JP2019512015A - 機械的刺激による痛みに関連する電位依存性ナトリウム・チャネルNav1.1に対する調節薬 - Google Patents
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Abstract
本発明は、侵害受容及び痛みにおける役割が未知である電位依存性ナトリウム(Nav)チャネルの Nav1.1 サブタイプを選択的に遮断する化合物の使用を提供する。本発明は、Nav1.1 発現線維がモダリティ特異的侵害受容器であることを実証する:即ち、それらの活性化は、神経因性炎症のない強い疼痛行動を引き出し、熱的刺激ではなく、機械的刺激に対して顕著な過敏性を生じる。腸内では、閾値の高い機械的刺激感受性線維はまた Nav1.1 を発現し、過敏性腸症候群のモデルにおいてはトキシン感受性が高くなっている。本発明は、機械的刺激による痛みの根底にある感覚神経線維の興奮性を調節することにおいて、Nav1.1 の予想しなかった役割を提供し、Nav1.1 チャネルを調節することができる他のペプチド及び低分子のスクリーニングする方法及び神経学的障害を治療する際のそれらの使用を提供する。
Description
本出願は、2016 年 2 月 26 日に出願された米国仮特許出願第 62/300,237 号の利益を主張し、本明細書に完全に記載されているかのように、すべての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
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本出願には、EFS-Web を介して ASCII フォーマットで提出されたシーケンス・リストが含まれており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。2015 年 2 月 25 日に作成された前記 ASCII コピーは、P13939-01_ST25.txt という名前で、2,364 バイトのサイズである。
本出願には、EFS-Web を介して ASCII フォーマットで提出されたシーケンス・リストが含まれており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。2015 年 2 月 25 日に作成された前記 ASCII コピーは、P13939-01_ST25.txt という名前で、2,364 バイトのサイズである。
助成金に関する情報
本発明は、米国国立研究所(National Institutes of Health)の助成金 NS091352, NS065071, NS081907 に基づく政府の支援によってなされた。米国政府は本発明に一定の権利を有する。
本発明は、米国国立研究所(National Institutes of Health)の助成金 NS091352, NS065071, NS081907 に基づく政府の支援によってなされた。米国政府は本発明に一定の権利を有する。
痛みとは、機能的に異なるクラスの一次求心性神経線維が、有害な熱的、化学的及び/又は機械的な刺激を検出して、持続的な痛みに寄与する不適応反応と急性損傷に対する防御反応を誘発するマルチモーダル(multimodal)なシステムである1。これらの侵害受容ニューロンでは、3つの電位依存性ナトリウム(Nav)チャネル・サブタイプ(Nav1.7、Nav1.8 及び Nav1.9)が、これらのチャネルに影響を及ぼす突然変異が痛みに対して不感受性になる又は持続性疼痛の症候群に関連していることから、特に注目を集めてきている2-6。Nav1.1(遺伝子名:SCN1a)も体性感覚ニューロンに発現しているが7-10、このサブタイプと侵害受容との間の関連については何も確立していない11。しかし、Nav1.1 に影響する突然変異は、てんかん12,13、自閉症14、及びアルツハイマー病15などの中枢神経系(CNS)障害に関連しており、これらの臨床的に優性な表現型によって末梢ニューロンにおけるこのサブタイプの役割が隠れてしまっている可能性がある。例えば、Nav1.1 の機能獲得型突然変異は、家族性片麻痺片頭痛タイプ 316(familial hemiplegic migraine type 3)の根底にあり、家族性片麻痺片頭痛タイプ 3 の表現型が CNS で始まるメカニズムに起因されるにもかかわらず、一次感覚ニューロンにおける前記チャネルの機能不全がこの痛み症候群に寄与する可能性がある17。
痛みにおける Nav1.1 の役割を解析するためのもう一つの大きな障害は、この高度に保存されたイオン・チャネルのファミリーのメンバーに対してサブタイプ選択的薬理学的プローブを開発することが非常に困難なことであることである18。このように、これらレセプターのサブタイプ選択的な薬理学的プローブとしての役割を果たすことができる分子を同定すること、及び有用な痛みの調節因子を同定する際にそれらを使用すること、に対する未だ満たされていないニーズは依然として存在する。
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合成、低分子ベースの探索プラットフォームに代わるものとして、天然物を、優れた特異性でレセプターを標的とする進化的に磨き上げられてきた新規薬剤の供給源として利用することができる。このような薬剤は、クモ、サソリ、イモガイ、及びヘビの複雑な毒液中に見いだすことができ19,20、害を加えてくる捕食者に痛みや不快感を誘発する感覚性の侵害受容器を活性化させる毒素(トキシン(toxin))を含む。本願発明者らは、Nav1.1 を特異的に標的とする 2 種類の痛みを引き起こすタランチュラのトキシン、及びこれらの薬剤を利用して Nav1.1 選択性を達成する分子認識部位を同定することを本明細書に記載する。そのような選択性により、本願発明者らは、有髄線維のあるサブセットにあるこれらのチャネルを特異的に活性化させて、急性疼痛及び機械的刺激に対するアロディニアを誘発し、侵害受容及び疼痛過敏症における Nav1.1 及びこれらの感覚神経線維の特定の役割についての新しい洞察を提供する。
ある実施形態によれば、本発明は、Nav1.1 チャネル調節活性を有するポリペプチドを提供する。
ある実施形態によれば、本発明は、以下のアミノ酸配列を含む Nav1.1 チャネル調節活性を有するポリペプチド δ-テラホトキシン-Hm1a(Hm1a)を提供する:
a)ECRYLFGGCSSTSDCCKHLSCRSDWKYCAWDGTFS(配列番号:1);
b)a)の機能的フラグメント;
c)a)若しくは b)の機能的ホモログ又はそれらの機能的フラグメント;及び
d)a)から c)の何れかのアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド。
a)ECRYLFGGCSSTSDCCKHLSCRSDWKYCAWDGTFS(配列番号:1);
b)a)の機能的フラグメント;
c)a)若しくは b)の機能的ホモログ又はそれらの機能的フラグメント;及び
d)a)から c)の何れかのアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド。
別の実施形態によれば、本発明は、以下のアミノ酸配列を含む Nav1.1 チャネル調節活性を有するポリペプチド δ-テラホトキシン-Hm1b(Hm1b)を提供する:
a)ECRYLFGGCKTTADCCKHLGCRTDLYYCAWDGTF-NH2(配列番号:2);
b)a)の機能的フラグメント;
c)a)若しくは b)の機能的ホモログ又はそれらの機能的フラグメント;及び
d)a)から c)の何れかのアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド。
a)ECRYLFGGCKTTADCCKHLGCRTDLYYCAWDGTF-NH2(配列番号:2);
b)a)の機能的フラグメント;
c)a)若しくは b)の機能的ホモログ又はそれらの機能的フラグメント;及び
d)a)から c)の何れかのアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド。
ある実施形態によれば、本発明は、本明細書に記載の Nav1.1 調節活性を有するポリペプチド又はそれらの誘導体、ホモログ、アナログ若しくは模倣体のいずれかをコードする核酸配列を提供する。
ある更なる実施形態によれば、本発明は、本明細書に記載の Nav1.1 調節活性を有するポリペプチド又はそれらの誘導体、ホモログ、アナログ若しくは模倣体のいずれかをコードする 1 つ以上の核酸配列を含むベクター提供する。
更なる別の実施形態によれば、本発明は、本明細書に記載の Nav1.1 調節活性を有する 1 種類以上のポリペプチド又はそれらの誘導体、ホモログ、アナログ若しくは模倣体、及び少なくとも 1 種類以上の生物学的に活性な薬剤を含む組成物を提供する。
別の実施形態によれば、本発明は、本明細書に記載の Nav1.1 調節活性を有する 1 種類以上のポリペプチド又はそれらの誘導体、ホモログ、アナログ若しくは模倣体、及び少なくとも 1 種類以上の造影剤を含む組成物を提供する。
ある実施形態によれば、本発明は、本明細書に記載の Nav1.1 調節活性を有する 1 種類以上のポリペプチド又はそれらの誘導体、ホモログ、アナログ若しくは模倣体の使用であって、Nav1.1 レセプターを発現する細胞又は細胞集団において、Nav1.1 レセプターを調節するための、有効量の前記ポリペプチドに前記細胞又は細胞集団を接触させることを含む、使用を提供する。
別の実施形態によれば、本発明は、本明細書に記載の Nav1.1 調節活性を有する 1 種類以上のポリペプチド又はそれらの誘導体、ホモログ、アナログ若しくは模倣体を含む組成物の使用であって、神経学的障害に罹患している被験体において、Nav1.1 レセプターを調節するための、1 種類以上のポリペプチド、及び任意選択的に少なくとも 1 種類以上の生物学的に活性のある薬剤を含む有効量の組成物を、前記被験体に投与することを含む、使用を提供する。
ある実施形態によれば、本発明は、神経学的障害に罹患している被験体の有髄ニューロンにある機械的侵害受容器を阻害するための、1 種類以上の Nav1.1 チャネル遮断薬を含む組成物の使用であって、1 種類以上の Nav1.1 チャネル遮断薬及び薬学的に許容される担体を含む有効量の組成物を、前記被験体に投与することを含む、使用を提供する。
ある実施形態によれば、本発明は、神経学的障害に罹患している被験体において機械的刺激による痛みを阻害するための、1 種類以上の Nav1.1 チャネル遮断薬を含む組成物の使用であって、1 種類以上の Nav1.1 チャネル遮断薬及び薬学的に許容される担体を含む有効量の組成物を、前記被験体に投与することを含む、使用を提供する。
ある実施形態によれば、本発明は、神経学的障害に罹患している被験体においてアロディニアを阻害するための、1 種類以上の Nav1.1 チャネル遮断薬を含む組成物の使用であって、1 種類以上の Nav1.1 チャネル遮断薬及び薬学的に許容される担体を含む有効量の組成物を、前記被験体に投与することを含む、使用を提供する。
ある実施形態によれば、本発明は、神経学的障害に罹患している被験体において非炎症性の痛みを阻害するための、1 種類以上の Nav1.1 チャネル遮断薬を含む組成物の使用であって、1 種類以上の Nav1.1 チャネル遮断薬及び薬学的に許容される担体を含む有効量の組成物を、前記被験体に投与することを含む、使用を提供する。
ある実施形態によれば、本発明は、過敏性腸症候群(Irritable Bowel Syndrome (IBS))に罹患している被験体の内臓結腸求心性ニューロン(splanchnic colonic afferent neurons)を阻害するための、1 種類以上の Nav1.1 チャネル遮断薬を含む組成物の使用であって、1 種類以上の Nav1.1 チャネル遮断薬及び薬学的に許容される担体を含む有効量の組成物を、前記被験体に投与することを含む、使用を提供する。
ある実施形態によれば、本発明は、IBS 又は IBS に関連する痛みに罹患している被験体において IBS を治療するための、1 種類以上の Nav1.1 チャネル遮断薬を含む組成物の使用であって、1 種類以上の Nav1.1 チャネル遮断薬及び薬学的に許容される担体を含む有効量の組成物を、前記被験体に投与することを含む、使用を提供する。
本発明の詳細な説明
本願発明者らの知見は、侵害受容における Nav1.1 及び Nav1.1 発現有髄求心性神経の関与を明白に示唆している。これらの線維の活性化又は感作は、神経因性の炎症を誘発することなく、強い急性疼痛並びに機械的刺激によるアロディニアを誘発するのに十分であり、これらの線維を、十分に特徴がわかっている C-侵害受容線維とは区別する。これまでの研究によれば、機械的侵害受容に関して有髄化した Aδ 線維の関与が示唆されてきているが44,45、本願では Nav1.1 が、急性及び慢性疼痛に対するこれらの線維の寄与をより正確に同定する重要な新しいマーカーを提供する。
本願発明者らの知見は、侵害受容における Nav1.1 及び Nav1.1 発現有髄求心性神経の関与を明白に示唆している。これらの線維の活性化又は感作は、神経因性の炎症を誘発することなく、強い急性疼痛並びに機械的刺激によるアロディニアを誘発するのに十分であり、これらの線維を、十分に特徴がわかっている C-侵害受容線維とは区別する。これまでの研究によれば、機械的侵害受容に関して有髄化した Aδ 線維の関与が示唆されてきているが44,45、本願では Nav1.1 が、急性及び慢性疼痛に対するこれらの線維の寄与をより正確に同定する重要な新しいマーカーを提供する。
本願発明者らの CVH モデルによる知見は、Nav1.1 を薬理学的に遮断することが、IBS に関連する慢性疼痛及びおそらくは片頭痛を含む機械的刺激による感作に関連する他の疼痛症状を減少させるための新規治療戦略を提示することを示す。脳内の Nav1.1 活性が FHM3 患者における前兆の根源になっているかもしれないが17、本発明は、これらの機能獲得型突然変異がまた機械的侵害受容器における Nav1.1 の作用を介して片頭痛を生じさせ得ることも示している。
ある実施形態によれば、本発明は、Nav1.1 チャネル調節活性を有するポリペプチドを提供する。
ある実施形態によれば、本発明は、以下のアミノ酸配列を含む Nav1.1 チャネル調節活性を有するポリペプチド δ-テラホトキシン-Hm1a(Hm1a)を提供する:
a)ECRYLFGGCSSTSDCCKHLSCRSDWKYCAWDGTFS(配列番号:1);
b)a)の機能的フラグメント;
c)a)若しくは b)の機能的ホモログ又はそれらの機能的フラグメント;及び
d)a)から c)の何れかのアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド。
a)ECRYLFGGCSSTSDCCKHLSCRSDWKYCAWDGTFS(配列番号:1);
b)a)の機能的フラグメント;
c)a)若しくは b)の機能的ホモログ又はそれらの機能的フラグメント;及び
d)a)から c)の何れかのアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド。
ある実施形態によれば、本発明は、以下のアミノ酸配列を含む Nav1.1 チャネル調節活性を有するポリペプチド δ-テラホトキシン-Hm1b(Hm1b)を提供する:
a)ECRYLFGGCKTTADCCKHLGCRTDLYYCAWDGTF-NH2(配列番号:2);
b)a)の機能的フラグメント;
c)a)若しくは b)の機能的ホモログ又はそれらの機能的フラグメント;及び
d)a)から c)の何れかのアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド。
a)ECRYLFGGCKTTADCCKHLGCRTDLYYCAWDGTF-NH2(配列番号:2);
b)a)の機能的フラグメント;
c)a)若しくは b)の機能的ホモログ又はそれらの機能的フラグメント;及び
d)a)から c)の何れかのアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド。
ある実施形態によれば、本発明は、本明細書に記載の Nav1.1 チャネル調節活性を有するポリペプチド又はそれらの誘導体、ホモログ、アナログ若しくは模倣体のいずれかをコードする核酸配列を提供する。
ある更なる実施形態によれば、本発明は、本明細書に記載の Nav1.1 チャネル調節活性を有するポリペプチド又はそれらの誘導体、ホモログ、アナログ若しくは模倣体のいずれかをコードする 1 つ以上の核酸配列を含むベクター提供する。
更なる別の実施形態によれば、本発明は、本明細書に記載の Nav1.1 チャネル調節活性を有する 1 種類以上のポリペプチド又はそれらの誘導体、ホモログ、アナログ若しくは模倣体、及び少なくとも 1 種類以上の生物学的に活性な薬剤を含む組成物を提供する。
別の実施形態によれば、本発明は、本明細書に記載の Nav1.1 チャネル調節活性を有する 1 種類以上のポリペプチド又はそれらの誘導体、ホモログ、アナログ若しくは模倣体、及び少なくとも 1 種類以上の造影剤を含む組成物を提供する。
ある実施形態によれば、本発明は、本明細書に記載の Nav1.1 チャネル調節活性を有する 1 種類以上のポリペプチド又はそれらの誘導体、ホモログ、アナログ若しくは模倣体の使用であって、Nav1.1 レセプターを発現する細胞又は細胞集団において、Nav1.1 レセプターを調節するための、有効量の前記ポリペプチドに前記細胞又は細胞集団を接触させることを含む、使用を提供する。
別の実施形態によれば、本発明は、本明細書に記載の Nav1.1 チャネル調節活性を有する 1 種類以上のポリペプチド又はそれらの誘導体、ホモログ、アナログ若しくは模倣体を含む組成物を使用であって、神経学的障害に罹患している被験体において、Nav1.1 レセプターを調節するための、1種類以上のポリペプチド、及び任意選択的に少なくとも 1 種類以上の生物学的に活性のある薬剤を含む有効量の組成物を、前記被験体に投与することを含む、使用を提供する。
用語「アミノ酸(amino acid)」は D 体又は L 体の天然の α-アミノ酸の残基(例えば、Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Lys、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、及び Val)、並びに β-アミノ酸、合成及び非天然アミノ酸を含む。多くのタイプのアミノ酸残基が前記ポリペプチドにおいて有用であり、本発明は天然の遺伝的にコードされるアミノ酸に限定されない。本明細書に記載されるペプチドに利用され得るアミノ酸の例は、例えば、Fasman, 1989, CRC Practical Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, CRC Press, Inc. 及びその中で引用される参考文献に見出すことができる。広範囲のアミノ酸残基の別の供給源は、RSP Amino Acids LLCのウェブサイトによって提供されている。
本明細書において「誘導体(derivatives)」とは、本発明の Nav1.1 チャネル調節ペプチドの部分(parts)、断片及び部分(portions)を含む。誘導体にはまた、一つ又は複数のアミノ酸置換、欠失及び/又は付加が含まれる。ホモログは、同じ種のクモ、又は同じ属又は科のクモのからの毒液からの機能的、構造的又は立体化学的に類似したペプチドを含む。そのようなホモログはすべて本発明によって企図される。
アナログ及び模倣体は、天然に存在しないアミノ酸を含むか、又はアミノ酸を含まないにもかかわらず前記ペプチドと機能的に同じ挙動を示す分子を含む分子を含む。天然物をスクリーニングすることは、アナログ及び模倣体を同定するための 1 つの有用な戦略である。
ペプチド合成中に非天然アミノ酸及び誘導体を取り込むことの例には、限定されるものではないが、ノルロイシン、4-アミノ酪酸、4-アミノ-3-ヒドロキシ-5-フェニルペンタン酸、6-アミノヘキサン酸、t-ブチルグリシン、ノルバリン、フェニルグリシン、オミシン、サルコシン、4-アミノ-3-ヒドロキシ-6-メチルヘプタン酸、2-チエニルアラニン及び/又はアミノ酸のD-異性体の使用が含まれる。本明細書で意図される既知の非天然アミノ酸の部分的なリストを表1に示す。
本明細書で企図される本発明のペプチドのアナログには、側鎖への修飾、ペプチド合成中の非天然アミノ酸及び/又はそれらの誘導体の取り込み、前記ペプチド分子又はそれらのアナログに構造的な制約を課す架橋剤の使用及び他の方法が含まれる。
ある実施形態によれば、本発明は、以下のアミノ酸配列を含む Nav1.1 チャネル調節活性を有するポリペプチド δ-テラホトキシン-Hm1a(Hm1a)のバリアント(variant)を提供する:
a)ECRYLFGGCSSTSDCCKHLSCRSDWKYCAWDGTF(配列番号:3);
b)a)の機能的フラグメント;
c)a)若しくは b)の機能的ホモログ又はそれらの機能的フラグメント;及び
d)a)から c)の何れかのアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド。
a)ECRYLFGGCSSTSDCCKHLSCRSDWKYCAWDGTF(配列番号:3);
b)a)の機能的フラグメント;
c)a)若しくは b)の機能的ホモログ又はそれらの機能的フラグメント;及び
d)a)から c)の何れかのアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド。
ある実施形態によれば、本発明は、以下のアミノ酸配列を含む Nav1.1 チャネル調節活性を有するポリペプチド δ-テラホトキシン-Hm1b(Hm1b)のバリアント(variant)を提供する:
a)ECRYLFGGCKTTADCCKHLGCRTDLYYCAWDGTF(配列番号:4);
b)a)の機能的フラグメント;
c)a)若しくは b)の機能的ホモログ又はそれらの機能的フラグメント;及び
d)a)から c)の何れかのアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド。
a)ECRYLFGGCKTTADCCKHLGCRTDLYYCAWDGTF(配列番号:4);
b)a)の機能的フラグメント;
c)a)若しくは b)の機能的ホモログ又はそれらの機能的フラグメント;及び
d)a)から c)の何れかのアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド。
本発明によって考慮される側鎖修飾の例には、アルデヒドとの反応、続いて NaBH4 での還元による還元的アルキル化;メチルアセトイミデート(methylacetimidate)によるアミド化;無水酢酸によるアシル化;シアン酸塩を用いたアミノ基のカルバモイル化;2,4,6-トリニトロベンゼン・スルホン酸(TNBS)によるアミノ基のトリニトロベンジル化;無水コハク酸及び無水テトラヒドロフタル酸によるアミノ基のアシル化;ピリドキサール-5-リン酸によるリジンのピリドキシル化と続いて NaBH4 を用いる還元などのアミノ基の修飾を含む。
アルギニン残基のグアニジン基は、2,3-ブタンジオン、フェニルグリオキサール及びグリオキサールなどの試薬を用いた複素環式縮合生成物の形成によって修飾することができる。
カルボキシル基は、O-アシルイソウレア形成を介したカルボジイミド活性化、続いて例えば対応するアミドへの誘導体化により修飾することができる。
スルフヒドリル基は、ヨード酢酸又はヨードアセトアミドによるカルボキシメチル化;システイン酸への過ギ酸酸化;他のチオール化合物との混合ジスルフィドの形成;マレイミド、無水マレイン酸又は他の置換マレイミドとの反応;4-クロロ水銀安息香酸、4-クロロ水銀フェニルスルホン酸、フェニル水銀クロライド、2-クロロ水銀-4-ニトロフェノール及び他の水銀を使用する水銀誘導体の形成;アルカリ性 pH でシアン酸塩を用いたカルバモイル化、などの方法によって修飾することができる。
トリプトファン残基は、例えば、N-ブロモスクシンイミドによる酸化、又は 2-ヒドロキシ-5-ニトロベンジル・ブロミド又はスルフェニル・ハライドによるインドール環のアルキル化によって修飾することができる。一方、チロシン残基は、テトラニトロメタンによるニトロ化により3-ニトロチロシン誘導体を形成するように改変することができる。
ヒスチジン残基のイミダゾール環の修飾は、ヨード酢酸誘導体を用いたアルキル化又はジエチルピロカーボネートを用いたN-カルボエトキシル化によって行うことができる。
3D 構造を安定化させるために、例えば、n = 1 から n = 6 の (CH2)n スペーサー基を有する二官能性イミド・エステル、グルタルアルデヒド、N-ヒドロキシスクシンイミド・エステルのようなホモ二官能性クロスリンカ―、並びに N-ヒドロキシスクシンイミドなどのアミノ反応性部分及びマレイミド、ジチオ部分(SH)又はカルボジイミド(COOH)などもう一つ別の官能基特異的反応性部分を通常含むヘテロ二官能性試薬を使用する、クロスリンカ―を使用しても良い。更に、ペプチドを、例えば、Cα 及び Nα-メチルアミノ酸の取り込み、アミノ酸の Cα 及び Cβ 原子間への二重結合の導入、N 又は C 末端との間、2 つの側鎖間又は側鎖と N 又は C 末端の間にアミド結合を形成するような共有結合を導入することによる環状ペプチド又はアナログの形成によって、立体構造的に制約しても良い。
本発明は更に、本発明のNav1.1 チャネル調節ペプチドのアンタゴニスト又はアゴニストとして作用することができる本ペプチドの小さな化学的アナログを企図する。化学的アナログは、前記ペプチド自体から必ずしも得られるとは限らないが、ある立体構造的な類似性を共有することがある。あるいは、化学的アナログは、前記ペプチドのある物理化学的特性を模倣するように特異的に設計されてもよい。化学的アナログは、化学的に合成されることもあるし、又は例えば天然物スクリーニングの後に見つけられることもある。
例えば、本願発明者らは、ルフィナミドから誘導され、2015 年 7 月 31 日に出願された米国特許公開第2015/0336904号に開示されており、あたかもその全体が述べられているかのように本明細書中に参考として援用される、新しいクラスの Nav1.1 チャネル遮断薬を以前に発見した。例えば、ある実施形態では、本発明は、式(I):
式(I);
の化合物又はそれらの塩、溶媒和若しくは立体異性体、ここで、X は水素又は 1 つ以上のハロゲン、NH2、NO2、SO2、CN 若しくは C1-C6アルキル基のような電子求引基;Alk は C1-C3 アルキル;R1は H, C1-C6アルキルで、これは OH、NH2、アルキルアミノ、アミド、アシル、スルホニル、スルホニルアミノ及びシアノ基で置換されていても良く;R2 は C1-C6アルキル、アルケニル及びフェニルで、これは 1 つ以上の OH、NH2、アルキルアミノ、アミド、アシル、カルボキシル、メトキシル、スルホニル、及びシアノ基で置換されていてもよく、並びに薬学的に許容される担体を、有効な量で、薬剤としての用途のために、好ましくは被験体の 1 つ以上のニューロンにある 1 つ以上の電位依存性ナトリウム Nav1.1 チャネルを開けることを調整する使用のために、又は、被験体の神経学的障害に関連する Nav1.1 チャネルを処理する際に使用するために、含む医薬組成物を提供する。
の化合物又はそれらの塩、溶媒和若しくは立体異性体、ここで、X は水素又は 1 つ以上のハロゲン、NH2、NO2、SO2、CN 若しくは C1-C6アルキル基のような電子求引基;Alk は C1-C3 アルキル;R1は H, C1-C6アルキルで、これは OH、NH2、アルキルアミノ、アミド、アシル、スルホニル、スルホニルアミノ及びシアノ基で置換されていても良く;R2 は C1-C6アルキル、アルケニル及びフェニルで、これは 1 つ以上の OH、NH2、アルキルアミノ、アミド、アシル、カルボキシル、メトキシル、スルホニル、及びシアノ基で置換されていてもよく、並びに薬学的に許容される担体を、有効な量で、薬剤としての用途のために、好ましくは被験体の 1 つ以上のニューロンにある 1 つ以上の電位依存性ナトリウム Nav1.1 チャネルを開けることを調整する使用のために、又は、被験体の神経学的障害に関連する Nav1.1 チャネルを処理する際に使用するために、含む医薬組成物を提供する。
ある別の実施形態では、式(I)の化合物は、以下からなる群:
又はそれらの塩、溶媒和若しくは立体異性体、から選択される。
したがって、ある実施形態によれば、本発明は、神経学的障害に罹患している被験体の有髄ニューロンにある機械的侵害受容器を阻害するための、1 種類以上の Nav1.1 チャネル遮断薬を含む組成物の使用であって、1 種類以上の Nav1.1 チャネル遮断薬及び薬学的に許容される担体を含む有効量の組成物を、前記被験体に投与することを含む、使用を提供する。
本明細書中で使用される場合、用語「有髄ニューロン(myelinated neurons)」は、有髄化され、侵害受容器を有する神経線維を指す。これらの神経線維は、A 有髄線維又は「AM」線維とも呼ばれ、又はある実施形態では、Aδ 疼痛線維を指す。
当業者であれば、侵害受容器に関連する軸索は、比較的ゆっくりとした伝導を担い、わずかにミエリン化されているか、又はより一般的にはミエリン化されていないことが理解されるであろう。したがって、痛みに関する情報を伝達する軸索は、AM 線維として本発明で言及されるように、約 20 m/s で伝導する Aδ 群の有髄軸索、又は一般に2 m/s 未満の速度で伝導する C 線維群の無髄軸索のどちらかに該当する。よって、すべての侵害受容情報の伝導が比較的遅いとしても、早い疼痛経路と遅い疼痛経路とが存在する。
一般に、より速く伝導する Aδ 侵害受容器は、危険な強い機械的な刺激又は熱機械的な刺激のいずれかに応答し、感受性スポットのクラスターからなる受容野を有する。他の無髄の侵害受容器は、熱的、機械的、及び化学的な刺激に応答する傾向があり、したがって、ポリモーダル(polymodal)であると言われている。要するに、皮膚には 3 つの主要な侵害受容器がある:即ち、Aδ 機械的刺激感受性侵害受容器、Aδ 熱機械的侵害受容器、及びポリモーダル(polymodal)侵害受容器があり、後者は特に C 線維と関連している。すべての痛み感受性ニューロンの受容野は比較的大きく、特に視床及び皮質のレベルでは大きい。おそらく、痛みの検出がその正確な場所よりも重要であるからであろう。
ある実施形態によれば、本発明は、神経学的障害に罹患している被験体において機械的刺激による痛みを阻害するための、1 種類以上の Nav1.1 チャネル遮断薬を含む組成物の使用であって、1 種類以上の Nav1.1 チャネル遮断薬及び薬学的に許容される担体を含む有効量の組成物を、前記被験体に投与することを含む、使用を提供する。
本明細書で使用する場合、用語「機械的刺激による痛み(mechanical pain)」は、機械的な又は熱機械的な刺激による痛みを含むことがある。
ある実施形態によれば、本発明は、神経学的障害に罹患している被験体においてアロディニアを阻害するための、1 種類以上の Nav1.1 チャネル遮断薬を含む組成物の使用であって、1 種類以上の Nav1.1 チャネル遮断薬及び薬学的に許容される担体を含む有効量の組成物を、前記被験体に投与することを含む、使用を提供する。
本明細書で使用する場合、用語「アロディニア(allodynic pain)」は、軽く触れるというような無害な機械的刺激によって引き起こされる痛みを伴う感覚を意味する。防御的役割を有する炎症性痛覚過敏性とは異なり、アロディニアには明らかな生物学的有用性がない。アロディニアは、糖尿病及び線維筋痛などの状態での神経損傷に関連する。
ある実施形態によれば、本発明は、神経学的障害に罹患している被験体において非炎症性の痛みを阻害するための、1 種類以上の Nav1.1 チャネル遮断薬を含む組成物の使用であって、1 種類以上の Nav1.1 チャネル遮断薬及び薬学的に許容される担体を含む有効量の組成物を、前記被験体に投与することを含む、使用を提供する。
本明細書で使用する場合、用語「非炎症の痛みを阻害する(inhibit non-inflammatory pain)」は、組織の炎症又は炎症及び炎症過程から生じる組織損傷以外の病因によって引き起こされる痛みを伴う感覚を意味する。
ある実施形態によれば、本発明は、過敏性腸症候群(IBS)に罹患している被験体の内臓結腸求心性ニューロン(splanchnic colonic afferent neurons)を阻害するための、1 種類以上の Nav1.1 チャネル遮断薬を含む組成物の使用であって、1 種類以上の Nav1.1 チャネル遮断薬及び薬学的に許容される担体を含む有効量の組成物を、前記被験体に投与することを含む、使用を提供する。
ある実施形態によれば、本発明は、IBS 又は IBS に関連する痛みに罹患している被験体において IBS を治療するための、1 種類以上の Nav1.1 チャネル遮断薬を含む組成物の使用であって、1 種類以上の Nav1.1 チャネル遮断薬及び薬学的に許容される担体を含む有効量の組成物を、前記被験体に投与することを含む、使用を提供する。
本明細書で使用する場合、用語「ペプチド」は、長さ 4 から 100 アミノ酸残基、好ましくは長さ約 10 から 80 残基、より好ましくは長さ 15 から 65 残基の配列を含み、1 つのアミノ酸の α-カルボキシル基は、隣接するアミノ酸の主鎖(α- 又は β-)のアミノ基にアミド結合によって結合している。本明細書で、記載及び特許請求された方法及び組成物での使用のために提供されるペプチドは、環状であってもよい。
ヒト被験体での正確な有効量は、前記被験体の疾患症状の重篤度、全身の健康状態、年齢、体重、性別、食事、投与の時間及び頻度、薬物の組合せ、反応感受性、並びに治療に対する忍容性又は反応性に依存する。ありふれた実験によって、この量を決定することができ、医療専門家の判断の範囲内である。組成物は、患者に個別に投与されてもよく、又は他の薬物、ホルモン、薬剤などと組み合わせて投与されてもよい。
本発明のペプチド及び 1 種類以上の Nav1.1 チャネル遮断薬の投与経路には、限定されるものではないが、皮下、静脈内、腹腔内、頭蓋内、皮内、筋肉内、眼内、髄腔内、脳内、鼻腔内、点滴、点滴静注、パッチ及びインプラント(例えば、ポンプ)が含まれる。
1 つ以上の実施形態において、本発明は、1 種類以上の本発明のペプチド又は 1 種類以上の Nav1.1 チャネル遮断薬及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。他の態様において、前記医薬組成物はまた、1 種類以上の更なる生物学的に活性な薬剤を含む。
本明細書に記載されるペプチド組成物に関して、前記担体は、従来使用されているものの何れであっても良く、溶解性及び前記活性化合物との反応性の欠如などの物理化学的な考慮のみによって、並びに投与経路によってのみ制限される。本明細書に記載される担体、例えば、ビヒクル(vehicle)、アジュバント、賦形剤、及び希釈剤は、当業者に周知であり、一般に容易に入手可能である。前記担体は、前記活性薬剤に対して化学的に不活性なものであることが好ましく、使用条件下で有害な副作用又は毒性をほとんど又は全く有さないものであることが好ましい。前記担体の例には、生理学的に許容され得る既知の緩衝液のような可溶性担体(例えば、リン酸緩衝液)、並びに固体担体又はラテックス・ビーズなどの固体組成物が含まれる。
本明細書で使用される担体又は希釈剤は、固形製剤のための固体担体又は希釈剤、液体製剤のための液体担体又は希釈剤、又はそれらの混合物であってもよい。
限定されるものではないが、固体担体又は希釈剤は、ゴム、デンプン(例えば、コーン・スターチ、アルファ化デンプン)、糖類(例えば、ラクトース、マンニトール、スクロース、デキストロース)、セルロース系物質(例えば微結晶セルロース)、アクリレート (例えばポリメチルアクリレート)、炭酸カルシウム、酸化マグネシウム、タルク、又はそれらの混合物を含む。
液体製剤の場合、薬学的に許容される担体は、例えば、水性又は非水性の溶液又は懸濁液であることがある。非水性溶媒の例は、プロピレン・グリコール、ポリエチレン・グリコール、及び例えばオレイン酸エチルのような注射可能な有機エステルである。水性担体には、例えば、生理食塩水及び緩衝媒体を含む、水、アルコール/水溶液、シクロデキストリン、エマルション又は懸濁液が含まれる。
非経口ビヒクル(vehicle)(皮下、静脈内、動脈内、又は筋肉内注射用)には、例えば、塩化ナトリウム溶液、リンゲル・デキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル(lactated Ringer's)及び固定油が含まれる。非経口投与に適した製剤には、例えば、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤及び前記製剤を対象となるレシピエントの血液と等張にする溶質を含有することがある水性並びに非水性の等張滅菌注射溶液、並びに懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤及び防腐剤を含有することがある水性並びに非水性滅菌懸濁液が挙げられる。
更に、ある実施形態において、本発明のペプチド又はそれらの誘導体、又は 1 種類以上の Nav1.1 チャネル遮断薬を含む組成物は、結合剤(例えば、アカシア、コーンスターチ、ゼラチン、カルボマー、エチル・セルロース、グアー・ガム、ヒドロキシプロピル・セルロース、ヒドロキシプロピル・メチル・セルロース、ポビドン)、崩壊剤(例えば、コーンスターチ、片栗粉、アルギン酸、二酸化ケイ素、クロスカルメロース・ナトリウム、クロスポビドン、グアー・ガム、デンプン・グリコール酸ナトリウム)、様々な pH とイオン強度のバッファー(例えば、Tris-HCl、酢酸バッファー、リン酸バッファー)、表面への吸着を防ぐアルブミン又はゼラチンのような添加物、洗剤(detergents)(例えば、Tween 20、Tween 80、Pluronic F68、胆汁酸塩)、プロテアーゼ阻害剤、界面活性剤(surfactants)(例えば、ラウリル硫酸ナトリウム)、浸透促進剤(permeation enhancers)、可溶化剤(例えば、クレモホール、グリセロール、ポリエチレン・グリセロール、塩化ベンザルコニウム 、安息香酸ベンジル、シクロデキストリン、ソルビタン・エステル、ステアリン酸)、酸化防止剤(例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム、ブチル化ヒドロキシアニソール)、安定化剤(例えば、ヒドロキシプロピル・セルロース、ヒドロキシプロピルメチル・セルロース)、増粘剤(例えば、カルボマー、コロイド状二酸化ケイ素、エチル・セルロース、グアー・ガム)、甘味剤(例えば、アスパルテーム、クエン酸)、防腐剤(例えば、チメロサール、ベンジル・アルコール、パラベン)、潤滑剤(例えば、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレン・グリコール、ラウリル硫酸ナトリウム)、流動助剤(例えば、コロイド状二酸化ケイ素)、可塑剤(例えば、フタル酸ジエチル、クエン酸トリエチル)、乳化剤(例えば、カルボマー、ヒドロキシプロピル・セルロース、ラウリル硫酸ナトリウム)、ポリマー・コーティング(例えば、ポロキサマー又はポロキサミン)、コーティング及びフィルム形成剤(例えば、エチル・セルロース、アクリレート、ポリメタクリレート)、及び/又はアジュバントを更に含むことがある。
担体の選択は、部分的には、特定のペプチド又は 1 種類以上の Nav1.1 チャネル遮断薬を含む組成物によって、前記組成物を投与するために使用される特定の方法と同様、決定される。したがって、本発明の薬学的組成物の様々な適切な製剤が存在する。1 つ以上の経路を使用して本発明の組成物を投与することができ、ある場合には、特定の経路は、別の経路よりもより即時的かつより有効な応答を提供することができる。
注射用製剤は本発明に従う。注射可能な組成物のための有効な医薬担体の要件は、当業者に周知である(例えば、Pharmaceutics and Pharmacy Practice, J.B. Lippincott Company, Philadelphia, PA, Banker and Chalmers, eds., 頁 238-250 (1982), 及び ASHP Handbook on Injectable Drugs, Trissel, 15th ed., 頁 622-630 (2009))。
本明細書中で使用される場合、用語「治療的に活性な薬剤(therapeutically active agent)」又は「生物学的に活性な薬剤(biologically active agent)」は、疾患又は症状を、それに罹患している被験体において、治療又は調節するのに有用な薬剤を意味する。治療的に活性な薬剤の例には、疾患の症状を治療するための当該分野で公知の任意の薬物(drugs)、ペプチド、siRNA及びコンジュゲートを含むことがある。
生物学的に活性な薬剤は、前記組成物の意図された目的に応じて広範囲に変化し得る。活性という用語は当該分野で認識されており、被験体において局所的に又は全身的に作用する生物学的、生理学的又は薬理学的に活性な物質である任意の部分を指す。「薬物(drugs)」と呼ぶことができる生物学的に活性な薬剤の例は、Merck Index、Physicians’ Desk Reference 及び The Pharmacological Basis of Therapeutics のような周知の文献に記載されており、それらは、限定されることなく、医薬品;ビタミン;ミネラル・サプリメント;疾患又は病気の治療、予防、診断、治癒又は緩和に使用される物質;身体の構造又は機能に影響を及ぼす物質;又は生理学的環境に置かれた後に生物学的に活性又はより活性になるプロドラッグ(pro-drugs)を含む。
生物学的に活性な薬剤の更なる例としては、酵素、レセプター・アンタゴニスト又はアゴニスト、ホルモン及び抗体を含むが、これらに限定されない。有用な生物学的に活性な薬剤の具体例には、例えば、自律神経薬(抗コリン作用薬、抗ムスカリン性抗コリン作用薬、麦角アルカロイド、副交感神経作用薬、コリン作動性副交感神経作用薬(cholinergic agonist parasympathomimetics)、コリンエステラーゼ阻害薬副交感神経作用薬(cholinesterase inhibitor parasympathomimetics)、交感神経遮断薬、α-遮断薬交感神経遮断薬(α-blocker sympatholytics)、交感神経遮断薬、交感神経刺激薬及びアドレナリン作動性交感神経刺激静脈麻酔薬(adrenergic agonist sympathomimetics intravenous anesthetics)、バルビツレート系静脈麻酔薬、ベンゾジアゼピン系静脈麻酔薬及びオピエート・アゴニスト静脈麻酔薬骨格筋弛緩薬(opiate agonist intravenous anesthetics skeletal muscle relaxants)、神経筋遮断薬骨格筋弛緩薬、並びにリバース神経筋遮断薬骨格筋弛緩薬(reverse neuromuscular blocker skeletal muscle relaxants)など);神経学的薬(抗痙攣薬、バルビツレート系抗痙攣薬、ベンゾジアゼピン系抗痙攣薬、抗片頭痛薬、抗パーキンソン病薬、抗めまい薬、オピエート・アゴニスト(opiate agonists)及びオピエート・アンタゴニスト(opiate antagonists)など);向精神薬(抗うつ薬、ヘテロ環抗うつ薬、モノアミン・オキシダーゼ阻害薬、選択的セロトニン再取り込み阻害薬、三環系抗うつ薬、抗そう薬、抗精神病薬、フェノチアジン系抗精神病薬、抗不安薬、鎮静薬並びに催眠薬、バルビツレート系鎮静薬及び催眠薬、ベンゾジアゼピン系抗不安薬、鎮静薬、並びに催眠薬、並びに精神刺激薬など)が含まれる。
本明細書で使用される場合、用語「治療する(treat)」及び「予防する(prevent)」は、それに派生する語句と同様に、必ずしも 100 %又は完全な治療又は予防を意味するものではない。むしろ、当業者のうちの 1 人が潜在的な利益又は治療効果を有すると認識する様々な程度の治療又は予防が存在する。
本明細書で使用される場合、用語「治療する(treat)」とは、それに派生する語句と同様に、診断的及び予防的並びに疾患を緩和する治療(disorder remitative treatment)を含む。
Nav1.1 チャネル調節活性を、直接的又は間接的に含む神経学的障害は、本ペプチド及び本発明のペプチド又は 1 種類以上の Nav1.1 チャネル遮断薬を含む医薬組成物を用いて研究及び/又は治療することができる。Nav1.1 チャネルが関与する疾患の知られた例には:発熱性てんかん(febrile epilepsy)、GEFS +、ドラベット症候群(Dravet syndrome)(乳児期の重症のミオクローヌスてんかん (severe myclonic epilepsy of infancy)又は SMEI としても知られている)、境界型 SMEI(SMEB)、ウェスト症候群(West syndrome)(乳児痙攣としても知られている)、ドゥーズ症候群(Doose syndrome)(ミオクロニー脱力発作を伴うてんかん(myoclonic astatic epilepsy)としても知られている)、ミオクロニーを伴わない乳児難治てんかん(intractable childhood epilepsy with generalized tonic-clonic seizures)(ICEGTC)、パナイトポーロス症候群(Panayiotopoulos syndrome)、家族性自閉症、ラスムッセン脳炎(Rasmussens's encephalitis)及びレノックス−ガストー症候群(Lennox-Gastaut syndrome)が含まれる。本明細書に記載された発見に基づいて、限定されるものではないが、そのような疾患の他の例には、アルツハイマー病、FHM3を含む片頭痛並びに疾患(例えば、過敏性腸症候群、ニューロパチーと関連した静的、機械的又は動的アロディニア、複合性局所疼痛症候群(complex regional pain syndrome)、帯状疱疹後神経痛、線維筋痛症、脊髄損傷、月経痛、他の子宮痛及び関連疾患を含む)での機械的刺激感受性神経線維に関連する急性及び/又は慢性疼痛の治療が含まれる。
ある実施形態では、本発明のペプチド及び 1 種類以上の Nav1.1 チャネル遮断薬組成物は、前記ペプチド及び組成物に共有結合した造影剤を含むことがある。
ある実施形態によれば、本発明は、本明細書に記載の Nav1.1 チャネル調節活性を有する 1 種類以上のポリペプチド及び少なくとも 1 種類以上の造影剤とを含む組成物を提供する。
別の実施形態によれば、本発明は、1 種類以上の Nav1.1 チャネル遮断薬及び少なくとも 1 種類以上の造影剤を含む組成物を提供する。
ある実施形態では、前記造影剤は蛍光色素である。前記色素は、可視又は近赤外(NIR)スペクトルのエミッタ(emitter)であることがある。本発明に有用な既知の色素としては、カルボシアニン、インドカルボシアニン、オキサカルボシアニン、チアカルボシアニン 及びメロシアニン、ポリメチン、クマリン 、ローダミン、キサンテン、フルオレセイン、ホウ素ジピロメテン (BODIPY)、Cy5、Cy5.5、Cy7、VivoTag-680、VivoTag-S680、VivoTag-S750、AlexaFluor488、AlexaFluor660、AlexaFluor680、AlexaFluor700、AlexaFluor750、AlexaFluor790、Dy677、Dy676、Dy682、Dy752、Dy780、DyLight547、Dylight647、HiLyte Fluor 647、HiLyte Fluor 680、HiLyte Fluor 750、IRDye 800CW、IRDye 800RS、IRDye 700DX、ADS780WS、ADS830WS及びADS832WSがある。
NIR 領域において活性である有機色素は、生物医学的利用において公知である。しかし、親水性や光安定性が低く、量子収率が低く、生体系での安定性が低く及び検出感度が低いなど、従来の色素の限界のために容易に利用できる NIR 色素はごくわずかである。非常に改善された化学的及び光安定性、高い蛍光強度及び長い蛍光寿命を有する NIR 色素(シアニン色素、スクアライン、フタロシアニン、ポルフィリン誘導体及び BODIPY(ホウ素ジピロメテン )アナログを含む)の開発に最近大きな進歩が見られた。NIR 色素の例は、ポリメチン架橋によって連結された 2 つの含窒素芳香族複素環を有する小有機分子であるシアニン色素(ポリメチン・シアニン色素とも呼ばれる)を含み、Cy5、Cy5.5、Cy7 及びそれらの誘導体を含む。スクアライン(しばしばスクアリリウム色素と呼ばれる)は、分子の両端に芳香族又は複素環成分を有するオキソシクロブテロレート・コアからなり、その一例は KSQ-4-H である。フタロシアニンは、窒素原子を介して一緒に結合した4つの架橋ピロール・サブユニットからなる二次元 18π 電子芳香族ポルフィリン誘導体である。BODIPY(ホウ素ジピロメテン )色素は、4,4'-ジフルオロ-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセンの一般構造を有し、高い量子収率及び優れた熱及び光化学安定性を備えたバンド幅が狭く鋭い蛍光(sharp fluorescence)を有する。
本発明のペプチド又は 1 種類以上の Nav1.1 チャネル遮断薬及び本発明の組成物に結合することがある他の造影剤には、PET 造影剤及び SPECT 造影剤が含まれる。最も広く使用されている薬剤には、ジエチレン・トリアミン・ペンタ酢酸(DTPA)、1,4,7,10-テトラ-アザシクロドデカン-1,4,7,10-テトラ酢酸(DOTA)及びそれらの類縁体などの分岐キレート剤を含む。ジアミン・ジチオール、活性化メルカプトアセチル - グリシル - グリシル - グリシン(MAG3)、及びヒドラジドニコチンアミド(HYNIC)などのキレート剤は、99mTc 及び 186Re のような金属をキレート化することができる。キレート剤を使用する代わりに、N-スクシンイミジル-4-18F-フルオロベンゾエート(18F-SFB)のような補欠分子族が、ペプチドを 18F で標識するために必要である。ある実施形態によれば、前記キレート剤は DOTA である。
ある実施形態によれば、本発明は、イメージングに適した金属同位体に結合した本発明のペプチド又は 1 種類以上の Nav1.1 チャネル遮断薬を提供する。本発明に有用な同位体の例としては、Tc-94m、Tc-99m、In-111、Ga-67、Ga-68、Y-86、Y-90、Lu-177、Re-186、Re-188、Cu-64、Cu-67、Co-55、Co-57、Sc-47、Ac-225、Bi-213、Bi-212、Pb-212、Sm-153、Ho-166 又は Dy-i66 が含まれる。
ある実施形態によれば、本発明は、ペプチド又は 1 種類以上の Nav1.1 チャネル遮断薬及び組成物を提供し、そのなかにおいて、前記造影剤部分は、SPECT イメージングにおける使用に適していることが知られている 111In 標識 DOTA を含む。
別の実施形態によれば、本発明は、ペプチド又は 1 種類以上の Nav1.1 チャネル遮断薬及び組成物を提供し、そのなかにおいて、前記造影剤は、MR イメージングでの使用に適していることが知られている Gd3 + 標識 DOTA を含む。他の適切な放射性同位元素が、本明細書中に開示される 111In 及び Gd3+ と置換され得ることは、当業者に理解される。
ある実施形態によれば、本発明は、本明細書に記載の Nav1.1 チャネル調節活性を有する 1 種類以上のポリペプチド、又はそれ以上の Nav1.1 チャネル遮断薬を含む組成物(Nav1.1 チャネル遮断薬は、その組成物を必要とする被験体のなかで、直接的に又は間接的に、Nav1.1 チャネルを調節する活性を含む神経学的障害の診断のために、少なくとも 1 種類以上の造影剤に共有結合している)の使用を提供し、Nav1.1 チャネル調節活性を有する 1 種類以上のポリペプチド、又はそれ以上の Nav1.1 チャネル遮断薬(少なくとも 1 種類以上の造影剤に共有結合している)及び薬学的に許容される担体を含む有効量の組成物を前記被験体に投与することを含む、組成物の使用を提供する。
限定されるものではないが、そのような造影剤を使用することができる疾患の例には:発熱性てんかん(febrile epilepsy)、GEFS +、ドラベット症候群(Dravet syndrome)、境界型 SMEI(SMEB)、ウェスト症候群(West syndrome)、ドゥーズ症候群(Doose syndrome)、ミオクロニーを伴わない乳児難治てんかん(intractable childhood epilepsy with generalized tonic-clonic seizures)(ICEGTC)、パナイトポーロス症候群(Panayiotopoulos syndrome)、家族性自閉症、ラスムッセン脳炎(Rasmussens's encephalitis)、レノックス−ガストー症候群(Lennox-Gastaut syndrome)、FHM3を含む片頭痛、疾患(例えば、過敏性腸症候群、ニューロパチーと関連した静的、機械的又は動的アロディニア、複合性局所疼痛症候群(complex regional pain syndrome)、帯状疱疹後神経痛、線維筋痛症、脊髄損傷及び関連疾患を含む)での機械的刺激感受性神経線維に関連する急性及び/又は慢性疼痛、が含まれ得る。
ある実施形態によれば、本発明は、本明細書に記載の Nav1.1 調節活性を有するポリペプチド又はそれらの誘導体、ホモログ、アナログ若しくは模倣体のいずれかをコードする 1 つ以上の核酸配列を提供する。
本明細書で使用される「核酸(nucleic acid)」は、「ポリヌクレオチド(polynucleotide)」、「オリゴヌクレオチド(oligonucleotide)」及び「核酸分子(nucleic acid molecule)」を含み、一般に DNA 又は RNA のポリマーを意味し、一本鎖又は二本鎖であり、合成する又は自然源より得る(例えば、単離される及び/若しくは精製される)ことができ、天然、非天然又は改変したヌクレオチドを含んでいることがあり、並びに天然、非天然又は改変したヌクレオチド間結合(例えば、ホスホロアミデート結合又はホスホロチオエート結合)を非修飾オリゴヌクレオチドのヌクレオチド間に見られるホスホジエステル結合の代わりに含むことがある。一般的には、前記核酸はいかなる挿入、欠失、逆位及び/又は置換も含まないことが好ましい。しかしながら、前記核酸が 1 つ以上の挿入、欠失、逆位、及び/又は置換を含むことは、本明細書で考察されるように、場合によっては適切であり得る。
ある実施形態では、本発明の核酸は組換え体である。本明細書中で使用される場合、用語「組換え」は、(i)天然又は合成の核酸セグメントを生細胞内で複製することができる核酸分子に結合することによって、生細胞外で構築される分子、又は(ii)上記(i)に記載されたものの複製物から生じる分子、のことを言う。本明細書の目的のために、前記複製は in vitro 複製又は in vivo複製であってもよい。
ある実施形態によれば、本発明は、本明細書で開示される Nav1.1 チャネル調節活性を有するポリペプチド又はそれらの誘導体、ホモログ、アナログ若しくは模倣体のいずれかをコードする 1 つ以上の天然に存在しない cDNA 配列を提供する。
前記核酸は、当該分野で公知の手順を用いた化学合成及び/又は酵素ライゲーション反応に基づいて構築することができる。例えば、核酸は、天然に存在するヌクレオチド又は前記分子の生物学的安定性を増加させるために、若しくはハイブリダイゼーション時に形成される二本鎖の物理的安定性を高めるために設計された様々な修飾ヌクレオチド(例えば、ホスホロチオエート誘導体及びアクリジン置換ヌクレオチド)を使用して、化学的に合成することができる。限定されるものではないが、前記核酸を生成する為に使用され得る修飾ヌクレオチドの例には、5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-クロロウラシル、5-ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、4-アセチルシトシン、5-(カルボキシヒドロキシメチル)ウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ-D-ガラクトシルキューオシン(beta-D-galactosylqueosine)、イノシン、N6-イソペンテニルアデニン、1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアニン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、N6-置換アデニン、7-メチルグアニン、5-メチルアミノメチルウラシル、5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、ベータ-D-マンノシルキューオシン(beta-D-mannosylqueosine)、5'-メトキシカルボキシメチルウラシル、5-メトキシウラシル、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸(v)、ワイブトシン(wybutoxosine)、シュードウラシル(pseudouracil)、キューオシン(queosine)、2-チオシトシン、5-メチル-2-チオウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-メチルウラシル、ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、3-(3-アミノ-3-N-2-カルボキシプロピル)ウラシル、及び2,6-ジアミノプリンが含まれる。あるいは、本発明の核酸の 1 種類以上は、Macromolecular Resources(フォート・コリンズ、コロラド州(Fort Collins, CO))及び Synthegen(ヒューストン、テキサス州(Houston, TX))のような会社から購入することができる。
前記核酸は、当該分野で公知の手順を用いた化学合成及び/又は酵素ライゲーション反応に基づいて構築することができる。例えば、Sambrook et al. (eds.), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (2001) 及び Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, NY (2007) を参照されたい。例えば、核酸は、天然に存在するヌクレオチド又は前記分子の生物学的安定性を増加させるために、若しくはハイブリダイゼーション時に形成される二本鎖の物理的安定性を高めるために設計された様々な修飾ヌクレオチド(例えば、ホスホロチオエート誘導体及びアクリジン置換ヌクレオチド)を使用して、化学的に合成することができる。限定されるものではないが、前記核酸を生成する為に使用され得る修飾ヌクレオチドの例には、5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-クロロウラシル、5-ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、4-アセチルシトシン、5-(カルボキシヒドロキシメチル)ウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ-D-ガラクトシルキューオシン(beta-D-galactosylqueosine)、イノシン、N6-イソペンテニルアデニン、1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアニン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、N6-置換アデニン、7-メチルグアニン、5-メチルアミノメチルウラシル、5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、ベータ-D-マンノシルキューオシン(beta-D-mannosylqueosine)、5'-メトキシカルボキシメチルウラシル、5-メトキシウラシル、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸(v)、ワイブトシン(wybutoxosine)、シュードウラシル(pseudouracil)、キューオシン(queosine)、2-チオシトシン、5-メチル-2-チオウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-メチルウラシル、ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、3-(3-アミノ-3-N-2-カルボキシプロピル)ウラシル、及び2,6-ジアミノプリンが含まれる。あるいは、本発明の核酸の 1 種類以上は、Macromolecular Resources(フォート・コリンズ、コロラド州(Fort Collins, CO))及び Synthegen(ヒューストン、テキサス州(Houston, TX))のような会社から購入することができる。
別の実施形態によれば、本発明は、本明細書に記載の Nav1.1 調節活性を有するポリペプチド又はそれらの誘導体、ホモログ、アナログ若しくは模倣体のいずれかをコードする 1 つ以上の核酸配列を含むベクター提供する。
本発明の核酸は、組換え発現ベクターに組み込むことができる。これに関して、本発明は、本発明の核酸のいずれかを含む組換え発現ベクターを提供する。本明細書の目的のために、用語「組換え発現ベクター(recombinant expression vector)」は、宿主細胞による mRNA、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドの発現を可能にする遺伝子改変オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの構築物であって、前記構築物が mRNA、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、前記ベクターを mRNA、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドを細胞内で発現するのに十分な条件下にある細胞に接触させた場合に、宿主細胞による mRNA、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドの発現を可能にする遺伝子改変オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの構築物を意味する。本発明のベクターは、全体として天然に存在するものではない。しかしながら、前記ベクターの一部は天然に存在し得る。本発明の組換え発現ベクターは何れのタイプのヌクレオチドを含んでもよく、DNA 及び RNA を含むが限定はされず、一本鎖又は二本鎖であってもよく、合成される又は部分的にも自然源から得られることがあり、天然、非天然又は改変したヌクレオチドを含むことがある。前記組換え発現ベクターは、天然に存在する、天然に存在しないヌクレオチド間結合、又は両方のタイプの結合を含むことがある。好ましくは、前記非天然又は改変したヌクレオチド又はヌクレオチド間結合は、前記ベクターの転写又は複製を妨害しない。
本発明の組換え発現ベクターは、例えば、Sambrookら(上記)及びAusubelら(上記)に記載の標準的な組換え DNA 技術を用いて調製することができる。環状又は線状である発現ベクターの構築物は、原核又はアフリカツメガエル卵母細胞などの真核宿主細胞で機能する複製系を含むように調製することができる。複製系は、例えば ColE1、2μ プラスミド、λ、SV40、ウシ・パピローマ・ウイルスなどに由来することがある。
望ましくは、前記組換え発現ベクターは、必要に応じて及び前記ベクターが DNA ベース又は RNA ベースであるかを考慮して、前記ベクターが導入される宿主のタイプ(例えば、細菌、真菌、植物又は動物)に特異的な(転写及び翻訳の開始及び終止コドンのような)調節配列を含む。
前記組換え発現ベクターは、形質転換又はトランスフェクトされた宿主の選択を可能にする 1 種類以上のマーカー遺伝子を含むことがある。マーカー遺伝子は、殺生物剤に対する耐性(例えば、抗生物質、重金属などに対する耐性、栄養要求性宿主(auxotrophic host)を原栄養性(prototrophy)にする相補性など)を含む。本発明の発現ベクターに適したマーカー遺伝子には、例えば、LacZ、緑色蛍光タンパク質(GFP)、ルシフェラーゼ、ネオマイシン/G418 耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ヒスチジノール耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、及びアンピシリン耐性遺伝子が含まれる。
前記異種核酸は、前記標的細胞中に通常は見出されない核酸であってもよく、又は前記標的細胞中に通常見出される核酸の余分な 1 コピー又は複数コピーであってもよい。用語「外因性(exogenous)」及び「異種性(heterologous)」は、本明細書では相互に交換可能なものとして使用される。
本発明は更に、本明細書に記載の組換え発現ベクターのいずれかを含む宿主細胞を提供する。本明細書中で使用される場合、用語「宿主細胞(host cell)」は、本発明の組換え発現ベクターを含み得る任意のタイプの細胞をいう。前記宿主細胞は動物細胞のことがある。好ましくは、ある実施形態では、前記宿主細胞は哺乳動物細胞である。前記宿主細胞は、培養細胞又は初代細胞(即ち、生物、例えばヒトから直接単離される)のことがある。前記宿主細胞は、付着細胞又は懸濁細胞(すなわち懸濁液中で増殖する細胞)のことがある。最も好ましくは、前記宿主細胞はヒト細胞である。前記宿主細胞は、任意の細胞タイプであって良く、任意のタイプの組織に由来しても良く、任意の発生ステージのものであって良い。最も好ましくは、前記宿主細胞は、例えば、筋肉、肺、及び脳細胞などを含むことがある。
本発明の方法のなかで言及する宿主は任意の宿主であって良い。好ましくは、前記宿主は哺乳動物である。
本明細書中で使用される場合、用語「哺乳動物(mammal)」は、限定されるものではないが、マウス及びハムスターなどのネズミ目(order Rodentia)の哺乳動物、及びウサギなどのウサギ目(order Lagomorpha)の哺乳動物などを含む、任意の哺乳動物のことを言う。前記哺乳動物は、ネコ科(Felines)(ネコ)及びイヌ科(Canines)(イヌ)などを含む肉食目(order Carnivora)のものであることが好ましい。前記哺乳動物はウシ亜科(Bovines)(ウシ)及びイノシシ科(Swines)(ブタ)などを含む偶蹄目(order Artiodactyla)、又はウマ科(Equines)(ウマ)を含む奇蹄目(order Perissodactyla)の哺乳動物であることがより好ましい。前記哺乳動物が霊長類目(Primates)、セボイド目(Ceboids)若しくはシモイド目(Simoids)(サル)、又は類人猿目(order Anthropoids)(ヒト(humans)及び類人猿(apes))であることが最も好ましい。特に好ましい哺乳動物はヒト(human)である。
また、本発明は、本明細書に記載の少なくとも 1 種類の宿主細胞を含む細胞集団(population of cells)を提供する。前記細胞集団は異質な集団であっても良く、その異質な集団は、記載された組換え発現ベクターのいずれかを含む宿主細胞と少なくとも 1 種類の他の細胞(例えば、前記組換え発現ベクターの何れをも含まない宿主細胞(例えば、神経細胞)、若しくは神経細胞以外の細胞(例えば皮膚細胞、好中球、赤血球、肝細胞、内皮細胞、上皮細胞、筋肉細胞、脳細胞など))を含む。或いは、前記細胞の集団は、前記集団が前記組換え発現ベクターを含む宿主細胞を主に含む(例えば、本質的にそれからなる(consisting essentially of))、実質的に均質な集団であっても良い。前記集団はまた、細胞のクローン化集団であることがあり、その中では、前記集団の全ての細胞が組換え発現ベクターを含むというような、前記集団の全ての細胞が組換え発現ベクターを含む単一の宿主細胞のクローンである。本発明のある実施形態では、前記細胞の集団は、本明細書に記載の組換え発現ベクターを含む宿主細胞を含むクローン化集団である。
本発明は更に、Nav1.1 チャネル調節活性を有する低分子又は本発明のペプチドの誘導体及びアナログを同定するためのスクリーニング方法を包含する。このような方法には、Nav1.1 チャネルを含む細胞又は細胞集団の調製物を使用すること、前記細胞又は前記細胞集団を試験化合物に接触させること、及び前記試験化合物の存在下で前記チャネル活性を測定することが含まれる。このことを、前記細胞又は前記細胞集団を 1 種類以上の本発明のペプチドに接触させること、本発明のペプチドの存在下でチャネル活性を測定することの前又は後に行っても良い。次いで、前記細胞又は前記細胞集団を、ICA-121431 などの Nav1.1 チャネル遮断薬の存在下で、前記試験化合物及び/又は本発明のペプチドに接触させ、次いで前記チャネル活性を測定しても良い。
前記試験化合物が Nav1.1 チャネルを選択的に活性化し、その活性化が本発明のペプチドによる活性化量と等しいか又はそれよりも大きい場合、そしてその際、前記試験化合物による Nav1.1 チャネルの活性化が Nav1.1 チャネル遮断薬が存在するときに阻害される場合、前記試験化合物を選択的な Nav1.1 チャネル活性化剤であると決定する。
前記試験化合物が Nav1.1 チャネルを選択的に活性化し、その活性化が本発明のペプチドによる活性化量より小さい場合、そしてその際、本発明のペプチドによる Nav1.1 チャネルの活性化が、前記標的化合物の存在下で、Nav1.1 チャネル遮断薬と等しいか又はそれよりも強く阻害される場合、前記試験化合物を選択的な Nav1.1 チャネル遮断薬であると決定する。
本明細書に開示されるスクリーニング方法において使用される細胞又は細胞集団は、1 つ以上の Nav1.1 チャネルを含む何れの細胞であっても良い。例えば、前記細胞は、Nav1.1 チャネルをコードし、細胞で発現する核酸を含むベクターでトランスフェクトされた神経細胞又は非神経細胞であることがある。ある実施形態では、前記細胞は、例えば、アフリカツメガエル卵母細胞であっても良い。ある実施形態では、前記細胞又は細胞集団は、Nav1.1 チャネルを含む培養神経細胞であっても良い。不死化細胞系として、又は Nav1.1 チャネルを含む初代培養神経細胞のいずれかとして、任意の既知の神経細胞培養物を使用しても良い。ある他の実施形態では、全神経の ex vivo での調製物を用いて化合物をスクリーニングしても良い。例えば、伏在神経(saphenous nerve)のようなマウスの四肢の皮神経(cutaneous nerve)を、当業者に知られているex vivo での調製物に使用しても良く、これらの神経を前記試験化合物及び本発明のペプチドに曝露して、その神経活動を測定しても良い。
ある実施形態では、哺乳動物から腸の神経を摘出することができ、活動電位発生の in vitro 記録を行うことがある。ある実施形態において、使用される神経は、内臓結腸求心性神経(splanchnic colonic afferent nerves)である。
1 つ以上の実施形態によれば、正常な健康なマウス及び IBS のマウスモデルである慢性の内臓機械的刺激過敏症(chronic visceral mechanical hypersensitivity (CVH))を有するマウス由来の神経の調製物を用いて、試験化合物をスクリーニングし、正常及び CVH ニューロンでの試験化合物と対照化合物の活性を比較することができる。例えば、CVH マウス及び正常対照由来の結腸求心性神経を試験化合物に曝露することができ、次いで機械感覚応答を測定する。試験化合物が、対照化合物と比較して、正常マウスよりも CVH マウスの機械的刺激感覚応答を低下させる場合、前記試験化合物は Nav1.1 チャネル遮断薬であると判定され、IBS に伴う疼痛の治療に有用でありかもしれない。
1 つ以上の実施形態によれば、上記の方法のいずれかにおける Nav1.1 チャネルの活性の測定は、当該分野で公知の電気生理学的方法を用いて行うことができる。限定されるものではないが、そのような方法の例には、(自動化された)パッチ・クランプ法、2 電極ボルテージ・クランプ・レコーディング技術(two-electrode voltage-clamp recording techniques)、カット−オープン卵母細胞ワセリン・ギャップ法(cut-open oocyte Vaseline gap technique)、及び他の方法が含まれる。
ある実施形態では、上記の方法のいずれかにおける Nav1.1 チャネルの活性の測定は、当該分野で公知のイメージング方法を使用して行うことができる。例えば、細胞内のNav1.1 チャネルは、蛍光イメージング・プレート・リーダー(FLIPR)技術のような蛍光又は発光検出方法を使用して、ベラトリジンなどの Nav1.1 チャネル・モジュレータと組み合わせて測定することができる。
毒液の採取とスクリーニング。
クモ、サソリ、ムカデ由来の毒液を穏やかな電気刺激によって採取し、乾燥させて使用するまで凍らせた。109 種の毒液を、標準的な倒立型顕微鏡装置を用いてレシオメトリック・カルシウム・イメージング(ratiometric calcium imaging)によって試験した。応答をデジタル化し、MetaMorph ソフトウェア(Molecular Devices)を用いて解析した。毒液は、刺激に同期して、バックグラウンド以上で視覚的に検出可能であり、ニューロンに限定した(すなわち、グリア細胞又は線維芽細胞へのカルシウム流入(calcium entry)を引き起こさなかった)応答を誘発した。薬理学的解析を用いて可能性のある標的を絞り込み、続いて未精製毒液又は精製画分を候補となるクローン化したチャネルで試験した。前記応答がしっかりしていることと新規ターゲットでの選択性に関する根拠に基づいて、候補品を先に進めた。
クモ、サソリ、ムカデ由来の毒液を穏やかな電気刺激によって採取し、乾燥させて使用するまで凍らせた。109 種の毒液を、標準的な倒立型顕微鏡装置を用いてレシオメトリック・カルシウム・イメージング(ratiometric calcium imaging)によって試験した。応答をデジタル化し、MetaMorph ソフトウェア(Molecular Devices)を用いて解析した。毒液は、刺激に同期して、バックグラウンド以上で視覚的に検出可能であり、ニューロンに限定した(すなわち、グリア細胞又は線維芽細胞へのカルシウム流入(calcium entry)を引き起こさなかった)応答を誘発した。薬理学的解析を用いて可能性のある標的を絞り込み、続いて未精製毒液又は精製画分を候補となるクローン化したチャネルで試験した。前記応答がしっかりしていることと新規ターゲットでの選択性に関する根拠に基づいて、候補品を先に進めた。
Hm1a/b の単離。
H. maculate 由来の毒液(1 mg 乾燥)を、C18 逆相(RP)高速液体クロマトグラフィー(HPLC)カラム(Jupiter 250×4.6mm, 5mm; Phenomenex、トーランス(Torrance)、カリフォルニア州(CA))を付けた島津 Prominence HPLC システム(Shimadzu、ライダルメア(Rydalmere)、ニュー・サウス・ウェールズ(NSW)、オーストラリア)で分画した。溶媒 A(水中 0.1 %ギ酸)中で、溶媒 B(90 %アセトニトリル、水中 0.1 %ギ酸)の以下の線形勾配を流速 1 ml/分で使用した:5 % B で 5 分間、次いで 5 から 20 % の B で 5 分間、続いて 20 から 40 % の B で 40 分間。214 nm 及び 280 nm での吸光度を測定し、収集した画分を -20 ℃ で保存する前に凍結乾燥した。
H. maculate 由来の毒液(1 mg 乾燥)を、C18 逆相(RP)高速液体クロマトグラフィー(HPLC)カラム(Jupiter 250×4.6mm, 5mm; Phenomenex、トーランス(Torrance)、カリフォルニア州(CA))を付けた島津 Prominence HPLC システム(Shimadzu、ライダルメア(Rydalmere)、ニュー・サウス・ウェールズ(NSW)、オーストラリア)で分画した。溶媒 A(水中 0.1 %ギ酸)中で、溶媒 B(90 %アセトニトリル、水中 0.1 %ギ酸)の以下の線形勾配を流速 1 ml/分で使用した:5 % B で 5 分間、次いで 5 から 20 % の B で 5 分間、続いて 20 から 40 % の B で 40 分間。214 nm 及び 280 nm での吸光度を測定し、収集した画分を -20 ℃ で保存する前に凍結乾燥した。
質量分析。
ペプチドの質量を、4700 Proteomics Bioanalyzer モデル(Applied Biosystems、カールスバッド(Carlsbad)、カリフォルニア州(CA))を用いたマトリックス支援レーザー脱離/イオン化(MALDI)飛行時間型(TOF)質量分析(MS)によって測定した。ペプチドを水に溶解して、α-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸マトリックス(50 %アセトニトリル、5 %ギ酸中 7 mg/ml)と 1:1(v/v)で混合し、質量スペクトルをポジティブ・リフレクター・モード(positive reflector mode)で得た。すべての得られた質量は、モノアイソトピック(monoisotopic)M + H+ イオンに対するものである。
ペプチドの質量を、4700 Proteomics Bioanalyzer モデル(Applied Biosystems、カールスバッド(Carlsbad)、カリフォルニア州(CA))を用いたマトリックス支援レーザー脱離/イオン化(MALDI)飛行時間型(TOF)質量分析(MS)によって測定した。ペプチドを水に溶解して、α-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸マトリックス(50 %アセトニトリル、5 %ギ酸中 7 mg/ml)と 1:1(v/v)で混合し、質量スペクトルをポジティブ・リフレクター・モード(positive reflector mode)で得た。すべての得られた質量は、モノアイソトピック(monoisotopic)M + H+ イオンに対するものである。
エドマン配列解析。
N 末端配列解析は、オーストラリア・プロテオーム分析施設(シドニー、ニュー・サウス・ウェールズ、オーストラリア)(Australian Proteome Analysis Facility (Sydney, NSW, Australia))によって実施された。簡潔に言うと、Hm1a(600 pmol)及び Hm1b(250 pmol)を再構成し、DTT(25 mM)を用いて還元し、56 ℃で 0.5 時間インキュベートした。次いで、前記サンプルをヨードアセトアミド(55 mM)を用いて室温で 0.5 時間アルキル化し、Zorbax 300SB-C18 カラム(3×150 mm)を使用する RP-HPLC により精製した。目的の標的ピークを同定し、収集し、次いで真空下で最小体積まで減少させた。サンプル全体を、予めサイクルを回してバイオブレーン(Biobrene)で処理したディスク上に乗せ、37(Hm1a)サイクル又は 42(Hm1b)サイクルのエドマン N 末端配列解析にそれぞれ供した。自動エドマン分解は、Applied Biosystems 494 Procise Protein Sequencing System を用いて行った。
N 末端配列解析は、オーストラリア・プロテオーム分析施設(シドニー、ニュー・サウス・ウェールズ、オーストラリア)(Australian Proteome Analysis Facility (Sydney, NSW, Australia))によって実施された。簡潔に言うと、Hm1a(600 pmol)及び Hm1b(250 pmol)を再構成し、DTT(25 mM)を用いて還元し、56 ℃で 0.5 時間インキュベートした。次いで、前記サンプルをヨードアセトアミド(55 mM)を用いて室温で 0.5 時間アルキル化し、Zorbax 300SB-C18 カラム(3×150 mm)を使用する RP-HPLC により精製した。目的の標的ピークを同定し、収集し、次いで真空下で最小体積まで減少させた。サンプル全体を、予めサイクルを回してバイオブレーン(Biobrene)で処理したディスク上に乗せ、37(Hm1a)サイクル又は 42(Hm1b)サイクルのエドマン N 末端配列解析にそれぞれ供した。自動エドマン分解は、Applied Biosystems 494 Procise Protein Sequencing System を用いて行った。
配列決定。
Hm1a について、エドマン配列解析を行うと、ECRYLFGGCSSTSDCCKHLSCRSDWKYCAWDGTF (配列番号:3)がその配列として得られ、このモノアイソトピック質量(M+H+ イオンについて)は 3908.58 Da と計算される。これは、Hm1a のモノアイソトピック質量 3995.55 Da よりも 86.97 Da 分短い。それゆえ、本願発明者らは、Hm1a の C 末端にある「S」(87 Da)が無くなっているものとし、ECRYLFGGCSSTSDCCKHLSCRSDWKYCAWDGTFS (配列番号:1)を完全な配列と結論する。この完全な配列は、モノアイソトピック質量(M+H+ イオンについて)が 3995.61 Da と計算され、これは天然の Hm1a について測定した質量と 0.06 Da だけ異なる。
Hm1a について、エドマン配列解析を行うと、ECRYLFGGCSSTSDCCKHLSCRSDWKYCAWDGTF (配列番号:3)がその配列として得られ、このモノアイソトピック質量(M+H+ イオンについて)は 3908.58 Da と計算される。これは、Hm1a のモノアイソトピック質量 3995.55 Da よりも 86.97 Da 分短い。それゆえ、本願発明者らは、Hm1a の C 末端にある「S」(87 Da)が無くなっているものとし、ECRYLFGGCSSTSDCCKHLSCRSDWKYCAWDGTFS (配列番号:1)を完全な配列と結論する。この完全な配列は、モノアイソトピック質量(M+H+ イオンについて)が 3995.61 Da と計算され、これは天然の Hm1a について測定した質量と 0.06 Da だけ異なる。
Hm1b について、エドマン配列解析を行うと、ECRYLFGGCKTTADCCKHLGCRTDLYYCAWDGT (配列番号:4)がその配列として得られ、このモノアイソトピック質量(M+H+ イオンについて)は 3745.6 Da と計算される。これは、Hm1a のモノアイソトピック質量 3892.60 Da のよりも 147 Da 分短い。それゆえ、本願発明者らは、Hm1b の C 末端にあるアミド化された「F」が無くなっているものとし、ECRYLFGGCKTTADCCKHLGCRTDLYYCAWDGTF-NH2 (配列番号:2)を完全な配列と結論する。C 末端アミド化は、4 μg の天然 Hm1b をカルボキシペプチダーゼ Y で 20 分間消化し、インタクト(intact)な Hm1b と消化した Hm1b との間の質量差を測定することによって確認した。本願発明者らは、この差異が 146 Da であり、アミド化された C 末端を有する最終残基 Phe に相当することがわかった。この完全な配列は、モノアイソトピック質量(M+H+イオンについて)が 3892.64 Da と計算され、天然の Hm1b と一致する。
Hm1b の C 末端がアミド化されていることを確認するために、以前に記載したように51、本願発明者らは、カルボキシペプチダーゼ Y(CPY)で天然の Hm1b を消化し、MALDI-TOF によって反応をモニターして C 末端残基の質量を同定した。100 mM 酢酸アンモニウム、pH 5.5 中で 5μL の 800 ng/μL 天然 Hm1bを、2 ng/μL の CPY とともに 37 ℃で 20 分間インキュベートした。前記反応を、0, 1, 5, 10 及び 20 分において 0.4 μL を採取し、それを等容積の 60 %(v/v)アセトニトリル、5 %ギ酸(FA)中 7 mg/mL の α-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸と一緒に MALDI プレート上にスポットすることによってモニターした。乾燥したスポットを 10 μL の 1 % FAで洗浄し、乾燥させた後、4700 Proteomics Bioanalyser(Applied Biosciences、フォスター・シティ(Foster City)、カリフォルニア州、米国)の MALDI-TOF-MS で分析し、レフレクター・ポジティブ・モード(reflector positive mode)でスペクトルを取得した。
Hm1a の合成。
逆相 HPLC 用の溶媒は、0.05 % TFA/H2O(A)及び 90 % MeCN/0.043 % TFA/H2O(B)からなっていた。分析 HPLC は、0.3 mL/分の流速で 40 ℃ に加熱した Thermo Hypersil GOLD 2.1×100 mm C18 カラムを使用して島津 LC20AT システムで行った。30 分かけて 10 から 55 % 勾配の B を使用し、検出は 214 nm で行った。分取 HPLC は、10 から 50 % 勾配の B を用いて 16 mL/分の流速で 40 分間かけて流しながら Vydac 218TP1022 カラムで実施した。質量分析は、陽イオン・モードの API2000(ABI Sciex)質量分析計で行った。全ての試薬は購入し、更に精製することなく使用した。
逆相 HPLC 用の溶媒は、0.05 % TFA/H2O(A)及び 90 % MeCN/0.043 % TFA/H2O(B)からなっていた。分析 HPLC は、0.3 mL/分の流速で 40 ℃ に加熱した Thermo Hypersil GOLD 2.1×100 mm C18 カラムを使用して島津 LC20AT システムで行った。30 分かけて 10 から 55 % 勾配の B を使用し、検出は 214 nm で行った。分取 HPLC は、10 から 50 % 勾配の B を用いて 16 mL/分の流速で 40 分間かけて流しながら Vydac 218TP1022 カラムで実施した。質量分析は、陽イオン・モードの API2000(ABI Sciex)質量分析計で行った。全ての試薬は購入し、更に精製することなく使用した。
ペプチド合成
位置選択的なジスルフィド結合形成52-54を用いて Hm1a を合成した。このペプチドは、Symphony(Protein Technologies Inc.)自動化ペプチド合成機及び H-Ser(tBu)-2-ClTrt(ローディング 0.69 mmol/g)ポリスチレン樹脂を用いて 0.1 mmol のスケールで合成した。カップリングは、装填樹脂に対して 5 倍量の Fmoc-アミノ酸/HBTU/DIEA(1:1:1)を用いて DMF 中で 2×20 分間行った。Fmoc の脱保護は、30 %ピペリジン/DMF(1×1.5 分、次いで 1×4 分)を使用して行った。非システインアミノ酸側鎖は、Asp(OtBu)、Arg(Pbf)、Glu(OtBu)、His(Trt)、Lys(Boc)、Ser(tBu)、Thr(tBu)、Trp(Boc) 及び Tyr(tBu) として保護した。システイン側鎖は、Cys2、Cys16(Meb)、Cys9、Cys21(Dpm) 及び Cys15、Cys28(Trt) として保護した。前記樹脂からの切り出しは、室温で 1 時間、10 % AcOH/10 % TFE/DCM で処理して行った。その生成物を沈殿させ、n-ヘキサンで洗浄し、次いで 1,4-ジオキサン/MeCN/H2O から凍結乾燥した。
位置選択的なジスルフィド結合形成52-54を用いて Hm1a を合成した。このペプチドは、Symphony(Protein Technologies Inc.)自動化ペプチド合成機及び H-Ser(tBu)-2-ClTrt(ローディング 0.69 mmol/g)ポリスチレン樹脂を用いて 0.1 mmol のスケールで合成した。カップリングは、装填樹脂に対して 5 倍量の Fmoc-アミノ酸/HBTU/DIEA(1:1:1)を用いて DMF 中で 2×20 分間行った。Fmoc の脱保護は、30 %ピペリジン/DMF(1×1.5 分、次いで 1×4 分)を使用して行った。非システインアミノ酸側鎖は、Asp(OtBu)、Arg(Pbf)、Glu(OtBu)、His(Trt)、Lys(Boc)、Ser(tBu)、Thr(tBu)、Trp(Boc) 及び Tyr(tBu) として保護した。システイン側鎖は、Cys2、Cys16(Meb)、Cys9、Cys21(Dpm) 及び Cys15、Cys28(Trt) として保護した。前記樹脂からの切り出しは、室温で 1 時間、10 % AcOH/10 % TFE/DCM で処理して行った。その生成物を沈殿させ、n-ヘキサンで洗浄し、次いで 1,4-ジオキサン/MeCN/H2O から凍結乾燥した。
第 1 のジスルフィド結合(Cys15-Cys28)を、前記粗生成物を HFIP(5 mL)に溶解し、10 % HFIP/DCM(20 mL)中の I2(4 当量)の攪拌溶液に 5 分間かけて滴加することにより、形成させた。撹拌を更に 5 分間続け、次いで前記溶液を H2O 中のアスコルビン酸/NaOAc の溶液に注いだ。前記水相を DCM で抽出し、合わせた有機層を水で洗浄した。減圧下で溶媒を除去した後、その生成物を 1,4-ジオキサン/MeCN/H2O から凍結乾燥した。ESI-MS(m/z):計算値(平均)2159.4 [M+3H]3+、実測値 2159.7。
残りの側鎖保護基(Cys(Meb) 以外)を、室温で 2 時間、95 % TFA/2.5 % TIPS/2.5 % H2O で処理して除去した。切断溶液の大部分を N2気流下で蒸発させた後、その生成物を沈殿させ、冷 Et2O で洗浄し、50 % MeCN/0.1 % TFA/H2O から凍結乾燥して、Cys2,Cys16(Meb),Cys9,Cys21(SH),Cys15-Cys28(SS) Hm1a (280 mg) を得た。ESI-MS(m/z):計算値(平均)1404.3 [M+3H]3+、実測値 1404.1。
第 2 のジスルフィド結合(Cys9-Cys21)を、前の工程からの粗生成物を 30 % DMSO/0.1 M HCl(0.5 mg/mL)に溶解し、室温で 24 時間撹拌することにより、形成させた。次いで、分取 HPLC(30 mg)により Cys2,16(Meb),Cys9-Cys21(SS),Cys15-Cys28(SS) Hm1a を単離した。ESI-MS(m/z):計算値(平均)1403.6 [M+3H]3+、実測値 1403.3。
次いで、第 3 のジスルフィド結合(Cys2-Cys16)を、0 ℃で 1 時間、HF/p-クレゾール(9:1)で処理することにより Cys(Meb) 基を最初に除去することによって、形成させた。その生成物を沈殿させ、冷 Et2O で洗浄し、50 % MeCN/0.1 % TFA/H2O から凍結乾燥し、Cys2,16(SH),Cys9-Cys21(SS),Cys15-Cys28(SS) Hm1a (24 mg) を得た。ESI-MS(m/z):計算値(平均)1334.1 [M+3H]3+、実測値 1333.7。遊離したチオールの酸化は、第 2 のジスルフィド結合について記載したように 30 % DMSO/0.1 M HCl を用いて行い、完全に酸化された Hm1a (3 mg) を得たが、これは分析 HPLC によって基準サンプルと区別できなかった。ESI-MS(m/z):計算値(平均)1333.5 [M+3H]3+、実測値 1333.1。
略語:DCM、ジクロロメタン;DIEA、N,N-ジイソプロピルエチルアミン;DMF、N,N-ジメチルホルムアミド;HBTU、2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウム・ヘキサフルオロホスフェート;HFIP、1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロプロパン-2-オール;MeCN、アセトニトリル;TFA、トリフルオロ酢酸;TIPS、トリイソプロピルシラン。
Nav 及び Kv チャネルのコンストラクト。
ヒト (h) Nav1.4, hNav1.5, 及びラット (r)Kv2.1 は、Peter Ruben(サイモン・フレイザー大学、カナダ)(Simon Fraser University, Canada)、Chris Ahern(アイオワ大学、米国)(University of Iowa, USA) 及び Kenton J Swartz(アメリカ国立神経疾患・脳卒中研究所、米国国立衛生研究所、米国)(NINDS, NIH, USA) からそれぞれ贈与された。hNav1.1-1.3, hNav1.6-1.8 は、Origene Technologies, Inc. (MD, USA) から購入した。アクセション番号は、NM_001165963.1 (hNav1.1), NM_021007.2 (hNav1.2), NM_006922.3 (hNav1.3), NM_000334 (hNav1.4), NM_198056 (hNav1.5), NM_014191.2 (hNav1.6), NM_002977.2 (hNav1.7), 及び NM_006514.3 (hNav1.8) である。チャネルキメラは、rNav1.4(Baron Chanda、ウィスコンシン大学、米国、から贈与された)(University of Wisconsin, USA)、Kv2.1Δ755,56、hNav1.1、及びhNav1.924(Origene Technologies:NM_014139.2)を鋳型としたシーケンシャル PCR(sequential PCR)を用いて作製した。マウス Kv4.1 は、AddGene から入手し、Lawrence Salkoff 博士の研究室に由来した。前記 Kv2.1Δ7 コンストラクトは、外側開口部に、チャネルをアジトキシン-2(孔を塞ぐサソリ・トキシン57)感受性にする 7 つの点突然変異を含む。完全に配列決定した DNA を適切な制限酵素で線状化した後、全てのコンストラクトの cRNA は T3 又は T7 ポリメラーゼ(mMessage mMachine kit, Life technologies, 米国)を用いて合成した。
ヒト (h) Nav1.4, hNav1.5, 及びラット (r)Kv2.1 は、Peter Ruben(サイモン・フレイザー大学、カナダ)(Simon Fraser University, Canada)、Chris Ahern(アイオワ大学、米国)(University of Iowa, USA) 及び Kenton J Swartz(アメリカ国立神経疾患・脳卒中研究所、米国国立衛生研究所、米国)(NINDS, NIH, USA) からそれぞれ贈与された。hNav1.1-1.3, hNav1.6-1.8 は、Origene Technologies, Inc. (MD, USA) から購入した。アクセション番号は、NM_001165963.1 (hNav1.1), NM_021007.2 (hNav1.2), NM_006922.3 (hNav1.3), NM_000334 (hNav1.4), NM_198056 (hNav1.5), NM_014191.2 (hNav1.6), NM_002977.2 (hNav1.7), 及び NM_006514.3 (hNav1.8) である。チャネルキメラは、rNav1.4(Baron Chanda、ウィスコンシン大学、米国、から贈与された)(University of Wisconsin, USA)、Kv2.1Δ755,56、hNav1.1、及びhNav1.924(Origene Technologies:NM_014139.2)を鋳型としたシーケンシャル PCR(sequential PCR)を用いて作製した。マウス Kv4.1 は、AddGene から入手し、Lawrence Salkoff 博士の研究室に由来した。前記 Kv2.1Δ7 コンストラクトは、外側開口部に、チャネルをアジトキシン-2(孔を塞ぐサソリ・トキシン57)感受性にする 7 つの点突然変異を含む。完全に配列決定した DNA を適切な制限酵素で線状化した後、全てのコンストラクトの cRNA は T3 又は T7 ポリメラーゼ(mMessage mMachine kit, Life technologies, 米国)を用いて合成した。
電気生理。
アフリカツメガエル卵母細胞。
チャネル及びキメラを、cRNA を注入後、1 から 4 日間、バース培地(Barth’s medium)(88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0.33 mM Ca(NO3)2, 0.41 mM CaCl2, 0.82 mM MgSO4, 2.4 mM NaHCO3, 5 mM HEPES 及び 0.1 mg/mL ゲンタマイシン; NaOH で pH 7.6 に調整)中 17 ℃でインキュベートしたアフリカツメガエル(Xenopus laevis)卵母細胞(米国Xenopus one(登録商標)から取得した動物)で発現させた。そして次に、150 μl のレコーディング・チャンバー(recording chamber)又は小さな容量(< 20 μl)の Oocyte Perfusion Chamber(AutoMate Scientific)を備えた 2 電極ボルテージ・クランプ・レコーディング技術(two-electrode voltage-clamp recording techniques)(OC-725C; Warner Instruments 又は GeneClamp 500B; Axon Instruments)を用いて研究した。データを 4 kHz でフィルターにかけ、pClamp 10 ソフトウェア(Molecular Devices、米国)を用いて 20 kHz でデジタル化した。微小電極抵抗は、3 M の KCl を充填した場合、0.5-1 MΩ であった。Kv チャネル実験のためには、外部記録溶液は(mM 単位):50 KCl, 50 NaCl, 5 HEPES, 1 MgCl2 及び 0.3 CaCl2, NaOH で pH 7.6 に調整、を含有したものとした。Navチャネル実験のためには、外部記録溶液は(mM 単位):100 NaCl, 5 HEPES, 1 MgCl2 及び 1.8 CaCl2, NaOH で pH 7.6 に調整、を含有したものとした。すべての実験は室温(約 22 ℃)で実施し、トキシン・サンプルを 0.1 % BSA を含む記録溶液で希釈した。アジトキシン-2 又は TTX でチャネルを遮断することによって同定された、リーク(leak)及びバックグラウンド・コンダクタンス(background conductance)を、それぞれ Kv 又は Navチャネル電流について差し引いた。電位−活性化相関を、Kvチャネルのテール電流(tail currents)を測定することによって、又は定常電流をモニタし、Nav チャネルのコンダクタンスを計算することによって得た。開口する確率が低くなる負の保持電位を用いて、トキシンによる閉鎖又は休止チャネルの占有度を調べ、トキシンが結合したチャネルを開けられないぐらい弱い脱分極刺激を用いて非結合チャネルの割合を推定した。レコーディング・チャンバー(recording chamber)にトキシンを添加した後、トキシンとチャネルとの間の平衡を、5-10 秒間隔で誘発する弱い脱分極刺激を用いてモニターした。すべてのチャネルについて、トキシンの存在及び非存在下で電位−活性化相関を記録した。オフライン・データ解析は、Clampfit 10(Molecular Devices、米国)及び Origin 7.5(Originlab、米国)を用いて行った。
アフリカツメガエル卵母細胞。
チャネル及びキメラを、cRNA を注入後、1 から 4 日間、バース培地(Barth’s medium)(88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0.33 mM Ca(NO3)2, 0.41 mM CaCl2, 0.82 mM MgSO4, 2.4 mM NaHCO3, 5 mM HEPES 及び 0.1 mg/mL ゲンタマイシン; NaOH で pH 7.6 に調整)中 17 ℃でインキュベートしたアフリカツメガエル(Xenopus laevis)卵母細胞(米国Xenopus one(登録商標)から取得した動物)で発現させた。そして次に、150 μl のレコーディング・チャンバー(recording chamber)又は小さな容量(< 20 μl)の Oocyte Perfusion Chamber(AutoMate Scientific)を備えた 2 電極ボルテージ・クランプ・レコーディング技術(two-electrode voltage-clamp recording techniques)(OC-725C; Warner Instruments 又は GeneClamp 500B; Axon Instruments)を用いて研究した。データを 4 kHz でフィルターにかけ、pClamp 10 ソフトウェア(Molecular Devices、米国)を用いて 20 kHz でデジタル化した。微小電極抵抗は、3 M の KCl を充填した場合、0.5-1 MΩ であった。Kv チャネル実験のためには、外部記録溶液は(mM 単位):50 KCl, 50 NaCl, 5 HEPES, 1 MgCl2 及び 0.3 CaCl2, NaOH で pH 7.6 に調整、を含有したものとした。Navチャネル実験のためには、外部記録溶液は(mM 単位):100 NaCl, 5 HEPES, 1 MgCl2 及び 1.8 CaCl2, NaOH で pH 7.6 に調整、を含有したものとした。すべての実験は室温(約 22 ℃)で実施し、トキシン・サンプルを 0.1 % BSA を含む記録溶液で希釈した。アジトキシン-2 又は TTX でチャネルを遮断することによって同定された、リーク(leak)及びバックグラウンド・コンダクタンス(background conductance)を、それぞれ Kv 又は Navチャネル電流について差し引いた。電位−活性化相関を、Kvチャネルのテール電流(tail currents)を測定することによって、又は定常電流をモニタし、Nav チャネルのコンダクタンスを計算することによって得た。開口する確率が低くなる負の保持電位を用いて、トキシンによる閉鎖又は休止チャネルの占有度を調べ、トキシンが結合したチャネルを開けられないぐらい弱い脱分極刺激を用いて非結合チャネルの割合を推定した。レコーディング・チャンバー(recording chamber)にトキシンを添加した後、トキシンとチャネルとの間の平衡を、5-10 秒間隔で誘発する弱い脱分極刺激を用いてモニターした。すべてのチャネルについて、トキシンの存在及び非存在下で電位−活性化相関を記録した。オフライン・データ解析は、Clampfit 10(Molecular Devices、米国)及び Origin 7.5(Originlab、米国)を用いて行った。
複数のプロトコルを使用して、研究された Nav チャネル及びキメラの生物物理学的特徴を調べた。コンダクタンス−電位及び定常状態での不活性化の相関を測定するために、Nav チャネルを発現する卵母細胞を -90 mV に保持し、5 mV ステップで -90 mV から 5 mV まで 50 ミリ秒間に脱分極させた後、直ちに段階的に -15 mV にして得られる最大電流を発生させ、50 ミリ秒後、-90 mV の保持電位に戻した。前記プロトコールでの電位を増加させる部分の間に生成されるピーク電流を用いてコンダクタンス−電位相関を計算した。一方、-15 mV のステップ中のピーク電流を、その前の電位ステップの関数として使用し、定常状態での不活性化の相関を決定した。速い不活性化の時定数は、上述のプロトコールの -15 mV のステップに単一指数曲線をフィッティングさせることによって決定した。ボルツマン曲線を Clampfit 10(Molecular Devices、米国)によってフィッティングさせ、統計を Excel 又は R 統計パッケージ(スチューデント t 検定(Student’s t-test)))で計算した。
培養ニューロン。
培養マウス TG ニューロンのホール・セル・パッチ・クランプ(whole cell patch clamp)を記載のように実施した58。バッファー溶液(mM 単位)は、150 NaCl, 2.8 KCl, 1 MgSO4, 10 HEPES, pH 7.4 (NaOH) を含有し、SmartSquirt Micro-Perfusion システム(AutoMate)を用いてトキシン/薬物(drugs)有り又は無しで灌流した。結腸 DRG については、抵抗が 2-5 MΩ の、火で先端を鈍らせた(fire-polished)ガラス電極を用いて、プレーティング後 20-48 時間の蛍光標識した胸腰部(T10-L1)結腸 DRG ニューロンでホール・セル・レコーディング(Whole-cell recordings)を行った。全ての記録は、室温(20-22 ℃)で行った。シグナルを Axopatch 200A増幅器を使用して増幅し、Digadata 1322A でデジタル化し、pCLAMP 9 ソフトウェア(Molecular Devices、サニーベール(Sunnyvale)、カリフォルニア州、米国)を用いて記録した。すべての DRG ニューロンについて、保持電位は -70 mV とした。カレント・クランプ・モード(current clamp mode)では、保持電位(-70 mV)から一連の脱分極パルス(500 ms、10 pAステップ)を加え、基電流(活動電位生成に必要な電流量(pA))を測定した。2 倍の基電流での活動電位発生数も測定した。脱分極パルスを、通常の外部バス浴液中で、Hm1a(100 nM)の添加後に試験した。コントロール溶液及び Hm1a を、試験をしているニューロンの 1 mm 以内に配置した重力駆動マルチバレル灌流システムで添加した。細胞内溶液(mM 単位)は:KCl, 135; MgCl2, 2; MgATP, 2; EGTA-Na, 5; Hepes-Na, 10; pH 7.4 に調整、を含む。細胞外溶液(mM 単位)は:NaCl, 140; KCl, 4; MgCl2, 2; CaCl2, 2; Hepes-Na, 10; glucose, 5; pH 7.4 に調整、を含む。
培養マウス TG ニューロンのホール・セル・パッチ・クランプ(whole cell patch clamp)を記載のように実施した58。バッファー溶液(mM 単位)は、150 NaCl, 2.8 KCl, 1 MgSO4, 10 HEPES, pH 7.4 (NaOH) を含有し、SmartSquirt Micro-Perfusion システム(AutoMate)を用いてトキシン/薬物(drugs)有り又は無しで灌流した。結腸 DRG については、抵抗が 2-5 MΩ の、火で先端を鈍らせた(fire-polished)ガラス電極を用いて、プレーティング後 20-48 時間の蛍光標識した胸腰部(T10-L1)結腸 DRG ニューロンでホール・セル・レコーディング(Whole-cell recordings)を行った。全ての記録は、室温(20-22 ℃)で行った。シグナルを Axopatch 200A増幅器を使用して増幅し、Digadata 1322A でデジタル化し、pCLAMP 9 ソフトウェア(Molecular Devices、サニーベール(Sunnyvale)、カリフォルニア州、米国)を用いて記録した。すべての DRG ニューロンについて、保持電位は -70 mV とした。カレント・クランプ・モード(current clamp mode)では、保持電位(-70 mV)から一連の脱分極パルス(500 ms、10 pAステップ)を加え、基電流(活動電位生成に必要な電流量(pA))を測定した。2 倍の基電流での活動電位発生数も測定した。脱分極パルスを、通常の外部バス浴液中で、Hm1a(100 nM)の添加後に試験した。コントロール溶液及び Hm1a を、試験をしているニューロンの 1 mm 以内に配置した重力駆動マルチバレル灌流システムで添加した。細胞内溶液(mM 単位)は:KCl, 135; MgCl2, 2; MgATP, 2; EGTA-Na, 5; Hepes-Na, 10; pH 7.4 に調整、を含む。細胞外溶液(mM 単位)は:NaCl, 140; KCl, 4; MgCl2, 2; CaCl2, 2; Hepes-Na, 10; glucose, 5; pH 7.4 に調整、を含む。
皮膚−神経レコーディング。
Hm1a クモ・トキシンに応答する一次求心性神経の活動を評価するために、以前に記載されているように59、本願発明者らは ex vivo 皮膚−神経標本を利用した。簡潔に言うと、吸入イソフルランを介して動物を軽く麻酔し、次いで頸椎脱臼死をさせた。下肢の毛を剃毛し、後足の毛状の皮膚を速やかに伏在神経を支配する神経に沿って切開した。次いで、前記皮膚及び神経を、加温(32 ℃)して、酸素供給をしているバッファー((mM 単位)123 NaCl, 3.5 KCl, 2.0 CaCl2, 1.7 NaH2PO4, 0.7 MgSO4, 9.5 グルコン酸ナトリウム, 5.5 グルコース, 7.5 スクロール及び滴定してpH を 7.45 ± 0.05 にした 10 HEPES から成る)で満たしたレコーディング・チャンバーに置いた。
Hm1a クモ・トキシンに応答する一次求心性神経の活動を評価するために、以前に記載されているように59、本願発明者らは ex vivo 皮膚−神経標本を利用した。簡潔に言うと、吸入イソフルランを介して動物を軽く麻酔し、次いで頸椎脱臼死をさせた。下肢の毛を剃毛し、後足の毛状の皮膚を速やかに伏在神経を支配する神経に沿って切開した。次いで、前記皮膚及び神経を、加温(32 ℃)して、酸素供給をしているバッファー((mM 単位)123 NaCl, 3.5 KCl, 2.0 CaCl2, 1.7 NaH2PO4, 0.7 MgSO4, 9.5 グルコン酸ナトリウム, 5.5 グルコース, 7.5 スクロール及び滴定してpH を 7.45 ± 0.05 にした 10 HEPES から成る)で満たしたレコーディング・チャンバーに置いた。
次いで、前記神経を鉱油で満たしたチャンバーに通し、隆起したミラー・プレートの上ではぎ取り、細胞外記録電極上に置いた。次に、先端を鈍らせた(blunt)ガラス・プローブを利用して機械的な探索刺激を加えることによって、単一ユニット受容野を同定した。1.2 と 10 m/s の間の伝導速度に基づいて Aδ 求心性線維を同定し、機械的刺激に対する緩慢な適応に基づいて A 型機械的侵害受容器(AM)に亜型分類した60。
AM 線維の位置を特定した後、そのフォン・フレイ(von Frey)閾値を、較正したフォン・フレイ・フィラメント(von Frey filaments)で受容野を刺激して、活動電位生成の閾値の力を測定することによって、得た。次いで、金属堀(内径:4.7 mm)を前記受容野の中心の上に置き、前記受容野を周囲のバッファーから隔離した。次いで、前記堀内のバッファーを排出し、1 μMの Hm1a 又はビヒクル(vehicle)(バッファー)のいずれかを含むバッファーで置換した。受容野をトキシン又はバッファーと共に 2-5 分間インキュベートした。次いで、特注して作ったフィードバック制御機械的刺激装置を堀内に配置し、前記受容野を一連の増加する力(15 mN、50 mN、100 mN)でそれぞれ 10 秒間機械的に刺激した。感作/脱感作を回避するために、刺激の間に 1 分間の休止期間を設けた。
データを、PowerLab A/D コンバータ(AD Instruments、米国)を用いてデジタル化し、LabChart ソフトウェア及び Spike Histogram 拡張モジュール(AD Instruments、米国)を用いて記録した。すべての皮膚−神経データを記録し、トキシン又はビヒクル(vehicle)を使用したかどうかを知らない実験者と供に解析した。神経線維の発火が、バックグラウンド・ノイズ及び刺激中の他の神経線維の発火の両方から明確に区別される場合にのみ、記録を最終データセットに含めることにした。
消化管−神経レコーディング。
活動電位発生の in vitro 単一ユニット細胞外記録は、内臓結腸求心性神経から行った。記録は、標準的なプロトコル61-63を用いて健常又は CVH マウスから行った。2 g のフォン・フレイ・ヘア(vfh)プローブを求心性受容野へ 3 秒間当てることへの応答として、ベースラインの機械的刺激感受性を測定した。このプロセスを 3 から 4 回繰り返し、毎回 10 秒ずつ間隔をあけた。その後、Hm1a(100 nM)、Nav1.1 遮断薬 ICA-121432(500 nM)又は ICA-121432(500 nM)及び Hm1a(100 nM)の両方の組み合わせを添加後に機械的刺激感受性を再試験した。データをスパイク/s として示し、平均 ± SEM として表わした。
活動電位発生の in vitro 単一ユニット細胞外記録は、内臓結腸求心性神経から行った。記録は、標準的なプロトコル61-63を用いて健常又は CVH マウスから行った。2 g のフォン・フレイ・ヘア(vfh)プローブを求心性受容野へ 3 秒間当てることへの応答として、ベースラインの機械的刺激感受性を測定した。このプロセスを 3 から 4 回繰り返し、毎回 10 秒ずつ間隔をあけた。その後、Hm1a(100 nM)、Nav1.1 遮断薬 ICA-121432(500 nM)又は ICA-121432(500 nM)及び Hm1a(100 nM)の両方の組み合わせを添加後に機械的刺激感受性を再試験した。データをスパイク/s として示し、平均 ± SEM として表わした。
動物の使用、管理(husbandry)及びジェノタイピング(genotyping)。
マウスは、UCSF 機関動物管理委員会(Institutional Animal Care Committee (IACUC))のガイドラインに従って飼育した(bred and housed)。2-5 匹の動物を餌と水を自由に摂れるようにして一緒に飼育した。Floxed SCN1a マウス13は、William Catterall 博士(ワシントン大学薬理学科)からの好意で提供を受けた。Floxed マウスを Peripherin Cre(Per-Cre)マウス37と交配し、SCN1aF/F x Per-Cre コンディショナル・ノックアウト・マウス(conditional knockout mice)を作製した。Nav1.1 floxed 対立遺伝子を、以前に記載したプライマー(Cheah)を用いて検出し、Per-Cre 発現を、Cre リコンビナーゼに対する以下のプライマーを用いて検出した:
Cre_F: TAGCGTTCGAACGCACTGATTTCG (配列番号:5);
Cre_R: CGCCGTAAATCAATCGATGAGTTG (配列番号:6)。
マウスは、UCSF 機関動物管理委員会(Institutional Animal Care Committee (IACUC))のガイドラインに従って飼育した(bred and housed)。2-5 匹の動物を餌と水を自由に摂れるようにして一緒に飼育した。Floxed SCN1a マウス13は、William Catterall 博士(ワシントン大学薬理学科)からの好意で提供を受けた。Floxed マウスを Peripherin Cre(Per-Cre)マウス37と交配し、SCN1aF/F x Per-Cre コンディショナル・ノックアウト・マウス(conditional knockout mice)を作製した。Nav1.1 floxed 対立遺伝子を、以前に記載したプライマー(Cheah)を用いて検出し、Per-Cre 発現を、Cre リコンビナーゼに対する以下のプライマーを用いて検出した:
Cre_F: TAGCGTTCGAACGCACTGATTTCG (配列番号:5);
Cre_R: CGCCGTAAATCAATCGATGAGTTG (配列番号:6)。
身体的な行動実験は、UCSF IACUCによって承認され、実験動物の管理と使用に関する米国国立衛生研究所(NIH)のガイド(National Institutes of Health (NIH) Guide of the Care and Use of Laboratory Animals)と国際疼痛学会(International Association for the Study of Pain)の勧告に従った。皮膚−神経レコーディングに使用した動物は、6-16 週齢の未使用の C57bl/6 雄マウス(n = 10)とした。マウスは、14:10 の明:暗周期で、環境調節した部屋の中で、餌及び水に自由にアクセスできるようにして、飼育した。全てのプロトコールは、ウィスコンシン州立医科大学の機関動物管理及び使用委員会(Institutional Animal Care and Use Committee at the Medical College of Wisconsin)によって承認された。結腸求心性及び結腸 DRG ニューロン研究で使用する動物は、雄の C57BL/6J マウスとした。アデレード大学の動物倫理委員会(The Animal Ethics Committees of The University of Adelaide)と南オーストラリア州保健医療研究所(South Australian Health and Medical Research Institute (SAHMRI))は動物を使用する実験を承認した。
感覚ニューロンの培養とカルシウム・イメージング。
新生児(P0-P3)Sprague-Dawley ラット又は C57BL/6 マウスから三叉神経節を摘出し、> 12時間培養し、カルシウム・イメージング又は電気生理学的記録に供した。胚 DRG 培養は、Jonah Chan 氏好意により提供された64。記載されたように胚培養を維持し、初代培養が確立された後、1 から 10 日後にカルシウム・イメージング実験を行った。初代細胞を、ポリ-L-リジン(Sigma)及びラミニン(Invitrogen-10 μg/ml)でコートしたカバースリップ上に播いた。カルシウム・イメージングのために1時間超、Fura-2-AM(Molecular Probes)を細胞に負荷した。バッファー溶液 - (mM単位)150 NaCl, 2.8 KCl, 1 MgSO 4, 10 HEPES, pH 7.4(NaOH)を、SmartSquirt Micro-Perfusion システム(AutoMate)を使用して、トキシン/薬物(drugs)有り又は無しで灌流した。
新生児(P0-P3)Sprague-Dawley ラット又は C57BL/6 マウスから三叉神経節を摘出し、> 12時間培養し、カルシウム・イメージング又は電気生理学的記録に供した。胚 DRG 培養は、Jonah Chan 氏好意により提供された64。記載されたように胚培養を維持し、初代培養が確立された後、1 から 10 日後にカルシウム・イメージング実験を行った。初代細胞を、ポリ-L-リジン(Sigma)及びラミニン(Invitrogen-10 μg/ml)でコートしたカバースリップ上に播いた。カルシウム・イメージングのために1時間超、Fura-2-AM(Molecular Probes)を細胞に負荷した。バッファー溶液 - (mM単位)150 NaCl, 2.8 KCl, 1 MgSO 4, 10 HEPES, pH 7.4(NaOH)を、SmartSquirt Micro-Perfusion システム(AutoMate)を使用して、トキシン/薬物(drugs)有り又は無しで灌流した。
In situ ハイブリダイゼーションと免疫組織化学。
in situ ハイブリダイゼーション(ISH)は、ViewRNA ISH Tissue 2-plex 又は 1-plex Assay Kits(Affymetrix)を用いて行った。標的 mRNA のシグナルは、明視野又は蛍光顕微鏡において点として現れる。8-12 週齢のマウスをペントバルビタールで深く麻酔し、10 ml のリン酸バッファー生理食塩水(PBS)、続いて 10 ml の 10 %中性緩衝ホルマリン(NBF)を心臓から灌流した。DRG を摘出し、10 % NBF 中 4 ℃ O/N で後固定、30 % w/v ショ糖を含む PBS 中 4 ℃ O/N で凍結保護、次いで -20 ℃で OCT コンパウンド(OCT Compound)に包埋した。組織を 12 μm の切片にし、切片を Diamond White Glass スライド(Globe Scientific)に乗せて(thaw-captured)、使用するまで -20 ℃で保存した。スライドは、最適なシグナルを生成させるために 2 週間以内に使用した。
in situ ハイブリダイゼーション(ISH)は、ViewRNA ISH Tissue 2-plex 又は 1-plex Assay Kits(Affymetrix)を用いて行った。標的 mRNA のシグナルは、明視野又は蛍光顕微鏡において点として現れる。8-12 週齢のマウスをペントバルビタールで深く麻酔し、10 ml のリン酸バッファー生理食塩水(PBS)、続いて 10 ml の 10 %中性緩衝ホルマリン(NBF)を心臓から灌流した。DRG を摘出し、10 % NBF 中 4 ℃ O/N で後固定、30 % w/v ショ糖を含む PBS 中 4 ℃ O/N で凍結保護、次いで -20 ℃で OCT コンパウンド(OCT Compound)に包埋した。組織を 12 μm の切片にし、切片を Diamond White Glass スライド(Globe Scientific)に乗せて(thaw-captured)、使用するまで -20 ℃で保存した。スライドは、最適なシグナルを生成させるために 2 週間以内に使用した。
製造業者が示すように、0.1 M HCl 及び 300 mM NaCl を含む H2O 中でインキュベーションすることにより内在性アルカリホスファターゼを不活性化することを含む凍結組織改変(frozen tissue modifications)をして ViewRNA ISH Tissue 2-plex アッセイを行った。H&E 対比染色(H&E counterstaining)の手順は省略した。Leica DMRB 顕微鏡と Leica Application Suite v3.5.0 を使用した DFC500 デジタル・カメラで画像を取得し、ImageJ ソフトウェアを使用して更に解析した。
神経細胞のサブ集団マーカー(NF200、IB4、CGRP、TH)及び Nav1.1 mRNA を共に標識するために、ViewRNA ISH Tissue 1-plex Assay 及び免疫組織化学を から改変したプロトコール65を用いて続けて行った。ISH/IHC はすべての一次抗体が使えるわけではないことが分かった。動物、組織、及びスライドは、前の段落の記載に従って調製した。組織切片を含む凍結スライドを 60 ℃で 10 分間真空オーブンで加温し、4 % v/v ホルムアルデヒドを含む PBS に室温で 10 分間固定した後、凍結組織改変(frozen tissue modifications)を使う前記製造者のプロトコールに従って、ThermoBrite Slide Processingシステム(Abbott Molecular)中で、工程を進めた。示すように、慎重に及びしっかりと洗浄工程を実施した。最適なプロテアーゼ及びプローブとのインキュベーション時間は、それぞれ 12 分及び 2 時間とした。Fast Red Substrateでの発色(development)後、スライドを PBS 中で短時間すすぎ、次いですぐに免疫組織化学のために処理した。スライドを、0.1 % v/v Triton X-100(Sigma)及び 10 %正常ヤギ血清(NGS)を含む PBS からなる室温(RT)でのブロッキング溶液中で 1 時間インキュベートした。次いで、スライドを一次抗体溶液(0.1 % Triton X-100 及び 2.5 % NGS を含む PBS)中 4 ℃ O/N でインキュベートし、新しい PBS 3X 中で 2 分間激しくかき回し、次いで二次抗体溶液(0.1 % v/v Triton X-100 を含む PBS)で 2 時間室温で暗所にてインキュベートした。次に、新しい PBS 3X 中で 2 分間激しくかき回して切片を洗浄した後、DAPI と供に ProLong Gold 退色防止試薬(Life Technologies)を使ってマウントし、カバースリップを乗せた。Leica DMRB 顕微鏡と Leica Application Suite v3.5.0 を使用した DFC500 デジタルカメラで画像を取得し、ImageJ ソフトウェアを使用して更に解析した。
Affymetrix 社に、マウス Nav1.1(Scn1a, NM_018733.2)に対してタイプ 1 プローブ・セットを、マウス TRPV1(TrpV1, NM_001001445.2)、マウス Nav1.7(Scn9a, NM_001290674.1)、マウス 5HT3(Htr3a, NM_001099644.1)及びマウス TRPM8(Trpm8, NM_134252.3)のコーディング領域に対してタイプ 6 プローブ・セットを設計することを依頼した。本願発明者らは、以下の一次抗体を使用した:マウス抗 NF200 抗体(1:10,000, Sigma)、ウサギ抗 CGRP 抗体(1:10,000, Peninsula Labs)及びウサギ抗 TH 抗体(1:5,000, AbCam)。本願発明者らは、マウス又はウサギに対する、フルオロフォア結合のヤギで産生した二次抗体を、必要に応じて使用した(1:1,000, Alexa Fluor 488, Life Technologies)。IB4 が結合する細胞を同定するために、一次及び二次抗体の代わりにビオチン化 IB4(1:1,000, Vector Labs)及びフルオロフォア結合ストレプトアビジン(1:1,000, Alexa Fluor 488, Life Technologies)を使用した。Fos 染色は、Hm1a 又は PBS を後足に注射して 90 分後に行った。脊髄の切片を腰椎 L4/L5 から調製し、ウサギ抗 Fos 抗体(1:5,000, CalBiochem)で染色した。ATF3 抗体(Santa Cruz Biotechnology)は 1:2000 で使用した。
統計及び実験デザイン。
細胞生理学、組織学及び動物行動についてのサンプル・サイズは、これらのアッセイの以前の経験に基づいて、統計的に有意な結果を得るのに必要な独立した観察の最小数として選択した。組織学については、少なくとも 3 匹の動物のそれぞれからの少なくとも 3 つの切片の数とした。卵母細胞及びマウス・ニューロンの実験については、すべての実験で複数のバッチ/同腹子(litters)を使用した。行動実験については、盲検の実験者によって、異なる実験的なコホートで動物を無作為に選択した。実験及び対照条件は、1 つ又は複数のケージから無作為に選択した動物を用いて、同じ実験時間経過内で比較した。そして反応は、注射条件及び実験的なコホートに関して知らない実験者によってスコア付けをした。動物のジェノタイプは、耳のタグで追跡し、解析が完了した後にジェノタイプが分かるようにした。
細胞生理学、組織学及び動物行動についてのサンプル・サイズは、これらのアッセイの以前の経験に基づいて、統計的に有意な結果を得るのに必要な独立した観察の最小数として選択した。組織学については、少なくとも 3 匹の動物のそれぞれからの少なくとも 3 つの切片の数とした。卵母細胞及びマウス・ニューロンの実験については、すべての実験で複数のバッチ/同腹子(litters)を使用した。行動実験については、盲検の実験者によって、異なる実験的なコホートで動物を無作為に選択した。実験及び対照条件は、1 つ又は複数のケージから無作為に選択した動物を用いて、同じ実験時間経過内で比較した。そして反応は、注射条件及び実験的なコホートに関して知らない実験者によってスコア付けをした。動物のジェノタイプは、耳のタグで追跡し、解析が完了した後にジェノタイプが分かるようにした。
データは、凡例に記載したように、Prism 6 ソフトウェア(GraphPad Software、サン・ディエゴ、カリフォルニア州、米国)及びスチューデント t- 検定(Student's t-test)又は一元分散分析(ANOVA)のどちらかの後にボンフェローニ(Bonferroni) 又はテューキー(Tukey’s)のポストホック検定を行う有意差検定を使用して解析した。全ての有意差検定は両側である。有意水準は * p <0.05、** p <0.01、*** p <0.001 及び **** p <0.0001である。実験の数(n)及び有意性は、図の凡例の中に記載する。すべての有意差検定は、適切に設定した実験計画及び比較の性質として、妥当であるとされた。本願発明者らは、比較が行われる実験パラダイム内では、等分散と正規分布データを仮定する。これらは、本願発明者らのグループや他の人が以前に公表したように、これらの実験的パラダイム内の有意性検定が依存する共通の仮定である。
行動。
図4の行動実験では、成体マウス(6-12 週齢)を使用した。雄及び雌のマウスは、後肢の防衛反応実験において別々に最初は考慮された。両性は、Nav1.1F/Fx Per-Cre CKO マウスと比較して WT 同腹子においてトキシンに対して有意により強く反応した(片側対応の無いスチューデント t 検定、p < 0.05、WT 雌:n = 5、CKO 雌:n = 6、WT 雄:n = 5、CKO 雄:n = 5)。従って、雄及び雌の行動反応をプールし、その後の実験を、CKO 及び WT 同腹子実験については雄及び雌マウスの両方で、又は他の条件(例えば、Cap による欠失(Cap ablation))については雄マウスのみについて行った。足蹠内に注射(5 μM の Hm1a を含む又は含まない 10 μl の PBS)の直後の 20 分間の観察期間中に、防衛応答を記録した。舐め/噛む行動は、注射条件及び実験コホート(WT、CKO 又は Cap により欠失させた(Cap ablation)マウス)に関して盲検とした実験者によって、行動の秒数としてスコア化した。ハーグリーヴス(Hargreaves)及びフォン・フレイ(Von Frey)試験は、500 nM Hm1a 又は Hm1b を足蹠内に注射した後 30 分に行った。Cap による欠失(Cap ablation)は、先に記載したようにして行った34。そして、cap で処置したマウスをホット・プレート上で試験して、TRPV1+ 求心性神経が欠失していることを確認した。 欠失は組織学によっても確認した。
図4の行動実験では、成体マウス(6-12 週齢)を使用した。雄及び雌のマウスは、後肢の防衛反応実験において別々に最初は考慮された。両性は、Nav1.1F/Fx Per-Cre CKO マウスと比較して WT 同腹子においてトキシンに対して有意により強く反応した(片側対応の無いスチューデント t 検定、p < 0.05、WT 雌:n = 5、CKO 雌:n = 6、WT 雄:n = 5、CKO 雄:n = 5)。従って、雄及び雌の行動反応をプールし、その後の実験を、CKO 及び WT 同腹子実験については雄及び雌マウスの両方で、又は他の条件(例えば、Cap による欠失(Cap ablation))については雄マウスのみについて行った。足蹠内に注射(5 μM の Hm1a を含む又は含まない 10 μl の PBS)の直後の 20 分間の観察期間中に、防衛応答を記録した。舐め/噛む行動は、注射条件及び実験コホート(WT、CKO 又は Cap により欠失させた(Cap ablation)マウス)に関して盲検とした実験者によって、行動の秒数としてスコア化した。ハーグリーヴス(Hargreaves)及びフォン・フレイ(Von Frey)試験は、500 nM Hm1a 又は Hm1b を足蹠内に注射した後 30 分に行った。Cap による欠失(Cap ablation)は、先に記載したようにして行った34。そして、cap で処置したマウスをホット・プレート上で試験して、TRPV1+ 求心性神経が欠失していることを確認した。 欠失は組織学によっても確認した。
慢性の内臓知覚過敏症のモデル。
大腸炎を、前述の通り TNBS の投与によって誘導した62,63。簡潔に言うと、13 週齢の麻酔したマウスに、ポリエチレン・カテーテルを介して 0.1 mL の TNBS(30 % EtOH 中 130 μg/mL)を結腸内浣腸で投与した62,63,66。粘膜構造、細胞浸潤、陰窩膿瘍(crypt abscesses)及び杯細胞(goblet cell)の喪失に関する組織学的検査を行い、処置後第 3 日までに有意な TNBS 誘発の損傷を確認した。これは第 7 日までに大部分回復し、28 日までに完全に回復した。28 日時点のマウスの高閾値侵害受容器は、顕著な機械的刺激過敏性、機械的刺激による活性化閾値の低下、痛覚過敏性及びアロディニアを呈した67。このように、それらを「慢性の内臓知覚過敏症(CVH)マウス」と呼ぶ62,63,66,68。
大腸炎を、前述の通り TNBS の投与によって誘導した62,63。簡潔に言うと、13 週齢の麻酔したマウスに、ポリエチレン・カテーテルを介して 0.1 mL の TNBS(30 % EtOH 中 130 μg/mL)を結腸内浣腸で投与した62,63,66。粘膜構造、細胞浸潤、陰窩膿瘍(crypt abscesses)及び杯細胞(goblet cell)の喪失に関する組織学的検査を行い、処置後第 3 日までに有意な TNBS 誘発の損傷を確認した。これは第 7 日までに大部分回復し、28 日までに完全に回復した。28 日時点のマウスの高閾値侵害受容器は、顕著な機械的刺激過敏性、機械的刺激による活性化閾値の低下、痛覚過敏性及びアロディニアを呈した67。このように、それらを「慢性の内臓知覚過敏症(CVH)マウス」と呼ぶ62,63,66,68。
結腸 DRG ニューロンの逆行追跡(Retrograde tracing)及び細胞培養。
16 週齢の健常及び CVH マウスをハロタンで麻酔し、中線開腹手術後、AlexaFluor-488 に結合した蛍光逆行ニューロン・トレーサ・コレラ・トキシン・サブユニット B を 10 μL、下行結腸の壁内で漿膜下に 3 回注射を行った。注射 4 日後、マウスを CO2 吸入により屠殺し、T10-L1 から DRG を外科的に摘出した。DRG を 37 ℃で 30 分間、4 mg/mL コラゲナーゼ II(GIBCO, Invitrogen)及び 4 mg/mL ディスパーゼ(GIBCO)で消化し、続いて 37 ℃で 10 分間、4 mg/mL コラゲナーゼ II で消化した。ニューロンを、火で先端を鈍らせた(fire-polished)パスツール・ピペットの中を通すことでばらばらにし、単一細胞の懸濁液になるように力学的に解離させた。ニューロンを、10 % FCS(Invitrogen)、2 mM L-グルタミン(GIBCO)、100 μM MEM 非必須アミノ酸(GIBCO)及び100 mg/ml ペニシリン/ストレプトマイシン(Invitrogen)を含む DMEM(GIBCO)中に再懸濁した。ニューロンは、ポリ-D-リジン(800 μg/ml)及びラミニン(20 μg/ml)でコートし、8 mm HCl で処理したカバースリップ上にスポット的に播種し、37 ℃、5 % CO2 のインキュベーター内で培養した。
16 週齢の健常及び CVH マウスをハロタンで麻酔し、中線開腹手術後、AlexaFluor-488 に結合した蛍光逆行ニューロン・トレーサ・コレラ・トキシン・サブユニット B を 10 μL、下行結腸の壁内で漿膜下に 3 回注射を行った。注射 4 日後、マウスを CO2 吸入により屠殺し、T10-L1 から DRG を外科的に摘出した。DRG を 37 ℃で 30 分間、4 mg/mL コラゲナーゼ II(GIBCO, Invitrogen)及び 4 mg/mL ディスパーゼ(GIBCO)で消化し、続いて 37 ℃で 10 分間、4 mg/mL コラゲナーゼ II で消化した。ニューロンを、火で先端を鈍らせた(fire-polished)パスツール・ピペットの中を通すことでばらばらにし、単一細胞の懸濁液になるように力学的に解離させた。ニューロンを、10 % FCS(Invitrogen)、2 mM L-グルタミン(GIBCO)、100 μM MEM 非必須アミノ酸(GIBCO)及び100 mg/ml ペニシリン/ストレプトマイシン(Invitrogen)を含む DMEM(GIBCO)中に再懸濁した。ニューロンは、ポリ-D-リジン(800 μg/ml)及びラミニン(20 μg/ml)でコートし、8 mm HCl で処理したカバースリップ上にスポット的に播種し、37 ℃、5 % CO2 のインキュベーター内で培養した。
(実施例1)
毒液のスクリーニングにより、選択的な Nav1.1 活性化トキシンを同定する。
一次求心性侵害受容器を標的とする新規トキシンを同定するために、本願発明者らは、カルシウム・イメージングを用いて、培養した体性感覚ニューロンを活性化する作用について、集めた 109 種類のクモ、サソリ及びムカデ毒液をスクリーニングした。タランチュラHeteroscodra maculate(図1a)由来の毒液が、マウス又はラットの三叉神経節(TG)又は後根神経節(DRG)からのニューロンのサブセットを強く興奮させる。毒液を分画すると、2 つの活性ピークが得られ、これを MALDI-MS 及びエドマン配列解析によって同定した。本願発明者らは、これらトキシンを δ-テラホトキシン-Hm1a(Hm1a)及び δ-テラホトキシン-Hm1b(Hm1b)(関連しあう配列の 2 種類のインヒビター・システイン・ノット(ICK)ペプチドである)と命名した。合成 Hm1a をラット DRG ニューロン等に添加すると、カルシウム応答を誘発し(図1b)、Hm1a が活性毒液成分であることが確認された。他に記載がない限り、全てのその後の実験は合成 Hm1a ペプチドを用いて行った。
毒液のスクリーニングにより、選択的な Nav1.1 活性化トキシンを同定する。
一次求心性侵害受容器を標的とする新規トキシンを同定するために、本願発明者らは、カルシウム・イメージングを用いて、培養した体性感覚ニューロンを活性化する作用について、集めた 109 種類のクモ、サソリ及びムカデ毒液をスクリーニングした。タランチュラHeteroscodra maculate(図1a)由来の毒液が、マウス又はラットの三叉神経節(TG)又は後根神経節(DRG)からのニューロンのサブセットを強く興奮させる。毒液を分画すると、2 つの活性ピークが得られ、これを MALDI-MS 及びエドマン配列解析によって同定した。本願発明者らは、これらトキシンを δ-テラホトキシン-Hm1a(Hm1a)及び δ-テラホトキシン-Hm1b(Hm1b)(関連しあう配列の 2 種類のインヒビター・システイン・ノット(ICK)ペプチドである)と命名した。合成 Hm1a をラット DRG ニューロン等に添加すると、カルシウム応答を誘発し(図1b)、Hm1a が活性毒液成分であることが確認された。他に記載がない限り、全てのその後の実験は合成 Hm1a ペプチドを用いて行った。
テトロドトキシン(TTX)は、Hm1a 誘発性カルシウム応答を遮断したが(図1b)、これは Nav チャネルの関与を示唆している。実際、TG ニューロンでのホールセル・パッチクランプ・レコーディング(whole-cell patch-clamp recordings)は、Hm1a が Nav電流の不活性化を強く阻害することを示している(図1c)。体性感覚ニューロンは、Nav1.1, 1.6, 1.7, 1.8 及び 1.9 等を含む複数の Nav チャネル・サブタイプを発現する;しかし、Nav1.1, 1.6, 1.7 のみが TTX に対して感受性であり21、このことにより本願発明者らの探索が絞り込まれることになった。次に、ICA-121431(Nav1.1 及び Nav1.3 に対する選択性を有する低分子阻害剤22(図1b))を試験し、胚性 DRG 及び P0 マウスの TG 培養物の両方における Hm1a 誘発性カルシウム応答を大きく減少させることを見出した(図1d)。これは、主要な感覚性ニューロンのサブタイプの中で、Nav1.1 が主要な標的であることを示唆している。対照的に、ICA-121431 は、Nav チャネルサブタイプ間の選択性がほとんどない Hm1a 関連ペプチドであるSGTx1 に対する応答を部分的にブロックするだけである。このように、SGTx1 が Hm1a よりも TG 及び胚性 DRG ニューロンのより大きなコホートを興奮させることは驚くべきことではない(図1c-d)。Nav1.1 に対するトキシン選択性を確認するために、本願発明者らはアフリカツメガエル卵母細胞において Nav1.1-1.8 チャネルを異種性に発現させた。注目すべきことに、Hm1a は、hNav1.1 の速い不活性化を阻害し(EC50 = 38±6 nM)、hNav1.2 及び hNav1.3 に対する効果は実質的にそれよりも弱く、hNav1.4-1.8 に対する効果はない(図1e)。[天然の Hm1b を使用して同様の結果が得られた。] Nav1.9 は組換えシステムでは効率的に発現しないが、代理キメラ(4 つの hNav1.9 ドメインのそれぞれからの S3b-S4 トキシン結合領域を含む rKv2.1 チャネル)はまたトキシン非感受性であった。
Hm1b は新規トキシンであるが、Hm1a の方は、Kv4.1 電位依存性カリウム(Kv)チャネルの中程度のアフィニティーを有する遮断薬である κ-テラホトキシン-Hm1a として以前に記載されている25。しかし、本願発明者らは高濃度(5 μMまで)の合成 Hm1a が、mKv4.1 電流の 20 %以下しか遮断しないのを見出している。本願発明者らは、1 μM の天然 Hm1a が Nav1.1 に対して飽和効果を示すが、mKv4.1 を遮断することができないことを同様に見出した。最後に、培養感覚ニューロンでは、外向きの K+電流は 500 nM の Hm1a による影響を受けず、それゆえ、その主な生理学的標的は Nav1.1 であることが示唆された。Nav1.1 への影響は、なぜ脳への Hm1a の注射が痙攣及び急速死を誘発することが以前に示されたのかを説明し得る。まとめると、これらの結果は、Hm1a が Nav1.1 を選択的に標的とすることによって、感覚ニューロンのサブセットを活性化することを実証している。
Nav チャネルの急速な不活性化の阻害は、静止膜電位を直接に変更することなく細胞を過興奮性にするはずである。実際、ホールセル・カレント・クランプ装置(whole-cell current clamp configuration)における Hm1a 応答性 TG ニューロンの解析は、これがそうであることを示している。Hm1a は静止膜電位を変化させない(Hm1a 添加前、Vm = -55±6mV; Hm1a 添加後、Vm = -56±6mV);しかし、20 pA の電流注入中にスパイク頻度を大きく増加させる。Hm1a はまた、活動電位の幅を ~28 %ほど有意に延長するが、不活性化 Na+電流ではないものを流入させることと一致する(図1f)。膜電位に直接的な影響がない場合、トキシン誘発カルシウム・シグナルは「自発的(spontaneous)」な細胞の脱分極に依存する。実際、本願発明者らは、若い(胚又は新生児)マウス又はラット由来の感覚ニューロン培養物においてトキシン応答が最も強いことを見出した。これは、おそらくこれらの細胞又は培養条件における活動電位発火の閾値が低いことを反映していると思われる。この仮説と一致するが、本願発明者らは、トキシン曝露前に成体ニューロンをプロスタグランジン E2(PGE2)で感作26すると、トキシン感受性細胞の割合が大きく増加することを見出した。
(実施例2)
Hm1a の選択性は、Nav1.1 の DIV 内にある S1-S2 ループに依存する。
Hm1a 効果の解析をすると、前記トキシンが速い不活性化の速度及び程度を阻害することが明らかになるが(図2a)、これは、ドメイン IV(DIV)の S3b-S4 電位センサー領域に結合する、より選択性の低いペプチド・トキシンについて記載されたメカニズムと同様である23。Hm1a が同じ部位を標的としているか否かを判断するために、hNav1.1 から 4 つの S3b-S4 領域のそれぞれを、ホモ四量体 rKv2.1 チャネルのそれと類似する性質の部位(通常は前記トキシンに非感受性である)に移し替えることを行った。実際に、DIV S3b-S4領域を移し替えるだけで、rKv2.1 を Hm1a に感受性とし、このセグメントがトキシン作用の主要な決定因子であることを示している(図2b)。しかしながら、この領域は hNav1.1, 1.2 及び 1.3 において同一であるか又は高度に保存されており、前記トキシンは DIV S3b-S4 と相互作用し得るが、このような相互作用ではトキシンの選択性を完全には説明できない。トキシン選択性を特定する更なる領域を同定するために、本願発明者らは、Nav1.1 と Nav1.4 とのキメラを構築した(後者は Hm1a に対して完全に非感受性である。)。hNav1.4 の S3b-S4 領域を hNav1.1 のものへ置換することによってトキシン感受性にはならなかったが、Nav1.1 の S3b-S4 領域と S1-S2 ループの両方を移し替えるとトキシン感受性となった(図2c)。これらの結果は、S1-S2 ループ及び S3b-S4 領域の両方が一緒になって、トキシン感受性及びサブタイプ選択性を決定することを示唆し、これは前記 S1-S2 ループが電位センサー上のトキシン認識部位に寄与し得るという以前の示唆と一致する。
Hm1a の選択性は、Nav1.1 の DIV 内にある S1-S2 ループに依存する。
Hm1a 効果の解析をすると、前記トキシンが速い不活性化の速度及び程度を阻害することが明らかになるが(図2a)、これは、ドメイン IV(DIV)の S3b-S4 電位センサー領域に結合する、より選択性の低いペプチド・トキシンについて記載されたメカニズムと同様である23。Hm1a が同じ部位を標的としているか否かを判断するために、hNav1.1 から 4 つの S3b-S4 領域のそれぞれを、ホモ四量体 rKv2.1 チャネルのそれと類似する性質の部位(通常は前記トキシンに非感受性である)に移し替えることを行った。実際に、DIV S3b-S4領域を移し替えるだけで、rKv2.1 を Hm1a に感受性とし、このセグメントがトキシン作用の主要な決定因子であることを示している(図2b)。しかしながら、この領域は hNav1.1, 1.2 及び 1.3 において同一であるか又は高度に保存されており、前記トキシンは DIV S3b-S4 と相互作用し得るが、このような相互作用ではトキシンの選択性を完全には説明できない。トキシン選択性を特定する更なる領域を同定するために、本願発明者らは、Nav1.1 と Nav1.4 とのキメラを構築した(後者は Hm1a に対して完全に非感受性である。)。hNav1.4 の S3b-S4 領域を hNav1.1 のものへ置換することによってトキシン感受性にはならなかったが、Nav1.1 の S3b-S4 領域と S1-S2 ループの両方を移し替えるとトキシン感受性となった(図2c)。これらの結果は、S1-S2 ループ及び S3b-S4 領域の両方が一緒になって、トキシン感受性及びサブタイプ選択性を決定することを示唆し、これは前記 S1-S2 ループが電位センサー上のトキシン認識部位に寄与し得るという以前の示唆と一致する。
(実施例3)
Nav1.1 は古典的な C-線維侵害受容器では発現していない。
これまでの研究では、Nav1.1 は、中直径及び大直径の有髄感覚ニューロンに発現していることが示されてきている7。これは、成体マウスの DRG の中直径(断面積 400-700 μm2)ニューロンにおいて、Nav1.1 の転写物が選択的に多くなっていることを示す本願発明者らのデータと一致している(図3)。本願発明者らは全細胞の 35 %において Nav1.1 mRNA を検出したが、その大部分(> 75 %)は有髄(NF200 陽性)コホートに属する。対照的に、本願発明者らは、Nav1.1 陽性細胞と、TRPV1、CGRP、チロシン・ヒドロキシラーゼ及びレクチン IB4 等を含む、小直径の無髄ニューロンのマーカーとのオーバーラップは、限定的(5-11%)であることを観察した。しかしながら、本願発明者らは、軽度に有髄化している Aδ ニューロンによって主に発現している29、セロトニン開口型チャネルである 5-HT3レセプター(43 %の Nav1.1 陽性細胞が 5-HT3 を発現する)と実質的に共発現していることを観察した。最後に、22 %の Nav1.1 陽性細胞が、C 及び Aδ 線維の両方に見られる低温/メントール・レセプター TRPM8 を発現していた30。まとめると、本願発明者らは、Nav1.1 が Aδ 線維等を含む有髄ニューロンで主に発現していると結論するが、これは、分離した DRG ニューロンからの公開された単一細胞トランスクリプトーム・プロファイリング・データと一致する31。興味深いことに、ほとんどの(> 85 %)Nav1.1 陽性細胞は Nav1.7 も発現しており、この有髄ニューロンの集団が侵害受容に寄与している可能性を示唆している(下記参照)。
Nav1.1 は古典的な C-線維侵害受容器では発現していない。
これまでの研究では、Nav1.1 は、中直径及び大直径の有髄感覚ニューロンに発現していることが示されてきている7。これは、成体マウスの DRG の中直径(断面積 400-700 μm2)ニューロンにおいて、Nav1.1 の転写物が選択的に多くなっていることを示す本願発明者らのデータと一致している(図3)。本願発明者らは全細胞の 35 %において Nav1.1 mRNA を検出したが、その大部分(> 75 %)は有髄(NF200 陽性)コホートに属する。対照的に、本願発明者らは、Nav1.1 陽性細胞と、TRPV1、CGRP、チロシン・ヒドロキシラーゼ及びレクチン IB4 等を含む、小直径の無髄ニューロンのマーカーとのオーバーラップは、限定的(5-11%)であることを観察した。しかしながら、本願発明者らは、軽度に有髄化している Aδ ニューロンによって主に発現している29、セロトニン開口型チャネルである 5-HT3レセプター(43 %の Nav1.1 陽性細胞が 5-HT3 を発現する)と実質的に共発現していることを観察した。最後に、22 %の Nav1.1 陽性細胞が、C 及び Aδ 線維の両方に見られる低温/メントール・レセプター TRPM8 を発現していた30。まとめると、本願発明者らは、Nav1.1 が Aδ 線維等を含む有髄ニューロンで主に発現していると結論するが、これは、分離した DRG ニューロンからの公開された単一細胞トランスクリプトーム・プロファイリング・データと一致する31。興味深いことに、ほとんどの(> 85 %)Nav1.1 陽性細胞は Nav1.7 も発現しており、この有髄ニューロンの集団が侵害受容に寄与している可能性を示唆している(下記参照)。
この組織学的分析を補完するために、トキシン感受性と他のレセプター選択的アゴニスト感受性とのオーバーラップについても検討した。Hm1a 応答細胞は、新生児(P0)マウスから培養された TG ニューロンの 13 %を構成するが、これらのうちのほとんどが、C 線維に限局する TRPA1 レセプターのアゴニストであるカラシ油(AITC)には応答しない(13 %未満)。更に、P0 という初期ステージで、大部分(約 60 %)の感覚ニューロンが TRPV1 を発現するという事実にもかかわらず32、トキシン感受性 P0 ニューロンのわずかに 3 分の 1 しかカプサイシンに応答しない。トキシン感受性細胞の半分以上(52 %)が選択的 5-HT3 アゴニストである mCPBG に応答し、トキシン応答細胞の38 %はまたメントールに反応する。更に、トキシン感受性細胞が IB4 を結合するのはあったとしてもほとんどない。最後に、本願発明者らは、ex vivo 皮膚−神経調製物を用いて、機械的侵害受容性 Aδ 線維(AM’s)に対する Hm1a の効果を調べた。本願発明者らは、1 μM Hm1a を皮膚受容野に与えると、機械的刺激の間にこれらの AM 線維の発火率が有意に増加することを見出し(図3d)、この線維クラスにおける機能する Nav1.1 の発現を確認した。以前の研究では、TRPV1 は AM 線維においてわずかに発現していることが示されており33、これは、Nav1.1 と TRPV1 とが部分的にのみオーバーラップすることを示す上記の組織学的データと一致している。まとめると、これらの機能的データによって、本願発明者らは、有髄化された Aδ 線維に Nav1.1 が発現することを組織学的に確認し、更に、この特定の Navチャネル・サブタイプが機械的侵害受容に関与することが示唆される。
(実施例4)
Hm1a は、非炎症性の痛み及び機械的刺激によるアロディニアを誘発する。
次に、本願発明者らは、Hm1a を用いて、Nav1.1 発現線維の活性化が疼痛行動を引き起こすかどうかを直接的に検討することとした。実際に、マウスの後肢に Hm1a(10 μl 中 5 μM)を注射すると、観察期間中(図4a)、すぐさま強い防衛反応(発作的に注射した足を舐めたり又は咬んだりする)が誘発される。トキシンを注射することはまた、注射と同側にある表面層(superficial lamina)の後角ニューロンにおける Fos 免疫反応性を有意に増加させ、有髄侵害受容器とそれらが中心で接続していることの機能的関与を示している(図4b)。
Hm1a は、非炎症性の痛み及び機械的刺激によるアロディニアを誘発する。
次に、本願発明者らは、Hm1a を用いて、Nav1.1 発現線維の活性化が疼痛行動を引き起こすかどうかを直接的に検討することとした。実際に、マウスの後肢に Hm1a(10 μl 中 5 μM)を注射すると、観察期間中(図4a)、すぐさま強い防衛反応(発作的に注射した足を舐めたり又は咬んだりする)が誘発される。トキシンを注射することはまた、注射と同側にある表面層(superficial lamina)の後角ニューロンにおける Fos 免疫反応性を有意に増加させ、有髄侵害受容器とそれらが中心で接続していることの機能的関与を示している(図4b)。
トキシン誘発侵害受容が、TRPV1 及び Nav1.1 を共発現する小さな集団の線維に依存する可能性を排除するために、本願発明者らは、カプサイシンを髄腔内(脊髄)に注射することによって、TRPV1 陽性の神経末端を欠失させた。その場合、Hm1a 誘発性の防衛行動は持続した(図4a)。注目すべきことに、Hm1a は、注射された足の腫脹又は血漿の溢出、大部分の TRPV1 発現ニューロンを包含するペプチド作動性 C- 線維侵害受容ニューロンの活性化によって直ちに誘発される神経因性の炎症反応を引き起こさない(図4c)。これらの結果は、本願発明者らによる Nav1.1 発現の組織学的及び機能的な同定と併せて、Hm1a が有髄感覚線維の非ペプチド作動性サブセットを発火させることによって疼痛を誘発することを更に示唆する。
TRPV1 発現線維を遺伝的又は薬理学的に除去することは、有害な熱に対する感受性を大きく低下させるが、機械的刺激に対する感受性を乱すものではない。対照的に、上記の解剖学的及び生理学的結果は、Nav1.1 陽性線維が主に機械的刺激侵害受容に寄与していることを示唆している。そこで、本願発明者らは、急性行動を誘発するのには不十分な用量(10 μl 中 500 nM)のトキシンを足蹠内に注射後、熱的及び機械的刺激に対する反応をモニターすることにより、Hm1a がこれらの行動モダリティに対して効果を異にするかどうかを検討した。実際、Hm1a を足蹠内に注射しても、熱に対する感受性を変化させないが、TRPV1 発現線維に依存しない機械的刺激に対する強い感作を生じる(図4d、e)。同等の機械的刺激の感作はまた、天然の Hm1b ペプチドを注射した後にも観察される(図4e)。これらの行動学的観察と一致して、本願発明者らは、カプサイシン感受性でもあるニューロンを除いて、全ての Hm1a 応答性の成体 DRG ニューロンが機械的刺激により活性化される電流を示すことを見出した(図4f)。
トキシン誘発行動における Nav1.1 の必要性を確認するために、本願発明者らは、floxed Nav1.1対立遺伝子13を持つマウスを、発生過程の無髄及び有髄の感覚性ニューロンの大部分において活性があるペリフェリン・プロモーターの制御下で Cre リコンビナーゼを発現する系統と交配させた。実際に、ペリフェリン -Cre x YFP レポーター系統を解析すると、これらの動物は 46 % の Nav1.1 陽性細胞において Cre リコンビナーゼを発現することを示した。驚くべきことに、この線維のサブセットから Nav1.1 を欠失させることによって、急性の防衛反応及び機械的刺激への感作の両方を含む、トキシン誘発行動が有意に減弱する(図4a、e)。
神経傷害又は炎症によって侵害受容経路が強く活性化されることは、一次及び二次感作の両方を惹起することがあり、後者は、炎症又は傷害の部位に対して反対側の機械的刺激又は熱的刺激への過敏性として現れることがある。実際に、本願発明者らは、Hm1a を片側に注射しても、注射した側とその反対側の両方の足で、強くて同じくらいの機械的刺激への感作が生じることを見出した(図4e)。この反対側性の感作は、熱感受性には変化が観察されなかったため、モダリティ特異的でもある(図4d)。重要なことに、Hm1a を介する機械的刺激感受性は、Nav1.1-ペリフェリン Cre 動物の同側及び反対側の足で等価的に減少していて、これは反対側の効果が Nav1.1 に依存することを示している(図4e)。本願発明者らは神経因性炎症の兆候を観察していないので、この表現型が Hm1a を介した神経の傷害に起因するかどうかを検討した。しかし、トキシンを注射しても神経損傷のマーカーである ATF3 の発現が誘導されないため、これはありそうにない40。まとめると、これらの所見は、Nav1.1 発現線維を直接に活性化することは、強くてモダリティ特異的な両側性の感作を生じさせるのに十分であることを示す。
(実施例5)
Nav1.1 は、過敏性腸症候群のモデルで上昇している。
慢性的な機械的刺激過敏性は過敏性腸症候群(IBS)患者において腹痛が進展することの根本にある。機械的刺激−侵害受容における Nav1.1 のはっきりとした役割を考慮して、本願発明者らは、このチャネルが腸の機械的刺激に感受性がある線維で発現しているか否か、もしそうなら、このチャネルが慢性の内臓機械的刺激過敏症(CVH)モデルにおけるニューロンの感作に寄与するか否かを検討した。これらの疑問に答えるために、本願発明者らは、健常マウス又は CVH マウスに由来する ex vivo 腸−神経調製物における機械的刺激への応答を調べた。健常な動物由来の調製物では、Hm1a は、想定される機械的侵害受容器を構成する高閾値結腸求心性神経のサブ集団(40 %)における機械的刺激誘発スパイクを増加させる(図5a)。これに対応して、ICA-121431 は機械的刺激応答を低下させ、調べた線維の 50 %で Hm1a への感作を遮断する(図5a)。更に、Hm1a は、ホールセル・カレント・クランプ解析(whole-cell current clamp analysis)(図5b)によって測定されるように、逆行性に追跡された結腸 DRG ニューロンのサブセット(45 %)における活動電位発火の閾値を有意に低下させる。これらの結果は、高閾値の機械的刺激感受性結腸線維のサブセットが、機能する Nav1.1 チャネルを発現することを示している。
Nav1.1 は、過敏性腸症候群のモデルで上昇している。
慢性的な機械的刺激過敏性は過敏性腸症候群(IBS)患者において腹痛が進展することの根本にある。機械的刺激−侵害受容における Nav1.1 のはっきりとした役割を考慮して、本願発明者らは、このチャネルが腸の機械的刺激に感受性がある線維で発現しているか否か、もしそうなら、このチャネルが慢性の内臓機械的刺激過敏症(CVH)モデルにおけるニューロンの感作に寄与するか否かを検討した。これらの疑問に答えるために、本願発明者らは、健常マウス又は CVH マウスに由来する ex vivo 腸−神経調製物における機械的刺激への応答を調べた。健常な動物由来の調製物では、Hm1a は、想定される機械的侵害受容器を構成する高閾値結腸求心性神経のサブ集団(40 %)における機械的刺激誘発スパイクを増加させる(図5a)。これに対応して、ICA-121431 は機械的刺激応答を低下させ、調べた線維の 50 %で Hm1a への感作を遮断する(図5a)。更に、Hm1a は、ホールセル・カレント・クランプ解析(whole-cell current clamp analysis)(図5b)によって測定されるように、逆行性に追跡された結腸 DRG ニューロンのサブセット(45 %)における活動電位発火の閾値を有意に低下させる。これらの結果は、高閾値の機械的刺激感受性結腸線維のサブセットが、機能する Nav1.1 チャネルを発現することを示している。
CVH マウスの結腸求心性神経において、ベースラインの機械的刺激感覚応答は健常対照と比較して上昇する(図5aと5cを比較)。Hm1a を添加すると、CVH 線維のサブセット(36 %)における機械的刺激に誘発されるスパイクを、既に上昇したレベルを超えて高める(図5c)。興味深いことに、CVH(及び正常対照とは対照的に)において、トキシンを添加すると、大部分の(64 %)逆行性に追跡された結腸 DRG ニューロンの電気的興奮性を劇的に増加させる(図5d)。これは Nav1.1 の機能的な上昇を示唆する。更に、ICA-121431 は、大部分の(70 %)CVH 感作線維における機械的刺激感覚応答を、ベースライン対照の機械的刺激感覚応答に似たレベルにまで低下させ(図5aと5cを比較)、Hm1a の感作効果を遮断する(図5c)。まとめると、これらの結果は、IBS における機械的刺激過敏性における Nav1.1 の役割を支持する。
Nav チャネルのサブタイプ選択的リガンドの開発は重要であるが、難しい目標である。本願発明者らの結果は、サブタイプ選択性を高める DIV S1-S2 ループ内の部位を同定したもので、以下に示すように他のサブタイプ特異的な開口修飾因子(gating modifiers)を設計するための有用な戦略を提供する。
(実施例6)
FB Nav1.1 遮断薬は、CVH を有するマウス由来の結腸侵害受容器のサブ集団における機械的刺激感受性を低下させる。
活動電位発生の ex vivo 単一ユニット細胞外記録を、内臓結腸求心性神経で行った。記録は、標準的なプロトコール(例えば、Brierley, S. M., Jones, R. C., III, Gebhart, G. F. & Blackshaw, L. A. Splanchnic and pelvic mechanosensory afferents signal different qualities of colonic stimuli in mice. Gastroenterolog 127, 166-178 (2004))を使用して、健常又は CVH マウスで行った。ベースラインの機械的刺激感受性は、求心性受容野へ 2-g フォン・フレイ・ヘア・プローブを 3 秒間の適用したことへの応答として測定した。このプロセスを 3-4 回繰り返し、毎回 10 秒ずつ間隔をあけた。次いで、Hm1a(100 nM)若しくは Nav1.1 遮断薬の化合物 B(100 μM)又はそれらの組み合わせを添加した後に、機械的刺激感受性を再試験した。瞬時周波数(Instantaneous frequency)は、活動電位とその前の活動電位との間の時間間隔の逆数として定義される。グループ・データは、毎秒スパイクとして提示され、平均±s.e.m. として表される。
FB Nav1.1 遮断薬は、CVH を有するマウス由来の結腸侵害受容器のサブ集団における機械的刺激感受性を低下させる。
活動電位発生の ex vivo 単一ユニット細胞外記録を、内臓結腸求心性神経で行った。記録は、標準的なプロトコール(例えば、Brierley, S. M., Jones, R. C., III, Gebhart, G. F. & Blackshaw, L. A. Splanchnic and pelvic mechanosensory afferents signal different qualities of colonic stimuli in mice. Gastroenterolog 127, 166-178 (2004))を使用して、健常又は CVH マウスで行った。ベースラインの機械的刺激感受性は、求心性受容野へ 2-g フォン・フレイ・ヘア・プローブを 3 秒間の適用したことへの応答として測定した。このプロセスを 3-4 回繰り返し、毎回 10 秒ずつ間隔をあけた。次いで、Hm1a(100 nM)若しくは Nav1.1 遮断薬の化合物 B(100 μM)又はそれらの組み合わせを添加した後に、機械的刺激感受性を再試験した。瞬時周波数(Instantaneous frequency)は、活動電位とその前の活動電位との間の時間間隔の逆数として定義される。グループ・データは、毎秒スパイクとして提示され、平均±s.e.m. として表される。
図6A-6Cは、100 μM濃度の化合物 Bが、健常マウス由来の結腸侵害受容器の機械的刺激感受性を阻害することを示す。更に、化合物 B は、ニューロンに対する Hm1a トキシンの感作効果を阻害し、その阻害活性をなお保持する。
(実施例7)
実施例5に記載したのと同じ CVH モデルを使用して、CVH マウス由来の結腸求心性神経において、本願発明者らは、化合物 B が Nav1.1 チャネル遮断薬として作用し、健常対照と比較してベースラインの機械的刺激感覚応答を阻害するかどうかを試験した。図7A-7Cに示すように、化合物 B は、CVH マウス由来の結腸侵害受容器のサブ集団における機械的刺激感受性を低下させた。実施例6と同様に、化合物 B は Hm1a の存在に影響されず、Hm1a は Hm1a トキシンの刺激活性を遮断した。
実施例5に記載したのと同じ CVH モデルを使用して、CVH マウス由来の結腸求心性神経において、本願発明者らは、化合物 B が Nav1.1 チャネル遮断薬として作用し、健常対照と比較してベースラインの機械的刺激感覚応答を阻害するかどうかを試験した。図7A-7Cに示すように、化合物 B は、CVH マウス由来の結腸侵害受容器のサブ集団における機械的刺激感受性を低下させた。実施例6と同様に、化合物 B は Hm1a の存在に影響されず、Hm1a は Hm1a トキシンの刺激活性を遮断した。
このデータは、化合物 B によって例示されるクラスの化合物が Nav1.1 チャネルの遮断薬であり、IBS に関連する疼痛等のように機械的刺激感受性ニューロンが介在する疼痛及び疾患を治療するための治療組成物として使用され得ることを示す。
(実施例8)
片頭痛に関するニトログリセリン(NTG)モデルにおける化合物 B の抗アロディニア効果。
NTG は後肢に機械的刺激アロディニアを誘発した。ディクソンのアップ−ダウン法(Dixon up-and-down method)により、フォン・フレイ・モノフィラメント(VFF; 8本のフィラメント、範囲0.008〜2 g、Stoelting Co)を使用して機械的刺激の閾値を測定した51。薬物試験のために、48 匹の未使用の C57Bl/6 雄マウス(20-30 g)を以下の群に無作為に分けた(一群あたり n = 12 のマウス):ビヒクル(vehicle)/シクロデキストリン、ビヒクル(vehicle)/化合物 B 75 mg/kg、NTG/シクロデキストリン、及び NTG/化合物 B 75 mg/kg。試験の前に、すべての動物を、1 週間、行動実験室で午前中、カップの様に手を丸めて(cupped hand technique)扱った52。各試験日に、最大 12 匹の動物を使用し、等しく 4 つの群に分けた。マウスを、4 つの室に分けられた透明なアクリル製ケージ(8.7 インチ × 8.7 インチ × 5 インチ)に閉じ込め、試験する足に完全にアクセスできるようにした隆起した金網プラットフォームの上に一匹ずつのせた。試験日及びその 1 日前に、マウスを 2 時間馴化させた。機械的刺激の閾値を、このモデルにおける NTG の時間 - ピーク効果(TPE)に合うように(データは示されていない)、10 mg/kg の NTG(又はビヒクル(vehicle))の腹腔内投与前(ベースライン)及び腹腔内投与後 75 分及び 120 分に評価した。40 %シクロデキストリンの生理食塩水又は 40 %シクロデキストリンの生理食塩水中に溶解した 75 mg/kg 化合物 B を、NTG 投与に対して反対側に、最初の NTG 投与時点の 30 分前に、化合物 B の TPE に合うように、投与した。各フィラメントを、真ん中の VFF(0.4 g)から開始して、1 秒間隔で 5 回、各後肢の中心に対して垂直に適用した。応答がない場合、応答が確認されるまで一連の中の次の VFF を適用した。VFF に対する応答は、舐め行動が観察されたかどうかにかかわらず、適用した刺激に対して、試験している後肢をすぐさま引っ込めることとして記録した。引っ込める閾値は、両方の後肢の平均として定量した。前記実験者は、前記処置群に対してブラインド(blind)であった。
片頭痛に関するニトログリセリン(NTG)モデルにおける化合物 B の抗アロディニア効果。
NTG は後肢に機械的刺激アロディニアを誘発した。ディクソンのアップ−ダウン法(Dixon up-and-down method)により、フォン・フレイ・モノフィラメント(VFF; 8本のフィラメント、範囲0.008〜2 g、Stoelting Co)を使用して機械的刺激の閾値を測定した51。薬物試験のために、48 匹の未使用の C57Bl/6 雄マウス(20-30 g)を以下の群に無作為に分けた(一群あたり n = 12 のマウス):ビヒクル(vehicle)/シクロデキストリン、ビヒクル(vehicle)/化合物 B 75 mg/kg、NTG/シクロデキストリン、及び NTG/化合物 B 75 mg/kg。試験の前に、すべての動物を、1 週間、行動実験室で午前中、カップの様に手を丸めて(cupped hand technique)扱った52。各試験日に、最大 12 匹の動物を使用し、等しく 4 つの群に分けた。マウスを、4 つの室に分けられた透明なアクリル製ケージ(8.7 インチ × 8.7 インチ × 5 インチ)に閉じ込め、試験する足に完全にアクセスできるようにした隆起した金網プラットフォームの上に一匹ずつのせた。試験日及びその 1 日前に、マウスを 2 時間馴化させた。機械的刺激の閾値を、このモデルにおける NTG の時間 - ピーク効果(TPE)に合うように(データは示されていない)、10 mg/kg の NTG(又はビヒクル(vehicle))の腹腔内投与前(ベースライン)及び腹腔内投与後 75 分及び 120 分に評価した。40 %シクロデキストリンの生理食塩水又は 40 %シクロデキストリンの生理食塩水中に溶解した 75 mg/kg 化合物 B を、NTG 投与に対して反対側に、最初の NTG 投与時点の 30 分前に、化合物 B の TPE に合うように、投与した。各フィラメントを、真ん中の VFF(0.4 g)から開始して、1 秒間隔で 5 回、各後肢の中心に対して垂直に適用した。応答がない場合、応答が確認されるまで一連の中の次の VFF を適用した。VFF に対する応答は、舐め行動が観察されたかどうかにかかわらず、適用した刺激に対して、試験している後肢をすぐさま引っ込めることとして記録した。引っ込める閾値は、両方の後肢の平均として定量した。前記実験者は、前記処置群に対してブラインド(blind)であった。
図8に示すように、ベースライン閾値と比較して、NTG/化合物 B(紫線)及びビヒクル(vehicle)/化合物 B(赤線)群におけるアロディニア閾値に有意差はなかった。NTG/シクロ(緑線)及びビヒクル(vehicle)/シクロ(青線)群の両方は、NTG/ビヒクル(vehicle)注射後の 75 及び 120 分の時点で、機械的刺激へのアロディニア閾値が減少していた。これらの結果は、化合物 B は NTG 誘発の触覚アロディニアを誘発しないようにすることができ、ビヒクル(vehicle)とシクロデキストリンの混合物ではアロディニア効果が生じたことを示している。したがって、前記データは、化合物 B により例示されるクラスの化合物が、片頭痛に関連する疼痛等のように機械的刺激感受性ニューロンが介在する疼痛及び疾患を治療するための治療組成物として使用され得ることを示す。
本明細書に引用された、刊行物、特許出願及び特許等を含むすべての参考文献は、各参考文献が個々にかつ具体的に参照により組み入れられることが示され、及びその全体が本明細書に記載されているのと同じ程度に参照により本明細書に組み込まれる。
本発明を説明する文脈(特に以下の特許請求の範囲の文脈)における用語「a」、「an」及び「the」並びに同様の指示対象の使用は、本明細書に示されているか、又は文脈から明らかに矛盾しない限り、単数形及び複数形の両方を包含するものと解釈されるべきである。用語「含む(comprising)」、「有する(having)」、「含む(including)」及び「含む(containing)」は、別段の記載がない限り、制限のない用語(すなわち、「含む(including)が、これに限定されない」を意味する)と解釈されるべきである。本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書中に別段の指示がない限り、範囲内の各別個の値を個々に参照する簡略方法として役立つことを意図しており、各別個の値は、本明細書に個別に列挙されているかのように、本明細書に取り込まれる。本明細書中に記載される全ての方法は、本明細書中で他に指示されない限り、又は文脈によって明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施され得る。本明細書で提供される任意の及びすべての例、又は例示的な用語(例えば、「〜など(such as)」)の使用は、単に本発明をよりよく示すことを意図しており、別段の主張がなされない限り、本発明の範囲を限定するものではない。本明細書中のいかなる言葉も、本発明の実施に不可欠な請求する要素を示すものとして解釈されるべきである。
本発明の好ましい実施形態を本明細書に記載し、本発明を実施するために本願発明者らに知られている最良の形態を含む。これらの好ましい実施形態の変形形態は、前述の記載を読むことにより当業者には明らかになるであろう。本願発明者らは、当業者がこのような変形を必要に応じて使用するものと考えており、本願発明者らは、本発明が本明細書に具体的に記載されたものとは別の方法で実施されることも意図している。したがって、本発明は、適用法によって許容されるように、添付の特許請求の範囲に記載された主題のすべての改変及び均等物を含む。更に、本明細書中で他に指示されない限り、あるいは文脈によって明らかに矛盾しない限り、それらのすべての可能な変形における上記の要素の任意の組合せが本発明に包含される。
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Claims (11)
- 式(I):
式(I)
の、1 種類以上の Nav1.1 チャネル遮断薬又はそれらの塩、溶媒和若しくは立体異性体を含む組成物の使用であって、ここで、X は水素又はハロゲン、NH2、NO2、SO2、CN 若しくは C1-C6アルキル基のような 1 つ以上の電子求引基;Alk は C1-C3 アルキル;R1 は H, C1-C6 アルキルで、これは OH、NH2、アルキルアミノ、アミド、アシル、スルホニル、スルホニルアミノ及びシアノ基で置換されていても良く;R2 は C1-C6アルキル、アルケニル及びフェニルで、これは 1 つ以上の OH、NH2、アルキルアミノ、アミド、アシル、カルボキシル、メトキシル、スルホニル、及びシアノ基で置換されていてもよく、神経学的障害に罹患している被験体の有髄ニューロン上の機械的侵害受容器を阻害するための、1 種類以上の Nav1.1 チャネル遮断薬及び薬学的に許容される担体を含む有効量の組成物を、前記被験体に投与することを含む、使用。 - 式(I):
式(I)
の、1 種類以上の Nav1.1 チャネル遮断薬又はそれらの塩、溶媒和若しくは立体異性体を含む組成物の使用であって、ここで、X は水素又はハロゲン、NH2、NO2、SO2、CN 若しくは C1-C6 アルキル基のような 1 つ以上の電子求引基;Alk は C1-C3 アルキル;R1は H, C1-C6アルキルで、これは OH、NH2、アルキルアミノ、アミド、アシル、スルホニル、スルホニルアミノ及びシアノ基で置換されていても良く;R2 は C1-C6アルキル、アルケニル及びフェニルで、これは 1 つ以上の OH、NH2、アルキルアミノ、アミド、アシル、カルボキシル、メトキシル、スルホニル、及びシアノ基で置換されていてもよく、神経学的障害に罹患している被験体の機械的刺激による痛みを阻害するための、1 種類以上の Nav1.1 チャネル遮断薬及び薬学的に許容される担体を含む有効量の組成物を、前記被験体に投与することを含む、使用。 - 式(I):
式(I)
の、1 種類以上の Nav1.1 チャネル遮断薬又はそれらの塩、溶媒和若しくは立体異性体を含む組成物の使用であって、ここで、X は水素又はハロゲン、NH2、NO2、SO2、CN 若しくは C1-C6 アルキル基のような 1 つ以上の電子求引基;Alk は C1-C3アルキル;R1は H, C1-C6アルキルで、これは OH、NH2、アルキルアミノ、アミド、アシル、スルホニル、スルホニルアミノ及びシアノ基で置換されていても良く;R2 は C1-C6アルキル、アルケニル及びフェニルで、これは 1 つ以上の OH、NH2、アルキルアミノ、アミド、アシル、カルボキシル、メトキシル、スルホニル、及びシアノ基で置換されていてもよく、神経学的障害に罹患している被験体のアロディニアを阻害するための、1 種類以上の Nav1.1 チャネル遮断薬及び薬学的に許容される担体を含む有効量の組成物を、前記被験体に投与することを含む、使用。 - 式(I):
式(I)
の、1 種類以上の Nav1.1 チャネル遮断薬又はそれらの塩、溶媒和若しくは立体異性体を含む組成物の使用であって、ここで、X は水素又はハロゲン、NH2、NO2、SO2、CN 若しくは C1-C6 アルキル基のような 1 つ以上の電子求引基;Alk は C1-C3 アルキル;R1は H, C1-C6アルキルで、これは OH、NH2、アルキルアミノ、アミド、アシル、スルホニル、スルホニルアミノ及びシアノ基で置換されていても良く;R2 は C1-C6アルキル、アルケニル及びフェニルで、これは 1 つ以上の OH、NH2、アルキルアミノ、アミド、アシル、カルボキシル、メトキシル、スルホニル、及びシアノ基で置換されていてもよく、神経学的障害に罹患している被験体の非炎症性の痛みを阻害するための、1 種類以上の Nav1.1 チャネル遮断薬及び薬学的に許容される担体を含む有効量の組成物を、前記被験体に投与することを含む、使用。 - 式(I):
式(I)
の、1 種類以上の Nav1.1 チャネル遮断薬又はそれらの塩、溶媒和若しくは立体異性体を含む組成物の使用であって、ここで、X は水素又はハロゲン、NH2、NO2、SO2、CN 若しくは C1-C6 アルキル基のような 1 つ以上の電子求引基;Alk は C1-C3 アルキル;R1は H, C1-C6アルキルで、これは OH、NH2、アルキルアミノ、アミド、アシル、スルホニル、スルホニルアミノ及びシアノ基で置換されていても良く;R2 は C1-C6アルキル、アルケニル及びフェニルで、これは 1 つ以上の OH、NH2、アルキルアミノ、アミド、アシル、カルボキシル、メトキシル、スルホニル、及びシアノ基で置換されていてもよく、過敏性腸症候群(Irritable Bowel Syndrome (IBS))に罹患している被験体の内臓結腸求心性ニューロン(splanchnic colonic afferent neurons)を阻害するための、1 種類以上の Nav1.1 チャネル遮断薬及び薬学的に許容される担体を含む有効量の組成物を、前記被験体に投与することを含む、使用。 - 式(I):
式(I)
の、1 種類以上の Nav1.1 チャネル遮断薬又はそれらの塩、溶媒和若しくは立体異性体を含む組成物の使用であって、ここで、X は水素又はハロゲン、NH2、NO2、SO2、CN 若しくは C1-C6 アルキル基のような 1 つ以上の電子求引基;Alk は C1-C3 アルキル;R1は H, C1-C6アルキルで、これは OH、NH2、アルキルアミノ、アミド、アシル、スルホニル、スルホニルアミノ及びシアノ基で置換されていても良く;R2 は C1-C6アルキル、アルケニル及びフェニルで、これは 1 つ以上の OH、NH2、アルキルアミノ、アミド、アシル、カルボキシル、メトキシル、スルホニル、及びシアノ基で置換されていてもよく、IBS 又は IBS に伴う痛みに罹患している被験体の IBS を治療するための、1 種類以上の Nav1.1 チャネル遮断薬及び薬学的に許容される担体を含む有効量の組成物を、前記被験体に投与することを含む、使用。 - 式(I):
式(I)
の、1 種類以上の Nav1.1 チャネル遮断薬又はそれらの塩、溶媒和若しくは立体異性体を含む組成物の使用であって、ここで、X は水素又はハロゲン、NH2、NO2、SO2、CN 若しくは C1-C6 アルキル基のような 1 つ以上の電子求引基;Alk は C1-C3 アルキル;R1は H, C1-C6アルキルで、これは OH、NH2、アルキルアミノ、アミド、アシル、スルホニル、スルホニルアミノ及びシアノ基で置換されていても良く;R2 は C1-C6アルキル、アルケニル及びフェニルで、これは 1 つ以上の OH、NH2、アルキルアミノ、アミド、アシル、カルボキシル、メトキシル、スルホニル、及びシアノ基で置換されていてもよく、片頭痛又は片頭痛若しくは関連する疾患に伴う痛みに罹患している被験体の片頭痛を治療するための、1 種類以上の Nav1.1 チャネル遮断薬及び薬学的に許容される担体を含む有効量の組成物を、前記被験体に投与することを含む、使用。 - 請求項1から7の何れか一項に記載の方法の使用であって、式(I)の、1 種類以上の Nav1.1 チャネル遮断薬が、以下からなる群:
又はそれらの塩、溶媒和若しくは立体異性体、から選択される、請求項1から7の何れか一項に記載の方法の使用。 - 式(I)の、1 種類以上の Nav1.1 チャネル遮断薬が、有効量の 1 種類以上の更なる生物学的に活性な薬剤と併用して投与される、請求項1から7の何れか一項に記載の方法の使用。
- 前記 1 種類以上の更なる生物学的に活性な薬剤が、酵素、レセプター・アンタゴニスト若しくはアゴニスト、ホルモン及び抗体、自律神経薬、例えば、抗コリン作用薬、抗ムスカリン性抗コリン作用薬、麦角アルカロイド、副交感神経作用薬、コリン作動性副交感神経作用薬(cholinergic agonist parasympathomimetics)、コリンエステラーゼ阻害薬副交感神経作用薬(cholinesterase inhibitor parasympathomimetics)、交感神経遮断薬、α-遮断交感神経遮断薬(α-blocker sympatholytics)、交感神経遮断薬、交感神経刺激薬、アドレナリン作動性交感神経刺激薬(adrenergic agonist sympathomimetics intravenous anesthetics)、静脈麻酔薬、バルビツレート系静脈麻酔薬、ベンゾジアゼピン系静脈麻酔薬、オピエート・アゴニスト静脈麻酔薬(opiate agonist intravenous anesthetics)、骨格筋弛緩薬(skeletal muscle relaxants)、神経筋遮断薬骨格筋弛緩薬(neuromuscular blocker skeletal muscle relaxants)、リバース神経筋遮断薬骨格筋弛緩薬(reverse neuromuscular blocker skeletal muscle relaxants)、神経学的薬、抗痙攣薬、バルビツレート系抗痙攣薬、ベンゾジアゼピン系抗痙攣薬、抗片頭痛薬、抗パーキンソン病薬、抗めまい薬、オピエート・アゴニスト(opiate agonists)及びオピエート・アンタゴニスト(opiate antagonist)など;向精神薬、抗うつ薬、ヘテロ環抗うつ薬、モノアミン・オキシダーゼ阻害薬、選択的セロトニン再取り込み阻害薬、三環系抗うつ薬、抗そう薬、抗精神病薬、フェノチアジン系抗精神病薬、抗不安薬、鎮静薬並びに催眠薬、バルビツレート系鎮静薬、ベンゾジアゼピン系抗不安薬、鎮静薬、並びに催眠薬、並びに精神刺激薬を含む、請求項9の使用。
- 前記神経学的障害が:発熱性てんかん(febrile epilepsy)、GEFS +、ドラベット症候群(Dravet syndrome)(乳児期の重症のミオクローヌスてんかん (severe myclonic epilepsy of infancy)又は SMEI としても知られている)、境界型 SMEI(SMEB)、ウェスト症候群(West syndrome)(乳児痙攣としても知られている)、ドゥーズ症候群(Doose syndrome)(ミオクロニー脱力発作を伴うてんかん(myoclonic astatic epilepsy)としても知られている)、ミオクロニーを伴わない乳児難治てんかん(intractable childhood epilepsy with generalized tonic-clonic seizures)(ICEGTC)、パナイトポーロス症候群(Panayiotopoulos syndrome)、家族性自閉症、ラスムッセン脳炎(Rasmussens's encephalitis)及びレノックス−ガストー症候群(Lennox-Gastaut syndrome)、アルツハイマー病、FHM3を含む片頭痛、疾患(過敏性腸症候群、ニューロパチーと関連した静的、機械的又は動的アロディニア、複合性局所疼痛症候群(complex regional pain syndrome)、帯状疱疹後神経痛、線維筋痛症、脊髄損傷、月経痛、他の関連疾患)での機械的刺激感受性神経線維に関連する急性及び/又は慢性疼痛の治療、からなる群から選択される、請求項1から7の何れか一項に記載の方法の使用。
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