KR20180135031A - Ilc2의 기능적 소성, 면역성 및 copd - Google Patents
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Abstract
본 발명은 제2형 선천성 림프구 세포(ILC2)의 제1형 선천성 림프구 세포(ILC1)로의 전환을 억제함으로써 폐 염증과 관련된 질병 또는 장애를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
Description
선천성 림프구 세포(ILC)는 병원체에 대한 방어, 상피 장벽 기능의 유지, 공생 미생물의 봉쇄, 조직 복구 및 신진대사 조절을 포함하여 염증에 다양한 역할을 하는 조직-상주하는 선천성 림프구의 최근에 기술된 군집이다(Artis, D. & Spits, H. 선천성 림프구 세포의 생물학. Nature 517, 293-301 (2015); McKenzie, A., Spits, H., & Eberl, G. 염증 및 면역력에 있어서 선천성 림프구 세포. Immunity 41, 366-374 (2014)). 이들 세포의 수가 제한되어 있음에도 불구하고, 이들은 진행중인 면역 반응에 유의한 영향을 미친다. ILC는 기능적으로 분리된 서브셋(ILC1, ILC2 및 ILC3)으로 분류되며, 이는 헬퍼 CD4+ T 세포 계통과 매우 유사하다. CD4+ T 세포 헬퍼 서브셋을 조절하는 많은 전사 인자와 사이토카인 또한 해당 ILC 그룹에서 중요한 역할을 한다. 따라서, T-bet은 ILC1 발달과 기능에 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀진 반면, GATA-3 및 RORγt는 각각 ILC2 및 ILC3 기능에 필수적이다.
ILC는 상이한 표현형 서브셋으로 분류되지만, ILC가 '고정'되지 않고 염증 환경에 따라 이들 세포는 상당한 기능적 소성을 나타내는 것으로 밝혀졌다(Artis et al.; Diefenbach, A., Colonna, M., & Koyasu, S. 선천성 림프구 세포의 발달, 분화 및 다양성. Immunity 41, 354-365 (2014)). 예를 들어, 인간 ILC1은 IL-1β, 레티노 산 및 IL-23과 같은 국소 환경 신호에 반응하여 ILC3으로 분화할 수 있다. ILC3은 IL-12의 존재 하에 ILC1로 분화할 수 있기 때문에, ILC3으로 분화하는 상기 능력은 양방향이다. 게다가, 장내-거주 ILC3는 T-bet과 RORγt를 공동-발현하고, 미생물에 의해 유도된 신호, IL-23, 또는 IL-12+IL-18에 반응하여 IFNγ를 생산하는 것으로 나타났다. 마지막으로, ILC3는 TLR2 리간드에 반응하여 IL-5 및 IL-13을 생성할 수 있어, ILC3가 ILC2로 분화될 수 있음을 시사한다. 그러나, ILC1과 ILC3 서브셋 사이에 입증된 소성에도 불구하고, ILC2가 생리학적으로 관련된 기능적 유연성을 나타내는지 여부는 분명하지 않다. 최근 상이한 ILC 서브셋 사이의 유전자 발현 프로파일을 분석한 보고서에 따르면 ILC2가 다른 서브셋과 가장 동질되고 구별되는 것으로 밝혀졌으며(Robinette, M.L. et al. 전사 프로그램은 선천성 림프구 세포 등급과 서브셋의 분자 특성을 정의한다. Nat Immunol 16, 306-317 (2015)), ILC2는 ILC1 및 ILC3에 비해 대체 표현형을 채택하는 능력이 더 제한적이라는 생각과 일치한다.
만성 폐쇄성 폐 질환(COPD)은 장기간의 담배 연기 노출과 관련된 장애이며, 점진적이고 돌이킬 수 없는 폐 기능의 상실을 특징으로 한다. COPD 환자의 서브셋은 호흡기 감염에 따른 증상의 급성 악화를 경험하며, 이러한 악화는 이환율과 사망률의 중요한 원인이다. 호흡기 병원균 인플루엔자, 호흡기 세포융합 바이러스(RSV), 라이노바이러스(HRV) 및 비피막형 헤모필루스 인플루엔자(non-typeable Haemophilus influenzae)가 COPD-관련 악화의 주요 원인 중 하나이다. COPD는 2030년까지 전 세계적으로 세 번째로 큰 사망 원인이 될 것으로 예상되지만; COPD-관련 유발인자가 폐의 면역 반응에 어떻게 영향을 미치는 지는 거의 알려져 있지 않다. IL-1, IL-18 및 IL-33을 비롯한 다수의 IL-1 계열 구성원 사이토카인이 마우스 모델에서의 연기-관련 염증 및 악화와 관련되어 있다(Kearley, J. et al. 담배 연기는 선천성 림프구 세포 기능을 침묵시키고, 감염에 대한 악화된 타입 I 인터류킨-33-의존성 반응을 촉진시킨다. Immunity 42, 566-579 (2015)). Kearley et al.의 문헌에는 담배 연기가 ST2 수용체 발현의 현저한 재분배와 관련되어 있으며, Th1-편향된 NK 세포 및 대식세포에 대한 Th2-관련 ILC2 반응으로부터, 결과적으로 폐에서 떠나, IL-33 반응성을 변화시킨다는 것이 이전에 보고되었다. 따라서, 폐-상주하는 ILC 군집의 변화는 결과적인 염증 반응의 유형과 크기에 중요한 영향을 줄 수 있다.
비록 희귀하지만 주목할 만한 수의 1형 및 3형 ILC가 있지만, 마우스 폐의 대부분의 ILC는 ILC2이다. 담배 연기 노출은 폐-상주하는 ILC에 의한 Th2 사이토카인의 생성 감소와 관련이 있지만, 이 상황에서 국소 ILC 서브셋 간의 역학 및 발달 관계는 아직 밝혀지지 않았다. 본 발명에서, ILC2는 ILC2의 ILC1로의 분화를 촉진시키는 국소 IL-12 및 IL-18 신호에 의존하는 상당한 기능적 소성을 나타내는 것으로 밝혀졌다.
ILC는 점막 면역의 중요한 중재자이며, 1군과 3군의 ILC 사이의 표현형 소성이 이미 확립되어 있다. 본원에는 상주하는 폐 ILC2도 GATA-3의 손실과 T-Bet+ IFN-γ 생성 ILC1로의 수반되는 전환을 특징으로, 감염 또는 유해 물질에 대한 응답으로 기능 소성을 나타내는 것이 입증되어 있다. Th1 사이토카인, IL-12 및 IL-18은 이러한 전환을 유도하는 반면, 염증 부위 내에서 양자 전달된 GFP+ ILC2 클러스터는 바이러스에 반응하여 ILC1-유사 표현형을 채택한다. 기계적으로, 이 ILC1는 T-bet-의존적 방식으로 바이러스-유발 염증을 현저히 증가시킨다. 특히, IL-12는 인간 ILC2를 T-bet+ IFN-γ 생성 ILC1로 전환시킬 수 있으며, COPD 환자의 ILC1 빈도는 질병의 중증도 및 악화 가능성과 관련이 있다. 종합적으로, 이 데이터는 ILC2의 기능적 소성이 COPD와 같은 호흡기 질환에 악영향을 미칠 수 있는 악화된 항-바이러스성 면역을 유발할 수 있음을 입증한다.
본 발명의 주요 양태 중 일부가 하기에 요약되어 있다. 추가적인 양태는 본 발명의 상세한 설명, 실시예, 도면 및 청구범위 섹션에 기재되어있다. 본 명세서의 각 섹션의 설명은 다른 섹션과 함께 읽도록 되어있다. 또한, 본 발명의 각 섹션에서 설명된 다양한 구현예는 다양한 다른 방식으로 조합될 수 있으며, 이러한 모든 조합은 본 발명의 범주 내에 속한다.
일 양태에서, 본 발명은 선천성 림프구 세포(서브셋 2)(ILC2)를 선천성 림프구 세포(서브셋 1)(ILC1)로 전환시키는 것을 억제하는 방법으로서, ILC2의 T-bet+IFNγ+ILC1로의 전환을 방지하고, ILC1 상에서 IL-12 수용체 또는 IL-18 수용체 발현의 수준을 유지 또는 억제하고, 및/또는 ILC2 상에서 ST2 또는 GATA3 발현의 수준을 유지 또는 증가시키는 조절제와 ILC2를 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에서, 조절제와 접촉된 ILC2는 ILC2의 국소 풀(local pool)일 수 있거나, 폐 또는 폐 조직에 국한될 수 있거나, 또는 순환하는 ILC2일 수 있다. 본 발명의 또 다른 양태에서, ILC1로의 전환이 억제된 ILC2는 순환하는 ILC2일 수 있거나, 또는 다른 조직, 특히 폐 염증성 질환 또는 COPD에 걸리거나 이와 연관될 수 있는 조직에 국한되는 ILC2일 수 있다.
다른 양태에서, 본원은 치료를 필요로 하는 대상체에서 폐 염증과 관련된 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법으로서, 상기 대상체가 ILC1의 미리 결정된 수준과 비교된, 및/또는 하나 이상의 대조군 샘플내 ILC1의 수준과 비교된, 대상체로부터 수득된 하나 이상의 샘플내 ILC1의 상승된 수준을 갖는 것으로 결정되는 방법을 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 또한 치료를 필요로 하는 대상체에서 폐 염증과 관련된 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법으로서, 상기 대상체가 ILC1/ILC2의 미리 결정된 비율과 비교된, 및/또는 하나 이상의 대조군 샘플내 ILC1/ILC2의 비율과 비교된, 상기 대상체로부터 수득된 하나 이상의 샘플내 ILC1/ILC2의 상승된 비율을 갖는 것으로 결정되는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 치료를 필요로 하는 대상체에서 폐 염증과 관련된 질병 또는 장애의 악화를 예방 또는 치료하는 방법으로서, 상기 대상체에게 질병-변경 약제를 투여하는 단계를 포함하며, 상기 대상체가 ILC1의 미리 결정된 수준과 비교된, 및/또는 하나 이상의 대조군 샘플내 ILC1의 수준과 비교된, 상기 대상체로부터 수득된 하나 이상의 샘플내 ILC1의 상승된 수준을 갖는 것으로 결정되는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에서, 폐 염증은 담배 연기, 박테리아 감염 또는 바이러스 감염에 의해 유발될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법에서, 질병 또는 장애는 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD)이다.
본 발명은 또한 질병-변경 약제로 치료하기 위한 후보로서 폐 염증과 관련된 질병 또는 장애로 진단된 환자를 선별하는 방법으로서, 상기 환자가 ILC1/ILC2의 미리 결정된 비율과 비교된, 및/또는 하나 이상의 대조군 샘플내 ILC1/ILC2의 비율과 비교된, 상기 대상체로부터 수득된 하나 이상의 샘플내 ILC1/ILC2의 상승된 비율을 갖는 것으로 결정된다면, 치료를 위한 환자를 선택하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 질병-변경 약제는 ILC2의 ILC1로의 전환의 조절제, 기관지 확장제, 흡입 스테로이드, 조합 흡입제, 경구 스테로이드 또는 포스포디에스테라제-4 억제제이다.
특정 구현예에서, 증가된 비율의 ILC1/ILC2를 갖는다는 결정 또는 증가된 수준의 ILC1을 갖는다는 결정은 ILC2의 분자 표지와 ILC1의 분자 표지 사이의 전환의 결정에 기초한다. 추가의 구현예에서, ILC2의 분자 표지는 Gata3, Rora, Il4, Il5, Il9, ll13, Penk(프로엔케팔린), Areg(암피레굴린), Il17rb 및 Il1rI1로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 Th2-관련 전사체의 발현에 상응한다. 추가의 구현예에서, ILC1의 분자 표지는 Gata3, Rora, Il4, Il5, Il9, ll13, Penk(프로엔케팔린), Areg(암피레굴린), Il17rb 및 Il1rI1로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 Th2-관련 전사체의 저 발현, 및 Tbx21, Ifng, Il12rb2, Il18r1, Cxcr3, 및 Ccr5로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 전사체의 보다 높은 수준에 상응하며, 상기 수준은 ILC2에서 상기 전사체의 수준과 비교된다.
본 발명의 방법에 의해 치료 또는 예방되는 폐 염증은 담배 연기, 박테리아 감염, 바이러스 감염 또는 이들의 조합에 의해 유발될 수 있다. 일 구현예에서, 개시된 방법에 의해 치료 또는 예방되는 질병 또는 장애는 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD)이다.
도 1. 인플루엔자 감염은 폐-상주하는 ILC에서 GATA-3의 하향-조절을 유발한다. (a) CD45+, 생존가능(Viable), CD3-, CD49b-, 계통(Lin) 음성, CD90+로서 유동 세포계측법에 의한 폐-상주하는 ILC의 동정. 계통 마커: TCRαβ, TCRγδ, CD5, CD27, F4/80, Gr1, CD19, B220, FCεRI, CD11c 및 CD11b. (b) 이소타입 대조군(회색 음영)과 비교되는 Lin- CD90+ 폐 ILC(음영없음) 상에서의 ILC-관련 마커의 발현. (c) 나이브 마우스의 폐에서 ILC1, ILC2 및 ILC3의 절대 수치. ILC 서브셋은 각각 T-bet, GATA-3 및 RORγt의 발현에 기초하여 정의된다. (d) ST2-GFP 리포터 마우스의 폐-상주하는 ILC에서 ST2-GFP 발현의 대표적인 FACS. (e) 나이브 마우스 및 인플루엔자 A에 감염된 마우스의 폐-상주하는 ILC에서의 세포내 GATA-3의 대표적인 FACS 및 정량화. (f) 나이브 및 감염된 마우스에서 폐-상주하는 ILC에서의 T1/ST2 및 IL-18Rα 발현의 대표적인 FACS 및 정량화. (g) 나이브 및 감염된 마우스에서 폐-상주하는 ILC에서의 ST2 및 IL-18Rα 발현의 상관 관계. (h) 나이브 및 감염된 마우스에서 폐-상주하는 ILC에서의 IL-12rβ2 발현의 대표적인 FACS 플롯 및 평균 형광 강도(MFI). (i) 감염후(p.i.) 7일째에 나이브 및 감염된 마우스에서 폐-상주하는 ILC의 세포내 T-bet 발현의 대표적인 FACS 플롯 및 정량화. (j) 감염된 마우스에서 감염후(p.i.)7일째에 IL-18Rα 음성 또는 양성 ILC상에서의 세포내 T-bet 발현. (k) 나이브 및 감염된 마우스에서 IL-18Rα를 발현하는 Ki67+ 세포의 백분율. (l) 지시된 바와 같이 자극된 농축된 ILC 배양물로부터의 상층액내 IL-5, IL-13 및 IFN-γ의 수준, 모의-감염된 마우스로부터의 ILC와 비교하여 절대 사이토카인 수준의 변화로서 제시된 데이터. a-c 및 e-i의 데이터는 5개의 독립적인 실험을 대표하며, d의 정량화는 3개의 독립적인 실험으로부터 풀링되고, j는 2개의 독립적인 실험으로부터 풀링되며, l-k는 2개의 독립적인 실험을 대표한다. *p<0.01, **p<0.001, *** p<0.0001. 달리 명시하지 않는 한, 감염된 마우스로부터의 데이터는 7일째에 분석되었다.
도 2. 여러 유발자들은 폐-상주하는 ILC 역학을 극적으로 변경시킨다. (a) 인플루엔자 A(A/FM/1/47), 인플루엔자 A(PR8) 또는 호흡기 세포융합 바이러스(RSV)에 의해 감염된 WT BALB/c 마우스의 폐-상주하는 ILC의 GATA-3 MFI, (b) 스타필로 코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) (c) 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus Influenza). (d-f) 감염 후 5일째에 H. flu에 의해 감염된 마우스 및 나이브로부터의 폐-상주하는 ILC에 대한 IL-18Rα 및 T-bet 발현의 대표적인 FACS 및 MFI 정량화. (g-h) 나이브 실내 공기 대조군 및 지시된 시점에서 담배 연기에 노출된 마우스로부터의 폐-상주하는 ILC에서 GATA-3 발현의 대표적인 FACS 및 MFI. (i-k) 나이브 실내 공기 대조군 및 8주 동안 담배 연기에 노출된 마우스로부터의 폐-상주하는 ILC에 대한 T-bet 및 IL-18Rα 발현의 대표적인 FACS 및 MFI 정량화. (1-m) 나이브 실내 공기 대조군 또는 8주 동안 담배 연기에 노출된 마우스로부터의 폐-상주하는 ILC에 대한 IL-12Rβ2 발현의 대표적인 FACS 및 MFI. a-f의 데이터는 그룹당 n≥5마리의 마우스를 갖는 2~3회의 독립적인 실험을 대표한다. i-m의 데이터는 그룹당 최소 5마리의 마우스를 사용한 3~4회의 독립적인 실험을 대표한다. *p<0.01, **p<0.001, ***p<0.0001.
도 3. (a) 지시된 사이토카인으로 96시간 동안 배양한 마우스 폐 ILC로부터의 IFN-γ 발현을 나타내는 대표적인 유동 세포계측도. (b) ILC 배양물에서의 IFN-γ 수준. PBS, IL-33, IL-12+IL-18 또는 IL-12+IL-18+IL-33를 비강 내 투여한 SCID 마우스로부터의 ILC에 대한 GATA-3(c), 또는 T-bet 및 IL-18Rα(d)의 발현을 나타내는 대표적인 유동 세포계측도. (e) 지시된대로 치료한 마우스의 폐-상주하는 ILC2(원형) 또는 ILC1(사각형) 세포의 수. 특정 치료군 및 지시된 바와 같이 24시간 동안 자극된 마우스의 폐로부터 풍부한 ILC로부터의 상층액내 IL-5(f) 및 IFN-γ(g) 수준. (h) IL-12+IL-18+IL-33으로 처리된 마우스의 폐로부터 풍부한 ILC에서 사이토카인 발현을 나타내는 대표적인 유동 세포계측도. (i) 나이브 한배새끼 대조군 또는 ST2-GFP 리포터 마우스 또는 IL-12+IL-18+IL-33로 처리된 리포터 마우스로부터의 폐-상주하는 ILC상의 ST2-GFP 대 IL-18Rα의 발현의 대표적인 유동 세포계측도. (j) 지시된 바와 같이 처리된 리포터 마우스의 ILC2 또는 ILC1 세포상의 ST2-GFP 발현의 MFI. (k) 나이브 폐(ILC2 및 NK 세포), IL-12+IL-18+IL-33(활성 ILC2 세포(ST2+) 및 활성 ILC1 세포(IL-18Rα+))로 처리된 폐, 또는 나이브 간(ILC1 세포)로부터 세포를 분류하고, 및 선택된 유전자의 qPCR 분석을 히트 맵(heat map)으로서 시각화한다. 데이터는 3(f-g) 또는 4(a-d) 복제물의 평균 또는 평균±S.E.M; 또는 5마리의 마우스/그룹 또는 9마리의 마우스/그룹(PBS 그룹 단독)에 의한 2개의 독립적인 실험(e)로 표시되고; 또는 3마리(나이브) 또는 4마리(사이토카인-처리된)마우스/그룹에 의한 2개의 독립적인 실험(i-j)으로부터 풀링한다. *p<0.01, **p<0.001.
도 4. 양자전달된 ILC2는 인플루엔자 감염 후 ILC1 마커를 상향-조절한다. (a) 전달된 GFP+ILC는 CD25, CD90 및 ST2를 발현하는 Lin-GFP+ 세포로서 유동 세포계측법을 통해 확인할 수 있었다. (b) ST2+IL-18Rα-ILC2는 IL-33로 비강 내 치료된 전체 GFP 리포터 마우스의 폐에서 분류되었다. 12시간 후에 인플루엔자에 감염된 수혜자 RAG/SCID 결핍 마우스에 100,000개의 분류된 ILC2, 3천만개의 비장세포 및 3~4백만 개의 C57BL/6 GFP 음성 폐-유래된 T/NK 세포를 정맥내 전달했다. 감염 후 7일째에 양자전달된 GFP+ILC에 대한 Gata3(c), IL-18Rα(d) 및 IL-12Rβ2(e)의 유동 세포계측법. 감염 후 7일째에 양자전달된 GFP+ILC에 대한 GATA-3(f), IL-18Rα(g) 및 IL-12Rβ2(h)의 MFI. b-h의 데이터는 그룹당 적어도 4마리의 마우스에 의한 3개의 독립적인 실험을 나타낸다.
도 5. 바이러스 복제 및 Th1 사이토카인 생성과 관련된 영역의 ILC2 클러스터. (a) 자동으로 분절된 GFP+세포 마스크(ROI; 방법 참조)에서 DNA 프로브 DAPI(진회색)의 평균 강도로 측정한 개개의 GFP+ 세포 및 GATA-3 및 핵 함유물의 평균 발현의 분산도. (b) 핵 DAPI 함량에 대해 조정된 GATA-3 값에 대한 대조군과 감염된 마우스의 풀링된 GFP+ 세포(y 축)의 빈도를 나타내는 히스토그램. (c) 감염 후 6일째 개별 마우스에서의 ILC GATA-3 발현의 정량화. a-c의 데이터는 조건 당 700-1700개의 총 계수된 세포를 나타낸다.
도 6. ILC1 세포는 T-bet-의존적 방식으로 항-바이러스성 면역력을 증가시킨다. 인플루엔자 PR8로 감염시킨 후 7일째에 C57BL/6 및 Tbx21-/- 마우스의 폐-상주하는 ILC에서 (a-b) GATA-3, (c-d) IL-12Rβ2 및 (e-f) ST2 및 IL-18Rα 발현의 정량화 및 대표적인 유동 세포계측법 플롯. (g) 감염 후 7일째에 풍부한 나이브 및 감염된 C57BL/6 및 Tbx21-/- 마우스로부터의 ILC에서 IFN-γ 발현을 나타내는 대표적인 유동 세포계측도. IL-33 또는 IL-33+IL-12+IL-18로 각각 처리된 마우스로부터 ILC2 및 ILC1 세포를 정제하고, (h) RAG/γc-결핍 마우스로 전이시켰다. 바이러스-유발 체중 감소 및 (i) 사이토카인 처리 마우스(방법 참조)로부터 정제된 ILC2 또는 ILC1 세포로 재구성된 RAG/γC-결핍 마우스에서 감염 후 2일째(j)에 측정된 BAL 사이토카인 발현. (k) 감염 후 2일째에 측정된 C57BL/6 또는 Tbx21-/- 마우스로부터 정제된 ILC1 세포로 재구성된 RAG/γc-결핍 마우스의 BAL 액에서 사이토카인의 발현. a-g의 데이터는 5마리(C57BL/6), 6마리(감염된 Tbx21 -/-) 또는 7마리(나이브 Tbx21 -/-)의 마우스/그룹에 의한 2개의 독립적인 실험을 나타낸다. i-j의 데이터는 4마리(ILC2 재구성된, ILC1 재구성된 대조군) 또는 5마리(ILC1 재구성된 감염된) 마우스/그룹에 의한 2개의 독립적인 실험을 나타낸다. k의 데이터는 7마리의 마우스/그룹에 의한 하나의 실험으로부터의 데이터이다. *p<0.01, **p<0.001.
도 7. IL-12는 GATA-3을 억제하고, 인간 ILC2에서 T-bet 및 IFN-γ를 유도한다. CD45+ 생존 CD3- CD19- Lin- IL-7Rα+ CD161+ CRTH2+로 정의된 ILC2는 정상 인간 공여자의 말초혈액으로부터 분류하고, IL-33, IL-12 또는 IL-33 +IL-12와 함께 5일간 배양하였다. 모든 배양물은 IL-2를 함유하였다. 지시된 조건에서 5일 배양한 후, ILC2 상에서의 (a) GATA-3, (b) T-bet 및 (c) CD25 발현. (d) IL-13, (e) IL-4 및 (f) IFN-γ의 수준을 ELISA에 의해 배양 상등액에서 측정하였다. 데이터는 4개의 독립적인 실험을 대표하고, 세포는 각 실험에 3~4명의 건강한 공여자로부터 풀링되었다.
도 8. COPD 환자는 질병의 중증도와 관련있는 순환 ILC1의 백분율을 증가시킨다. (a) 비-흡연 대조군과 COPD 환자의 말초 혈액내 ILC 상에서의 대표적인 T-bet 및 CRTH2 발현. (b) 건강한 대조군, 흡연 대조군 및 전체 COPD 환자에서의 순환 ILC1의 백분율; ILC1은 T-bet+로 정의됨. (c) 건강한 대조군, 흡연 대조군 및 전체 COPD 환자에서의 순환 ILC2의 백분율; ILC2는 CRTH2+로 정의됨. (d) 순환 ILC1의 백분율 및 (e) GOLD 상태에 의해 계층화된, 건강한 대조군, 흡연 대조군 및 COPD 환자 중 ILC2. (f) ILC1의 백분율과 FEV1% 예측치 사이의 상관관계. 악화 빈도에 의해 계층화된 건강한 대조군, 흡연 대조군 및 COPD 환자 중 (g) 순환 ILC1의 백분율 및 (h) ILC2의 백분율. (i) 건강한 대조군, 흡연 대조군 및 전체 COPD 환자에서의 순환 ILC2와 ILC1의 백분율 간의 상관 관계. 도면내 약어: NS = 비-흡연자; Sm = 흡연자. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.
도 2. 여러 유발자들은 폐-상주하는 ILC 역학을 극적으로 변경시킨다. (a) 인플루엔자 A(A/FM/1/47), 인플루엔자 A(PR8) 또는 호흡기 세포융합 바이러스(RSV)에 의해 감염된 WT BALB/c 마우스의 폐-상주하는 ILC의 GATA-3 MFI, (b) 스타필로 코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) (c) 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus Influenza). (d-f) 감염 후 5일째에 H. flu에 의해 감염된 마우스 및 나이브로부터의 폐-상주하는 ILC에 대한 IL-18Rα 및 T-bet 발현의 대표적인 FACS 및 MFI 정량화. (g-h) 나이브 실내 공기 대조군 및 지시된 시점에서 담배 연기에 노출된 마우스로부터의 폐-상주하는 ILC에서 GATA-3 발현의 대표적인 FACS 및 MFI. (i-k) 나이브 실내 공기 대조군 및 8주 동안 담배 연기에 노출된 마우스로부터의 폐-상주하는 ILC에 대한 T-bet 및 IL-18Rα 발현의 대표적인 FACS 및 MFI 정량화. (1-m) 나이브 실내 공기 대조군 또는 8주 동안 담배 연기에 노출된 마우스로부터의 폐-상주하는 ILC에 대한 IL-12Rβ2 발현의 대표적인 FACS 및 MFI. a-f의 데이터는 그룹당 n≥5마리의 마우스를 갖는 2~3회의 독립적인 실험을 대표한다. i-m의 데이터는 그룹당 최소 5마리의 마우스를 사용한 3~4회의 독립적인 실험을 대표한다. *p<0.01, **p<0.001, ***p<0.0001.
도 3. (a) 지시된 사이토카인으로 96시간 동안 배양한 마우스 폐 ILC로부터의 IFN-γ 발현을 나타내는 대표적인 유동 세포계측도. (b) ILC 배양물에서의 IFN-γ 수준. PBS, IL-33, IL-12+IL-18 또는 IL-12+IL-18+IL-33를 비강 내 투여한 SCID 마우스로부터의 ILC에 대한 GATA-3(c), 또는 T-bet 및 IL-18Rα(d)의 발현을 나타내는 대표적인 유동 세포계측도. (e) 지시된대로 치료한 마우스의 폐-상주하는 ILC2(원형) 또는 ILC1(사각형) 세포의 수. 특정 치료군 및 지시된 바와 같이 24시간 동안 자극된 마우스의 폐로부터 풍부한 ILC로부터의 상층액내 IL-5(f) 및 IFN-γ(g) 수준. (h) IL-12+IL-18+IL-33으로 처리된 마우스의 폐로부터 풍부한 ILC에서 사이토카인 발현을 나타내는 대표적인 유동 세포계측도. (i) 나이브 한배새끼 대조군 또는 ST2-GFP 리포터 마우스 또는 IL-12+IL-18+IL-33로 처리된 리포터 마우스로부터의 폐-상주하는 ILC상의 ST2-GFP 대 IL-18Rα의 발현의 대표적인 유동 세포계측도. (j) 지시된 바와 같이 처리된 리포터 마우스의 ILC2 또는 ILC1 세포상의 ST2-GFP 발현의 MFI. (k) 나이브 폐(ILC2 및 NK 세포), IL-12+IL-18+IL-33(활성 ILC2 세포(ST2+) 및 활성 ILC1 세포(IL-18Rα+))로 처리된 폐, 또는 나이브 간(ILC1 세포)로부터 세포를 분류하고, 및 선택된 유전자의 qPCR 분석을 히트 맵(heat map)으로서 시각화한다. 데이터는 3(f-g) 또는 4(a-d) 복제물의 평균 또는 평균±S.E.M; 또는 5마리의 마우스/그룹 또는 9마리의 마우스/그룹(PBS 그룹 단독)에 의한 2개의 독립적인 실험(e)로 표시되고; 또는 3마리(나이브) 또는 4마리(사이토카인-처리된)마우스/그룹에 의한 2개의 독립적인 실험(i-j)으로부터 풀링한다. *p<0.01, **p<0.001.
도 4. 양자전달된 ILC2는 인플루엔자 감염 후 ILC1 마커를 상향-조절한다. (a) 전달된 GFP+ILC는 CD25, CD90 및 ST2를 발현하는 Lin-GFP+ 세포로서 유동 세포계측법을 통해 확인할 수 있었다. (b) ST2+IL-18Rα-ILC2는 IL-33로 비강 내 치료된 전체 GFP 리포터 마우스의 폐에서 분류되었다. 12시간 후에 인플루엔자에 감염된 수혜자 RAG/SCID 결핍 마우스에 100,000개의 분류된 ILC2, 3천만개의 비장세포 및 3~4백만 개의 C57BL/6 GFP 음성 폐-유래된 T/NK 세포를 정맥내 전달했다. 감염 후 7일째에 양자전달된 GFP+ILC에 대한 Gata3(c), IL-18Rα(d) 및 IL-12Rβ2(e)의 유동 세포계측법. 감염 후 7일째에 양자전달된 GFP+ILC에 대한 GATA-3(f), IL-18Rα(g) 및 IL-12Rβ2(h)의 MFI. b-h의 데이터는 그룹당 적어도 4마리의 마우스에 의한 3개의 독립적인 실험을 나타낸다.
도 5. 바이러스 복제 및 Th1 사이토카인 생성과 관련된 영역의 ILC2 클러스터. (a) 자동으로 분절된 GFP+세포 마스크(ROI; 방법 참조)에서 DNA 프로브 DAPI(진회색)의 평균 강도로 측정한 개개의 GFP+ 세포 및 GATA-3 및 핵 함유물의 평균 발현의 분산도. (b) 핵 DAPI 함량에 대해 조정된 GATA-3 값에 대한 대조군과 감염된 마우스의 풀링된 GFP+ 세포(y 축)의 빈도를 나타내는 히스토그램. (c) 감염 후 6일째 개별 마우스에서의 ILC GATA-3 발현의 정량화. a-c의 데이터는 조건 당 700-1700개의 총 계수된 세포를 나타낸다.
도 6. ILC1 세포는 T-bet-의존적 방식으로 항-바이러스성 면역력을 증가시킨다. 인플루엔자 PR8로 감염시킨 후 7일째에 C57BL/6 및 Tbx21-/- 마우스의 폐-상주하는 ILC에서 (a-b) GATA-3, (c-d) IL-12Rβ2 및 (e-f) ST2 및 IL-18Rα 발현의 정량화 및 대표적인 유동 세포계측법 플롯. (g) 감염 후 7일째에 풍부한 나이브 및 감염된 C57BL/6 및 Tbx21-/- 마우스로부터의 ILC에서 IFN-γ 발현을 나타내는 대표적인 유동 세포계측도. IL-33 또는 IL-33+IL-12+IL-18로 각각 처리된 마우스로부터 ILC2 및 ILC1 세포를 정제하고, (h) RAG/γc-결핍 마우스로 전이시켰다. 바이러스-유발 체중 감소 및 (i) 사이토카인 처리 마우스(방법 참조)로부터 정제된 ILC2 또는 ILC1 세포로 재구성된 RAG/γC-결핍 마우스에서 감염 후 2일째(j)에 측정된 BAL 사이토카인 발현. (k) 감염 후 2일째에 측정된 C57BL/6 또는 Tbx21-/- 마우스로부터 정제된 ILC1 세포로 재구성된 RAG/γc-결핍 마우스의 BAL 액에서 사이토카인의 발현. a-g의 데이터는 5마리(C57BL/6), 6마리(감염된 Tbx21 -/-) 또는 7마리(나이브 Tbx21 -/-)의 마우스/그룹에 의한 2개의 독립적인 실험을 나타낸다. i-j의 데이터는 4마리(ILC2 재구성된, ILC1 재구성된 대조군) 또는 5마리(ILC1 재구성된 감염된) 마우스/그룹에 의한 2개의 독립적인 실험을 나타낸다. k의 데이터는 7마리의 마우스/그룹에 의한 하나의 실험으로부터의 데이터이다. *p<0.01, **p<0.001.
도 7. IL-12는 GATA-3을 억제하고, 인간 ILC2에서 T-bet 및 IFN-γ를 유도한다. CD45+ 생존 CD3- CD19- Lin- IL-7Rα+ CD161+ CRTH2+로 정의된 ILC2는 정상 인간 공여자의 말초혈액으로부터 분류하고, IL-33, IL-12 또는 IL-33 +IL-12와 함께 5일간 배양하였다. 모든 배양물은 IL-2를 함유하였다. 지시된 조건에서 5일 배양한 후, ILC2 상에서의 (a) GATA-3, (b) T-bet 및 (c) CD25 발현. (d) IL-13, (e) IL-4 및 (f) IFN-γ의 수준을 ELISA에 의해 배양 상등액에서 측정하였다. 데이터는 4개의 독립적인 실험을 대표하고, 세포는 각 실험에 3~4명의 건강한 공여자로부터 풀링되었다.
도 8. COPD 환자는 질병의 중증도와 관련있는 순환 ILC1의 백분율을 증가시킨다. (a) 비-흡연 대조군과 COPD 환자의 말초 혈액내 ILC 상에서의 대표적인 T-bet 및 CRTH2 발현. (b) 건강한 대조군, 흡연 대조군 및 전체 COPD 환자에서의 순환 ILC1의 백분율; ILC1은 T-bet+로 정의됨. (c) 건강한 대조군, 흡연 대조군 및 전체 COPD 환자에서의 순환 ILC2의 백분율; ILC2는 CRTH2+로 정의됨. (d) 순환 ILC1의 백분율 및 (e) GOLD 상태에 의해 계층화된, 건강한 대조군, 흡연 대조군 및 COPD 환자 중 ILC2. (f) ILC1의 백분율과 FEV1% 예측치 사이의 상관관계. 악화 빈도에 의해 계층화된 건강한 대조군, 흡연 대조군 및 COPD 환자 중 (g) 순환 ILC1의 백분율 및 (h) ILC2의 백분율. (i) 건강한 대조군, 흡연 대조군 및 전체 COPD 환자에서의 순환 ILC2와 ILC1의 백분율 간의 상관 관계. 도면내 약어: NS = 비-흡연자; Sm = 흡연자. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.
본 발명은 인플루엔자-관련 염증이 GATA-3의 소실 및 Th2-관련 마커의 발현 감소를 특징으로 하는 폐 ILC 군집 내에서 상당한 표현형 변화를 야기하고, IL-18Rα+ T-bet+ ILC1의 뚜렷한 확장과 크게 서로 관련이 있음을 입증한다. 또한, ST2-GFP 리포터 마우스 및 GFP+ILC2의 양자 전달을 이용하여, IL-12 및 IL-18 자극에 반응하여 일어나는, ILC1 확장이 상주하는 폐 ILC2에서의 직접 변환의 결과라는 신규한 증거가 제공된다. 또한 다양한 유발 인자, 특히 COPD의 악화와 관련된 유발인자가 국소 ILC2에서 이러한 소성을 개시한다는 사실이 밝혀졌으며, 여기에는 수많은 바이러스 및 박테리아 감염뿐만 아니라 담배 연기 노출도 포함된다. 특히, ILC2의 기능적 전환을 유발하는 손상의 정도는 이 반응이 폐의 염증 및/또는 손상의 일반적인 특징임을 시사한다.
더욱이, 본 발명은 ILC2 소성이 다단식 과정을 포함한다는 것을 제공한다: 조직 내의 염증 부위로의 ILC2의 이동, GATA-3의 유의적인 손실을 통한 침묵화, 및 이후에 표현형 스위치 및 이들 세포의 기능적 국소 반응을 설명하는 미세환경 큐에의 노출. 본 발명은 GFP+ILC2를 갖는 양자 전달 시스템을 사용하여, 감염후 국소 IL-12 및 IL-18 생산과 관련된 염증 영역 내에서 '침묵된' ILC(즉, GATA-3LOW)가 수렴하고, ILC1 표현형으로 스위칭한다. IL-12+IL-18+IL-33 자극 후의 분자 분석은 신생(emerging) ILC1(즉, 전-ILC2)가 활성화된 ILC2와 부분적으로 중복되지만 별개의 유전자 특성을 공유하기 때문에 ILC2 소성에 대한 이 개념과 일치한다. 이것은 Th2 전사체의 감쇠와, 전-염증 반응과 관련된 Th1-유사 유전자의 뚜렷한 증가를 특징으로 한다. 중요하게는, IL-12+IL-18+IL-33 활성화된 ILC2는 휴식 ILC2와 비교하여, 전사 인자 GATA-3 및 T-bet의 동시 발현을 포함하여 혼합된 Th1/Th2 신호를 나타내며, 이는 폐 ILC2 소성이 국소 미세환경 변화에 대응하여 발생한다는 것을 가리킨다.
흥미롭게도, IL-12 및 IL-18에 대한 수용체의 상향조절은 박테리아 감염 및 담배 연기 노출 동안 ILC 상에서 발생하며, 이러한 사이토카인이 다수의 환경에서 ILC1 전환과 관련됨을 나타낸다. 또한, 이러한 Th1-유사 염증성 사이토카인은 박테리아 감염 및 연기 유발성 염증에 대한 숙주 반응에 필수적인 것으로 나타났다. 따라서, 표현형을 전환하는 ILC2의 능력은 다수의 신호를 필요로 하고, COPD와 같은 폐 질환과 관련된 유발인자를 포함하는 것으로 나타난다.
감염 및 유해 작용제에 대한 폐-상주하는 ILC 군집으로부터의 반응의 현저한 유사성은 이러한 표현형 변화의 기초가 되는 공통적인 메카니즘을 지지한다. IL-12는 최근 인간에서 ILC3 소성의 핵심 조절제로 등장했으며, 데이터는 마우스 및 인간 ILC2의 소성을 직접 유도하는 이 사이토카인의 역할을 나타낸다. 실제로, IL-12는 여기에서 사용된 바이러스 및 박테리아 감염 중에 생성되고, IL-12 및 IL-18의 비강내 투여는 매우 유사한 표현형, 즉 GATA-3의 손실 및 ILC1의 특이한 출현을 초래한다. 또한, 바이러스 감염 동안 외인성 IL-12의 국소 투여는 GATA-3의 손실을 증가시키고, 후속하는 ILC1 확장을 증가시킨다. IL-18Rα 이전의 ILC2에 대한 IL-12Rβ2의 초기 발현과 ST2 및 IL-12Rβ2를 동시 발현하는 ILC2의 존재는 IL-12가 이 세포들에서 초기 침묵화 및 표현형 전환에 기여할 수 있다는 관찰과 일치한다. IL-12에 의해 유도된 주요 다운스트림 효과기 중 하나는 IFN-γ이며, 최근의 보고에 따르면이 사이토카인은 ILC2 반응을 직접 저해할 수 있다고 한다. (Molofsky, A. et al. 인터류킨-33 및 인터페론-γ는 면역교란동안 그룹 2 선천성 림프구 세포 활성화를 역-조절한다. Immunity 43, 161-174 (2015)). 따라서, IL-12-IFN-γ 축은 ILC1에 대한 ILC2 침묵화 및 표현형 전환의 조절에 중요한 요소인 것으로 보인다.
인플루엔자를 비롯한 대부분의 바이러스에 의한 감염은 바이러스 복제 부위와 관련된 조직학적으로 구별되는 염증 부위를 특징으로 하는 폐 질환을 유발한다. 낮은 수의 ILC에도 불구하고, 현재 연구에서 수행된 광범위한 면역조직화학적 이미지 분석 결과, 감염 후 ILC가 조직의 염증 부위에 수렴한다는 것이 밝혀졌다. 본 발명은 폐에서 ILC를 구체적으로 시각화하는 첫 번째 예를 설명하고, 중요하게는 이들 세포가 IL-12 및 IL-18 mRNA를 발현하는 골수-유도 세포에 가까운 인플루엔자-밀집 영역 내에 모이는 것이 데이터로 밝혀졌다. 이러한 세포의 높은 사이토카인 출력뿐만 아니라 ILC의 축적은 미세환경의 사이토카인 농도가 감염 중에 현저하게 증가한다는 것을 의미한다. 실제로 양자 전달된 ILC1은 바이러스 감염에 의해 유발된 TNFα, IL-1β, IL-12p70 및 IFN-γ를 포함하는 Th1-유사 염증성 사이토카인 생성, 및 감염되기 전에 ILC2를 받은 동물과 비교했을때 바이러스에 의한 체중 감소를 유의하게 증폭시켰다.
주목할 만하게도, 폐의 감염 부위와 관련된 ILC는 조직의 감염되지 않은 부위에서 발견된 것보다 GATA-3의 발현이 낮았다. 종합적으로 말하자면, 이러한 데이터는 ILC2가 염증 부위를 접하게 되면 적극적으로 침묵하고 표현형을 국소적으로 전환하고, 대체 매개체를 생성시켜 바이러스 유도성 면역을 증폭시킨다는 것을 입증한다. 본 발명의 광범위한 IHC 이미지 분석은 전체 군집-수준 분석, 즉 총 폐 소화가 조직-상주하는 ILC 표현형의 미세환경 변화를 모호하게 하거나 과소-평가할 수 있기 때문에 국소 변화 조사의 중요성을 강조했다.
장기간의 담배 연기 노출은 COPD의 발병을 초래할 수 있고, 이들 환자의 서브셋에서 악화에 대한 후속 감수성과 관련되어있다. 놀랍게도, 폐렴 면역계가 이 유해 작용제에 어떻게 반응하는지에 대한 이해가 상대적으로 적다. 본 연구에서 제공한 중요한 발견은 연기 노출이 상주하는 폐 ILC2를 ILC1로 전환시켜 만성 흡연자에서 관찰되는 부상 및 염증 악화에 대한 감수성을 잠재적으로 증가시키는 것이다. 기계론적으로, 이러한 데이터는 또한 연기에 노출된 마우스의 폐에서 분리된 ILC2에서 관찰된 침묵 효과에 대한 기본 컨텍스트를 제공하며, 이 경우 생체 외 자극 후 IL-5 및 IL-13의 생산이 현저하게 감소된다. IL-12는 전염성 환경에서 ILC2 소성의 결정적인 조절인자인 것처럼 보이지만, 이 사이토카인은 담배 연기 노출에 반응하여 생산되는 것으로 나타났다. 또한, IL-12에 의해 유도된 ILC2 소성을 증가시키는 두 가지 요소인 IL-18과 IL-33은 실험용 연기 노출동안 COPD 환자에서 현저히 상향-조절되었다. 따라서, IL-12-유도성 호흡기 감염은 이전의 담배 연기 노출과 관련된 상승된 IL-33 및 IL-18과 관련하여 과염증성 ILC1 반응을 유발할 수 있다.
이전의 연구에 따르면, IL-12와 인간 ILC3의 배양은 ILC1 마커의 상향-조절을 초래하는 반면, ILC1은 IL-23, IL-1β 및 레티노산의 존재하에 ILC3으로 분화될 수 있음을 보여 주었다. 본 발명의 데이터는 인간 CRTH2+ ILC2가 GATA-3을 하향-조절하고 T-bet 및 IFN-γ를 상향-조절함으로써 IL-12에 반응한다는 것을 입증한다. 이 세포들 또한 CD25를 잃으며, 이는 IL-18Rα+ 마우스 ILC1에서 CD25 발현의 감소와 일치한다. 또한, 이전의 연구는 인간 ILC2가 IL-12 및/또는 IL-1β+IL-12 자극 후에 ILC1-IFN-γ 생산 세포로 전환할 수 있다는 것을 확인했다. 이제는 모든 인간 ILC 서브셋이 기능적 소성을 나타냄으로써 ILC가 질병 상태에서 표현형을 얼마나 자주 뒤집는 지에 대한 질문을 제기한다.
여기서, 환자가 순환하는 ILC2 및 ILC1의 현저히 변경된 비율을 가졌음을 보여주는 결과가 인간 COPD로 확장되었다. 특히, 순환하는 ILC1의 수가 더 많은 환자는 폐 기능이 악화되고 질병이 더 심해지며, 빈번한 악화에 더 취약한 것으로 나타난다. 따라서, 순환하는 ILC 아형은 이 질병의 국소 ILC 군집을 반영할 수 있다. 마우스의 감염-유발 염증을 극적으로 증폭시킬 수 있는 ILC1의 능력을 감안할 때, COPD 환자의 ILC1 수가 증가하면 악화의 빈도 또는 중증도에 원인이 될 수 있다. 염증이 생긴 마우스 폐에서 ST2+와 IL-18Rα+ ILC 사이의 상관 관계를 나타내는, COPD 환자의 ILC1과 ILC2 사이의 강한 상관 관계는 소성이 이 질환에서 활동적인 과정일 수 있음을 나타낸다. ILC의 표현형적으로 무질서한 특성과 고갈에 대한 알려진 세포-특이적인 표면 마커의 부족을 고려할 때, 소성의 조작을 통해 이러한 세포를 표적으로 하는 것 즉, 과염증성 ILC1를 조직-보호 ILC2로 전환함으로써 COPD 악화의 치료와 관리에 있어서 새로운 치료적 접근방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 실시는 달리 지시되지 않는 한, 세포 생물학, 세포 배양, 분자 생물학, 형질전환 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 및 면역학의 통상적인 기술을 사용할 것이며, 이들은 당 업계의 기술 범위 내에 있다. 이러한 기술은 문헌에서 충분히 설명되어있다. 예를 들어, Ausubel et al. eds. (2015) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons); Greenfield, ed. (2013) Antibodies: A Laboratory Manual (2nd ed., Cold Spring Harbor Press); Green and Sambrook, eds. (2012), Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press); Krebs et al., eds. (2012) Lewin's Genes XI (11th ed., Jones & Bartlett Learning); Freshney (2010) Culture Of Animal Cells (6th ed., Wiley); Weir and Blackwell, eds., (1996) Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (5th ed., Wiley-Blackwell); Borrebaeck, ed. (1995) Antibody Engineering (2nd ed., Oxford Univ. Press); Glover and Hames, eds., (1995) DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (2nd ed., IRL Press); Rees et al., eds. (1993) Protein Engineering: A Practical Approach (1st ed., IRL Press); Mayer and Walker, eds. (1987) Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Academic Press, London); Nisonoff (1984) Introduction to Molecular Immunology (2nd ed., Sinauer Associates, Inc.); and Steward (1984) Antibodies: Their Structure and Function (1st ed., Springer Netherlands)을 참조한다.
본 발명이 보다 쉽게 이해될 수 있도록, 특정 용어가 정의된다. 추가의 정의는 본 명세서 전반에 걸쳐 설명된다. 다르게 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 관련된 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 예를 들어, The Dictionary of Cell and Molecular Biology (5th ed. J.M. Lackie ed., 2013), the Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology (2d ed. R. Cammack et al. eds., 2008), and The Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology (2d ed. P-S. Juo, 2002)는 본원에 사용된 일부 용어의 일반적인 정의를 당업자에게 제공할 수 있다.
정의
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태는 문맥이 달리 명시하지 않는 한, 복수 대상을 포함한다. "하나 이상의" 및 "적어도 하나의"라는 용어뿐만 아니라 단수표현 용어는 서로 바꾸어 사용될 수 있다.
또한, "및/또는"은 두개의 특정된 특징 또는 구성 요소 각각 또는 다른 구성 요소의 특정 개시로서 간주되어야 한다. 따라서, "A 및/또는 B"와 같은 문구에서 사용된 " 및/또는"이라는 용어는 A 및 B, A 또는 B, A(단독), 및 B(단독)를 포함하도록 의도된다. 마찬가지로 "A, B 및/또는 C"와 같은 문구에 사용된 "및/또는"이라는 용어는 A, B 및 C; A, B 또는 C; A 또는 B; A 또는 C; B 또는 C; A 및 B; A 및 C; B 및 C; A(단독); B(단독); 및 C(단독)를 포함하도록 의도된다.
단위, 접두사 및 기호는 Systeme International de Unites(SI) 수락 양식에 표시되어있다. 숫자 범위는 범위를 정의하는 숫자를 포함한다. 본 명세서에 제공된 제목은 본 명세서의 전체를 참조하여 가질 수 있는, 본 발명의 다양한 양태 또는 구현예의 제한이 아니다. 따라서, 제목 바로 아래에 정의된 용어는 명세서 전체를 참조함으로써 더욱 완전하게 정의된다.
구현예들이 "포함하는"이라는 용어로 기술되는 어느 곳에서든지, "구성되는" 및/또는 "본질적으로 이루어진"과 관련하여 설명되는 유사한 구현예가 포함된다.
아미노산은 본원에서 그의 일반적으로 공지된 3-문자 기호 또는 IUPAC-IUB 생화학 명명위원회(IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission)에 의해 권장되는 1-문자 기호로 지칭된다. 마찬가지로, 뉴클레오타이드는 일반적으로 허용되는 단일 문자 코드에 의해 언급된다.
"IL-12"는 인터류킨 12를 지칭한다. IL-12의 활성 형태는 헤테로다이머이고; p35 서브유닛은 IL-12A 유전자에 의해 코딩되고, p40 서브유닛은 IL-12B 유전자에 의해 코딩된다. 인간 및 다른 포유동물 IL-12의 서브유닛 모두에 대한 전장 아미노산 및 뉴클레오타이드 서열은 당 업계에 공지되어있다. IL-12는 I형 사이토카인 수용체에 결합한다. IL-12 수용체(IL-12R)는 β1 및 β2 서브유닛으로 구성된 막관통성 단백질이다. 인간 및 다른 포유동물 IL-12β1 및 IL-12β2에 대한 전장 아미노산 및 뉴클레오타이드 서열은 당 업계에 공지되어있다.
"IL-18"은 인터류킨 18을 지칭하며, IFN-γ 유도 인자라고도 한다. 인간 및 다른 포유동물 IL-18의 전장 아미노산 및 뉴클레오타이드 서열은 당 업계에 공지되어있다. IL-18은 IL-18 수용체 부류 단백질(IL-18RAP) 및 IL-18 수용체 1(IL-18R1) 단백질로 이루어진 이종성 복합체인 IL-18 수용체(IL-18R)에 결합한다. 인간 및 다른 포유동물 IL-18RAP 및 IL-18R1에 대한 전장 아미노산 및 뉴클레오타이드 서열은 당 업계에 공지되어있다.
"억제제"는 다른 분자의 활성을 억제, 차단 또는 저해하는 분자이다. 리간드의 활성은 예를 들어 리간드의 그의 수용체에 대한 결합을 방해하거나, 수용체의 결합-유도된 활성화를 방해함으로써 억제될 수 있다. 억제는 리간드 자체를 차단하거나 그것이 결합하는 수용체를 차단함으로써 달성될 수 있다. 또한, 막관통 수용체의 경우, 가용성 수용체 유도체의 도입은 리간드의 활성을 억제할 수 있다. 가용성 수용체 유도체는 천연의 막관통 수용체와의 리간드 결합을 경쟁하여, 천연 수용체에 대한 리간드 결합으로 인한 세포 활성화 또는 신호 전달을 감소시키거나 제거한다. 억제는 작용적일 수도 있고 길항적일 수도 있다. 억제제는 예를 들어 소분자, 뮤테인 및 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 결합 분자, 억제 RNA, 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드일 수 있다. 본 발명에 사용하기 위한 억제제는 바람직하게는 "특이적"이며, 이는 하나의 표적 또는 구조적으로 관련된 표적 군에 영향을 미친다는 것을 의미한다.
용어 "억제하다", "차단하다" 및 "저해하다"는 상호교환적으로 사용되며, 활성의 완전 차단을 비롯한 생물학적 활성의 임의의 통계적으로 유의한 감소를 지칭한다. 예를 들어, "억제"는 생물학적 활성의 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%의 감소를 의미할 수 있다. 따라서, 예를 들어 신호 전달 경로에 대한 효과를 기술하기 위해 "저해" 또는 "억제"라는 용어가 사용되는 경우, 용어는 처리되지 않은 (대조군) 세포에 대해, 신호- 또는 표적-유도된 세포 발달, 소성 또는 신호 전달을 통계적으로 유의하게 감소시키는 억제제의 능력을 지칭한다. 특정 구현예에서, 예를 들어 유동 세포계측법, 웨스턴 블롯팅, ELISA, 또는 당업자들에게 공지된 다른 분석법에 의해 측정할 때, 억제제는 표적-반응 세포내 표적-매개된 세포 활성화 또는 신호 전달을 적어도 10%, 또는 적어도 20%, 또는 적어도 30%, 또는 적어도 40%, 또는 적어도 50%, 또는 적어도 60%, 또는 적어도 70%, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 90% 또는 약 100% 억제할 수 있다. "차단" 항체 또는 "길항제" 항체는 그것이 결합하는 항원의 생물학적 활성을 억제하거나 감소시키는 항체이다. 특정 양태에서, 차단 항체 또는 길항제 항체는 항원의 생물학적 활성을 실질적으로 또는 완전히 억제한다. 바람직하게는, 생물학적 활성은 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 심지어 100% 감소된다.
"결합 친화도"는 일반적으로 분자(예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 그의 결합 파트너(예를 들어, 항원) 사이의 비공유 상호작용의 총합의 강도를 지칭한다. 달리 명시하지 않는 한, 본원에 사용된 바와 같이, "결합 친화도"는 결합 쌍의 구성원(예를 들어, 항체 및 항원) 간의 1:1 상호작용을 반영하는 고유한 결합 친화도를 나타낸다. 분자 X의 파트너 Y에 대한 친화도는 일반적으로 해리 상수(KD)로 나타낼 수 있다. 친화도는 본원에 기술된 것들을 포함하여 당 업계에 공지된 통상적인 방법에 의해 측정될 수 있다. 저-친화도 항체는 일반적으로 항원에 천천히 결합하며, 쉽게 해리되는 경향이 있는 반면, 고-친화도 항체는 일반적으로 항원에 더 빨리 결합하고 더 오래 결합하여 있는 경향이 있다.
항원에 대한 항체의 친화도 또는 결합도는 당 업계에 공지된 임의의 적합한 방법, 예를 들어 유동 세포계측법, 효소-결합 면역흡착분석(ELISA) 또는 방사선면역측정법(RIA) 또는 동역학(예를 들어, KINEXA® 또는 BIACORE™ 분석)을 사용하여 실험적으로 측정될 수 있다. 직접 결합 분석법 및 경쟁 결합 분석법 포맷이 쉽게 사용될 수 있다. (예를 들어, Berzofsky et al., "항체-항원 상호작용," In Fundamental Immunology, Paul, W. E., ed., Raven Press: New York, N.Y. (1984); Kuby, Immunology, W. H. Freeman and Company: New York, N.Y. (1992) 참조) 특정 결합 분자-표적 상호작용의 측정된 친화도는 다른 조건(예를 들어, 염 농도, pH, 온도)하에 측정할 경우 달라질 수 있다. 따라서, 친화도 및 다른 표적-결합 매개변수(예를 들어, KD 또는 Kd, Kon, Koff)의 측정은 당 분야에 알려진 바와 같이, 결합 분자(예를 들어, 항체) 및 표적(예를 들어, 항원)의 표준화된 용액, 및 표준화된 완충액에 의해 이루어진다.
용어 "조절제"는 대사 경로로의 변화(예를 들어, 활성 저해, 억제, 자극 또는 증가)를 유발하는 분자 또는 화합물을 지칭한다. "조절제"는 예를 들어 소분자, 폴리펩타이드, 항체, 항원 결합 단편 또는 뮤테인일 수 있다.
"소분자"는 전형적으로 저 분자량, 즉 약 1 킬로달톤 미만의 유기 분자이다. 소분자 억제제는 예를 들어, 통상적인 방법을 사용하여 소분자 라이브러리를 스크리닝함으로써 확인될 수 있다.
"결합 분자"는 결합 분자가 치료제 또는 진단 시약으로서 유용할 정도의 충분한 친화도로 그의 표적에 결합할 수 있는 것이다. 표적에 "특이적으로 결합하는" 결합 분자는 예를 들어 방사선면역분석법(RIA), BIACORE®, KINEXA® 또는 당 업계에 공지된 다른 결합 분석법에 의해 측정했을 때, 결합 분자의 그의 표적에 대한 결합력의 약 10% 미만의 정도로 비 관련 단백질에 결합한다. 특정 구현예에서, 결합 분자는 ≤1 μM, ≤100 nM, ≤10 nM, ≤1 nM, ≤0.1 nM, ≤10 pM, ≤1 pM 또는 ≤0.1 pM의 해리 상수(KD)로 그의 표적에 결합한다. 용어 "결합 분자"는 항체 및 그의 항원-결합 단편을 포함한다. 특정 구현예에서, 결합 분자는 항체가 아닌 폴리펩타이드이다. 단백질 표적에 고친화도로 결합하는 비-항체 폴리펩타이드를 동정하고 생성하는 다양한 방법이 당 업계에 공지되어있다. 예를 들어, Skerra, Curr. Opin. Biotechnol. 18:295-304 (2007), Hosse et al., Protein Science 15:14-27 (2006), Gill et al., Curr. Opin. Biotechnol. 17:653-658 (2006), Nygren, FEBS J. 275:2668-76 (2008), and Skerra, FEBS J. 275:2677-83 (2008)을 참조한다. 특정 구현예에서, 파지 디스플레이 기술은 폴리펩타이드와 같은 결합 분자를 동정 및/또는 생산하는데 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 폴리펩타이드는 단백질 A, 리포칼린, 피브로넥틴 도메인, 안키린 컨센서스 반복 도메인 및 티오레독신으로 구성된 그룹으로부터 선택된 유형의 단백질 골격을 포함한다.
"뮤테인"은 천연 아미노산 서열과 관련하여, 하나 이상의 아미노산 잔기가 상이한 아미노산 잔기에 첨가되거나, 결실되거나, 또는 상이한 아미노산 잔기로 치환되는, 자연 발생 단백질의 유사체이다. 뮤테인은 공지된 합성 방법, 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같이, 부위-지정 돌연변이유발에 의해, 또는 당 업계에 공지된 임의의 다른 적합한 기술에 의해 제조될 수 있다.
용어 "항체"는 면역글로불린 분자의 가변 영역내 적어도 하나의 항원 인식 부위를 통해 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드, 탄수화물, 폴리뉴클레오타이드, 지질 또는 이들의 조합과 같은 표적을 인식하고 이들과 특이적으로 결합하는 면역글로불린 분자를 지칭한다. 본원에서 사용된 용어 "항체"는 항체가 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 다클론 항체; 단일클론 항체; 다중특이적 항체, 예컨대 적어도 2개의 손상되지 않은 항체로부터 생성된 이중특이성 항체; 인간화된 항체; 인간 항체; 키메라 항체; 항체의 항원-결정 부분을 포함하는 융합 단백질; 및 항원 인식 부위를 포함하는 임의의 다른 변형된 면역글로불린 분자를 포함한다. 항체는 α, δ, ε, γ 및 μ로 각각 지칭되는 중쇄 불변 도메인의 아이덴티티에 기초한, 면역글로불린의 임의의 5개의 주요 부류: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM, 또는 이들의 하위부류(이소타입)(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2)일 수 있다. 다른 종류의 면역글로불린은 서로 다른 잘 알려진 서브유닛 구조와 3차원 구조를 가지고 있다. 포유동물 경쇄의 두 종류, 람다와 카파가 있다. 항체는 네이키드이거나, 독소, 방사성 동위원소 등과 같은 다른 분자에 접합될 수 있다.
용어 "항원-결합 단편"은 항체의 상보성 결정 가변 영역을 포함하는 손상되지 않은 항체의 일부분을 지칭한다. 전장 항체의 단편은 항체의 항원-결합 단편일 수 있다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편, 선형 항체, 단일사슬 항체(예를 들어, ScFv) 및 항체 단편으로부터 형성된 다중 특이성 항체가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다.
"단일클론 항체"(mAb)는 단일 항원 결정기 또는 에피토프의 매우 특이적인 인식 및 결합에 관여하는 균질한 항체 군집을 지칭한다. 이것은 전형적으로 상이한 항원 결정기에 대한 상이한 항체를 포함하는 다클론 항체와는 대조적이다. "단일클론"이라는 용어는 온전한 및 전장 단일클론 항체 뿐만 아니라 항체 단편(예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, Fv), 단쇄(scFv) 돌연변이체, 항체 부위를 포함하는 융합 단백질, 및 항원 인식 부위를 포함하는 임의의 다른 변형된 면역글로불린 분자에 적용할 수 있다. 또한, "단일클론 항체"는 하이브리도마, 파지 선별, 재조합 발현 및 형질전환 동물을 포함하지만, 이에 한정되지 않는 임의의 많은 방법으로 제조된 항체를 지칭한다.
용어 "인간화된 항체"는 최소 비-인간(예를 들어, 뮤린) 서열을 함유하도록 조작된, 비-인간(예를 들어, 뮤린) 면역글로불린으로부터 유래된 항체를 지칭한다. 전형적으로, 인간화된 항체는 상보성 결정 영역(CDR)으로부터의 잔기가 원하는 특이성, 친화도, 및 능력을 갖는 비-인간 종(예를 들어, 마우스, 래트, 토끼 또는 햄스터)의 CDR로부터의 잔기로 대체된 인간 면역글로불린이다(Jones et al., 1986, Nature, 321:522-525; Riechmann et al., 1988, Nature, 332:323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science, 239:1534-1536). 일부 예에서, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역(FW) 잔기는 원하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 비-인간 종으로부터의 항체의 상응하는 잔기로 대체된다.
인간화된 항체는 항체 특이성, 친화도 및/또는 능력을 개선하고 최적화하기 위해 Fv 프레임워크 영역 및/또는 치환된 비-인간 잔기 내에서의 추가 잔기의 치환에 의해 추가로 변형될 수 있다. 일반적으로, 인간화된 항체는 비-인간 면역글로불린에 상응하는 CDR 영역의 전체 또는 실질적으로 전체를 함유하는 적어도 하나의, 및 전형적으로는 2개 또는 3개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이지만, FR 영역의 전체 또는 실질적으로 전체는 인간 면역글로불린 컨센서스 서열의 영역이다. 인간화된 항체는 또한 면역글로불린 불변 영역 또는 도메인(Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 인간 면역글로불린의 일부를 포함할 수 있다. 인간화된 항체를 생성시키는데 사용되는 방법의 예는 미국 특허 제5,225,539호 및 제5,639,641호에 기술되어 있다.
용어 "인간 항체"는 당 업계에 공지된 임의의 기술을 사용하여 제조된 인간에 의해 생성된 항체에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 항체 또는 인간에 의해 생성된 항체를 의미한다. 인간 항체의 정의는 적어도 하나의 인간 중쇄 및/또는 경쇄 폴리펩타이드, 예컨대 뮤린 경쇄 및 인간 중쇄 폴리펩타이드를 포함하는 항체를 포함하는 온전한 또는 전장 항체를 포함한다.
용어 "키메라 항체"는 면역글로불린 분자의 아미노산 서열이 둘 이상의 종으로부터 유래된 항체를 의미한다. 전형적으로, 경쇄 및 중쇄의 가변 영역은 원하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 한 종의 포유동물(예를 들어, 마우스, 래트, 토끼 등)로부터 유래된 항체의 가변 영역에 상응하는 반면, 불변 영역은 다른 종(일반적으로 인간)으로부터 유래된 항체의 서열과 상동성이어서 종에서 면역 반응을 유도하는 것을 피한다.
용어 "항체" 또는 "면역글로불린"은 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 전형적인 항체는 디설파이드 결합에 의해 상호 연결된 적어도 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)를 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본원에서는 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, 즉 CH1, CH2 및 CH3으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본원에서 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역(CL)으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인, Cl로 구성된다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포(예를 들어, 효과기 세포) 및 고전 보체 시스템의 제1 성분(C1q)을 포함하는, 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
VH 및 VL 영역은 프레임워크(FW) 영역이라 불리는 더 보존된 영역이 산재된, 상보성-결정 영역(CDR)으로 지칭되는 초 가변성의 영역으로 더욱 세분될 수 있다. 각 사슬 내의 CDR은 FW 영역에 의해 근접하여 함께 유지되고, 다른 사슬로부터의 CDR과 함께 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다. 각각의 VH 및 VL은 FW1, CDR1, FW2, CDR2, FW3, CDR3, FW4 순서로 아미노-말단으로부터 카르복시-말단으로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FW로 구성된다.
CDR을 결정하기 위한 적어도 2개의 기술이 있다: (1) 종간 서열 가변성에 기초한 접근법(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)); 및 (2) 항원-항체 복합체의 결정학적 연구에 기초한 접근법(Al-lazikani et al., J. Molec . Biol . 273:927-948 (1997)). 또한, CDR을 결정하기 위해 상기 2개의 접근법의 조합이 본 기술 분야에서 때때로 사용된다.
Kabat에서와 같은 아미노산 위치 넘버링은 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인(경쇄의 대략 잔기 1-107 및 중쇄의 잔기 1-113)에 사용되는 넘버링 시스템을 나타낸다. 이 넘버링 시스템을 사용하여, 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FW 또는 CDR로의 단축 또는 삽입에 대응하는 더 적은 또는 추가의 아미노산을 함유할 수 있다. 잔기의 Kabat 넘버링은 항체 서열의 상동성 영역에서 "표준" Kabat 넘버링된 서열과의 정렬에 의해 주어진 항체에 대해 결정될 수 있다.
"억제성 RNA"는 RNA 간섭에 의한 유전자 발현을 억제하는 것이다. 억제성 RNA의 예는 마이크로 RNA(miRNA) 및 소형 간섭 RNA(siRNA)를 포함한다. "안티센스 올리고뉴클레오타이드"는 mRNA에 결합하여 그의 번역을 방지하는 핵산 가닥이다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 리보뉴클레오타이드, 디옥시리보뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드 유사체 또는 이들의 조합으로 구성될 수 있다. 억제성 RNA 및 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 고안하고 제조하는 방법은 당 업계에 공지되어있다.
"단리된" 폴리펩타이드, 항체, 결합 분자, 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 세포는 자연계에서는 발견되지 않는 형태이다. 단리된 폴리펩타이드, 항체, 결합 분자, 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 세포는 자연에서 발견되는 형태로 더 이상 존재하지 않는 정도로 정제된 것들을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 폴리펩타이드, 항체, 결합 분자, 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 세포는 실질적으로 순수하다. 본원에서 사용되는 용어 "실질적으로 순수한"은 75% 초과, 바람직하게는 80% 또는 90% 초과, 및 가장 바람직하게는 95% 초과의 순도를 의미한다.
"대상체" 또는 "개체" 또는 "동물" 또는 "환자" 또는 "포유동물"은 진단, 예후 또는 치료가 요구되는 임의의 대상체, 특히 포유동물 대상체를 의미한다. 포유동물 대상체는 예를 들어 인간, 비-인간 영장류, 개, 고양이, 기니아 피그, 토끼, 래트, 마우스, 말, 소, 곰 등을 포함하는, 인간, 가축, 농장 동물, 스포츠 동물 및 동물원 동물을 포함한다.
"약학적 조성물"이란 용어는 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이도록 하는 형태이고, 조성물이 투여되는 대상체에게 허용할 수 없게 독성인 추가 성분을 함유하지 않는 제제를 지칭한다. 이러한 조성물은 무균일 수 있으며, 생리 식염수와 같은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 적합한 약학적 조성물은 완충액(예를 들어 아세테이트, 포스페이트 또는 시트레이트 완충액), 계면활성제(예를 들어, 폴리소르베이트), 안정화제(예를 들어, 인간 알부민), 방부제(예를 들어, 벤질 알코올), 생체이용률을 개선하기 위한 흡수촉진제 및/또는 다른 통상적인 가용화제 또는 분산제 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
본원에 개시된 바와 같은 결합 분자의 "유효량"은 구체적으로 명시된 목적, 예를 들어, 치료 또는 예방 효과를 수행하기에 충분한 양이다. "유효량"은 명시된 목적과 관련하여, 경험적으로 그리고 일상적인 방식으로 결정될 수 있다.
"치료하는" 또는 "치료" 또는 "치료하기 위한" 또는 "완화시키는" 또는 "완화시키기 위한"과 같은 용어는 진단된 병리학적 상태 또는 장애를 치료하고, 감속시키고, 이의 증상을 감소시키고/시키거나 진행을 정지시키는 치료학적 수단을 의미한다. 따라서, 치료가 필요한 대상체는 이미 장애가 있는 대상체를 포함한다. 특정 구현예에서, 환자가 질병 또는 장애와 관련된 증상의 예를 들어, 전체적, 부분적 또는 일시적 경감 또는 제거를 나타내는 경우, 본원에 제공된 방법에 따라 폐 염증과 관련된 질병 또는 장애에 대해 대상체가 성공적으로 "치료"된다.
"예방하다" 또는 "예방"은 표적화된 병리학적 상태 또는 장애의 발병을 예방 및/또는 늦추는 예방적 또는 방지적 조치를 의미한다. 따라서, 예방이 필요한 대상체에는 장애가 있거나 걸리기 쉬운 대상체가 포함된다. 특정 구현예에서, 폐 염증과 관련된 질병 또는 장애는 환자가 일시적으로 또는 영구적으로, 본 발명의 방법에 따르지 않은 환자보다 예를 들어 질병 또는 장애와 관련된 증상이 보다 적거나 또는 덜 심각하거나, 또는 질병 또는 장애와 관련된 증상의 발병이 늦어지는 경우, 본원에서 제공된 방법에 따라 성공적으로 예방된다.
용어 "폴리펩타이드", "펩타이드" 및 "단백질"은 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있으며, 개질된 아미노산을 포함할 수 있고, 비-아미노산은 이를 방해할 수 있다. 상기 용어는 또한 자연적으로 또는 개입에 의해; 예를 들어, 디설파이드 결합, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화 또는 임의의 다른 조작 또는 변형, 예컨대 표지화 성분과의 접합에 의해 변형된 아미노산 중합체를 포함한다. 또한, 정의 내에는 예를 들어, 하나 이상의 아미노산 유사체(예를 들어, 비 천연 아미노산 등을 포함함)뿐만 아니라 당 업계에 공지된 다른 변형물도 포함하는 폴리펩타이드가 포함된다. 특정 구현예에서, 폴리펩타이드는 단일 사슬 또는 관련 사슬로서 발생할 수 있다.
본원에서 사용된 "폴리뉴클레오타이드"는 하나 이상의 "핵산", "핵산 분자" 또는 "핵산 서열"을 포함할 수 있으며, 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 중합체를 지칭하며, DNA 및 RNA를 포함한다. 폴리뉴클레오타이드는 데옥시리보뉴클레오타이드, 리보뉴클레오타이드, 변형된 뉴클레오타이드 또는 염기, 및/또는 이들의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라제에 의해 중합체에 혼입될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 메틸화 뉴클레오타이드 및 그의 유사체와 같은 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 상기 설명은 RNA 및 DNA를 포함하여, 본원에 언급된 모든 폴리뉴클레오타이드에 적용된다.
결합 분자의 제조
단일클론 항체는 Kohler and Milstein Nature 256:495 (1975)에 기술된 것과 같은 하이브리도마 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 하이브리도마 방법을 사용하여, 마우스, 햄스터 또는 다른 적절한 숙주 동물이 면역화되어, 면역화 항원에 특이적으로 결합할 항체의 림프구에 의한 생성을 유도한다. 림프구는 시험관내에서 면역화될 수 있다. 면역화 후, 림프구가 단리되고, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 사용하여 적합한 골수종 세포주와 융합되어, 융합되지 않은 림프구 및 골수종 세포로부터 선택될 수 있는 하이브리도마 세포를 형성한다. 면역침전, 면역블롯팅 또는 시험관내 결합 분석(예를 들어, RIA 또는 ELISA)에 의해 결정된 바와 같이 선택된 항원에 대해 특이적으로 지시된 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마는 표준 방법을 사용하여 시험관내 배양에서(Goding, 단일클론 항체: 원리 및 실험, Academic Press, 1986) 또는 동물에서 복수 종양으로 생체 내에서 증식될 수 있다. 그런 다음 단일클론 항체는 배양배지 또는 복수 액으로부터 정제될 수 있다.
인간 항체는 당 업계에 공지된 다양한 기술을 사용하여 직접 제조될 수 있다. 시험관 내에서 면역화되거나, 또는 표적 항원에 대한 항체를 생산하는 면역화된 개체로부터 단리된, 불멸화된 인간 B 림프구가 생성될 수 있다(예를 들어, Cole et al., 단일클론 항체 및 암 요법, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boemer et al., J. Immunol. 147 (1):86-95 (1991); 및 미국 특허 제5,750,373호 참조).
억제제는 파지 라이브러리로부터 선택될 수 있으며, 여기서 파지 라이브러리는 예를 들어 Vaughan et al.(Nat. Biotechnol ., 14:309-314 (1996)), Sheets et al.(Proc. Nat'l . Acad . Sci . U.S.A . 95:6157-6162(1998)), Hoogenboom et al.(J . Mol. Biol. 227:381 (1991)), 및 Marks et al.(J. Mol. Biol. 222:581 (1991))에 의해 기재된 바와 같이 인간 항체를 발현한다. 항체 파지 라이브러리의 생성 및 사용 기술은 또한 미국 특허 제5,969,108호, 제6,172,197호, 제5,885,793호, 제6,521,404호; 제6,544,731호; 제6,555,313호; 제6,582,915호; 제6,593,081호; 제6,300,064호; 제6,653,068호; 제6,706,484호; 및 제7,264,963호; 및 Rothe et al., J. Mol. Biol. 375:1182-1200 (2007)에 기재되어있다.
친화도 성숙 전략 및 사슬 셔플 전략은 당 업계에 공지되어 있으며, 고친화도 인간 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 생성하기 위해 사용될 수 있다. (Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992) 참조).
일부 구현예에서, 항체는 인간화된 항체 또는 그의 항원-결합 단편일 수 있다. 비-인간 또는 인간 항체를 조작, 인간화 또는 리서페이싱(resurfacing)하는 방법도 또한 사용될 수 있고, 당 업계에 잘 알려져있다. 인간화된, 리서페이싱된 또는 유사하게 조작된 항체는 비-인간, 예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 비-인간 영장류 또는 다른 포유동물인 공급원으로부터의 하나 이상의 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 이러한 비-인간 아미노산 잔기는 종종 "도입" 잔기라고 불리는 잔기로 대체되며, 이는 일반적으로 알려진 인간 서열의 "도입" 변수, 상수 또는 기타 도메인으로부터 취해진다. 상기 도입 서열은 당 업계에 공지된 바와 같이, 면역원성을 감소시키거나 결합, 친화성, 온(on)-비율, 오프(off)-비율, 결합력, 특이성, 반감기 또는 임의의 다른 적합한 특성을 감소, 증진 또는 변형시키는데 사용될 수 있다. 일반적으로, CDR 잔기는 직접적이고, 가장 실질적으로 항원 결합에 영향을 미친다. 따라서, 비-인간 또는 인간 CDR 서열의 일부 또는 전부가 유지되는 반면, 가변 및 불변 영역의 비-인간 서열이 인간 또는 다른 아미노산으로 대체될 수 있다.
항체는 또한 임의적으로 표적 항원 및 다른 유리한 생물학적 성질에 대한 높은 친화성을 보유하여 조작된, 인간화, 리서페이싱, 조작된 또는 인간 항체일 수 있다. 이러한 목표를 달성하기 위해, 인간화된(또는 인간) 또는 조작된 항체 및 리서페이싱된 항체는 친계 서열, 조작된 및 인간화된 서열의 3차원 모델을 사용하여, 친계 서열 및 다양한 개념적 인간화된 및 조작된 생성물을 분석하는 방법에 의해 선택적으로 제조될 수 있다. 3차원 면역글로불린 모델은 일반적으로 이용가능하고, 당업자에게 친숙하다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3차원 입체 구조를 설명하고 표시하는 컴퓨터 프로그램이 이용가능하다. 이들 디스플레이의 검사는 후보 결합 분자 서열의 기능화, 즉 후보 결합 분자가 그의 표적에 결합하는 능력에 영향을 미치는 잔기의 분석에서 잔기의 가능한 역할의 분석을 허용한다. 이러한 방식으로, FW 잔기는 컨센서스 및 도입 서열로부터 선택되고 조합되어, 표적에 대한 증가된 친화도와 같은 원하는 결합 분자 특성이 달성될 수 있다.
항체 또는 그의 항원-결합 단편의 인간화, 리서페이싱 또는 조작은 임의의 공지된 방법, 예컨대 Jones et al., Nature 321:522 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534 (1988), Sims et al., J. Immunol . 151: 2296 (1993); Chothia and Lesk, J. Mol . Biol . 196:901 (1987), Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993), 미국 특허 제5,639,641호, 제5,723,323호; 제5,976,862호; 제5,824,514호; 제5,817,483호; 제5,814,476호; 제5,763,192호; 제5,723,323호; 제5,766,886호; 제5,714,352호; 제6,204,023호; 제6,180,370호; 제5,693,762호; 제5,530,101호; 제5,585,089호; 제5,225,539호; 제4,816,567호; 제7,557,189호; 제7,538,195호; 및 제7,342,110호; 국제 출원 번호 PCT/US98/16280; PCT/US96/18978; PCT/US91/09630; PCT/US91/05939; PCT/US94/01234; PCT/GB89/01334; PCT/GB91/01134; PCT/GB92/01755; 국제 특허 출원 공보 WO90/14443; WO90/14424; WO90/14430; 및 유럽 특허 공개 EP 229246에 기술되지만, 이에 한정되지 않는 방법들을 사용하여 수행될 수 있다.
인간화된 항체 및 이의 항원-결합 단편은 또한 면역화시에 내인성 면역글로불린 생산의 부재하에 인간 항체의 전체 레퍼토리를 생성할 수 있는 인간 면역글로불린 좌위를 함유하는 형질전환 마우스에서 제조될 수 있다. 이 접근법은 미국 특허 제5,545,807호; 제5,545,806호; 제5,569,825호; 제5,625,126호; 제5,633,425호; 및 제5,661,016호에 기재되어있다.
특정 구현예에서, 항체 단편이 다음과 같이 사용된다. 항체 단편의 생산을 위한 다양한 기술이 알려져 있다. 전통적으로 상기 단편은 손상되지 않은 항체의 단백질분해적 소화를 통해 유도된다. 예를 들어, Morimoto et al., J. Biochem. Biophys. Meth. 24:107-117 (1993); Brennan et al., Science, 229:81-83 (1985)를 참조한다. 특정 구현예에서, 항체 단편은 재조합적으로 생산된다. Fab, Fv 및 scFv 항체 단편은 대장균(E. coli) 또는 다른 숙주 세포에서 모두 발현되어 분비될 수 있으므로, 다량의 상기 단편을 생산할 수 있게 된다. 상기 항체 단편은 또한 상기 항체 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 항체 단편은 또한 미국 특허 제5,641,870호에 기재된 선형 항체일 수 있다. 항체 단편의 생산을 위한 다른 기술은 당업자에게 명백할 것이다.
본 발명에 따르면, 주어진 표적에 특이적인 단일-쇄 항체의 생산에 기술을 적용할 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제4,946,778호 참조). 또한, 방법은 Fab 발현 라이브러리의 구조를 위해 채택될 수 있어서(예를 들어, Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989) 참조), 표적에 대한 원하는 특이성을 갖는 단일클론 Fab 단편의 신속하고 효과적인 동정을 가능하게 한다. 항체 단편은 또한 당 업계의 기술에 의해 제조될 수 있으며, 이는 하기를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다: (a) 항체 분자의 펩신 소화에 의해 생성된 F(ab')2 단편; (b) F(ab')2 단편의 디설파이드 브릿지를 감소시킴으로써 생성된 Fab 단편, (c) 항체 분자를 파파인 및 환원제로 처리하여 생성된 Fab 단편, 및 (d) Fv 단편.
치료 방법
담배 연기, 박테리아 감염, 바이러스 감염 또는 이들의 조합에 의해 유발된 COPD 또는 폐 염증과 같은, 폐 염증과 관련된 질병 또는 장애의 치료 또는 예방을 위한 방법이 제공된다. 폐 염증과 관련된 질병 또는 장애는 천식, 낭포성 섬유증, 기관지 확장증 및 염증성 장(IBD) 관련 질병을 포함한다.
본원에 기재된 바와 같이, 본 발명은 현저한 표현형 변화가 COPD 환자 또는 폐 염증과 관련된 질환을 갖는 환자의 폐 ILC 군집 내에서 발생할 수 있음을 입증한다. 본 발명은 COPD 환자 또는 폐 염증성 증상을 갖는 환자들의 폐 ILC 군집이 GATA-3의 상실 및 IL-18Rα+T-bet+ILC1의 현저한 확장과 강한 상관 관계가 있는 Th2-관련 마커의 발현 감소를 특징으로 할 수 있음을 추가로 입증한다. 또한, 본 발명에 따르면 ILC1 확장이 IL-12 및 IL-18 자극에 반응하여 생기는 상주하는 폐 ILC2로부터의 직접 전환에 의해 유발될 수 있다. 또한 다양한 유발인자, 특히 COPD의 악화와 관련된 유발인자가 국소 ILC2에서 이러한 소성을 개시하는 것으로 나타났으며, 여기에는 다수의 바이러스 및 박테리아 감염뿐만 아니라 담배 연기 노출도 포함된다.
이러한 관찰을 고려하여, 선천성 림프구 세포(서브셋 2)(ILC2)를 선천성 림프구 세포(서브셋 1)(ILC1)로 전환시키는 것을 억제하기 위한 방법이 제공되며, 여기서 ILC2는 ILC2의 T-bet+ IFNγ+ ILC1로의 전환을 억제하고, ILC1내 IL-12 수용체 및/또는 IL-18 수용체 발현의 수준을 유지 또는 억제하고, 및/또는 ILC2내 ST2, CRTH2 및/또는 GATA3 발현의 수준을 유지 또는 증가시킨다. ILC2 군집의 ILC1로의 전환 억제는 COPD 또는 근본적인 폐 염증성 질환과 관련된 증상의 악화를 제한하는 치료를 포함하는 예방, 치료를 용이하게 할 수 있다. 또한, ILC1에 대한 ILC2의 상기 억제는 COPD의 진행을 제한하거나, 다른 폐 염증성 증상의 진행을 제한할 수 있다.
환자에게 보다 표적화되거나 강화된 치료 옵션 또는 치료 요법을 제공하기 위해, 증강된 수준의 ILC1 또는 ILC1/ILC2의 증가된 비율을 갖는 것으로 결정된 대상체 또는 환자에 대해 증상의 악화를 제한하는 치료를 포함하는 예방, 치료가 수행되는 추가의 방법이 또한 제공되며, 상기 결정은 조절제 또는 질병-변경 약제를 투여하기 전에, ILC2의 분자 표지와 ILC1의 분자 표지 간의 전환을 확인함으로써 이루어진다.
또한 본 발명에 따르면 본 발명의 ILC2의 분자 표지가 Gata3, Rora, Il4 , Il5, Il9 , ll13 , Penk(프로엔케팔린), Areg(암피레굴린), Il17rb, 및 Il1rI1로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 Th2-관련 전사체의 발현에 상응한다는 것을 제공한다. 본 발명의 ILC1의 분자 표지는 청구항 제26항에 따른 하나 이상의 Th2-관련 전사체의 더 낮은 발현 및 Tbx21, Ifng, Il12rb2, Il18r1, Cxcr3, 및 Ccr5로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 전사체의 더 높은 수준에 상응하며, 상기 수준은 ILC2에서 상기 전사체의 수준과 비교된다.
일 구현예에서, 본원에 기술된 방법은 조절제 또는 질병-변경 약제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 조절제 또는 질병-변경 약제의 투여에 대한 임상 반응은 ELISA, ELISPOT, RIA, 크로마토그래피 등에 의해 검출가능한 변화를 포함하지만, 이에 한정되지 않으며, 자기 공명 영상화(MRI), X-방사선 영상화, 컴퓨터 단층촬영(Computed Tomography, CT) 스캔, 유동 세포계측법 또는 형광-활성화 세포 분류기(FACS) 분석, 조직학, 육안 병리학 및 혈액 화학과 같은 스크리닝 기술을 사용하여 평가될 수 있다. 또한, 조절제 또는 질병-변경 약제로 치료받는 대상체는 질병 또는 장애와 관련된 증상의 개선을 경험할 수 있다.
조절제 또는 질병-변경 약제를 제조하고 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 방법은 당업자에게 공지되어 있거나, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 투여 경로는 예를 들어, 경구, 비경구, 흡입 또는 국소 투여일 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "비경구"는 예를 들어, 정맥 내, 동맥 내, 복강 내, 근육 내, 피하, 직장 및 질 투여를 포함한다. 경구 투여 형태는 예를 들어, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 및 용액을 포함한다. 비강 에어로졸 또는 흡입 투여 형태는 예를 들어, 벤질 알코올 또는 다른 적절한 방부제, 생체이용률을 향상시키는 흡수 촉진제 및/또는 다른 통상적인 가용화제 또는 분산제를 사용하여 식염수 용액으로서 제조될 수 있다.
통상적으로, 적합한 약학적 조성물은 완충액(예를 들어, 아세테이트, 포스페이트 또는 시트레이트 완충액), 임의로 계면활성제(예를 들어, 폴리소르베이트), 임의로 안정화제(예를 들어, 인간 알부민) 등을 포함할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제의 형태 또는 특징은 그것이 조합될 활성 성분의 양, 투여 경로 및 다른 잘 알려진 변수들에 의해 규정될 수 있다. 일 구현예에서, 투여는 예를 들어 흡입 또는 비강내 투여에 의해 기도에 직접적으로 이루어진다.
본원에서 논의된 바와 같이, 조절제 또는 질병-변경 약제는 폐 염증과 관련된 질병 또는 장애의 생체 내 치료를 위한 치료적 유효량으로 투여될 수 있다. 이와 관련하여, 억제제(들)는 활성제의 투여를 용이하게 하고, 안정성을 증진시키도록 제형화될 수 있음을 이해할 것이다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 무독성 멸균 담체, 예컨대 생리 식염수, 무독성 완충제, 방부제 등을 포함할 수 있다. 본원에 개시된 치료 방법에 사용하기에 적합한 제형은 Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (2000)에 기재되어 있다.
상기 조성물은 단일 투여량, 다수 투여량으로 또는 확립된 주입기간 동안 투여될 수 있다. 용량 요법은 또한 최적의 원하는 반응(예를 들어, 치료적 또는 예방적 반응)을 제공하도록 조정될 수 있다. 투여 형태를 제조하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 조절제 또는 질병-변경 약제의 양은 투여 수단, 표적 부위, 환자의 생리학적 상태(즉, 질환의 중증도, 질환의 병력 및 치료를 받는 개체의 연령, 신장, 체중, 건강 및 신체 상태), 치료가 예방적 또는 치료적인지 여부, 투여된 다른 약제 및 환자가 인간 또는 동물인지 여부를 포함하는 많은 상이한 인자에 따라 달라질 것이다. 일반적으로, 환자는 인간이지만 형질전환 포유동물을 포함한 비인간 포유동물도 치료될 수 있다. 투여될 조절제 또는 질병-변경 약제의 양은 본 발명 내용이 제시될 때, 과도한 실험없이 당업자에 의해 용이하게 결정된다. 치료 용량은 안전성 및 효능을 최적화하기 위해 당업자에게 공지된 일상적인 방법을 사용하여 적정될 수 있다.
본 발명은 담배 연기, 박테리아 감염, 바이러스 감염 또는 이들의 조합에 의해 유발된 COPD 또는 폐 염증과 같은, 폐 염증과 관련된 질병 또는 장애를 치료 또는 예방하기 위한 조절제 또는 질병-변경 약제의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한, 담배 연기, 박테리아 감염, 바이러스 감염, 또는 이들의 조합에 의해 야기되는 COPD 또는 폐 염증과 같은, 폐 염증과 관련된 질병 또는 장애를 치료 또는 예방하기 위한 약제의 제조에 있어서 조절제 또는 질병-변경 약제의 용도를 제공한다.
"질병-변경 약제"는 단기-작용 또는 장시간-작용 기관지 확장제를 포함하는 기관지 확장제, 흡입 스테로이드, 조합 흡입기, 경구 스테로이드, 포스포디에스테라제-4 억제제 또는 테오필린일 수 있다.
본원에 인용된 모든 참고 문헌은 그 전체가 본원에 참고로 포함되어 있다. 또한, 본원에 인용되거나 언급된 임의의 제품에 대한 임의의 제조사의 지침 또는 카탈로그는 참조용으로 포함된다. 본 명세서 또는 본 명세서의 교시에 참조로 포함된 문헌들은 본 발명의 실시에 사용될 수 있다. 본 명세서에 참조로 포함된 문헌들은 선행 기술로 인정되지 않는다.
실시예
본 발명의 구현예는 본 발명의 특정 항체의 제조 및 본 발명의 항체를 사용하기 위한 방법을 상세히 기술하는, 이하의 비-제한적인 실시예를 참고로 하여 추가로 정의될 수 있다. 재료 및 방법에 대한 많은 변형이 본 발명의 범주를 벗어나지 않고 실시될 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다.
실시예
1. 폐-상주하는
ILC2가
인플루엔자 감염 후
GATA
-3을
하향조절한다
ILC2는 주요 폐 ILC 군집이며, GATA-3의 발현을 특징으로 한다. 이전에 담배 연기가 상기 세포내 IL-5 및 IL-13 생성을 억제함으로써 폐-상주하는 ILC2 반응을 침묵시키는 것으로 나타났다. 본 발명은 이 변화의 관련성, 및 COPD와 관련된 다른 병원성 자극이 동일하게 작용할 수 있는지 여부를 제공한다.
폐 ILC2는 계통 마커의 발현에 대해 음성이고 CD90, IL-7Rα, CD44, ICOS, GATA-3 및 ST2에 대해 양성(높음)인 비-T/NK 세포 군집으로 정의되었다(도 1a, 1b). 폐-상주하는 면역 세포에 대한 ST2의 발현은 담배 연기 노출에 따라 동적으로 조절된다. 따라서, ST2에 대한 특정 제제가 없고 그 조절을 보다 정확하게 이해할 필요가 있는 경우, ST2-GFP+ 리포터 마우스가 개발되었다. 나이브 폐 발현 T-bet 또는 RORγt(즉, ILC1 및 ILC3 세포)에서 Lin-CD90+ 세포의 작은 군집이 있었지만, 대부분의 ILC는 ST2HI GATA-3HI이었고, 전체 ILC 풀의 약 85~90%를 나타냈다. 이 관찰은 ILC2가 CD90, IL-7Rα, CD44 및 CD25를 발현하는 Lin- ST2-GFP+ 세포로 쉽게 확인될 수 있는 ST2 리포터 마우스(도 1c, 1d)에서 ILC2를 평가할 때 확인되었다.
흥미롭게도, 감염되지 않은 마우스로부터의 ILC2와 비교할 때, 인플루엔자 A에 의한 감염은 GATA-3의 신속하고 극적인 손실(50% 이상)을 초래하였다. 이 손실은 감염 후(p.i.) 48시간이라는 이른 시기에 관찰되었으며, 여전히 감염 후(p.i.)6일째에 증명되었다(도 1e). 또한, GATA-3의 손실은 감염 후 이들 세포에서 ILC2-관련 마커 ST2의 발현이 현저히 감소한 것과 관련이 있었다(도 1f). 혈액, 배액 림프절(dLN) 또는 기관지 폐포 세척액(BAL)에서 유의한 ILC의 검출이 없었기 때문에 이러한 마커의 손실은 ILC2 배출 또는 세포사와 관련이 없었으며; PI 및 Annexin V 염색에 의해 결정된 바와 같이 폐의 ILC는 세포 자멸사인 것으로 보이지 않았다.
바이러스 감염은 IL-12 및 IL-18을 포함하는 전-염증성 사이토카인의 생성과 관련되기 때문에, ILC에서 상기 Th1 관련 매개체에 대한 수용체 발현을 검사하였다. 놀랍게도, ILC2에 대한 ST2의 감소는 IL-18Rα+ILC 군집의 병행 증가와 강하게 관련이 있었다(도 1f, 1g; R = -0.859). 또한 IL-12Rβ2 발현이 ST2의 소실과 상관 관계가 없는 것으로 나타났지만, 감염 후 IL-18Rα+ILC 군집에서 IL-12Rβ2의 유의한 증가가 관찰되었으며(도 1h), 이는 IL-12Rβ2가 이 세포에서 IL-18Rα보다 일찍 나타날 수 있음을 시사한다.
T-bet은 ILC1의 마커이고 Th1 반응의 촉진과 밀접하게 관련되어 있는 IL-12 하류의 전사 인자이다. 따라서, T-bet 발현을 위한 폐-상주하는 ILC를 검사하였고, 감염 후(p.i.) 7일째에 T-bet을 발현하는 ILC의 비율의 증가와 함께 발생한 이들 세포내 GATA-3의 소실이 발견되었다(도 1i). 실제로, 바이러스-유도된 T-bet+ ILC는 모두 폐의 IL-18Rα+ 서브셋 내에 포함되어 있었다(도 1j). IL-18Rα+ T-bet+ ILC는 CD3-, CD49b-, Lin-, CD90+ 및 CD44+로 유지되었지만, 이들은 ST2+ ILC와 비교하여 중간수준의 CD25, IL-7Rα, ICOS 및 c-Kit를 발현하였다.
흥미롭게도, 바이러스 감염 후의 ILC 군집에서의 변화는 이러한 동일한 시점에서 폐의 유의적인 RORγt+ ILC3가 검출되지 않았기 때문에, ILC1-유사 반응에 특이적인 것으로 나타났다. 더욱이, 감염 중 폐에서 증식하는 Ki67+ ILC의 대부분은 IL-18Rα+를 발현하였으며(도 1k), 이는 IL-18Rα가 이들 세포의 유지 또는 기능에 중요한 역할을 한다는 것을 시사한다.
전사 인자 발현의 이러한 변화의 결과를 조사하기 위해, 전체 폐 상주하는 ILC를 인플루엔자 감염 마우스로부터 분리하고, 생체 외로 자극하여 사이토카인 발현 패턴을 평가하였다. 감염된 마우스의 폐 ILC는 감염 후(p.i.) 7일째에 모의 (PBS 처리) 동물로부터의 ILC보다 IL-5 및 IL-13이 현저히 적게 생성됨을 발견했다(도 1l). 그러나, IL-12 및 IL-18에 대한 수용체의 상향-조절과 일치하여, 감염된 동물의 폐로부터 분리된 ILC는 생체 외에서 IL-12 및 IL-18 자극에 대한 반응으로 현저한 수준의 IFN-γ를 생성하였다(도 1l).
종합하면, 이들 데이터는 국소 ILC2 기능의 감소 및 IL-18Rα+ T-bet+ IFNγ+ ILC1의 확장을 특징으로 하는, 바이러스 감염 동안 상주하는 폐 ILC의 표현형 및 기능적 능력 모두에서 주요 변화를 입증한다.
실시예
2. 담배 연기 노출과 박테리아 감염은 폐
ILC의
표현형 변화를 유도한다.
COPD의 악화가 다수의 바이러스성 및 박테리아성 호흡기 감염과 관련되기 때문에, 상이한 COPD-관련 병원균으로 감염된 마우스에서 ILC 아군의 전환이 일어났는지 여부를 조사하였다. 놀랍게도 매우 비슷한 패턴이 발견되었다. 인플루엔자 A(PR8), 호흡기 세포융합 바이러스(RSV)(도 2a) 또는 그람-양성 및 그람-음성 박테리아인 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)(도 2b) 및 비-피막형 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae)(NTHi)(도 2c~2f)의 상이한 균주 접종은 모두 GATA-3의 손실을 유도하고, 이후 폐 ILC 군집 내 IL-12Rβ2, IL-18Rα 및 T-bet 발현을 증가시켰다.
ILC 아군에서의 이러한 변화는 COPD의 주요 원인 중 하나인 담배 연기 노출이 GATA-3의 극적인 손실(즉, 4일 및 10일간의 연기 흡입 후)을 유발한다는 점에서 전염성 유발인자에 국한되지 않았다. GATA-3 수준은 6개월 간의 지속적인 연기 노출을 통해 현저히 감소된 상태를 유지했다(도 2g~2h, 최대 8주까지 나타난 데이터). 특히 IL-12Rβ2+, IL-18Rα+, T-bet+ ILC1 군집의 출현은 8주간의 연기 노출 후 관찰되었으며(도 2i~2m), 6개월간의 추가 치료 후에도 유지되었다. 마지막으로 담배 연기 노출과 바이러스 감염이 조합된 COPD 악화 모델에서, 폐-상주하는 ILC의 변화가 크게 증가한 것으로 나타났다. 이전에 담배 연기에 노출된 마우스는 담배 연기 또는 바이러스 단독에 비해, GATA-3 및 ST2가 더 강하게 억제되었으며, 폐-상주하는 ILC에서 훨씬 높은 수준의 IL-18Rα를 나타냈다.
종합적으로, 이들 데이터는 국소적인 ILC 군집의 표현형 전환이 외래 및/또는 환경적 손상에 반응하는 일반적인 메카니즘일 수 있음을 입증한다.
실시예
3. IL-12 및 IL-18은
IFN
-γ를 유도하여 국소 ST2+
ILC2
풀로부터 ILC1을
생산한다
ILC2가 ILC1 표현형을 채택할 수 있는지를 조사하기 위해, IL-33-확장된 ILC2는 폐에서 > 98% 순도로 농축되어, 4 내지 7일 동안 다양한 사이토카인과 함께 배양하였다. 이들 세포를 IL-12 또는 IL-15로 자극하면, ILC2로부터 IFN-γ의 생산이 유도되지 않았다. 그러나, IL-18, 특히 IL-12와 IL-18의 조합에 반응하여, 이들 세포의 약 20~50%(각각)가 IFN-γ를 생산했다. 이것은 또한 배양 상등액에 존재하는 수준에도 반영되었다(도 3a, 3b). 이 데이터는 IL-12 및 IL-18이 ILC3으로부터 IFN-γ 생산을 유도할 수 있음을 입증하는 연구와 일치한다.
IL-15가 ILC1에 의한 IFN-γ의 발현을 촉진한다는 이전의 보고에도 불구하고, IL-15가 단독으로, 또는 IL-12 및/또는 IL-18과 조합하여, 상기 조건 하에 IFN-γ 생성에 유의한 영향을 미치지 않는 것으로 밝혀졌다(도 3b). IL-5의 생산은 ILC2가 이 사이토카인을 구성적으로 생산한다는 개념을 뒷받침하는 이 분석에서 여러 조건들에서 현저하게 일관되었다. IL-13 생산은 더 다양했지만, NFκB-활성화 사이토카인, 특히 IL-33 및 IL-18에 반응하여 수준이 지속적으로 더 높아졌다. 놀랍게도 ILC2는 IL-12 및 IL-18로 자극했을 때 IL-13 및 IFN-γ를 공동 발현하여, 이들 세포가 ILC2의 기능적 소성과 일치하는 무질서한 사이토카인 발현 양상을 가졌음을 입증한다. 따라서, 폐-유도된 ILC2는 ILC1-관련 마커를 발현할 수 있으며, IL-12+IL-18에 반응하여 풍부한 수준의 IFN-γ를 생성할 수 있다.
IL-12 및 IL-18이 생체 내에서 ILC1 확장을 유도할 수 있는지 여부를 결정하기 위해, IL-12+IL-18, IL-33 단독 또는 3개의 모든 사이토카인의 조합의 비강내 투여 후의 ILC 반응을 조사하였다. IL-12p70과 IL-18의 나이브 마우스에 대한 국소 공동투여는 PBS 또는 IL-33-처리 대조군과 비교하여 전체 폐-상주하는 ILC에서 GATA-3 및 ST2의 발현을 유의하게 감소시켰으며(도 3c), 바이러스 감염동안 관찰된 것과 유사하였다(도 1). 그리고, IL-12+IL-18 처리는 IL-18Rα+, T-bet+ ILC의 발현 및 수를 현저하게 증가시켰으며, 이는 PBS 또는 IL-33 치료와 비교했을 때 IL-5 및 IL-13을 현저히 덜 생성했지만, 생체 외 IFN-γ의 정량을 매우 높였다(도 3d~3g).
IL-33의 비강 내 전달은 폐 내의 ST2+, GATA-3+ ILC2의 수를 현저히 증가시켰으며, 이는 고수준의 IL-5(도 3f) 및 IL-13을 생산하였다. 흥미롭게도, IL-12+IL-18(도 3c, 3d)에 대한 응답으로, ILC1의 비율이 현저하게 증가하였음에도 불구하고, 이들 세포의 총 수의 최소, 그러나 현저한 증가가 관찰되었다(도 3e). 그러나 IL-12+IL-18와 조합하여 IL-33을 투여하면 ILC2 확장을 희생시키면서 ILC1의 총 수를 극적으로 증가시켰다(도 3e). 더욱이, Th2 사이토카인의 생산을 유도하는 IL-33의 능력은 IL-12 및 IL-18의 존재 하에서 현저하게 제거되었고, 이들 세포는 상당한 양의 IFN-γ를 생산하였다(도 3g). 이 세포들은 또한 국소 ILC2 풀에서 IL-18Rα+ T-bet+ IFN-γ+ ILC1의 출현과 일치하여 IL-5 및 IFN-γ를 공동 발현하였다(도 3h). 특히, IL-12 또는 IL-18 단독 투여는 GATA-3, T-bet, IL-18Rα 또는 IFN-γ의 발현에 최소한의 영향을 미쳤다. 따라서, IL-12 및 IL-18은 생체 내에서 ILC1 확장을 공동 조절하지만, IL-33은 이러한 반응을 증폭시키기 위해 상황에 의존하는 방식으로 작용한다.
ST2는 ILC2에서 GATA-3의 직접 표적이다. ILC1가 사이토카인 치료 후 국소 ILC2 풀에서 확장되는지 여부를 결정하기 위해, ST2 GFP+ 마우스에서의 이러한 실험을 반복했다. ST2-GFP+ 대 IL-18Rα 발현의 비교는 나이브 폐에서 ILC의 2개의 구별되는 군집, ST2-GFP+ IL-18Rα- ILC2(93.4%) 및 ST2-GFP- IL-18Rα+ ILC1(4.01%)를 보여줬으며, 이는 IL-18Rα의 발현에 의해 결정된 바와 같이, IL-12+IL-18+IL-33 처리시 극적으로 변화하여 ILC1의 빈도를 증가시켰다(도 3i). 확연하게, 상기 IL-18Rα+ 세포는 또한 ST2-GFP의 중간물이었으며(도 3i), 원래의 ST2-GFP+ ILC2 군집의 약 50%를 나타내는 것으로 평가되었다. GFP+ 평균 형광 강도(MFI)의 임시 분석은 사이토카인 치료 후 ILC2에서 ST2 발현의 온건하지만 상당한 감소를 나타냈다. IL-18Rα+세포에 대한 ST2-GFP+의 발현은 나이브 폐에서 ST2-GFP-IL-18Rα+ ILC1과 비교하여 현저하게 증가하였지만 낮았다(도 3j). 따라서, ILC1은 폐내 기존의 진짜 ILC1의 파생물보다는 국소 ST2+ILC2 풀에서 나온다.
IL-12+IL-18+IL-33(사이토카인) 처리된 마우스로부터 분류된 ILC2(ST2+ IL-18Rα-) 및 ILC1(ST2- IL-18Rα+)에 대한 나이브 마우스로부터 분류된 ILC2 사이의 유전자 발현 프로파일의 비교는 부분적으로 겹치지만 뚜렷한 분자 패턴을 나타냈다. Gata3, Rora, Il4, Il5, Il9, ll13, Penk(프로엔케팔린), Areg(암피레굴린), Il17rb, 및 Il1rI1을 포함하여, 나이브 폐에서 분리된 ILC2는 Th2-관련 전사체를 발현하였다. 이와 유사하게, 사이토카인으로 처리한 마우스에서 얻은 ILC2는 많은 상기 동일한 유전자를 상향-조절하였다(도 3k). 대조적으로, 사이토카인으로 처리된 동물로부터의 IL-18Rα+ILC1은 상기 ILC2 전사체의 더 낮은 발현 및 Tbx21 , Ifng, Il12rb2 , Il18r1 , Cxcr3, 및 Ccr5의 높은 수준을 특징으로 하는, 변경된 독특한 유전자 발현 프로파일을 갖는 것으로 나타났다(도 3k). 주목할 만하게, 이 세포들은 그들의 Th1-관련 전사체가 높았지만 세포분해 기능과 관련된 현저히 낮은 수준의 유전자(예를 들어, Prf1, Gzma, Gzmb, Gzmc)를 발현했기 때문에 나이브 간 ILC1/폐 NK 세포와 사이토카인 확장된 ILC2 사이의 표현형이 중간이었다(도 3k). 흥미롭게도, ILC2와 비교할 때, 활성화된 ILC1에서 Il7ra, Il2r, 및 Icos의 발현이 더 낮았지만, 케모카인 수용체, 예를 들어 Ccr5, Ccl17, 및 Cx3cr1에 관한 사이토카인-처리 마우스의 ILC 서브셋의 차이가 관찰되었다(도 3k).
집합적으로, 이들 데이터는 ILC2 소성이 분자 표지 내에서의 전환을 포함한다는 것을 강조하며, 이는 유동 세포계측법을 통해 보고된 단백질성 변화와 일치한다.
실시예
4.
ILC2는
바이러스 감염동안
ILC1로
직접 전환하고, 염증
부위내에서
응집한다
ILC2가 감염 중에 ILC1로 전환할 수 있고, 및/또는 전환할 수 있는 능력을 갖는지 여부는 ILC, NK 세포 및 성숙한 림프구가 없는 RAG/γc 이중 넉아웃 마우스를 사용하여 직접 시험하였다. 폐 상주하는 ST2HIGH, IL-18Rα- ILC2를 IL-33 처리된 GFP+ 형질전환 마우스로부터 FACS-분류하고, A형 인플루엔자 감염 12시간 전에 RAG/γc-/- 마우스에 정맥 내로 전달했다(도 4a). IL-33-확장된 GFP+ ILC2는 높은 수준의 GATA-3 및 Th2 사이토카인을 발현하였지만, ILC1 마커는 발현하지 않았다(도 4b~4f). 이 프로토콜은 모든 ILC가 GFP 발현에 의해 쉽게 확인될 수 있도록 보장하기 위해 사용되었다.
감염에 대한 반응은 야생형 마우스와 비교하여 RAG/γc-/- 동물에서 지연되고 치사되었으며; 따라서, 생존 기간을 연장시키기 위해, 이들 마우스를 감염시 GFP- 비장 세포 및 폐-유래 NK 및 T 세포로 재구성하였다(복강 내). 전달된 GFP+ ILC는 GATA-3, IL-12Rβ2 및 IL-18Rα의 발현을 포함하여, 그들의 표현형 프로파일의 변화에 대해 감염 후(p.i.) 7일 및 10일에 분석하였다. 양자 전달시 GFP+ ILC는 수혜자 마우스의 폐에 침투하였고, CD25, CD90 및 ST2를 발현하는 Lin- GFP+ 세포와 같이 나이브 및 감염된 동물에서 유동 세포계측법으로 쉽게 확인할 수 있었다(도 4b).
또한, 감염에 반응하여, 이들 GFP+ ILC2는 감염 후(p.i.) 7일까지 GATA-3 발현을 유의하게 하향-조절하였다(도 4c, 4f). 또한, GATA-3의 이러한 손실은 이들 GFP+ 세포에서 IL-18Rα 및 IL-12Rβ2의 현저한 상향-조절과 상관 관계가 있었다(도 4d, 4e, 4g, 4h). 또한 감염 후(p.i.) 10일에 GFP+ ILC2에서 유사한 표현형 변화가 관찰되었지만, 감염 후(p.i.) 7일 또는 10일에 잠재적으로 이들 마우스에서 감염에 대한 반응이 지연되었기 때문에, T-bet 발현이 검출되지 않았다. 놀랍게도, IL-12+IL-18에 의한 생체 외 자극시에, GFP+ 세포는 감염 후(p.i.) 10일에 상당량의 IFN-γ를 생산할 수 있었으며, 이 변화는 IL-13의 하향-조절과 일치했다.
놀랍게도, 이들 동일한 마우스로부터의 폐 조직의 면역조직화학적(IHC) 분석은 폐 내의 감염에 대해 뚜렷한 패치(Patchy) 같은 반응을 나타내었다. 전이된 GFP+ ILC는 바이러스-유발된 염증과 특징적으로 관련된 염증성 병소 내에서 응집된 것처럼 보였다. 고배율 확대는 ILC가 바이러스 복제 영역 내에서, 심지어 비-염증 부위와 밀접한 경계를 이루는 조직 영역에서조차도 전형적으로 밀집되어 있음을 보여주었다. 그러나, 실질 조직의 비-염증 부위에 있는 GFP+ ILC도 관찰되었지만, 이들의 수가 훨씬 적고 대부분 혼자 있었다. 이중 IHC를 사용하여, 인플루엔자+ 상피 세포와 함께 ILC의 이러한 클러스터의 공동-정위뿐만 아니라 염증이 있는 기도 주변의 혈관주위 영역이 확인되었다. 중요하게도, IHC와 인시츄 하이브리드화의 조합은 IL-12 및 IL-18 mRNA를 발현하는 골수-유래 세포가 폐의 염증 부위 내에서 GFP+ ILC에 근접하여 빈번하게 확인되었음을 보여주었다.
감염 후 폐에서의 GATA-3 관련 ILC 발현을 조사하고 정량화하기 위해, 4중 조직화학을 조합된 면역형광 및 발색 IHC(실시예 9 참조)와 함께 사용하였다. 디지털화된 전체 슬라이드 이미지의 컴퓨터화된 이미지 분석을 사용하여, 모든 개별 GFP+ ILC(녹색 형광)가 조직에서 자동으로 확인되었고, 청색 DAPI, (횡단면 당 총 핵 함유량에 대한 DNA 마커) 뿐만 아니라 그들의 적색/분홍색 GATA-3 면역염색에 대한 염색 강도로 점수를 매겼다.
대조군 마우스에서의 GATA-3HIGH ILC 및 인플루엔자-처리 동물에서의 비-감염 영역을 감염 후(p.i.) 5일 및 6일째 각각의 감염 영역에서의 전형적인 GATA-3LOW ILC와 각각 비교하여 분석을 수행하였다. 대조군(PBS로 처리) 대 감염된 마우스로부터의 전체 폐 절편에서의 ILC2-관련 GATA-3 발현을 처음 검사하였다. 개별 GFP+ 세포에 대한 분산도 분석은 바이러스-감염된 폐가 감염되지 않은 마우스와 비교하여 훨씬 더 많은 GATA-3LOW 발현 ILC를 포함한다는 것을 명확하게 보여준다(도 5a). 모든 인플루엔자 처리된 마우스의 균일한 감염을 더 확인한 후, 핵 단면이 2D 단면 세포 영역에서 상이하므로, 각 GFP+ 세포에서의 GATA-3 발현을 세포의 핵 DAPI 함량으로 표준화했다. 다시 대조군에 비해 감염된 마우스에서 GATA-3HIGH ILC 빈도의 현저한 감소가 발견되었다(도 5b).
흥미롭게도, 감염 후(p.i.) 5일째에 비해 6일째에 조사된 마우스의 GFP+ 세포에서 GATA-3 강도가 더 감소되었으므로, 인플루엔자 처리된 마우스로부터의 ILC에서 GATA-3의 시간 의존적 손실이 관찰되었다(도 5a, 5b). FACS 데이터는 GATA3 발현의 이러한 시간 과정을 확인했다. 중요하게는, 대조군 마우스와 감염된 마우스 사이의 ILC-관련 GATA-3 수준의 통계적으로 유의한 감소는 개별 마우스 폐 단면 당 평균 GFP+ GATA-3 발현을 비교함으로써 정량화되었다(도 5c; 감염 후(p.i.) 5일째의 데이터).
마지막으로, 감염의 불규칙한 성질을 감안할 때, GATA-3 발현의 손실은 폐 조직 전체에 걸쳐 염증이 있는 미세환경에 특이적이었다. 따라서, 4배(인플루엔자, GFP, GATA-3 및 DAPI) 염색된 절편의 공간 데이터(x, y 좌표)를 사용하여, 폐 조직 영역에서의 GATA-3 발현 수준을 높은 대 낮은 세포 및 바이러스 밀도와 비교하는 집중 분석을 수행하였다. GATA-3 강도에 따라 개별 GFP 세포의 공간 분포를 플롯팅하고 컬러-코딩한 이미지와 함께, 폐의 패치 세포-밀집 영역을 동일한 섹션의 바이러스 밀도 히트맵과 비교했다. 주목할 만하게도, GATA-3LOW ILC는 폐의 감염 부위 내에서 훨씬 더 빈번했다. 대조적으로, 주변의 감염되지 않은 조직 영역에서 발견된 ILC는 주로 GATA-3HIGH이었다.
요약하면, 이들 데이터는 ILC2가 바이러스 감염 후 ILC1-유사 표현형으로 직접 전환하고, 바이러스 복제와 관련된 영역으로 이동한다는 것을 입증한다. 이것은 아마도 후속 소성을 통제하는, IL-12 및 IL-18과 같은 국소적인 전-염증 단서에 대한 반응일 것이다.
실시예
5. T-bet은
ILC2를
침묵화
하기
위해 필요하지 않지만
IFN
-γ의 생산에 필요하다
바이러스 감염 후에 ILC1의 유지 및/또는 증식에 T-bet에 대한 기능적 역할이 있는지를 결정하기 위해, T-bet 결핍 마우스에서의 ILC 반응을 조사하였다. 흥미롭게도, T-bet은 GATA-3 및 ST2의 손실 또는 이들 세포에서의 IL-12Rβ2 및 IL-18Rα 발현의 증가에 필요하지 않으며, C57BL/6(WT) 마우스와 비교할 때 ILC1 증식에 T-bet가 필요하지 않았다(도 6a~6f). 그러나 감염된 T-bet-/- 동물로부터 분리된 ILC는 IL-12+IL-18로 생체 외 자극 후 IFN-γ를 생성하는 능력에 있어서 현저하게 손상되었다(도 6g). 또한, WT 및 T-bet-/- 마우스로부터의 ILC는 GATA-3 및 ST2를 하향-조절하고 IL-12Rβ2 및 IL-18Rα 사슬을 상향-조절함으로써 IL-12+IL-18의 비강내 투여에 유사하게 반응하였다. 그러나 바이러스 감염 연구에서와 마찬가지로 IL-12+IL-18에 대한 반응으로 IFN-γ를 최대한 발현시키기 위해서는 T-bet이 필요했다. 따라서, T-bet는 Th1-유형의 염증에 대한 반응으로 ILC2를 ILC1로 전환시키는데 필요하지 않지만, 이들 세포에서 IFN-γ를 최적으로 생산하는데 필수적인 것으로 나타난다.
실시예
6.
ILC1은
병원성이며, 바이러스에 의한 체중 감소와 감염에 대한 염증 반응을 극적으로 증폭시킨다
ILC2 소성에 대한 생물학적 관련성 및 감염 중 ILC1에 대한 그들의 특정 표현형 전환이 다음에 조사되었다. 그러나, ILC-특이적인 표면 마커가 없기 때문에, ILC 군집의 항체-매개된 고갈에 대한 전략이 제한적이다. Thy 항원(CD90)에 대한 항체는 적응 면역 세포가 없는 동물에서 조직-상주하는 ILC를 고갈시키는데 성공적으로 사용되었다. 항 CD90 항체로 치료하면 폐-상주하는 ILC의 90% 초과가 고갈된다는 사실이 확인되었지만, 이 항체는 NK 세포와 폐-상주하는 CD90+ CD45- CD166+ Sca-1+ 중간엽 줄기 세포의 군집의 약 70%를 조직적으로 고갈시켰다는 것을 발견하였다.
따라서, ILC1의 생물학적 기능을 보다 명확하게 설명하기 위해, 면역저하된 마우스에서의 ILC1 또는 ILC2의 양자 전달을 수행하였다(도 6h). IL-33 또는 IL-12+IL-18+IL-33 처리된 C57BL/6 마우스로부터 폐-상주하는 ILC2(ST2+, GATA-3+) 및 ILC1(IL-18Rα+, T-bet+)을 분리하고, A형 인플루엔자 감염 24시간 전에 C57BL/6 RAG/γc 결핍 마우스로 전달하였다. 놀랍게도, 양자전달된 ILC1을 받은 동물은 감염되기 전에 ILC2로 재구성된 마우스에 비해 감염에 대한 체중 감소가 현저히 나타났다(도 6h). 또한 ILC1의 전이는 IFN-γ, IL-12p70, TNFα, IL-1α 및 IL-6을 포함한, 극적이고 과장된 전-염증성 사이토카인 생성과 관련이 있었다(도 6i).
이 시점에서 ILC1 전달에 따른 세포 염증의 차이는 아마도 RAG/γc 결핍 마우스에서의 감염에 대한 지연된 반응으로 인해 관찰되지 않았다. ILC1의 염증 잠재성에 T-bet/IFN-γ가 필요한지 여부를 확실하게 테스트하기 위해, C57BL/6(WT) 및 T-bet 결핍 마우스로부터 분리된 ILC1을 사용하여 양자 전달을 반복하였다. 이전에 나타낸 바와 같이(도 6i), ILC1 전달은 악화된 Th1 사이토카인 생산과 관련되었지만(도 6j); 그러나, T-bet 결핍 ILC1은 IFNγ 생산을 포함하여, 증가된 항-바이러스성 반응을 촉진시킬 수 없었다(도 6j). 놀랍게도, 이들 세포에서의 T-bet의 부재는 Th2 사이토카인 생성, 즉 폐 내의 IL-4 및 IL-5를 유의하게 유발하였다.(도 6k).
따라서, IL-12 및 IL-18은 바이러스-유도된 염증을 현저히 증가시키는 능력을 갖는 ILC1의 군집을 확장시키는 반면, T-bet은 이들 세포의 전체 염증 잠재성에 요구된다.
실시예
7. IL-12는 인간
ILC2에서
소성을
유도한다
인간 ILC2가 소성을 나타내고 ILC1로 분화할 수 있는지를 시험하기 위해, IL-2+IL-33 또는 IL-2+IL-12의 존재하에 5일 동안 배양된, 건강한 공여자의 말초 혈액으로부터 Lin- IL-7Rα+ CRTH2+ CD161+ ILC2를 선별하고, 표면 마커 및 사이토카인 출력을 조사하였다. 이전에 보고된 바와 같이, CRTH2는 인간 ILC2에 대한 표지이고, IL-2+IL-33에서 배양된 ILC2는 CRTH2+, GATA3+, Tbet-, CD25+, CD161+ 및 IL-7Rα+였다(도 7a~7c). 이 세포들은 높은 수준의 IL-13과 IL-4를 생성하지만 IFN-γ의 양은 유의하게 낮았다(도 7d~7f). 주목할만하게는, 신선하게 분리된 말초 혈액 ILC2는 IL-33에 반응하여 IL-5를 거의 또는 전혀 생산하지 않았으며, Ohne et al.의 관찰과 일치하였다. 대조적으로, 배양 배지에 IL-12를 첨가하면 ILC2에서 GATA-3과 CD25의 수준이 현저하게 감소했지만, 이와 동시에 동일한 세포에서 T-bet 발현이 극적으로 증가했으며, 이는 마우스 ILC 표현형에서의 관찰을 입증한다(도 7a~7c). 또한 IL-12에 대한 반응으로, IL-33이 존재하더라도 ILC2는 IL-13과 IL-4의 농도가 낮아졌다(도 7d, 7e). 더욱이, IL-12는 인간 ILC2에서 높은 수준의 IFN-γ를 유도하였고, IL-33의 존재 하에서 이러한 수준이 증가되었다(도 7f).
따라서, 인간 ILC2는 IL-12 자극 후 ILC1 표현형을 획득할 수 있고, 마우스 ILC2와 유사하게 IL-33은 이들 세포에 의한 IFN-γ 생성을 증폭시킬 수 있다.
실시예
8.
COPD
환자는 질병의 심각성과 상관관계가 있는
ILC
반응을 극적으로 변화하였다
COPD 환자는 바이러스성 또는 세균성 병원균에 의한 감염 후 증상이 급성으로 악화되고, 이러한 악화는 환자의 이환율 및 사망률과 상관 관계가 있다. 본 발명을 위해 개발되고 사용된 COPD의 마우스 모델은 바이러스, 박테리아 감염 또는 담배 연기 단독에 노출된 후 폐-상주하는 ILC 군집에서 유의한 기능적 및 표현형 변화를 나타내며, 이러한 효과는 연기가 바이러스 감염과 조합될 때 과장된다(도 2). COPD 환자에서 유사한 변화가 발생했는지 여부를 조사하기 위해, COPDGene 코호트로부터의 안정된 환자의 말초 혈액에서 ILC 서브셋의 빈도를 조사했다. 건강한 대조군의 말초 혈액내 순환 ILC를 분석한 결과, 순환 ILC의 약 40%가 ILC2 마커 CRTH2 뿐만 아니라 CD25, IL7Rα 및 GATA-3을 발현하고, 순환 ILC의 약 5%가 ILC1(본원에는 T-betHI로 정의됨, 도 8a)이었으며, 이는 이전의 보고와 일치한다. 순환중인 많은 ILC가 공지된 ILC1, ILC2 또는 ILC3 마커를 발현하지 못하는 것으로 밝혀졌으며, 순환하는 ILC 전구체 또는 미성숙 세포를 나타내는지는 불분명하다.
COPD 환자에서 ILC1의 빈도는 건강한 대조군과 비교할 때 순환계에서 현저하게 상승하는 것으로 관찰되었다(도 8a, 8b). 이 ILC1의 증가는 순환하는 ILC2 세포의 빈도의 수반되는 감소와 서로 관련이 있었다(도 8c). 그리고, 더욱 심각한 질병(GOLD III/IV)을 갖는 환자는 경증 질병을 갖는 환자(GOLD I/II; 도 8d)와 비교했을 때 ILC1 빈도가 유의하게 높았다. 반대로, 보다 경증의 환자(GOLD II) 또는 건강한 흡연자와 비교할때 더욱 중증의 환자(GOLD III/IV)에서는 ILC2 비율이 현저하게 낮았다(도 8e). 매치된(연령 및 흡연 팩 년) 건강한 흡연자는, 모든 COPD 환자(GOLD I-IV)에서 ILC1의 빈도가 건강한 흡연자에 비해 더 높은 (명백한) 경향이 있었지만 건강한 대조군에 비해 ILC1 비율의 유의한 증가를 나타냈다(도 8b). 흥미롭게도, '건강한 흡연자' 그룹의 몇몇 개인은 비교적 낮은 FEV1/FVC 비율(0.73-0.71)로 나타났으며; 즉, 보다 경미한 COPD 환자에서 발견된 비율(0.7 이하)과 유사하여 일부 대상체에서 ILC1 증가를 설명할 수 있다. 그럼에도 불구하고 예측된 FEV1%(R = -0.4162, p <0.01) 및 FEV1/FVC 비율(R = -0.4154, p <0.01)로 평가할 때, % ILC1와 폐 기능간에 유의한 역 상관관계가 있었다(도 8f). 대조적으로, COPD 환자의 % ILC2는 폐 기능 매개변수와 양의 상관관계를 보였다.
ILC1%와 악화의 평균 횟수 사이에는 유의한 선형 경향이 있었는데, 1년 당 2회 이상 악화된 환자는 최고 ILC1 및 최저 ILC2 빈도를 가졌다(도 8g, 8h). % ILC1 대 ILC2와의 상호관계 및 질병-관련 임상 종점과 일관되게, ILC1 대 ILC2의 비율 사이의 강한 상관 관계(R = -0.5529, p <0.001)가 발견되었으며, 이는 COPD에서 ILC2의 ILC1로의 직접 전환에 대한 가설을 뒷받침했다(도 8i). 실제로, ILC1과 ILC2 사이의 역 상관 관계는 일관되게 관찰되었지만, ILC1과 ILC2의 합은 같은 수준(42.3±13.1%, 평균±SD)으로 유지되며, 이는 기존 ILC 군집 내의 소성에 기인할 수 있음을 시사한다.
총괄적으로, 이들 데이터는 COPD가 순환 ILC의 풀에서 현저한 변화와 관련되며, ILC1의 빈도 증가는 질병의 중증도, 폐 기능 및 악화 빈도와 상관 관계가 있음을 입증한다.
실시예
9. 재료 및 방법
마우스
BALB/c(Harlan), SCID(Jax), C57BL/6(Jax), RAG/SCID 결핍(Taconic), GFP 형질전환(C57BL/6-Tg(CAG-EGFP) 131Osb/LeySopJ, Jax) 마우스를 MedImmune에 수용하고, IACUC에서 승인한 프로토콜에 따라 치료하였다. T-bet-/-(Jax) 마우스를 기관 지침 및 프로토콜에 따라 펜실베이니아 대학교에서 보관하고 관리했다.
ST2-GFP 리포터 마우스의 생성
표적화 구조물을 뮤린 배반포에 주사하였다. 구조체는 상류 4kb의 짧은 상동성 아암을 포함하고, 이어서 인트론 10에 위치한 FRT-측면 퓨로마이신 내성 카세트, 이어서 정지 코돈이 결실된 Il1rl1 유전자의 엑손 11, 및 eGFP에 융합된 T2A 자체-절단 펩타이드의 융합 서열, 이어서 새로운 정지 코돈을 포함했다. 구조체는 6kb 길이의 상동성 아암으로 끝났다. 표적화 구조물을 생성하기 위해 사용된 모든 서열은 Il1rl1 동형체 A(막-결합; Uniprot ID: P14719-1)에 상응하는, Ensembl 전사체 ENSMUST00000097772(Il1rl1-001)에 기초하였다. Flp-매개된 재조합 후, 퓨로마이신 선별 유전자가 결실되어, 표적화된 Il1rl1 유전자의 인트론 10에 남은 단일 FRT 부위를 남기고, 이어서 엑손11-T2A-eGFP 융합 서열을 남겼다. 실험에 사용된 모든 ST2-리포터 마우스는 BALB/c 배경에 이형접합성 ST2+/GFP였다. 한배새끼를 대조군으로 사용하였다.
연기 모델
담배 연기에 노출된 마우스를 이전에 공개된 프로토콜에 따라 하루 2회, 일주일에 5일 스모킹하고, 도 2에 명시된 시점에서 분석하였다.
박테리아 및 바이러스 감염 모델
인플루엔자 A(A/FM/1/47)의 50XTCID50, 50XTCID50 PR8 균주(둘 다 H1N1임), 또는 106 pfu RSVA2를 마우스에 비강 내 투여하였다. 일부 연구에서는 인플루엔자 A가 이전에 확립된 프로토콜에 따라 연기 노출 후 투여되었다. 마우스는 도면에 명시된 시점에서 분석하였다. 마우스를 비-피막형 헤모필리스 인플루엔자(Haemophilis influenzae) 107 cfu로 비강 내 치료하고, 감염 후 2일째 및 5일째에 분석하거나, 또는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 105 cfu로 비강 내 투여하고, 감염 후 5일째에 분석하였다.
인시츄 ILC 확장
시험관내 실험을 위해 ILC 군집을 확장시키기 위해, BALB/c SCID 마우스를 1μg의 재조합 IL-33(사내에서 생성됨), IL-12(eBiosciences) 또는 IL-18(R&D)에 의해 D1, D3 및 D5에 비강내 치료하고, D7에 희생시켰다. ILC는 생체외 분석을 위해 하기 기술된 대로 농축되었다. ILC2를 확장시키기 위해, IL-33을 사용하였다. ILC1 확장을 위해, IL-12+IL-18+IL-33을 사용하였다.
Fluidigm 분석
ILC2(CD45+ 생존가능한 CD3- CD49b- Lin- CD90+ ST2+ IL-18Rα-로 정의됨)를 나이브 폐로부터 분류하였다. 상기 기술된 바와 같이, IL-12+IL-18+IL-33으로 처리된 마우스의 폐로부터 ILC2 (CD45+ 생존가능한 CD3- CD49b- Lin- CD90+ ST2+ IL-18Rα-) 및 ILC1 (CD45+ 생존가능한 CD3- CD49b- Lin- CD90+ ST2- IL-18Rα+)를 분류하였다. 대조군의 경우, 나이브 폐로부터 NK 세포(CD45+ 생존가능한 CD49b+ CD3-)를 분류하고, 나이브 간(CD45+ 생존가능한 CD3- CD19- NKp46- CD11a+ TRAIL+)으로부터 ILC1을 분류하였다. RNA를 세포로부터 분리하고, 관심있는 전사체에 대한 프로브를 로딩한 Fluidigm Biomark Dynamic 어레이(Fluidigm Corp., South San Francisco, CA)를 사용하여 qPCR을 수행하였다.
ILC 농축(마우스)
폐를 PBS로 관류하고, 약 2cm 조각으로 절단하고, LiberaseTM 및 DNAse(둘다 Roche)와 함께 37℃에서 45분 동안 배양한 후, 70㎛ 세포 스트레이너를 통해 부수고, 완전한 RPMI로 세척하였다. 남아있는 혈액 세포를 ACK 세포 용해 완충액(Invitrogen)으로 용해시키고, 단일 세포 현탁액을 CD3, CD19, B220, CD5, TCRαβ, TCRγδ, CD11c, F4/80, Gr1, Ter119, CD49b, 및 CD27에 대한 비오틴화 항체와 함께 배양하였다. 이어서 세포를 항-비오틴 마이크로비드(Milltenyi)와 함께 배양하고, 제조사의 프로토콜에 따라 고갈시켰다. 각 ILC 농축에 대해 고갈을 2회 반복하였으며, 일반적으로 95% 초과의 순 ILC 군집을 수득했다.
시험관내 배양을 위한 ILC 분리(인간)
MedImmune Blood Donor 프로그램에 의해 모집된 건강한 지원자로부터 혈액을 수집하였다. 모든 지원자는 정보에 입각한 동의를 했다. 제조사의 프로토콜에 따라 CPT 튜브(BD)를 사용하여 PBMC를 분리하였다. ACK 용해 완충액을 사용하여 남아있는 적혈구를 용해시켰다. 3~4명의 건강한 공여자의 PBMC를 NK 세포 농축 키트(StemCell Technologies)를 사용하여 풀링하고 고갈시켰다. 이어서, ILC를 생존가능한, CD45+, nonT/nonB, Lin-, IL-7Rα+, CD161+, CRTH2+ 세포로 99% 순도로 분류하였다.
ILC의 생체외 자극
ILC를 상기한 바와 같이 뮤린 폐 또는 인간 혈액으로부터 단리하고, 도면에 나타난 바와 같이 IL-2, IL-7, IL-33, IL-12, IL-18, IL-15 또는 이들의 조합으로 자극하였다. 모든 사이토카인은 50 ng/mL로 사용되었다. 세포를 유동 세포계측법으로 분석하고, 상층액을 MSD 또는 ELISA(MesoScale Diagnostics)에 의해 사이토카인 생산에 대해 분석하였다.
COPD 샘플
건강한 대조군, 흡연 대조군 및 COPDGene 코호트에 등록된 COPD 환자들로부터 혈액을 수집하였다. 환자 인구 통계는 표 1과 표 2에 제공되어 있다. 모든 연구는 National Jewish Health에서 IRB의 승인을 받았다.
[표 1]
[표 2]
유동 세포계측법
마우스 ILC를 CD3, CD49b, IL-18Rα (eBiosciences), CD45, CD25, CD90, CD44 (Biolegend), 및 ST2 (MDBiosciences)에 대한 항체로 염색하였다. 계통 칵테일에는 TCRαβ, TCRγδ, CD5, CD27, F4/80, CD11c, Gr1, CD19, FCεsRI 및 B220(eBiosciences)에 대한 항체가 포함되었다. 세포내 항체에는 GATA-3, T-bet, IL-13, IL-5 및 IFN-γ(eBiosciences)가 포함되었다. 모든 FACS 실험에 생/사 고정가능 블루(live/dead fixable blue)(Invitrogen)를 사용했다. ILC의 세포내 사이토카인 염색을 위해 지시된 시간동안 세포를 지시된 사이토카인과 함께 배양한 후, PMA/이오노마이신 및 브레펠딘(Brefeldin) A로 2~4시간 동안 자극하여 표면 염색, 고정시키고, 및 세포내 염색을 위해 투과화시켰다(FoxP3 염색 키트, eBiosciences).
COPD 환자로부터의 인간 ILC(도 8)의 염색을 위해, 비 흡연 건강한 대조군, 흡연 대조군 또는 안정한 COPD 환자로부터의 PBMC를 헤파린 CP 튜브(BD Biosciences)로부터 분리하고, 제조사의 프로토콜에 따라 CD3 및 CD19 마이크로 비드(Miltenyi)를 사용하여 T 및 B 세포를 고갈시켰다. 모든 공여자는 COPDgene 풀에서 가져와 연구 지침에 따라 정보에 입각한 동의를 받았다. 세포를 CD3, CD19, IL-7Rα, CD161(eBiosciences), CRTH2 및 CD56(Biolegend)에 대한 항체로 염색하였다. 계통 칵테일에는 TCRαβ, TCRγδ, CD34, CD14, CD16, CD1α, CD303α, CD123, FcεR1(eBiosciences)에 대한 항체가 포함된다. 세포내 항체에는 GATA-3 및 T-bet(eBiosciences)이 포함된다. 모든 FACS 실험에 생/사 고정가능 블루(Invitrogen)를 사용했다. 모든 샘플은 LSR II에서 실행하고, FlowJo를 사용하여 분석하였다.
ILC의 양자 전달
ILC2 전달(도 4, 5 및 6)에 대해, ILC2를 확장시키기 위해 2.5μg의 재조합 IL-33으로, 또는 ILC1을 확장하기 위해 IL-12+IL-18+IL-33으로 마우스를 1, 3 및 5일에 비강내 처리하였다. 7일째, CD45+ 생존가능한 CD3- CD49b- Lin- CD90+ CD44+ CD25+ ST2+ IL-18Rα- 세포를 정제하고 꼬리 정맥 주사를 통해 1-1.5×105 세포를 전달했다. ILC2 이외에 2.5-3×106 폐-유래 T/B/NK 세포가 전달되었다. 12시간 후, 수혜자 마우스는 전술한 바와 같이 인플루엔자 A에 감염되었다. 감염 후 7일과 10일에 분석을 수행하였다. 감염 후 2일째에 BAL의 사이토카인을 MSD로 측정하였다.
면역조직화학 요법
GFP-양성 세포의 동정.
자동화된 면역조직화학 로봇(AutostainerPlus, Dako)에서 면역조직화학적 염색 전에 파라핀-임베디드 폐 절편을 열 유도된 에피토프 회수(HIER)시켰다. 간단히 말하자면, 절편을 순차적으로 EnVision™ FLEX 퍼옥시다제-차단 제제 및 혈청 유리 단백질 블록(Dako)으로 차단한 다음, 1차 닭 항-GFP 항체(Abcam)와 함께 배양했다. 다음으로, 절편을 HRP에 접합된 염소 항-닭 항체(Abcam)와 함께 배양한 다음, 3,3'-디아미노벤지딘(DAB) 기질-색소원 용액과 함께 배양하고, 메이어(Mayer)의 헤마톡실린(청색 핵)으로 대조군 염색하였다. 마지막으로, 절편을 에탄올 시리즈를 통해 탈수시키고, 크실렌으로 세척하고, Pertex(HistoLab)로 고정하였다.
GFP-양성 세포와 인플루엔자 A의 이중 면역조직화학 염색
GFP 및 인플루엔자 A에 대한 면역 반응성을 마우스 폐에서 공동-시각화하였다. 간단히, HIER 처리된 절편을 닭 항-GFP 항체와 함께 배양하고, HRP에 접합된 염소 항-닭 항체(Abcam)에 의해 검출하고, 갈색의 면역반응 생성물을 색소원으로서의 퍼옥시다제 기질 DAB를 사용하여 생산하였다. 이어서, 절편을 변성 용액(Biocare Medical)으로 처리하고, 염소 항-인플루엔자 A 항체(Abcam)와 함께 배양한 후 HRP-접합된 토끼 항-염소 항체(Dako)와 함께 배양하였다. 마지막으로, 녹색의 인플루엔자 면역반응 생성물은 색소원으로서의 퍼옥시다아제 기질 비나 그린(Vina Green)(Biocare Medical)을 사용하여 생산되었다. 헤마톡실린을 배경 염색(청색 핵)으로 사용하고, 조직 절편을 크실렌으로 세척하고, Pertex로 고정시켰다.
GFP, GATA-3 및 인플루엔자 A의 3가지 면역조직화학 염색
HIER 처리된 조직 절편을 염소 항-인플루엔자 A 항체와 함께 배양한 후, HRP-접합된 토끼 항-염소 항체와 배양하고, 인플루엔자 면역반응 부위에서 갈색 DAB 색소를 발생시켰다. 다음으로, 절편을 변성 차단 용액으로 처리하고, 닭 항-GFP 및 토끼 항-GATA3 1차 항체(Abcam)와 함께 배양하였다. 이어서, 각각 Alexa 488 또는 555(Life Technologies)에 접합된 염소 항-닭 및 염소 항-토끼 2차 항체와 함께 배양을 수행하였다. 마지막으로, 조직을 DNA-결합 형광색소 Hoechst(청색 핵)로 처리하고, PBS/글리세롤로 고정시켰다. 모든 3개의 마커에 대한 면역반응성은 조합된 명 시야 및 표면형광(epifluoroscence) 디지털 슬라이드 스캐너 유닛(Olympus VS120)에 의해 캡쳐하고 디지털화하였다.
인 시츄 하이브리드화(ISH)
제조사의 지침(Advanced Cell Diagnostics)에 따라 RNAscope 2.0 FFPE 분석 키트를 사용하여 IL-12 및 IL-18 mRNA를 시각화하였다. 간단히, 조직 절편을 탈 파라핀화시키고, 내인성 효소 블록과 함께 배양하고, 전처리 완충액에서 비등시키고, 프로테아제로 처리한 후, Mm-IL12b(319551, ACD) 및 Mm-IL18(416731, ACD) 프로브를 사용한 표적 프로브 하이브리드화를 수행하였다. 하우스키핑 유전자 PPIB 또는 박테리아 유전자 DapB에 대한 프로브를 각각 양성 및 음성 대조군으로 제공하였다. 그런 다음, 표적 RNA를 증폭시키고, DAB 색소원에 의해 검출하였다. 마지막으로, 조직 절편을 탈수시키고, Pertex를 사용하여 고정하였다.
IL-12 또는 IL-18 mRNA 및 GFP-양성 ILC의 조합된 시각화
인시츄 하이브리드화를 통해 IL-12 또는 IL-18 mRNA에 대해 이전에 염색된 조직 절편을 닭 항-GFP 항체와 함께 배양한 후, 염소 항-닭 HRP 및 비나 그린(Vina Green) 색소원 발생을 사용하여 검출하였다.
GFP
+
세포에서 GATA-3 강도의 4중 조직화학 및 정량화
GFP, GATA-3(각각 Alexa 488 및 Alexa-555로 면역형광성 측정) 및 인플루엔자(DAB 색소원에 의한 명시야 시각화)에 대한 3중 면역조직화학 염색과 조합된 DNA/핵 염색(DAPI, Alexa 355)에 절편을 적용하였다. 모든 염색 채널은 조합된 형광 및 명시야 Olympus VS-120 가상 슬라이드 현미경으로 디지털화하여, 각 마커에 대한 전체 절편의 고해상도 이미지 하나를 생성했다. 개별 GFP-양성 세포에서 GATA-3 면역염색의 강도는 자동화된 관심 영역(ROI) 기반 방법(소프트웨어 ImageJ 1.47v)을 사용하여 측정하였다. 간단히 Alexa 488 이미지부터 시작하여, 강도 임계값을 조정하고, 잠그고, GFP-양성 세포에 해당하는 ROI를 생성하는데 사용했다. 이어서, 다수의 GFP ROI를 대응하는 Alexa-555 이미지에 붙여 넣고, 각 GFP-양성 ROI에서 GATA-3의 강도(즉, Alexa555 평균 강도)를 측정하는데 사용하였다. 이와 유사하게, GFP ROI를 Alexa 355 이미지에 붙여 넣었으며, 동일한 GFP-양성 ROI의 DAPI 강도를 계산하여 핵 함량에 대한 GATA-3 강도를 조정했다. 인플루엔자 염색의 스캔된 명시야 이미지는 GFP 세포, GATA-3 강도 및 부위 지속 감염 사이의 공간적 관계를 시각화하는데 사용하였다.
GFP
+ 세포에서 인플루엔자 A의 정량화
절편을 GFP 및 인플루엔자 A(DAB 및 비나 그린에 의해 각각 명시야 시각화)에 대한 면역조직화학 염색을 실시하고, Olympus VS-120 가상 슬라이드 현미경으로 디지털화하였다. 컴퓨터화된 이미지 분석(Visiomorph-DP, 덴마크)을 사용하여, 인플루엔자 A의 전체 면역반응성과 전체 조직 면적을 계산하였다. 인플루엔자 A 양성률은 인플루엔자 A 면역반응성을 갖는 전체 조직 면적의 %로 계산하였다.
통계 분석
COPD 샘플
연속 측정의 비교를 위해 그룹내 이질적 분산(heterogeneous-within-group variance)을 갖는 일방향 혼합 효과 ANOVA 모델을 적용하였다. 연간 측정과 평균 악화 수준 사이의 선형 추세를 테스트하기 위해 선형 대비를 사용하였다. 범주형 측정의 비교를 위해 피셔의 정확한 검정(Fisher's exact test)을 사용하고, 인구통계학적 표에서 연간 평균 악화를 비교하기 위해 윌콕슨 검정(Wilcoxon test)을 사용하였다. 두 연속 측정 간의 상관관계를 평가하기 위해 피어슨 상관관계 계수를 사용하였다. 통계 분석을 위해 SAS 9.3을 사용하였다.
기타 모든 분석
그래프패드 프리즘(GraphPad Prism)을 사용하여 도면의 간단한 설명에 기재된 바와 같이 데이터를 분석하고 표현하였다. 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타낸다.
***
특정 구현예에 대한 전술한 설명은 당업자의 지식을 적용함으로써 다른 사람들이 과도한 실험없이, 본 발명의 일반적인 개념을 벗어나지 않으면서, 상기 특정 구현예와 같은 다양한 적용을 용이하게 변형 및/또는 개조할 수 있는 본 발명의 일반적인 성질을 완전히 밝힐 것이다. 그러므로, 상기 개조 및 변형은 본원에 제시된 교시 및 지침에 기초하여, 개시된 구현예들의 등가물의 의미 및 범위 내에 있는 것으로 의도된다. 본 명세서의 어구 또는 용어는 본 명세서의 용어 또는 어구가 본 발명의 교시 및 지침에 비추어 당업자에 의해 해석될 수 있도록 설명의 목적을 위한 것이며, 한정하려는 것이 아님을 이해해야 한다. 본 발명은 하기 청구범위에 의해 추가로 기술된다.
Claims (27)
- 선천성 림프구 세포(서브셋 2)(ILC2)를 선천성 림프구 세포(서브셋 1)(ILC1)로 전환시키는 것을 억제하는 방법으로서, 상기 ILC2의 T-bet+IFNγ+ILC1로의 전환을 방지하고, ILC1내 IL-12 수용체 및/또는 IL-18 수용체 발현의 수준을 유지 또는 억제하고, 및/또는 ILC2내 ST2, CRTH2 및/또는 GATA3 발현의 수준을 유지 또는 증가시키는 조절제와 상기 ILC2를 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 조절제가 억제제 또는 작용제인, 방법. - 제2항에 있어서,
상기 억제제 또는 작용제가 소분자 또는 항체 또는 그의 항원 결합 단편인, 방법. - 제3항에 있어서,
상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 인간 항체, 인간화된 항체, 키메라 항체, 재조합 항체, 이중-특이적 항체, 다중-특이적 항체, 및 그의 항원-결합 단편으로부터 선택되는, 방법. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조절제가 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편인, 방법. - 제5항에 있어서,
상기 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 Fv, Fab, F(ab')2, Fab', dsFv 단편, 단일사슬 Fv(scFV), sc(Fv)2, 디설파이드-결합(dsFv), 이중체, 삼중체, 사중체, 미니체, 또는 단일사슬 항체로부터 선택되는, 방법. - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조절제와 접촉되는 상기 ILC2가 폐 또는 폐 조직으로 정위되는, 방법. - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조절제와 접촉되는 상기 ILC2가 순환 ILC2인, 방법. - 치료를 필요로 하는 대상체에서 폐 염증과 관련된 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법으로서, 상기 대상체에게 질병-변경 약제를 투여하는 단계를 포함하며, 상기 대상체가 ILC1의 미리 결정된 수준과 비교된, 및/또는 하나 이상의 대조군 샘플내 ILC1의 수준과 비교된, 상기 대상체로부터 수득된 하나 이상의 샘플내 ILC1의 상승된 수준을 갖는 것으로 결정되는, 방법.
- 치료를 필요로 하는 대상체에서 폐 염증과 관련된 질병 또는 장애를 예방 또는 치료하는 방법으로서, 상기 대상체에게 질병-변경 약제를 투여하는 단계를 포함하며, 상기 대상체가 ILC1/ILC2의 미리 결정된 비율과 비교된, 및/또는 하나 이상의 대조군 샘플내 ILC1/ILC2의 비율과 비교된, 상기 대상체로부터 수득된 하나 이상의 샘플내 ILC1/ILC2의 상승된 비율을 갖는 것으로 결정되는, 방법.
- 치료를 필요로 하는 대상체에서 폐 염증과 관련된 질병 또는 장애의 악화를 예방 또는 치료하는 방법으로서, 상기 대상체에게 질병-변경 약제를 투여하는 단계를 포함하며, 상기 대상체가 ILC1의 미리 결정된 수준과 비교된, 및/또는 하나 이상의 대조군 샘플내 ILC1의 수준과 비교된, 상기 대상체로부터 수득된 하나 이상의 샘플내 ILC1의 상승된 수준을 갖는 것으로 결정되는, 방법
- 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 폐 염증은 담배 연기, 박테리아 감염 또는 바이러스 감염에 의해 유발되는, 방법. - 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 질병 또는 장애가 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD)인, 방법. - 제11항에 있어서,
상기 악화는 담배 연기, 박테리아 감염 또는 바이러스 감염에 의해 유발되는, 방법. - 제9항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 폐 염증 또는 상기 질병 또는 장애의 악화가 바이러스 감염에 의해 유발되는, 방법. - 제9항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
ILC1의, 바이러스 복제와 관련된 영역으로의 이동을 억제하는 단계를 추가로 포함하는, 방법. - 질병-변경 약제로 치료하기 위한 후보로서 폐 염증과 관련된 질병 또는 장애로 진단된 환자를 선별하는 방법으로서, 상기 환자가 ILC1/ILC2의 미리 결정된 비율과 비교된, 및/또는 하나 이상의 대조군 샘플내 ILC1/ILC2의 비율과 비교된, 상기 대상체로부터 수득된 하나 이상의 샘플내 ILC1/ILC2의 상승된 비율을 갖는 것으로 결정된다면, 치료를 위한 환자를 선택하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제17항에 있어서,
상기 질병-변경 약제가 ILC2의 ILC1로의 전환 조절제인, 방법. - 제17항에 있어서,
상기 질병-변경 약제가 기관지 확장제, 흡입 스테로이드, 조합 흡입제, 경구 스테로이드 또는 포스포디에스테라제-4 억제제인, 방법. - 제17항에 있어서,
상기 조절제가 억제제 또는 작용제인, 방법. - 제20항에 있어서,
상기 억제제 또는 작용제가 소분자 화합물 또는 항체 또는 그의 항원 결합 단편인, 방법. - 제21항에 있어서,
상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 인간 항체, 인간화된 항체, 키메라 항체, 재조합 항체, 이중-특이적 항체, 다중-특이적 항체, 및 그의 항원-결합 단편으로부터 선택되는, 방법. - 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조절제가 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편인, 방법. - 제23항에 있어서,
상기 단일클론 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 Fv, Fab, F(ab')2, Fab', dsFv 단편, 단일사슬 Fv(scFV), sc(Fv)2, 디설파이드-결합(dsFv), 이중체, 삼중체, 사중체, 미니체, 또는 단일사슬 항체로부터 선택되는, 방법. - 제9항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
ILC1/ILC2의 사전 결정된 비율과 비교된, 및/또는 하나 이상의 대조군 샘플내 ILC1/ILC2의 비율과 비교된, 상기 대상체로부터 얻은 하나 이상의 샘플내 증가된 비율의 ILC1/ILC2를 갖는다는 상기 결정, 또는 ILC1의 사전 결정된 수준과 비교된, 및/또는 하나 이상의 대조군 샘플내 ILC1의 수준과 비교된, 상기 대상체로부터 얻은 하나 이상의 샘플내 증가된 수준의 ILC1의 상기 결정은 ILC2의 분자 표지와 ILC1의 분자 표지 사이의 전환의 결정에 기초되는, 방법. - 제25항에 있어서,
ILC2의 상기 분자 표지가 Gata3, Rora, Il4 , Il5, Il9 , ll13 , Penk(프로엔케팔린), Areg(암피레굴린), Il17rb, 및 Il1rI1로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 Th2-관련 전사체의 발현에 상응하는, 방법. - 제25항 또는 제26항에 있어서,
ILC1의 상기 분자 표지는 제26항에 따른 하나 이상의 Th2-관련 전사체의 더 낮은 발현 및 Tbx21 , Ifng , Il12rb2 , Il18r1 , Cxcr3, 및 Ccr5로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 전사체의 더 높은 수준에 상응하며, 상기 수준은 ILC2내 상기 전사체의 수준과 비교되는, 방법.
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