JP2019515902A - Ilc2、免疫、およびcopdの機能的可塑性 - Google Patents
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Abstract
本開示は、タイプ1自然リンパ球(ILC1)へのタイプ2自然リンパ球(ILC2)の変換を阻害することによって、肺炎症を伴う疾患または障害を処置または予防する方法を提供する。【選択図】図7
Description
自然リンパ球(ILC)は、最近記載された、組織に内在する自然リンパ球の集団であり、病原体に対する防御、上皮性関門機能の維持、共生微生物叢の封じ込め、組織修復、および代謝の調節が挙げられる、炎症において果たす多様な役割を有する(Artis,D.& Spits,H.The biology of innate lymphoid cells.Nature 517,293−301(2015);McKenzie,A.,Spits,H.,& Eberl,G.Innate Lymphoid Cells in Inflammation and Immunity.Immunity 41,366−374(2014))。当該細胞は、数が限られているにも拘らず、進行中の免疫反応に大きな影響を与える。ILCは、ヘルパーCD4+T細胞系に酷似している、機能的に不連続なサブセット(ILC1、ILC2、およびILC3)に分類される。CD4+T細胞ヘルパーサブセットを調節する多くの転写因子およびサイトカインもまた、対応するILC群において重要な役割を果たす。ゆえに、T−betが、ILC1の発達および機能に重要であることが示されてきた一方、GATA−3およびRORγtが、ILC2およびILC3の機能にそれぞれ必要とされる。
ILCは、様々な表現型のサブセットに分類されてきたが、新しい証拠により、ILCは「固定」されていないこと、そして炎症性の環境に応じて、当該細胞は相当な機能的可塑性を示すことが示されている(Artis et al.;Diefenbach,A.,Colonna,M.,& Koyasu,S.Development,Differentiation,and Diversity of Innate Lymphoid Cells.Immunity 41,354−365(2014))。例えば、ヒトILC1は、局所的な環境シグナル、例えばIL−1β、レチノイン酸、およびIL−23に反応して、ILC3に分化することができる。ILC3に分化するこの能力は、ILC3がIL−12の存在下でILC1に分化することができるので、双方向性である。さらに、腸に内在するILC3は、T−betおよびRORγtを共発現し、微生物叢駆動シグナル、IL−23またはIL−12+IL−18に反応して、IFNγを生成することが示されてきた。最後に、ILC3は、TLR2リガンドに反応して、IL−5およびIL−13を生成することができ、このことは、ILC3がILC2に分化し得ることを示唆している。しかしながら、ILC1サブセットとILC3サブセット間で実証されてきた可塑性にも拘らず、ILC2が、生理的に関連した何らかの機能的可撓性を示すかは、明らかでない。異なるILCサブセット間の遺伝子発現プロフィールを分析した最近の報告では、ILC2が最も同質であり、他のサブセットと異なっていることが明らかとなっており(Robinette,M.L.et al.Transcriptional programs define molecular characteristics of innate lymphoid cell classes and subsets.Nat Immunol 16,306−317(2015))、これは、ILC2が、ILC1およびILC3と比較して、代替の表現型を採用する能力がより限られているかもしれないという考えと一致している。
慢性閉塞性肺疾患(COPD)は、タバコ煙への長期の曝露と関連した障害であり、肺機能の進行性の、不可逆性の損失によって特徴付けられる。COPD患者の一部は、気道感染症後に症候の急性的悪化を経験し、当該増悪は、罹患率および死亡率の重大な原因である。呼吸器感染症病原体インフルエンザ、呼吸合胞体ウイルス(RSV)、ライノウイルス(HRV)、および分類不可能なインフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)は、COPD関連増悪の推測される主要なトリガーの1つである。COPDは、世界中で2030年までで3番目の死因となると推定されている;しかしながら、COPD関連トリガーが、肺において免疫反応にどのように影響するかについて、ほとんど理解されていない。IL−1、IL−18、およびIL−33が挙げられるいくつかのIL−1ファミリメンバのサイトカインが、マウスモデルにおける煙関連の炎症および増悪に関連付けられてきた(Kearley,J.et al.Cigarette Smoke Silences Innate Lymphoid Cell Function and Facilitates an Exacerbated Type I Interleukin−33−Dependent Response to Infection.Immunity 42,566−579(2015))。Kearleyらにおいて、タバコ煙は、ST2レセプタ発現の印象的な再分布と関連し、その結果は、肺におけるIL−33反応を、Th2関連ILC2反応から離れて、Th1スキュードNK細胞およびマクロファージに向けて変更することが、以前に報告された。ゆえに、肺に内在するILC集団の変化は、結果として生じる炎症反応の型および大きさに大きく影響を及ぼし得る。
マウス肺における大部分のILCはILC2であるものの、稀であるが相当数の1型および3型のILCが存在する。タバコ煙への曝露は、肺に内在するILCによるTh2サイトカインの生成の減少を伴うが、この環境における局所的ILCサブセット間の動力学および発達関係は、調査されていないままである。本発明において、ILC2が、ILC2のILC1への分化を促進する局所的なIL−12シグナルおよびIL−18シグナルに依存するかなりの機能的可塑性を示すことが見出された。
ILCは、粘膜免疫の重要なメディエータであり、そしてILC1群とILC3群間の表現型可塑性は、以前に確立された。本明細書では、内在肺ILC2もまた、感染性の、または有害な剤に反応して機能的可塑性を示すことが実証され、これは、GATA−3の損失、およびILC1を生成するT−Bet+IFN−γへの付随するスイッチによって特徴付けられる。Th1サイトカイン、IL−12およびIL−18は、この変換を誘導する一方、炎症領域内の養子移入されたGFP+ILC2クラスターが、ウイルスに反応して、ILC1様表現型を採用する。機構的に、当該ILC1は、T−bet依存的に、ウイルス起因性炎症を著しく増大させる。特に、IL−12は、ヒトILC2を、T−bet+IFN−γ生成ILC1に変換し得、そしてCOPD患者におけるILC1の頻度は、疾患の重篤度、および増悪に対する感受性と相関する。まとめると、これらのデータは、ILC2の機能的可塑性が、抗ウイルス免疫の悪化をもたらし得、これが、COPDのような呼吸器疾患において不都合な結果に至る虞があることを実証している。
本発明の主要な態様の一部が、以下に要約されている。更なる態様は、本開示の発明を実施するための形態、実施例、図面、および特許請求の範囲の節に記載されている。本開示の各節における記載は、他の節と併せて読まれることが意図されている。さらに、本開示の各節に記載される種々の実施形態は、種々の異なる方法で組み合わされ得、そしてそのような組合せは全て、本発明の範囲内にあることが意図されている。
一態様において、本開示は、自然リンパ球(サブセット2)(ILC2)の、自然リンパ球(サブセット1)(ILC1)への変換を阻害する方法であって、ILC2の、T−bet+IFNγ+ILC1へのスイッチを防止し、ILC1上でのIL−12レセプタもしくはIL−18レセプタの発現レベルを維持もしくは抑制し、かつ/またはILC2上でのST2もしくはGATA3の発現レベルを維持し、もしくは増大させるモジュレータにILC2を接触させることを含む方法を提供する。
開示される方法において、モジュレータと接触するILC2は、ILC2の局所的プールであってもよいし、肺または肺組織に局所化していてもよいし、循環ILC2であってもよい。本発明の更なる態様において、ILC1への変換が阻害されるILC2は、循環ILC2であってもよいし、他の組織、特に肺炎症性疾患またはCOPDに冒されている虞があり、またはこれらと関連している虞がある組織に局所化しているILC2であってもよい。
他の態様において、本開示は、肺炎症を伴う疾患または障害の予防または処置を必要とする対象に、これを施す方法であって、対象は、ILC1の所定のレベルと比較して、かつ/または1つもしくは複数のコントロールサンプルにおけるILC1のレベルと比較して、対象からとられた1つまたは複数のサンプルにおけるILC1のレベルが高いと判定される、方法を提供する。
他の態様において、本発明はまた、肺炎症を伴う疾患または障害の予防または処置を必要とする対象に、これを施す方法であって、対象は、ILC1/ILC2の所定の比率と比較して、かつ/または1つもしくは複数のコントロールサンプルにおけるILC1/ILC2の比率と比較して、前記対象からとられた1つまたは複数のサンプルにおけるILC1/ILC2の比率が高いと判定される、方法を提供する。
本発明はまた、肺炎症を伴う疾患または障害の悪化の予防または処置を必要とする対象に、これを施す方法であって、前記対象に疾患修飾性医薬品を投与することを含み、前記対象は、ILC1の所定のレベルと比較して、かつ/または1つもしくは複数のコントロールサンプルにおけるILC1のレベルと比較して、前記対象からとられた1つまたは複数のサンプルにおけるILC1のレベルが高いと判定される、方法を提供する。
本発明の方法において、肺炎症は、タバコの煙、細菌感染、またはウイルス感染によって引き起こされ得る。さらに、本発明の方法において、疾患または障害は、慢性閉塞性肺疾患(COPD)である。
本発明はまた、疾患修飾性医薬品による処置の候補としての、肺炎症を伴う疾患または障害と診断される患者を選択する方法であって、患者が、ILC1/ILC2の所定の比率と比較して、かつ/または1つもしくは複数のコントロールサンプルにおけるILC1/ILC2の比率と比較して、前記対象からとられた1つまたは複数のサンプルにおけるILC1/ILC2の比率が高いと判定されるならば、患者を処置のために選択することを含む、方法を提供する。特定の実施形態において、疾患修飾性医薬品は、ILC1変換へのILC2のモジュレータ、気管支拡張薬、吸入ステロイド、組合せインヘラー、経口ステロイド、またはホスホジエステラーゼ−4インヒビタである。
特定の実施形態において、ILC1/ILC2の比率が高いという判定またはILC1のレベルが高いという判定は、ILC2の分子サインの、ILC1の分子サインへのスイッチの判定に基づく。更なる実施形態において、ILC2の分子サインは、Gata3、Rora、Il4、Il5、Il9、ll13、Penk(プロエンケファリン)、Areg(アンフィレグリン)、Il17rb、およびIl1rI1からなる群から選択される1つまたは複数のTh2関連転写産物の発現に対応する。更なる実施形態において、ILC1の分子サインは、Gata3、Rora、Il4、Il5、Il9、ll13、Penk(プロエンケファリン)、Areg(アンフィレグリン)、Il17rb、およびIl1rI1からなる群から選択される1つまたは複数のTh2関連転写産物のより低い発現、ならびにTbx21、Ifng、Il12rb2、Il18r1、Cxcr3、およびCcr5からなる群から選択される1つまたは複数の転写産物のより高いレベルに対応し、前記レベルは、ILC2の前記転写産物のレベルと比較される。
本発明の方法によって処置され、または予防される肺炎症は、タバコ煙、細菌感染、ウイルス感染、またはそれらの組合せによって引き起こされ得る。一実施形態において、開示される方法によって処置され、または予防される疾患または障害は、慢性閉塞性肺疾患(COPD)である。
本発明は、インフルエンザ関連炎症が、IL−18Rα+T−bet+ILC1の著しい増殖と強く相関する、GATA−3の損失およびTh2関連マーカーの発現の減少によって特徴付けられる、肺ILC集団内での顕著な表現型変化を引き起こすことを実証する。さらに、ST2−GFPリポーターマウス、およびGFP+ILC2の養子移入を利用して、ILC1増殖が、IL−12刺激およびIL−18刺激に反応して起こる肺内在ILC2からの直接的変換の結果であるという新規の証拠も提供される。さらに、いくつかのウイルス感染および細菌感染ならびにタバコ煙への曝露が挙げられる、多種多様なトリガー、とりわけCOPDの増悪に関連したトリガーが、局所的ILC2のこの可塑性を開始することが示される。特に、ILC2のこの機能的変換をトリガーする傷害(insult)の大きさは、この反応が、肺における炎症および/または損傷の一般的な特徴であることを示唆している。
さらに、本発明は、ILC2可塑性が、事象の多段階シーケンスを包含することを示す:ILC2の、組織内の炎症領域への移動、GATA−3の顕著な損失を介したサイレンシング、ならびにその後の、当該細胞の表現型スイッチおよび機能的局所的反応を決定する微環境的キューへの曝露。GFP+ILC2による養子移入系を用いて、本発明は、以下の感染、「サイレンシングされた」ILC(すなわちGATA−3LOW)が、局所的なIL−12生成およびIL−18生成に関連する炎症領域内で収束して、ILC1表現型にスイッチすることを示す。IL−12+IL−18+IL−33刺激後の分子分析は、ILC2可塑性についてのこの概念に合致する。なぜなら、新しいILC1(すなわちex−ILC2)は、部分的に重複するが、異なる遺伝子サインを、活性化されたILC2と共有するからである。これは、炎症誘発性反応と関連する、Th2転写産物の減少およびTh1様遺伝子の顕著な増大によって特徴付けられる。重要なことに、IL−12+IL−18+IL−33活性化ILC2は、静止ILC2と比較して、転写因子GATA−3およびT−betの共発現が挙げられる混合Th1/Th2サインを示し、このことは、肺ILC2可塑性が、局所的微環境変化に反応して起こることを示している。
興味深いことに、IL−12およびIL−18のレセプタの上方制御が、細菌感染中に、そしてタバコ煙への曝露中にILC上で起こり、このことは、これらのサイトカインが、複数の環境においてILC1変換と関連することを示している。また、これらのTh1様炎症性サイトカインは、細菌感染起因性および煙起因性炎症に対する宿主反応に不可欠であることが示されてきた。ゆえに、表現型をスイッチするILC2の能力は、複数のシグナルを必要とし、かつCOPD等の肺の疾患と関連するトリガーに関わるようである。
肺に内在するILC集団由来の、感染性の有害な剤に対する反応の顕著な類似性は、これらの表現型の変化の基礎となる共通の機構を支持する。IL−12は最近、ヒトにおけるILC3可塑性の重要なレギュレータとして現れ、データが、マウスおよびヒトのILC2の可塑性を直接誘導するのにこのサイトカインが果たす役割を示している。実際、IL−12は、本明細書で用いられるウイルスおよび細菌の感染中に生成され、そしてIL−12およびIL−18の鼻腔内投与が、非常に類似した表現型、すなわちGATA−3の損失およびILC1の特異的出現をもたらす。加えて、ウイルス抗原投与中の外因性IL−12の局所的投与は、GATA−3の損失を増強して、その後のILC1増殖を増大させる。IL−18Rα前の、ILC2上でのIL−12Rβ2の初期の発現、ならびにST2およびIL−12Rβ2を共発現するILC2の存在は、IL−12が当該細胞において初期のサイレンシングおよび表現型スイッチに寄与し得るという観察と一致している。IL−12によって誘導される重要な下流エフェクタの1つが、IFN−γであり、最近の報告は、このサイトカインが、ILC2反応を直接低下させ得ることを示している(Molofsky,A.et al.Interleukin−33 and Interferon−γ Counter−Regulate Group 2 Innate Lymphoid Cell Activation during Immune Perturbation.Immunity 43,161−174(2015))。ゆえに、IL−12−IFN−γアクシスは、ILC2サイレンシングの調節、およびILC1への表現型スイッチにおける重要な因子であるようである。
インフルエンザが挙げられるほとんどのウイルスによる感染は、ウイルスの複製領域と関連する炎症の組織学的に異なった遺伝子座によって特徴付けられる肺疾患を引き起こす。ILCの数が少ないにも拘らず、本研究において実行される広範な免疫組織化学的画像分析により、感染後、ILCが、組織の炎症領域内で収束することが明らかとなった。本発明は、肺におけるILCの詳細な視覚化の初めての例を開示しており、そして重要なことに、データにより、当該細胞が、IL−12 mRNAおよびIL−18 mRNAを発現する脊髄由来の細胞にごく近いインフルエンザ密集領域内でクラスターを形成することが明らかとなった。ILCのこの蓄積は、当該細胞の高いサイトカインアウトプットに加えて、微環境サイトカイン濃度が、感染中に著しく増強されるであろうことを示している。実際に、養子移入されたILC1は、感染前にILC2を受け入れた動物と比較した場合に、ウイルス感染によって喚起されるTNFα、IL−1β、IL−12p70、およびIFN−γが挙げられるTh1様炎症性サイトカインの生成、ならびにウイルス起因性の体重減少を顕著に拡大した。
注目すべきことに、肺の感染領域と関連するILCは、組織の冒されていない領域において見出されるよりもGATA−3の発現が低いことも見出された。まとめると、これらのデータは、炎症遺伝子座に直面するILC2が、能動的にサイレンシングされて、スイッチ表現型に局所的に向けられて、代替メディエータを生成することでウイルス起因性免疫を拡大することを実証している。本発明の広範なIHC画像分析は、局所的変化の調査の重要性を強調した。というのも、集団全体でのレベル分析、すなわち、総肺ダイジェスト(total lung digest)が、組織内在ILC表現型のミクロ環境変化を不明瞭にし、または過小評価する虞があるからである。
タバコ煙への長期曝露が、COPDの進行の原因となり得、そして当該患者の一部において、悪化に対するその後の感受性に関連付けられてきた。驚くべきことに、肺の免疫系が、この有害な剤にどのように反応するかについて、比較的ほとんど理解されていない。本明細書中で示される重要な発見は、煙への曝露もまた、内在する肺ILC2のILC1への変換をトリガーすることによって、慢性喫煙者において観察される損傷への感受性、および炎症の悪化を潜在的に増大させることであった。機構的に、これらのデータはまた、煙に曝露させたマウスの肺から単離されたILC2に及ぶ、観察されるサイレンシング効果についての根本的な状況を示しており、そこではIL−5およびIL−13の生成が、イクスビボ刺激後に著しく引き下げられている。IL−12は、感染環境におけるILC2可塑性の重要なレギュレータであるようであるが、このサイトカインもまた、タバコ煙への曝露に反応して生成されることが示された。さらに、IL−12起因性ILC2可塑性を増大させる2つの因子、IL−18およびIL−33は双方とも、実験上の煙曝露中に、そしてCOPD患者において、著しく上方制御される。ゆえに、IL−12誘導呼吸器感染症が、先行するタバコ煙曝露と関連してIL−33およびIL−18が高められるという状況の中で、超炎症性ILC1反応を駆動するよう刺激される(primed)可能性がある。
以前の研究は、IL−12とのヒトILC3の培養が、ILC1マーカーの上方制御をもたらす一方で、ILC1が、IL−23、IL−1β、およびレチノイン酸の存在下で、ILC3に分化し得ることを示した。本発明におけるデータは、GATA−3を下方制御し、かつT−betおよびIFN−γを上方制御することによって、ヒトCRTH2+ILC2がIL−12に反応することを実証している。当該細胞はまた、CD25を損なっており、これは、IL−18Rα+マウスILC1においてCD25の発現が低いことと一致している。さらに、以前の研究は、ヒトILC2が、IL−12および/またはIL−1β+IL−12刺激の後に、ILC1−IFN−γ生成細胞にスイッチし得ることを確認している。全てのヒトILCサブセットが、機能的可塑性を示すことが現在明らかであり、これにより、疾患状態においてILCがどれくらい頻繁に表現型を反転させるかという疑問が出てくる。
本明細書では、患者が、循環するILC2およびILC1の比率を大きく変更したことを示す発見が、ヒトCOPDにも拡大された。詳細には、患者は、循環ILC1数が多いほど、肺機能が悪く、疾患が重度であり、そして頻繁な増悪に感受性であるようである。それゆえに、循環ILCサブタイプは、この疾患における局所的ILC集団を反映し得る。マウスにおいて感染起因性の炎症を劇的に拡大するILC1の能力を考えると、COPD患者におけるILC1数の増大は、増悪の頻度または重篤度の原因となり得る可能性がある。炎症を起こしたマウス肺におけるST2+ILCとIL−18Rα+ILC間の関係を反映する、COPD患者におけるILC1とILC2間の強い相関は、可塑性がこの疾患における活性プロセスであり得ることを示す。ILCの表現型的に雑然とした性質、および枯渇についての既知の細胞特異的表面マーカーの不足を考えると、可塑性の操作による、すなわち超炎症性ILC1を変換して組織保護ILC2に戻すことによる当該細胞の標的化は、COPDにおける増悪の処置および管理における新規の治療的アプローチを提供し得る。
本発明の実行は、特に明記されない限り、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、細菌学、組換えDNA、および免疫学の従来の技術を使用することとなり、これらは当該技術の範囲内である。そのような技術は、文献において詳細に説明されている。例えば、Ausubel et al.eds.(2015)Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley and Sons);Greenfield,ed.(2013)Antibodies:A Laboratory Manual(2nd ed.,Cold Spring Harbor Press);Green and Sambrook,eds.(2012),Molecular Cloning:A Laboratory Manual(4th ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press);Krebs et al.,eds.(2012)Lewin’s Genes XI(11th ed.,Jones & Bartlett Learning);Freshney(2010)Culture Of Animal Cells(6th ed.,Wiley);Weir and Blackwell,eds.,(1996)Handbook Of Experimental Immunology,Volumes I−IV(5th ed.,Wiley−Blackwell);Borrebaeck,ed.(1995)Antibody Engineering(2nd ed.,Oxford Univ.Press);Glover and Hames,eds.,(1995)DNA Cloning:A Practical Approach,Volumes I and II(2nd ed.,IRL Press);Rees et al.,eds.(1993)Protein Engineering:A Practical Approach(1st ed.,IRL Press);Mayer and Walker,eds.(1987)Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Academic Press,London);Nisonoff(1984)Introduction to Molecular Immunology(2nd ed.,Sinauer Associates,Inc.);およびSteward(1984)Antibodies:Their Structure and Function(1st ed.,Springer Netherlands)参照。
本発明がより容易に理解され得るように、特定の用語が定義される。追加の定義が、本開示を通して示される。別途定義されない限り、本明細書中で用いられる全ての技術用語および科学用語は、本発明が関係する当該技術の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。例えば、The Dictionary of Cell and Molecular Biology(5th ed.J.M.Lackie ed.,2013)、the Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology(2d ed.R.Cammack et al.eds.,2008)、およびThe Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology(2d ed.P−S.Juo,2002)が、本明細書中で用いられる一部の用語の一般的な定義を当業者に提供することができる。
定義
本明細書および添付の特許請求の範囲において用いられる単数形「a」、「an」、および「the」は、文脈上、そうでないとする明確な指示がない限り、複数の指示対象を含む。用語「a」(または「an」)、ならびに用語「1つまたは複数」および「少なくとも1つ」は、互換的に用いられ得る。
本明細書および添付の特許請求の範囲において用いられる単数形「a」、「an」、および「the」は、文脈上、そうでないとする明確な指示がない限り、複数の指示対象を含む。用語「a」(または「an」)、ならびに用語「1つまたは複数」および「少なくとも1つ」は、互換的に用いられ得る。
さらに、「および/または」は、2つの具体的な特徴または成分のそれぞれの特定の開示としてとられるべきであり、他の特徴または成分の有無に拘らない。ゆえに、「Aおよび/またはB」等のフレーズで用いられる用語「および/または」は、AおよびB、AまたはB、A(のみ)、ならびにB(のみ)を含むことが意図される。同様に、「A、B、および/またはC」等のフレーズで用いられる用語「および/または」は、A、B、およびC;A、B、またはC;AまたはB;AまたはC;BまたはC;AおよびB;AおよびC;BおよびC;A(のみ);B(のみ);ならびにC(のみ)を含むことが意図される。
単位、接頭辞、および符号は、Systeme International de Unites(SI)で受け入れられている形態で表される。数の範囲は、範囲を定義する数を含む。本明細書中で提供される見出しは、本発明の種々の態様または実施形態の限定ではない。これは、本明細書を全体として参照することによって理解され得る。したがって、直ぐ下で定義される用語は、本明細書の全体を参照することによってより完全に定義される。
実施形態が文言「含む」で記載されている場合はいつでも、「からなる」および/または「から本質的になる」の文言で記載される異なる類似の実施形態が含まれる。
アミノ酸は、本明細書中で、IUPAC−IUB Biochemical Nomenclature Commissionによって推奨される、一般的に知られている3文字符号によって、または1文字符号によって示される。ヌクレオチドも同様に、それらの一般的に受け入れられている1文字コードによって示される。
「IL−12」は、インターロイキン12を指す。IL−12の活性形態は、ヘテロダイマーである;p35サブユニットが、IL−12A遺伝子によってコードされ、p40サブユニットが、IL−12B遺伝子によってコードされる。ヒトおよび他の哺乳類のIL−12のサブユニット双方についての全長のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列が、当該技術において知られている。IL−12は、I型サイトカインレセプタに結合する。IL−12レセプタ(IL−12R)は、β1サブユニットおよびβ2サブユニットで構成される膜貫通タンパク質である。ヒトおよび他の哺乳類のIL−12β1およびIL−12β2についての全長のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列が、当該技術において知られている。
「IL−18」は、IFN−γ誘導因子とも呼ばれるインターロイキン18を指す。ヒトおよび他の哺乳類のIL−18の全長のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列が、当該技術において知られている。IL−18は、IL−18レセプタ(IL−18R)に結合する。これは、IL−18レセプタアクセサリタンパク質(IL−18RAP)およびIL−18レセプタ1(IL−18R1)タンパク質で構成されるヘテロマー複合体である。ヒトおよび他の哺乳類のIL−18RAPおよびIL−18R1についての全長のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列が、当該技術において知られている。
「インヒビタ」は、別の分子の活性を阻害し、阻止し、または抑制する分子である。リガンドの活性は、例えば、リガンドの、そのレセプタへの結合に干渉することによって、またはレセプタの結合起因性の活性化に干渉することによって、阻害され得る。阻害は、リガンドそれ自体を阻止することによって、または結合するレセプタを阻止することによって、達成され得る。さらに、膜貫通レセプタの場合、可溶性のレセプタ誘導体の導入が、リガンドの活性を阻害し得る。可溶性のレセプタ誘導体は、リガンド結合を、固有の膜貫通レセプタと競合するので、固有のレセプタへのリガンド結合に由来する細胞活性化またはシグナル伝達を引き下げ、または除外する。阻害は、アゴニスト的であってもアンタゴニスト的であってもよい。インヒビタは、例えば、小分子、結合分子(突然変異タンパク質および抗体またはその抗原結合フラグメントが挙げられる)、阻害RNA、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドであってよい。本発明に用いられるインヒビタは好ましくは「特異的」であり、これは、1つの標的に、または構造的に関連した標的の一群に作用を及ぼすことを意味する。
用語「阻害する」、「阻止する」、および「抑制する」は、互換的に用いられており、活性の完全な阻止が挙げられる、生物学的活性の、統計学的に有意なあらゆる低下を指す。例えば、「阻害」は、生物学的活性の約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、または100%の低下を指し得る。したがって、用語「阻害」または「抑制」が、例えば、シグナル伝達経路に及ぼす作用を記載するために用いられる場合、当該用語は、未処理(コントロール)細胞と比較して、シグナル起因性もしくは標的起因性の細胞発達、可塑性、またはシグナル伝達を統計学的に有意に引き下げるインヒビタの能力を指す。特定の実施形態において、インヒビタは、例えば、フローサイトメトリ、ウエスタンブロッティング、ELISA、または当業者に知られている他のアッセイによって判定されて、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、または約100%、標的反応性細胞における標的媒介細胞の活性化またはシグナル伝達を阻害することができる。「ブロッキング」抗体または「アンタゴニスト」抗体は、これが結合する抗原の生物学的活性を阻害し、または引き下げるものである。特定の態様において、ブロッキング抗体またはアンタゴニスト抗体は、実質的に、または完全に、抗原の生物学的活性を阻害する。望ましくは、生物学的活性は、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、または100%も引き下げられる。
「結合親和性」は一般に、分子(例えば抗体)の単一の結合部位と、その結合パートナー(例えば抗原)間の、非共有結合性の相互作用の全体の強度を指す。特に明記されない限り、本明細書中で用いられる「結合親和性」は、結合対のメンバー(例えば、抗体および抗原)間の1:1の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子Xの、そのパートナーYとの親和性は一般に、解離定数(KD)によって表され得る。親和性は、本明細書中に記載されるものが挙げられる、当該技術において知られている一般的な方法によって測定され得る。低親和性抗体は一般に、抗原にゆっくり結合し、そして容易に解離する傾向があるが、高親和性抗体は一般に、抗原により速く結合し、そしてより長く結合したままとなる傾向がある。
抗原との抗体の親和性または結合力は、当該技術において知られている適切なあらゆる方法、例えばフローサイトメトリ、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)もしくはラジオイムノアッセイ(RIA)、またはカイネティクス(例えば、KINEXA(登録商標)またはBIACORE(商標)分析)を用いて実験的に判定され得る。直接結合アッセイおよび競合結合アッセイフォーマットが容易に使用され得る(例えば、Berzofsky et al.,“Antibody−Antigen Interactions”,In Fundamental Immunology,Paul,W.E.,ed.,Raven Press:New York,N.Y.(1984);Kuby,Immunology,W.H.Freeman and Company:New York,N.Y.(1992)参照)。特定の結合分子−標的相互作用の測定される親和性は、異なる条件(例えば、塩濃度、pH、温度)下で測定されるならば、変わり得る。ゆえに、親和性、および他の標的−結合パラメータ(例えば、KDまたはKd、Kon、Koff)の測定は、当該技術において知られている、結合分子(例えば抗体)および標的(例えば抗原)の標準化された溶液、ならびに標準化されたバッファでなされる。
用語「モジュレータ」は、代謝経路に変化(例えば、活性の阻害、抑制、刺激、または増大)を引き起こす分子または化合物を指す。「モジュレータ」は、例えば、小分子、ポリペプチド、抗体、抗原結合フラグメント、または突然変異タンパク質であり得る。
「小分子」は典型的に、低分子量、すなわち約キロダルトン未満の有機分子である。小分子インヒビタは、例えば、ルーチンの方法を用いて小分子ライブラリをスクリーニングすることによって、同定され得る。
「結合分子」は、結合分子が治療剤または診断試薬として有用であるように、十分な親和性でその標的に結合することができるものである。その標的に「特異的に結合する」結合分子は、例えば、ラジオイムノアッセイ(RIA)、BIACORE(登録商標)、KINEXA(登録商標)、または当該技術において知られている他の結合アッセイによって測定されて、結合分子の、その標的への結合の約10%未満の程度まで、無関係なタンパク質に結合する。特定の実施形態において、結合分子は、その標的に、≦1μM、≦100nM、≦10nM、≦1nM、≦0.1nM、≦10pM、≦1pM、または≦0.1pMの解離定数(KD)で結合する。用語「結合分子」は、抗体およびその抗原結合フラグメントを含む。特定の実施形態において、結合分子は、抗体でないポリペプチドである。タンパク質標的に高い親和性で結合する非抗体ポリペプチドを同定かつ生成する種々の方法が、当該技術において知られている。例えば、Skerra,Curr.Opin.Biotechnol.18:295−304(2007)、Hosse et al.,Protein Science 15:14−27(2006)、Gill et al.,Curr.Opin.Biotechnol.17:653−658(2006)、Nygren,FEBS J.275:2668−76(2008)、およびSkerra,FEBS J.275:2677−83(2008)参照。特定の実施形態において、ファージディスプレイ技術が、結合分子、例えばポリペプチドを同定かつ/または生成するのに用いられてきた。特定の実施形態において、ポリペプチドは、プロテインA、リポカリン、フィブロネクチンドメイン、アンキリンコンセンサスリピートドメイン、およびチオレドキシンからなる群から選択されるタイプのタンパク質スカフォールドを含む。
「突然変異タンパク質」は、天然に存在するタンパク質の類似体であり、その中では、天然のアミノ酸配列と比較して、1つまたは複数のアミノ酸残基が、様々なアミノ酸残基に加えられ、それから欠失され、またはそれによって置換されている。突然変異タンパク質は、既知の合成方法によって、例えば、本明細書中で記載されるように、部位指向性突然変異誘発によって、または当該技術において知られている他の適切なあらゆる技術によって、調製され得る。
用語「抗体」は、免疫グロブリン分子を指し、これは、免疫グロブリン分子の可変領域内の少なくとも1つの抗原認識部位により、標的、例えばタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、または上述の組合せを認識し、かつこれに特異的に結合する。本明細書中で用いられる用語「抗体」は、ポリクローナル抗体;モノクローナル抗体;多特異的抗体、例えば少なくとも2つの無傷抗体から生成される二重特異的抗体;ヒト化抗体;ヒト抗体;キメラ抗体;抗体の抗原決定部分を含む融合タンパク質;および抗原認識部位を含む他のあらゆる修飾免疫グロブリン分子を包含するが、抗体が、所望の生物学的活性を示す限りにおいてである。抗体は、免疫グロブリンの5つの主要なクラスのいずれかであってよい:それぞれアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミューと呼ばれる、重鎖定常ドメインの同一性に基づく、IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgM、またはそれらのサブクラス(アイソタイプ)(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2)。異なるクラスの免疫グロブリンは、異なる周知のサブユニット構造および三次元構造を有する。哺乳類の軽鎖の2つのクラス、ラムダおよびカッパが存在する。抗体は、裸であってもよいし、毒素、放射性同位体等の他の分子に結合されていてもよい。
用語「抗原結合フラグメント」は、抗体の相補性決定可変領域を含む無傷抗体の部分を指す。全長抗体のフラグメントは、抗体の抗原結合フラグメントであり得る。抗体フラグメントの例として、限定されないが、Fabフラグメント、Fab’フラグメント、F(ab’)2フラグメント、およびFvフラグメント、直鎖抗体、一本鎖抗体(例えばScFv)、および抗体フラグメントから形成される多特異的抗体が挙げられる。
「モノクローナル抗体」(mAb)は、単一の抗原決定因子またはエピトープの高度に特異的な認識および結合に関与する均一な抗体集団を指す。これは、様々な抗原決定因子に対して向けられる様々な抗体を典型的に含むポリクローナル抗体と対照的である。用語「モノクローナル」は、無傷モノクローナル抗体および全長モノクローナル抗体の双方に、そして抗体フラグメント(例えば、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv)、一本鎖(scFv)突然変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、および抗原認識部位を含む他の修飾されたあらゆる免疫グロブリン分子に当てはまり得る。さらに、「モノクローナル抗体」は、以下に限定されないが、ハイブリドーマ、ファージ選択、組換え発現、およびトランスジェニック動物によるものが挙げられるいくつかの方法で製造されるような抗体を指す。
用語「ヒト化抗体」は、最小限の非ヒト(例えばマウス)配列を含有するように操作された、非ヒト(例えばマウス)免疫グロブリンに由来する抗体を指す。典型的には、ヒト化抗体は、相補性決定領域(CDR)由来の残基が、所望される特異性、親和性、および能力を有する非ヒト種(例えば、マウス、ラット、ウサギ、またはハムスター)のCDR由来の残基によって置換されているヒト免疫グロブリンである(Jones et al.,1986,Nature,321:522−525;Riechmann et al.,1988,Nature,332:323−327;Verhoeyen et al.,1988,Science,239:1534−1536)。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク領域(FW)残基は、所望される特異性、親和性、および能力を有する非ヒト種由来の抗体中の対応する残基で置換されている。
ヒト化抗体はさらに、Fvフレームワーク領域における、かつ/または置換された非ヒト残基内の、追加の残基の置換によって、抗体特異性、親和性、および/または能力を洗練し、かつ最適化するように修飾されていてよい。一般に、ヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリンに相当するCDR領域の全てまたは実質的に全てを含有する可変ドメインの少なくとも1つ、典型的には2つまたは3つを実質的に全て含むこととなるが、FR領域の全てまたは実質的に全ては、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリンの定常領域またはドメイン(Fc)の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのものを含み得る。ヒト化抗体を生成するのに用いられる方法の例が、米国特許第5225539号明細書および米国特許第5639641号明細書に記載されている。
用語「ヒト抗体」は、ヒトによって生成される抗体、または当該技術において知られているあらゆる技術を用いて製造される、ヒトによって生成される抗体に相当するアミノ酸配列を有する抗体を意味する。ヒト抗体の定義は、少なくとも1つのヒトの重鎖ポリペプチドおよび/または軽鎖ポリペプチドを含む無傷抗体または全長抗体、例えばマウス軽鎖ポリペプチドおよびヒト重鎖ポリペプチドを含む抗体を含む。
用語「キメラ抗体」は、免疫グロブリン分子のアミノ酸配列が2種以上に由来する抗体を指す。典型的には、軽鎖および重鎖双方の可変領域は、哺乳類(例えば、マウス、ラット、ウサギその他)の一種に由来する、所望される特異性、親和性、および能力を有する抗体の可変領域に相当する一方、定常領域は、別の種における免疫反応を誘発することを回避するために、その種(通常ヒト)に由来する抗体中の配列に相同である。
用語「抗体」または「免疫グロブリン」は、本明細書中で互換的に用いられる。典型的な抗体は、ジスルフィド結合によって相互に結合する少なくとも2つの重(H)鎖および2つの軽(L)鎖を含む。各重鎖は、重鎖可変領域(本明細書中でVHと省略される)および重鎖定常領域で構成される。重鎖定常領域は、3つのドメイン、CH1、CH2、およびCH3で構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域(本明細書中でVLと省略される)および軽鎖定常領域(CL)で構成される。軽鎖定常領域は、1つのドメイン、Clで構成される。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫系の種々の細胞(例えばエフェクタ細胞)および古典的補体系の第1の成分(C1q)が挙げられる宿主の組織または因子への、免疫グロブリンの結合を媒介することができる。
VH領域およびVL領域は、相補性決定領域(CDR)と呼ばれる超可変性の領域にさらに再分割され得、フレームワーク(FW)領域と呼ばれるより保存された領域に散在している。各鎖におけるCDRは、FW領域によって隣接して一緒に保持されており、他の鎖由来のCDRと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している。それぞれのVHおよびVLは、3つのCDRおよび4つのFWで構成されており、以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端に配置されている:FW1、CDR1、FW2、CDR2、FW3、CDR3、FW4。
CDRを判定する少なくとも2つの技術が存在する:(1)種間配列変動性に基づくアプローチ(Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991));および(2)抗原−抗体複合体の結晶学的研究に基づくアプローチ(Al−lazikani et al.,J.Molec.Biol.273:927−948(1997))。また、これらの2つのアプローチの組合せが、時折、当該技術において、CDRを判定するのに用いられる。
Kabatのようなアミノ酸位置ナンバリングは、重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメイン(軽鎖のおおよそ残基1〜107および重鎖の残基1〜113)に用いられるナンバリング系を指す。このナンバリング系を用いて、実際の直鎖状アミノ酸配列は、可変ドメインのFWまたはCDRの短縮、またはそれらへの挿入に対応するより少ない、または追加のアミノ酸を含有し得る。残基のKabatナンバリングは、所定の抗体について、抗体の配列の相同領域での、Kabatナンバリングされる「標準的な」配列とのアラインメントによって、決定され得る。
「阻害RNA」は、遺伝子発現をRNA干渉によって阻害するものである。阻害RNAの例として、ミクロRNA(miRNA)および低分子干渉RNA(siRNA)が挙げられる。「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、mRNAに結合してその翻訳を妨げる核酸鎖である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、またはそれらの組合せで構成され得る。阻害RNAおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計して生成する方法が、当該技術において知られている。
「単離された」ポリペプチド、抗体、結合分子、ポリヌクレオチド、ベクター、または細胞は、自然界で見出されない形態である。単離されたポリペプチド、抗体、結合分子、ポリヌクレオチド、ベクター、または細胞として、もはや自然界で見出される形態でない程度にまで精製されたものが挙げられる。一部の実施形態において、単離されたポリペプチド、抗体、結合分子、ポリヌクレオチド、ベクター、または細胞は、実質的に純粋である。本明細書中で用いられる場合、用語「実質的に純粋」は、75%を超える、好ましくは80%または90%を超える、最も好ましくは95%を超える純度を指す。
「対象」、「個体」、「動物」、「患者」、または「哺乳類」が意味するのは、診断、予後、または治療が所望されるあらゆる対象、特に哺乳類の対象である。哺乳類の対象として、ヒト、家畜、農場の動物、スポーツ用の動物、および動物園の動物が挙げられ、例えば、ヒト、ヒト以外の霊長類、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、クマその他が挙げられる。
用語「医薬組成物」は、活性成分の生物学的活性が有効となり得るような形態であり、そして組成物が投与されることとなる対象にとって容認できないほど有毒な追加の成分を含有しない調製物を指す。そのような組成物は、滅菌され得、そして薬学的に許容可能なキャリア、例えば生理食塩水を含んでよい。適切な医薬組成物は、バッファ(例えば酢酸バッファ、リン酸バッファ、またはクエン酸バッファ)、界面活性剤(例えばポリソルベート)、安定化剤(例えばヒトアルブミン)、防腐剤(例えばベンジルアルコール)、生体利用性を増強する吸収プロモータ、および/または他の従来の可溶化剤もしくは分散剤の1つまたは複数を含んでよい。
本明細書中で開示される結合分子の「有効な量」は、具体的に定められた目的、例えば、治療効果または予防効果を実行するのに十分な量である。「有効な量」は、定められた目的に関して、実験に基づいて、そしてルーチン様式で、決定され得る。
「処置」または「緩和」等の用語は、診断された病状または障害の症候を治療し、減速し、軽減し、かつ/またはその進行を停止する治療措置を指す。ゆえに、処置が必要なものとして、すでに障害があるものが挙げられる。特定の実施形態において、患者が、例えば、疾患または障害と関連する症候の完全な、部分的な、または一過性の緩和または排除を示すならば、対象は、本明細書中で提供される方法に従って、肺炎症を伴う疾患または障害について首尾よく「処置されている」。
「予防する」または「予防」は、標的の病状または障害の進行を予防し、かつ/または減速する予防的または防止的な措置を指す。ゆえに、予防が必要なものとして、障害を起こしやすく、またはこれに感受性であるものが挙げられる。特定の実施形態において、患者が、例えば、疾患もしくは障害と関連する、本発明の方法を受けなかった患者よりも低い重度の症候、または疾患もしくは障害と関連する症候の後の発症を一時的に、または永久に進行させるならば、肺炎症を伴う疾患または障害が、本明細書中で提供される方法に従って、首尾よく予防されている。
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、あらゆる長さのアミノ酸のポリマーに言及するのに、本明細書中で互換的に用いられる。ポリマーは、直鎖状であっても分岐していてもよく、修飾アミノ酸を含んでもよく、そして非アミノ酸で中断されていてもよい。用語はまた、自然に、または介入;例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または他のあらゆる操作もしくは修飾、例えば標識成分との結合によって修飾されたアミノ酸ポリマーを包含する。また、定義内に含まれるものとして、例えば、アミノ酸(例えば非天然のアミノ酸その他が挙げられる)の1つまたは複数の類似体を含有するポリペプチド、および当該技術において知られている他の修飾がある。特定の実施形態において、ポリペプチドは、単鎖または結合鎖として生じ得る。
本明細書中で用いられる「ポリヌクレオチド」は、1つまたは複数の「核酸」、「核酸分子」、または「核酸配列」が挙げられ得、あらゆる長さのヌクレオチドのポリマーを指し、そしてDNAおよびRNAが挙げられる。ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドもしくは修飾塩基、および/またはそれらの類似体、あるいはDNAポリメラーゼまたはRNAポリメラーゼによってポリマー中に組み込まれ得るあらゆる基質であってよい。ポリヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチドおよびその類似体を含み得る。先の記載は、RNAおよびDNAが挙げられる、本明細書中で言及される全てのポリヌクレオチドに当てはまる。
結合分子の調製
モノクローナル抗体が、ハイブリドーマ法、例えばKohler and Milstein Nature 256:495(1975)によって記載されるものを用いて調製され得る。ハイブリドーマ法を用いて、マウス、ハムスター、または他の適切な宿主動物が、免疫化抗原に特異的に結合すると考えられる抗体のリンパ球による生成を誘発するように免疫化される。リンパ球もインビトロで免疫化され得る。免疫化の後、リンパ球は単離されて、例えば、ポリエチレングリコール(PEG)を用いて、適切な骨髄腫細胞株と融合されて、ハイブリドーマ細胞が形成されて、これがその後、融合しなかったリンパ球および骨髄腫細胞から選択され得る。免疫沈降、イムノブロッティングによって、またはインビトロ結合アッセイ(例えば、RIAまたはELISA)によって判定されて、選択された抗原に対して特異的に向けられるモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマがその後、標準的な方法を用いるインビトロ培養(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,Academic Press,1986)で、または動物における腹水腫瘍としてインビボで、増殖され得る。モノクローナル抗体はその後、培地または腹水から精製され得る。
モノクローナル抗体が、ハイブリドーマ法、例えばKohler and Milstein Nature 256:495(1975)によって記載されるものを用いて調製され得る。ハイブリドーマ法を用いて、マウス、ハムスター、または他の適切な宿主動物が、免疫化抗原に特異的に結合すると考えられる抗体のリンパ球による生成を誘発するように免疫化される。リンパ球もインビトロで免疫化され得る。免疫化の後、リンパ球は単離されて、例えば、ポリエチレングリコール(PEG)を用いて、適切な骨髄腫細胞株と融合されて、ハイブリドーマ細胞が形成されて、これがその後、融合しなかったリンパ球および骨髄腫細胞から選択され得る。免疫沈降、イムノブロッティングによって、またはインビトロ結合アッセイ(例えば、RIAまたはELISA)によって判定されて、選択された抗原に対して特異的に向けられるモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマがその後、標準的な方法を用いるインビトロ培養(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,Academic Press,1986)で、または動物における腹水腫瘍としてインビボで、増殖され得る。モノクローナル抗体はその後、培地または腹水から精製され得る。
ヒト抗体は、当該技術において知られている種々の技術を用いて、直接調製され得る。標的抗原に向けられる抗体を生成する、インビトロで免疫化された、または免疫化個体から単離された不死化ヒトBリンパ球が生成され得る(例えば、Cole et al.,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,p.77(1985);Boemer et al.,J.Immunol.147(1):86−95(1991);および米国特許第5750373号明細書参照)。
インヒビタは、ファージライブラリから選択され得、ファージライブラリは、例えば、Vaughan et al.(Nat.Biotechnol.,14:309−314(1996))、Sheets et al.(Proc.Nat’l.Acad.Sci.U.S.A.95:6157−6162(1998))、Hoogenboom et al.(J.Mol.Biol.227:381(1991))、およびMarks et al.(J.Mol.Biol.222:581(1991))によって記載されるように、ヒト抗体を発現する。また、生成技術および抗体ファージライブラリの使用が、米国特許第5969108号明細書、米国特許第6172197号明細書、米国特許第5885793号明細書、米国特許第6521404号明細書;米国特許第6544731号明細書;米国特許第6555313号明細書;米国特許第6582915号明細書;米国特許第6593081号明細書;米国特許第6300064号明細書;米国特許第6653068号明細書;米国特許第6706484号明細書;および米国特許第7264963号明細書;ならびにRothe et al.,J.Mol.Biol.375:1182−1200(2007)に記載されている。
親和性成熟戦略および鎖シャッフリング戦略が、当該技術において知られており、高親和性ヒト抗体またはその抗原結合フラグメントを生成するのに使用され得る(Marks et al.,Bio/Technology 10:779−783(1992)参照)。
一部の実施形態において、抗体は、ヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントであってよい。非ヒト抗体またはヒト抗体を操作し、ヒト化し、またはリサーフェシングする方法もまた用いられ得、当該技術において周知である。ヒト化され、リサーフェシングされ、または同様に操作された抗体は、ヒト以外、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒト以外の霊長類、または他の哺乳類であるソース由来の1つまたは複数のアミノ酸残基を有してよい。これらの非ヒトアミノ酸残基は、多くの場合「インポート」残基と呼ばれる残基によって置換されており、これは典型的に、既知のヒト配列の「インポート」可変ドメイン、定常ドメイン、または他のドメインからとられる。そのようなインポートされた配列は、当該技術において知られているように、免疫原性を引き下げ、または結合、親和性、オンレート(on−rate)、オフレート(off−rate)、結合力、特異性、半減期、もしくは他の適切なあらゆる特性を引き下げ、増強し、もしくは修飾するのに用いられ得る。一般に、CDR残基は、抗原結合への影響に、直接、かつほとんど実質的に、関与する。したがって、非ヒトCDR配列またはヒトCDR配列の一部または全てが維持される一方、可変領域および定常領域の非ヒト配列は、ヒトまたは他のアミノ酸で置換されていてよい。
また、抗体が、場合によっては、ヒト化され、リサーフェシングされ、操作され、またはヒト抗体が操作されて、標的抗原に対する高い親和性および他の有利な生物学的特性が保持され得る。この目標を達成するために、親の配列、操作された配列、およびヒト化配列の3次元モデルを用いて、ヒト化(またはヒト)抗体または操作された抗体およびリサーフェシングされた抗体が、場合によっては、親の配列および種々の概念上のヒト化された生成物および操作された生成物を分析するプロセスによって調製されてよい。三次元免疫グロブリンモデルが一般的に利用可能であり、当業者によく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の予想される三次元立体配座構造を示してディスプレイするコンピュータプログラムが利用可能である。当該ディスプレイの調査により、候補の結合分子配列の機能において果たす、残基の可能性がある役割の分析、すなわち、標的に結合する候補結合分子の能力に影響する残基の分析が可能となる。このように、FW残基が、コンセンサス配列およびインポート配列から選択され得、かつ組み合わされ得るので、所望される結合分子特性、例えば、標的に対する親和性の増大が達成される。
抗体またはその抗原結合フラグメントのヒト化、リサーフェシング、または操作は、例えば、以下に限定されないが、Jones et al.,Nature 321:522(1986);Riechmann et al.,Nature 332:323(1988);Verhoeyen et al.,Science 239:1534(1988)),Sims et al.,J.Immunol.151:2296(1993);Chothia and Lesk,J.Mol.Biol.196:901(1987),Carter et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89:4285(1992);Presta et al.,J.Immunol.151:2623(1993),米国特許第5639641号明細書,米国特許第5723323号明細書;米国特許第5976862号明細書;米国特許第5824514号明細書;米国特許第5817483号明細書;米国特許第5814476号明細書;米国特許第5763192号明細書;米国特許第5723323号明細書;米国特許第5766886号明細書;米国特許第5714352号明細書;米国特許第6204023号明細書;米国特許第6180370号明細書;米国特許第5693762号明細書;米国特許第5530101号明細書;米国特許第5585089号明細書;米国特許第5225539号明細書;米国特許第4816567号明細書,米国特許第7557189号明細書;米国特許第7538195号明細書;および米国特許第7342110号明細書;国際出願PCT/US98/16280号明細書;国際出願PCT/US96/18978号明細書;国際出願PCT/US91/09630号明細書;国際出願PCT/US91/05939号明細書;国際出願PCT/US94/01234号明細書;国際出願PCT/GB89/01334号明細書;国際出願PCT/GB91/01134号明細書;国際出願PCT/GB92/01755号明細書;国際公開第90/14443号パンフレット;国際公開第90/14424号パンフレット;国際公開第90/14430号パンフレット;ならびにEP229246号明細書に記載されるような既知のあらゆる方法を用いて実行されてよい。
また、免疫化して直ぐに、内在性免疫グロブリンの生成不在下でヒト抗体の完全なレパートリーを生成することができるヒト免疫グロブリン遺伝子座を含有するトランスジェニックマウスにおいて、ヒト化抗体およびその抗原結合フラグメントが製造されてもよい。このアプローチは、米国特許第5545807号明細書;米国特許第5545806号明細書;米国特許第5569825号明細書;米国特許第5625126号明細書;米国特許第5633425号明細書;および米国特許第5661016号明細書に記載されている。
特定の実施形態において、抗体フラグメントが用いられる。抗体フラグメントの生成のための種々の技術が知られている。習慣的に、当該フラグメントは、無傷抗体のタンパク質分解消化を介して誘導される。例えば、Morimoto et al.,J.Biochem.Biophys.Meth.24:107−117(1993);Brennan et al.,Science,229:81−83(1985)参照。特定の実施形態において、抗体フラグメントは、組換えにより生成される。Fab、Fv、およびscFvの抗体フラグメントは全て、大腸菌(E.coli)または他の宿主細胞中で発現されて、これらから分泌され得るので、当該フラグメントの大量生成が可能となる。また、そのような抗体フラグメントは、先で考察した抗体ファージライブラリから単離され得る。また、抗体フラグメントは、米国特許第5641870号明細書に記載されるような直鎖状の抗体であってもよい。抗体フラグメントの生成のための他の技術は、当業者にとって明らかであろう。
本発明に従えば、所定の標的に対して特異的な一本鎖抗体の生成技術が応用されてよい(例えば、米国特許第4946778号明細書参照)。また、Fab発現ライブラリの構築方法(例えば、Huse et al.,Science 246:1275−1281(1989)参照)が応用されて、標的にとって所望される特異性を有するモノクローナルFabフラグメントの迅速かつ効率的な同定が可能となる。また、抗体フラグメントは、以下に限定されないが以下が挙げられる、当該技術の範囲内の技術によって生成され得る:(a)抗体分子のペプシン消化によって生成されるF(ab’)2フラグメント;(b)F(ab’)2フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって生成されるFabフラグメント、(c)抗体分子の、パパインおよび還元剤による処理によって生成されるFabフラグメント、ならびに(d)Fvフラグメント。
処置方法
肺炎症、例えばCOPD、またはタバコ煙、細菌感染、ウイルス感染、もしくはそれらの組合せによって引き起こされる肺炎症を伴う疾患または障害の処置方法または予防方法が提供される。肺炎症を伴う疾患または障害として、喘息、嚢胞性線維症、気管支拡張症、および炎症性腸(IBD)関連疾患が挙げられる。
肺炎症、例えばCOPD、またはタバコ煙、細菌感染、ウイルス感染、もしくはそれらの組合せによって引き起こされる肺炎症を伴う疾患または障害の処置方法または予防方法が提供される。肺炎症を伴う疾患または障害として、喘息、嚢胞性線維症、気管支拡張症、および炎症性腸(IBD)関連疾患が挙げられる。
本明細書中で記載されるように、本発明は、重大な表現型の変化が、COPD患者または肺炎症を伴う障害に苦しむ患者の肺ILC集団内で起こり得ることを実証する。本発明はさらに、COPD患者または肺炎症性の症状がある患者の肺ILC集団が、IL−18Rα+T−bet+ILC1の著しい増殖と強く相関する、GATA−3の損失およびTh2関連マーカーの発現の低下によって特徴付けられ得ることを実証する。さらに、本発明はまた、ILC1増殖が、IL−12およびIL−18の刺激に反応して起こる、内在する肺ILC2からの直接的な変換によって引き起こされ得ることを示す。さらに、いくつかのウイルス感染および細菌感染、ならびにタバコ煙への曝露が挙げられる多種多様なトリガー、とりわけCOPDの増悪と関連するトリガーが、局所的ILC2におけるこの可塑性を誘導することが示された。
これらの観察を鑑みて、自然リンパ球(サブセット2)(ILC2)の、自然リンパ球(サブセット1)(ILC1)への変換を阻害する方法が、本明細書中で提供され、ILC2が、ILC2の、T−bet+IFNγ+ILC1へのスイッチを妨げ、ILC1におけるIL−12レセプタおよび/もしくはIL−18レセプタの発現レベルを維持もしくは抑制し、かつ/またはILC2におけるST2、CRTH2、および/もしくはGATA3の発現レベルを維持し、もしくは増大させるモジュレータと接触する。ILC2の集団の、ILC1への変換の阻害が、予防、COPDまたは隠れた肺炎症性の症状に関連した症候の悪化を制限するための処置が挙げられる処置を促進し得る。さらに、ILC2の、ILC1へのそのような阻害は、COPDの進行を制限し得、または他の肺炎症性の症状の進行を制限し得る。
また、より多くの標的処置選択肢もしくは標的処置レジメンまたは増強処置選択肢もしくは増強処置レジメンを患者に提供するために、予防、症候の悪化を制限する処置が挙げられる処置が、ILC1のレベルが高い、またはILC1/ILC2の比率が高いと判定された対象または患者に実行され、そのような判定が、モジュレータまたは疾患修飾性医薬品を投与する前に、ILC2の分子サインの、ILC1の分子サインへのスイッチを同定することによってなされる、追加の方法が提供される。
本発明はまた、本発明のILC2の分子サインが、Gata3、Rora、Il4、Il5、Il9、ll13、Penk(プロエンケファリン)、Areg(アンフィレグリン)、Il17rb、およびIl1rI1からなる群から選択される1つまたは複数のTh2関連転写産物の発現に対応することを示す。本発明のILC1の分子サインは、請求項26に記載の1つまたは複数のTh2関連転写産物のより低い発現、ならびにTbx21、Ifng、Il12rb2、Il18r1、Cxcr3、およびCcr5からなる群から選択される1つまたは複数の転写産物のより高いレベルに対応し、前記レベルは、ILC2の前記転写産物のレベルと比較される。
一実施形態において、本明細書中に記載される方法は、モジュレータまたは疾患修飾性医薬品を対象に投与することを含む。モジュレータまたは疾患修飾性医薬品の投与に対する臨床反応は、スクリーニング技術、例えば磁気共鳴撮像(MRI)、X線撮影、コンピュータ断層撮影(CT)スキャン、フローサイトメトリ、または蛍光活性化セルソータ(FACS)分析、組織学、剖検所見、および血液化学を用いて評価され得、以下に限定されないが、ELISA、ELISPOT、RIA、クロマトグラフィ等によって検出可能な変化が挙げられる。さらに、モジュレータまたは疾患修飾性医薬品による治療を経験する対象は、疾患または障害に関連する症候の向上を経験し得る。
モジュレータまたは疾患修飾性医薬品を調製し、かつそれを必要とする対象に投与する方法は、当業者に周知であり、または当業者によって容易に決定され得る。投与経路は、例えば、経口、非経口であってもよいし、吸入によってもよいし、局所的であってもよい。本明細書中で用いられる用語「非経口」は、例えば、静脈内投与、動脈内投与、腹膜内投与、筋肉内投与、皮下投与、直腸投与、および膣投与を含む。経口剤型として、例えば、カプセル、タブレット、水性懸濁液、および溶液が挙げられる。経鼻エーロゾルまたは吸入剤型は、例えば、ベンジルアルコール、または他の適切な防腐剤、生体利用性を増強する吸収プロモータ、および/または他の従来の可溶化剤もしくは分散剤を使用して、生理食塩水溶液として調製されてよい。
通常、適切な医薬組成物は、バッファ(例えば酢酸バッファ、リン酸バッファ、またはクエン酸バッファ)、場合によっては界面活性剤(例えばポリソルベート)、場合によっては安定化剤(例えばヒトアルブミン)その他を含んでよい。薬学的に許容可能なキャリアまたは希釈剤の形態および特性は、組み合わされることになる活性成分の量、投与経路、および他の周知の変量によって決定され得る。一実施形態において、投与は、例えば吸入または鼻腔内投与によって、気道に直接的になされる。
本明細書中で考察されるように、モジュレータまたは疾患修飾性医薬品は、肺炎症を伴う疾患または障害のインビボ処置にとって治療的に有効な量で投与され得る。この点に関して、インヒビタは、投与を容易にし、かつ活性剤の安定性を促進するように製剤化され得ることは勿論である。
本発明に従う医薬組成物は、薬学的に許容可能な、毒性のない、滅菌されるキャリア、例えば生理食塩水、無毒性バッファ、防腐剤等を含み得る。本明細書中で開示される治療方法に用いるのに適した製剤が、Remington’s Pharmaceutical Sciences,20th ed.,Mack Publishing Co.,Easton,PA(2000)に記載されている。
組成物は、単回用量、複数回用量として投与されてもよいし、点滴の確立された期間にわたって投与されてもよい。投薬量レジメンもまた、所望される最適反応(例えば、治療的反応または予防的反応)を実現するように調整され得る。キャリア材料と組み合わされて剤型を生成することができるモジュレータまたは疾患修飾性医薬品の量は、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態(すなわち、治療を受ける個体の疾患の重篤度、病歴、ならびに年齢、身長、体重、健康状態、および物理的状態)、処置が予防的であるか治療的であるか、他の医薬品が投与されるか、そして患者がヒトであるか動物であるかが挙げられる多くの様々な因子に応じて変わることとなる。通常、患者はヒトであるが、トランスジェニック哺乳類を含む非ヒト哺乳類もまた処置され得る。投与されることになるモジュレータまたは疾患修飾性医薬品の量は、本開示を前提に、当業者によって、過度の実験をすることなく容易に決定される。処置投薬量は、当業者に知られているルーチンの方法を用いて、安全性および有効性を最適化するように滴定され得る。
本開示はまた、肺炎症、例えばCOPD、またはタバコ煙、細菌感染、ウイルス感染、もしくはそれらの組合せによって引き起こされる肺炎症を伴う疾患または障害を処置し、または予防するためのモジュレータまたは疾患修飾性医薬品の使用を提供する。
本開示はまた、肺炎症、例えばCOPD、またはタバコ煙、細菌感染、ウイルス感染、もしくはそれらの組合せによって引き起こされる肺炎症を伴う疾患または障害を処置し、または予防する医薬の製造におけるモジュレータまたは疾患修飾性医薬品の使用を提供する。
「疾患修飾性医薬品」は、短時間作用型または長時間作用型の気管支拡張薬、吸入ステロイド、組合せインヘラー、経口ステロイド、ホスホジエステラーゼ−4インヒビタ、またはテオフィリンが挙げられる気管支拡張薬であってよい。
本開示において引用される全ての参考文献は、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。また、本明細書中で引用され、または言及されるあらゆる製品についてのメーカーのあらゆる説明書またはカタログが、参照によって組み込まれる。参照によって本文中に組み込まれる文献、または本文中のあらゆる教示は、本発明の実行に用いられ得る。参照によって本文中に組み込まれる文献は、先行技術であることが承認されていない。
本開示の実施形態は、本開示の特定の抗体の調製および本開示の抗体を用いる方法を詳細に記載する、以下の非限定的な実施例を参照してさらに定義され得る。材料および方法の双方に対する多くの改良が、本開示の要旨を逸脱しない範囲で実行され得ることは、当業者にとって明らかであろう。
実施例1.肺に内在するILC2は、インフルエンザ抗原投与の後、GATA−3を下方制御する
ILC2は、肺の主要なILC集団であり、GATA−3の発現によって特徴付けられる。タバコ煙が、当該細胞においてIL−5およびIL−13の生成を抑制することによって、肺に内在するILC2反応をサイレンシングすることが以前に示された。本発明は、この変化の関連性、およびCOPDと関連する他の病原性の刺激が、これと同じことをし得るかを示すものである。
ILC2は、肺の主要なILC集団であり、GATA−3の発現によって特徴付けられる。タバコ煙が、当該細胞においてIL−5およびIL−13の生成を抑制することによって、肺に内在するILC2反応をサイレンシングすることが以前に示された。本発明は、この変化の関連性、およびCOPDと関連する他の病原性の刺激が、これと同じことをし得るかを示すものである。
肺ILC2は、非T/NK細胞の集団と定義され、これは、リニイッジマーカーの発現についてネガティブであり、そしてCD90、IL−7Rα、CD44、ICOS、GATA−3、およびST2についてポジティブ(高)であった(図1a、図1b)。肺に内在する免疫細胞上でのST2の発現は、タバコ煙への曝露の後に、動的に調節される。したがって、ST2に特異的な試薬、およびその調節をより正確に理解するための必要性の不在下で、ST2−GFP+リポーターマウスを開発した。T−betまたはRORγtを発現する無感作の肺に、Lin−CD90+細胞(すなわち、ILC1細胞およびILC3細胞)の小集団が存在するが、大部分のILCは、ST2HIGATA−3HIであり、総ILCプールのおおよそ85〜90%を表した。この観察は、ST2リポーターマウスにおいてILC2を評価したときに確認され(図1c、図1d)、ILC2が、CD90、IL−7Rα、CD44、およびCD25を発現するLin−ST2−GFP+細胞として容易に同定可能であった。
興味深いことに、インフルエンザA型による感染は、非感染マウス由来のILC2と比較した場合、GATA−3の急速かつ劇的な損失(≧50%)をもたらした。この損失は、感染後(p.i.)48時間という早い時期に観察されて、p.i.6日目でも依然として明らかであった(図1e)。さらに、GATA−3の損失は、感染後の当該細胞において、ILC2関連マーカーST2の発現の著しい低下と相関した(図1f)。当該マーカーの損失は、ILC2流出または細胞死と関連しなかった。なぜなら、血液、流入領域リンパ節(dLN)、または気管支肺胞洗浄(BAL)において、有意なILCの検出がなかったため;そして肺におけるILCが、PIおよびアネキシンV染色の判定に従って、アポトーシスであるようではなかったためであった。
ウイルス感染が、IL−12およびIL−18が挙げられる炎症誘発性サイトカインの生成を伴うので、ILCにおけるこれらのTh1関連メディエータのレセプタ発現を調査した。驚くほどに、ILC2上でのST2の損失が、IL−18Rα+ILC集団の平行増加と強く相関した(図1f、図1g;R=−0.859)。IL−12Rβ2発現が、ST2の損失と相関するようではなかったが、感染後のこのIL−18Rα+ILC集団上でのIL−12Rβ2の有意な増大も観察された(図1h)ことから、IL−12Rβ2は、当該細胞上のIL−18Rαよりも早く出現し得ることが示唆される。
T−betは、IL−12の下流にある転写因子であり、これは、ILC1のマーカーであり、Th1反応の促進と強固に関連する。したがって、T−betを発現する肺内在ILCを調査して、p.i.7日目にT−betを発現するILCのパーセンテージの増大と付随して起こる、当該細胞におけるGATA−3の損失が見出された(図1i)。実際に、ウイルス起因性T−bet+ILCは全て、肺におけるIL−18Rα+サブセット内に含まれていた(図1j)。IL−18Rα+T−bet+ILCは、CD3−、CD49b−、Lin−、CD90+、およびCD44+のままであった一方、ST2+ILCと比較して、中間レベルのCD25、IL−7Rα、ICOS、およびc−Kitを発現した。
興味深いことに、ウイルス感染後のILC集団の変化は、ILC1様反応に特異的であるようであった。というのも、同時点での肺における顕著なRORγt+ILC3が検出されなかったからである。さらに、感染中の肺における大部分の増殖Ki67+ILCは、IL−18Rα+を発現した(図1k)ことから、当該細胞の維持または機能にIL−18Rαが果たす役割が示唆された。
転写因子発現の変化の結果を調査するために、総肺内在ILCを、インフルエンザ感染マウスから単離して、イクスビボで刺激して、サイトカイン発現パターンを評価した。感染マウス由来の肺ILCは、p.i.7日目にて、モック(PBS処理)動物由来のILCよりも著しく少ないIL−5およびIL−13を生成することが見出された(図1l)。しかしながら、IL−12およびIL−18についてのレセプタの上方制御に合わせて、感染動物の肺から単離したILCは、IL−12およびIL−18のイクスビボ刺激に反応して、有意なレベルのIFN−γを生成した(図1l)。
まとめると、これらのデータは、局所的ILC2機能の低下およびIL−18Rα+T−bet+IFNγ+ILC1の増殖によって特徴付けられる、ウイルス抗原投与中の肺内在ILCの表現型および機能的能力双方の主要な変化を実証している。
実施例2.タバコ煙への曝露および細菌感染は、肺ILCの表現型変化を誘導する
COPDの増悪が、ウイルスおよび細菌のいくつかの呼吸器感染と関連するので、ILCサブグループのスイッチが、様々なCOPD関連病原体を抗原投与したマウスで起こるかを調査した。驚くほどに、酷似したパターンが見出された。インフルエンザA型(PR8)、呼吸合胞体ウイルス(RSV)(図2a)、またはグラム陽性菌およびグラム陰性菌、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)(図2b)および分類不可能なインフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)(NTHi)(図2c〜図2f)の様々な株による接種は全て、GATA−3の損失、およびその後の、肺ILC集団内でのIL−12Rβ2、IL−18Rα、およびT−betの発現の増大を誘導した。
COPDの増悪が、ウイルスおよび細菌のいくつかの呼吸器感染と関連するので、ILCサブグループのスイッチが、様々なCOPD関連病原体を抗原投与したマウスで起こるかを調査した。驚くほどに、酷似したパターンが見出された。インフルエンザA型(PR8)、呼吸合胞体ウイルス(RSV)(図2a)、またはグラム陽性菌およびグラム陰性菌、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)(図2b)および分類不可能なインフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)(NTHi)(図2c〜図2f)の様々な株による接種は全て、GATA−3の損失、およびその後の、肺ILC集団内でのIL−12Rβ2、IL−18Rα、およびT−betの発現の増大を誘導した。
ILCサブグループのこの移行は、COPDの主な起因因子の1つであるタバコ煙への曝露が、GATA−3の劇的な損失を誘導した(すなわち、煙吸入の4日後および10日後)点で、感染性トリガーに限定されなかった。GATA−3レベルは、6ヵ月の連続的な煙曝露により、有意に引き下げられたままであった(図2g〜図2h;データを最大8週示す)。特に、IL−12Rβ2+、IL−18Rα+、T−bet+ILC1集団の出現は、煙への曝露の8週後も観察され(図2i〜図2m)、更なる処理の6ヵ月後も維持された。最後に、COPD増悪モデルにおいて、タバコ煙への曝露がウイルス感染と組み合わされる場合、肺に内在するILCの変化は、劇的に増大することが見出された。以前にタバコ煙に曝露されたマウスは、煙またはウイルス単独と比較して、GATA−3およびST2の抑制がより大きく、かつ肺内在ILCのIL−18Rαのレベルが非常に高かった。
まとめると、これらのデータは、局所的ILC集団における表現型のスイッチが、外来の、そして/または環境の傷害に反応する一般的な機構であり得ることを実証している。
実施例3.IL−12およびIL−18は、局所的ST2+ILC2プールからIFN−γ生成ILC1を誘導する
ILC2がILC1表現型を採用し得るかを試験するために、IL−33拡張(expanded)ILC2を、肺から>98%の純度に富化して、4〜7日間、種々のサイトカインと共に培養した。IL−12またはIL−15による当該細胞の刺激は、ILC2からのIFN−γの生成を誘導しなかった。しかしながら、IL−18に、そして特にIL−12およびIL−18の組合せに反応して、当該細胞の約20〜50%(それぞれ)が、IFN−γを生成した。これはまた、培養液上清中に存在するレベルにも反映された(図3a、図3b)。これらのデータは、IL−12およびIL−18が、ILC3からのIFN−γ生成を誘導し得ることを実証する研究と一致している。
ILC2がILC1表現型を採用し得るかを試験するために、IL−33拡張(expanded)ILC2を、肺から>98%の純度に富化して、4〜7日間、種々のサイトカインと共に培養した。IL−12またはIL−15による当該細胞の刺激は、ILC2からのIFN−γの生成を誘導しなかった。しかしながら、IL−18に、そして特にIL−12およびIL−18の組合せに反応して、当該細胞の約20〜50%(それぞれ)が、IFN−γを生成した。これはまた、培養液上清中に存在するレベルにも反映された(図3a、図3b)。これらのデータは、IL−12およびIL−18が、ILC3からのIFN−γ生成を誘導し得ることを実証する研究と一致している。
IL−15がILC1によるIFN−γの発現を促進するという以前の報告にも拘らず、IL−15は単独で、またはIL−12および/もしくはIL−18と組み合わされて、これらの条件下で、IFN−γ生成に有意に影響を及ぼさないことが見出された(図3b)。IL−5の生成は、注目すべきことに、このアッセイにおいて、様々な条件の全体にわたって一貫していた。このことは、ILC2が当該サイトカインを本質的に生成するという概念を支持している。IL−13生成はより可変的であったが、レベルは、NFκB活性化サイトカイン、特にIL−33およびIL−18に反応して、一貫してより高かった。驚くほどに、ILC2は、IL−12およびIL−18で刺激した場合に、IL−13およびIFN−γを共発現した。このことは、当該細胞が、ILC2の機能的可塑性と一致するサイトカイン発現の雑然としたパターンを有することを実証している。ゆえに、肺由来のILC2は、IL−12+IL−18に反応して、ILC1関連マーカーを発現し得、かつ高いレベルのIFN−γを生成し得る。
IL−12およびIL−18がインビボでILC1増殖を誘導し得るかを判定するために、IL−12+IL−18、IL−33単独、または3つ全てのサイトカインの組合せの鼻腔内投与後のILC反応を調査した。IL−12p70およびIL−18の、無感作マウスへの局所的共投与は、PBSまたはIL−33処理コントロールと比較して、総肺内在ILCにおけるGATA−3およびST2の発現を有意に減少させ(図3c)、そしてウイルス感染中に観察されたものと同程度であった(図1)。さらに、IL−12+IL−18処理は、IL−18Rα+、T−bet+ILCの発現および数を著しく増大させ、これは、PBS処理またはIL−33処理と比較した場合、劇的に少ないIL−5およびIL−13を、しかし有意に高い量のIFN−γを、イクスビボで生成した(図3d〜図3g)。
IL−33の鼻腔内送達は、肺内のST2+、GATA−3+ILC2の数を有意に増大させ、これは高いレベルのIL−5(図3f)およびIL−13を生成した。興味深いことに、ILC1の割合の著しい増大にも拘らず、IL−12+IL−18(図3c、図3d)に反応して、当該細胞の総数の最小の、それでも有意な増大が観察された(図3e)。しかしながら、IL−12+IL−18と組み合わせたIL−33の投与は、ILC2増殖を犠牲にして、ILC1の総数を劇的に増大させた(図3e)。さらに、Th2サイトカインの生成を誘導するIL−33の能力は、IL−12およびIL−18の存在下で著しく止められ、当該細胞は、かなりの量のIFN−γを生成した(図3g)。当該細胞はまた、IL−5およびIFN−γを共発現し(図3h)、これは、局所的ILC2プールからのIL−18Rα+T−bet+IFN−γ+ILC1の発生と一致している。特に、IL−12またはIL−18いずれかの単独の投与は、GATA−3、T−bet、IL−18Rα、またはIFN−γの発現に及ぼす効果が最小であった。ゆえに、IL−12およびIL−18は、ILC1増殖をインビボで共調節する一方、IL−33は、コンテキスト依存的に作用して、この反応を拡大する。
ST2は、ILC2におけるGATA−3の直接の標的である。ILC1がサイトカイン処理後に局所的ILC2プールから増殖するかを判定するために、ST2 GFP+マウスにおいてこれらの実験を繰り返した。ST2−GFP+対IL−18Rαの発現の比較により、無感作肺においてILCの2つの異なった集団、ST2−GFP+IL−18Rα−ILC2(93.4%)およびST2−GFP−IL−18Rα+ILC1(4.01%)が明らかとなり、これらは、IL−12+IL−18+IL−33処理と同時に劇的に変更されて、IL−18Rαの発現によって判定して、ILC1の頻度が増大した(図3i)。驚くほどに、当該IL−18Rα+細胞はまた、ST2−GFPについて中程度であり(図3i)、元のST2−GFP+ILC2集団のおおよそ50%を表すと推定された。GFP+平均蛍光強度(MFI)のアドホック分析により、サイトカイン処理後のILC2上でのST2発現の、中程度であるが有意な低下が明らかとなった。IL−18Rα+細胞上でのST2−GFP+の発現は、無感作の肺において、ST2−GFP−IL−18Rα+ILC1と比較して低いが、さらに著しく増大した(図3j)。ゆえに、ILC1は、肺内の既存の、真正の(bona fide)ILC1の増殖からではなく、局所的ST2+ILC2プールから出現する。
無感作マウスからソートしたILC2間の遺伝子発現プロフィールの、IL−12+IL−18+IL−33(サイトカイン)処理マウスからソートしたILC2(ST2+IL−18Rα−)およびILC1(ST2−IL−18Rα+)に対する比較により、部分的に重複するが異なった分子パターンが明らかとなった。無感作肺から単離したILC2は、Gata3、Rora、Il4、Il5、Il9、ll13、Penk(プロエンケファリン)、Areg(アンフィレグリン)、Il17rb、およびIl1rI1が挙げられるTh2関連転写産物を発現した。同様に、サイトカイン処理マウス由来のILC2は、多くの当該同遺伝子を上方制御した(図3k)。それに対して、サイトカイン処理動物由来のIL−18Rα+ILC1は、上述のILC2転写産物のより低い発現、ならびにTbx21、Ifng、Il12rb2、Il18r1、Cxcr3、およびCcr5のより高いレベルによって特徴付けられる、変更された、特有の遺伝子発現プロフィールを有するようであった(図3k)。特に、当該細胞は、無感作の肝臓ILC1/肺NK細胞の、サイトカイン拡張ILC2に対する表現型が中程度であった。というのも、Th1関連転写産物は、より高かったが、細胞溶解機能に関連する遺伝子(例えば、Prf1、Gzma、Gzmb、Gzmc)を著しく低いレベルで発現したからである(図3k)。興味深いことに、例えば、Ccr5、Ccl17、およびCx3cr1といったケモカインのレセプタに関する、サイトカイン処理マウス由来のILCのサブセットの差異も観察された一方、Il7ra、Il2r、およびIcosの発現は、ILC2と比較した場合に、活性化ILC1においてより低かった(図3k)。
まとめると、これらのデータは、ILC2可塑性が、分子サイン内のスイッチに関係することを強調しており、これは、フローサイトメトリを介して報告されるプロテオミクス変化と一致している。
実施例4.ILC2は、ウイルス抗原投与中にILC1に直接変換して、炎症の領域内でクラスターを形成する
ILC2が、感染中にILC1に変換され、かつ/またはスイッチする能力を有し得るかを、ILC、NK細胞、および成熟リンパ球を欠くRAG/γc二重ノックアウトマウスを用いて、直接試験した。肺内在ST2HIGH、IL−18Rα−ILC2を、インフルエンザA型感染の12時間前に、IL−33処理GFP+トランスジェニックマウスからFACSソートして、RAG/γc−/−マウス中に静脈内から移入した(図4a)。IL−33拡張GFP+ILC2は、高いレベルのGATA−3サイトカインおよびTh2サイトカインを発現したが、ILC1マーカーはそうではなかった(図4b〜図4f)。このプロトコルを用いて、全てのILCを、GFP発現によって容易に定義可能であると考えられることを確実にした。
ILC2が、感染中にILC1に変換され、かつ/またはスイッチする能力を有し得るかを、ILC、NK細胞、および成熟リンパ球を欠くRAG/γc二重ノックアウトマウスを用いて、直接試験した。肺内在ST2HIGH、IL−18Rα−ILC2を、インフルエンザA型感染の12時間前に、IL−33処理GFP+トランスジェニックマウスからFACSソートして、RAG/γc−/−マウス中に静脈内から移入した(図4a)。IL−33拡張GFP+ILC2は、高いレベルのGATA−3サイトカインおよびTh2サイトカインを発現したが、ILC1マーカーはそうではなかった(図4b〜図4f)。このプロトコルを用いて、全てのILCを、GFP発現によって容易に定義可能であると考えられることを確実にした。
感染への反応は、野生型マウスと比較して、RAG/γc−/−動物において遅延し、かつ致死であった;したがって、生存を長くするために、当該マウスを、感染時に、GFP−脾細胞、ならびに肺由来のNK細胞およびT細胞で(腹膜内で)再構築した。その後、移入したGFP+ILCを、p.i.7日目と10日目に、GATA−3、IL−12Rβ2、およびIL−18Rαの発現が挙げられる表現型プロフィールの変化について分析した。養子移入して直ぐに、GFP+ILCは、レシピエントマウスの肺に浸潤し、フローサイトメトリによって、CD25、CD90、およびST2を発現するLin−GFP+細胞として、無感作動物および感染動物において容易に定義可能だった(図4b)。
さらに、感染に反応して、当該GFP+ILC2は、p.i.7日目までにGATA−3発現を有意に下方制御した(図4c、図4f)。さらに、GATA−3のこの損失は、当該GFP+細胞上でのIL−18RαおよびIL−12Rβ2の顕著な上方制御と相関した(図4d、図4e、図4g、図4h)。また、GFP+ILC2の表現型の同程度の変化が、p.i.10日目に観察された。しかしながら、当該マウスにおける感染に対する反応の遅延に潜在的に起因して、p.i.7日目または10日目のT−bet発現は検出されなかった。注目すべきことに、IL−12+IL−18によるイクスビボ刺激の直後に、GFP+細胞は、p.i.10日目にかなりの量のIFN−γを生成することができた。この変化は、IL−13の下方制御と合致した。
驚くほどに、当該同マウス由来の肺組織の免疫組織化学的(IHC)分析は、肺内で、感染に対する著しいパッチ様反応を明らかにした。移入したGFP+ILCは、ウイルス起因性炎症と特徴的に関連する炎症巣内にクラスターを形成するようであった。倍率が高いほど、ILCは典型的に、非炎症領域に密接する組織の領域においてでさえ、ウイルス複製領域内でクラスターを形成することが明らかとなった。しかしながら、実質組織の非炎症領域におけるGFP+ILCも観察されたが、数は非常に少なく、大部分は孤立していた。二重IHCを用いて、インフルエンザ+上皮細胞によるILCの当該クラスターの共局所性、および炎症を起こした気道に隣接する血管周囲領域を確認した。重要なことに、IHCおよびインサイチュハイブリダイゼーションの組合せは、IL−12およびIL−18のmRNAを発現する脊髄由来細胞が、肺の炎症領域内でGFP+ILCに隣接して頻繁に同定されることを明らかにした。
四重組織化学(Quadruple histochemistry)を、免疫蛍光および発色性IHCの組合せと使用して(実施例9参照)、感染後の肺におけるGATA−3関連ILC発現を調査し、かつ定量化した。デジタル化したスライド画像全体のコンピュータ処理画像解析を用いて、個々の全GFP+ILC(緑色の蛍光)を、組織内で自動的に同定して、青色DAPI(断面あたりの総核含有量についてのDNAマーカー)ならびにその赤色/ピンク色のGATA−3についての免疫染色について、染色強度でスコア化した。
コントロールマウスにおけるGATA−3HIGHILCに、そしてインフルエンザ処理動物由来の非感染領域に、感染領域における典型的なGATA−3LOWILCと比較して、それぞれp.i.5日目および6日目に分析を実行した。最初に、コントロールマウス(PBS処理)対感染マウス由来の肺切片全体におけるILC2関連GATA−3発現を調査した。個々のGFP+細胞の分散ダイヤグラム分析により、明らかに、ウイルス感染肺が、非感染マウスと比較して、有意に多くのGATA−3LOW発現ILCを含有したことが示される(図5a)。全インフルエンザ処理マウスにおける均一な感染の更なる確認の後に、そして核の表示が2D断面細胞領域において異なるので、各GFP+細胞におけるGATA−3発現を、細胞の核DAPI含有量に対して標準化した。ここでも、コントロールと比較した、感染マウスにおけるGATA−3HIGHILC頻度の著しい引き下げが見出された(図5b)。
興味深いことに、インフルエンザ処理マウス由来のILCにおけるGATA−3の時間依存的損失が観察された。なぜなら、GATA−3強度が、p.i.5日目に対して6日目に調査したマウスのGFP+細胞において、さらに縮小したからである(図5a、5b)。FACSデータは、GATA3発現のこの時間経過を確認した。重要なことに、コントロールマウスと感染マウス間のILC関連GATA−3レベルの統計学的に有意な引き下げを、個々のマウス肺切片あたりの平均GFP+GATA−3発現を比較することによって、定量化した(図5c;p.i.5日目由来のデータ)。
最後に、感染の不規則な性質を考えると、GATA−3発現の損失は、評価した肺組織の全体を通して、炎症微環境に特異的であった。ゆえに、四重(インフルエンザ、GFP、GATA−3、およびDAPI)染色切片由来の空間データ(x、y座標)を用いて、肺組織の領域におけるGATA−3発現レベルを、細胞およびウイルスの高密度対低密度と比較する詳細な分析を実行した。肺のパッチ状の細胞高密度領域を、同切片由来のウイルス密度ヒートマップと、そして個々のGFP細胞の空間分布をプロットして、それらのGATA−3強度に従って色分けした画像と、比較した。注目すべきことに、GATA−3LOWILCは、肺の感染領域内で、かなり高頻度であった。それに対して、周囲の、非感染組織領域において見出されるILCは、大部分がGATA−3HIGHであった。
要約すれば、これらのデータは、ILC2が直接、ウイルス抗原投与後にILC1様表現型に変換されて、ウイルス複製と関連する領域に移動することを実証している。これはおそらく、その後の可塑性を決定する局所的炎症誘発キュー、例えばIL−12およびIL−18に対する反応である。
実施例5.T−betは、ILC2のサイレンシングに必ずしも必要でないが、IFN−γの生成に必要とされる
ウイルス抗原投与の後にILC1の維持および/または増殖に果たすT−betの機能的役割があるかを判定するために、T−bet欠損マウスのILC反応を調査した。興味深いことに、T−betは、C57BL/6(WT)マウスと比較した場合に、当該細胞上でのGATA−3およびST2の発現の損失またはIL−12Rβ2およびIL−18Rαの発現の増加に必要とされず、T−betは、ILC1増殖にも必要とされなかった(図6a〜図6f)。しかしながら、感染T−bet−/−動物から単離したILCは、IL−12+IL−18によるイクスビボ刺激の後に、IFN−γを生成する能力が著しく損なわれた(図6g)。さらに、WTマウスおよびT−bet−/−マウス由来のILCは、同様に、GATA−3およびST2を下方制御し、かつIL−12Rβ2鎖およびIL−18Rα鎖を上方制御することによって、IL−12+IL−18の鼻腔内投与に反応した。しかしながら、ウイルス感染研究の場合のように、T−betは、IL−12+IL−18に反応するIFN−γの最大発現に必要とされた。ゆえに、T−betは、Th1型炎症に反応するILC1へのILC2の変換に必ずしも必要でないが、当該細胞におけるIFN−γの最適な生成に不可欠であるようである。
ウイルス抗原投与の後にILC1の維持および/または増殖に果たすT−betの機能的役割があるかを判定するために、T−bet欠損マウスのILC反応を調査した。興味深いことに、T−betは、C57BL/6(WT)マウスと比較した場合に、当該細胞上でのGATA−3およびST2の発現の損失またはIL−12Rβ2およびIL−18Rαの発現の増加に必要とされず、T−betは、ILC1増殖にも必要とされなかった(図6a〜図6f)。しかしながら、感染T−bet−/−動物から単離したILCは、IL−12+IL−18によるイクスビボ刺激の後に、IFN−γを生成する能力が著しく損なわれた(図6g)。さらに、WTマウスおよびT−bet−/−マウス由来のILCは、同様に、GATA−3およびST2を下方制御し、かつIL−12Rβ2鎖およびIL−18Rα鎖を上方制御することによって、IL−12+IL−18の鼻腔内投与に反応した。しかしながら、ウイルス感染研究の場合のように、T−betは、IL−12+IL−18に反応するIFN−γの最大発現に必要とされた。ゆえに、T−betは、Th1型炎症に反応するILC1へのILC2の変換に必ずしも必要でないが、当該細胞におけるIFN−γの最適な生成に不可欠であるようである。
実施例6.ILC1は病原性であり、ウイルス起因性の体重減少および感染に対する炎症反応を劇的に拡大する
次に、感染中のILC2可塑性、およびILC1への特異的表現型スイッチについての生物学的関連性を調査した。しかしながら、ILC特異的表面マーカーの不足を考えると、ILC集団の抗体媒介枯渇の戦略は、限られている。Thy抗原(CD90)に向けられる抗体が、適応性の免疫細胞が全くない動物において、組織内在ILCを枯渇させるのに首尾よく用いられてきた。抗CD90抗体による処理が、肺内在ILCの>90%を枯渇させるという事実が確認された一方、当該抗体が、全身的に、NK細胞の約70%、および肺内在CD90+CD45−CD166+Sca−1+間葉系幹細胞の集団を枯渇させることも見出された。
次に、感染中のILC2可塑性、およびILC1への特異的表現型スイッチについての生物学的関連性を調査した。しかしながら、ILC特異的表面マーカーの不足を考えると、ILC集団の抗体媒介枯渇の戦略は、限られている。Thy抗原(CD90)に向けられる抗体が、適応性の免疫細胞が全くない動物において、組織内在ILCを枯渇させるのに首尾よく用いられてきた。抗CD90抗体による処理が、肺内在ILCの>90%を枯渇させるという事実が確認された一方、当該抗体が、全身的に、NK細胞の約70%、および肺内在CD90+CD45−CD166+Sca−1+間葉系幹細胞の集団を枯渇させることも見出された。
したがって、ILC1の生物学的機能により明確に対処するために、免疫不全マウスにおけるILC1またはILC2の養子移入を実行した(図6h)。肺内在ILC2(ST2+、GATA−3+)およびILC1(IL−18Rα+、T−bet+)を、IL−33またはIL−12+IL−18+IL−33で処理したC57BL/6マウスから単離して、インフルエンザA型感染の24時間前に、C57BL/6RAG/γc欠損マウス中に移入した。驚くほどに、養子ILC1を受け入れた動物は、感染前にILC2で再構築したマウスと比較して、感染に対して有意に大きな体重減少を示した(図6h)。さらに、ILC1の移入は、IFN−γ、IL−12p70、TNFα、IL−1α、およびIL−6が挙げられる、劇的な、増幅された炎症誘発性サイトカインの生成と相関した(図6i)。
この時点でのILC1移入後の細胞炎症の差異は、おそらくRAG/γc欠損マウスにおける感染に対する反応の遅延に起因して、観察されなかった。T−bet/IFN−γがILC1の炎症潜在性に必要とされたかを最終的に試験するために、C57BL/6(WT)マウスおよびT−bet欠損マウスから単離したILC1を用いて、養子移入を繰り返した。先で示すように(図6i)、ILC1移入は、Th1サイトカイン生成の増幅を伴った(図6j);しかしながら、T−bet欠損ILC1は、IFNγ生成が挙げられる、この強化された抗ウイルス反応を促進することができなかった(図6j)。驚くほどに、当該細胞におけるT−betの不在は、肺内で、Th2サイトカイン、すなわちIL−4およびIL−5の生成を、有意にトリガーした(図6k)。
ゆえに、IL−12およびIL−18は、ウイルス起因性炎症を劇的に強化する能力と共にILC1の集団を増殖させる一方、T−betは、当該細胞の完全な炎症潜在性に必要とされる。
実施例7.IL−12は、ヒトILC2の可塑性を誘導する
ヒトILC2が可塑性を実証することができ、かつILC1に分化することができるかを試験するために、Lin−IL−7Rα+CRTH2+CD161+ILC2を、健康なドナーの末梢血からソートして、IL−2+IL−33またはIL−2+IL−12の存在下で5日間培養して、表面マーカーおよびサイトカインアウトプットについて調査した。以前に報告されたように、CRTH2がヒトILC2のマーカーであることが見出されており、そしてIL−2+IL−33中で培養したILC2は、CRTH2+、GATA3+、Tbet−、CD25+、CD161+、およびIL−7Rα+であった(図7a〜図7c)。当該細胞は、高いレベルのIL−13およびIL−4を生成したが、IFN−γの量を有意に低くした(図7d〜図7f)。特に、フレッシュに単離した末梢血ILC2は、IL−33に反応して、IL−5をほとんど生成しなかった。これは、Ohneらの観察と一致している。それに対して、培地へのIL−12の付加により、ILC2中のGATA−3およびCD25のレベルが有意に引き下げられたが、付随して、当該同細胞におけるT−bet発現の劇的な増大を促進し(図7a〜図7c)、マウスILC表現型における観察を補強した。さらに、IL−12に反応して、当該ILC2は、IL−33の存在下でさえ、低いレベルのIL−13およびIL−4を生成した(図7d、図7e)。さらに、IL−12は、ヒトILC2において高いレベルのIFN−γを誘導し、当該レベルは、IL−33の存在下で強化された(図7f)。
ヒトILC2が可塑性を実証することができ、かつILC1に分化することができるかを試験するために、Lin−IL−7Rα+CRTH2+CD161+ILC2を、健康なドナーの末梢血からソートして、IL−2+IL−33またはIL−2+IL−12の存在下で5日間培養して、表面マーカーおよびサイトカインアウトプットについて調査した。以前に報告されたように、CRTH2がヒトILC2のマーカーであることが見出されており、そしてIL−2+IL−33中で培養したILC2は、CRTH2+、GATA3+、Tbet−、CD25+、CD161+、およびIL−7Rα+であった(図7a〜図7c)。当該細胞は、高いレベルのIL−13およびIL−4を生成したが、IFN−γの量を有意に低くした(図7d〜図7f)。特に、フレッシュに単離した末梢血ILC2は、IL−33に反応して、IL−5をほとんど生成しなかった。これは、Ohneらの観察と一致している。それに対して、培地へのIL−12の付加により、ILC2中のGATA−3およびCD25のレベルが有意に引き下げられたが、付随して、当該同細胞におけるT−bet発現の劇的な増大を促進し(図7a〜図7c)、マウスILC表現型における観察を補強した。さらに、IL−12に反応して、当該ILC2は、IL−33の存在下でさえ、低いレベルのIL−13およびIL−4を生成した(図7d、図7e)。さらに、IL−12は、ヒトILC2において高いレベルのIFN−γを誘導し、当該レベルは、IL−33の存在下で強化された(図7f)。
ゆえに、ヒトILC2は、IL−12刺激後にILC1表現型を得ることができ、そして、マウスILC2に類似して、IL−33は、当該細胞によってIFN−γの生成を拡大することができる。
実施例8.COPD患者が、疾患重篤度と相関するILC反応を劇的に変更した
COPDの個体は、ウイルス病原体または細菌病原体による感染後に症候の急性的な悪化を経験し、当該増悪は、患者の罹患率および死亡率と相関する。本発明のために開発して利用したCOPDのマウスモデルにより、ウイルス感染、細菌感染、またはタバコ煙のみへの曝露の後に、肺内在ILC集団の有意な機能的表現型の変化が実証され、当該効果は、煙をウイルス感染と組み合わせた場合に増幅する(図2)。類似の変化がCOPD患者で起こったかを調査するために、COPDGeneコホート由来の安定した患者の末梢血におけるILCサブセットの頻度を調査した。健康なコントロールの末梢血における循環ILCの分析により、循環ILCの約40%が、ILC2マーカーCRTH2、ならびにCD25、IL7Rα、およびGATA−3を発現すること、そして循環ILCの約5%が、ILC1(本明細書でT−betHIと定義する、図8a)であることが明らかとなり、これは以前の報告と一致している。循環している多くのILCが、知られているILC1、ILC2またはILC3のマーカーを発現しないことが見出された。そして、これらが循環ILC前駆体または未発達細胞を表しているかは、不明である。
COPDの個体は、ウイルス病原体または細菌病原体による感染後に症候の急性的な悪化を経験し、当該増悪は、患者の罹患率および死亡率と相関する。本発明のために開発して利用したCOPDのマウスモデルにより、ウイルス感染、細菌感染、またはタバコ煙のみへの曝露の後に、肺内在ILC集団の有意な機能的表現型の変化が実証され、当該効果は、煙をウイルス感染と組み合わせた場合に増幅する(図2)。類似の変化がCOPD患者で起こったかを調査するために、COPDGeneコホート由来の安定した患者の末梢血におけるILCサブセットの頻度を調査した。健康なコントロールの末梢血における循環ILCの分析により、循環ILCの約40%が、ILC2マーカーCRTH2、ならびにCD25、IL7Rα、およびGATA−3を発現すること、そして循環ILCの約5%が、ILC1(本明細書でT−betHIと定義する、図8a)であることが明らかとなり、これは以前の報告と一致している。循環している多くのILCが、知られているILC1、ILC2またはILC3のマーカーを発現しないことが見出された。そして、これらが循環ILC前駆体または未発達細胞を表しているかは、不明である。
COPD患者におけるILC1の頻度は、健康なコントロールと比較した場合、循環系において著しく高いことが観察された(図8a、図8b)。ILC1のこの増大は、循環ILC2細胞の頻度の付随する低下と相関した(図8c)。さらに、より重度の疾患の患者(GOLD III/IV)は、より軽度の疾患(GOLD I/II)の患者と比較した場合、ILC1の頻度が有意に高かった(図8d)。逆に、ILC2比は、より軽度の患者(GOLD II)または健康な喫煙者と比較して、より重度の患者(GOLD III/IV)において著しく低かった(図8e)。マッチした(年齢および喫煙パックイヤー)健康な喫煙者はまた、健康なコントロールと比較して、ILC1比の有意な増大を示したが、健康な喫煙者と比較して、全てのCOPD患者(GOLD I〜IV)において、ILC1の頻度がより高い(明らかな)傾向があった(図8b)。興味深いことに、「健康な喫煙者」群の何人かの個体は、比較的低いFEV1/FVC比(0.73〜0.71)を示した;すなわち、より軽度のCOPD患者において見出される比率(≦0.7)と同程度であり、これは、当該対象の一部において、ILC1の増大の原因であり得る。それでもやはり、%ILC1と肺機能との間には、予測したFEV1%(R=−0.4162、p<0.01)およびFEV1/FVC比(R=−0.4154、p<0.01)によって評価されるように、有意な逆相関があった(図8f)。それに対して、COPD患者の%ILC2は、肺機能パラメータと正相関した。
重要なことに、%ILC1と増悪の平均数との間で有意な線形トレンドが存在し、増悪/年が≧2である患者は、ILC1頻度が最も高く、かつILC2頻度が最も低かった(図8g、図8h)。%ILC1対%ILC2と、疾患関連臨床エンドポイントとの相互関係と一致して、ILC1対ILC2の比率の強い相関(R=−0.5529、p<0.001)が見出されたので、COPDにおけるILC2の、ILC1への直接変換についての仮説が支持される(図8i)。実際に、ILC1とILC2間の逆相関が一貫して観察された;それでも、ILC1およびILC2の総計は、同じレベルのままであり(42.3±13.1%;平均±SD)、これは、既存のILC集団内の可塑性に起因し得ることを示唆している。
まとめると、これらのデータは、COPDが、循環ILCのプールの著しい変化と関連すること、そしてILC1の頻度の増大が、疾患の重篤度、肺機能、および増悪の頻度と相関することを実証している。
実施例9.材料および方法
マウス
BALB/cマウス(Harlan)、SCIDマウス(Jax)、C57BL/6マウス(Jax)、RAG/SCID欠損マウス(Taconic)、GFPトランスジェニックマウス(C57BL/6−Tg(CAG−EGFP)131Osb/LeySopJ、Jax)を、IACUCによって承認されるプロトコルに従ってMedImmuneにて収容して、処理した。T−bet−/−マウス(Jax)を、施設ガイドラインおよびプロトコルに従って、University of Pennsylvaniaにて収容して維持した。
マウス
BALB/cマウス(Harlan)、SCIDマウス(Jax)、C57BL/6マウス(Jax)、RAG/SCID欠損マウス(Taconic)、GFPトランスジェニックマウス(C57BL/6−Tg(CAG−EGFP)131Osb/LeySopJ、Jax)を、IACUCによって承認されるプロトコルに従ってMedImmuneにて収容して、処理した。T−bet−/−マウス(Jax)を、施設ガイドラインおよびプロトコルに従って、University of Pennsylvaniaにて収容して維持した。
ST2−GFPリポーターマウスの生成
標的構築体を、マウス胚盤胞中に注射した。構築体は、上流の4kbの短いホモロジーアームに続いて、イントロン10内に位置するFRT隣接ピューロマイシン耐性カセットの後に、Il1rl1遺伝子のエキソン11を含有し、そこで終止コドンは欠失しており、そして直ぐ後に、eGFPに融合したT2A自己切断ペプチドの融合配列に続いて、新しい終止コドンが続いた。構築体は、長さ6kbのホモロジーアームで終わった。標的構築体を生じさせるのに用いた全配列は、Ensembl転写産物ENSMUST00000097772(Il1rl1−001)に基づいた。これは、Il1rl1アイソフォームA(Membrane−bound;Uniprot ID:P14719−1)に相当する。Flp媒介組換えの後、ピューロマイシン選択遺伝子が欠失して、標的Il1rl1遺伝子のイントロン10内に、単一のFRT部位に続いて、エキソン11−T2A−eGFP融合配列をそのまま残した。実験に用いた全てのST2−リポーターマウスは、BALB/cバックグラウンド上のヘテロ接合ST2+/GFPであった。同腹仔をコントロールとして用いた。
標的構築体を、マウス胚盤胞中に注射した。構築体は、上流の4kbの短いホモロジーアームに続いて、イントロン10内に位置するFRT隣接ピューロマイシン耐性カセットの後に、Il1rl1遺伝子のエキソン11を含有し、そこで終止コドンは欠失しており、そして直ぐ後に、eGFPに融合したT2A自己切断ペプチドの融合配列に続いて、新しい終止コドンが続いた。構築体は、長さ6kbのホモロジーアームで終わった。標的構築体を生じさせるのに用いた全配列は、Ensembl転写産物ENSMUST00000097772(Il1rl1−001)に基づいた。これは、Il1rl1アイソフォームA(Membrane−bound;Uniprot ID:P14719−1)に相当する。Flp媒介組換えの後、ピューロマイシン選択遺伝子が欠失して、標的Il1rl1遺伝子のイントロン10内に、単一のFRT部位に続いて、エキソン11−T2A−eGFP融合配列をそのまま残した。実験に用いた全てのST2−リポーターマウスは、BALB/cバックグラウンド上のヘテロ接合ST2+/GFPであった。同腹仔をコントロールとして用いた。
煙モデル
タバコ煙に曝露するマウスを、以前に公開されたプロトコルに従って、1日2回、1週あたり5日喫煙させて、図2に指定した時点にて分析した。
タバコ煙に曝露するマウスを、以前に公開されたプロトコルに従って、1日2回、1週あたり5日喫煙させて、図2に指定した時点にて分析した。
細菌およびウイルスの抗原投与モデル
インフルエンザA型の50XTCID50(A/FM/1/47)、50XTCID50 PR8株(双方ともH1N1である)、または106pfuのRSVA2を、マウスに鼻腔内投与した。一部の研究において、インフルエンザA型を、以前に確立されたプロトコルに従う煙曝露の後に投与した。マウスを、図に指定した時点にて分析した。マウスを、107cfuの分類不可能なインフルエンザ菌(Haemophilis influenzae)で鼻腔内処理して、感染後2日目および5日目に分析し、または、105cfuの黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)で処理して、感染後5日目に分析した。
インフルエンザA型の50XTCID50(A/FM/1/47)、50XTCID50 PR8株(双方ともH1N1である)、または106pfuのRSVA2を、マウスに鼻腔内投与した。一部の研究において、インフルエンザA型を、以前に確立されたプロトコルに従う煙曝露の後に投与した。マウスを、図に指定した時点にて分析した。マウスを、107cfuの分類不可能なインフルエンザ菌(Haemophilis influenzae)で鼻腔内処理して、感染後2日目および5日目に分析し、または、105cfuの黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)で処理して、感染後5日目に分析した。
インサイチュILC増殖
インビトロ実験用にILC集団を増殖させるために、BALB/c SCIDマウスを、1日目、3日目、および5日目に、組換えIL−33(社内で生成)、IL−12(eBiosciences)、またはIL−18(R&D)の1μgで鼻腔内処理して、7日目に犠牲にした。ILCを、以下に記載するように、エキソビボ分析用に富化した。ILC2を増殖させるために、IL−33を用いた。ILC1増殖のために、IL−12+IL−18+IL−33を用いた。
インビトロ実験用にILC集団を増殖させるために、BALB/c SCIDマウスを、1日目、3日目、および5日目に、組換えIL−33(社内で生成)、IL−12(eBiosciences)、またはIL−18(R&D)の1μgで鼻腔内処理して、7日目に犠牲にした。ILCを、以下に記載するように、エキソビボ分析用に富化した。ILC2を増殖させるために、IL−33を用いた。ILC1増殖のために、IL−12+IL−18+IL−33を用いた。
Fluidigm分析
ILC2(CD45+生存可能CD3−CD49b−Lin−CD90+ST2+IL−18Rα−と定義する)を、無感作肺からソートした。ILC2(CD45+生存可能CD3−CD49b−Lin−CD90+ST2+IL−18Rα−)およびILC1(CD45+生存可能CD3−CD49b−Lin−CD90+ST2−IL−18Rα+)を、先に記載したように、IL−12+IL−18+IL−33で処理したマウスの肺からソートした。コントロールについて、NK細胞(CD45+生存可能CD49b+CD3−)を無感作肺からソートして、ILC1を、無感作肝臓からソートした(CD45+生存可能CD3−CD19−NKp46−CD11a+TRAIL+)。RNAを細胞から単離して、qPCRを、Fluidigm Biomark Dynamicアレイを用いて実行して、注目する転写産物用のプローブ(Fluidigm Corp.,South San Francisco,CA)と共にロードした。
ILC2(CD45+生存可能CD3−CD49b−Lin−CD90+ST2+IL−18Rα−と定義する)を、無感作肺からソートした。ILC2(CD45+生存可能CD3−CD49b−Lin−CD90+ST2+IL−18Rα−)およびILC1(CD45+生存可能CD3−CD49b−Lin−CD90+ST2−IL−18Rα+)を、先に記載したように、IL−12+IL−18+IL−33で処理したマウスの肺からソートした。コントロールについて、NK細胞(CD45+生存可能CD49b+CD3−)を無感作肺からソートして、ILC1を、無感作肝臓からソートした(CD45+生存可能CD3−CD19−NKp46−CD11a+TRAIL+)。RNAを細胞から単離して、qPCRを、Fluidigm Biomark Dynamicアレイを用いて実行して、注目する転写産物用のプローブ(Fluidigm Corp.,South San Francisco,CA)と共にロードした。
ILC富化(マウス)
肺をPBSで灌流し、約2cmのピースの小立方体にし、Liberase(商標)およびDNase(双方ともRoche)と共に37℃にて45分間インキュベートしてから、70μmの細胞ストレーナによってマッシュして、完全RPMIで洗浄した。残りの血球を、ACK細胞溶解バッファ(Invitrogen)で溶解して、単細胞懸濁液を、CD3、CD19、B220、CD5、TCRαβ、TCRγδ、CD11c、F4/80、Gr1、Ter119、CD49b、およびCD27に対するビオチン化抗体と共にインキュベートした。次に細胞を、メーカーのプロトコルに従って、抗ビオチンマイクロビーズ(Milltenyi)と共にインキュベートして、枯渇させた。各ILC富化について、枯渇を2回繰り返して、典型的に>95%の純粋なILC集団を産出した。
肺をPBSで灌流し、約2cmのピースの小立方体にし、Liberase(商標)およびDNase(双方ともRoche)と共に37℃にて45分間インキュベートしてから、70μmの細胞ストレーナによってマッシュして、完全RPMIで洗浄した。残りの血球を、ACK細胞溶解バッファ(Invitrogen)で溶解して、単細胞懸濁液を、CD3、CD19、B220、CD5、TCRαβ、TCRγδ、CD11c、F4/80、Gr1、Ter119、CD49b、およびCD27に対するビオチン化抗体と共にインキュベートした。次に細胞を、メーカーのプロトコルに従って、抗ビオチンマイクロビーズ(Milltenyi)と共にインキュベートして、枯渇させた。各ILC富化について、枯渇を2回繰り返して、典型的に>95%の純粋なILC集団を産出した。
インビトロ培養(ヒト)用のILC単離
MedImmune Blood Donorプログラムによって動員した健康なボランティアから採血した。全ボランティアは、インフォームドコンセントを提出した。CPT管(BD)を用いて、メーカーのプロトコルに従って、PBMCを単離した。残りの赤血球を、ACK溶解バッファを用いて溶解した。3〜4人の健康なドナー由来のPBMCをプールして、NK細胞富化キット(StemCell Technologies)を用いて枯渇させた。次に、ILCを、生存可能、CD45+、非T/非B、Lin−、IL−7Rα+、CD161+、CRTH2+細胞として、99%の純度にソートした。
MedImmune Blood Donorプログラムによって動員した健康なボランティアから採血した。全ボランティアは、インフォームドコンセントを提出した。CPT管(BD)を用いて、メーカーのプロトコルに従って、PBMCを単離した。残りの赤血球を、ACK溶解バッファを用いて溶解した。3〜4人の健康なドナー由来のPBMCをプールして、NK細胞富化キット(StemCell Technologies)を用いて枯渇させた。次に、ILCを、生存可能、CD45+、非T/非B、Lin−、IL−7Rα+、CD161+、CRTH2+細胞として、99%の純度にソートした。
ILCのイクスビボ刺激
ILCを、上記のようにマウス肺またはヒト血液から単離して、図において述べるように、IL−2、IL−7、IL−33、IL−12、IL−18、IL−15、またはそれらの組合せで刺激した。全てのサイトカインを、50ng/mLにて用いた。細胞を、フローサイトメトリによって分析して、上清を、MSDまたはELISA(MesoScale Diagnostics)によって、サイトカイン生成についてアッセイした。
ILCを、上記のようにマウス肺またはヒト血液から単離して、図において述べるように、IL−2、IL−7、IL−33、IL−12、IL−18、IL−15、またはそれらの組合せで刺激した。全てのサイトカインを、50ng/mLにて用いた。細胞を、フローサイトメトリによって分析して、上清を、MSDまたはELISA(MesoScale Diagnostics)によって、サイトカイン生成についてアッセイした。
COPDサンプル
血液を、COPDGeneコホートに登録した健康なコントロール、喫煙コントロール、およびCOPD患者から収集した。患者背景を、表1および表2に示す。全ての研究は、National Jewish HealthのIRBによって承認された。
血液を、COPDGeneコホートに登録した健康なコントロール、喫煙コントロール、およびCOPD患者から収集した。患者背景を、表1および表2に示す。全ての研究は、National Jewish HealthのIRBによって承認された。
フローサイトメトリ
マウスILCを、CD3、CD49b、IL−18Rα(eBiosciences)、CD45、CD25、CD90、CD44(Biolegend)、およびST2(MDBiosciences)に対する抗体で染色した。リニイッジカクテルは、TCRαβ、TCRγδ、CD5、CD27、F4/80、CD11c、Gr1、CD19、FCεRI、およびB220(eBiosciences)に対する抗体を含んだ。細胞内抗体は、GATA−3、T−bet、IL−13、IL−5、およびIFN−γ(eBiosciences)を含んだ。Live/dead fixable blue(Invitrogen)を、全てのFACS実験に用いた。ILCの細胞内サイトカイン染色のために、細胞を、示した期間、示したサイトカインと共にインキュベートしてから、2〜4時間、PMA/イオノマイシンおよびブレフェルディンAで刺激してから、表面を染色し、固定し、かつ透過化処理して(FoxP3染色キット、eBiosciences)、細胞内を染色した。
マウスILCを、CD3、CD49b、IL−18Rα(eBiosciences)、CD45、CD25、CD90、CD44(Biolegend)、およびST2(MDBiosciences)に対する抗体で染色した。リニイッジカクテルは、TCRαβ、TCRγδ、CD5、CD27、F4/80、CD11c、Gr1、CD19、FCεRI、およびB220(eBiosciences)に対する抗体を含んだ。細胞内抗体は、GATA−3、T−bet、IL−13、IL−5、およびIFN−γ(eBiosciences)を含んだ。Live/dead fixable blue(Invitrogen)を、全てのFACS実験に用いた。ILCの細胞内サイトカイン染色のために、細胞を、示した期間、示したサイトカインと共にインキュベートしてから、2〜4時間、PMA/イオノマイシンおよびブレフェルディンAで刺激してから、表面を染色し、固定し、かつ透過化処理して(FoxP3染色キット、eBiosciences)、細胞内を染色した。
COPD患者由来のヒトILCの染色(図8)のために、健康な禁煙コントロール、喫煙コントロール、または安定したCOPD患者由来のPBMCを、メーカーのプロトコルに従って、Heparin CP Tube(BD Biosciences)から単離して、CD3およびCD19のマイクロビーズ(Miltenyi)を用いて、T細胞およびB細胞を枯渇させた。全てのドナーを、研究ガイドラインに従って、COPDgeneプールおよび所定のインフォームドコンセントから抽出した。次に、細胞を、CD3、CD19、IL−7Rα、CD161(eBiosciences)、CRTH2、およびCD56(Biolegend)に対する抗体で染色した。リニイッジカクテルは、TCRαβ、TCRγδ、CD34、CD14、CD16、CD1α、CD303α、CD123、FcεR1(eBiosciences)に対する抗体を含む。細胞内抗体は、GATA−3およびT−bet(eBiosciences)を含んだ。Live/dead fixable blue(Invitrogen)を、全てのFACS実験に用いた。全てのサンプルを、LSR II上でランして、FlowJoを用いて分析した。
ILCの養子移入
ILC2移入(図4、図5、および図6)のために、マウスを、2.5μgの組換えIL−33で1日目、3日目、および5日目に鼻腔内処理してILC2を増殖させ、またはIL−12+IL−18+IL−33で鼻腔内処理してILC1を増殖させた。7日目に、CD45+生存可能CD3−CD49b−Lin−CD90+CD44+CD25+ST2+IL−18Rα−細胞を精製して、1〜1.5×105個を、尾静脈注射を介して移入した。ILC2に加えて、2.5〜3×106個の肺由来のT/B/NK細胞を移入した。12時間後に、レシピエントマウスを、先に述べたようにインフルエンザA型に感染させた。分析を、感染後7日目および10日目に行った。BAL中のサイトカインを、感染後2日目に、MSDによって測定した。
ILC2移入(図4、図5、および図6)のために、マウスを、2.5μgの組換えIL−33で1日目、3日目、および5日目に鼻腔内処理してILC2を増殖させ、またはIL−12+IL−18+IL−33で鼻腔内処理してILC1を増殖させた。7日目に、CD45+生存可能CD3−CD49b−Lin−CD90+CD44+CD25+ST2+IL−18Rα−細胞を精製して、1〜1.5×105個を、尾静脈注射を介して移入した。ILC2に加えて、2.5〜3×106個の肺由来のT/B/NK細胞を移入した。12時間後に、レシピエントマウスを、先に述べたようにインフルエンザA型に感染させた。分析を、感染後7日目および10日目に行った。BAL中のサイトカインを、感染後2日目に、MSDによって測定した。
免疫組織化学的手順
GFPポジティブ細胞の同定。
パラフィン包埋肺切片を、熱誘導エピトープ回収(heat induced epitope retrieval;HIER)にかけてから、自動化免疫組織化学ロボット(AutostainerPlus,Dako)において免疫組織化学的に染色した。簡潔に、切片を、EnVision(商標)FLEXペルオキシダーゼブロッキング試薬および無血清タンパク質ブロック(双方ともDako)で順次ブロックしてから、一次ニワトリ抗GFP抗体(Abcam)と共にインキュベートした。次に、切片を、HRPに結合したヤギ抗ニワトリ抗体(Abcam)と共にインキュベートしてから、3,3’−ジアミノベンジジン(DAB)基質−クロモゲン溶液と共にインキュベートして、Mayerのヘマトキシリン(blue nuclei)で対比染色した。最後に、切片を、エタノールシリーズにより脱水して、キシレン中でクリアにして、Pertex(HistoLab)でマウントした。
GFPポジティブ細胞の同定。
パラフィン包埋肺切片を、熱誘導エピトープ回収(heat induced epitope retrieval;HIER)にかけてから、自動化免疫組織化学ロボット(AutostainerPlus,Dako)において免疫組織化学的に染色した。簡潔に、切片を、EnVision(商標)FLEXペルオキシダーゼブロッキング試薬および無血清タンパク質ブロック(双方ともDako)で順次ブロックしてから、一次ニワトリ抗GFP抗体(Abcam)と共にインキュベートした。次に、切片を、HRPに結合したヤギ抗ニワトリ抗体(Abcam)と共にインキュベートしてから、3,3’−ジアミノベンジジン(DAB)基質−クロモゲン溶液と共にインキュベートして、Mayerのヘマトキシリン(blue nuclei)で対比染色した。最後に、切片を、エタノールシリーズにより脱水して、キシレン中でクリアにして、Pertex(HistoLab)でマウントした。
GFPポジティブ細胞およびインフルエンザA型の二重免疫組織化学的染色
GFPおよびインフルエンザA型の免疫反応性を、マウス肺において共視覚化した。簡潔に、HIER処理切片を、ニワトリ抗GFP抗体と共にインキュベートして、HRPに結合したヤギ抗ニワトリ抗体(Abcam)によって検出して、褐色に着色した免疫反応生成物を、ペルオキシダーゼ基質DABを用いて、クロモゲンとして生じさせた。次に、切片を、変性溶液(Biocare Medical)で処理してから、ヤギ抗インフルエンザA型抗体(Abcam)と共にインキュベートした後に、HRP結合ウサギ抗ヤギ抗体(Dako)と共にインキュベートした。最後に、緑色に着色したインフルエンザ免疫反応生成物を、ペルオキシダーゼ基質Vina Green(Biocare Medical)を用いて、クロモゲンとして生じさせた。ヘマトキシリンを、背景染色(blue nuclei)として用いて、組織切片を、キシレン中でクリアにして、Pertexでマウントした。
GFPおよびインフルエンザA型の免疫反応性を、マウス肺において共視覚化した。簡潔に、HIER処理切片を、ニワトリ抗GFP抗体と共にインキュベートして、HRPに結合したヤギ抗ニワトリ抗体(Abcam)によって検出して、褐色に着色した免疫反応生成物を、ペルオキシダーゼ基質DABを用いて、クロモゲンとして生じさせた。次に、切片を、変性溶液(Biocare Medical)で処理してから、ヤギ抗インフルエンザA型抗体(Abcam)と共にインキュベートした後に、HRP結合ウサギ抗ヤギ抗体(Dako)と共にインキュベートした。最後に、緑色に着色したインフルエンザ免疫反応生成物を、ペルオキシダーゼ基質Vina Green(Biocare Medical)を用いて、クロモゲンとして生じさせた。ヘマトキシリンを、背景染色(blue nuclei)として用いて、組織切片を、キシレン中でクリアにして、Pertexでマウントした。
GFP、GATA−3、およびインフルエンザA型の三重免疫組織化学的染色
HIER処理組織切片を、ヤギ抗インフルエンザA型抗体と共にインキュベートしてから、HRP結合ウサギ抗ヤギ抗体と共にインキュベートして、インフルエンザ免疫反応性の部位にて褐色のDABクロモゲンを発現させた。次に、切片を、変性ブロッキング溶液で処理して、ニワトリ抗GFP一次抗体およびウサギ抗GATA3一次抗体(Abcam)と共にインキュベートした。これを続いて、Alexa 488または555にそれぞれ結合したヤギ抗ニワトリ二次抗体およびヤギ抗ウサギ二次抗体(Life Technologies)と共にインキュベートした。最後に、組織を、DNA結合蛍光色素Hoechst(blue nuclei)で処理して、PBS/グリセロールでマウントした。3つのマーカー全てについての免疫反応性を、組み合わせた明視野および落射蛍光デジタルスライドスキャナユニット(Olympus VS120)によってキャプチャしてデジタル化した。
HIER処理組織切片を、ヤギ抗インフルエンザA型抗体と共にインキュベートしてから、HRP結合ウサギ抗ヤギ抗体と共にインキュベートして、インフルエンザ免疫反応性の部位にて褐色のDABクロモゲンを発現させた。次に、切片を、変性ブロッキング溶液で処理して、ニワトリ抗GFP一次抗体およびウサギ抗GATA3一次抗体(Abcam)と共にインキュベートした。これを続いて、Alexa 488または555にそれぞれ結合したヤギ抗ニワトリ二次抗体およびヤギ抗ウサギ二次抗体(Life Technologies)と共にインキュベートした。最後に、組織を、DNA結合蛍光色素Hoechst(blue nuclei)で処理して、PBS/グリセロールでマウントした。3つのマーカー全てについての免疫反応性を、組み合わせた明視野および落射蛍光デジタルスライドスキャナユニット(Olympus VS120)によってキャプチャしてデジタル化した。
インサイチュハイブリダイゼーション(ISH)
IL−12およびIL−18のmRNAを、RNAscope 2.0 FFPEアッセイキットを用いて、メーカーの説明書に従って、視覚化した(Advanced Cell Diagnostics)。簡潔に、組織切片を脱パラフィンして、内在性酵素ブロックと共にインキュベートして、前処理バッファ中で沸騰させて、プロテアーゼで処理してから、Mm−IL12b(319551、ACD)プローブおよびMm−IL18(416731、ACD)プローブを用いて、標的プローブハイブリダイゼーションを行った。ハウスキーピング遺伝子PPIBまたは細菌遺伝子DapBに対するプローブを、それぞれポジティブコントロールおよびネガティブコントロールとして機能させた。次に、標的RNAを増幅させて、DABクロモゲンで検出した。最後に、組織切片を脱水して、Pertexを用いてマウントした。
IL−12およびIL−18のmRNAを、RNAscope 2.0 FFPEアッセイキットを用いて、メーカーの説明書に従って、視覚化した(Advanced Cell Diagnostics)。簡潔に、組織切片を脱パラフィンして、内在性酵素ブロックと共にインキュベートして、前処理バッファ中で沸騰させて、プロテアーゼで処理してから、Mm−IL12b(319551、ACD)プローブおよびMm−IL18(416731、ACD)プローブを用いて、標的プローブハイブリダイゼーションを行った。ハウスキーピング遺伝子PPIBまたは細菌遺伝子DapBに対するプローブを、それぞれポジティブコントロールおよびネガティブコントロールとして機能させた。次に、標的RNAを増幅させて、DABクロモゲンで検出した。最後に、組織切片を脱水して、Pertexを用いてマウントした。
IL−12またはIL−18のmRNAおよびGFPポジティブILCの、組み合わせた視覚化
その後、IL−12またはIL−18のmRNAについてインサイチュハイブリダイゼーションにより先で着色した組織切片を、ニワトリ抗GFP抗体と共にインキュベートしてから、ヤギ抗ニワトリHRPおよびVina Greenクロモゲン発現を用いて検出した。
その後、IL−12またはIL−18のmRNAについてインサイチュハイブリダイゼーションにより先で着色した組織切片を、ニワトリ抗GFP抗体と共にインキュベートしてから、ヤギ抗ニワトリHRPおよびVina Greenクロモゲン発現を用いて検出した。
GFP+細胞におけるGATA−3強度の四重組織化学および定量化
切片を、GFP、GATA−3(それぞれAlexa 488およびAlexa−555による免疫蛍光)、およびインフルエンザ(DABクロモゲンによる明視野視覚化)についての三重免疫組織化学的染色と組み合わせたDNA/核染色(DAPI、Alexa 355)にかけた。全ての染色チャンネルを、組み合わせた蛍光および明視野Olympus VS−120バーチャルスライド顕微鏡によってデジタル化して、各マーカーについて切片全体の1つの高解像度画像を生成した。個々のGFPポジティブ細胞におけるGATA−3免疫染色の強度を、自動化関心領域(ROI)ベース法(ソフトウェアImageJ 1.47v)を用いて測定した。簡潔に、Alexa488の画像で始めて、強度閾値を調整して、ロックして、GFPポジティブ細胞に対応するROIを生じさせるのに用いた。次に、複数のGFP ROIを、対応するAlexa−555画像中にペーストして、各GFPポジティブROIにおけるGATA−3の強度(すなわち、Alexa555平均強度)を測定するのに用いた。同様に、GFP ROIを、Alexa 355画像中にペーストして、同じGFPポジティブROIにおけるDAPIの強度を算出して、核含有量についてGATA−3強度を調整した。インフルエンザ染色のスキャンした明視野画像を用いて、GFP細胞と、GATA−3強度と、局所の継続中の感染との空間関係を視覚化した。
切片を、GFP、GATA−3(それぞれAlexa 488およびAlexa−555による免疫蛍光)、およびインフルエンザ(DABクロモゲンによる明視野視覚化)についての三重免疫組織化学的染色と組み合わせたDNA/核染色(DAPI、Alexa 355)にかけた。全ての染色チャンネルを、組み合わせた蛍光および明視野Olympus VS−120バーチャルスライド顕微鏡によってデジタル化して、各マーカーについて切片全体の1つの高解像度画像を生成した。個々のGFPポジティブ細胞におけるGATA−3免疫染色の強度を、自動化関心領域(ROI)ベース法(ソフトウェアImageJ 1.47v)を用いて測定した。簡潔に、Alexa488の画像で始めて、強度閾値を調整して、ロックして、GFPポジティブ細胞に対応するROIを生じさせるのに用いた。次に、複数のGFP ROIを、対応するAlexa−555画像中にペーストして、各GFPポジティブROIにおけるGATA−3の強度(すなわち、Alexa555平均強度)を測定するのに用いた。同様に、GFP ROIを、Alexa 355画像中にペーストして、同じGFPポジティブROIにおけるDAPIの強度を算出して、核含有量についてGATA−3強度を調整した。インフルエンザ染色のスキャンした明視野画像を用いて、GFP細胞と、GATA−3強度と、局所の継続中の感染との空間関係を視覚化した。
GFP+細胞におけるインフルエンザA型の定量化
切片を、GFPおよびインフルエンザA型についての免疫組織化学的染色にかけて(それぞれ、DABおよびVina Greenによる明視野視覚化)、Olympus VS−120バーチャルスライド顕微鏡によってデジタル化した。インフルエンザA型および総組織領域の総免疫反応性を、コンピュータ処理画像分析(Visiomorph−DP、Denmark)を用いて算出した。インフルエンザA型陽性を、インフルエンザA型免疫反応性を有する、総組織領域の%として算出した。
切片を、GFPおよびインフルエンザA型についての免疫組織化学的染色にかけて(それぞれ、DABおよびVina Greenによる明視野視覚化)、Olympus VS−120バーチャルスライド顕微鏡によってデジタル化した。インフルエンザA型および総組織領域の総免疫反応性を、コンピュータ処理画像分析(Visiomorph−DP、Denmark)を用いて算出した。インフルエンザA型陽性を、インフルエンザA型免疫反応性を有する、総組織領域の%として算出した。
統計分析
COPDサンプル
群内不均一性の分散による一元配置混合効果ANOVAモデルを、連続測定値の比較に用いた。線形対比を用いて、測定値と、1年あたりの平均増悪のレベルとの線形トレンドを試験した。Fisherの正確確率検定を、カテゴリカル測定値の比較に用い、そしてWilcoxon検定を、患者背景表における1年あたりの平均増悪を比較するのに用いた。Pearson相関係数を、2つの連続する測定値間の相関を評価するのに用いた。SAS 9.3を統計分析に用いた。
COPDサンプル
群内不均一性の分散による一元配置混合効果ANOVAモデルを、連続測定値の比較に用いた。線形対比を用いて、測定値と、1年あたりの平均増悪のレベルとの線形トレンドを試験した。Fisherの正確確率検定を、カテゴリカル測定値の比較に用い、そしてWilcoxon検定を、患者背景表における1年あたりの平均増悪を比較するのに用いた。Pearson相関係数を、2つの連続する測定値間の相関を評価するのに用いた。SAS 9.3を統計分析に用いた。
他の全ての分析
GraphPad Prismを用いて、図面の簡単な説明に記載したようにデータを分析して、表した。誤差棒は、平均値の標準誤差を表す。
GraphPad Prismを用いて、図面の簡単な説明に記載したようにデータを分析して、表した。誤差棒は、平均値の標準誤差を表す。
特定の実施形態の上述の記載は、本発明の一般的な性質を完全に明らかにすると考えられるので、本発明の一般的な概念を逸脱しない範囲で、過度の実験なく、当該技術の技術範囲内の知識を用いることによって、そのような特定の実施形態を他のものに容易に修正し、かつ/または種々の用途に適合させることができる。したがって、そのような適合および修正は、本明細書中で提示される教示およびガイダンスに基づいて、開示される実施形態の等価物の意味および範囲の中にあることが意図される。本明細書の専門用語または言い回しが、教示および案内を考慮して当業者によって解釈され得るように、本明細書中の言い回しまたは専門用語は、限定ではなく説明を目的としていると理解されるべきである。本発明は、以下の特許請求の範囲によってさらに説明される。
Claims (27)
- 自然リンパ球(サブセット2)(ILC2)の、自然リンパ球(サブセット1)(ILC1)への変換を阻害する方法であって、前記ILC2の、T−bet+IFNγ+ILC1へのスイッチを防止し、ILC1におけるIL−12レセプタおよび/もしくはIL−18レセプタの発現レベルを維持もしくは抑制し、かつ/またはILC2におけるST2、CRTH2、および/もしくはGATA3の発現レベルを維持し、もしくは増大させるモジュレータに前記ILC2を接触させることを含む方法。
- 前記モジュレータは、インヒビタまたはアゴニストである、請求項1に記載の方法。
- 前記インヒビタまたは前記アゴニストは、小分子、または抗体もしくはその抗原結合フラグメントである、請求項2に記載の方法。
- 前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、組換え抗体、二重特異的抗体、多重特異的抗体、およびそれらの抗原結合フラグメントから選択される、請求項3に記載の方法。
- 前記モジュレータは、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、Fv、Fab、F(ab’)2、Fab’、dsFvフラグメント、一本鎖Fv(scFV)、sc(Fv)2、ジスルフィド結合(dsFv)、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、または一本鎖抗体から選択される、請求項5に記載の方法。
- 前記モジュレータと接触する前記ILC2は、肺に、または肺組織に局所化している、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記モジュレータと接触する前記ILC2は、循環ILC2である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 肺炎症を伴う疾患または障害の予防または処置を必要とする対象に、これを施す方法であって、前記対象に疾患修飾性医薬品を投与することを含み、前記対象は、ILC1の所定のレベルと比較して、かつ/または1つもしくは複数のコントロールサンプルにおけるILC1のレベルと比較して、前記対象からとられた1つまたは複数のサンプルにおけるILC1のレベルが高いと判定される、方法。
- 肺炎症を伴う疾患または障害の予防または処置を必要とする対象に、これを施す方法であって、前記対象に疾患修飾性医薬品を投与することを含み、前記対象は、ILC1/ILC2の所定の比率と比較して、かつ/または1つもしくは複数のコントロールサンプルにおけるILC1/ILC2の比率と比較して、前記対象からとられた1つまたは複数のサンプルにおけるILC1/ILC2の比率が高いと判定される、方法。
- 肺炎症を伴う疾患または障害の悪化の予防または処置を必要とする対象に、これを施す方法であって、前記対象に疾患修飾性医薬品を投与することを含み、前記対象は、ILC1の所定のレベルと比較して、かつ/または1つもしくは複数のコントロールサンプルにおけるILC1のレベルと比較して、前記対象からとられた1つまたは複数のサンプルにおけるILC1のレベルが高いと判定される、方法。
- 前記肺炎症は、タバコ煙、細菌感染、またはウイルス感染によって引き起こされる、請求項9〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記疾患または前記障害は、慢性閉塞性肺疾患(COPD)である、請求項9〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記悪化は、タバコ煙、細菌感染、またはウイルス感染によって引き起こされる、請求項11に記載の方法。
- 前記肺炎症、または前記疾患もしくは前記障害の前記悪化は、ウイルス感染によって引き起こされる、請求項9〜14のいずれか一項に記載の方法。
- ウイルス複製と関連する領域へのILC1の移動を阻害することをさらに含む、請求項9〜15のいずれか一項に記載の方法。
- 疾患修飾性医薬品による処置の候補としての、肺炎症を伴う疾患または障害と診断される患者を選択する方法であって、前記患者が、ILC1/ILC2の所定の比率と比較して、かつ/または1つもしくは複数のコントロールサンプルにおけるILC1/ILC2の比率と比較して、前記対象からとられた1つまたは複数のサンプルにおけるILC1/ILC2の比率が高いと判定されるならば、前記患者を処置のために選択することを含む、方法。
- 前記疾患修飾性医薬品は、ILC1変換へのILC2のモジュレータである、請求項17に記載の方法。
- 前記疾患修飾性医薬品は、気管支拡張薬、吸入ステロイド、組合せインヘラー、経口ステロイド、またはホスホジエステラーゼ−4インヒビタである、請求項17に記載の方法。
- 前記モジュレータは、インヒビタまたはアゴニストである、請求項17に記載の方法。
- 前記インヒビタまたは前記アゴニストは、小分子化合物、または抗体もしくはその抗原結合フラグメントである、請求項20に記載の方法。
- 前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、組換え抗体、二重特異的抗体、多重特異的抗体、およびそれらの抗原結合フラグメントから選択される、請求項21に記載の方法。
- 前記モジュレータは、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項20〜22のいずれか一項に記載の方法。
- 前記モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、Fv、Fab、F(ab’)2、Fab’、dsFvフラグメント、一本鎖Fv(scFV)、sc(Fv)2、ジスルフィド結合(dsFv)、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、または一本鎖抗体から選択される、請求項23に記載の方法。
- ILC1/ILC2の所定の比率と比較して、かつ/または1つもしくは複数のコントロールサンプルにおけるILC1/ILC2の比率と比較して、前記対象からとられた1つまたは複数のサンプルにおけるILC1/ILC2の比率が高いという前記判定、あるいはILC1の所定のレベルと比較して、かつ/または1つもしくは複数のコントロールサンプルにおけるILC1のレベルと比較して、前記対象からとられた1つまたは複数のサンプルにおけるILC1のレベルが高いという前記判定は、ILC2の分子サインの、ILC1の分子サインへのスイッチの判定に基づく、請求項9〜24のいずれか一項に記載の方法。
- ILC2の前記分子サインは、Gata3、Rora、Il4、Il5、Il9、ll13、Penk(プロエンケファリン)、Areg(アンフィレグリン)、Il17rb、およびIl1rI1からなる群から選択される1つまたは複数のTh2関連転写産物の発現に対応する、請求項25に記載の方法。
- ILC1の前記分子サインは、請求項26に記載の1つまたは複数のTh2関連転写産物のより低い発現、ならびにTbx21、Ifng、Il12rb2、Il18r1、Cxcr3、およびCcr5からなる群から選択される1つまたは複数の転写産物のより高いレベルに対応し、前記レベルは、ILC2の前記転写産物のレベルと比較される、請求項25または26に記載の方法。
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