
(ii)任选存在的增强递送的第二基团，其中所述第二基团与所述肽基团的N-末端结合；
或
(b)在蛋白酶体亚基β1和β2之间结合的芳基磺酰胺；
R2和R3独立地选自甲基、甲氧基、乙基、乙烯基、乙炔基和氰基，其中甲基和乙基可以被OH或卤素取代。
2.权利要求1所述的化合物，其中R2和R3是相同的。
3.权利要求2所述的化合物，其中R2和R3是甲基、甲氧基或-CH2OH。
4.权利要求1至3中任一项所述的化合物，其中X是C＝O且
是CH＝O或CO-NHS。
5.权利要求1至3中任一项所述的化合物，其中所述肽基团由Ser(OMe)-Ser(OMe)-Phe、Leu-Leu-Tyr或Ala-Ala-Ala组成。
6.权利要求1所述的化合物，其中所述化合物具有式(IIa)或(IIb)
其中R1是2-甲基噻唑-5-基羰基Ser(OMe)-Ser(OMe)-NH-CH(CH2-C6H5)。
7.化合物在离体或体外作为蛋白酶体抑制剂的用途，其中所述化合物为式(I)的化合物
其中
X是C＝O、C＝S或B-OH；
(a)CH＝O、CH2-I、CH2-Br、CH2-Cl、CH2-OPO(OH)2、CH2-OTs、CO-NHS或CH＝CH2，其中OTs是对甲苯磺酰氧基且NHS是N-氧基-琥珀酰亚胺；或
(b)O-I、O-Br、O-Cl、S-I、S-Br或S-I；
R1由以下组成
(a)(i)第一基团，其为与蛋白酶体的蛋白水解位点结合的肽基团，所述第一基团与X结合；其中所述肽基团由三个α-氨基酸组成，其中N-末端氨基酸选自Ser(OMe)、Leu、Phe和Ala；
中间氨基酸选自Ser(OMe)、Leu、Phe和Ala；和/或C-末端氨基酸选自Phe、Tyr、Leu、Ser(OMe)和Ala；并且X代替所述肽基团的C-末端氨基酸的羰基或α-碳；和
(ii)任选存在的增强递送的第二基团，其中所述第二基团与所述肽基团的N-末端结合；
或
(b)在蛋白酶体亚基β1和β2之间结合的芳基磺酰胺；
R2和R3独立地选自H、甲基、甲氧基、乙基、乙烯基、乙炔基和氰基，其中甲基和乙基可以被OH或卤素取代。
8.抑制蛋白酶体的方法，所述方法包括使蛋白酶体和化合物接触，条件是排除通过对人体或动物体实施的治疗和诊断方法来治疗所述人体或动物体的方法，和/或所述方法在体外或离体进行，其中所述化合物为式(I)的化合物
其中
X是C＝O、C＝S或B-OH；
(a)CH＝O、CH2-I、CH2-Br、CH2-Cl、CH2-OPO(OH)2、CH2-OTs、CO-NHS或CH＝CH2，其中OTs是对甲苯磺酰氧基且NHS是N-氧基-琥珀酰亚胺；或
(b)O-I、O-Br、O-Cl、S-I、S-Br或S-I；
R1由以下组成
(a)(i)第一基团，其为与蛋白酶体的蛋白水解位点结合的肽基团，所述第一基团与X结合；其中所述肽基团由三个α-氨基酸组成，其中N-末端氨基酸选自Ser(OMe)、Leu、Phe和Ala；
中间氨基酸选自Ser(OMe)、Leu、Phe和Ala；和/或C-末端氨基酸选自Phe、Tyr、Leu、Ser(OMe)和Ala；并且X代替所述肽基团的C-末端氨基酸的羰基或α-碳；和
(ii)任选存在的增强递送的第二基团，其中所述第二基团与所述肽基团的N-末端结合；
或
(b)在蛋白酶体亚基β1和β2之间结合的芳基磺酰胺；
R2和R3独立地选自H、甲基、甲氧基、乙基、乙烯基、乙炔基和氰基，其中甲基和乙基可以被OH或卤素取代。
9.药物，其包含权利要求1至6中任一项所定义的化合物或由权利要求1至6中任一项所定义的化合物组成。
10.化合物在制备用于治疗、改善或预防癌症、自身免疫疾病、肌营养不良症、肺气肿或伴随癌症或AIDS的恶病质的药物中的用途，其中所述化合物为式(I)的化合物
其中
X是C＝O、C＝S或B-OH；
(a)CH＝O、CH2-I、CH2-Br、CH2-Cl、CH2-OPO(OH)2、CH2-OTs、CO-NHS或CH＝CH2，其中OTs是对甲苯磺酰氧基且NHS是N-氧基-琥珀酰亚胺；或
(b)O-I、O-Br、O-Cl、S-I、S-Br或S-I；
R1由以下组成
(a)(i)第一基团，其为与蛋白酶体的蛋白水解位点结合的肽基团，所述第一基团与X结合；其中所述肽基团由三个α-氨基酸组成，其中N-末端氨基酸选自Ser(OMe)、Leu、Phe和Ala；
中间氨基酸选自Ser(OMe)、Leu、Phe和Ala；和/或C-末端氨基酸选自Phe、Tyr、Leu、Ser(OMe)和Ala；并且X代替所述肽基团的C-末端氨基酸的羰基或α-碳；和
(ii)任选存在的增强递送的第二基团，其中所述第二基团与所述肽基团的N-末端结合；
或
(b)在蛋白酶体亚基β1和β2之间结合的芳基磺酰胺；
R2和R3独立地选自H、甲基、甲氧基、乙基、乙烯基、乙炔基和氰基，其中甲基和乙基可以被OH或卤素取代；
其中
(a)所述癌症是淋巴恶性肿瘤；或
(b)所述自身免疫疾病是类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、
综合征或硬皮病。
11.权利要求10所述的用途，其中所述癌症选自多发性骨髓瘤(MM)、非霍奇金淋巴瘤和
巨球蛋白血症。
12.权利要求11所述的用途，其中所述多发性骨髓瘤(MM)为复发性或难治性MM。
13.权利要求11所述的用途，其中所述非霍奇金淋巴瘤为B细胞淋巴瘤。
14.权利要求13所述的用途，其中所述B细胞淋巴瘤为套细胞淋巴瘤(MCL)或弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。
15.鉴定能够抑制蛋白酶体的化合物的方法，所述方法包括使式(III)的测试化合物与蛋白酶体接触，
其中R4是有机基团，X、Y和Z如权利要求1和4中任一项所定义，并且
R2和R3独立地选自H、甲基、甲氧基、乙基、乙烯基、乙炔基和氰基，其中甲基和乙基可以被OH或卤素取代；
其中存在所述测试化合物与不存在其相比所述蛋白酶体降低的活性表明所述测试化合物是能够抑制蛋白酶体的化合物。
16.权利要求15所述的方法，其中R2和R3是相同的。
17.权利要求16所述的方法，其中R2和R3是甲基、甲氧基或-CH2OH。
18.权利要求15所述的方法，其中所述活性是蛋白水解活性。
19.权利要求18所述的方法，其中所述活性选自胱天蛋白酶样活性、胰蛋白酶样活性和糜蛋白酶样活性。
20.式(IV)的化合物
其中
A为NH-NH2或N3；
X如权利要求1和4中任一项所定义；
(a)CH＝O、CH2-I、CH2-Br、CH2-OPO(OH)2、CH2-OTs或CO-NHS，其中OTs是对甲苯磺酰氧基且NHS是N-氧基-琥珀酰亚胺；或
(b)O-I、O-Br、O-Cl、S-I、S-Br或S-I；并且
R2和R3独立地选自H、甲基、甲氧基、乙基、乙烯基、乙炔基和氰基，其中甲基和乙基可以被OH或卤素取代。
21.权利要求20所述的化合物，其中所述R2和R3是相同的。
22.权利要求21所述的化合物，其中所述R2和R3是甲基、甲氧基或-CH2OH。
23.式(IV)的化合物在合成蛋白酶体抑制剂中的用途，
其中
A为NH-NH2或N3；
X、Y和Z如权利要求1和4中任一项所定义；并且
R2和R3独立地选自H、甲基、甲氧基、乙基、乙烯基、乙炔基和氰基，其中甲基和乙基可以被OH或卤素取代。
24.权利要求23所述的用途，其中所述R2和R3是相同的。
25.权利要求24所述的用途，其中所述R2和R3是甲基、甲氧基或-CH2OH。
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