JP2019509758A - グルタチオン産生のための最適化された宿主細胞 - Google Patents
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Abstract
本開示は、グルタチオン(GSH)の産生および蓄積のための遺伝子修飾された宿主細胞に関する。遺伝子修飾された宿主細胞は、活性が増加した変異型Cys4pの発現を可能にし得る。追加または代替として、遺伝子修飾された宿主細胞は、核から細胞質への転位が低下している変異型Yap1pを発現し得る。さらに、追加または代替として、遺伝子修飾された宿主細胞は、異種スレオニンアルドラーゼ(Gly1p)を発現し得る。【選択図】図3
Description
関連出願および文書への相互参照
本出願は、2016年3月31日に出願された米国仮特許出願第62/315,796号の優先権を主張する。電子書式の配列表が同時に提出されている。優先出願および配列表の内容は、その全体が本明細書に含まれる。
本出願は、2016年3月31日に出願された米国仮特許出願第62/315,796号の優先権を主張する。電子書式の配列表が同時に提出されている。優先出願および配列表の内容は、その全体が本明細書に含まれる。
本開示は、グルタチオンを産生および蓄積することができる遺伝子修飾された宿主細胞(好ましくは、遺伝子修飾された酵母宿主細胞)およびそれを用いるプロセスに関する。遺伝子修飾された宿主細胞は、増大した生物学的活性を有する突然変異型シスタチオニンβ−シンターゼタンパク質(Cys4p)、核から細胞質への転位能力が制限された突然変異型Yap1pおよび/または異種スレオニンアルドラーゼ(Gly1p)を発現する。
グルタチオン(GSH、L−γ−グルタミル−L−システイニルグリシン)は、いくつかの重要な生理学的プロセスにおいて役割を果たすユビキタスな非タンパク質チオールトリペプチドであり、医薬品、化粧品および食品添加剤産業において使用が増大している。この強力な酸化防止剤は、ベーキング(例えば、生地の緩和)、オノロジーおよび醸造(芳香成分安定剤)または酵母抽出物中の香味料エンハンサー(「コクミ」味)として高い関心がある。GSHの高い需要のために、生産の効率を高めることは商業的に重要である。サッカロミセス・セレビシアエは、「一般に安全と認められる(Generally Regarded As Safe)」(GRAS)であり、低分泌性であり、安価な基質上で高細胞密度に比較的容易に増殖するため、GSH微生物合成に使用することができる。
細胞内で、グルタチオンは、主に還元型(GSH)および酸化型(GSSG)の形態で存在し、2つの連続するATP依存性反応で3つの前駆体アミノ酸(グルタミン酸、システインおよびグリシン)から合成される。まず、L−γ−グルタミルシステイン合成酵素(Gsh1p)はシステインをγ−グルタミルシステインに変換し、その後、GSH合成酵素(Gsh2p)によってグルタチオンに変換される。GSH生合成は、3つの異なるレベル:転写、翻訳後および基質利用可能性で厳密に制御される。
グルタチオン(GSH)の生合成には、システイン、グルタミン酸およびグリシンの3つのアミノ酸が必要である。酵母の増殖中、システインの添加は、GSHおよび中間体γ−グルタミルシステイン(γ−GC)の両方の産生の増加をもたらす。システインとグリシンを同時に供給すると、(γ−GC)の一部のGSHへの変換をもたらす。
酵母においてはグリシンの合成に至る主な経路が2つ存在する。1つの経路においては、GLY1によってコードされるL−スレオニンアルドラーゼは、L−スレオニン(解糖中間体であるオキサロ酢酸から産生される)からグリシンを産生する。グリシンはまた、SHM1(ミトコンドリア)およびSHM2(細胞質ゾル)によってコードされる2つのヒドロキシメチルトランスフェラーゼを介して、L−セリンから形成され得る。
遺伝子操作された酵母株を用いたGSHの微生物生産は、増加する産業需要を満たす可能性がある。従来の方法では、細胞内のGSH含有量を天然レベルと比較してわずか2倍に増加させることができ、したがって、GSH濃度をさらに増加させることにより、これらの生成物の効率をかなり向上させることができる。S.セレビシアエにおけるGSHの濃度範囲は、乾燥細胞重量の0.1〜1%である。これは、使用される株、成長条件およびGSH測定方法によって様々である。
増大した量の細胞内GSH(好ましくはほとんどが還元型である)を産生および蓄積し、細胞内γ−グルタミルシステインまたは遊離システインの量を親株のその対応する量と比較して減少させることができる遺伝子修飾された宿主細胞を提供することが非常に望ましい。いくつかの実施形態において、遺伝子修飾された宿主細胞を用いたGSH産生段階(例えば、発酵)の間のシステインまたはグリシンの補充を低減または排除することが望ましいであろう。いくつかの実施形態において、遺伝子修飾された宿主細胞を用いてGSHおよびGSHを含む調製物(生、半精製および精製)を作製するためのプロセスもまた提供されることが望ましい。
本開示は、遺伝子修飾された宿主細胞(好ましくは、遺伝子修飾された宿主細胞)およびGSHの産生のためのその使用に関する。遺伝子修飾された宿主細胞は、遊離細胞内システイン、γ−グルタミルシステイン(g−GCまたはγ−GC)および真のGSHを含む、より多くの全チオール(全GHSおよび見かけのGSHとしても知られている)を合成する。さらに、遺伝子修飾された株は、対応する野生株と比較して真のGSHの割合を高く蓄積し、g−GCはごくわずかしか蓄積しない。
第1の態様によれば、本開示は、グルタチオンを製造するプロセスを提供する。概して、本プロセスは、遺伝子修飾された宿主細胞で基質を発酵させてグルタチオンを含む発酵混合物を得るステップを含む。この遺伝子修飾された宿主細胞は、(i)野生型Cys4pと比較して生物学的活性が増加した変異型シスタチオニンβ−シンターゼタンパク質(Cys4p)をコードする第1の異種核酸分子、(ii)野生型Yap1pと比較して核から細胞質に転位する能力が低下した変異型Yap1pをコードする第2の異種核酸分子および/または(iii)スレオニンアルドラーゼタンパク質(Gly1p)をコードする第3の異種核酸分子を有する。一実施形態において、遺伝子修飾された宿主細胞は、第1の異種核酸分子、および第2の異種核酸分子または第3の異種核酸分子のうちの少なくとも1つを有する。一実施形態において、変異型Cys4pは野生型Cys4pの断片である。例えば、変異型Cys4pは、野生型Cys4pから1つまたは複数のC末端アミノ酸残基を欠失させることによって得ることができる。さらに別の例において、変異型Cys4pは、野生型Cys4pから制御ドメインを欠失させることによって得ることができる。一実施形態において、変異型Cys4pは配列番号2のアミノ酸配列からなる。さらに別の実施形態において、遺伝子修飾された宿主細胞において、野生型Cys4pをコードする天然の核酸分子の少なくとも1つのコピーが第1の異種核酸分子によって置換される。さらに別の実施形態において、遺伝子修飾された宿主細胞は、第1の異種核酸分子の少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つまたは少なくとも4つのコピーを含む。さらなる実施形態において、変異型Yap1pは、遺伝子修飾された宿主細胞の核内に実質的に位置する。さらに別の実施形態において、変異型Yap1pは、野生型Yap1pと比較した場合、少なくとも1つのアミノ酸置換を有する。例えば、少なくとも1つのアミノ酸置換は、野生型Yap1pのシステインリッチドメインに対応するドメインに位置することができる。さらに別の例において、変異型Yap1pは、野生型Yap1pのシステインリッチドメインに対応するドメイン中のシステイン残基を親水性アミノ酸残基(例えば、アスパラギン酸残基など)で置換することによって得ることができる。さらに別の例において、変異型Yap1pの置換システイン残基は、配列番号3の残基626に対応する位置に位置する。さらに別の実施形態において、変異型Yap1pは配列番号4または配列番号5のアミノ酸配列を含む。一実施形態において、遺伝子修飾された宿主細胞において、野生型Yap1pをコードする天然の核酸分子の少なくとも1つのコピーが第2の異種核酸分子によって置換される。別の実施形態において、遺伝子修飾された宿主細胞は、第2の異種核酸分子の少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つまたは少なくとも4つのコピーを含む。さらなる実施形態において、遺伝子修飾された宿主細胞は、第3の異種核酸分子の少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つまたは少なくとも4つのコピーを含む。さらに別の実施形態において、遺伝子修飾された宿主細胞は、第1の異種核酸分子および第2の異種核酸分子;第1の異種核酸分子および第3の異種核酸分子;第2の異種核酸分子および第3の異種核酸分子;または第1の異種核酸分子、第2の異種核酸分子および第3の異種核酸分子を含む。一実施形態において、本プロセスは、発酵混合物を酵母抽出物または酵母加水分解物に加工するステップをさらに含む。さらに別の実施形態において、本プロセスは、発酵混合物からの遺伝子修飾された宿主細胞を精製または不活性化するステップをさらに含む。なお別の実施形態において、このプロセスは、発酵混合物からグルタチオンを精製するステップをさらに含む。別の実施形態において、遺伝子修飾された宿主細胞は、遺伝子修飾された酵母宿主細胞である。例えば、遺伝子修飾された酵母宿主細胞はサッカロミセス(Saccharomyces)属に由来することができる。別の例において、遺伝子修飾された酵母宿主細胞は、サッカロミセス・セレビシアエ(Saccharomyces cerevisiae)種に由来する。
第2の態様によれば、本開示は、本明細書に記載のプロセスによって得ることが可能または得られる発酵基質、酵母抽出物、酵母加水分解物、精製された遺伝子修飾された宿主細胞および/または不活性化遺伝子修飾された宿主細胞を提供する。
第3の態様によれば、本開示は、遺伝子修飾された宿主細胞におけるグルタチオン蓄積を増加させるためのプロセスに関する。概して、このプロセスは、親酵母宿主細胞中に第1の異種核酸分子、第2の異種核酸分子および/または第3の異種核酸分子を導入して遺伝子修飾された宿主細胞を生成するステップを含む。このプロセスにおいて、第1の異種核酸分子は、野生型Cys4pと比較して生物学的活性が増加した変異型シスタチオニンβ−シンターゼタンパク質(Cys4p)をコードする。さらに、第2の異種核酸分子は、野生型Yap1pと比較した場合、細胞質内に輸送される能力が限定された変異型Yap1pをコードする。さらに、第3の異種核酸分子は、異種スレオニンアルドラーゼ(Gly1p)をコードする。一実施形態において、遺伝子修飾された宿主細胞は、第1の異種核酸分子、および第2の異種核酸分子または第3の異種核酸分子のうちの少なくとも1つを有する。一実施形態において、変異型Cys4pは野生型Cys4pの断片である。例えば、変異型Cys4pは、野生型Cys4pから1つまたは複数のC末端アミノ酸残基を欠失させることによって得ることができる。さらに別の例において、変異型Cys4pは、野生型Cys4pから制御ドメインを欠失させることによって得ることができる。一実施形態において、変異型Cys4pは、配列番号2のアミノ酸配列からなる。さらに別の実施形態において、遺伝子修飾された宿主細胞において、野生型Cys4pをコードする天然の核酸分子の少なくとも1つのコピーが第1の異種核酸分子によって置換される。なお別の実施形態において、遺伝子修飾された宿主細胞は、第1の異種核酸分子の少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つまたは少なくとも4つのコピーを含む。さらなる実施形態において、変異型Yap1pは、遺伝子修飾された宿主細胞の核内に実質的に位置する。さらに別の実施形態において、変異型Yap1pは、野生型Yap1pと比較した場合、少なくとも1つのアミノ酸置換を有する。例えば、少なくとも1つのアミノ酸置換は、野生型Yap1pのシステインリッチドメインに対応するドメインに位置することができる。なお別の例では、変異型Yap1pは、野生型Yap1pのシステインリッチドメインに対応するドメイン中のシステイン残基を親水性アミノ酸残基(例えば、アスパラギン酸残基など)で置換することによって得ることができる。さらに別の例では、変異型Yap1pの置換されたシステイン残基は、配列番号3の残基626に対応する場所に位置する。さらに別の例では、変異型Yap1pは、配列番号4または配列番号5のアミノ酸配列を含む。一実施形態において、遺伝子修飾された宿主細胞において、野生型Yap1pをコードする天然の核酸分子の少なくとも1つのコピーが第2の異種核酸分子によって置換される。別の実施形態において、遺伝子修飾された宿主細胞は、第2の異種核酸分子の少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つまたは少なくとも4つのコピーを含む。なお別の実施形態において、遺伝子修飾された宿主細胞は、第3の異種核酸分子の少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つまたは少なくとも4つのコピーを含む。別の実施形態において、遺伝子修飾された宿主細胞は、遺伝子修飾された酵母宿主細胞である。例えば、遺伝子修飾された酵母宿主細胞はサッカロミセス属に由来することができる。別の例において、遺伝子修飾された酵母宿主細胞は、サッカロミセス・セレビシアエ種に由来する。
第4の態様によれば、本開示は、本明細書に記載のプロセスによって得られる遺伝子修飾された宿主細胞に関する。
第5の態様によれば、本開示は、(i)野生型Cys4pと比較した場合、生物学的活性が上昇した変異型シスタチオニンβ−シンターゼタンパク質(Cys4p)をコードする第1の異種核酸分子;(ii)野生型Yap1pと比較した場合、核から細胞質に転位する能力が低下した変異型Yap1pをコードする第2の異種核酸分子;および/または(iii)スレオニンアルドラーゼ(Gly1p)をコードする第3の異種核酸分子の少なくとも2つを含む遺伝子修飾された宿主細胞に関する。一実施形態において、遺伝子修飾された宿主細胞は、第1の異種核酸分子、および第2の異種核酸分子または第3の異種核酸分子のうちの少なくとも1つを有する。一実施形態において、変異型Cys4pは野生型Cys4pの断片である。例えば、変異型Cys4pは、野生型Cys4pから1つまたは複数のC末端アミノ酸残基を欠失させることによって得ることができる。さらに別の例において、変異型Cys4pは、野生型Cys4pから制御ドメインを欠失させることによって得ることができる。一実施形態において、変異型Cys4pは、配列番号2のアミノ酸配列からなる。さらに別の実施形態において、遺伝子修飾された宿主細胞において、野生型Cys4pをコードする天然の核酸分子の少なくとも1つのコピーが第1の異種核酸分子によって置換される。なお別の実施形態において、遺伝子修飾された宿主細胞は、第1の異種核酸分子の少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つまたは少なくとも4つのコピーを含む。さらなる実施形態において、変異型Yap1pは、遺伝子修飾された宿主細胞の核内に実質的に位置する。さらに別の実施形態において、変異Yap1pは、野生型Yap1pと比較した場合、少なくとも1つのアミノ酸置換を有する。例えば、少なくとも1つのアミノ酸置換は、野生型Yap1pのシステインリッチドメインに対応するドメインに位置することができる。なお別の例では、変異型Yap1pは、野生型Yap1pのシステインリッチドメインに対応するドメイン中のシステイン残基を親水性アミノ酸残基(例えば、アスパラギン酸残基など)で置換することによって得ることができる。さらに別の例では、変異型Yap1pの置換されたシステイン残基は、配列番号3の残基626に対応する場所に位置する。さらに別の例では、変異型Yap1pは、配列番号4または配列番号5のアミノ酸配列を含む。一実施形態において、遺伝子修飾された宿主細胞において、野生型Yap1pをコードする天然の核酸分子の少なくとも1つのコピーが第2の異種核酸分子によって置換される。別の実施形態において、遺伝子修飾された宿主細胞は、第2の異種核酸分子の少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つまたは少なくとも4つのコピーを含む。なお別の実施形態において、遺伝子修飾された宿主細胞は、第3の異種核酸分子の少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つまたは少なくとも4つのコピーを含む。別の実施形態において、遺伝子修飾された宿主細胞は、遺伝子修飾された酵母宿主細胞である。例えば、遺伝子修飾された酵母宿主細胞はサッカロミセス属に由来することができる。別の例において、遺伝子修飾された酵母宿主細胞は、サッカロミセス・セレビシアエ種に由来する。
第5の態様によれば、本開示は、(i)野生型Cys4pと比較した場合、生物学的活性が上昇した変異型シスタチオニンβ−シンターゼタンパク質(Cys4p)をコードする第1の異種核酸分子;(ii)野生型Yap1pと比較した場合、核から細胞質に転位する能力が低下した変異型Yap1pをコードする第2の異種核酸分子;および/または(iii)スレオニンアルドラーゼ(Gly1p)をコードする第3の異種核酸分子の少なくとも2つを含む遺伝子修飾された宿主細胞に関する。一実施形態において、遺伝子修飾された宿主細胞は、第1の異種核酸分子、および第2の異種核酸分子または第3の異種核酸分子のうちの少なくとも1つを有する。一実施形態において、変異型Cys4pは野生型Cys4pの断片である。例えば、変異型Cys4pは、野生型Cys4pから1つまたは複数のC末端アミノ酸残基を欠失させることによって得ることができる。さらに別の例において、変異型Cys4pは、野生型Cys4pから制御ドメインを欠失させることによって得ることができる。一実施形態において、変異型Cys4pは、配列番号2のアミノ酸配列からなる。さらに別の実施形態において、遺伝子修飾された宿主細胞において、野生型Cys4pをコードする天然の核酸分子の少なくとも1つのコピーが第1の異種核酸分子によって置換される。なお別の実施形態において、遺伝子修飾された宿主細胞は、第1の異種核酸分子の少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つまたは少なくとも4つのコピーを含む。さらなる実施形態において、変異型Yap1pは、遺伝子修飾された宿主細胞の核内に実質的に位置する。さらに別の実施形態において、変異Yap1pは、野生型Yap1pと比較した場合、少なくとも1つのアミノ酸置換を有する。例えば、少なくとも1つのアミノ酸置換は、野生型Yap1pのシステインリッチドメインに対応するドメインに位置することができる。なお別の例では、変異型Yap1pは、野生型Yap1pのシステインリッチドメインに対応するドメイン中のシステイン残基を親水性アミノ酸残基(例えば、アスパラギン酸残基など)で置換することによって得ることができる。さらに別の例では、変異型Yap1pの置換されたシステイン残基は、配列番号3の残基626に対応する場所に位置する。さらに別の例では、変異型Yap1pは、配列番号4または配列番号5のアミノ酸配列を含む。一実施形態において、遺伝子修飾された宿主細胞において、野生型Yap1pをコードする天然の核酸分子の少なくとも1つのコピーが第2の異種核酸分子によって置換される。別の実施形態において、遺伝子修飾された宿主細胞は、第2の異種核酸分子の少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つまたは少なくとも4つのコピーを含む。なお別の実施形態において、遺伝子修飾された宿主細胞は、第3の異種核酸分子の少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つまたは少なくとも4つのコピーを含む。別の実施形態において、遺伝子修飾された宿主細胞は、遺伝子修飾された酵母宿主細胞である。例えば、遺伝子修飾された酵母宿主細胞はサッカロミセス属に由来することができる。別の例において、遺伝子修飾された酵母宿主細胞は、サッカロミセス・セレビシアエ種に由来する。
本発明の性質を一般的に記載したので、ここで添付の図面を参照して、その好ましい実施形態を例示として示す。
本開示は、発酵の間にグルタチオンを産生するためのプロセスにおける遺伝子修飾された宿主細胞、およびそれらの使用に関する。本開示はまた、特に、発酵の間にグルタチオンを産生するためのプロセスにおける遺伝子修飾された酵母宿主細胞、およびそれらの使用に関する。いくつかの実施形態において、遺伝子修飾された宿主細胞の使用により、総チオールの実質的な増加、特にグルタチオンの産生および蓄積が可能となる。特定の状況下で、遺伝子修飾された宿主細胞の総チオール含量は、対応する野生型(すなわち、親または非遺伝子修飾された)細胞と比較して、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%またはそれ以上増加する。他の状況において、遺伝子修飾された宿主細胞は、対応する野生型(すなわち、親または非遺伝子修飾された宿主)細胞と比較して、そのγ−L−グルタミル−L−システイン副産物よりも高い割合の真のGSHを生成する。いくつかの状況において、遺伝子修飾された宿主細胞は、対応する野生型(すなわち、親または非遺伝子修飾された宿主)細胞と比較した場合、より少ない細胞内遊離システインを生成する。さらに他の状況において、遺伝子修飾された宿主細胞は、対応する野生型(すなわち、親または非遺伝子修飾された)細胞よりも、同じGSH含量を達成するための発酵の間、より少ない補充(例えば、より少ないシステイン補充および/または少ないグリシン補充)を要求する。
遺伝子修飾された宿主細胞
本開示は、対応する親または非遺伝子修飾された宿主細胞よりも多くのGSHを産生および蓄積することができる遺伝子修飾された宿主細胞を提供する。遺伝子修飾された宿主細胞は、遺伝子修飾された酵母宿主細胞であり得る。本開示の文脈において、遺伝子修飾された宿主細胞は、変異したシスタチオニンβ−シンターゼタンパク質Cys4pの発現を可能にする少なくとも1つの遺伝子修飾、変異型Yap1pの発現を可能にする第2の遺伝子修飾および/または異種スレオニンアルドラーゼ(Gly1p)の発現を可能にする第3の遺伝子修飾を有する。いくつかの実施形態において、遺伝子修飾された宿主細胞は、例えば、異種ガンマグルタミルシステインシンテターゼ1タンパク質(Gsh1p)および/または異種グルタチオンシンテターゼ2タンパク質(Gsh2p)を発現させるためのさらなる遺伝子修飾されたもまた含む。
遺伝子修飾された宿主細胞
本開示は、対応する親または非遺伝子修飾された宿主細胞よりも多くのGSHを産生および蓄積することができる遺伝子修飾された宿主細胞を提供する。遺伝子修飾された宿主細胞は、遺伝子修飾された酵母宿主細胞であり得る。本開示の文脈において、遺伝子修飾された宿主細胞は、変異したシスタチオニンβ−シンターゼタンパク質Cys4pの発現を可能にする少なくとも1つの遺伝子修飾、変異型Yap1pの発現を可能にする第2の遺伝子修飾および/または異種スレオニンアルドラーゼ(Gly1p)の発現を可能にする第3の遺伝子修飾を有する。いくつかの実施形態において、遺伝子修飾された宿主細胞は、例えば、異種ガンマグルタミルシステインシンテターゼ1タンパク質(Gsh1p)および/または異種グルタチオンシンテターゼ2タンパク質(Gsh2p)を発現させるためのさらなる遺伝子修飾されたもまた含む。
遺伝子修飾された宿主細胞は、酵母宿主細胞であり得る。本明細書に記載されるように遺伝子修飾され得る適切な酵母宿主細胞は、例えば、アルキスラ(Arxula)、ブレッタノミセス(Brettanomyces)、カンジダ(Candida)、クリプトコックス(Cryptococcus)、デバリオミセス(Debaryomyces)、クロエッケラ(Kloeckera)、クルイベロミセス(Kluyveromyces)、ハンセニアスポラ(Hanseniaspora)、ハンセヌラ(Hansenula)、メトシュニコウィア(Metschnikowia)、ピキア(Pichia)、ファフィア(Phaffia)、サッカロミセス(Saccharomyces)、スケフェルソミセス(Scheffersomyces)、シゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)、シュワンニオミセス(Schwanniomyces)、スポロボロミセス(Sporobolomyces)、スタルメレラ(Starmerella)、テトラピシスポラ(Tetrapisispora)、ヤロウィア(Yarrowia)またはチゴサッカロミセス(Zygosaccharomyces)属由来であり得る。いくつかの実施形態において、酵母宿主細胞は、油性酵母細胞であり得る。例えば、油性酵母宿主細胞は、ブラケスレア(Blakeslea)、カンジダ、クリプトコックス、クンニンガメラ(Cunninghamella)、リポミセス(Lipomyces)、モルチエレラ(Mortierella)、ムコル(Mucor)、フィコミセス(Phycomyces)、ピチウム(Pythium)、ロドスポリズム(Rhodosporidum)、ロドトルラ(Rhodotorula)、トリコスポロン(Trichosporon)またはヤロウィア属由来であり得る。いくつかの代替的な実施形態において、酵母宿主細胞は、油性微細藻類宿主細胞(例えば、スラウストキトリウム(Thraustochytrium)属またはシゾキトリウム(Schizochytrium)属由来)であり得る。適切な酵母種としては、例えば、アルキスラ・アデニニボランス(Arxula adeninivorans)、ブレッタノミセス・ブルキセレンシス(Brettanomyces bruxellensis)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、カンジダ・コリコサ(Candida coliculosa)/トルラスポラ・デルブルエキイ、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、カンジダ・ユティリス(Candida utilis)(サイバーリンドネラ・ジャディニイ)、クリプトコックス・スキンネリ(Cryptococcus skinneri)、デバリオミセス種(Debaryomyces sp.)、デバリオミセス・ハンセニイ(Debaryomyces hansenii)、デバリオミセス・ポリモルフス(Debaryomyces polymorphus)、ハンセニアスポラ・ビネア(Hanseniaspora vinea)、ハンセニアスポラ・オッシデンタリス(Hanseniaspora occidentalis)、ハンセニアスポラ・ウバルム(Hanseniaspora uvarum)、ハンセヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)、クルイベロミセス・ラクティス、クルイベロミセス・マルキシアヌス var ドロソフィラルム(Kluyveromyces marxianus var drosophilarum)、クルイベロミセス・テルモトレランス(Kluyveromyces thermotolerans)、クルイベロミセス・ウィッケラミイ(Kluyveromyces wickerhamii)、クルイベロミセス・フラギリス(Kluyveromyces fragilis)、メトスクニコウィア・プルケリマ(カンジダ・プルケリマ)(Metschnikowia pulcherrima(Candida pulcherrima))、メトスクニコウィア・フルクチコラ(Metschnikowia fructicola)、ファフィア・ロドチマ(Phaffia rhodozyma)、ピキア・アノマラ(Pichia anomala)、ピキア・クドリアブゼビイ(Pichia kudriavzevii)、ピキア・オッシデンタリス(Pichia occidentalis)、ピキア・パストリス、サッカロミセス・ブルガリ(Saccharomyces bulgari)、サッカロミセス・セレビシアエ、サッカロミセス・ジアスタチクス(Saccharomyces diastaticus)、サッカロミセス・エキシグオス(Saccharomyces exiguous)、サッカロミセス・ウバルム(Saccharomyces uvarum)、シェフェルソミセス・スチピチス(Scheffersomyces stipitis)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizzosaccharomyces pombe)、シュワンニオミセス・オッシデンタリス(Schwanniomyces occidentalis)、スポロボロミセス(Sporobolomyces)、スタルメレラ・ボンビコラ(Starmerella bombicolla)、テトラピシスポラ・ファフィイ(Tetrapisispora phaffii)、ヤロウィア・リポリチカ(Yarrowia lipolytica)、チゴサッカロミセス・バイリイまたはチゴサッカロミセス・ロウキシイ(Zygosaccharomyces rouxii)が挙げられる。1つの特定の実施形態において、遺伝子修飾された酵母宿主細胞はサッカロミセス属由来であり、さらなる実施形態においては、サッカロミセス・セレビシアエ種由来である。
遺伝子修飾された宿主細胞は細菌であり得る。本明細書に記載のように遺伝子修飾され得る適切な細菌宿主細胞は、グラム陽性細菌またはグラム陰性細菌であり得る。遺伝子修飾された細菌宿主細胞は、アシドバクテリア(Acidobacteria)、アクチノバクテリア(Actinobacteria)、アキフィカ(Aquificae)、バクテロイデス(Bacteroidetes)、クラミジア(Chlamydiae)、コロロビ(Cholorobi)、クロロフレキシ(Chloroflexi)、クリシオゲネテス(Chrysiogenetes)、シアノバクテリア(Cyanobacteria)、デフェリバクテレス(Deferribacteres)、デイノコックス−テルムス(Deinococcus−Thermus)、ジクチオグロミ(Dictyoglomi)、フィブロバクテレス(Fibrobacteres)、フィルミクテス(Firmicutes)、フソバクテリア(Fusobacteria)、ゲンマチモナデテス(Gemmatimonadetes)、レンチスファエラ(Lentisphaerae)、ニトロスピラ(Nitrospirae)、プランクトミセテス(Planctomycetes)、プロテオバクテリア(Proteobacteria)、スピロヘータ(Spirochaetes)、サーモデススルフォバクテリア(Thermodesulfobacteria)、サーモトガエ(Thermotogae)またはベルコミクロビア(Verrucomicrobia)門由来であり得る。1つの特定の実施形態において、遺伝子修飾された細菌宿主細胞は、大腸菌(Escherichia coli)である。
上に示したように、遺伝子修飾された宿主細胞は、1つまたは複数の異種タンパク質(例えば、変異型Cys4p、変異型Yap1p、Gly1p、Gsh1pおよび/またはGsh2p)をコードする1つまたは複数の異種核酸分子を含む。「異種」という用語は、核酸分子(プロモーターまたはコーディング配列など)またはタンパク質に関して使用される場合、宿主生物または細胞において天然に見出されない核酸分子またはタンパク質を指す。「異種」はまた、供給源の生物から除去または増幅され、続いて、対応する天然の遺伝子とは異なる形態、例えば、その生物のゲノムの天然の位置ではないように、供給源の生物に再導入される天然のコーディング領域またはその一部を含む。異種核酸分子は、宿主細胞に意図的に導入される。「異種」核酸分子またはタンパク質は、任意の供給源(例えば、真核生物、原核生物、ウイルスなど)に由来し得る。一実施形態において、異種核酸分子は、真核生物(例えば、遺伝子修飾された宿主細胞と同じ属からまたは同じ種からの酵母のような)に由来し得る。本明細書で使用される「異種」という用語は、内因性供給源以外の供給源に由来する要素(核酸またはタンパク質)のことも指す。したがって、例えば、異種の要素は、宿主細胞の異なる株から、または異なる分類学的グループ(例えば、異なる界、門、綱、目、科、属もしくは種、またはこれらの分類の1つの中の任意の下位群)の生物から由来してもよい。「異種」という用語はまた、本明細書において「外因性」という用語と同義に使用される。
(i)変異型シスタチオニンβ−シンターゼ(Cys4p)
システインはGSH産生の律速段階にあることが知られている。シスタチオニンβ−シンターゼタンパク質(本明細書においてはCys4pとも呼ばれる)は、ホモシステインからのシステイン生合成における最初の関与段階を触媒する。GSH産生の増加を示す酵母株は、Cys4pをコードする転写物を過剰発現することが示された(Nisamedtinovら、2010、Nisamedtinovら、2011およびOrumetsら、2012)。Cys4pの過剰発現はサイバーリンドネラ・ジャディニイ(以前のカンジダ・ユティリス)(Suzukiら、2011)、ピキア・パストリス(CN101220338AおよびCN101245363A参照)およびサッカロミセス・セレビシアエ(Suzukiら、2011)において、GSH含量を増加させることが示されている。しかしながら、本出願で示されるように、酵母宿主細胞中の野生型Cys4pの過剰発現は、総チオールにおいて中程度の増加しかもたらさない(例えば、図1の株SIL005について得られた結果を参照のこと)。
(i)変異型シスタチオニンβ−シンターゼ(Cys4p)
システインはGSH産生の律速段階にあることが知られている。シスタチオニンβ−シンターゼタンパク質(本明細書においてはCys4pとも呼ばれる)は、ホモシステインからのシステイン生合成における最初の関与段階を触媒する。GSH産生の増加を示す酵母株は、Cys4pをコードする転写物を過剰発現することが示された(Nisamedtinovら、2010、Nisamedtinovら、2011およびOrumetsら、2012)。Cys4pの過剰発現はサイバーリンドネラ・ジャディニイ(以前のカンジダ・ユティリス)(Suzukiら、2011)、ピキア・パストリス(CN101220338AおよびCN101245363A参照)およびサッカロミセス・セレビシアエ(Suzukiら、2011)において、GSH含量を増加させることが示されている。しかしながら、本出願で示されるように、酵母宿主細胞中の野生型Cys4pの過剰発現は、総チオールにおいて中程度の増加しかもたらさない(例えば、図1の株SIL005について得られた結果を参照のこと)。
CYS4、CYS4.353の機能獲得対立遺伝子が、その制御ドメインを除外したシスタチオニンβ−シンターゼをコードし、より高い比活性を生じることになり(Jheeら、2000)、S.セレビシアエにおいて細胞増殖速度の加速および細胞分裂をもたらす(Blankら、2009)ことが報告されている。驚くべきことに、本出願で示されるように、遺伝子CYS4.353が遺伝子修飾された酵母宿主細胞において発現される場合、総チオールの激しい増加が観察される(例えば、図1の株SIL010について得られた結果を参照)。
本開示の遺伝子修飾された宿主細胞(および特に本開示の遺伝子修飾された酵母宿主細胞)は、野生型Cys4pと比較して生物学的活性が増加した変異型Cys4pをコードする第1の異種核酸分子を含み得る。したがって、このような遺伝子修飾された宿主細胞は、変異型Cys4pを発現することができ、適切な条件に置かれた場合、遺伝子修飾された宿主細胞は、発酵中に総チオール(およびGSH産生)を最終的に増加させる変異型Cys4pを発現する。第1の異種核酸分子は、遺伝子修飾された宿主細胞中の1つまたは複数のコピーに(1つまたは複数の中立的組込み部位で)組み込まれ得る。第1の異種核酸分子は、天然のCys4pをコードする天然の核酸分子の1つまたは複数のコピーを置換してもよい。一実施形態において、遺伝子修飾された宿主細胞(および特に遺伝子修飾された酵母宿主細胞)は、第1の異種核酸分子のコピーが組み込まれた1つまたは複数のコピーを(1つまたは複数の中立的組込み部位で)有することができ、天然のCys4pをコードする天然の核酸分子の少なくとも1つのコピー(または両方のコピー)が、第1の異種核酸によって置換されている。
遺伝子修飾された宿主細胞において発現される場合、変異型Cys4pは、野生型Cys4pよりも生物学的活性が増加している。本開示の文脈において、野生型Cys4pは、シスタチオニンβ−シンターゼ活性を有するタンパク質、すなわちホモシステインをシスタチオニンに酵素的に変換することができるタンパク質を指す。野生型または天然のCys4pは、酵母ゲノムによってコードされ、触媒ドメインおよび制御ドメインの両方を含む。野生型Cys4pは、必須の活性部位残基スレオニン−81、セリン−82、スレオニン−85、グルタミン−157およびチロシン−158を含む(Aitkenら、2004)。図7は、様々な酵母種から得られた野生型Cys4pのアミノ酸アライメントを提供する。一実施形態において、変異型Cys4pは、図7に示すように、スレオニン−81、セリン−82、スレオニン−85、グルタミン−157およびチロシン−158に対応する必須の活性部位残基を有する。
一実施形態において、野生型Cys4pは、配列番号6、8、10、12、14、16、20または22のいずれか1つのアミノ酸配列を有する。別の実施形態において、野生型Cys4pは、図7に示される野生型Cys4pのいずれか1つである。さらに別の実施形態において、野生型Cys4pは、図7に示されるコンセンサス配列に対応する。
さらに別の実施形態において、本開示の野生型Cys4p(変異体と呼ぶことができる)は、野生型Cys4pがシスタチオニンβ−シンターゼ活性を示す条件で、配列番号6、8、10、12、14、16、20または22のいずれか1つと図7に示されるコンセンサス配列で少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%の同一性を共有する。「同一性」は、Computational Molecular Biology(Lesk,A.M.編)、Oxford University Press、NY(1988);Biocomputing:Informatics and Genome Projects(Smith,D.W.編)Academic Press、NY(1993);Computer Analysis of Sequence Data、Part I(Griffin,A.M.およびGriffin,H.G.編)Humana Press、NJ(1994);Sequence Analysis in Molecular Biology(von Heinje、G.編)Academic Press(1987);およびSequence Analysis Primer(Gribskov,M.およびDevereux,J.編)、Stockton Press、NY(1991)に記載されているものを含むが、これらに限定されない既知の方法によって容易に計算することができる。同一性を決定するための好ましい方法は、試験される配列間の最良の一致を与えるように設計される。同一性および類似性を決定する方法は、公的に入手可能なコンピュータプログラムにまとめられている。配列アラインメントおよびパーセント同一性計算は、LASERGENEバイオインフォマティクスコンピューティングスイート(LASERGENE bioinformatics computing suite)(DNASTAR Inc.、Madison、Wis.)のMegalignプログラムを用いて行うことができる。本明細書中に開示の配列の複数のアライメントは、アラインメントのClustal法(HigginsおよびSharp(1989)CABIOS.5:151〜153頁)を使用してデフォルトのパラメータ(GAP PENALTY=10、GAP LENGTH PENALTY=10)を用いて行った。Clustal法を用いたペアワイズアライメントのデフォルトのパラメータは、KTUPLB 1、GAP PENALTY=3、WINDOW=5、およびDIAGONALS SAVED=5であった。
上に示したように、本開示の遺伝子修飾された宿主細胞(遺伝子修飾された酵母宿主細胞など)は、いくつかの実施形態において、変異型Cys4pをコードする第1の核酸分子を含むことができる。本開示の文脈において、「変異型」Cys4pは、野生型Cys4pに対して増加したシスタチオニンβ−シンターゼ活性を有するタンパク質を指す。さらに、野生型Cys4pと比較した場合、変異型Cys4pは、野生型Cys4pと1つまたは複数のアミノ酸残基の差異を有する。しかしながら、変異型Cys4pはシスタチオニンβ−シンターゼ活性を示すため、変異型Cys4pは、その触媒部位内の81位(または対応する位置)のスレオニン、82位(または対応する位置)のセリン、85位(または対応する位置)のスレオニン、157位(または対応する位置)のグルタミンおよび158位(または対応する位置)のチロシンを有する。
一実施形態において、変異型Cys4pは、「野生型」Cys4pに対して増加したシスタチオニンβ−シンターゼ活性および/または安定性を示す野生型Cys4pの断片である。本開示の文脈において使用される場合、「断片」という用語は、野生型タンパク質より少なくとも1つ少ないアミノ酸残基を有するタンパク質を指す。この欠失は、野生型Cys4pのN末端、C末端のいずれかまたはN末端およびC末端の両方で起こり得る。本開示の文脈において、変異型Cys4pが野生型Cys4pの断片である場合、それは野生型Cys4pの触媒ドメインを少なくとも含む。いくつかの実施形態において、変異型Cys4pは、野生型Cys4pの少なくとも300、310、320、330、340、350以上の連続したアミノ酸残基を有することができる。特定の実施形態において、変異型Cys4pは、野生型Cys4pのカルボキシ末端から1つまたは複数のアミノ酸残基を欠失させることによって得られ、例えば、野生型Cys4pの制御ドメインの一部または全てを欠失させることによって得られる。Cys4pの制御ドメインは図7に図示され、配列番号1の354位〜507位に対応する。一実施形態において、変異型Cys4pは、配列番号1の残基1〜353によって定義される配列、ならびに配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号19、配列番号20または配列番号22の対応する配列からなる。いくつかの特定の実施形態において、変異型Cys4pは、配列番号2のアミノ酸配列からなる。
本開示は、そのような断片および変異体が野生型Cys4pに対して増加したシスタチオニンβ−シンターゼ活性および/または安定性を示す場合には、変異型Cys4pの断片および/または変異体の使用も含む。変異型Cys4pの断片は、変異型Cys4pよりも少なくとも1つ少ないアミノ酸残基を有する変異型Cys4pを指す。欠失は、野生型タンパク質のN末端、C末端のいずれか、またはN末端およびC末端の両方で起こり得る。変異型Cys4pの変異体は、アミノ酸残基の1つまたは複数が保存または非保存アミノ酸残基で置換されたものであり得る。変異型Cys4pの「変異体」は、保存的変異体または対立遺伝子変異体であり得る。本明細書において使用されるように、保存的変異体は、変異型Cys4pの生物学的機能に悪影響を及ぼさないアミノ酸配列の変更を指す。置換、挿入または欠失は、変更された配列が変異型Cys4pに関連する生物学的機能を妨害または破壊する場合、タンパク質に悪影響を与えると言われる。例えば、生物学的活性に悪影響を及ぼすことなく、タンパク質の全体的な電荷、構造または疎水性−親水性特性を変更することができる。したがって、変異型Cys4pの生物学的活性に悪影響を及ぼすことなく、変異型Cys4pを例えばより疎水性または親水性にするためにアミノ酸配列を変更することができる。
(ii)変異型Yap1p
Yap1pはS.セレビシアエ酸化的ストレス応答に関与する転写因子である。これは、GSH1、GSH2、CYS3およびCYS4遺伝子の正の転写制御因子である。Yap1pをコードする転写物を過剰発現することが示されている、GSH産生の増加を示す酵母株(Nisamedtinovら、2010およびNisamedtinovら、2011)。野生型Yap1p過剰発現もまた、GSH蓄積を増強することが示された(Orumetsら、2012)。
(ii)変異型Yap1p
Yap1pはS.セレビシアエ酸化的ストレス応答に関与する転写因子である。これは、GSH1、GSH2、CYS3およびCYS4遺伝子の正の転写制御因子である。Yap1pをコードする転写物を過剰発現することが示されている、GSH産生の増加を示す酵母株(Nisamedtinovら、2010およびNisamedtinovら、2011)。野生型Yap1p過剰発現もまた、GSH蓄積を増強することが示された(Orumetsら、2012)。
Yap1pの生物学的活性は、その細胞内局在化によって影響を受ける:酸化ストレス下で、野生型Yap1pは核内に局在し、その生物学的活性を媒介するが、酸化ストレスが減少すると野生型Yap1pは細胞質に移行し、その生物学的活性を停止させる(Kugeら、1997)。野生型Yap1pの可逆的核局在は、そのC末端システインリッチドメイン(CRD)によって媒介される。CRDは、特定のシステイン残基間にジスルフィド結合を形成することができ、ある状況では、Yap1pの核輸出配列を隠蔽し、RNAレベルでの発現が変化がなく、さらにより低いタンパク質レベルにもかかわらず、核内で活性状態を保持させる(Kugeら、2001およびKugeら、1997)。
本開示の遺伝子修飾された宿主細胞は、変異型Yap1pをコードする異種核酸分子を含むことができる。変異型Yap1pは、野生型Yap1pと比較した場合、核から細胞質に転移する能力が低下する。したがって、細胞質におけるその最初の翻訳後、変異型Yap1pは、実質的に、いくつかの実施形態においては専ら、遺伝子修飾された宿主細胞の核内に(例えば、遺伝子修飾された酵母宿主細胞の核内に)位置する。遺伝子修飾された宿主細胞は、変異型Yap1pを発現する能力があり、適切な条件に置かれた場合、遺伝子修飾された宿主細胞は、変異型Yap1pを発現する。変異型Yap1をコードする異種核酸分子は、遺伝子修飾された宿主細胞中の1つまたは複数のコピーで(1つまたは複数の中立的組込み部位で)組み込むことができる。第2の異種核酸分子は、天然のYap1pをコードする天然の核酸分子の1つまたは両方のコピーを置換することができる。一実施形態において、遺伝子修飾された宿主細胞(および特に遺伝子修飾された酵母宿主細胞)は、(1つまたは複数の中立的組込み部位で)異種核酸分子のコピーが組み込まれた1つまたは複数のコピーを有することができ、ここで、天然のYap1pをコードする天然の核酸分子の少なくとも1つのコピー(または両方のコピー)が第1の異種核酸によって置換されている。
遺伝子修飾された宿主細胞において(特に、遺伝子修飾された酵母宿主細胞において)発現される場合、変異型Yap1pは、野生型Yap1pの能力と比較して核から細胞質に転移する能力が低下している。本開示の文脈において、野生型Yap1pは、塩基性ロイシンジッパー転写因子活性を有するタンパク質、すなわち、様々な遺伝子の発現を調節することができるタンパク質を指す。例えば、野生型Yap1pの転写因子活性の一つは、γグルタミルシステイン合成酵素タンパク質(Gsh1p)およびグルタチオン合成2タンパク質(Gsh2p)をそれぞれコードするGSH1およびGSH2遺伝子の発現を増加させることである。一実施形態において、野生型Yap1pは、例えば、酵母ゲノムなどの真核生物ゲノムによってコードされる。図8は、様々な酵母種由来の野生型Yap1pのアミノ酸アライメントを提供する。一実施形態において、野生型Yap1pは、配列番号7、9、11、13、15、17、18、19、21または23のいずれか1つのアミノ酸配列を有する。別の実施形態において、野生型Yap1pは、図8に示す野生型Yap1pのいずれか1つである。さらに別の実施形態において、野生型Yap1pは、図8に示されるコンセンサス配列に対応する。
さらに別の実施形態において、本開示の野生型Yap1pは、野生型Yap1pに酸化的ストレスが減少したときに核から細胞質に転移する能力がある限りにおいて、配列番号7、9、11、13、15、17、18、19、21または23のいずれか1つまたは図8に示されるコンセンサス配列と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%の同一性を共有することができる。「同一性」は、Computational Molecular Biology(Lesk,A.M.編)、Oxford University Press、NY(1988);Biocomputing:Informatics and Genome Projects(Smith,D.W.編)Academic Press、NY(1993);Computer Analysis of Sequence Data、Part I(Griffin,A.M.およびGriffin,H.G.編)Humana Press、NJ(1994);Sequence Analysis in Molecular Biology(von Heinje,G.編)Academic Press(1987);およびSequence Analysis Primer(Gribskov,M.およびDevereux,J.編)、Stockton Press、NY(1991)に記載されているものを含むが、これらに限定されない既知の方法によって容易に計算することができる。同一性を決定するための好ましい方法は、試験される配列間の最良の一致を与えるように設計される。同一性および類似性を決定する方法は、公的に入手可能なコンピュータプログラムにまとめられている。配列アラインメントおよびパーセント同一性計算は、LASERGENEバイオインフォマティクスコンピューティングスイート(DNASTAR Inc.、Madison、Wis.)のMegalignプログラムを用いて行うことができる。本明細書中に開示の配列の複数のアライメントは、アラインメントのClustal法(HigginsおよびSharp(1989)CABIOS.5:151〜153頁)を使用してデフォルトのパラメータ(GAP PENALTY=10、GAP LENGTH PENALTY=10)を用いて行った。Clustal法を用いたペアワイズアライメントのデフォルトのパラメータは、KTUPLB 1、GAP PENALTY=3、WINDOW=5、およびDIAGONALS SAVED=5であった。
上に示したように、本開示の遺伝子修飾された宿主細胞は、いくつかの実施形態において、変異型Yap1pをコードする異種核酸分子を含むことができる。本開示の文脈において、「変異型」Yap1pは、「野生型」Yap1pの能力と比較した場合、宿主細胞の核から細胞質に転移する能力が低下しているか、または欠如しているタンパク質を指す。いくつかの実施形態において、細胞質におけるその最初の翻訳後、変異型Yap1pは、宿主細胞の核において構成的に発現される。さらに、野生型Yap1pと比較した場合、変異型Yap1pは、野生型Yap1pと1つまたは複数のアミノ酸残基の差異を有する。
一実施形態において、変異型Yap1pは、「野生型」Yap1pと比較した場合、酵母宿主細胞の核から細胞質へ転移する能力が低下しているか、または欠如していることを示す野生型Yap1pの断片である。本開示の文脈において使用される場合、「断片」という用語は、野生型タンパク質より少なくとも1つ少ないアミノ酸残基を有するタンパク質を指す。この欠失は、野生型タンパク質のN末端、C末端のいずれかまたはN末端およびC末端の両方で起こり得る。本開示の文脈において、変異型Yap1pが野生型Yap1pの断片である場合、野生型Yap1pの塩基性領域およびロイシンジッパーを少なくとも含む。例えば、変異型Yap1pは、野生型Yap1pからシステインリッチドメインを(少なくとも部分的におよびいくつかの実施形態においては完全に)欠失させることによって得ることができる。選択されたYap1pのシステインリッチドメインを図8に示す。いくつかの実施形態において、変異型Yap1pは野生型Yap1pの少なくとも100、200、300、400、500、600以上の連続したアミノ酸残基を有することができる。
一実施形態において、変異型Yap1pは、野生型Yap1pの1つまたは複数のアミノ酸残基を置換することによって得ることができる。一実施形態において、変異型Yap1pは、野生型Yap1pのシステインリッチドメイン内のアミノ酸置換を含む。野生型Yap1pのシステインリッチドメインは図8に図示されており、配列番号3の残基604〜635に対応する。野生型Yap1pのシステインリッチドメインは、3つのシステイン残基:配列番号3の604位に対応する第1のシステイン残基、配列番号3の626位に対応する第2のシステイン残基、および配列番号3の635位に対応する第3のシステイン残基を含む。一実施形態において、変異型Yap1p(Yap1pのシステインリッチドメインに対応するドメイン内の)は、第1のシステイン残基(配列番号3の604位の残基に対応する)および野生型Yap1pの第3のシステイン残基(配列番号3の635位の残基に対応する)を有し、第2のシステイン残基(配列番号3の626位の残基に対応する)における置換を含む。変異型Yap1pは、野生型Yap1pのシステインリッチドメインの第2のシステイン残基を、例えばアスパラギン酸、ロイシン、アルギニン、ヒスチジン、グルタミン酸、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、リシン、セリン、チロシン、メチオニンまたはトリプトファンなどの親水性アミノ酸残基により置換することによって得ることができる。別の実施形態において、変異型Yap1pは、野生型Yap1pのシステインリッチドメインの第2のシステイン残基をアスパラギン酸残基で置換することによって得ることができる。一実施形態において、変異型Yap1pは、配列番号4または5のアミノ酸配列を含む。別の実施形態において、変異型Yap1pは、配列番号7、9、11、13、15、17、18、19、21または23のいずれか1つのアミノ酸配列を含み、システインリッチドメインの第2のシステイン(配列番号3の626位の残基に対応する)は親水性アミノ酸残基(上に示したような)、好ましくはアスパラギン酸残基により置換されている。
本開示はまた、そのような断片および変異体が、野生型Yap1pと比較したとき宿主細胞の核から細胞質へ転移する能力の低下または欠如を示す場合に、変異型Yap1pの断片および/または変異体を使用することを含む。変異型Yap1pの断片は、変異型Yap1pより少なくとも1つ少ないアミノ酸残基を有する変異型Yap1pを指す。この欠失は、野生型タンパク質のN末端、C末端のいずれかまたはN末端およびC末端の両方で起こり得る。変異型Yap1pの変異体は、1つまたは複数のアミノ酸残基が保存または非保存アミノ酸残基で置換されたものであり得る。変異型Yap1pの「変異体」は、保存的変異体または対立遺伝子変異体であり得る。本明細書において使用されるように、保存的変異体とは、変異型Yap1pの生物学的機能に悪影響を及ぼさないアミノ酸配列の変更を指す。置換、挿入または欠失は、変更された配列が変異型Yap1pに関連する生物学的機能を妨害または破壊する場合、タンパク質に悪影響を与えると言われる。例えば、生物学的活性に悪影響を及ぼすことなく、タンパク質の全体的な電荷、構造または疎水性−親水性特性を変更することができる。したがって、変異型Yap1pの生物学的活性に有害な影響を与えることなく、変異型Yap1pを例えばより疎水性または親水性にするためにアミノ酸配列を変更することができる。
(iii)異種スレオニンアルドラーゼ(Gly1p)
グリシンはGSHの産生に必要である。L−スレオニンアルドラーゼタンパク質(Gly1pとも呼ばれる)は、スレオニンからアセトアルデヒドを除去してグリシンを生成することを触媒する。
(iii)異種スレオニンアルドラーゼ(Gly1p)
グリシンはGSHの産生に必要である。L−スレオニンアルドラーゼタンパク質(Gly1pとも呼ばれる)は、スレオニンからアセトアルデヒドを除去してグリシンを生成することを触媒する。
本開示の遺伝子修飾された宿主細胞(および特に本開示の遺伝子修飾された酵母宿主細胞)は、異種Gly1pをコードする異種核酸分子を含み得る。したがって、このような遺伝子修飾された宿主細胞は、異種Gly1pを発現することができ、適切な条件に置かれた場合、遺伝子修飾された宿主細胞は、場合によって、異種Gsh1pおよび/または変異型Cys4pの発現と組み合わせて、総チオール(およびGSH産生)の増加を好む異種Gly1pを発現する。Gly1pをコードする異種核酸分子は、遺伝子修飾された宿主細胞中の1つまたは複数のコピーに(1つまたは複数の中立的組込み部位で)組み込まれ得る。一実施形態において、遺伝子修飾された宿主細胞(および特に遺伝子修飾された酵母宿主細胞)は、Gly1pをコードする異種核酸分子のコピーを(1つまたは複数の中立的組込み部位に)組み込んだ1つまたは複数(例えば、少なくとも2つ、3つまたは4つ)のコピーを有する。
一実施形態において、異種Gly1pは、配列番号24、25、26、27、28、29、30、31または32のいずれか1つのアミノ酸配列を有する。別の実施形態において、異種Gly1pは、図9に示される異種Gly1pの任意の1つである。さらに別の実施形態において、異種Gly1pは、図9に示されるコンセンサス配列に対応する。
本開示はまた、1つまたは複数のアミノ酸残基が保存または非保存アミノ酸残基で置換されたものであり得る異種Gly1pの変異体に関する。異種Gly1pの「変異体」は、保存的変異体または対立遺伝子変異体であり得る。本明細書において使用されるように、保存的変異体は、異種Gly1pの生物学的機能に悪影響を及ぼさないアミノ酸配列の変化を指す。置換、挿入または欠失は、変化した配列が異種Gly1pに関連する生物学的機能を妨害または破壊する場合、タンパク質に悪影響を与えると言われている。例えば、生物学的活性に悪影響を及ぼすことなく、タンパク質の全体的な電荷、構造または疎水性−親水性特性を変更することができる。したがって、異種Gly1pの生物学的活性に悪影響を及ぼすことなく、異種Gly1pを例えばより疎水性または親水性にするために、アミノ酸配列を変更することができる。
さらに別の実施形態において、本開示の異種Gly1pの変異体は、異種Gly1pがスレオニンアルドラーゼ活性を示すならば、図9に示されたコンセンサス配列と配列番号24、25、26、27、28、29、30、31または32のいずれか1つと少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%の同一性を共有し得る。「同一性」は、Computational Molecular Biology(Lesk,A.M.編)、Oxford University Press、NY(1988);Biocomputing:Informatics and Genome Projects(Smith,D.W.編)Academic Press、NY(1993);Computer Analysis of Sequence Data、Part I(Griffin,A.M.およびGriffin,H.G.編)Humana Press、NJ(1994);Sequence Analysis in Molecular Biology(von Heinje,G.編)Academic Press(1987);およびSequence Analysis Primer(Gribskov,M.およびDevereux,J.編)、Stockton Press、NY(1991)に記載されているものを含むが、これらに限定されない既知の方法によって容易に計算することができる。同一性を決定するための好ましい方法は、試験される配列間の最良の一致を与えるように設計される。同一性および類似性を決定する方法は、公的に入手可能なコンピュータプログラムにまとめられている。配列アラインメントおよびパーセント同一性計算は、LASERGENEバイオインフォマティクスコンピューティングスイート(DNASTAR Inc.、Madison、Wis.)のMegalignプログラムを用いて行うことができる。本明細書中に開示の配列の複数のアライメントは、アラインメントのClustal法(HigginsおよびSharp(1989)CABIOS.5:151〜153頁)を使用してデフォルトのパラメータ(GAP PENALTY=10、GAP LENGTH PENALTY=10)を用いて行った。Clustal法を用いたペアワイズアライメントのデフォルトのパラメータは、KTUPLB 1、GAP PENALTY=3、WINDOW=5、およびDIAGONALS SAVED=5であった。
一実施形態において、異種Gly1pは、スレオニンアルドラーゼ活性を示す野生型Gly1pの断片である。本開示の文脈において使用される場合、「断片」という用語は、野生型タンパク質より少なくとも1つ少ないアミノ酸残基を有するタンパク質を指す。この欠失は、野生型異種Gly1pのN末端、C末端のいずれかまたはN末端およびC末端の両方で起こり得る。本開示の文脈において、異種Gly1pが野生型Gly1pの断片である場合、それは野生型Gly1pの触媒ドメインを少なくとも含む。いくつかの実施形態において、異種Gly1pの断片は、野生型Gly1pの少なくとも250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350またはそれ以上の連続したアミノ酸残基を有することができる。
(iv)さらなる異種核酸分子
遺伝子修飾された宿主細胞は、変異型Cys4pをコードする第1の異種核酸分子、変異型Yap1pをコードする第2の異種核酸分子および/または異種Gly1pをコードする第3の異種核酸分子の少なくとも1つを含む。さらなる実施形態において、遺伝子修飾された宿主細胞は、第1の異種核酸分子(変異型Cys4pをコードする)および第2の核酸分子(変異型Yap1pをコードする)の少なくとも1つまたは第3の異種核酸分子(スレオニンアルドラーゼタンパク質(Gly1p)をコードする)を含む。一実施形態において、遺伝子修飾された宿主細胞は、変異型Cys4pをコードする第1の異種核酸分子および変異型Yap1pをコードする第2の異種核酸分子の両方を含む。さらなる実施形態において、遺伝子修飾された宿主細胞は、変異型Cys4pをコードする第2の異種核酸分子および異種のGly1pをコードする第3の異種核酸分子の両方を含む。別の実施形態において、遺伝子修飾された宿主細胞は、変異型Yap1pをコードする第2の異種核酸分子および異種Gly1pをコードする第3の異種核酸分子の両方を含む。さらに別の実施形態において、遺伝子修飾された宿主細胞は、変異型Cys4pをコードする第1の異種核酸分子、変異型Yap1pをコードする第2の異種核酸分子および異種Gly1pをコードする第3の異種核酸分子を含む。
(iv)さらなる異種核酸分子
遺伝子修飾された宿主細胞は、変異型Cys4pをコードする第1の異種核酸分子、変異型Yap1pをコードする第2の異種核酸分子および/または異種Gly1pをコードする第3の異種核酸分子の少なくとも1つを含む。さらなる実施形態において、遺伝子修飾された宿主細胞は、第1の異種核酸分子(変異型Cys4pをコードする)および第2の核酸分子(変異型Yap1pをコードする)の少なくとも1つまたは第3の異種核酸分子(スレオニンアルドラーゼタンパク質(Gly1p)をコードする)を含む。一実施形態において、遺伝子修飾された宿主細胞は、変異型Cys4pをコードする第1の異種核酸分子および変異型Yap1pをコードする第2の異種核酸分子の両方を含む。さらなる実施形態において、遺伝子修飾された宿主細胞は、変異型Cys4pをコードする第2の異種核酸分子および異種のGly1pをコードする第3の異種核酸分子の両方を含む。別の実施形態において、遺伝子修飾された宿主細胞は、変異型Yap1pをコードする第2の異種核酸分子および異種Gly1pをコードする第3の異種核酸分子の両方を含む。さらに別の実施形態において、遺伝子修飾された宿主細胞は、変異型Cys4pをコードする第1の異種核酸分子、変異型Yap1pをコードする第2の異種核酸分子および異種Gly1pをコードする第3の異種核酸分子を含む。
複数の異種核酸分子が遺伝子修飾された宿主細胞(遺伝子修飾された酵母宿主細胞など)に存在する実施形態において、各々の異種核酸分子は、(1つまたは複数のコピーにおける)中立的組込み部位に組み込まれるか、および/または天然の(野生型)核酸分子(例えば、Cys4pまたはYap1pをコードする天然の核酸分子)をコードする核酸分子のコピーの一方または両方を置換することができる。例えば、第1、第2および第3の異種核酸分子は、遺伝子修飾された宿主細胞中の1つまたは複数のコピーで(1つまたは複数の中立的組込み部位で)両方を組み込むことができる。このような実施形態において、中立的組込み部位は同じであっても異なっていてもよい。別の例において、第1の異種核酸分子は、天然のCys4pをコードする天然の核酸分子の1つまたは複数のコピーを置換することができ、第2の異種核酸分子の1つまたは複数のコピーは、1つまたは複数の中立的組込み部位に組み込むことができる。さらに別の例において、遺伝子修飾された宿主細胞(および特に遺伝子修飾された酵母宿主細胞)は、第1および第2の異種核酸分子(1つ又は複数の中立的組込み部位で)のコピーが組み込まれた1つまたは複数のコピーを有することができ、天然のCys4pをコードする天然の核酸分子の少なくとも1つのコピー(または両方のコピー)は第1の異種核酸によって置換される。さらに別の例では、第1の異種核酸分子は、遺伝子修飾された宿主細胞中の1つまたは複数のコピーで(1つまたは複数の中立的組込み部位に)組み込むことができる一方で、第2の核酸分子は、天然の野生型Yap1pをコードする核酸分子の1つまたは両方のコピーを置換することができる。第1の異種核酸分子は、天然のCys4pをコードする天然の核酸分子の1つまたは複数のコピーを置換することができ、第2の異種核酸は、天然のYap1pをコードする天然の核酸分子の1つまたは複数のコピーを置換することができる。さらに別の例において、遺伝子修飾された宿主細胞(および特に遺伝子修飾された酵母宿主細胞)は、(1つまたは複数の中立的組込み部位で)第1の異種核酸分子のコピーが組み込まれた1つまたは複数のコピーを有することができ、ここで、天然のCys4pをコードする天然の核酸分子の少なくとも1つのコピー(または両方のコピー)が第1の異種核酸によって置換され、天然のYap1pをコードする天然の核酸分子の少なくとも1つのコピー(または両方のコピー)が第2の異種核酸分子によって置換されている。さらに別の例において、遺伝子修飾された宿主細胞(および特に遺伝子修飾された酵母宿主細胞)は、(1つまたは複数の中立的組込み部位で)第1および第2の異種核酸分子のコピーが組み込まれた1つまたは複数のコピーを有することができ、ここで、天然のCys4pをコードする天然の核酸分子の少なくとも1つのコピー(または両方のコピー)が第1の異種核酸によって置換され、天然のYap1pをコードする天然の核酸分子の少なくとも1つのコピー(または両方のコピー)が第2の異種核酸分子によって置換されている。
遺伝子修飾された宿主細胞は、グルタチオンの産生および蓄積に好ましい追加の遺伝子をコードするさらなる異種核酸分子を含み得る。例えば、遺伝子修飾された宿主細胞は、Gsh1pをコードする第4の核酸分子および/またはGsh2pをコードする第5の核酸分子を含み得る。さらに別の例において、遺伝子修飾された宿主細胞は、Gsh1pをコードする第4の核酸分子およびGsh2pをコードする第5の核酸分子の両方を含み得る。組換え宿主細胞の異種核酸分子の各々は、遺伝子修飾された宿主細胞中の1つまたは複数のコピー内に存在し得る。例えば、異種核酸分子の各々は、遺伝子修飾された宿主細胞において1、2、3または4つのコピー内に存在し得る。異種核酸分子の各々のコピー数は独立して選択される。
一実施形態において、遺伝子修飾された宿主細胞は、変異型Cys4p(中立的な位置で組み込まれる)をコードする第1の異種核酸分子の少なくとも2つ、好ましくは少なくとも4つのコピーを含み、ここで、野生型Yap1pをコードする天然の核酸分子の少なくとも1つ、好ましくは2つのコピーは、変異型Yap1をコードする第2の異種核酸分子によって置換されている。別の実施形態において、遺伝子修飾された宿主細胞は、変異型Cys4p(中立的な位置で組み込まれる)をコードする第1の異種核酸分子の少なくとも2つ、好ましくは少なくとも4つのコピーおよび異種Gly1pをコードする第2の異種核酸分子少なくとも2つ、好ましくは少なくとも4つのコピーを含む。このような実施形態において、Gsh1pをコードする第3の異種核酸分子およびGsh2pをコードする第4の異種核酸分子の各々の少なくとも2つ、好ましくは4つのコピーを含むことが必要であり得る。
一実施形態において、遺伝子修飾された宿主細胞(および特に遺伝子修飾された酵母宿主細胞)は、第2、第3、第4および第5の異種核酸分子を(組み込まれた形態で)担持する。天然の野生型Yap1pをコードする天然の核酸分子の両方のコピーはそれぞれ、第2の異種核酸分子によって置換される。さらに、第2の核酸分子は、遺伝子修飾された宿主細胞のゲノムにおいて複数コピー(好ましくは4つ)に組み込まれる。さらに、第3および第4の核酸分子の両方は各々、遺伝子修飾された宿主細胞のゲノム中に複数コピー(好ましくは4つ)に組み込まれる。
さらなる実施形態において、遺伝子修飾された宿主細胞(および特に遺伝子修飾された酵母宿主細胞)は、第1、第2、第3、第4および第5の異種核酸分子を(組み込まれた形態で)担持する。天然の野生型Cys4pおよび天然の野生型Yap1pをコードする天然の核酸分子の各々の両方のコピーはそれぞれ、第1および第2の異種核酸分子によって置換される。さらに、第2の核酸分子は、遺伝子修飾された宿主細胞のゲノムにおいて複数コピー(好ましくは4つ)に組み込まれる。さらに、第3および第4の核酸分子は各々、遺伝子修飾された宿主細胞のゲノム中に複数コピー(好ましくは4つ)に組み込まれる。
一実施形態において、遺伝子修飾された宿主細胞は、野生型または変異型シスタチオニンγ−リアーゼタンパク質(Cys3p)をコードする異種核酸分子を含まないが、それにもかかわらず、天然のシスタチオニンγ−リアーゼタンパク質(Cys3p)を発現する。
遺伝子修飾された宿主細胞を製造するプロセス
遺伝子修飾された宿主細胞は、従来的な分子生物学的なツールおよび教示を使用して、調製することができる。本開示の文脈において、遺伝子修飾された宿主細胞を製造するためのプロセスは、変異型Cys4pをコードする第1の異種核酸分子、変異型Yap1pをコードする第2の異種核酸分子、および/または異種Gly1pをコードする第3の異種核酸分子を導入するステップを含む。場合によって、本プロセスはまた、Gsh1pをコードする第4の異種核酸分子および/またはGsh2pをコードする第5の異種核酸分子を導入するステップも含み得る。一実施形態において、本プロセスは、野生型または変異型シスタチニンγ−リアーゼタンパク質(Cys3p)をコードする異種核酸分子の導入を含まない(例えば、除外する)が、それにもかかわらず、天然のシスタチオニンγ−リアーゼタンパク質(Cys3p)を発現する。
遺伝子修飾された宿主細胞を製造するプロセス
遺伝子修飾された宿主細胞は、従来的な分子生物学的なツールおよび教示を使用して、調製することができる。本開示の文脈において、遺伝子修飾された宿主細胞を製造するためのプロセスは、変異型Cys4pをコードする第1の異種核酸分子、変異型Yap1pをコードする第2の異種核酸分子、および/または異種Gly1pをコードする第3の異種核酸分子を導入するステップを含む。場合によって、本プロセスはまた、Gsh1pをコードする第4の異種核酸分子および/またはGsh2pをコードする第5の異種核酸分子を導入するステップも含み得る。一実施形態において、本プロセスは、野生型または変異型シスタチニンγ−リアーゼタンパク質(Cys3p)をコードする異種核酸分子の導入を含まない(例えば、除外する)が、それにもかかわらず、天然のシスタチオニンγ−リアーゼタンパク質(Cys3p)を発現する。
異種核酸分子の各々は、独立して、遺伝子修飾された宿主細胞に組み込まれ得るか、または独立して、そこで複製し得る。本明細書において使用される「組み込まれる」という用語は、分子生物学技法によって、宿主細胞のゲノムに入れられる、遺伝子要素を指す。例えば、遺伝子要素は、宿主細胞によって保持されるプラスミドなどのベクターとは対照的に、宿主細胞の染色体内に入れることができる。遺伝子要素を宿主細胞のゲノムに組み込むための方法は、当該技術分野において周知であり、これには、相同的組換えが挙げられる。異種核酸分子は、宿主細胞のゲノムに1つまたは複数のコピーで存在し得る。代替として、異種核酸分子は、独立して、宿主細胞のゲノムから複製していてもよい。このような実施形態において、異種核酸分子は、安定であり、自己複製が可能である。
一実施形態において、少なくとも1つの異種核酸分子は、遺伝子修飾された宿主細胞のゲノムに組み込まれる。さらに別の実施形態において、すべての異種核酸分子が、遺伝子修飾された宿主細胞のゲノムに組み込まれる。異種核酸分子の各々は、中立的組込み部位(同じかもしくは異なる部位)に組み込まれ得るか、または対応する野生型タンパク質をコードする対応する天然の核酸分子を特異的に置換するように設計され得るかのいずれかである。
一実施形態において、遺伝子修飾された宿主細胞に導入されることが意図される1つまたは複数の異種核酸分子は、それが意図されるレシピエント宿主細胞に導入される前に、少なくとも部分的または完全に、コドン最適化されることが企図される。
一実施形態において、存在する場合、変異型Cys4pをコードする第1の異種核酸分子は、中立的組込み部位に組み込まれる。複数のコピー(例えば、2つ、3つ、または4つのコピー)に存在する場合、第1の異種核酸分子の各々は、同じかまたは異なる中立的組込み部位に組み込まれ得る。代替としてまたは組み合わせて、第1の異種核酸分子は、野生型Cys4pをコードする核酸分子の1つまたは両方のコピーを置換することができる。
なお別の実施形態において、存在する場合、変異型Yap1pをコードする第2の異種核酸分子は、酵母宿主細胞において、野生型Yap1pをコードする核酸分子の1つまたは好ましくは両方のコピーを置換することができる。代替としてまたは組み合わせて、第2の異種核酸分子は、中立的組込み部位(これは、第1の異種核酸分子の組込み部位と同じであっても異なってもよい)に組み込まれ得る。複数のコピー(例えば、2つ、3つ、または4つ)に存在する場合、第2の異種核酸分子の各々は、同じかまたは異なる組込み部位(これは、第1の異種核酸分子の組込み部位と同じであっても異なってもよい)に組み込まれ得る。
なおさらなる実施形態において、存在する場合、第3の異種核酸分子(Gly1pをコードする)は、同じかまたは異なる中立的組込み部位(これは、第1または第2の異種核酸分子の組込み部位と同じであっても異なってもよい)に組み込まれ得る。
一実施形態において、存在する場合、第4の異種核酸分子(Gsh1pをコードする)および第5の異種核酸分子(Gsh2pをコードする)は、同じかまたは異なる中立的組込み部位(これは、第1または第2の異種核酸分子の組込み部位と同じであっても異なってもよい)に組み込まれ得る。
さらに別の実施形態において、本プロセスは、変異型Cys4pをコードする第1の異種核酸分子の1つまたは複数のコピーを1つまたは複数の中立的組込み部位に組み込むステップと、宿主細胞(例えば、酵母宿主細胞)において野生型Yap1pをコードする核酸分子の1つまたは好ましくは両方のコピーを、変異型Yap1pをコードする第2の異種核酸分子と置換するステップとを含み得る。このような実施形態において、本プロセスはまた、スレオニンアルドラーゼ(Gly1p)をコードする第3の異種核酸分子、Gsh1pをコードする第4の異種核酸分子、およびGsh2pをコードする第5の核酸分子の1つまたは複数のコピーを、同じかまたは異なる中立的組込み部位に組み込むステップを含み得る。
異種核酸分子は、ベクターを使用して、宿主細胞に導入することができる。「ベクター」、例えば、「プラスミド」、「コスミド」、または「YAC」(酵母人工染色体)は、染色体外要素を指し、通常、環状二本鎖DNA分子の形態をしている。このようなベクターは、任意の供給源に由来する、自律的複製配列、ゲノム組込み配列、ファージもしくはヌクレオチド配列、線形、環状、もしくはスーパーコイルの一本鎖もしくは二本鎖DNAもしくはRNAであり得、いくつかのヌクレオチド配列が、接合または組み換えられて、プロモーター断片および選択された遺伝子産物のためのDNA配列を適切な3’非翻訳配列とともに細胞に導入することが可能な固有の構成となっている。
異種核酸分子が、中立的組込み部位に組み込まれることが意図される場合、異種核酸分子にプロモーターを含めることが必要であり得る。このような実施形態において、プロモーターおよび目的のタンパク質をコードする核酸分子は、互いに作動可能に連結されている。本開示の文脈において、「作動可能に連結されている」または「作動可能に結合している」という表現は、プロモーターが、ある特定の条件下において、核酸分子からの異種タンパク質の発現を可能にする様式で、異種タンパク質をコードする核酸分子と物理的に結合しているという事実を指す。一実施形態において、プロモーターは、異種タンパク質をコードする核酸配列の上流(5’)に位置し得る。本開示の文脈において、1つまたは1つを上回るプロモーターが、異種核酸分子に含まれてもよい。1つを上回るプロモーターが、異種核酸分子に含まれる場合、プロモーターの各々は、異種タンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結されている。
異種核酸分子が、中立的組込み部位に組み込まれることが意図される場合、異種核酸分子にターミネーターを含めることが必要であり得る。このような実施形態において、ターミネーターおよび目的のタンパク質をコードする核酸分子は、互いに作動可能に連結されている。本開示の文脈において、「作動可能に連結されている」または「作動可能に結合している」という表現は、ターミネーターが、ある特定の条件下において、異種タンパク質のコーディング配列の末端を示すことを可能にする様式で、異種タンパク質をコードする核酸と物理的に結合しているという事実を指す。一実施形態において、ターミネーターは、異種タンパク質をコードする核酸配列の上流(3’)に位置し得る。本開示の文脈において、1つまたは1つを上回るターミネーターが、異種核酸分子に含まれてもよい。1つを上回るターミネーターが、異種核酸分子に含まれる場合、ターミネーターの各々は、異種タンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結されている。
グルタチオンを製造するプロセス
本開示はまた、本明細書に記載されるかまたは本明細書に記載されるプロセスによって得られる遺伝子修飾された宿主細胞の使用に基づいて、グルタチオンを製造するためのプロセスにも関する。概して、本プロセスは、遺伝子修飾された宿主細胞で基質を発酵させてグルタチオンを含む発酵混合物を得るステップを含む。本開示の文脈において使用されるとき、「基質」という用語は、発酵の間に使用することができる、宿主細胞のための炭素の供給源を指す。基質は、液体形態であることが好ましく、場合によっては、炭水化物(例えば、グルコース)、糖アルコール(例えば、グリセロール)、ビタミン、ミネラル、ならびに/またはアミノ酸(例えば、システインおよび/もしくはグリシン)が補充されていてもよい。遺伝子修飾された宿主細胞が、遺伝子修飾された酵母宿主細胞である場合、このような基質は、限定することなく、組成規定培地または非組成規定培地、例えば、糖蜜(テンサイまたはサトウキビから得られる)などであり得る。発酵は、異種核酸分子の発現およびグルタチオンの蓄積を可能にする状況下において行われる。
本開示はまた、本明細書に記載されるかまたは本明細書に記載されるプロセスによって得られる遺伝子修飾された宿主細胞の使用に基づいて、グルタチオンを製造するためのプロセスにも関する。概して、本プロセスは、遺伝子修飾された宿主細胞で基質を発酵させてグルタチオンを含む発酵混合物を得るステップを含む。本開示の文脈において使用されるとき、「基質」という用語は、発酵の間に使用することができる、宿主細胞のための炭素の供給源を指す。基質は、液体形態であることが好ましく、場合によっては、炭水化物(例えば、グルコース)、糖アルコール(例えば、グリセロール)、ビタミン、ミネラル、ならびに/またはアミノ酸(例えば、システインおよび/もしくはグリシン)が補充されていてもよい。遺伝子修飾された宿主細胞が、遺伝子修飾された酵母宿主細胞である場合、このような基質は、限定することなく、組成規定培地または非組成規定培地、例えば、糖蜜(テンサイまたはサトウキビから得られる)などであり得る。発酵は、異種核酸分子の発現およびグルタチオンの蓄積を可能にする状況下において行われる。
本プロセスは、遺伝子修飾された宿主細胞で基質を発酵させてGSHを含む発酵混合物を得るステップを含む。「発酵混合物」という用語は、発酵基質、遺伝子修飾された宿主細胞、および遺伝子修飾された宿主細胞による発酵の間に産生される代謝産物を指す。発酵混合物は、様々な後続の操作によってさらに処理され得る。例えば、発酵したものの抽出物を得ることができ、このような抽出物を、場合によっては、脱水または乾燥させてもよい。本開示の文脈において、発酵混合物の抽出物中、遺伝子修飾された宿主細胞は、不活性化されており、全体として存在してもよく(すなわち、遺伝子修飾された宿主細胞が、相対的にインタクトである)、またはさらに成分に分けられていてもよい(すなわち、遺伝子修飾された宿主細胞は、意図的に破壊される)。遺伝子修飾された宿主細胞が、酵母である場合、酵母抽出物が、発酵混合物から産生され得る。例えば、酵母抽出物は、発酵混合物を加水分解または自己分解し(化学的、熱的、および/もしくは酵素的に)、続いて可溶性画分から不溶物を分離(単離)することによって、得ることができる(酵母抽出物に対応する)。酵母抽出物は、加水分解された遺伝子修飾された宿主細胞からなる。発酵混合物は、加水分解して、加水分解物を得ることができ、これを、場合によっては、脱水または乾燥させてもよい。遺伝子修飾された酵母宿主細胞が、酵母である場合、酵母加水分解物を、発酵混合物から得ることができる。酵母加水分解物は、遺伝子修飾された酵母細胞を、それ自体の酵素によって溶解させることによって、得ることができる。酵母加水分解物は、通常、可溶性画分および不溶性画分の両方を含む。いくつかの実施形態において、本プロセスは、発酵混合物から遺伝子修飾された宿主細胞(例えば、遺伝子修飾された酵母宿主細胞など)を精製するステップをさらに含む。精製された遺伝子修飾された宿主細胞は、細胞の完全性を維持し、後続の増殖を可能にするために、処理(アリコートへ分割、希釈、凍結、濾過、および/または凍結乾燥)してもよい。代替として、遺伝子修飾された宿主細胞(例えば、遺伝子修飾された酵母宿主細胞など)は、処理(アリコートへ分割、希釈、凍結、濾過、および/または凍結乾燥)される前に、不活性化(例えば、殺滅)されてもよい。場合によって、グルタチオンは、精製され得る(少なくとも部分的に、およびいくつかの実施形態では完全に)。
発酵混合物またはそれから得ることができ様々な生成物は、例えば、医薬用途、化粧品用途、ならびに動物およびヒトの食品用途(例えば、栄養、製パン、およびワイン製造)などの多数の用途において有利に使用することができる。グルタチオンおよびグルタチオンを含む生成物は、経口投与、局所投与、または非経口投与のために製剤化され得る。
本発明は、本発明の範囲を限定するのではなく本発明を例示するために提供される以下の実施例を参照することによってより容易に理解されるであろう。
実施例1
遺伝子修飾されたサッカロミセス・セレビシアエ宿主細胞
遺伝子カセット(天然のプロモーターおよびターミネーターを含む)を、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅させ、相同的組換えによって、示される標的部位(表1)に組み込んだ。
遺伝子修飾されたサッカロミセス・セレビシアエ宿主細胞
遺伝子カセット(天然のプロモーターおよびターミネーターを含む)を、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅させ、相同的組換えによって、示される標的部位(表1)に組み込んだ。
チオール含量の判定。単独または組み合わせで、これらの構築物を含む株の5ミリリットル培養物を、32℃で、200rpmの振盪フラスコにおいて、規定培地で18時間増殖させた。次いで、エルマン試薬を使用して総チオールの測定を行った。
株は、CYS4の2つのコピーを付加した場合に、1.2倍多いチオールを産生したが、この効果は、CYS4.353を使用した場合に、有意により顕著であり、1.7倍のチオール含量の増加があった。Yap1pの構成的発現により、1.3倍の総チオール含量の増加があり、CYS4.353と組み合わせた場合には1.8倍であった。
構成的に活性なYap1pのさらなるコピー、CYS4.353のさらなるコピー、ならびにGSH1およびGSH2の余分なコピーを発現する追加の株を、設計した(3つの遺伝子は、Yap1pによって正に制御される)。GSH1およびGSH2は、中立的組込み部位に付加した。すべての遺伝子は、天然のプロモーターおよびターミネーターの制御下にある。親株と比較した、結果として得られる総チオール(見かけのGSH)の増加を、図1に表し、表2に示す。
無添加(市販のクリーム)、システインのみを添加(市販のクリーム+Cys)、またはシステインおよびグリシンの両方を添加(市販のクリーム+Cys+Gly)の工業用20L発酵槽中で増殖させた後、SIL068株から不活性な乾燥酵母を産生した。遊離システイン、γ−GC、および真のGSHの分布を正確に測定するために、HPLCを使用してチオールを定量化し、結果を、図2に示す。興味深いことに、工業条件下において糖蜜中で増殖させたSIL068は、1.6%の真のGSH含量を示した(1.9%の総チオール)。システインおよびグリシンを添加すると、真のGSHは、4.8%まで増加し得る(6.3%の総チオール)。
CYS3の追加のコピーを、CYS4(SIL016)またはCYS4.353(SIL020)の余分なコピーとともに含む追加の株を、構築した(表1)。このような株は、単にCYS4またはCYS4.353を過剰発現するものと比較して、見かけのGSH含量の増加を示さなかった(図1、表2)。
不活性な乾燥酵母(IDY)を、システインまたはシステインおよびグリシンの添加によって繁殖させた市販のクリームから産生した。IDYを、標準的なノータイムドウのレシピを使用して、バゲットにおいて、そのパン生地緩和作用について試験した。緩和作用は、バゲットを測定することによって評価する(生地緩和作用が高いほど、バゲットは長くなる)。
この試験に使用したSIL068 IDY1(システインおよびグリシンで繁殖させたSIL068株で不活性な乾燥酵母を作製することによって得た)は、4.92%の真のGSHが測定され、総チオールについては6%であった。SIL068 IDY2(システインのみで繁殖させたSIL068株で不活性な乾燥イーストを作製することによって得た)は、1.9%の真のGSHが測定され、総チオールについては5.7%であった。使用したIDYの量は、Fermaid−SR(商標)市販製品からの総チオール量を反映するように、必要に応じて調節したが、これは、特定のロットでは、17%総チオールであることが測定された。
図3および以下の表3において見られるように、いずれのSIL068 IDYも、総チオール含量に比例する生地緩和作用を有する。サンプルの生地緩和性能は、その見かけのGSH含量と関連すると見られる。
組換え宿主細胞におけるGSH含量をさらに増加させるために、GLY1の役割をさらに調査した。遺伝子修飾された酵母株SIL061は、構成的プロモーターの制御下にあるGSH1の8つの余分なコピー、構成的プロモーターの制御下にあるGSH2の2つの余分なコピー、および内因性CYS4プロモーターの制御下にあるCYS4.353の2つのコピーを含む。SIL061は、構成的プロモーターの制御下にあるGLY1の4つの追加のコピーを含むように、さらに操作した(SIL143)。1mMのシステインを添加した最小培地において増殖させると、GLY1の余分なコピーが、中間体γ−GCからGSHへの60%を上回る変換をもたらした(図4)。
実施例2
遺伝子修飾されたピキア・パストリス宿主細胞
実施例1の遺伝子修飾が、他の属に適用できるかどうかを判定するために、遺伝子修飾されたP.パストリス宿主細胞を作製した。遺伝子カセット(天然のプロモーターおよびターミネーターを含む)を、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅させ、相同的組換えによって、示される標的部位(表2)に組み込んだ。
遺伝子修飾されたピキア・パストリス宿主細胞
実施例1の遺伝子修飾が、他の属に適用できるかどうかを判定するために、遺伝子修飾されたP.パストリス宿主細胞を作製した。遺伝子カセット(天然のプロモーターおよびターミネーターを含む)を、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅させ、相同的組換えによって、示される標的部位(表2)に組み込んだ。
野生型または遺伝子修飾されたP.パストリスの5ミリリットル培養物を、32℃で、200rpmの振盪フラスコにおいて、規定培地で18時間増殖させた。エルマン試薬を使用して、チオールを誘導体化させ、実施例1に記載されるように、HPLCによって定量化した。
野生型CYS4を有する株(SIL148)は、野生型株と比較して、総チオール含量に改善を示さない。しかしながら、図5に示されるように、CYS4.340を発現する株(SIL150)は、真のGSH含量に1.58倍の増加を有する。これは、変異型CYS4(制御ドメインを有さないCys4pをコードする)が、コマガタエラ(Komagataella)属におけるGSH産生に肯定的な作用を有することを示す。
YAP1の余分なコピーを有する株SIL151は、野生型X−33と比較して、GSH含量に1.39倍の増加を示す。変異型YAP1、YAP1.C414Dの余分なコピーを株SIL153に組み込むことにより、GSH産生がX−33のものより2.07倍増加し、したがって、野生型YAP1よりも有意に多い。株SIL153は、株SIL151よりも真のGSH含量に1.48倍の増加を示した。これは、変異型YAP1が、コマガタエラ属におけるGSH産生に肯定的な作用を有することを示す。
本発明は、その特定の実施形態に関連して記載されているが、特許請求の範囲が、実施例に記載される好ましい実施形態によって限定されるものではなく、全体として記述に一致する最も広範な解釈が与えられるべきであることを、理解されたい。
(参考文献)
(参考文献)
Claims (49)
- グルタチオンを製造するプロセスであって、遺伝子修飾された宿主細胞で基質を発酵させてグルタチオンを含む発酵混合物を得るステップを含み、前記遺伝子修飾された宿主細胞が、
・野生型Cys4pと比較して生物学的活性が増加した変異型シスタチオニンβ−シンターゼタンパク質(Cys4p)をコードする第1の異種核酸分子、
・野生型Yap1pと比較して核から細胞質に転位する能力が低下した変異型Yap1pをコードする第2の異種核酸分子、および/または
・スレオニンアルドラーゼタンパク質(Gly1p)をコードする第3の異種核酸分子
のうちの少なくとも1つを有する、プロセス。 - 前記遺伝子修飾された宿主細胞が、前記第1の異種核酸分子と、前記第2の核酸分子または前記第3の異種核酸分子のうちの少なくとも1つとを有する、請求項1に記載のプロセス。
- 前記変異型Cys4pが、前記野生型Cys4pの断片である、請求項1または2に記載のプロセス。
- 前記変異型Cys4pが、前記野生型Cys4pから1つまたは複数のC末端アミノ酸残基を欠失させることによって得られる、請求項3に記載のプロセス。
- 前記変異型Cys4pが、前記野生型Cys4pから制御ドメインを欠失させることによって得られる、請求項4に記載のプロセス。
- 前記変異型Cys4pが、配列番号2のアミノ酸配列からなる、請求項5に記載のプロセス。
- 前記遺伝子修飾された宿主細胞において、前記野生型Cys4pをコードする天然の核酸分子の少なくとも1つのコピーが、前記第1の異種核酸分子によって置換される、請求項1から6のいずれか一項に記載のプロセス。
- 前記遺伝子修飾された宿主細胞が、前記第1の異種核酸分子の少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、または少なくとも4つのコピーを含む、請求項1から6のいずれか一項に記載のプロセス。
- 前記変異型Yap1pが、前記野生型Yap1pと比較した場合、少なくとも1つのアミノ酸置換を有する、請求項1から8のいずれか一項に記載のプロセス。
- 前記少なくとも1つのアミノ酸置換が、前記野生型Yap1pのシステインリッチドメインに対応するドメインに位置する、請求項9に記載のプロセス。
- 前記変異型Yap1pが、前記野生型Yap1pの前記システインリッチドメインに対応する前記ドメイン中のシステイン残基を親水性アミノ酸残基で置換することによって得られる、請求項10に記載のプロセス。
- 前記親水性アミノ酸残基が、アスパラギン酸残基である、請求項11に記載のプロセス。
- 前記置換システイン残基が、配列番号3の残基626に対応する位置に位置する、請求項11または12に記載のプロセス。
- 前記変異型Yap1pが、配列番号4または配列番号5のアミノ酸配列を含む、請求項13に記載のプロセス。
- 前記遺伝子修飾された宿主細胞において、前記野生型Yap1pをコードする天然の核酸分子の少なくとも1つのコピーが、前記第2の異種核酸分子によって置換される、請求項1から14のいずれか一項に記載のプロセス。
- 前記遺伝子修飾された宿主細胞が、前記第2の異種核酸分子の少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、または少なくとも4つのコピーを含む、請求項1から15のいずれか一項に記載のプロセス。
- 前記遺伝子修飾された宿主細胞が、前記第3の異種核酸分子の少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、または少なくとも4つのコピーを含む、請求項1から16のいずれか一項に記載のプロセス。
- 前記遺伝子修飾された宿主細胞が、
・前記第1の異種核酸分子および前記第2の異種核酸分子、
・前記第1の異種核酸分子および前記第3の異種核酸分子、
・前記第2の異種核酸分子および前記第3の異種核酸分子、または
・前記第1の異種核酸分子、前記第2の異種核酸分子、および前記第3の異種核酸分子
を含む、請求項1から17のいずれか一項に記載のプロセス。 - 前記発酵混合物を、酵母抽出物または酵母加水分解物に加工するステップをさらに含む、請求項1から18のいずれか一項に記載のプロセス。
- 前記発酵混合物から前記遺伝子修飾された宿主細胞を精製するステップをさらに含む、請求項1から19のいずれか一項に記載のプロセス。
- 前記発酵混合物からの前記遺伝子修飾された宿主細胞を不活性化するステップをさらに含む、請求項1から19のいずれか一項に記載のプロセス。
- 前記発酵混合物からグルタチオンを精製するステップをさらに含む、請求項1から21のいずれか一項に記載のプロセス。
- 前記遺伝子修飾された宿主細胞が、遺伝子修飾された酵母宿主細胞である、請求項1から22のいずれか一項に記載のプロセス。
- 前記遺伝子修飾された酵母宿主細胞が、サッカロミセス属に由来する、請求項23に記載のプロセス。
- 前記遺伝子修飾された酵母宿主細胞が、サッカロミセス・セレビシアエ種に由来する、請求項24に記載のプロセス。
- 請求項1から25のいずれか一項に記載のプロセスによって得ることができる発酵基質。
- 請求項19に記載のプロセスによって得ることができる酵母抽出物または酵母加水分解物。
- 請求項20に記載のプロセスによって得られる精製された遺伝子修飾された宿主細胞。
- 請求項21に記載のプロセスによって得られる不活性化された遺伝子修飾された宿主細胞。
- 遺伝子修飾された宿主細胞であって、
・野生型Cys4pと比較して生物学的活性が増加した変異型シスタチオニンβ−シンターゼタンパク質(Cys4p)をコードする第1の異種核酸分子、
・野生型Yap1pと比較して核から細胞質に転位する能力が低下した変異型Yap1pをコードする第2の異種核酸分子、および/または
・スレオニンアルドラーゼタンパク質(Gly1p)をコードする第3の異種核酸分子
のうちの少なくとも2つを含む、遺伝子修飾された宿主細胞。 - 前記第1の異種核酸分子と、前記第2の異種核酸分子または前記第3の異種核酸分子のうちの少なくとも1つとを含む、請求項30に記載の遺伝子修飾された宿主細胞。
- 前記変異型Cys4pが、前記野生型Cys4pの断片である、請求項30または31に記載の遺伝子修飾された宿主細胞。
- 前記変異型Cys4pが、前記野生型Cys4pから1つまたは複数のC末端アミノ酸残基を欠失させることによって得られる、請求項32に記載の遺伝子修飾された宿主細胞。
- 前記変異型Cys4pが、前記野生型Cys4pから制御ドメインを欠失させることによって得られる、請求項33に記載の遺伝子修飾された宿主細胞。
- 前記変異型Cys4pが、配列番号2のアミノ酸配列からなる、請求項34に記載の遺伝子修飾された宿主細胞。
- 前記野生型Cys4pをコードする天然の核酸分子の少なくとも1つのコピーが、前記第1の異種核酸分子によって置換される、請求項30から35のいずれか一項に記載の遺伝子修飾された宿主細胞。
- 前記第1の異種核酸分子の少なくとも2つ、少なくとも3つ、または少なくとも4つのコピーを含む、請求項30から36のいずれか一項に記載の遺伝子修飾された宿主細胞。
- 前記変異型Yap1pが、前記野生型Yap1pと比較した場合、少なくとも1つのアミノ酸置換を有する、請求項30から37のいずれか一項に記載の遺伝子修飾された宿主細胞。
- 前記少なくとも1つのアミノ酸置換が、前記野生型Yap1pのシステインリッチドメインに対応するドメインに位置する、請求項38に記載の遺伝子修飾された宿主細胞。
- 前記変異型Yap1pが、前記野生型Yap1pの前記システインリッチドメインに対応する前記ドメイン中のシステイン残基を親水性アミノ酸残基で置換することによって得られる、請求項39に記載の遺伝子修飾された宿主細胞。
- 前記親水性アミノ酸残基が、アスパラギン酸残基である、請求項40に記載の遺伝子修飾された宿主細胞。
- 前記置換システイン残基が、配列番号3の残基626に対応する位置に位置する、請求項40または41に記載の遺伝子修飾された宿主細胞。
- 前記変異型Yap1pが、配列番号4または配列番号5のアミノ酸配列を含む、請求項42に記載の遺伝子修飾された宿主細胞。
- 前記野生型Yap1pをコードする天然の核酸分子の少なくとも1つのコピーが、前記第2の異種核酸分子によって置換される、請求項30から43のいずれか一項に記載の遺伝子修飾された宿主細胞。
- 前記第2の異種核酸分子の少なくとも2つ、少なくとも3つ、または少なくとも4つのコピーを含む、請求項30から44のいずれか一項に記載の遺伝子修飾された宿主細胞。
- 前記第3の異種核酸分子の少なくとも2つ、少なくとも3つ、または少なくとも4つのコピーを含む、請求項30から45のいずれか一項に記載の遺伝子修飾された宿主細胞。
- 遺伝子修飾された酵母宿主細胞である、請求項30から46のいずれか一項に記載の遺伝子修飾された宿主細胞。
- 前記遺伝子修飾された酵母宿主細胞が、サッカロミセス属に由来する、請求項47に記載の遺伝子修飾された宿主細胞。
- 前記遺伝子修飾された酵母宿主細胞が、サッカロミセス・セレビシアエ種に由来する、請求項48に記載の遺伝子修飾された宿主細胞。
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