JP2019518081A - 環境侵襲によるヒト皮膚バリアダメージを軽減するためのナンキョクコメススキ抽出物の使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明の発明者らは、ヒト皮膚バリア機能を高めるために、より詳細にはUV放射由来ではない環境侵襲および皮膚乾燥に対する皮膚保護剤として、ナンキョクコメススキ(EDA)の抽出物を有益に用いることができることを見出した。
本発明のEDAまたはその組成物は、特に、皮膚の張性および/または硬さおよび/または弾力性および/または柔軟性の改善を目的とすることができる。
本実験の目的は、ヒト線維芽細胞におけるナンキョクコメススキ抽出物での前処理が、空気中の水分の欠如または高浸透圧ショックのいずれかに起因して生じる脱水に対して及ぼし得る保護作用を評価することであり、細胞の生存における変化を測定することである。
−評価した産物:
ナンキョクコメススキ抽出物(EDA):線維芽細胞を用いた実験では、マルトデキストリンで乾燥させたEDA(バッチ番号160215)を用いた。この産物をダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)に濃度10mg/ml(EDA2.1mg/mlに相当)で溶解し、磁気攪拌機で30分間攪拌し、0.2μmの無菌酢酸セルロースフィルタ(Minisart、ザルトリウス社)で濾過した。
フェノールレッドフリーDMEM培地(ダルベッコ変法イーグル培地)(シグマ社)。DMEM培地(シグマ社)。ペニシリン−ストレプトマイシン(シグマ社)。グルタミン(シグマ社)。ウシ胎児血清(シグマ社)。0.25%トリプシン−エチレンジアミンテトラアセテート(EDTA)(シグマ社)。リン酸緩衝食塩水(PBS)。ハンクス液 (以下ハンクスとする)(シグマ社)。スクロース(シグマ社)。グルタルアルデヒド(シグマ社)。クリスタルバイオレット(シグマ社)。ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)(シグマ社)。
使用した細胞は、健康な任意の様々なドナーから得られ、かつ液体N2で保存した耳後部皮膚弁の外側部分から単離したヒト皮膚線維芽細胞である。実験では、2mMのグルタミン、50μg/mlのペニシリン、50U/mlのストレプトマイシン、10%のウシ胎児血清が補充されたDMEMを含む培養フラスコで、7%のCO2と93%の加湿空気の雰囲気で37℃に保たれているHeraeusオーブン内にて、約90%のコンフルエンスに到達するまで増殖させた細胞を用いた。その後、トリプシン処理により新規処理を行った。実験のために、105個の細胞/mlの初期密度で、平底の96ウェルプレート(ヌンク(Nunc)社)に播種した9回〜11回処理の細胞をそれぞれ使用し、コンフルエンスに到達するまでインキュベータで増殖させた。
EDAでの前処理:上述の通りに調製した1ウェル当たり100μlのEDA溶液(または完全DMEMの適切な希釈液)を各プレートの半数に添加し、プレートをインキュベータで約24時間インキュベートした。
プレートをハンクスで2回洗浄した。これらを100μlの0.25%グルタルアルデヒドのハンクス溶液で室温にて15分間固定化した。プレートを水で1回洗浄した。これらを2%エタノール溶液中の0.2%クリスタルバイオレット溶液で、37℃にて15分間染色した。プレートを水で洗浄し、細胞を100μlの1%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)で溶解した。プレートをプレート攪拌機で慎重に攪拌し、BMG Fluostar Optima分光光度計で550nmの吸光度を読み取った。
統計解析を各実験に対して行い、各ウェルの値を独立した値とみなし、ExcelまたはGraph Pad Prismを用いたスチューデントのt検定によって有意性を判定した。
−脱水により引き起こされる細胞死に対するEDA前処理の作用:
以下の表は、異なるドナー由来の線維芽細胞を用いて行った2つの異なる実験結果を示し、図1は両実験の生存率の平均を示している。
以下の表は、異なるドナー由来の線維芽細胞を用いて行った2つの異なる実験結果を示し、図2は両実験の生存率の平均を示している。
上述の結果により、EDAでの前処理は、脱水および高浸透圧ショックから保護することができることが分かる。
本実験の目的は、不死化ヒトケラチノサイト細胞株HaCaTにおけるナンキョクコメススキ抽出物での前処理が、熱ストレス(低温または高温)対して及ぼし得る保護作用を評価することであり、第一に生存率に関して、第二にミトコンドリア電位に対するその働きに関して、該保護作用を評価することである。
−評価した産物:
凍結乾燥ナンキョクコメススキ抽出物(EDA)、バッチ番号13E04。この産物を標準緩衝液(以下を参照)に1mg/mlの濃度で直接溶解し、この溶液からの100μlを適用した。
RPMI1640培地(シグマ社)。ペニシリン−ストレプトマイシン(シグマ社)。グルタミン(シグマ社)。ウシ胎児血清(シグマ社)。0.25%トリプシン−EDTA(シグマ社)。リン酸緩衝食塩水(PBS)。評価用標準緩衝液(NaClの80mM、KClの75ml、D−グルコース25mM、(4−(3−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)25mM、pH7.4)。テトラメチルローダミンメチルエステル過塩素酸塩(TMRM)(シグマ社)。カルボニルシアニドm−クロロフェニルヒドラゾン(CCCP)(シグマ社)。グルタルアルデヒド(シグマ社)。クリスタルバイオレット(シグマ社)。ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)(シグマ社)。
使用した細胞は、不死化ヒトケラチノサイト細胞株HaCaTである。細胞を、蛍光専用の平底のプラスチック96ウェルプレート(ヌンク社)において、2mMのグルタミン、50μg/mlのペニシリン、50U/mlのストレプトマイシン、10%のウシ胎児血清が補充されたRPMIで、5%のCO2と95%の加湿空気の雰囲気で37℃に保たれているHeraeusオーブン内にて培養した。細胞を100%コンフルエンスまで増殖した後に処理した。A列とH列は通常、細胞を入れないままとした。
熱ストレス実験:培地を除去し、プレートを標準緩衝液100μlで1回洗浄した。100μlのEDA溶液を添加し、プレートを、細胞培養に適した条件下でオーブン内にて37℃で1時間インキュベートした。1つの実験に3つのプレートを用いて、1つは熱的攻撃のない対照用であり、別の1つは低温の熱的攻撃用であり、最後の1つは高温の熱的攻撃用であり、各プレートの半数は対照用に使用され、残りの半数はEDAでの前処理用に使用される。
Huangにより説明されたプロトコルに従って行った(Huang SG.Development of a High Throughput Screening Assay for Mitochondrial Membrane Potential in Living Cells. J Biomol Screen 2002, 7: 383-9):プレートを標準緩衝液で2回洗浄し、1つのウェル当たり100μlの標準緩衝液をプレート全体に添加し、1つのウェル当たり10μlのTMRM(1.65μMの標準緩衝溶液からであり、0.8mMのDMSO溶液から即時調製されている)をプレート全体に添加し、1つのウェル当たり10μlのCCCP(0.12mMの標準緩衝溶液からであり、10mMのDMSO溶液から即時調製されている)を対応するウェル(プレートの通常半数)に添加した。このプレートを上述した条件下で15分間インキュベートした。インキュベーションが終了してから、プレートを1ウェル当たり160μlのPBSで4回洗浄した。1ウェル当たり100μlのPBSを添加し、プレートを下側読み取りのBMG Fluostar Optima蛍光リーダーで、530nmの励起フィルタおよび590nmの放射フィルタを用いて読み取った。
プレートをPBSで2回洗浄した。これらを100μlの0.25%グルタルアルデヒド溶液で室温にて15分間固定化した。これらを2%エタノール溶液中の0.2%クリスタルバイオレット溶液で、37℃にて10分間染色した。プレートを水で洗浄し、細胞を1%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)で溶解した。プレートをプレート攪拌機で慎重に攪拌し、BMG Fluostar Optima分光光度計で540nmの吸光度を読み取った。
統計解析を各実験に対して行い、各ウェルの値を独立した値とみなし、ExcelまたはGraph Pad Prismを用いたスチューデントのt検定によって有意性を判定した。
−低温熱ストレス:
a)細胞の生存:
2つの実験からの結果を次の表に示す:
より厳しい条件(凍結が生じていた条件)下では、細胞生存率への影響がさらにより有意であり、EDAの保護作用が明確に観察されている:
a)細胞の生存:
結果を次の表に示す:
より穏やかな条件(42℃、45分)では、EDAは高温によって引き起こされる熱ストレスからミトコンドリア電位を保護する顕著な傾向を持つことが観察されている:
上述の結果により、EDAでの前処理は、低温および高温の熱ストレスの影響から保護することができることが分かる。
本実験の目的は、ヒト線維芽細胞または形質転換ケラチノサイトにおけるナンキョクコメススキ抽出物での前処理が、たばこの煙によって引き起こされる汚染などの環境汚染に対して及ぼし得る保護作用を評価することであり、細胞の生存に対する該保護作用を評価することである。
−評価した産物:
ナンキョクコメススキ抽出物(EDA):線維芽細胞を用いた実験では、デンプンで乾燥させたEDA(バッチ番号150414)を用いた。EDA含有量0.25gEDA/g(産物)。この産物を完全DMEM培地に濃度10mg/ml(EDA2.5mg/mlに相当)で懸濁し、磁気攪拌機で30分間攪拌し、0.2μmの無菌酢酸セルロースフィルタ(Minisart、ザルトリウス社)で濾過した。ケラチノサイトを用いた実験では、マルトデキストリンに吸着したEDA、バッチ番号160215(乾燥緑葉バッチ番号241114)を用いた。この産物をDMEM培地に濃度10mg/ml(EDA2.1mg/mlに相当)で溶解し、磁気攪拌機で30分間攪拌し、0.2μmの無菌酢酸セルロースフィルタ(Minisart、ザルトリウス社)で濾過した。
フェノールレッドフリーDMEM培地(シグマ社)。DMEM培地(シグマ社)。ペニシリン−ストレプトマイシン(シグマ社)。グルタミン(シグマ社)。ウシ胎児血清(シグマ社)。0.25%トリプシン−EDTA(シグマ社)。リン酸緩衝食塩水(PBS)。ハンクス液 (以下ハンクスとする)(シグマ社)。グルタルアルデヒド(シグマ社)。クリスタルバイオレット(シグマ社)。ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)(シグマ社)。
使用した細胞は、健康な任意の様々なドナーから得られ、かつ液体N2で保存した耳後部皮膚弁の外側部分から単離したヒト皮膚線維芽細胞である。実験では、2mMのグルタミン、50μg/mlのペニシリン、50U/mlのストレプトマイシン、10%のウシ胎児血清が補充されたDMEMを含む培養フラスコで、7%のCO2と93%の加湿空気の雰囲気で37℃に保たれているHeraeusオーブン内にて、約90%のコンフルエンスに到達するまで増殖した細胞を用いた。その後、トリプシン処理により新規処理を行った。実験のために、105個の細胞/mlの初期密度で、平底の6ウェルまたは96ウェルプレート(ヌンク(Nunc)社)に播種した3回〜6回処理の細胞をそれぞれ使用し、コンフルエンスに到達するまでインキュベータで増殖させた。
使用された細胞は、不死化ヒトケラチノサイト細胞株HaCaTである。細胞を、平底のプラスチック96ウェルプレート(ヌンク社)において、2mMのグルタミン、50μg/mlのペニシリン、50U/mlのストレプトマイシン、10%のウシ胎児血清が補充されたDMEMで、5%のCO2と95%の加湿空気の雰囲気で37℃に保たれているHeraeusオーブン内にて培養した。実験のために、105個の細胞/mlの初期密度で、平底の96ウェルプレート(ヌンク(Nunc)社)に播種した細胞をそれぞれ使用し、コンフルエンスに到達するまでインキュベータで増殖させた。
EDAでの前処理:線維芽細胞を用いた実験とケラチノサイトを用いた実験の両方で、上述の通りに調製した1ウェル当たり100μlのEDA溶液を各プレートの半数に添加し、プレートをインキュベータで約20時間インキュベートした。
96ウェルプレートをハンクスで2回洗浄した。これらを100μlの0.25%グルタルアルデヒドのハンクス溶液で室温にて15分間固定化した。プレートを水で1回洗浄した。これらを2%エタノール溶液中の0.2%クリスタルバイオレット溶液で、37℃にて15分間染色した。プレートを水で洗浄し、細胞を100μlの1%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)で溶解した。それをプレート攪拌機で慎重に攪拌し、BMG Fluostar Optima分光光度計で550nmの吸光度を読み取った。
統計解析を各実験に対して行い、各ウェルの値を独立した値とみなし、ExcelまたはGraph Pad Prismを用いたスチューデントのt検定によって有意性を判定した。
a)線維芽細胞を用いた実験:
以下の表は、3つの異なる実験の結果を示す。
以下の表は、2つの異なる実験の結果を示す。
上述の結果により、EDAでの前処理は、たばこの煙による汚染の影響から保護することができることが分かる。
本実験の目的は、ヒト線維芽細胞におけるナンキョクコメススキ抽出物での前処理が、ヒ素、カドミウム、またはクロムによって引き起こされる汚染などの環境汚染に対して及ぼし得る保護作用を評価することであり、細胞の生存に対する該保護作用を評価することである。
−評価した産物:
ナンキョクコメススキ抽出物(EDA):線維芽細胞を用いた実験では、凍結乾燥されたEDAバッチ番号051214を用いた。この産物を完全DMEM培地に濃度5mg/mlで溶解し、磁気攪拌機で30分間攪拌し、0.2μmの無菌酢酸セルロースフィルタ(Minisart、ザルトリウス社)で濾過した。
フェノールレッドフリーDMEM培地(シグマ社)。DMEM培地(シグマ社)。ペニシリン−ストレプトマイシン(シグマ社)。グルタミン(シグマ社)。ウシ胎児血清(シグマ社)。0.25%トリプシン−EDTA(シグマ社)。リン酸緩衝食塩水(PBS)。ハンクス液 (以下ハンクスとする)(シグマ社)。グルタルアルデヒド(シグマ社)。クリスタルバイオレット(シグマ社)。ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)(シグマ社)。
使用した細胞は、健康な任意の様々なドナーから得られ、かつ液体N2で保存した耳後部皮膚弁の外側部分から単離したヒト皮膚線維芽細胞である。実験では、2mMのグルタミン、50μg/mlのペニシリン、50U/mlのストレプトマイシン、10%のウシ胎児血清が補充されたDMEMを含む培養フラスコで、7%のCO2と93%の加湿空気の雰囲気で37℃に保たれているHeraeusオーブン内にて、約90%のコンフルエンスに到達するまで増殖した細胞を用いた。その後、トリプシン処理により新規処理を行った。実験のために、105個の細胞/mlの初期密度で、平底の96ウェルプレート(ヌンク(Nunc)社)に播種した9回〜11回処理の細胞をそれぞれ使用し、コンフルエンスに到達するまでインキュベータで増殖させた。
EDAでの前処理:上述の通りに調製した1ウェル当たり100μlのEDA溶液(または完全DMEMの適切な希釈液)を各プレートの半数に添加し、プレートをインキュベータで約24時間インキュベートした。
プレートをハンクスで2回洗浄した。これらを100μlの0.25%グルタルアルデヒドのハンクス溶液で室温にて15分間固定化した。プレートを水で1回洗浄した。これらを2%エタノール溶液中の0.2%クリスタルバイオレット溶液で、37℃にて15分間染色した。プレートを水で洗浄し、細胞を100μlの1%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)で溶解した。それをプレート攪拌機で慎重に攪拌し、BMG Fluostar Optima分光光度計で550nmの吸光度を読み取った。
統計解析を各実験に対して行い、各ウェルの値を独立した値とみなし、ExcelまたはGraph Pad Prismを用いたスチューデントのt検定によって有意性を判定した。
−Cd(II)への暴露に関するEDAでの前処理の作用:
約50%の死亡率をもたらすCd(II)の作用濃度をまず決定した。結果を図7に示す:
Cr(III)およびCr(VI)の作用濃度を、これらの金属の異なる濃度に対する線維芽細胞の生存を検討することによってまず決定した。結果を図9に示す:
以下の表は、EDAでの前処理(5mg/ml)とそれに続くCr(III)+Cr(VI)への暴露から構成される実験の結果を示す:
以下の表は、EDAでの前処理(5mg/ml)が、続く9mMの亜ヒ酸ナトリウム(9mMのNaAsO2)への暴露によって引き起こされる攻撃に対して及ぼす影響について検討する3つの実験の結果を示す。
上述の結果により、EDAでの前処理は、ヒ素、カドミウム、またはクロムの汚染の影響から保護することができることが分かる。
Claims (8)
- UV放射由来ではない環境侵襲により引き起こされるヒト皮膚バリアダメージを軽減するためのナンキョクコメススキ(Deschampsia antarctica)(EDA)の抽出物の化粧用使用。
- 前記抽出物が、化学的大気汚染物質とUV放射以外の気候状態とにより誘発される皮膚の不快感および皮膚のダメージを予防および/または低減する、請求項1に記載の使用。
- 前記化学的大気汚染物質が、煙および重金属からなる群から選択される、請求項2に記載の使用。
- 前記気候状態が、浸透圧ショック、低空気湿度および環境上の熱ストレスからなる群から選択される、請求項2に記載の使用。
- ヒト皮膚バリア障害および関連する症状の寛解および/または予防に使用するためのナンキョクコメススキ(EDA)の抽出物。
- 前記ヒト皮膚バリア障害が、乾燥皮膚、アトピー性皮膚炎および接触性皮膚炎から選択される、請求項5に記載の使用のためのEDA。
- 前記ヒト皮膚バリア障害が、化学的大気汚染物質およびUV放射以外の気候状態からなる群から選択される環境侵襲によって悪化している、請求項5に記載の使用のためのEDA。
- ヒト皮膚バリア障害および関連する症状の治療および/または予防に使用するための組成物であって、生理学的に許容される媒体中にナンキョクコメススキ(EDA)の抽出物の有効量を含む、組成物。
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