JP2002145897A - アミノ酸誘導体及びその製造法 - Google Patents
アミノ酸誘導体及びその製造法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 新規な免疫プロテアソームを阻害する物質を
提供することによって、優れた免疫抑制剤、抗炎症剤、
抗アレルギー剤、自己免疫疾患治療剤、抗癌剤、神経変
性疾患治療剤を提供する。 【解決手段】 一般式（１） で表されることを特徴とする新規なアミノ酸誘導体及び
薬理学的に許容しうる塩及び水和物が免疫プロテアソー
ムを選択的に阻害することを見出し、本発明を完成し
た。
提供することによって、優れた免疫抑制剤、抗炎症剤、
抗アレルギー剤、自己免疫疾患治療剤、抗癌剤、神経変
性疾患治療剤を提供する。 【解決手段】 一般式（１） で表されることを特徴とする新規なアミノ酸誘導体及び
薬理学的に許容しうる塩及び水和物が免疫プロテアソー
ムを選択的に阻害することを見出し、本発明を完成し
た。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、構成型プロテアソ
ームを阻害することなく免疫型プロテアソームを選択的
に阻害し、免疫抑制剤、抗炎症剤、抗アレルギー剤、自
己免疫疾患治療剤、抗癌剤、神経変性疾患治療剤として
有用なアミノ酸誘導体およびそれらの製造法に関する。
ームを阻害することなく免疫型プロテアソームを選択的
に阻害し、免疫抑制剤、抗炎症剤、抗アレルギー剤、自
己免疫疾患治療剤、抗癌剤、神経変性疾患治療剤として
有用なアミノ酸誘導体およびそれらの製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】プロテアソームは真核細胞の主として核
や細胞質に存在するきわめて複雑な分子構造をした巨大
な可溶性高分子タンパク質複合体であり、沈降係数20Ｓ
のATP非依存型と沈降係数26ＳのATP依存型のふたつの分
子種として存在する。20Ｓプロテアソームはそれ自身で
キモトリプシン様活性やトリプシン様活性およびペプチ
ジルグルタミルペプチド加水分解活性を有しており、短
鎖のペプチドを分解することができる。26Ｓプロテアソ
ームは触媒機能を有する20Ｓプロテアソームに制御サブ
ユニット複合体が結合して形成されており、ユビキチン
化を受けたタンパク質をペプチドやアミノ酸に分解する
（実験医学 15巻、2056頁、1997年、Science vol.26
8、533頁、1995年、Nature 357巻、375頁、1992年）。
また、精製した古細菌プロテアソームの触媒機構の研究
から、プロテアソームがスレオニンプロテアーゼである
ことも判明している（Science vol.268、579頁、1995
年）。
や細胞質に存在するきわめて複雑な分子構造をした巨大
な可溶性高分子タンパク質複合体であり、沈降係数20Ｓ
のATP非依存型と沈降係数26ＳのATP依存型のふたつの分
子種として存在する。20Ｓプロテアソームはそれ自身で
キモトリプシン様活性やトリプシン様活性およびペプチ
ジルグルタミルペプチド加水分解活性を有しており、短
鎖のペプチドを分解することができる。26Ｓプロテアソ
ームは触媒機能を有する20Ｓプロテアソームに制御サブ
ユニット複合体が結合して形成されており、ユビキチン
化を受けたタンパク質をペプチドやアミノ酸に分解する
（実験医学 15巻、2056頁、1997年、Science vol.26
8、533頁、1995年、Nature 357巻、375頁、1992年）。
また、精製した古細菌プロテアソームの触媒機構の研究
から、プロテアソームがスレオニンプロテアーゼである
ことも判明している（Science vol.268、579頁、1995
年）。
【０００３】さらに最近、真核生物が通常有するプロテ
アソーム（構成型プロテアソーム）とは異なり、IFN-γ
によって強く誘導されるプロテアソームとして免疫プロ
テアソームが発見された（Adv. Immunol., vol.64、1
頁、1997年）。
アソーム（構成型プロテアソーム）とは異なり、IFN-γ
によって強く誘導されるプロテアソームとして免疫プロ
テアソームが発見された（Adv. Immunol., vol.64、1
頁、1997年）。
【０００４】プロテアソームの生理機能として、まずＴ
ＮＦ―α、IL-1、IL-2等の炎症性サイトカインやICAM-
1、VCAM-1等の接着分子の発現に重要な炎症性転写因子
ＮＦ−κＢの活性化に重要な役割をになっている（Cell
vol.78、773頁、1994年、 Cell vol.80、529頁、199
5年）。また、内在性抗原のプロセッシング酵素として
も機能しており、免疫応答においても重要な機能を果た
している。さらに細胞周期の制御にも関与し癌抑制タン
パク質の分解や神経細胞のアポトーシスにも関与してい
る（Nature vol.349、132頁、1991年、Cell vol.75、
495頁、1993年、FEBS vol.304、57頁、1992年、組織培
養 22巻、106頁、1996年、EMBO Journalvol.15、3845
頁、1996年）。
ＮＦ―α、IL-1、IL-2等の炎症性サイトカインやICAM-
1、VCAM-1等の接着分子の発現に重要な炎症性転写因子
ＮＦ−κＢの活性化に重要な役割をになっている（Cell
vol.78、773頁、1994年、 Cell vol.80、529頁、199
5年）。また、内在性抗原のプロセッシング酵素として
も機能しており、免疫応答においても重要な機能を果た
している。さらに細胞周期の制御にも関与し癌抑制タン
パク質の分解や神経細胞のアポトーシスにも関与してい
る（Nature vol.349、132頁、1991年、Cell vol.75、
495頁、1993年、FEBS vol.304、57頁、1992年、組織培
養 22巻、106頁、1996年、EMBO Journalvol.15、3845
頁、1996年）。
【０００５】以上のように、プロテアソームは細胞の増
殖や免疫系の制御など様々な生命現象と深く関わってい
ることが明らかとなってきた。従ってこのような多岐に
わたる生理作用を有するプロテアソームを阻害する薬剤
は、臓器移植における拒絶反応などに有効な免疫抑制
剤、あるいは慢性関節リウマチ、腎炎、変形性膝関節
炎、全身性エリテマトーデスなどの自己免疫疾患や炎症
性腸疾患などの慢性炎症性疾患、喘息、皮膚炎などのア
レルギー疾患の治療薬、癌さらには神経変性疾患治療薬
として有効であるものと考えられる。
殖や免疫系の制御など様々な生命現象と深く関わってい
ることが明らかとなってきた。従ってこのような多岐に
わたる生理作用を有するプロテアソームを阻害する薬剤
は、臓器移植における拒絶反応などに有効な免疫抑制
剤、あるいは慢性関節リウマチ、腎炎、変形性膝関節
炎、全身性エリテマトーデスなどの自己免疫疾患や炎症
性腸疾患などの慢性炎症性疾患、喘息、皮膚炎などのア
レルギー疾患の治療薬、癌さらには神経変性疾患治療薬
として有効であるものと考えられる。
【０００６】現在までに報告されているプロテアソーム
阻害剤としてはラクタシスチン（J.Antibiotic vol.4
0、113頁、1991年、蛋白質核酸酵素 41巻、327頁、199
6年、細胞工学 15巻、929頁、1996年）、TMC-95（特開
平11-29595）などの天然物や、ペプチドアルデヒド（WO
95/24914、J. Med. Chem.、Vol.38、2276頁、1995年、B
ioorganic & Med. Chem. Lett.、vol.6、287頁、1996
年、特開平10-36289、特開平11-292833）、ペプチド性
ケトアミドやケトアルデヒド（ Bioorganic &Med. Che
m. Lett.、vol.9、2603頁、1999年、 Bioorganic & Me
d. Chem. Lett.、vol.8、373頁、1998年）、ペプチド性
エポキシケトン（Tetrahedron Lett.、vol.39、1343
頁、1996年、特開平11-124397、Chemistry & Biology、
vol.6、811頁、1999年、Bioorganic & Med. Chem. Let
t.、vol.9、2283頁、1999年、 Bioorganic & Med. Che
m. Lett.、vol.9、3335頁、1999年）、ペプチドホウ酸
（WO96/13266、 Bioorganic & Med. Chem. Lett.、vol.
8、333頁、1998年）などが報告されている。これら阻害
剤は構成型プロテアソームと免疫プロテアソームに対す
る阻害活性の差異についてはまったく報告されていな
い。さらに、免疫プロテアソームを選択的に阻害する化
合物については未だ報告例がない。
阻害剤としてはラクタシスチン（J.Antibiotic vol.4
0、113頁、1991年、蛋白質核酸酵素 41巻、327頁、199
6年、細胞工学 15巻、929頁、1996年）、TMC-95（特開
平11-29595）などの天然物や、ペプチドアルデヒド（WO
95/24914、J. Med. Chem.、Vol.38、2276頁、1995年、B
ioorganic & Med. Chem. Lett.、vol.6、287頁、1996
年、特開平10-36289、特開平11-292833）、ペプチド性
ケトアミドやケトアルデヒド（ Bioorganic &Med. Che
m. Lett.、vol.9、2603頁、1999年、 Bioorganic & Me
d. Chem. Lett.、vol.8、373頁、1998年）、ペプチド性
エポキシケトン（Tetrahedron Lett.、vol.39、1343
頁、1996年、特開平11-124397、Chemistry & Biology、
vol.6、811頁、1999年、Bioorganic & Med. Chem. Let
t.、vol.9、2283頁、1999年、 Bioorganic & Med. Che
m. Lett.、vol.9、3335頁、1999年）、ペプチドホウ酸
（WO96/13266、 Bioorganic & Med. Chem. Lett.、vol.
8、333頁、1998年）などが報告されている。これら阻害
剤は構成型プロテアソームと免疫プロテアソームに対す
る阻害活性の差異についてはまったく報告されていな
い。さらに、免疫プロテアソームを選択的に阻害する化
合物については未だ報告例がない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、免疫プロテ
アソームを選択的に阻害する物質を提供することによっ
て、副作用の少ない優れた免疫抑制剤、抗炎症剤、抗ア
レルギー剤、自己免疫疾患治療剤、抗癌剤、神経変性疾
患治療剤を提供することにある。
アソームを選択的に阻害する物質を提供することによっ
て、副作用の少ない優れた免疫抑制剤、抗炎症剤、抗ア
レルギー剤、自己免疫疾患治療剤、抗癌剤、神経変性疾
患治療剤を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、免疫プロ
テアソーム選択的阻害活性を有する化合物について鋭意
研究を重ねた結果、これまでに知られているプロテアソ
ーム阻害剤とは構造を異にした新規なアミノ酸誘導体が
免疫プロテアソームを選択的に阻害することを見出し、
本発明を完成した。
テアソーム選択的阻害活性を有する化合物について鋭意
研究を重ねた結果、これまでに知られているプロテアソ
ーム阻害剤とは構造を異にした新規なアミノ酸誘導体が
免疫プロテアソームを選択的に阻害することを見出し、
本発明を完成した。
【０００９】即ち、本発明は一般式（１） ［式中、Ｒ１はベンジルオキシカルボニル基（Ｚ基）又
はＲ―CO―であり（Ｒは置換されていてもよいベンゼン
環又はナフタレン環を示し）、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は同
一または相異なって水素原子、置換されていてもよい炭
素数１〜４の低級アルキル基、ベンジル基、ナフチルメ
チル基又はインドリルメチル基を示し、Ｒ５は置換基を
有していてもよいビニル基、エチニル基、トリメチルシ
リルエチニル基、フェニルエチニル基又はチアゾール環
を示し、ｍ及びｎは０または１を示す］で表されること
を特徴とするアミノ酸誘導体及び薬理学的に許容しうる
塩及びその水和物、並びにそれらの少なくとも一種類以
上を有効成分とする免疫プロテアソーム選択的阻害剤で
ある。
はＲ―CO―であり（Ｒは置換されていてもよいベンゼン
環又はナフタレン環を示し）、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は同
一または相異なって水素原子、置換されていてもよい炭
素数１〜４の低級アルキル基、ベンジル基、ナフチルメ
チル基又はインドリルメチル基を示し、Ｒ５は置換基を
有していてもよいビニル基、エチニル基、トリメチルシ
リルエチニル基、フェニルエチニル基又はチアゾール環
を示し、ｍ及びｎは０または１を示す］で表されること
を特徴とするアミノ酸誘導体及び薬理学的に許容しうる
塩及びその水和物、並びにそれらの少なくとも一種類以
上を有効成分とする免疫プロテアソーム選択的阻害剤で
ある。
【００１０】本発明における一般式（１）で表される化
合物の薬理学的に許容される塩には、塩酸塩、臭化水素
酸塩、メタンスルホン酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩のよ
うな酸付加塩、またアルカリ塩としてはナトリウム、カ
リウム、マグネシウムなどの金属塩が挙げられる。
合物の薬理学的に許容される塩には、塩酸塩、臭化水素
酸塩、メタンスルホン酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩のよ
うな酸付加塩、またアルカリ塩としてはナトリウム、カ
リウム、マグネシウムなどの金属塩が挙げられる。
【００１１】また、本発明の一般式（１）において、低
級アルキル基、低級アルコキシ基、低級アルキルアミノ
基などの「低級アルキル基」とは、例えばメチル、エチ
ル、イソプロピルなどの直鎖もしくは分岐した炭素数１
〜４の炭化水素を表し、「置換されていてもよいベンゼ
ン環」とは、ベンゼン環上の任意の位置に炭素数１〜４
の低級アルキル基、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｆなどのハロゲン
原子、スルホンアミド基を有するものが挙げられる。
級アルキル基、低級アルコキシ基、低級アルキルアミノ
基などの「低級アルキル基」とは、例えばメチル、エチ
ル、イソプロピルなどの直鎖もしくは分岐した炭素数１
〜４の炭化水素を表し、「置換されていてもよいベンゼ
ン環」とは、ベンゼン環上の任意の位置に炭素数１〜４
の低級アルキル基、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｆなどのハロゲン
原子、スルホンアミド基を有するものが挙げられる。
【００１２】本発明によれば、上記一般式（１）で表さ
れる化合物は以下に述べる二つの経路により製造するこ
とができる。
れる化合物は以下に述べる二つの経路により製造するこ
とができる。
【００１３】〔経路１〕：一般式（２） ［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、ｍ及びｎは前述の通
り］で表される化合物と一般式（３） ［式中、ＭはLi、MgI、MgBr又はMgClを示し、Ｒ５は前
述の通り］で表される化合物を反応させることによって
製造する経路。反応はアルゴンなどの不活性ガス雰囲気
下、ＴＨＦなどを溶媒として用い、反応温度としては−
７８℃〜室温下に行うことができる。
り］で表される化合物と一般式（３） ［式中、ＭはLi、MgI、MgBr又はMgClを示し、Ｒ５は前
述の通り］で表される化合物を反応させることによって
製造する経路。反応はアルゴンなどの不活性ガス雰囲気
下、ＴＨＦなどを溶媒として用い、反応温度としては−
７８℃〜室温下に行うことができる。
【００１４】〔経路２〕：一般式（４） ［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びｍは前述の通り］で表さ
れる化合物と一般式（５） ［式中、Ｒ４、Ｒ５及びｎは前述の通り］で表される化
合物を縮合させる経路。反応は、通常のペプチド結合形
成反応に用いられる混合酸無水物法や活性エステル法に
よって製造することができ、好ましくは縮合剤を用いる
方法が適している。ジシクロヘキシルカルボジイミド
（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰ
Ｃ）、ジフェニルホスホリルアジド（ＤＰＰＡ）、ジエ
チルホスホリルシアニド（ＤＥＰＣ）、１−エチル−３
−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド
（ＷＳＣ）などの縮合剤の存在下、場合によっては４−
ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）を触媒として加
え、反応溶媒としてはＴＨＦ、塩化メチレン、ＤＭＳ
Ｏ、ＤＭＦなどを用い、反応温度としては０℃〜室温下
に行うことができる。
れる化合物と一般式（５） ［式中、Ｒ４、Ｒ５及びｎは前述の通り］で表される化
合物を縮合させる経路。反応は、通常のペプチド結合形
成反応に用いられる混合酸無水物法や活性エステル法に
よって製造することができ、好ましくは縮合剤を用いる
方法が適している。ジシクロヘキシルカルボジイミド
（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰ
Ｃ）、ジフェニルホスホリルアジド（ＤＰＰＡ）、ジエ
チルホスホリルシアニド（ＤＥＰＣ）、１−エチル−３
−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド
（ＷＳＣ）などの縮合剤の存在下、場合によっては４−
ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）を触媒として加
え、反応溶媒としてはＴＨＦ、塩化メチレン、ＤＭＳ
Ｏ、ＤＭＦなどを用い、反応温度としては０℃〜室温下
に行うことができる。
【００１５】
【実施例】次に本発明を具体例によって説明するが、こ
れらの例によって本発明が限定されるものではない。ま
た、本発明化合物は不斉炭素を有するが、それらの光学
異性体およびラセミ体も本発明は含有するものである。
れらの例によって本発明が限定されるものではない。ま
た、本発明化合物は不斉炭素を有するが、それらの光学
異性体およびラセミ体も本発明は含有するものである。
【００１６】＜実施例１＞ Ｎ−［Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）−（Ｌ）−フ
ェニルアラニル］］−（４Ｓ）−４−アミノ−５−フェ
ニル−１−ペンテン−３−オン アルゴン気流下、Z-Phe-Phe-NMe(OMe)(100mg)のTHF(2m
L)溶液を-78℃に冷却し、これにビニルマグネシウムブ
ロミドの1mol/L THF溶液(0.6mL)を滴下した。同温にて
１時間撹拌後、ゆっくりと室温まで戻し、更に室温にて
３時間撹拌した。反応液に１０％クエン酸水溶液(2mL)
を加え、１０分間撹拌後、反応液を水(20mL)で薄め、酢
酸エチルで抽出し、有機層を水、飽和食塩水の順に洗浄
し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去
し、残さをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開
溶媒 酢酸エチル：n-ヘキサン＝１：２）にて精製し、
目的物(27.4mg)を無色粉末晶として得た。FABMS:457([M
＋H]＋)
ェニルアラニル］］−（４Ｓ）−４−アミノ−５−フェ
ニル−１−ペンテン−３−オン アルゴン気流下、Z-Phe-Phe-NMe(OMe)(100mg)のTHF(2m
L)溶液を-78℃に冷却し、これにビニルマグネシウムブ
ロミドの1mol/L THF溶液(0.6mL)を滴下した。同温にて
１時間撹拌後、ゆっくりと室温まで戻し、更に室温にて
３時間撹拌した。反応液に１０％クエン酸水溶液(2mL)
を加え、１０分間撹拌後、反応液を水(20mL)で薄め、酢
酸エチルで抽出し、有機層を水、飽和食塩水の順に洗浄
し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧留去
し、残さをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開
溶媒 酢酸エチル：n-ヘキサン＝１：２）にて精製し、
目的物(27.4mg)を無色粉末晶として得た。FABMS:457([M
＋H]＋)
【００１７】＜実施例２＞ Ｎ−［Ｎ−（ベンジルオキシカルボニル）−（Ｌ）−フ
ェニルアラニル］］−（５Ｓ）−５−アミノ−６−フェ
ニル−１−ヘキセン−３−オン (５Ｓ)−５−ｔ−ブトキシカルボニルアミノ−６−フェ
ニル−１−ヘキセン−３−オン（120mg）を１mol/L HCl
-AcOEt（3mL）に溶解し、室温にて２時間撹拌後溶媒を
留去した。残さを塩化メチレン（5mL）に溶解し、Z-Phe
-OH（150mg）、ＷＳＣ（96mg）、１−ヒドロキシベンゾ
トリアゾール水和物（77mg）、トリエチルアミン（0.1m
L）を加え、１日室温にて撹拌した。反応液に水を加
え、塩化メチレンにて抽出後、希塩酸、水、飽和重曹
水、水、飽和食塩水の順に洗浄後、無水硫酸ナトリウム
にて乾燥した。溶媒を減圧留去し、残さをシリカゲルカ
ラムクロマトグラフィー（展開溶媒 酢酸エチル：ヘキ
サン＝１：２）にて精製し、目的物（30m）を無色粉末
として得た。FABMS：471([M＋H]＋)
ェニルアラニル］］−（５Ｓ）−５−アミノ−６−フェ
ニル−１−ヘキセン−３−オン (５Ｓ)−５−ｔ−ブトキシカルボニルアミノ−６−フェ
ニル−１−ヘキセン−３−オン（120mg）を１mol/L HCl
-AcOEt（3mL）に溶解し、室温にて２時間撹拌後溶媒を
留去した。残さを塩化メチレン（5mL）に溶解し、Z-Phe
-OH（150mg）、ＷＳＣ（96mg）、１−ヒドロキシベンゾ
トリアゾール水和物（77mg）、トリエチルアミン（0.1m
L）を加え、１日室温にて撹拌した。反応液に水を加
え、塩化メチレンにて抽出後、希塩酸、水、飽和重曹
水、水、飽和食塩水の順に洗浄後、無水硫酸ナトリウム
にて乾燥した。溶媒を減圧留去し、残さをシリカゲルカ
ラムクロマトグラフィー（展開溶媒 酢酸エチル：ヘキ
サン＝１：２）にて精製し、目的物（30m）を無色粉末
として得た。FABMS：471([M＋H]＋)
【００１８】以下、実施例１と同様にして各種アミノ酸
誘導体を種々の有機金属試薬と反応させ、表１に示した
化合物（実施例３〜１７）を合成した。なお特別に表記
しない限り、表中のアミノ酸はＬ体を示す。
誘導体を種々の有機金属試薬と反応させ、表１に示した
化合物（実施例３〜１７）を合成した。なお特別に表記
しない限り、表中のアミノ酸はＬ体を示す。
【００１９】次に本発明化合物について、有用性を裏付
ける成績を実験例によって示す。
ける成績を実験例によって示す。
【００２０】＜実験例１＞ プロテアソーム阻害試験 ウシの脾臓に含まれるプロテアソームは免疫プロテアソ
ームであることがエレウテリ（Eleuteri）らによって報
告されている（ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケ
ミストリー、２７２巻、１８号、１１８２４〜１１８３
１頁、１９９７年）。そこで、免疫プロテアソームはウ
シの脾臓から精製して使用した。また、構成型プロテア
ソームはウシの腎臓から精製して使用した。プロテアソ
ームの精製と活性測定は田中ら（ジャーナル・オブ・バ
イオロジカル・ケミストリー、２６３巻、３１号、１６
２０９〜１６２１７頁、１９８８年）に準じて行った。
具体的には、ウシの脾臓または腎臓にトリス・バッファ
ー（ｐＨ７．５）を加えてホモジナイズした遠心上清
を、硫安沈澱法、イオン交換クロマトグラフィー（Ｑセ
ファロースＦＦ）、ゲルろ過クロマトグラフィー（ハイ
ロード・スーパーデックス２００）で分画してプロテア
ソームを精製した。プロテアソームの活性はＳｕｃ−Ｌ
ｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−ＭＣＡ基質の分解を指
標にして測定した。９６穴プレートに、被験化合物のＤ
ＭＳＯ溶液を１μＬと、約１Ｕ／ｍＬのプロテアソーム
溶液を８９μＬ添加・混合し、３７℃で３０分間インキ
ュベートした。続いて、２００μmol/LのＳｕｃ−Ｌｅ
ｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−ＭＣＡ基質を１０μＬ添
加・混合し、３７℃で１時間インキュベートした。１０
％ＳＤＳ溶液を１００μＬ添加して反応を停止させた
後、基質から遊離したアミノメチルクマリンの蛍光強度
を、励起波長３５５ｎｍ、蛍光波長４６０ｎｍによって
測定し、その値をプロテアソーム活性とした。被験化合
物を添加しない時のプロテアソーム活性を基準に、その
活性を５０％阻害する化合物の濃度（ＩＣ５０）を算出
した。
ームであることがエレウテリ（Eleuteri）らによって報
告されている（ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケ
ミストリー、２７２巻、１８号、１１８２４〜１１８３
１頁、１９９７年）。そこで、免疫プロテアソームはウ
シの脾臓から精製して使用した。また、構成型プロテア
ソームはウシの腎臓から精製して使用した。プロテアソ
ームの精製と活性測定は田中ら（ジャーナル・オブ・バ
イオロジカル・ケミストリー、２６３巻、３１号、１６
２０９〜１６２１７頁、１９８８年）に準じて行った。
具体的には、ウシの脾臓または腎臓にトリス・バッファ
ー（ｐＨ７．５）を加えてホモジナイズした遠心上清
を、硫安沈澱法、イオン交換クロマトグラフィー（Ｑセ
ファロースＦＦ）、ゲルろ過クロマトグラフィー（ハイ
ロード・スーパーデックス２００）で分画してプロテア
ソームを精製した。プロテアソームの活性はＳｕｃ−Ｌ
ｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−ＭＣＡ基質の分解を指
標にして測定した。９６穴プレートに、被験化合物のＤ
ＭＳＯ溶液を１μＬと、約１Ｕ／ｍＬのプロテアソーム
溶液を８９μＬ添加・混合し、３７℃で３０分間インキ
ュベートした。続いて、２００μmol/LのＳｕｃ−Ｌｅ
ｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−ＭＣＡ基質を１０μＬ添
加・混合し、３７℃で１時間インキュベートした。１０
％ＳＤＳ溶液を１００μＬ添加して反応を停止させた
後、基質から遊離したアミノメチルクマリンの蛍光強度
を、励起波長３５５ｎｍ、蛍光波長４６０ｎｍによって
測定し、その値をプロテアソーム活性とした。被験化合
物を添加しない時のプロテアソーム活性を基準に、その
活性を５０％阻害する化合物の濃度（ＩＣ５０）を算出
した。
【００２１】＜実験例２＞ ルシフェラーゼレポーター
ジーンアッセイ 被験化合物のプロテアソーム阻害作用に基づくNF-κB活
性化阻害作用を、ホタルルシフェラーゼをレポーター遺
伝子としたレポータージーンアッセイで測定した。レポ
ーター遺伝子であるホタルルシフェラーゼ(Luc)遺伝子
の上流にチミジンキナーゼ(TK)のプロモーターおよび、
さらに上流にκB配列の5回繰り返し配列を連結させたプ
ラスミド（pNFkB-LUC：ストラタジーン社）をレポータ
ーベクターとして使用した。また、内部標準用として、
レポーター遺伝子であるウミシイタケルシフェラーゼ遺
伝子（RL）をTKプロモーターの上流に連結したプラスミ
ド（pRL-TK：ストラタジーン社）を使用した。 Gaczyns
kaらの方法（ネイチャー、1993年、365巻、264頁）に従
い、hIFN-γ（ヒトインターフェロン-γ、ベーリンガー
マンハイム社）を添加して、免疫プロテアソームを誘導
したヒト組織球性リンパ腫細胞U937 (ATCC No. CRL159
3)を、100ユニット/mLのhIFN-γと10%ウシ胎児血清（FB
S）を含むRPMI-1640培地（ギブコ社）で維持培養した。
このU937細胞に対して、リポフェクトアミン試薬（ギブ
コ社）を用いて、上記のプラスミドを同時に共トランス
フェクション（Co-transfection）した。一過性に遺伝
子をトランスフェクションした細胞を上記培地で懸濁
し、24ウェルプレートに7 x 105個/ウェルずつ分注し、
一晩培養した。被験化合物を上記培地で希釈し、これを
24ウェルプレートに添加して、45分間前処理した。その
後、終濃度3ng/mLになるようにhTNF-α（ヒト腫瘍壊死
因子、ベーリンガーマンハイム社）を添加して、さらに
5時間培養して細胞を刺激した。培養終了後、細胞を回
収し、細胞溶解液を得た。この細胞溶解液中のホタルル
シフェラーゼ活性を、デュアルルシフェラーゼレポータ
ーアッセイシステム（プロメガ社）を用いて測定した。
また、同時に同アッセイキットによりウミシイタケルシ
フェラーゼ活性を測定した。ホタルルシフェラーゼ活性
により検出されるNF-κB転写活性は、内部標準であるウ
ミシイタケルシフェラーゼ活性から標準化した。被験化
合物のNF-κB活性化阻害作用は、NF-κB転写活性の低下
によって観察され、その阻害率(%)は、以下の式により
算出した。 阻害率 (%) = ( 1 - ( Test - Blank) / ( Control - B
lank )) × 100 （Test： 化合物を添加してTNF-αで刺激した細胞の転
写活性、Blank：化合物を添加せず、TNF-αで刺激しな
かった細胞の転写活性、Control：化合物を添加せず、T
NF-αで刺激した細胞の転写活性） 実施例化合物１ IC50：6.66 μg/mL
ジーンアッセイ 被験化合物のプロテアソーム阻害作用に基づくNF-κB活
性化阻害作用を、ホタルルシフェラーゼをレポーター遺
伝子としたレポータージーンアッセイで測定した。レポ
ーター遺伝子であるホタルルシフェラーゼ(Luc)遺伝子
の上流にチミジンキナーゼ(TK)のプロモーターおよび、
さらに上流にκB配列の5回繰り返し配列を連結させたプ
ラスミド（pNFkB-LUC：ストラタジーン社）をレポータ
ーベクターとして使用した。また、内部標準用として、
レポーター遺伝子であるウミシイタケルシフェラーゼ遺
伝子（RL）をTKプロモーターの上流に連結したプラスミ
ド（pRL-TK：ストラタジーン社）を使用した。 Gaczyns
kaらの方法（ネイチャー、1993年、365巻、264頁）に従
い、hIFN-γ（ヒトインターフェロン-γ、ベーリンガー
マンハイム社）を添加して、免疫プロテアソームを誘導
したヒト組織球性リンパ腫細胞U937 (ATCC No. CRL159
3)を、100ユニット/mLのhIFN-γと10%ウシ胎児血清（FB
S）を含むRPMI-1640培地（ギブコ社）で維持培養した。
このU937細胞に対して、リポフェクトアミン試薬（ギブ
コ社）を用いて、上記のプラスミドを同時に共トランス
フェクション（Co-transfection）した。一過性に遺伝
子をトランスフェクションした細胞を上記培地で懸濁
し、24ウェルプレートに7 x 105個/ウェルずつ分注し、
一晩培養した。被験化合物を上記培地で希釈し、これを
24ウェルプレートに添加して、45分間前処理した。その
後、終濃度3ng/mLになるようにhTNF-α（ヒト腫瘍壊死
因子、ベーリンガーマンハイム社）を添加して、さらに
5時間培養して細胞を刺激した。培養終了後、細胞を回
収し、細胞溶解液を得た。この細胞溶解液中のホタルル
シフェラーゼ活性を、デュアルルシフェラーゼレポータ
ーアッセイシステム（プロメガ社）を用いて測定した。
また、同時に同アッセイキットによりウミシイタケルシ
フェラーゼ活性を測定した。ホタルルシフェラーゼ活性
により検出されるNF-κB転写活性は、内部標準であるウ
ミシイタケルシフェラーゼ活性から標準化した。被験化
合物のNF-κB活性化阻害作用は、NF-κB転写活性の低下
によって観察され、その阻害率(%)は、以下の式により
算出した。 阻害率 (%) = ( 1 - ( Test - Blank) / ( Control - B
lank )) × 100 （Test： 化合物を添加してTNF-αで刺激した細胞の転
写活性、Blank：化合物を添加せず、TNF-αで刺激しな
かった細胞の転写活性、Control：化合物を添加せず、T
NF-αで刺激した細胞の転写活性） 実施例化合物１ IC50：6.66 μg/mL
【００２２】以上のように、一般式（１）で表される本
発明化合物には免疫プロテアソーム選択的阻害作用が認
められ、さらにNF-κB転写活性の抑制も確認された。
発明化合物には免疫プロテアソーム選択的阻害作用が認
められ、さらにNF-κB転写活性の抑制も確認された。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 35/00 Ａ６１Ｐ 37/06 37/06 37/08 37/08 Ｃ０７Ｃ 231/08 Ｃ０７Ｃ 231/08 237/06 237/06 237/12 237/12 Ｃ１２Ｎ 9/99 Ｃ１２Ｎ 9/99 Ａ６１Ｋ 37/64 (72)発明者 栗山 和彦 栃木県小山市乙女１−７−16 (72)発明者 岩浪 哲 栃木県下都賀郡野木町潤島67−１ Ｆターム(参考） 4C084 AA02 AA03 AA07 BA14 DC32 NA14 ZB082 ZB112 ZB132 ZB262 ZC202 4C206 AA01 AA02 AA03 GA37 HA23 MA01 MA04 NA14 ZB08 ZB11 ZB13 ZB26 ZC20 4H006 AA01 AA03 AB20 AB21 BR10 BV20 4H045 AA10 AA20 AA30 BA11 BA51 DA56 EA21 EA22 EA28 FA31 FA58 GA01 HA02
Claims (4)
- 【請求項１】 一般式（１） ［式中、Ｒ１はベンジルオキシカルボニル基（Ｚ基）又
はＲ―CO―であり（Ｒは置換されていてもよいベンゼン
環又はナフタレン環を示し）、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は同
一または相異なって水素原子、置換されていてもよい炭
素数１〜４の低級アルキル基、ベンジル基、ナフチルメ
チル基又はインドリルメチル基を示し、Ｒ５は置換基を
有していてもよいビニル基、エチニル基、トリメチルシ
リルエチニル基、フェニルエチニル基又はチアゾール環
を示し、ｍ及びｎは０または１を示す］で表されること
を特徴とするアミノ酸誘導体及び薬理学的に許容しうる
塩及びその水和物。 - 【請求項２】 一般式（１） ［式中、Ｒ１はＺ基又はＲ―CO―であり（Ｒは置換され
ていてもよいベンゼン環又はナフタレン環を示し）、Ｒ
２、Ｒ３及びＲ４は同一または相異なって水素原子、置
換されていてもよい炭素数１〜４の低級アルキル基、ベ
ンジル基、ナフチルメチル基又はインドリルメチル基を
示し、Ｒ５は置換基を有していてもよいビニル基、エチ
ニル基、トリメチルシリルエチニル基、フェニルエチニ
ル基又はチアゾール環を示し、ｍ及びｎは０または１を
示す］で表されることを特徴とするアミノ酸誘導体及び
薬理学的に許容しうる塩及びその水和物の少なくとも一
種類以上を有効成分とする免疫プロテアソーム選択的阻
害剤。 - 【請求項３】 一般式（２） ［式中、 Ｒ１はＺ基又はＲ―CO―であり（Ｒは置換さ
れていてもよいベンゼン環又はナフタレン環を示し）、
Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は同一または相異なって水素原子、
置換されていてもよい炭素数１〜４の低級アルキル基、
ベンジル基、ナフチルメチル基又はインドリルメチル基
を示し、ｍ及びｎは０または１を示す］で表される化合
物に、一般式（３） ［式中、Ｒ５は置換基を有していてもよいビニル基、エ
チニル基、トリメチルシリルエチニル基、フェニルエチ
ニル基又はチアゾール環を示し、ＭはLi、MgI、MgBr又
はMgClを示す］で表される化合物を反応させることを特
徴とする一般式（１） ［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、ｍ及びｎは前
述の通り］で表される化合物の製造方法。 - 【請求項４】 一般式（４） ［式中、 Ｒ１はＺ基又はＲ―CO―であり（Ｒは置換さ
れていてもよいベンゼン環又はナフタレン環を示し）、
Ｒ２及びＲ３は同一または相異なって水素原子、置換さ
れていてもよい炭素数１〜４の低級アルキル基、ベンジ
ル基、ナフチルメチル基又はインドリルメチル基を示
し、ｍは０又は１を示す］で表される化合物と一般式
（５） ［式中、Ｒ５は置換基を有していてもよいビニル基、エ
チニル基、トリメチルシリルエチニル基、フェニルエチ
ニル基又はチアゾール環を示し、 ｎは０または１を示
す］で表される化合物を縮合させることを特徴とする一
般式（１） ［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、ｍ及びｎは前
述の通り］で表される化合物の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000343932A JP2002145897A (ja) | 2000-11-10 | 2000-11-10 | アミノ酸誘導体及びその製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
| JP2000343932A JP2002145897A (ja) | 2000-11-10 | 2000-11-10 | アミノ酸誘導体及びその製造法 |
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|---|---|
| JP2002145897A true JP2002145897A (ja) | 2002-05-22 |
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ID=18818216
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000343932A Pending JP2002145897A (ja) | 2000-11-10 | 2000-11-10 | アミノ酸誘導体及びその製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2002145897A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8633322B2 (en) | 2009-10-29 | 2014-01-21 | Janssen Pharmaceutica Nv | Alkynyl derivatives useful as DPP-1 inhibitors |
| WO2015032621A1 (en) * | 2013-09-06 | 2015-03-12 | Sandoz Ag | Synthesis of peptide epoxy ketones |
| JP2016505550A (ja) * | 2012-12-03 | 2016-02-25 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ | 置換トリアゾール及びイミダゾール化合物 |
| US11345724B2 (en) | 2016-06-06 | 2022-05-31 | MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Proteasome inhibitors |
-
2000
- 2000-11-10 JP JP2000343932A patent/JP2002145897A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8633322B2 (en) | 2009-10-29 | 2014-01-21 | Janssen Pharmaceutica Nv | Alkynyl derivatives useful as DPP-1 inhibitors |
| JP2016505550A (ja) * | 2012-12-03 | 2016-02-25 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ | 置換トリアゾール及びイミダゾール化合物 |
| WO2015032621A1 (en) * | 2013-09-06 | 2015-03-12 | Sandoz Ag | Synthesis of peptide epoxy ketones |
| US11345724B2 (en) | 2016-06-06 | 2022-05-31 | MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Proteasome inhibitors |
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