JP2019506899A - 分化細胞からの腎細胞の作製方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(1)分化細胞にHnf1bおよびPax8を過剰発現させることを含む、腎細胞の作製方法。
(2)前記分化細胞にEmx2および/またはHnf4aを過剰発現させることをさらに含む、項(1)の方法。
(3)前記分化細胞にEmx2、Hnf1bおよびPax8を過剰発現させることを含む、項(1)または(2)の方法。
(4)前記分化細胞にHnf4a、Hnf1bおよびPax8を過剰発現させることを含む、項(1)または(2)の方法。
(5)前記分化細胞にEmx2、Hnf4a、Hnf1bおよびPax8を過剰発現させることを含む、項(1)〜(4)のいずれか1項の方法。
(6)腎細胞が腎尿細管細胞である、項(1)〜(5)のいずれか1項の方法。
(7)腎細胞が腎尿細管上皮細胞である、項(1)〜(5)のいずれか1項の方法。
(8)分化細胞が哺乳動物細胞である、項(1)〜(7)のいずれか1項の方法。
(9)分化細胞がヒト細胞である、項(1)〜(8)のいずれか1項の方法。
(10)分化細胞が線維芽細胞である、項(1)〜(9)のいずれか1項の方法。
(11)線維芽細胞が胚性線維芽細胞である、項(10)の方法。
(12)線維芽細胞が成体線維芽細胞である、項(10)の方法。
(13)分化細胞が、腎臓を冒す障害に関連する遺伝子の改変を有する非ヒト動物から採取されたものである、項(1)〜(12)のいずれか1項の方法。
(14)前記腎臓を冒す障害が、腎尿細管を冒す病態、バーター症候群などの輸送不全、シチノーシス(cytinosis)などの腎尿細管を冒す代謝症候群、ネフロン癆などの繊毛関連疾患、末期腎疾患、嚢胞性腎疾患、多発性嚢胞腎、CAKUT、腎嚢胞性疾患、間質性疾患、腫瘍性腎疾患、腎尿細管疾患、代謝疾患および腎結石症からなる群より選択される、項(13)の方法。
(15)前記遺伝子がPkd1またはPkd2である、項(13)または(14)の方法。
(16)前記改変が、前記遺伝子の構成的ノックアウトまたは条件的ノックアウトである、項(13)〜(15)のいずれか1項の方法。
(17)前記過剰発現させることが、(a)Hnf1bおよびPax8ならびに任意選択でEmx2および/またはHnf4aをコードする1つまたは複数の核酸を準備することと、(b)前記1つまたは複数の核酸を分化細胞に導入して形質導入細胞またはトランスフェクト細胞を得ることと、(c)前記形質導入細胞またはトランスフェクト細胞をHnf1bおよびPax8ならびに任意選択でEmx2および/またはHnf4aの過剰発現が可能な条件下で培養することとを含む、項(1)〜(16)のいずれか1項の方法。
(18)前記1つまたは複数の核酸が、Emx2、Hnf1b、Hnf4a、Pax8またはその組合せをコードしそのコードされた遺伝子の過剰発現の誘導することが可能なプロモーターと作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含む、プラスミドまたはベクターである、項(17)の方法。
(19)前記Emx2が、配列番号1で示されるヌクレオチド配列またはその機能的フラグメントを含む、項(1)〜(18)のいずれか1項の方法。
(20)前記Hnf1bが、配列番号2で示されるヌクレオチド配列またはその機能的フラグメントを含む、項(1)〜(19)のいずれか1項の方法。
(21)前記Hnf4aが、配列番号3で示されるヌクレオチド配列またはその機能的フラグメントを含む、項(1)〜(20)のいずれか1項の方法。
(22)前記Pax8が、配列番号4で示されるヌクレオチド配列またはその機能的フラグメントを含む、項(1)〜(21)のいずれか1項の方法。
(23)前記分化細胞または前記腎細胞の腎臓を冒す障害に関連する少なくとも1つの遺伝子を改変することをさらに含む、項(1)〜(22)のいずれか1項の方法。
(24)前記改変することが、前記腎臓を冒す障害に関連する遺伝子を破壊することを含む、項(23)の方法。
(25)前記腎臓を冒す障害が、腎尿細管を冒す病態、バーター症候群などの輸送不全、シチノーシス(cytinosis)などの腎尿細管を冒す代謝症候群、ネフロン癆などの繊毛関連疾患、末期腎疾患、嚢胞性腎疾患、多発性嚢胞腎、CAKUT、腎嚢胞性疾患、間質性疾患、腫瘍性腎疾患、腎尿細管疾患、代謝疾患および腎結石症からなる群より選択される、項(23)または(24)の方法。
(26)前記遺伝子がPkd1またはPkd2である、項(23)〜(25)のいずれか1項の方法。
(27)項(1)〜(26)のいずれか1項の方法によって得られる、腎細胞。
(28)腎臓を冒す障害に関連する少なくとも1つの遺伝子に改変を有する、項(27)の腎細胞。
(29)前記改変が、前記遺伝子の構成的ノックアウトまたは条件的ノックアウトである、項(28)の腎細胞。
(30)前記腎臓を冒す障害が、腎尿細管を冒す病態、バーター症候群などの輸送不全、シチノーシス(cytinosis)などの腎尿細管を冒す代謝症候群、ネフロン癆などの繊毛関連疾患、末期腎疾患、嚢胞性腎疾患、多発性嚢胞腎、CAKUT、腎嚢胞性疾患、間質性疾患、腫瘍性腎疾患、腎尿細管疾患、代謝疾患および腎結石症からなる群より選択される、項(28)または(29)の腎細胞。
(31)前記遺伝子がPkd1またはPkd2である、項(28)〜(30)のいずれか1項の腎細胞。
(32)項(27)〜(31)のいずれか1項の腎細胞の腎毒性試験、薬理学的スクリーニングまたは疾患モデル化への使用。
(33)前記疾患モデル化が、腎尿細管を冒す病態、バーター症候群などの輸送不全、シチノーシス(cytinosis)などの腎尿細管を冒す代謝症候群、ネフロン癆などの繊毛関連疾患、末期腎疾患、嚢胞性腎疾患、多発性嚢胞腎、CAKUT、腎嚢胞性疾患、間質性疾患、腫瘍性腎疾患、腎尿細管疾患、代謝疾患および腎結石症からなる群より選択される腎臓を冒す障害のモデル化を含む、項(32)の使用。
本発明は、分化細胞に少なくともHnf1bおよびPax8ならびに任意選択でEmx2および/またはHnf4aを過剰発現させることを含む、腎細胞の作製方法に関する。本発明の方法は、分化細胞でのHnf1bおよびPax8の過剰発現を必要とする。好ましくは、Hnf1b、Pax8およびHnf4aを過剰発現させる。より好ましくは、Hnf1b、Pax8およびEmx2を過剰発現させる。最も好ましくは、Emx2、Hnf1b、Pax8およびHnf4aを過剰発現させる。
本明細書で使用される「線維芽細胞」という用語は、間葉起源の細胞を指す。線維芽細胞は結合組織にみられる。線維芽細胞はアクチン−ミオシンフィラメント、マトリックス要素(コラーゲン線維、細網線維線維および弾性線維)ならびにグリコサミノグリカンおよび糖タンパク質を合成し、これらは不定形の細胞間物質として分泌される。線維芽細胞としては、結合組織幹細胞、マトリックス合成細胞およびその他のタンパク質合成細胞、収縮性細胞および貪食細胞が挙げられる。活性な線維芽細胞は、多量に存在する小胞体(ER)、ゴルジ複合体およびリボソームを特徴とする。
本明細書で使用される「腎細胞」という用語は、腎細胞の特徴を有するか、腎臓内に存在するか、または後腎間葉もしくは尿管芽を起源とする細胞を指す。
EMX2遺伝子は、ショウジョウバエの「空の気門」遺伝子のホモログであるホメオボックス含有転写因子をコードする。ヒトのこの遺伝子に関する研究は、3つの組織、すなわち背側終脳、嗅上皮およびウロジェネシャル(urogenetial)系におけるその発現に焦点が当たられてきた。同遺伝子は発生過程で、背側終脳の吻側側方で低く尾側内側で高い勾配で発現し、新皮質を画定された機能領域にパターン化すると考えられている。同遺伝子は胚および成体の嗅上皮にも発現し、そこで真核翻訳開始因子4E(eIF4E)と複合体を形成し、mRNAの輸送または翻訳を調節するものと思われる。発生段階にある泌尿生殖器系では上皮組織に発現し、HOXA10による負の調節を受ける。選択的スプライシングにより、異なるタンパク質をコードする複数の転写産物バリアントが生じる。
E11.5〜E14.5胚の四肢からマウス胚性線維芽細胞を入手し得る。
約1週齢のマウスの尾端から生後マウス線維芽細胞を入手し得る。
約8週齢のマウスの尾端から成体マウス線維芽細胞を入手し得る。
健常な少年、例えば6歳の少年の包皮からヒト包皮線維芽細胞を入手し得る。
胎児皮膚からヒト胎児線維芽細胞を入手し得る(例えば、ScienCell Research Laboratories社から購入することができる)。
結果
腎細胞運命を誘導する転写因子の特定
候補腎臓再ログラミング因子の不偏選択の基準を定めるため(図1a)、本発明者らは、様々な成人ヒト組織のあらゆる既知の転写因子の定量的mRNA発現データを解析した 23 (図1bおよび図8a)。これまでに特定された再プログラミング因子の特徴の1つに、その標的組織における絶対発現量が多く、他の組織と比較しても相対発現量が多いことがある。これらの基準に基づき、55の候補腎臓再プログラミング因子からなるセットを明らかにすることができた。
本発明者らは最初、個々の候補再プログラミング因子または候補再プログラミング因子の組合せが哺乳動物細胞を腎細胞運命に方向付けることができるかどうかを試験した。候補因子は腎臓全体の発現データに基づき予測したものであるため、腎臓の主要な細胞型を構成する尿細管上皮細胞を誘導することを目的とした。
iRECの特徴を明らかにするため、蛍光標示式細胞分取(FACS)によりGFP陽性細胞を単離し、培養して拡大した。iRECは特徴的な上皮の形態を示し、コンフルエントまで増殖させると堅固な上皮層を形成した(図3a)。まばらに播種した細胞は培養2週間後にコロニーを形成し、iRECはクローン形成性の拡大が可能であることが示唆された 17 (図3b)。密に増殖させたiRECでは、腎上皮細胞の特徴の1つであり溶質の輸送および水流入を示すドーム様構造が頻繁にみられた 33 (図3c)。
次に、iRECの転写プロファイル全体をP7 Ksp−Cre mTOM/mGFPマウスからFACSにより単離した初代腎尿細管およびMEFと比較して評価した。マイクロアレイデータの階層的クラスタリング解析から、MEFよりも初代腎尿細管上皮細胞の方がiRECと類似していることがわかった(図4a)。
iRECの全体的なプロファイリングにより、様々なネフロン分節を代表する遺伝子の発現が検出された(図12b)。免疫染色およびフローサイトメトリーでは分節特異的タンパク質の不均一な発現が確認され、iRECには様々な尿細管分節アイデンティティの細胞が含まれることが示唆された(図4gおよび図13c)。
iREC細胞アイデンティティが外因性再プログラミング因子を除去した後も維持されるかどうかを明らかにするため、Ksp−Cre発現時に効率的に削除され得るloxP部位含有プロウイルスにより4つの因子を導入した。培養5週間後、このiRECには、4つの再プログラミング因子の外因性発現はみられなかったものの、上皮の形態および腎マーカー遺伝子の発現は維持されていた(図13f、13g、13h)。
次に、三次元細胞外マトリックスにおけるiRECの挙動の特徴を明らかにした。iRECをMatrigel 3D培養で増殖させたところ、一貫して中央に内腔のある球体を形成した(図5a、5b、5c)。これとは対照的に、MEFは不規則で構造化されていない集塊を形成するにとどまり、明確な組織化はみられなかった。iREC由来の球体は、タイトジャンクションタンパク質ZO−1の頂部局在を伴う強い頂底極性、ファロイジン染色によって示される頂部のアクチン蓄積および基底外側部のβカテニン局在を示した(図5d)。同様に、iRECの基底外側部にNa+/K+−ATPアーゼアルファ1の局在が検出され、メガリン(LRP2)は頂部局在を示し(図5d)、それらの腎尿細管上皮細胞における細胞内局在との一致がみられた。機械感覚チャネルTRPV4が主として頂端膜に検出された。間葉マーカーであるビメンチンの染色はiREC球体には全くみられなかった(図5d)。
急性腎損傷は、シスプラチン、ゲンタマイシンおよびタクロリムスなどの腎毒性物質による高頻度の有害作用として腎尿細管細胞が損傷を受けることにより起こる。3種類の薬物のいずれについても、処理iRECの方がMEFよりもアポトーシスの割合が有意に高かった(図5hおよび図14a)。腎損傷分子1(KIM1)は尿細管損傷に特異的なバイオマーカーであり 41 、ゲンタマイシン処理後にiRECで著明に増大した(図5iおよび図14b)。腎尿細管細胞内へのシスプラチン取込みは、一部が有機カチオン輸送体2(Oct2)により媒介される 42 。Oct2の阻害剤であることが知られているシメチジン 43 1mMとのインキュベーションによって、シスプラチンがiRECに引き起こした毒性を低下させることができたことは注目すべきことである(図5j)。このように、iRECは、尿細管上皮細胞と同様に腎毒性物質に対して応答し、腎毒性試験に使用され得る。
胚腎細胞の単細胞懸濁液は再集合し、尿管芽および初期尿細管などの胚腎構造を含めた腎オルガノイドに自己組織化することができる 44 。iRECがこの能力を共有しているかどうかを試験するため、mTomatoを構成的に発現するE13胚腎臓を分解して単細胞懸濁液とし、GFPを発現するiRECまたはMEFと混合し、次いで再集合させ培養した(図6a)。MEFは尿細管構造に統合されず、主として間質にみられるか、または集合体から排除されることさえあったが、iRECは尿細管上皮構造に統合された(図6b)。ラミニンの免疫染色により、iRECは上皮細胞が隣接する連続的な基底膜層を共有していることが示された(図6c)。iRECおよび天然の尿細管細胞には近位尿細管マーカーのLTLおよびメガリンが同じようにみられ、iRECが腎微小環境内で分化および極性化することが示された(図6c、6d、6e)。このように、iRECは自己組織化腎オルガノイドの形成に関与している可能性がある。
次に、ヒト線維芽細胞も腎上皮細胞運命へ再プログラミングすることが可能であるかどうかを試験した。ヒト線維芽細胞にEMX2、HNF1B、HNF4AおよびPAX8を組み合わせて過剰発現させたところ、マウスiRECに類似した上皮形態を有する細胞が得られた(図7a)。4TFで処理したヒト細胞には、iRECと同程度の膜βカテニン、核PAX2を含めたマーカーの発現および近位尿細管特異的LTLの陽性染色がみられた(図7a)。4TFで処理した後、腎臓の転写因子、接着分子および輸送体のmRNAレベルが線維芽細胞に比してアップレギュレートされた(図7b)。
線維芽細胞のiRECへの再プログラミングをヒト疾患のin vitroモデルの開発に利用できるかどうか評価するため、本発明者らは2つの戦略に従った。最初に、常染色体優性多発性嚢胞腎(ADPKD)のマウスモデルに由来するMEFをiRECへの再プログラミングに用いた。このマウスはloxPが導入されたPkd1対立遺伝子(Pkd1tm2Ggg)を保有し、この対立遺伝子はCreリコンビナーゼ発現時に切除され得る 59 。Pkd1の構成的ノックアウトは胚に致命的なものであるが、このマウスにCreを条件的に導入すると、ヒトに観察される嚢胞性腎疾患表現型が再現されることが示されている 60 。
動物
Xenopus胚を既に記載されている通りに培養し操作した 50 。簡潔に述べれば、雌のカエルにヒト絨毛性ゴナドトロピン(Sigma社)を700単位注射した。翌朝、卵母細胞を収集し、in vitroで受精させた。0.3×Mark改変リンガー液(1M NaCl;20mM KCl;10mM MgCl2;20mM CaCl2;50mM HEPES、pH7.5)中で胚を培養した。段階分けはNieuwkoopおよびFaber(http://xenbase.org)に従った。ジャクソン研究所からGt(ROSA)26Sortm4(ACTB−tdTomato,−EGFP)Luo/Jマウスを購入し(#007676系統起源:B6.129(Cg))、KSP−Cre/+(#012237 B6.Cg)マウスと交配させて腎尿細管上皮細胞を標識した。マウスをSPF施設にて固形飼料および水の自由摂取ならびに12時間の昼夜サイクルで飼育した。繁殖および遺伝子型同定を標準法に従って実施した。動物実験はいずれも、米国国立衛生研究所の「Guide for the Care and Use of Laboratory Animals」およびドイツの動物福祉に関する法律に従って実施され、地方自治体による承認(フライブルク県庁X12/08JおよびX13/08J)を受けたものである。
腎組織が混入しないようE13胚の四肢からマウス胚性線維芽細胞(MEF)を採取した。生後P7マウスおよび成体(P60)マウスから尾端線維芽細胞(TTF)を採取した。解剖用メスで組織を細切し、37℃で30分間、0.25%トリプシン−EDTAで消化した。MEF培地(MEFM:Dulbecco改変Eagle培地(DMEM)、10%ウシ胎児血清(FBS)、2mM L−グルタミン、ペニシリン/ストレプトマイシン)の添加によりトリプシン処理を停止させた。再懸濁後、細胞を遠心分離し、ペレットをMEFMに再懸濁させ、ゼラチンでコートした6ウェルプレート上で3日間、コンフルエントに達するまで平板培養した。qRT−PCR解析に用いる生後ヒト線維芽細胞を包皮から誘導した(HFoF)(倫理委員会番号521/13)。FACS、2D免疫染色および3D免疫染色に用いるヒト胎児皮膚線維芽細胞(HFeF)をScienCell Research Laboratories社(2300)から入手した。10%ウシ胎児血清、2mM L−グルタミンおよびペニシリン/ストレプトマイシンを添加した高グルコースDMEM中でヒト細胞を培養した。MEF、TTFおよびヒト線維芽細胞を液体窒素中で凍結させ、それ以上継代せずに再プログラミング実験に用いた。効率改善実験には、細胞培地に以下の物質を7日間添加した:ビタミンC(Sigma社、50μg/ml);CHIR99021(Sigma社、3μM);フォルスコリン(FocusBiomolecules社、10μM);バルプロ酸(Sigma社、1mM);5−アザシチジン(Sigma社、2μM)。
細胞をAlexa647標識アルブミン(1mg/ml、Life technologies社、A34785)と37℃で0分間、2分間、5分間、10分間、15分間、30分間および60分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を氷冷PBSで5回洗浄してエンドサイトーシスを停止させた。細胞を4%PFAで固定し、40倍レンズを備えたZeiss Axiovert蛍光顕微鏡を用いて撮像した。ImageJソフトウェアを用いて、1時点当たり5つの視野の平均蛍光強度を算出した。
MEFおよびiRECを以下の通りに薬物とインキュベートした:(シスプラチン(Teva社):6μg/mlで24時間;タクロリムス(Invivogen社):40μMで24時間;ゲンタマイシン(Sigma社):1mg/mlで48時間)。上清および付着細胞(トリプシン処理により得た)を収集することにより細胞を回収した。薬物処理細胞および未処理対照を1μg/ml DAPI(Invitrogen社、D1306)で5分間染色し、フローサイトメトリーで405nmレーザーを用いて励起させることにより蛍光を測定した。450/50nmの通過帯域フィルターを用いてDAPI染色細胞および未染色対照の発光を比較することにより死細胞を特定した。Kim−1発現解析では、MEFおよびiRECをゲンタマイシンで処理し(1mg/mlで48時間)、Kim−1を染色し(Miltenyi Biiotec社、130−106−024)、フローサイトメトリーにより解析した。シスプラチン取込み阻害実験では、MEFおよびiRECを未処理で放置するか、または6μg/mlシスプラチン単独もしくは6μg/mlシスプラチンと1mMシメチジン(Sigma−Aldrich社、C4522)とともにインキュベートした。細胞を上記の通りに回収し解析した。実験を3連で実施し、3回反復した。
3D細胞培養を既に記載されている通りにMatrigelで実施した 51 。簡潔に述べれば、細胞をトリプシン処理し、50μmのセルストレーナーに通し、カウントした。10,000個の細胞を低濃度成長因子Matrigel(Corning社、354230)100μlに懸濁させ、8ウェルμ−Slide(上記、80826)に播種した。Matrigelを37℃で15分間重合させた後、腎上皮成長培地(Lonza社、CC−3190)を添加した。7日後または球状体形成が明らかになったとき、細胞を撮像した。免疫蛍光染色用に細胞を4%PFAで固定した。
RNeasy Universal Plus Kit(Qiagen社、73404)を用いて全RNAを単離した。QuantiTect Reverse Transcription Kit(Qiagen社、205311)を用いてRNA 1μgを逆転写した。ROCHE LC480 light cyclerに1/500〜1/50の逆転写反応、遺伝子特異的プライマーおよびSYBR green Takyon mastermix(Eurogentec社、UF−NSCT−B0210)またはSYBR green I master(Roche社、04707516001)を用いてqRT−PCRを実施した。各遺伝子について3つの生物学的レプリケートを解析した。いずれのレプリケートも3回測定した。データ解析では、既に記載されている通りに、2(−デルタC(T))法を用いて相対発現レベルを算出した後、スチューデントのt検定を用いて統計解析を実施した 52 。使用したプライマーの配列を表1に記載する。
Xenopus胚のホールマウントin situハイブリダイゼーションを段階22、26、33および38で実施した。以前記載した通りにジゴキシゲニン−UTP標識アンチセンスプローブを使用した 50 。in situプローブを作製するため、プラスミドを直線化し、T7またはSP6(Roche社、DIG標識キット)で転写した。アルカリホスファターゼとコンジュゲートしたジゴキシゲニンに対する抗体を用いて、結合したプローブを検出した(Roche社、11093274910)。既に記載されている通りにパラフィン包埋マウス腎臓切片のin situハイブリダイゼーションを実施した 53 。簡潔に述べれば、胚または切り取った腎原基を4%パラホルムアルデヒド(PFA)/リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で固定し、エタノール系列で脱水し、パラフィンで包埋して10μmの切片にした。in situハイブリダイゼーションにジゴキシゲニン−UTP標識アンチセンスプローブを使用し、標準的プロトコルに従ってエオシン対比染色を実施した 53 。プローブ合成に使用したプラスミドは、著者から請求に応じて入手可能である。1段階当たり5個超の胚について特異的染色を検出した。WISHは再プログラミング因子を特定するスクリーニングの一環であったため、この実験を1回実施した。
MEFまたはiRECの細胞50個を6ウェルプレートに播種し、14日間増殖させた後、固定し、10%エタノール溶液に溶かした0.1%クリスタルバイオレットで15分間、室温にて染色した。3つの独立した実験の細胞を顕微鏡で目視検査することにより、コロニーをカウントした。
RNeasy Universal Plus Kit(Qiagen社、73404)を用いて、CFP処理対照MEF、GFP分取iRECおよびP6 mTOM/mGFPトランスジェニックマウスから抽出しGFP分取した初代腎KSP−Cre尿細管細胞の全RNAを単離した。いずれの細胞もRNA抽出前に分取を実施した。全RNA試料をAffymetrix WT Plus kit(Ambion社、オースティン、テキサス州、米国)で製造業者による記載通りに処理した。標識したフラグメントをAffymetrixハイブリダイゼーションオーブン645内で45℃、60rpmで16時間、Affymetrix WT Mouse Gene ST 1.0/2.0アレイとハイブリダイズさせた。Hybridization,Wash and Stain Kit(Affymetrix社、米国)を用いて洗浄および染色した後、Affymetrix GeneChip Scanner 3000 7Gでアレイをスキャンし、個々のプローブのシグナル強度値を得た。Affymetrix GeneChip Command Console Software Version 4.0を用いて生データからCELファイルを作成した。本発明者らは、さらなる解析にPartek Genomics Suiteソフトウェアを用いた(Partek社)。対照プローブおよび問合せプローブを含めたCELファイルを取り込んだ。GC含有量およびプローブ配列に合わせて調整するよう予備バックグランド調整を設定し、RMAバックグラウンド補正を実施した。Quantile正規化を用いてアレイを正規化し、Median Polish法を用いてプローブセットの要約を実施した。プローブ値をlog2に変換した。グループ間で差次的に発現した遺伝子を特定するため、Partekで一元ANOVAを実施した。本発明者らは、対比法としてFisherの最小有意差法(LSD)を用いた。アレイの結果はArrayExpress(E−MTAB−3648)に保管されている。
事前にピューロマイシン処理も低バックグラウンドに関する選択も実施していないヒト線維芽細胞h−iREC(4TF、SV40処理、GFP高CDH16レポーター活性に関して分取)またはMEF、4TF、3TF(Pax8を除いたもの)もしくは3TF(Hhnfaを除いたもの)で処理し事前に分取を実施していないMEFからRNA 2μgを単離した。GATC Biotech社(コンスタンツ、ドイツ)にてライブラリー調製およびシーケンシング(Illumina HiSeqシングルリード)を実施した。EBI SRA(ERR030893)からヒト腎臓試料を検索した。galaxy platform 54 を用いて配列リードアライメント(TopHat)を実施し、SeqMonkソフトウェア(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/seqmonk/)を用いてリードカウントを定量化した。階層的クラスタリングの前にグループ間のANOVAにより有意に差次的な発現を算出した。4−1処理細胞の解析では、有意にアップレギュレートされ(p<0.0001、ANOVA)、MEFと4TF処理細胞との間に1log2の差がみられる遺伝子を考慮に入れた。遺伝子をラット尿細管分節のRPKM発現データ 39 に対してマッピングし、近位分節(S1〜3)および集合管(CNT、CCD、OMCDおよびIMCD)における発現量中央値の間の差に従って分類した。関連するRNA−Seqデータはすべて著者から入手可能であり、European Nucleotide Archiveに保管されることになる。
段階39のXenopusおよびE15のマウス胚の腎臓由来の逆転写全RNA単離物のcDNAから完全長またはフラグメントのXenopus転写因子およびマウス転写因子をクローン化した。遺伝子特異的プライマーを用いて転写因子のコード配列を増幅した。PCR産物をpWPXLd(Addgene(番号12258))にクローン化した。レンチウイルスを作製するため、リン酸カルシウムを用いてpWPXLd、pMD2.G(Addgene、番号12559)およびpsPax2(Addgene、番号12260)のプラスミドDNAを293T細胞内に同時トランスフェクトした。トランスフェクションから2日後、既に記載されている通りに、細胞上清を回収し、ポリエチレングリコール沈殿法を用いてウイルスを濃縮した 55 。濃縮したウイルスを−80℃で凍結させ、細胞の形質導入の直前に解凍した。MEF、TTF、HFoFおよびHFeFの感染には、10μg/mlポリブレンを含有するMEFMでウイルス濃縮物を1:100(高ウイルス力価)〜1:1000(低ウイルス力価)に希釈し、細胞を12時間インキュベートした。ウイルス感染を5〜7回反復した。MEFMで7日間培養した後、MEFおよびTTFのGFP発現をフローサイトメトリーにより解析した。最後のウイルス形質導入から14日後、蛍光標示式細胞分取(FACS)によりGFP陽性iRECを単離し、さらなる解析のために拡大させた。最後の形質導入から21〜28日後、CD326+CD90−細胞、CD326+CD133+細胞またはCDH16−GFP+細胞の分取により、再プログラムされたHFeFを特定した。
SDS/PAGEによりタンパク質を分画し、ウエスタンブロットによるタンパク質検出に抗2A−ペプチド抗体(ABS31、Merck Millipore社)を用いた。
細胞をPBSで2回洗浄し、4%パラホルムアルデヒド中、室温で15分間固定した。透過処理では、細胞をPBST(PBS中0.1%のTriton−X−100)と室温で10分間インキュベートした。PBS中、2%ウマ血清、5%BSA、1%キンギョゼラチンで1時間ブロックした後、細胞を一次抗体と室温で60分間インキュベートし、次いで、暗所にて二次蛍光コンジュゲート抗体と室温で60分間インキュベートした。PBSで1:2,000に希釈したヘキスト33342でDNAを染色した。ブロッキング溶液10%を含有するPBSで一次抗体および二次抗体を希釈した。免疫蛍光染色に使用した抗体は以下の通りである:β−カテニン(Santa−Cruz社、sc7199、1:100)、Eカドヘリン(Invitrogen社、13−1900、1:100)、Epcam(Abcam社、ab71916、1:100)、ラミニン(Sigma社、L9393、1:100)、tetragonolobusレクチン(LTL)(Biozol社、B−1325、1:100)、メガリン(Santa−Cruz社、sc16478、1:100)、Na+K+−ATPアーゼ(Abcam社、ab7671、1:100)、PAX2(Abcam社、ab37129、1:100)、ファロイジン(Mol.Probes社、A22287、1:100)、TRPV4(Alomone社、acc−034、1:100)、ビメンチン(Sigma社、V2258、1:100)、ZO−1(Santa−Cruz社、sc33725、1:100)、PDZK1(Sigma Aldrich社/Atlas Antibodies社、HPA006155m、1:100)、Bst1(BioLegend社、BP−3、1:100)、FETUB(GeneTex社、GTX112260、1:100)。
フローサイトメトリー解析では、細胞を回収し、FACS緩衝液(3%FBSおよび5mM EDTAを添加したPBS)に再懸濁させ、50μmのセルストレーナーでろ過し、13色LCR Fortessa FACS解析装置(Becton Dickinson社)を用いて解析した。GFP陽性細胞の選択には、ARIA IIIまたはARIAFusion細胞分取装置(Becton Dickinson社)を用いた。FlowJoソフトウェア(FlowJo社)またはFACS DIVAソフトウェア(Becton Dickinson社)によりデータを解析した。マウス細胞およびヒト細胞の分取または解析には、以下の抗体を製造業者の指示に従って使用した:抗マウスCD90 Alexa 647(Biolegend社、105317)、抗マウスCD326 BV421(BD Bioscience社、563214)、抗マウスCD324 Alexa 647(Biolegend社、147308)、抗マウスCD157 APC(Biolegend社、140207)、抗マウスKi−67 APC(Biolegend社、652406)、抗ヒトCD90 FITC(MACS Miltenyi Biotec、130−097−930)、抗ヒトCD326 BV421(BD Bioscience社、563180)、 抗ヒトCD133 PE(Miltenyi Biotec社、130−098−046)。Eカドヘリンを染色する前に、Nunc Up Cell Surface細胞培養プレート(Sigma社、Z688800−6CS)上で細胞を増殖させ、トリプシン消化を実施せずに回収した。実験を良好に少なくとも3回反復した。
既に記載されている通りに腎臓の再集合を実施した 56 。簡潔に述べれば、E13胚マウス腎臓を20個回収し消化した。胚腎細胞80,000個をiRECまたは対照細胞8,000個と混合し、遠心分離によりペレット化した。ペレットを低結合性PCRチューブに移し、37℃で一晩集合させた。翌日、細胞集合体をtranswellフィルター(Costar社、3450)に移し、37℃、5%CO2で4日間培養した。再集合体を4%PFAで固定し、染色し、共焦点顕微鏡法により撮像した。
再細胞化実験 45 では、野生型の成体ラットまたは成体マウスの死体腎をヘパリン化PBS(10U/ml;Sigma社、H3393)で10回洗い流し、次いで、SDS(Roth社、2326.3)の1%PBS溶液中、脱細胞化が観察されるまで3〜5日間インキュベートした。この期間の間、6〜12時間毎に腎臓をSDSの1%PBS溶液で繰り返し洗浄した。次いで、脱細胞化した腎臓をペニシリン/ストレプトマイシンと100μg/ml Normocin(Invivogen社)とを含有するPBSで5回すすいだ。トリプシン処理した細胞106個を25G針で注入することにより臓器足場内にiRECを播種した後、MEFMで14日間培養した。検出器が高感度の740nmの2光子レーザーで自家蛍光を励起することにより細胞外マトリックスを可視化した。
25倍/0.8LD LCI−Plan−Apochromat対物レンズを備えたLSM−I−NLO2 510 META顕微鏡(ともにCarl Zeiss社)を用いて共焦点撮像を実施した。フルオロフォア(ヘキスト33342、GFP、トマト、Alexa647)の励起を740nmの2光子レーザーならびにそれぞれ488nm、561nmおよび633nmの単一光子レーザーで実施した。ZENソフトウェア(Zeiss社)およびImarisソフトウェア(Bitplane社)を用いて画像解析を実施した。
MEFおよびiRECの3D培養物を0.1Mリン酸緩衝液中、4%PFAおよび1%グルタルアルデヒドで1時間、室温にて固定した。0.1M PBで洗浄した後、培養物を70%エタノール中、45分間の1%OsO4(Sigma−Aldrich社、ドイツ)および1%酢酸ウラニル(Polysciences社、ドイツ)を用いてコントラストをつけた。脱水後、培養物をDurcupan(Sigma−Aldrich社、ドイツ)に平板包埋した。Philipps CM100透過型電子顕微鏡を用いて超薄切片(厚さ40nm)を解析した。
様々なヒト組織のあらゆる転写因子に関する定量的発現データ 23 を解析して、候補再プログラミング因子を特定した。標的組織での絶対発現量を他の全組織の中央値で除して相対発現量を求めた。転写回路解析を既に記載されている通りに実施し 37 、オンラインプラットフォームhttp://www.regulatorynetworks.org/を用いて再プログラミング因子の予測転写標的を検索した。マイクロアレイ実験のMEFとiRECとの間の差次的発現の値を各標的にマッピングし、Cytoscapeを用いて可視化した 57 。オンラインプラットフォームhttp://cellnet.hms.harvard.edu/を用いてCellNetスコアを算出した 34 。差次的に調節された遺伝子と公開されているRNAseqデータとの比較では、マイクロアレイ解析に基づきiRECとMEFとの間で10倍差次的に調節された遺伝子に生データ 35、36 をマッピングした。分子機能のGOターム解析では、10倍差次的に調節された遺伝子をDAVIDプラットフォームを用いて解析した 58 。SigmaStatを用いて統計解析を実施し、GraphPadPrismでグラフを作成した。スチューデントのt検定を用いたとき、データは正規分布を示した。複数のグループをANOVAにより比較する場合、分散の差を求めた。Microsoft Excelでデータ解析を実施した。
上記の通りに、E13.5胚(Pkd1tm2Ggg)からPkd1fl/flMEFを単離し再プログラミングを実施した。CreリコンビナーゼおよびフリッパーゼをpWPXLdにサブクローン化し、レンチウイルスにより形質導入した。Aria Fusion Cell Sorterを用いて96ウェルプレート内へのクローン選択を実施した。Pkd2のCRISPR/Cas9標的化には、プライマー5’−cac cgt gcc tgg agc agg acg aaa g−3’(配列番号63)および5’−cac cgt gcc tgg agc agg acg aaa g−3’(配列番号64)を用いて、Pkd2の第一エキソンを標的とするlentiGuide−Puro構築物を作製した。これらの構築物をlentiCas9−BlastとともにレンチウイルスによりiRECに発現させた。プライマー:5’−gccatggttaactccagacg−3’(配列番号65)および5’−gcgcaggcagttgtcaag−3’(配列番号66)を用いてゲノム遺伝子座を増幅した。PCR産物にサンガーシーケンシングを実施して、標的側の後ろにインデル形成の成功を示す不規則でスクランブル状のクロマトグラムを検出した。
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Claims (31)
- 分化細胞にHnf1bおよびPax8を過剰発現させることを含む、腎細胞の作製方法。
- 前記分化細胞にEmx2および/またはHnf4aを過剰発現させることをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記分化細胞にEmx2、Hnf1bおよびPax8を過剰発現させることを含む、請求項1または2に記載の方法。
- 前記分化細胞にHnf4a、Hnf1bおよびPax8を過剰発現させることを含む、請求項1または2に記載の方法。
- 前記分化細胞にEmx2、Hnf4a、Hnf1bおよびPax8を過剰発現させることを含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記腎細胞が腎尿細管細胞である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記腎細胞が腎尿細管上皮細胞である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記分化細胞が線維芽細胞である、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記線維芽細胞が胚性線維芽細胞である、請求項8に記載の方法。
- 前記線維芽細胞が成体線維芽細胞である、請求項8に記載の方法。
- 前記分化細胞が、腎臓を冒す障害に関連する遺伝子の改変を有する非ヒト動物から採取されたものである、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記腎臓を冒す障害が、腎尿細管を冒す病態、バーター症候群などの輸送不全、シチノーシス(cytinosis)などの腎尿細管を冒す代謝症候群、ネフロン癆などの繊毛関連疾患、末期腎疾患、嚢胞性腎疾患、多発性嚢胞腎、CAKUT、腎嚢胞性疾患、間質性疾患、腫瘍性腎疾患、腎尿細管疾患、代謝疾患および腎結石症からなる群より選択される、請求項11に記載の方法。
- 前記遺伝子がPkd1またはPkd2である、請求項11または12に記載の方法。
- 前記改変が、前記遺伝子の構成的ノックアウトまたは条件的ノックアウトである、請求項11〜13のいずれか1項に記載の方法。
- 前記過剰発現させることが、(a)Hnf1bおよびPax8ならびに任意選択でEmx2および/またはHnf4aをコードする1つまたは複数の核酸を準備することと、(b)前記1つまたは複数の核酸を前記分化細胞に導入して形質導入細胞またはトランスフェクト細胞を得ることと、(c)前記形質導入細胞またはトランスフェクト細胞をHnf1bおよびPax8ならびに任意選択でEmx2および/またはHnf4aの過剰発現が可能な条件下で培養することとを含む、請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法。
- 前記1つまたは複数の核酸が、Emx2、Hnf1b、Hnf4a、Pax8またはその組合せをコードし前記コードされた遺伝子の過剰発現の誘導することが可能なプロモーターと作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含む、プラスミドまたはベクターである、請求項15に記載の方法。
- 前記Emx2が、配列番号1で示されるヌクレオチド配列またはその機能的フラグメントを含む、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法。
- 前記Hnf1bが、配列番号2で示されるヌクレオチド配列またはその機能的フラグメントを含む、請求項1〜17のいずれか1項に記載の方法。
- 前記Hnf4aが、配列番号3で示されるヌクレオチド配列またはその機能的フラグメントを含む、請求項1〜18のいずれか1項に記載の方法。
- 前記Pax8が、配列番号4で示されるヌクレオチド配列またはその機能的フラグメントを含む、請求項1〜19のいずれか1項に記載の方法。
- 前記分化細胞または前記腎細胞の腎臓を冒す障害に関連する少なくとも1つの遺伝子を改変することをさらに含む、請求項1〜20のいずれか1項に記載の方法。
- 前記改変することが、前記腎臓を冒す障害に関連する遺伝子を破壊することを含む、請求項21に記載の方法。
- 前記腎臓を冒す障害が、腎尿細管を冒す病態、バーター症候群などの輸送不全、シチノーシス(cytinosis)などの腎尿細管を冒す代謝症候群、ネフロン癆などの繊毛関連疾患、末期腎疾患、嚢胞性腎疾患、多発性嚢胞腎、CAKUT、腎嚢胞性疾患、間質性疾患、腫瘍性腎疾患、腎尿細管疾患、代謝疾患および腎結石症からなる群より選択される、請求項21または22に記載の方法。
- 前記遺伝子がPkd1またはPkd2である、請求項21〜23のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1〜24のいずれか1項に記載の方法によって得られる、腎細胞。
- 腎臓を冒す障害に関連する少なくとも1つの遺伝子に改変を有する、請求項25に記載の腎細胞。
- 前記改変が、前記遺伝子の構成的ノックアウトまたは条件的ノックアウトである、請求項26に記載の腎細胞。
- 前記腎臓を冒す障害が、腎尿細管を冒す病態、バーター症候群などの輸送不全、シチノーシス(cytinosis)などの腎尿細管を冒す代謝症候群、ネフロン癆などの繊毛関連疾患、末期腎疾患、嚢胞性腎疾患、多発性嚢胞腎、CAKUT、腎嚢胞性疾患、間質性疾患、腫瘍性腎疾患、腎尿細管疾患、代謝疾患および腎結石症からなる群より選択される、請求項26または27に記載の腎細胞。
- 前記遺伝子がPkd1またはPkd2である、請求項26〜28のいずれか1項に記載の腎細胞。
- 請求項25〜29のいずれか1項の腎細胞の腎毒性試験、薬理学的スクリーニングまたは疾患モデル化への使用。
- 前記疾患モデル化が、腎尿細管を冒す病態、バーター症候群などの輸送不全、シチノーシス(cytinosis)などの腎尿細管を冒す代謝症候群、ネフロン癆などの繊毛関連疾患、末期腎疾患、嚢胞性腎疾患、多発性嚢胞腎、CAKUT、腎嚢胞性疾患、間質性疾患、腫瘍性腎疾患、腎尿細管疾患、代謝疾患および腎結石症からなる群より選択される腎臓を冒す障害のモデル化を含む、請求項30に記載の使用。
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