JP2019503171A - ヒトα−N−アセチルガラクトサミニダーゼポリペプチド - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、広く酵素補充治療(ERT)の分野にあり、より正確には、リソソーム蓄積症(LSD)の処置における使用のためのポリペプチド産物の分野にある。特に、本発明は、ヒトα−N−アセチルガラクトサミニダーゼ(NAGAL)ポリペプチド産物および関連産物、使用ならびに方法に関する。
リソソーム蓄積症(LSD)は、リソソームにおける貯蔵産物の分解に関与する異化酵素の活性が損なわれたことに起因する、そのような貯蔵産物の蓄積を特徴とする遺伝性代謝障害の多様な群である。貯蔵産物の蓄積は、細胞機能不全および進行性の臨床所見をもたらす。リソソーム酵素活性、特にリソソームヒドロラーゼ活性における欠損は、投与された酵素が、罹患細胞のリソソームに効果的に標的化され得ることを条件として、酵素補充治療(ERT)によって修正され得る。現時点では、ERTは、LSD、特に全身LSDを処置するための介入の好ましい方針である。
本発明者らは、真菌細胞において、ヒトα−Gal A自体ではなく、増加したα−ガラクトシダーゼ(α−Gal A)活性を有するヒトα−N−アセチルガラクトサミニダーゼ(NAGAL)酵素を産生することによって、上述の問題に対処しようとした。ヒトNAGAL遺伝子は、ヒトα−Gal Aをコードする遺伝子と密接に関連している。それらのコードされたタンパク質は、46%の配列同一性を共有し、類似のフォールディングを有するが、異なる基質特異性を有する(Tomasicら、2010年、J. Biol. Chem.、285巻(28号):21560〜6頁)。2つのアミノ酸置換(Ser188GluおよびAla191Leu、ヒトNAGALの出発メチオニンから始まる番号付け)をヒトNAGALの活性部位中に導入することによって、増加したα−ガラクトシダーゼ活性を有する酵素が取得されたことが、他者によって以前に示されている(Tajimaら、2009年、Am J Hum Genet.、85巻(5号):569〜80頁;Tomasicら、2010年、上記)。この変更されたNAGALは、α−Gal Aよりも高い血漿安定性を示し、α−Gal Aに対する抗体を含むファブリー患者の血清に対する免疫反応性を示さなかった。
配列番号1に示されるヒトNAGALポリペプチドのアスパラギン213に対応する第1のアミノ酸が、1つまたは複数のアミノ酸によって置換されている;または
配列番号1に示されるヒトNAGALポリペプチドのシステイン326に対応する第2のアミノ酸が、1つまたは複数のアミノ酸によって置換されている;または
配列番号1に示されるヒトNAGALポリペプチドのアスパラギン213に対応する第1のアミノ酸が、1つまたは複数のアミノ酸によって置換され、配列番号1に示されるヒトNAGALポリペプチドのシステイン326に対応する第2のアミノ酸が、1つまたは複数のアミノ酸によって置換されている、ヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を提供する。
1つまたは複数のアミノ酸のうち少なくとも1つが、配列番号1に示されるヒトNAGALポリペプチドのシステイン326に対応する第2のアミノ酸と直接的または間接的に相互作用することが可能であるように、配列番号1に示されるヒトNAGALポリペプチドのアスパラギン213に対応する第1のアミノ酸が、前記1つまたは複数のアミノ酸によって置換されている;または
1つまたは複数のアミノ酸のうち少なくとも1つが、配列番号1に示されるヒトNAGALポリペプチドのアスパラギン213に対応する第1のアミノ酸と直接的または間接的に相互作用することが可能であるように、配列番号1に示されるヒトNAGALポリペプチドのシステイン326に対応する第2のアミノ酸が、前記1つまたは複数のアミノ酸によって置換されている;または
第1のアミノ酸を置換する前記1つまたは複数のアミノ酸のうち少なくとも1つが、第2のアミノ酸を置換する前記1つまたは複数のアミノ酸のうち少なくとも1つと直接的または間接的に相互作用することが可能であるように、配列番号1に示されるヒトNAGALポリペプチドのアスパラギン213に対応する第1のアミノ酸が、1つまたは複数のアミノ酸によって置換され、配列番号1に示されるヒトNAGALポリペプチドのシステイン326に対応する第2のアミノ酸が、1つまたは複数のアミノ酸によって置換されている、ヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を提供する。
− 本明細書に教示されるヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片をコードする核酸配列を含む核酸分子。
− 本明細書に定義される核酸分子とこの核酸分子に作動可能に連結したプロモーターとを含む、発現カセットまたは発現ベクター。
治療における使用のための、本明細書に定義される核酸分子または本明細書に定義される発現カセットもしくは発現ベクター。
ファブリー病を処置する方法における使用のための、またはシンドラー病もしくは神崎病を処置する方法における使用のための、本明細書に定義される核酸分子または本明細書に定義される発現カセットもしくは発現ベクター。
かかる処置を必要とするヒト対象においてファブリー病を処置する方法またはシンドラー病もしくは神崎病を処置する方法であって、本明細書に定義される核酸分子または本明細書に定義される発現カセットもしくは発現ベクターの治療有効量を前記対象に投与するステップを含む方法。
本明細書に定義される核酸分子または本明細書に定義される発現カセットもしくは発現ベクターを含む医薬組成物。
本明細書に定義される核酸分子または本明細書に定義される発現カセットもしくは発現ベクターを含む宿主細胞。
− 本明細書に定義される宿主細胞の実質的に純粋な培養物。
− 宿主細胞において本明細書に教示されるヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片の発現を達成するための、本明細書に定義される核酸分子または本明細書に定義される発現カセットもしくは発現ベクターの使用。
− 本明細書に教示されるヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を産生するための方法であって、
a)宿主細胞が、ヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を発現するように、本明細書に定義される宿主細胞を培養するステップ、
b)宿主細胞または宿主細胞培養培地から、ヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を収集し、任意選択で単離するステップ
を含む方法。
本明細書で使用する場合、単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」および「その(the)」は、文脈が明らかに他を示さない限り、単数形および複数形の両方の指示対象を含む。
配列番号1に示されるヒトNAGALポリペプチドのアスパラギン213に対応する第1のアミノ酸が、1つまたは複数のアミノ酸によって置換されている、ヒトα−N−アセチルガラクトサミニダーゼ(NAGAL)ポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片;あるいは
配列番号1に示されるヒトNAGALポリペプチドのシステイン326に対応する第2のアミノ酸が、1つまたは複数のアミノ酸によって置換されている、ヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片;あるいは
配列番号1に示されるヒトNAGALポリペプチドのアスパラギン213に対応する第1のアミノ酸が、1つまたは複数のアミノ酸によって置換され、配列番号1に示されるヒトNAGALポリペプチドのシステイン326に対応する第2のアミノ酸が、1つまたは複数のアミノ酸によって置換されている、ヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片
を提供する。
1つまたは複数のアミノ酸のうち少なくとも1つが、配列番号1に示されるヒトNAGALポリペプチドのシステイン326に対応する第2のアミノ酸と直接的または間接的に相互作用することが可能であるように、配列番号1に示されるヒトNAGALポリペプチドのアスパラギン213に対応する第1のアミノ酸が、前記1つまたは複数のアミノ酸によって置換されている、ヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片;あるいは
1つまたは複数のアミノ酸のうち少なくとも1つが、配列番号1に示されるヒトNAGALポリペプチドのアスパラギン213に対応する第1のアミノ酸と直接的または間接的に相互作用することが可能であるように、配列番号1に示されるヒトNAGALポリペプチドのシステイン326に対応する第2のアミノ酸が、前記1つまたは複数のアミノ酸によって置換されている、ヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片;あるいは
第1のアミノ酸を置換する前記1つまたは複数のアミノ酸のうち少なくとも1つが、第2のアミノ酸を置換する前記1つまたは複数のアミノ酸のうち少なくとも1つと直接的または間接的に相互作用することが可能であるように、配列番号1に示されるヒトNAGALポリペプチドのアスパラギン213に対応する第1のアミノ酸が、1つまたは複数のアミノ酸によって置換され、配列番号1に示されるヒトNAGALポリペプチドのシステイン326に対応する第2のアミノ酸が、1つまたは複数のアミノ酸によって置換されている、ヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片
を提供する。
配列番号1に示されるヒトNAGALポリペプチドのアスパラギン213に対応する第1のアミノ酸が、そのうち少なくとも1つが負に荷電した側鎖基を含む、好ましくは、そのうち少なくとも1つがアスパラギン酸またはグルタミン酸(好ましくはアスパラギン酸)である1つまたは複数のアミノ酸によって置換され;
配列番号1に示されるヒトNAGALポリペプチドのシステイン326に対応する第2のアミノ酸が、
そのうち少なくとも1つが正に荷電した側鎖基を含む、好ましくは、そのうち少なくとも1つがアルギニン、ヒスチジンもしくはリシン(好ましくはアルギニン)である1つまたは複数のアミノ酸;または
そのうち少なくとも1つが極性非荷電側鎖基を含む、好ましくは、そのうち少なくとも1つがセリン、スレオニン、アスパラギンもしくはグルタミン(好ましくはセリン)である1つまたは複数のアミノ酸
によって置換されている、
ヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を提供する。
配列番号1に示されるヒトNAGALポリペプチドのアスパラギン213に対応する第1のアミノ酸が、そのうち少なくとも1つが負に荷電した側鎖基を含む、好ましくは、そのうち少なくとも1つがアスパラギン酸またはグルタミン酸(好ましくはアスパラギン酸)である1つ、2つまたは3つのアミノ酸、好ましくは1つまたは2つのアミノ酸によって置換され;
配列番号1に示されるヒトNAGALポリペプチドのシステイン326に対応する第2のアミノ酸が、
そのうち少なくとも1つが正に荷電した側鎖基を含む、好ましくは、そのうち少なくとも1つがアルギニン、ヒスチジンもしくはリシン(好ましくはアルギニン)である1つ、2つもしくは3つのアミノ酸、好ましくは1つもしくは2つのアミノ酸;または
そのうち少なくとも1つが極性非荷電側鎖基を含む、好ましくは、そのうち少なくとも1つがセリン、スレオニン、アスパラギンもしくはグルタミン(好ましくはセリン)である1つ、2つもしくは3つのアミノ酸、好ましくは1つもしくは2つのアミノ酸
によって置換されている、
ヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を提供する。
配列番号1に示されるヒトNAGALポリペプチドのアスパラギン213に対応する第1のアミノ酸が、負に荷電した側鎖基を含む1つのアミノ酸によって、好ましくは、アスパラギン酸またはグルタミン酸によって(好ましくはアスパラギン酸によって)置換され;
配列番号1に示されるヒトNAGALポリペプチドのシステイン326に対応する第2のアミノ酸が、
正に荷電した側鎖基を含む1つのアミノ酸によって、好ましくは、アルギニン、ヒスチジンもしくはリシンによって(好ましくはアルギニンによって);または
極性非荷電側鎖基を含む1つのアミノ酸によって、好ましくは、セリン、スレオニン、アスパラギンもしくはグルタミンによって(好ましくはセリンによって)
置換されている、
ヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を提供する。
配列番号1に示されるヒトNAGALポリペプチドのアスパラギン213に対応するアミノ酸位置において、そのうち少なくとも1つが負に荷電した側鎖基を含む1つまたは複数のアミノ酸、好ましくは、そのうち少なくとも1つが負に荷電した側鎖基を含む1つ、2つまたは3つのアミノ酸、より好ましくは、そのうち少なくとも1つが負に荷電した側鎖基を含む1つまたは2つのアミノ酸、さらにより好ましくは、負に荷電した側鎖基を含む1つのアミノ酸;および
配列番号1に示されるヒトNAGALポリペプチドのシステイン326に対応するアミノ酸位置において、そのうち少なくとも1つが正に荷電した側鎖基または極性非荷電側鎖基を含む1つまたは複数のアミノ酸、好ましくは、そのうち少なくとも1つが正に荷電した側鎖基または極性非荷電側鎖基を含む1つ、2つまたは3つのアミノ酸、より好ましくは、そのうち少なくとも1つが正に荷電した側鎖基または極性非荷電側鎖基を含む1つまたは2つのアミノ酸、さらにより好ましくは、正に荷電した側鎖基または極性非荷電側鎖基を含む1つのアミノ酸
を含む、ヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を提供する。
配列番号1に示されるヒトNAGALポリペプチドのアスパラギン213に対応するアミノ酸位置において、そのうち少なくとも1つがアスパラギン酸またはグルタミン酸(好ましくはアスパラギン酸)である1つまたは複数のアミノ酸、好ましくは、そのうち少なくとも1つがアスパラギン酸またはグルタミン酸(好ましくはアスパラギン酸)である1つ、2つまたは3つのアミノ酸、より好ましくは、そのうち少なくとも1つがアスパラギン酸またはグルタミン酸(好ましくはアスパラギン酸)である1つまたは2つのアミノ酸、さらにより好ましくは、アスパラギン酸またはグルタミン酸(好ましくはアスパラギン酸)である1つのアミノ酸;および
配列番号1に示されるヒトNAGALポリペプチドのシステイン326に対応するアミノ酸位置において、そのうち少なくとも1つがアルギニン、ヒスチジンまたはリシン(好ましくはアルギニン)である1つまたは複数のアミノ酸、好ましくは、そのうち少なくとも1つがアルギニン、ヒスチジンまたはリシン(好ましくはアルギニン)である1つ、2つまたは3つのアミノ酸、より好ましくは、そのうち少なくとも1つがアルギニン、ヒスチジンまたはリシン(好ましくはアルギニン)である1つまたは2つのアミノ酸、さらにより好ましくは、アルギニン、ヒスチジンまたはリシン(好ましくはアルギニン)である1つのアミノ酸
を含む、ヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を提供する。
配列番号1に示されるヒトNAGALポリペプチドのアスパラギン213に対応するアミノ酸位置において、そのうち少なくとも1つがアスパラギン酸またはグルタミン酸(好ましくはアスパラギン酸)である1つまたは複数のアミノ酸、好ましくは、そのうち少なくとも1つがアスパラギン酸またはグルタミン酸(好ましくはアスパラギン酸)である1つ、2つまたは3つのアミノ酸、より好ましくは、そのうち少なくとも1つがアスパラギン酸またはグルタミン酸(好ましくはアスパラギン酸)である1つまたは2つのアミノ酸、さらにより好ましくは、アスパラギン酸またはグルタミン酸(好ましくはアスパラギン酸)である1つのアミノ酸;および
配列番号1に示されるヒトNAGALポリペプチドのシステイン326に対応するアミノ酸位置において、そのうち少なくとも1つがセリン、スレオニン、アスパラギンまたはグルタミン(好ましくはセリン)である1つまたは複数のアミノ酸、好ましくは、そのうち少なくとも1つがセリン、スレオニン、アスパラギンまたはグルタミン(好ましくはセリン)である1つ、2つまたは3つのアミノ酸、より好ましくは、そのうち少なくとも1つがセリン、スレオニン、アスパラギンまたはグルタミン(好ましくはセリン)である1つまたは2つのアミノ酸、さらにより好ましくは、セリン、スレオニン、アスパラギンまたはグルタミン(好ましくはセリン)である1つのアミノ酸
を含む、ヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を提供する。
1つまたは複数のアミノ酸のうち少なくとも1つが、配列番号1に示されるヒトNAGALポリペプチドのシステイン326に対応する第2のアミノ酸と直接的または間接的に相互作用することが可能であるように、配列番号1に示されるヒトNAGALポリペプチドのアスパラギン213に対応する第1のアミノ酸が、前記1つまたは複数のアミノ酸によって本明細書に教示されるように置換されている;または
1つまたは複数のアミノ酸のうち少なくとも1つが、配列番号1に示されるヒトNAGALポリペプチドのアスパラギン213に対応する第1のアミノ酸と直接的または間接的に相互作用することが可能であるように、配列番号1に示されるヒトNAGALポリペプチドのシステイン326に対応する第2のアミノ酸が、前記1つまたは複数のアミノ酸によって本明細書に教示されるように置換されている;または
第1のアミノ酸を置換する前記1つまたは複数のアミノ酸のうち少なくとも1つが、第2のアミノ酸を置換する前記1つまたは複数のアミノ酸のうち少なくとも1つと直接的または間接的に相互作用することが可能であるように、配列番号1に示されるヒトNAGALポリペプチドのアスパラギン213に対応する第1のアミノ酸が、1つまたは複数のアミノ酸によって本明細書に教示されるように置換され、配列番号1に示されるヒトNAGALポリペプチドのシステイン326に対応する第2のアミノ酸が、1つまたは複数のアミノ酸によって置換されている、ヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を提供する。
第1のアミノ酸は、配列番号1に示されるヒトNAGALポリペプチドのアミノ酸208とアミノ酸218との間の位置に対応する、改変されたヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置し得る;および/あるいは(好ましくは「および」)
第2のアミノ酸は、配列番号1に示されるヒトNAGALポリペプチドのアミノ酸321とアミノ酸331との間の位置に対応する、改変されたヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置し得る。
第1のアミノ酸は、配列番号1に示されるヒトNAGALポリペプチドのアミノ酸209とアミノ酸217との間の位置、好ましくは、アミノ酸210とアミノ酸216との間の位置、より好ましくは、アミノ酸211とアミノ酸215との間の位置、さらにより好ましくは、アミノ酸212とアミノ酸214との間の位置、最も好ましくは、アミノ酸213の位置に対応する、改変されたヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置し得る;および/あるいは(好ましくは「および」)
第2のアミノ酸は、配列番号1に示されるヒトNAGALポリペプチドのアミノ酸322とアミノ酸330との間の位置、好ましくは、アミノ酸323とアミノ酸329との間の位置、より好ましくは、アミノ酸324とアミノ酸328との間の位置、さらにより好ましくは、アミノ酸325とアミノ酸327との間の位置、最も好ましくは、アミノ酸326の位置に対応する、改変されたヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置し得る。
第1のアミノ酸は、表1に記載される位置に対応する、改変されたヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置し得る;および/あるいは(好ましくは「および」)
第2のアミノ酸は、表1に記載される位置に対応する、改変されたヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置し得る。
第1のアミノ酸は、配列番号1に示されるヒトNAGALポリペプチドのアミノ酸213の位置に対応する、改変されたヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置し得る(好ましくは、第1のアミノ酸は、配列番号1に示されるヒトNAGALポリペプチドのアスパラギン213に対応し、それを置換する、改変されたヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置し得る);および/あるいは
第2のアミノ酸は、配列番号1に示されるヒトNAGALポリペプチドのアミノ酸326の位置に対応する、改変されたヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置し得る(好ましくは、第2のアミノ酸は、配列番号1に示されるヒトNAGALポリペプチドのシステイン326に対応し、それを置換する、改変されたヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置し得る)。
第1のアミノ酸は、配列番号1に示されるヒトNAGALポリペプチドのアミノ酸213の位置に対応する、改変されたヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置し得る(好ましくは、第1のアミノ酸は、配列番号1に示されるヒトNAGALポリペプチドのアスパラギン213に対応し、それを置換する、改変されたヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置し得る);および
第2のアミノ酸は、配列番号1に示されるヒトNAGALポリペプチドのアミノ酸326の位置に対応する、改変されたヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置し得る(好ましくは、第2のアミノ酸は、配列番号1に示されるヒトNAGALポリペプチドのシステイン326に対応し、それを置換する、改変されたヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置し得る)。
第1のアミノ酸は、負に荷電した側鎖基を含み得、好ましくは、第1のアミノ酸は、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸であり、より好ましくは、第1のアミノ酸はアスパラギン酸であり、第2のアミノ酸は、正に荷電した側鎖基を含み得、好ましくは、第2のアミノ酸は、アルギニン、ヒスチジンもしくはリシンであり、より好ましくは、第2のアミノ酸はアルギニンである;または
第1のアミノ酸は、正に荷電した側鎖基を含み得、好ましくは、第1のアミノ酸は、アルギニン、ヒスチジンもしくはリシンであり、第2のアミノ酸は、負に荷電した側鎖基を含み得、好ましくは、第2のアミノ酸は、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸である。
第1のアミノ酸は、配列番号1に示されるヒトNAGALポリペプチドのアミノ酸208とアミノ酸218との間の位置に対応する、改変されたヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置し得る;および/あるいは(好ましくは「および」)第2のアミノ酸は、配列番号1に示されるヒトNAGALポリペプチドのアミノ酸321とアミノ酸331との間の位置に対応する、改変されたヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置し得る;ならびに
第1のアミノ酸は、負に荷電した側鎖基を含み得、第2のアミノ酸は、正に荷電した側鎖基を含み得る;または第1のアミノ酸は、正に荷電した側鎖基を含み得、第2のアミノ酸は、負に荷電した側鎖基を含み得る;好ましくは、第1のアミノ酸は、負に荷電した側鎖基を含み、第2のアミノ酸は、正に荷電した側鎖基を含み得る。
第1のアミノ酸は、表1に記載される、配列番号1に示されるヒトNAGALポリペプチドのアミノ酸「AAx」の位置に対応する、改変されたヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置し得る;および/あるいは(好ましくは「および」)第2のアミノ酸は、表1に記載される、配列番号1に示されるヒトNAGALポリペプチドのアミノ酸「AAy」の位置に対応する、改変されたヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置し得る;ならびに
第1のアミノ酸は、負に荷電した側鎖基を含み得、第2のアミノ酸は、正に荷電した側鎖基を含み得る;または第1のアミノ酸は、正に荷電した側鎖基を含み得、第2のアミノ酸は、負に荷電した側鎖基を含み得る;好ましくは、第1のアミノ酸は、負に荷電した側鎖基を含み、第2のアミノ酸は、正に荷電した側鎖基を含み得る。
第1のアミノ酸は、配列番号1に示されるヒトNAGALポリペプチドのアミノ酸213の位置に対応する、改変されたヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置し得る(好ましくは、第1のアミノ酸は、配列番号1に示されるヒトNAGALポリペプチドのアスパラギン213に対応し、それを置換する、改変されたヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置し得る);および第2のアミノ酸は、配列番号1に示されるヒトNAGALポリペプチドのアミノ酸326の位置に対応する、改変されたヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置し得る(好ましくは、第2のアミノ酸は、配列番号1に示されるヒトNAGALポリペプチドのシステイン326に対応し、それを置換する、改変されたヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置し得る);ならびに
第1のアミノ酸は、負に荷電した側鎖基を含み得、第2のアミノ酸は、正に荷電した側鎖基を含み得る;または第1のアミノ酸は、正に荷電した側鎖基を含み得、第2のアミノ酸は、負に荷電した側鎖基を含み得る;好ましくは、第1のアミノ酸は、負に荷電した側鎖基を含み、第2のアミノ酸は、正に荷電した側鎖基を含み得る。
第1のアミノ酸は、配列番号1に示されるヒトNAGALポリペプチドのアミノ酸208とアミノ酸218との間の位置に対応する、改変されたヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置し得る;および/あるいは(好ましくは「および」)第2のアミノ酸は、配列番号1に示されるヒトNAGALポリペプチドのアミノ酸321とアミノ酸331との間の位置に対応する、改変されたヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置し得る;ならびに
第1のアミノ酸は、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸であり、第2のアミノ酸は、アルギニン、ヒスチジンもしくはリシンである;または第1のアミノ酸は、アルギニン、ヒスチジンもしくはリシンであり、第2のアミノ酸は、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸である;好ましくは、第1のアミノ酸は、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸であり、第2のアミノ酸は、アルギニン、ヒスチジンもしくはリシンである。
第1のアミノ酸は、表1に記載される、配列番号1に示されるヒトNAGALポリペプチドのアミノ酸「AAx」の位置に対応する、改変されたヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置し得る;および/あるいは(好ましくは「および」)第2のアミノ酸は、表1に記載される、配列番号1に示されるヒトNAGALポリペプチドのアミノ酸「AAy」の位置に対応する、改変されたヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置し得る;ならびに
第1のアミノ酸は、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸であり、第2のアミノ酸は、アルギニン、ヒスチジンもしくはリシンである;または第1のアミノ酸は、アルギニン、ヒスチジンもしくはリシンであり、第2のアミノ酸は、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸である;好ましくは、第1のアミノ酸は、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸であり、第2のアミノ酸は、アルギニン、ヒスチジンもしくはリシンである。
第1のアミノ酸は、配列番号1に示されるヒトNAGALポリペプチドのアミノ酸213の位置に対応する、改変されたヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置し得る(好ましくは、第1のアミノ酸は、配列番号1に示されるヒトNAGALポリペプチドのアスパラギン213に対応し、それを置換する、改変されたヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置し得る);および第2のアミノ酸は、配列番号1に示されるヒトNAGALポリペプチドのアミノ酸326の位置に対応する、改変されたヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置し得る(好ましくは、第2のアミノ酸は、配列番号1に示されるヒトNAGALポリペプチドのシステイン326に対応し、それを置換する、改変されたヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置し得る);ならびに
第1のアミノ酸は、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸であり、第2のアミノ酸は、アルギニン、ヒスチジンもしくはリシンである;または第1のアミノ酸は、アルギニン、ヒスチジンもしくはリシンであり、第2のアミノ酸は、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸である;好ましくは、第1のアミノ酸は、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸であり、第2のアミノ酸は、アルギニン、ヒスチジンもしくはリシンである。
第1のアミノ酸は、配列番号1に示されるヒトNAGALポリペプチドのアミノ酸208とアミノ酸218との間の位置に対応する、改変されたヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置し得る;および/あるいは(好ましくは「および」)第2のアミノ酸は、配列番号1に示されるヒトNAGALポリペプチドのアミノ酸321とアミノ酸331との間の位置に対応する、改変されたヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置し得る;ならびに
第1のアミノ酸はアスパラギン酸であり、第2のアミノ酸はアルギニンである;または第1のアミノ酸はアルギニンであり、第2のアミノ酸はアスパラギン酸である;好ましくは、第1のアミノ酸はアスパラギン酸であり、第2のアミノ酸はアルギニンである。
第1のアミノ酸は、表1に記載される、配列番号1に示されるヒトNAGALポリペプチドのアミノ酸「AAx」の位置に対応する、改変されたヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置し得る;および/あるいは(好ましくは「および」)第2のアミノ酸は、表1に記載される、配列番号1に示されるヒトNAGALポリペプチドのアミノ酸「AAy」の位置に対応する、改変されたヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置し得る;ならびに
第1のアミノ酸はアスパラギン酸であり、第2のアミノ酸はアルギニンである;または第1のアミノ酸はアルギニンであり、第2のアミノ酸はアスパラギン酸である;好ましくは、第1のアミノ酸はアスパラギン酸であり、第2のアミノ酸はアルギニンである。
第1のアミノ酸は、配列番号1に示されるヒトNAGALポリペプチドのアミノ酸213の位置に対応する、改変されたヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置し得る(好ましくは、第1のアミノ酸は、配列番号1に示されるヒトNAGALポリペプチドのアスパラギン213に対応し、それを置換する、改変されたヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置し得る);および第2のアミノ酸は、配列番号1に示されるヒトNAGALポリペプチドのアミノ酸326の位置に対応する、改変されたヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置し得る(好ましくは、第2のアミノ酸は、配列番号1に示されるヒトNAGALポリペプチドのシステイン326に対応し、それを置換する、改変されたヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置し得る);ならびに
第1のアミノ酸はアスパラギン酸であり、第2のアミノ酸はアルギニンである;または第1のアミノ酸はアルギニンであり、第2のアミノ酸はアスパラギン酸である;好ましくは、第1のアミノ酸はアスパラギン酸であり、第2のアミノ酸はアルギニンである。
第1のアミノ酸は、配列番号1に示されるヒトNAGALポリペプチドのアミノ酸213の位置に対応する、改変されたヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置するアスパラギン酸であり得る;および
第2のアミノ酸は、配列番号1に示されるヒトNAGALポリペプチドのアミノ酸326の位置に対応する、改変されたヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置するアルギニンであり得る。
ある特定の実施形態では、
第1のアミノ酸は、配列番号1に示されるヒトNAGALポリペプチドのアスパラギン213に対応し、それを置換する、改変されたヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置するアスパラギン酸であり得る;および
第2のアミノ酸は、配列番号1に示されるヒトNAGALポリペプチドのシステイン326に対応し、それを置換する、改変されたヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置するアルギニンであり得る。
ある特定の実施形態は、
第1のアミノ酸が、配列番号1に示されるヒトNAGALポリペプチドのアミノ酸213の位置に対応する、ヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置するアスパラギン酸である;および
第2のアミノ酸が、配列番号1に示されるヒトNAGALポリペプチドのアミノ酸326の位置に対応する、ヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のアミノ酸位置に位置するアルギニンである、
第1のアミノ酸および第2のアミノ酸を含むヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を提供する。ある特定の実施形態では、第1のアミノ酸は、第1のドメインの一部であり、第2のアミノ酸は、第2のドメインの一部である。
異種アミノ酸配列は、マンノース−6−リン酸受容体を標的化するための配列からなる群から選択される受容体標的化アミノ酸配列などの、受容体標的化アミノ酸配列であり得る;あるいは
異種アミノ酸配列は、分泌シグナル配列、例えば、Yarrowia Lip2プレプロ、Yarrowia Lip2プレ、Saccharomyces cerevisiae α−接合因子、Yarrowia XPR2プレプロもしくはYarrowia XPR2プレ配列であり得るまたはそれを含み得る;あるいは
異種アミノ酸配列は、分泌シグナル配列、例えば、Yarrowia Lip2プレプロ、Yarrowia Lip2プレ、Saccharomyces cerevisiae α−接合因子、Yarrowia XPR2プレプロまたはYarrowia XPR2プレ配列を含み得、分泌シグナル配列のC末端側に2つのX−Alaリピートをさらに含み得る;あるいは
異種アミノ酸配列は、改変されたヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片の精製を可能にし得る;あるいは
異種アミノ酸配列は、診断マーカーまたは検出可能なマーカーとしての使用のために構成され得る。
− N−グリカン活性の外鎖伸長における欠損、例えば、OCH1活性における欠損を含むように遺伝子操作され得る;および/あるいは
− MNN4、PNO1、MNN6またはそれらのいずれか1つの生物学的に活性なバリアントもしくは断片などの、N−グリカンのマンノシルリン酸化をもたらすことが可能なポリペプチドの発現を含むように遺伝子操作され得る。
a)宿主細胞が、ヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を発現するように、本明細書に定義される宿主細胞を培養するステップ、
b)宿主細胞または宿主細胞培養培地から、ヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を収集し、任意選択で単離するステップ
を含む方法を提供する。ある特定の実施形態では、宿主細胞は真菌細胞である。好ましくは、宿主細胞はYarrowia lipolytica細胞である。
増加したα−ガラクトシダーゼ活性を有するヒトNAGAL(NAGAL1)を発現するYarrowia lipolytica株の生成
実験の目的は、増加したα−ガラクトシダーゼ活性を有するようにアミノ酸置換Ser188GluおよびAla191Leu(開始メチオニンから始まるアミノ酸番号付け、ヒトNAGALの17アミノ酸のシグナルペプチドを含む;配列番号1に示されるヒトNAGALポリペプチド中では、これは、置換Ser171GluおよびAla174Leuに対応する)によって改変されたヒトリソソームα−N−アセチルガラクトサミニダーゼ(NAGAL)酵素の分泌された発現のためのYarrowia lipolytica株を開発することであった。この目的のために、Yarrowia Lip2pのシグナルペプチド(Lip2プレ配列)と成熟形態のNAGAL(哺乳動物分泌シグナルペプチドを除く、ヒトNAGALのアミノ酸18から始まる)との間の融合物をコードするYarrowiaコドン最適化合成遺伝子を、GenScriptに注文した。この合成遺伝子は、酵母小胞体(ER)内でのシグナルペプチドの効率的プロセシングを確実にするために、Lip2プレ配列と第1のNAGAL特異的アミノ酸との間に2つのX−Alaリピートもまたコードした(Gasmiら、2012年、Appl. Microbiol. Biotechnol.、96巻(1号):89〜101頁)。CACAヌクレオチド配列は、Yarrowiaにおける翻訳開始にとって有益であることが見出されたので、これをATG開始コドンの前に導入した(Gasmiら、2011年、Appl. Microbiol. Biotechnol.、89巻(1号):109〜19頁)。今後、アミノ酸置換Ser188GluおよびAla191Leu(開始メチオニンから始まるアミノ酸番号付け)を含むヒトNAGALを、簡便に「NAGAL1」または「NAGAL1(Mut)」と呼ぶ。Yarrowia lipolyticaにおける発現のための合成NAGAL1遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号10として与えられる(太字下線:開始ATG;イタリック下線:終止コドン):
増加したα−ガラクトシダーゼ活性を有するヒトNAGAL(NAGAL1)を発現するYarrowia lipolytica株の、制御されたバイオリアクター培養
NAGAL1発現株の最初の制御されたバイオリアクター培養のために、DASGIPによって開発された8−パラレル1L発酵系を使用した。この系は、培養の間の酸素取込み速度(OUR)および二酸化炭素生成速度(CER)を評価するための、pH、温度、溶存酸素のオンラインモニタリング、ならびに排ガス分析に対応している。
増加したα−ガラクトシダーゼ活性を有するヒトNAGALのバリアント(NAGAL1)を発現するYarrowia lipolytica株の生成
α−GalAとNAGALとの間の高い配列類似性(全体で46%)および非常に類似したタンパク質フォールドに基づくと、Yarrowia産生されたNAGAL1について、顕著により低い発現レベルは予測されなかった。
(i)第1の戦略では、NAGAL1のドメインIIをヒトα−GalAのドメインIIによって置き換えた、全ドメインIIスワッピングを実施した;
(ii)第2の戦略では、NAGAL1のドメインIとドメインIIとの間に(さらなる)イオン対を形成する可能性を導入できるという仮説に基づいて、NAGAL1のドメインIのアスパラギン213をアスパラギン酸によって置き換え、NAGAL1のドメインIIのシステイン326をアルギニンによって置き換えたNAGAL1バリアントを発現させた(成熟NAGAL1中の最初のアミノ酸から始まるアミノ酸の番号付け、即ち、哺乳動物分泌シグナルを除く);ならびに
(iii)第3の戦略では、NAGAL1のドメインIIの対になっていないシステイン326(成熟NAGAL1中の最初のアミノ酸から始まるアミノ酸の番号付け、即ち、哺乳動物分泌シグナルを除く)が、望ましくないジスルフィド架橋スクランブルの扇動因子であり得るという仮説に基づいて、システイン326を、アミノ酸セリン(サイズおよび疎水性が類似している)によって置き換えた。
異なるヒトNAGAL1バリアントを発現するYarrowia lipolytica株の制御されたバイオリアクター培養
制御されたバイオリアクター培養を、1Lの発酵系(DASGIP)において実施した。要するに、選択された株のシード培養物を、リッチ培地を含む振盪フラスコ中で28℃で一晩増殖させた。次いで、シードを、唯一の炭素供給源としてグリセロールを含む限定ミネラル培地を含む発酵槽ベッセル中に接種して、増殖が制限されない28℃でのバッチ期を開始させた。グリセロール枯渇後、プロセスを、2つの連続的指数関数的グリセロールフィードを適用することによる炭素制限下で実行した:40時間にわたる比較的速い指数関数的グリセロールフィードを伴う第1の期、およびおよそもう115時間にわたるより遅い指数関数的フィードを伴う第2の期。発酵プロセスを通じて、溶存酸素(およそ20%)、pH(6.8)、温度(28℃)、泡レベルおよびフィード速度を、能動的に制御した。溶存酸素レベルを、撹拌し、純粋酸素を混ぜることによって維持し、pHを、14%水酸化アンモニウムを添加することによって調整し、泡を、消泡プローブの活性化の際に消泡剤を添加することによって相殺した。プロセスの間、試料を定期的に採取して、以下のパラメーターを評価した:1)組換えタンパク質発現、2)活性アッセイを介した機能的酵素の発現、3)セクレトームのN−グリコシル化プロファイルの進化、4)バイオマス濃度、5)外部pH、6)細胞形態学、および7)総タンパク質濃度。
NAGAL1#2の発現のための多コピーYarrowia lipolytica株
最初に、本発明の原理を示す改変されたNAGALポリペプチドをコードする、NAGAL1#2発現構築物のADE2バリアントを、OXYY2163中に形質転換して、leu2栄養要求性およびura3栄養要求性を有する単一コピー発現株を生成した。プラスミドのゲノム組込みを、形質転換体に対するPCRスクリーニングによってチェックした。いくつかのPCR陽性クローンを、24ディープウェルプレート中での培養後に組換えNAGAL1#2の産生について試験した。簡潔に述べると、いくつかの形質転換体を、2mlのYPDを含むウェル中に接種し、28℃および180rpmで一晩培養した。次の日、1〜2μlのこの培養物を、新鮮なYPDを含む新たなウェルに移し、28℃および180rpmで一晩再培養した。次の日、24ウェルプレートを遠心分離し、培地を細胞ペレットから除去した。細胞を、2mlのSuperT/グリセロールリッチ培地中に再懸濁し、28℃で3〜4日間増殖させた。培養の終了時に、培地を回収し、NAGAL1#2発現を、SDS−PAGE/クーマシー染色およびウエスタンブロット分析を介して評価した(図20)。
NAGALポリペプチドの3Dモデリング
PyMOLソフトウェア(DeLano、2002年、The PyMOL Molecular Graphics System、www.pymol.org)を、ヒトNAGAL(PDB 3H54、暗い灰色)およびニワトリNAGAL(PDB 1KTB、明るい灰色)の構造的アラインメントおよび重ね合わせに使用した。これは、両方の酵素が非常に類似した三次フォールドを有することを示している(図26を参照のこと)。ニワトリNAGAL中のドメインIとドメインIIとの間の界面は、2つの安定化性イオン対Asp214−Arg327およびAsp221−Arg299を明らかにしている(Garmanら、2002年、Structure、10巻(3号):425〜34頁に記載されるとおり)。後者(図26の四角を参照のこと)は、ヒトNAGALでは位置が厳密に保存されるようであり、一方で前者は、ヒトオルソログには存在しないようである。Asn213がAsp213に変換され、同時にCys326がArg326に変換されたヒトNAGALの3Dバリアントを、PyMOL変異誘発ツールを使用してin silicoでモデリングし、特定の回転異性体を、近隣残基との立体衝突を回避するために選択した。本発明者らは、PyMOL測定ツールを使用して、導入されたAsp213側鎖とArg326側鎖との間の距離を評価し、これらが4Åと等しいまたはそれ未満であることを見出した。限定なしに、本発明者らは、この知見が、NAGALポリペプチドのドメインIとドメインIIとの間の相互作用を安定化させ得る、変異されたヒトNAGAL中の第2のAsp−Argイオン対を形成する可能性を確認すると推論する。
213位の残基と326位の残基との間の改善された相互作用を実証するさらなるヒトNAGALポリペプチド
本発明者らは、NAGAL1の以下のさらなるバリアントをさらに調製した:#4:単一のアミノ酸変化:Cys326Argから生じる(配列番号18);#5:単一のアミノ酸変化Asn213Aspから生じる(配列番号19);ならびに#6:二重アミノ酸変化Cys326SerおよびAsn213Aspから生じる(配列番号20)。
生成されたプラスミドおよび株の概要
上述の実験で使用したプラスミドは、図32および33にさらに記載される。
Claims (48)
- ヒトα−N−アセチルガラクトサミニダーゼ(NAGAL)ポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片であって、
配列番号1に示されるヒトNAGALポリペプチドのアスパラギン213に対応する第1のアミノ酸が、1つまたは複数のアミノ酸によって置換されている;または
配列番号1に示されるヒトNAGALポリペプチドのシステイン326に対応する第2のアミノ酸が、1つまたは複数のアミノ酸によって置換されている;または
配列番号1に示されるヒトNAGALポリペプチドのアスパラギン213に対応する第1のアミノ酸が、1つまたは複数のアミノ酸によって置換され、配列番号1に示されるヒトNAGALポリペプチドのシステイン326に対応する第2のアミノ酸が、1つまたは複数のアミノ酸によって置換されている、ヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片。 - 前記第1のアミノ酸が、1つ、2つもしくは3つのアミノ酸によって置換されている;または
前記第2のアミノ酸が、1つ、2つもしくは3つのアミノ酸によって置換されている;または
前記第1のアミノ酸が、1つ、2つもしくは3つのアミノ酸によって置換され、前記第2のアミノ酸が、1つ、2つもしくは3つのアミノ酸によって置換されている、請求項1に記載のヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片。 - 前記第1のアミノ酸が、1つのアミノ酸によって置換されている;または
前記第2のアミノ酸が、1つのアミノ酸によって置換されている;または
前記第1のアミノ酸が、1つのアミノ酸によって置換され、前記第2のアミノ酸が、1つのアミノ酸によって置換されている、請求項1に記載のヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片。 - 前記第1のアミノ酸がアスパラギンであり、
前記アスパラギンが、アスパラギン以外の1つまたは複数のアミノ酸によって置換されている;または
前記アスパラギンが、アスパラギン以外の1つ、2つもしくは3つのアミノ酸によって置換されている;または
前記アスパラギンが、アスパラギン以外の1つのアミノ酸によって置換されている、請求項1から3のいずれか一項に記載のヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片。 - 前記第2のアミノ酸がシステインであり、
前記システインが、システイン以外の1つまたは複数のアミノ酸によって置換されている;または
前記システインが、システイン以外の1つ、2つもしくは3つのアミノ酸によって置換されている;または
前記システインが、システイン以外の1つのアミノ酸によって置換されている、請求項1から4のいずれか一項に記載のヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片。 - 前記第1のアミノ酸を置換する1つまたは複数の前記アミノ酸が、アラニン、アルギニン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンからなる群から各々独立して選択される、請求項1から5のいずれか一項に記載のヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片。
- 前記第2のアミノ酸を置換する1つまたは複数の前記アミノ酸が、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンからなる群から各々独立して選択される、請求項1から6のいずれか一項に記載のヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片。
- 前記第1のアミノ酸が、そのうち少なくとも1つが負に荷電した側鎖基を含む1つまたは複数のアミノ酸によって置換されている;または
前記第1のアミノ酸が、そのうち少なくとも1つが負に荷電した側鎖基を含む1つ、2つもしくは3つのアミノ酸によって置換されている;または
前記第1のアミノ酸が、負に荷電した側鎖基を含む1つのアミノ酸によって置換されている、請求項1から7のいずれか一項に記載のヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片。 - 負に荷電した側鎖基を含む少なくとも1つの前記アミノ酸が、アスパラギン酸またはグルタミン酸、好ましくはアスパラギン酸である、請求項8に記載のヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片。
- 前記第2のアミノ酸が、そのうち少なくとも1つが正に荷電した側鎖基もしくは極性非荷電側鎖基を含む1つまたは複数のアミノ酸によって置換されている;または
前記第2のアミノ酸が、そのうち少なくとも1つが正に荷電した側鎖基もしくは極性非荷電側鎖基を含む1つ、2つもしくは3つのアミノ酸によって置換されている;または
前記第2のアミノ酸が、正に荷電した側鎖基もしくは極性非荷電側鎖基を含む1つのアミノ酸によって置換されている、請求項1から9のいずれか一項に記載のヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片。 - 正に荷電した側鎖基を含む少なくとも1つの前記アミノ酸が、アルギニン、ヒスチジンもしくはリシン、好ましくはアルギニンであり、または極性非荷電側鎖基を含む少なくとも1つの前記アミノ酸が、セリン、スレオニン、アスパラギンもしくはグルタミン、好ましくはセリンである、請求項10に記載のヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片。
- 前記第1のアミノ酸が、アスパラギン酸によって置換され、前記第2のアミノ酸が、アルギニンによって置換されている;または
前記第2のアミノ酸が、アルギニンによって置換されている;または
前記第1のアミノ酸が、アスパラギン酸によって置換され、前記第2のアミノ酸が、セリンによって置換されている;または
前記第2のアミノ酸が、セリンによって置換されている、請求項1から11のいずれか一項に記載のヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片。 - 前記ヒトNAGALポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号2に示されるとおりであるか、もしくは前記機能的に活性なバリアントが、配列番号2に対して少なくとも90%の配列同一性を示す;または
前記ヒトNAGALポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号3に示されるとおりであるか、もしくは前記機能的に活性なバリアントが、配列番号3に対して少なくとも90%の配列同一性を示す;または
前記ヒトNAGALポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号4に示されるとおりであるか、もしくは前記機能的に活性なバリアントが、配列番号4に対して少なくとも90%の配列同一性を示す;または
前記ヒトNAGALポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号5に示されるとおりであるか、もしくは前記機能的に活性なバリアントが、配列番号5に対して少なくとも90%の配列同一性を示す、請求項1から12のいずれか一項に記載のヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片。 - 1つまたは複数のアミノ酸のうち少なくとも1つが、配列番号1に示されるヒトNAGALポリペプチドのシステイン326に対応する第2のアミノ酸と直接的または間接的に相互作用することが可能であるように、配列番号1に示されるヒトNAGALポリペプチドのアスパラギン213に対応する第1のアミノ酸が、前記1つまたは複数のアミノ酸によって置換されている;または
1つまたは複数のアミノ酸のうち少なくとも1つが、配列番号1に示されるヒトNAGALポリペプチドのアスパラギン213に対応する第1のアミノ酸と直接的または間接的に相互作用することが可能であるように、配列番号1に示されるヒトNAGALポリペプチドのシステイン326に対応する第2のアミノ酸が、前記1つまたは複数のアミノ酸によって置換されている;または
前記第1のアミノ酸を置換する前記1つまたは複数のアミノ酸のうち少なくとも1つが、前記第2のアミノ酸を置換する前記1つまたは複数のアミノ酸のうち少なくとも1つと直接的または間接的に相互作用することが可能であるように、配列番号1に示されるヒトNAGALポリペプチドのアスパラギン213に対応する第1のアミノ酸が、1つまたは複数のアミノ酸によって置換され、配列番号1に示されるヒトNAGALポリペプチドのシステイン326に対応する第2のアミノ酸が、1つまたは複数のアミノ酸によって置換されている、ヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片。 - 前記第1のアミノ酸が、1つ、2つもしくは3つのアミノ酸によって置換されている;または
前記第2のアミノ酸が、1つ、2つもしくは3つのアミノ酸によって置換されている;または
前記第1のアミノ酸が、1つ、2つもしくは3つのアミノ酸によって置換され、前記第2のアミノ酸が、1つ、2つもしくは3つのアミノ酸によって置換されている、請求項14に記載のヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片。 - 前記第1のアミノ酸が、1つのアミノ酸によって置換されている;または
前記第2のアミノ酸が、1つのアミノ酸によって置換されている;または
前記第1のアミノ酸が、1つのアミノ酸によって置換され、前記第2のアミノ酸が、1つのアミノ酸によって置換されている、請求項14に記載のヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片。 - 前記第1のアミノ酸がアスパラギンであり、
前記アスパラギンが、アスパラギン以外の1つまたは複数のアミノ酸によって置換されている;または
前記アスパラギンが、アスパラギン以外の1つ、2つもしくは3つのアミノ酸によって置換されている;または
前記アスパラギンが、アスパラギン以外の1つのアミノ酸によって置換されている、請求項14から16のいずれか一項に記載のヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片。 - 前記第2のアミノ酸がシステインであり、
前記システインが、システイン以外の1つまたは複数のアミノ酸によって置換されている;または
前記システインが、システイン以外の1つ、2つもしくは3つのアミノ酸によって置換されている;または
前記システインが、システイン以外の1つのアミノ酸によって置換されている、請求項14から17のいずれか一項に記載のヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片。 - 前記相互作用が、イオン性相互作用または水素結合相互作用またはファンデルワールス相互作用である、請求項14から18のいずれか一項に記載のヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片。
- 前記イオン性相互作用が、少なくとも1つのイオン対の形成を含む、請求項19に記載のヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片。
- 前記少なくとも1つのイオン対が、前記第1のアミノ酸を置換する前記1つまたは複数のアミノ酸に含まれるアミノ酸の負に荷電した側鎖基と、前記第2のアミノ酸を置換する前記1つまたは複数のアミノ酸に含まれるアミノ酸の正に荷電した側鎖基との間に形成される、請求項20に記載のヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片。
- 前記水素結合相互作用が、直接的相互作用である、または前記水素結合相互作用が、1つもしくは複数の溶媒分子、好ましくは1つもしくは複数の水分子を含む、請求項19に記載のヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片。
- α−ガラクトシダーゼ活性を獲得するなどのためにさらに改変される、請求項1から22のいずれか一項に記載のヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片。
- 配列番号1に示されるヒトNAGALポリペプチドのアミノ酸171の位置に対応するアミノ酸位置におけるSからEへの置換、および配列番号1に示されるヒトNAGALポリペプチドのアミノ酸174の位置に対応するアミノ酸位置におけるAからLへの置換を含む、請求項23に記載のヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片。
- 前記ヒトNAGALポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号6に示されるとおりであるか、もしくは前記機能的に活性なバリアントが、配列番号6に対して少なくとも90%の配列同一性を示す;または
前記ヒトNAGALポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号7に示されるとおりであるか、もしくは前記機能的に活性なバリアントが、配列番号7に対して少なくとも90%の配列同一性を示す;または
前記ヒトNAGALポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号8に示されるとおりであるか、もしくは前記機能的に活性なバリアントが、配列番号8に対して少なくとも90%の配列同一性を示す;または
前記ヒトNAGALポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号9に示されるとおりであるか、もしくは前記機能的に活性なバリアントが、配列番号9に対して少なくとも90%の配列同一性を示す、請求項23または24に記載のヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片。 - 前記ヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片のC末端もしくはN末端のいずれかまたは両方の末端に、任意選択で1つまたは複数のリンカーペプチドによって接続された1つまたは複数の異種アミノ酸配列などの1つまたは複数の異種アミノ酸配列をさらに含む、請求項1から25のいずれか一項に記載のヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片。
- 1つまたは複数のN−グリカンを含み、好ましくは、前記N−グリカンのうち1つまたは複数がリン酸化され、より好ましくは、前記N−グリカンの数で40%またはそれよりも多くがリン酸化される、請求項1から26のいずれか一項に記載のヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片。
- 前記リン酸化されたN−グリカンのうち1つまたは複数が、脱キャップ化および脱マンノシル化され、好ましくは、前記リン酸化されたN−グリカンの数で40%またはそれよりも多くが、脱キャップ化および脱マンノシル化される、請求項27に記載のヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片。
- 治療における使用のための、請求項1から28のいずれか一項に記載のヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片。
- ファブリー病を処置する方法における使用のための、請求項23から25のいずれか一項または請求項23から25のいずれか一項に従属する請求項26から28のいずれか一項に記載のヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片、あるいはシンドラー病または神崎病を処置する方法における使用のための、請求項1から22のいずれか一項または請求項1から22のいずれか一項に従属する請求項26から28のいずれか一項に記載のヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片。
- かかる処置を必要とするヒト対象においてファブリー病を処置する方法であって、請求項23から25のいずれか一項または請求項23から25のいずれか一項に従属する請求項26から28のいずれか一項に記載のヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片の治療有効量を前記対象に投与するステップを含む方法、あるいはかかる処置を必要とするヒト対象においてシンドラー病または神崎病を処置する方法であって、請求項1から22のいずれか一項または請求項1から22のいずれか一項に従属する請求項26から28のいずれか一項に記載のヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片の治療有効量を前記対象に投与するステップを含む方法。
- 請求項1から28のいずれか一項に記載のヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を含む、医薬組成物。
- 請求項1から28のいずれか一項に記載のヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片をコードする核酸配列を含む、核酸分子。
- 請求項33に記載の核酸分子と前記核酸分子に作動可能に連結したプロモーターとを含む発現カセットまたは発現ベクターであって、好ましくは、前記発現カセットまたは発現ベクターが、宿主細胞、好ましくは真菌細胞、より好ましくはYarrowia lipolyticaまたはArxula adeninivoransにおいて、前記ヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片の発現をもたらすように構成される、発現カセットまたは発現ベクター。
- 治療における使用のための、請求項33に記載の核酸分子または請求項34に記載の発現カセットもしくは発現ベクター。
- 前記治療が、遺伝子治療またはmRNA治療である、請求項35に記載の使用のための、請求項33に記載の核酸分子または請求項34に記載の発現カセットもしくは発現ベクター。
- ファブリー病を処置する方法における使用のための、請求項23から25のいずれか一項または請求項23から25のいずれか一項に従属する請求項26から28のいずれか一項に記載のヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片をコードし、好ましくは、前記方法が、遺伝子治療方法またはmRNA治療方法である、請求項33に記載の核酸分子または請求項34に記載の発現カセットもしくは発現ベクター。
- シンドラー病または神崎病を処置する方法における使用のための、請求項1から22のいずれか一項または請求項1から22のいずれか一項に従属する請求項26から28のいずれか一項に記載のヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片をコードし、好ましくは、前記方法が、遺伝子治療方法またはmRNA治療方法である、請求項33に記載の核酸分子または請求項34に記載の発現カセットもしくは発現ベクター。
- かかる処置を必要とするヒト対象においてファブリー病を処置する方法であって、請求項23から25のいずれか一項または請求項23から25のいずれか一項に従属する請求項26から28のいずれか一項に記載のヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片をコードする請求項33に記載の核酸分子または請求項34に記載の発現カセットもしくは発現ベクターの治療有効量を前記対象に投与するステップを含み、好ましくは、遺伝子治療方法またはmRNA治療方法である、方法。
- かかる処置を必要とするヒト対象においてシンドラー病または神崎病を処置する方法であって、請求項1から22のいずれか一項または請求項1から22のいずれか一項に従属する請求項26から28のいずれか一項に記載のヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片をコードする請求項33に記載の核酸分子または請求項34に記載の発現カセットもしくは発現ベクターの治療有効量を前記対象に投与するステップを含み、好ましくは、遺伝子治療方法またはmRNA治療方法である、方法。
- 請求項33に記載の核酸分子または請求項34に記載の発現カセットもしくは発現ベクターを含む、医薬組成物。
- 請求項33に記載の核酸分子または請求項34に記載の発現カセットもしくは発現ベクターを含む、宿主細胞。
- 前記宿主細胞が、真菌細胞、好ましくはYarrowia lipolyticaまたはArxula adeninivoransである、請求項42に記載の宿主細胞。
- − N−グリカン活性の外鎖伸長における欠損、例えば、OCH1活性における欠損を含むように遺伝子操作される;および/あるいは
− MNN4、PNO1、MNN6またはそれらのいずれか1つの生物学的に活性なバリアントもしくは断片などの、N−グリカンのマンノシルリン酸化をもたらすことが可能なポリペプチドの発現を含むように遺伝子操作される、請求項42または43に記載の宿主細胞。 - 請求項42から44のいずれか一項に記載の宿主細胞の実質的に純粋な培養物。
- 宿主細胞において請求項1から28のいずれか一項に記載のヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片の発現を達成するための、請求項33に記載の核酸分子または請求項34に記載の発現カセットもしくは発現ベクターの使用であって、好ましくは、前記宿主細胞が、真菌細胞、より好ましくはYarrowia lipolyticaまたはArxula adeninivoransである、使用。
- 請求項1から28のいずれか一項に記載のヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を産生するための方法であって、
a)宿主細胞が、前記ヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を発現するように、請求項42から44のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養するステップ、
b)前記宿主細胞または宿主細胞培養培地から、前記ヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片を収集するステップであって、必要に応じて単離するステップ
を含む方法。 - 前記ヒトNAGALポリペプチドまたはその機能的に活性なバリアントもしくは断片に含まれるリン酸化されたN−グリカンの少なくとも一部の脱キャップ化および脱マンノシル化をさらに含み、例えば、前記脱キャップ化および脱マンノシル化が、in vitroで、または前記宿主細胞中で、または前記宿主細胞の溶解物中で起こる、請求項47に記載の方法。
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