JP2019500901A - 核酸の混合物を含むサンプルでコピー数異常を決定する方法 - Google Patents

核酸の混合物を含むサンプルでコピー数異常を決定する方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、１つ以上の対象配列の量において、異なると知られているか、異なると考えられる核酸の混合物でコピー数異常を決定する方法に関し、より詳細には、染色体の間およびシーケンシングの間で発生した可変性を解釈するために、生物情報学的分析法および統計的分析法を含むコピー数異常の決定方法に関する。本発明による多型決定方法は、胎児の医学的疾患に関連するか、関連すると考えられる染色体コピー数異常を決定するのに用いることができる。本発明の方法によって決定可能な染色体コピー数異常は、染色体１‐２２、ＸおよびＹの任意の１つ以上の三染色体および一染色体、全体の核酸配列に対する多染色体、および染色体の任意の１つ以上の配列断片の欠失および／または重複を含むことができるため、胎児の性別およびコピー数異常の分析において有用である。

Description

本発明は、胎児の性別およびコピー数異常を検出する方法に関し、より具体的には、妊婦の生体試料からＤＮＡを抽出し、配列情報を獲得した後、染色体領域の正規化校正および参照染色体をランダムに配列する方法を用いた非侵襲的な胎児染色体異常検出方法に関する。
胎児染色体異常に対する従来の出生前検査の項目としては、超音波検査、血中標識子検査、羊水検査、絨毛膜検査、経皮臍帯血検査などがある（Ｍａｌｏｎｅ ＦＤ，ｅｔ ａｌ．２００５；Ｍｕｊｅｚｉｎｏｖｉｃ Ｆ，ｅｔ ａｌ．２００７）。このうち、超音波検査と血中標識子検査は選別検査に、羊水染色体検査は確診検査に分類される。非侵襲的な方法である超音波検査と血中標識子検査は、胎児に対して直接的な試料採取を行わないため安全な方法であるが、検査の敏感度が８０％以下と低い（ＡＣＯＧ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｐｒａｃｔｉｃｅ Ｂｕｌｌｅｔｉｎｓ．２００７）。侵襲的な方法である羊水検査、絨毛膜検査、経皮臍帯血検査は、胎児染色体異常を確診することができるが、侵襲的医療行為による胎児の消失可能性が存在するという欠点がある（Ｍｕｊｅｚｉｎｏｖｉｃ Ｆ，ｅｔ ａｌ．２００７）。１９９７年Ｌｏらは、母体の血漿および血清中の胎児由来の遺伝物質のＹ染色体の塩基配列分析に成功したため、母体中の胎児遺伝物質を出生前検査に用いることとなった（Ｌｏ ＹＭ，ｅｔ ａｌ．１９９７）。母体の血液中の胎児遺伝物質は、胎盤の再形成過程のうち細胞死滅過程を経た栄養膜細胞の一部が物質交換機転によって母体の血液中に入ったものであって、実際には胎盤由来のものであり、これをｃｆｆ ＤＮＡ（ｃｅｌｌ‐ｆｒｅｅ ｆｅｔａｌ ＤＮＡ）と定義する。ｃｆｆ ＤＮＡは、早い場合には胚移植１８日目から、３７日目には殆どの母体血液中で発見される（Ｇｕｉｂｅｒｔ Ｊ，ｅｔ ａｌ．２００３）。ｃｆｆ ＤＮＡは、３００ｂｐ以下の短い鎖であり、母体の血液中に少量で存在する特徴を有しているため、それを胎児染色体異常の検出に適用するために、次世代シーケンサー（ＮＧＳ）を用いた大規模の並列塩基分析技術が用いられている。大規模の並列塩基分析技術を用いた非侵襲的な胎児染色体異常検出の性能は、染色体によって、９０‐９９％以上の検出敏感度を示しているが、偽陽性および偽陰性の結果が１‐１０％に相当するため、これに対する校正技術が必要な状況である（Ｇｉｌ ＭＭ，ｅｔ ａｌ．２０１５）。
そこで、本発明者らは、上記の問題点を解決し、高い敏感度、および低い偽陽性および偽陰性の結果を示す胎児染色体異常検出方法を開発すべく努力した結果、胎児染色体領域の正規化校正および参照染色体のランダム置換を行う場合、高い敏感度、および低い偽陽性／偽陰性の結果を有する分析結果が得られることを確認し、本発明を完成した。
本発明の目的は、非侵襲的に胎児の性別およびコピー数異常を検出する方法を提供することである。
本発明の他の目的は、非侵襲的に胎児の性別およびコピー数異常を検出する装置を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、前記方法で胎児の性別およびコピー数異常を検出するプロセッサにより実行されるように構成される命令を含むコンピュータ読み取り可能な媒体を提供することである。
前記目的を達成するために、本発明は、ａ）妊婦の生体試料からＤＮＡを抽出して抽出されたＤＮＡから配列情報を獲得するステップと、ｂ）獲得した配列情報（ｒｅａｄｓ）を標準遺伝子配列データベース（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｏｍｅ ｄａｔａｂａｓｅ）に整列（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）するステップと、ｃ）整列された配列情報（ｒｅａｄｓ）に対してＱ‐スコア（Ｑ‐ｓｃｏｒｅ）を計算し、基準値（ｃｕｔ‐ｏｆｆ ｖａｌｕｅ）以下の配列情報のみを選別するステップと、ｄ）選別された配列情報（ｒｅａｄｓ）に対してＧ‐スコア（Ｇ‐ｓｃｏｒｅ）を計算し、参照染色体の組み合わせと比較して、胎児の性別およびコピー数異常を決定するステップと、を含む、胎児の性別およびコピー数異常検出方法を提供する。
本発明はまた、妊婦の生体試料からＤＮＡを抽出して抽出されたＤＮＡから配列情報を解読する解読部と、獲得した配列情報（ｒｅａｄｓ）を標準遺伝子配列データベース（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｏｍｅ ｄａｔａｂａｓｅ）に整列（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）する整列部と、整列された配列情報（ｒｅａｄｓ）に対してＱ‐スコア（Ｑ‐ｓｃｏｒｅ）を計算し、基準値（ｃｕｔ‐ｏｆｆ ｖａｌｕｅ）以下の配列情報のみを選別する品質管理部と、選別された配列情報（ｒｅａｄｓ）に対してＧ‐スコア（Ｇ‐ｓｃｏｒｅ）を計算し、参照染色体の組み合わせと比較して、胎児の性別およびコピー数異常を決定する性別およびコピー数異常決定部と、を含む、胎児の性別およびコピー数異常検出装置を提供する。
本発明はまた、コンピュータ読み取り可能な媒体として、胎児の性別およびコピー数異常を検出するプロセッサにより実行されるように構成される命令を含むが、ａ）妊婦の生体試料からＤＮＡを抽出して抽出されたＤＮＡから配列情報を獲得するステップと、ｂ）獲得した配列情報（ｒｅａｄｓ）を標準遺伝子配列データベース（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｏｍｅ ｄａｔａｂａｓｅ）に整列（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）するステップと、ｃ）整列された配列情報（ｒｅａｄｓ）に対してＱ‐スコア（Ｑ‐ｓｃｏｒｅ）を計算し、基準値（ｃｕｔ‐ｏｆｆ ｖａｌｕｅ）以下の配列情報のみを選別するステップと、ｄ）選別された配列情報（ｒｅａｄｓ）に対してＧ‐スコア（Ｇ‐ｓｃｏｒｅ）を計算し、参照染色体の組み合わせと比較して、胎児の性別およびコピー数異常を決定するステップと、を含む方法により、胎児の性別およびコピー数異常を検出するプロセッサにより実行されるように構成される命令を含むコンピュータ読み取り可能な媒体を提供する。
本発明の胎児の性別およびコピー数異常を検出するための全体フローチャートである。 ｒｅａｄ ｄａｔａのＱＣ過程中、ＬＯＥＳＳアルゴリズムによるＧＣ正規化校正前と後の補正結果を図式化したものである。 ｒｅａｄ ｄａｔａのＱＣ過程中、ＬＯＥＳＳアルゴリズムによる染色体毎の変動係数（ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｏｆ Ｖａｒｉａｔｉｏｎ；ＣＶ）値の正規化校正前と後の補正結果を図式化したものである。 本発明の方法により染色体異常群と正常群に対して計算したＧ‐スコア値を比較した模式図である。
他の方式で定義されない限り、本明細書において使用されたあらゆる技術的・科学的用語は、本発明が属する技術分野に熟練した専門家によって通常理解されるものと同じ意味を有する。通常、本明細書において使用された命名法及び以下で詳述する實驗方法は、本技術分野において周知であり、しかも汎用されるものである。
本発明では、サンプルから獲得した配列分析データを正規化し、基準値に基づいて正規化されたデータを整列した後、参照染色体の組み合わせをランダム置換（ｒａｎｄｏｍ ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）して、健常者グループと実験対象者の染色体のＧ‐スコア（Ｇ‐ｓｃｏｒｅ）差の絶対値が最大値を満たす参照染色体の組み合わせを導出することで、胎児の性別およびコピー数異常を検出する場合、高い敏感度、および低い偽陽性／偽陰性エラー率で分析可能であるということを確認した。
すなわち、本発明の一実施形態では、妊婦の血液から抽出したＤＮＡをシーケンシングした後、ＬＯＥＳＳアルゴリズムを用いて品質を管理し、Ｇ‐スコア（Ｇ‐ｓｃｏｒｅ）を計算してから、健常者グループと実験対象者の染色体のＧ‐スコア（Ｇ‐ｓｃｏｒｅ）差の絶対値が最大値を満たすまで参照染色体の組み合わせをランダム置換して決定し、これに基づいてＧ‐スコア（Ｇ‐ｓｃｏｒｅ）の基準値を決定し、これを超える際に、実験対象者の染色体のコピー数に異常があると決定する方法を開発した（図１）。
したがって、一観点において、本発明は、
ａ）妊婦の生体試料からＤＮＡを抽出して抽出されたＤＮＡから配列情報を獲得するステップと、
ｂ）獲得した配列情報（ｒｅａｄｓ）を標準遺伝子配列データベース（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｏｍｅ ｄａｔａｂａｓｅ）に整列（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）するステップと、
ｃ）整列された配列情報（ｒｅａｄｓ）に対してＱ‐スコア（Ｑ‐ｓｃｏｒｅ）を計算し、基準値（ｃｕｔ‐ｏｆｆ ｖａｌｕｅ）以下の配列情報のみを選別するステップと、
ｄ）選別された配列情報（ｒｅａｄｓ）に対してＧ‐スコア（Ｇ‐ｓｃｏｒｅ）を計算し、参照染色体の組み合わせと比較して、胎児の性別およびコピー数異常を決定するステップと、を含む、胎児の性別およびコピー数異常検出方法に関する。
本発明において、前記選別された配列情報が染色体１３である場合、参照染色体の組み合わせは、これに限定されないが、４番および６番染色体であってもよく、選別された配列情報が染色体１８である場合、参照染色体の組み合わせは、これに限定されないが、４番、７番、１０番および１６番であってもよく、選別された配列情報が染色体２１である場合、参照染色体の組み合わせは、これに限定されないが、７番、１１番、１４番および２２番であってもよく、選別された配列情報が染色体Ｘである場合、参照染色体の組み合わせは、これに限定されないが、１６番および２０番染色体であってもよく、選別された配列情報が染色体Ｙである場合、参照染色体の組み合わせは、これに限定されないが、１番、２番、３番、４番、５番、６番、７番、８番、９番、１０番、１１番、１２番、１４番、１５番、１７番および１９番染色体であることを特徴とする。
本発明において、
前記ａ）ステップは、
（ｉ）胎児および母体の核酸混合物を、羊水検査（ａｍｎｉｏｃｅｎｔｅｓｉｓ）により獲得された羊水（ａｍｎｉｏｔｉｃ ｆｌｕｉｄ）、絨毛膜絨毛採取（ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ ｖｉｌｌｉ ｓａｍｐｌｉｎｇ）により獲得された絨毛（ｖｉｌｌｕｓ）、経皮下臍帯血採取（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｂｌｏｏｄ ｓａｍｐｌｉｎｇ）により獲得された臍帯血（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ）、自然流産された胎児組織（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｍｉｓｃａｒｒｙｉｎｇ ｆｅｔｕｓ ｔｉｓｓｕｅ）、またはヒトの末梢血（ｈｕｍａｎ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ）から取得するステップと、
（ｉｉ）採取された胎児および母体の核酸混合物から、塩析法（ｓａｌｔｉｎｇ‐ｏｕｔ ｍｅｔｈｏｄ）、カラムクロマトグラフィー法（ｃｏｌｕｍｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｍｅｔｈｏｄ）、ビーズ法（ｂｅａｄ−ｂａｓｅｄ ｍｅｔｈｏｄ）によりタンパク質、脂肪、およびその他の残余物を除去することで、精製された核酸を取得するステップと、
（ｉｉｉ）精製された核酸、または酵素的切断、粉砕、ハイドロシェア法（ｈｙｄｒｏｓｈｅａｒ ｍｅｔｈｏｄ）によりランダム断片化（ｒａｎｄｏｍ ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）された核酸に対して、シングルエンドシーケンシング（ｓｉｎｇｌｅ‐ｅｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）またはペアエンドシーケンシング（ｐａｉｒ‐ｅｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）ライブラリー（ｌｉｂｒａｒｙ）を製作するステップと、
（ｉｖ）製作されたライブラリーを次世代シーケンサー（ｎｅｘｔ‐ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）に反応させるステップと、
（ｖ）次世代シーケンサーで核酸の配列情報（ｒｅａｄｓ）を獲得するステップと、を含むことを特徴とする。
本発明において、前記次世代シーケンサー（ｎｅｘｔ‐ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）は、これに制限されないが、Ｈｉｓｅｑシステム（イルミナ株式会社製）、Ｍｉｓｅｑシステム（イルミナ株式会社製）、ゲノム分析機（ＧＡ）システム（イルミナ株式会社製）、４５４ＦＬＸ（ロシュカンパニー製）、ＳＯＬｉＤシステム（アプライドバイオシステムズ製）、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔシステム（ライフテクノロジーズ製）であってもよい。
本発明において、前記整列ステップは、これに制限されないが、ＢＷＡアルゴリズムまたはＧＲｃｈ３８配列を利用して行われるものであってもよい。
本発明において、前記ｃ）ステップは、
（ｉ）各整列された核酸配列の領域を特定するステップと、
（ｉｉ）マッピングクオリティスコア（ｍａｐｐｉｎｇ ｑｕａｌｉｔｙ ｓｃｏｒｅ）とＧＣ比率の基準値を満たす配列を特定するステップと、
（ｉｉｉ）前記特定された配列のうち、任意の事例１の染色体Ｎ（ＣｈｒＮ）の分率を下記の数式１によって計算するステップと、
（ｉｖ）染色体Ｎ番領域のＺ‐スコアを下記の数式２によって計算するステップと、
（ｖ）任意の事例１の１３、１８、２１番染色体にあたる領域のＺ‐スコアを除き、残りの染色体領域に対するＺ‐スコア（Ｚ‐ｓｃｏｒｅ）の標準偏差をＱ‐スコア（Ｑ‐ｓｃｏｒｅ）として計算するステップと、
（ｖｉ）Ｑ‐スコアの基準値を決定し、計算されたＱ‐スコア値が基準値を超える場合、基準未達である判定し、該当サンプルから配列情報（ｒｅａｄｓ）を再生産するステップと、を含むことを特徴とする。
本発明において、核酸配列の領域を特定する前記（ｉ）ステップで、核酸配列の領域は、これに制限されないが、２０ｋｂ〜１ＭＢであってもよい。
本発明において、前記（ｉｉ）ステップのマッピングクオリティスコア（ｍａｐｐｉｎｇ ｑｕａｌｉｔｙ ｓｃｏｒｅ）は、所望の基準によって変わり得るが、好ましくは１５〜７０スコア、さらに好ましくは５０〜７０スコアであってもよく、最も好ましくは６０スコアであってもよい。
本発明において、前記（ｉｉ）ステップのＧＣ比率は、所望の基準によって変わり得るが、好ましくは２０〜７０％、最も好ましくは３０〜６０％であることを特徴とする。
本発明において、前記（ｖｉ）ステップの基準値は、４であり、好ましくは３、最も好ましくは２であることを特徴とする。
本発明において、前記事例グループは、胎児の性別および染色体コピー数異常を検出するためのサンプルを意味し、参照グループは、これに限定されないが、標準遺伝子配列データベースのように比較できるｒｅｆｅｒｅｎｃｅ染色体グループを意味する。
本発明において、コピー数異常を決定する前記（ｄ）ステップは、
（ｉ）１番から２２番染色体から、ランダムに参照染色体を選別するステップと、
（ｉｉ）任意の染色体Ｎの分率値を下記の数式３によって計算するステップと、
（ｉｉｉ）任意の事例１の染色体Ｎ番のＧ‐スコア（Ｇ‐ｓｃｏｒｅ）を下記の数式４によって計算するステップと、
（ｉｖ）前記（ｉ）〜（ｉｉｉ）ステップを繰り返して行うことで、正常群と非正常群とのＧ‐スコア値差を最大にする染色体の組み合わせを選別するステップと、
（ｖ）前記（ｉｖ）ステップで得た染色体の組み合わせを用いてＧ‐スコアを計算し、計算されたＧ‐スコア値が基準値より低い場合には、コピー数減少と決定し、基準値より高い場合には、コピー数増加と決定するステップと、を含むことを特徴とする。
本発明において、前記（ｉｖ）ステップで繰り返して行う回数は、１００回以上、好ましくは１，０００回以上、最も好ましくは１００，０００回以上であってもよい。
本発明において、前記（ｖ）ステップのＧ‐スコアの基準値は、正常染色体で計算した値であれば制限されずに用いることができるが、好ましくは−２または２、最も好ましくは−３または３であることを特徴とする。
本発明において、胎児の性別を決定する前記（ｄ）ステップは、
（ｉ）前記コピー数異常を決定するステップの（ｉ）〜（ｉｖ）ステップを、胎児の核型が４６、ＸＸまたは４６、ＸＹである母の参照グループで行うことで、ＸおよびＹ染色体のＧ‐スコア基準値を獲得するステップと、
（ｉｉ）任意の事例のＸおよびＹ染色体のＧ‐スコアを前記基準値と比較して性別を決定するステップと、を含むことを特徴とする。
本発明において、前記ＸおよびＹ染色体に対するＧ‐スコアが基準値は、これに限定されないが、−２または２、最も好ましくは−３または３であることを特徴とし、Ｘ染色体に対するＧ‐スコアが基準値より低い場合には、性染色体をＸＯと決定し、基準値より高い場合には、Ｘ染色体が３つ以上であると決定して、Ｙ染色体に対するＧ‐スコアが基準値以上である場合には、Ｙ染色体が１つ以上であると決定することを特徴とする。
本発明において、前記Ｙ染色体が１つ以上である場合、Ｘ染色体の胎児分画を数式５によって、Ｙ染色体の胎児分画を数式６によって計算し、Ｘ染色体分画に対するＹ染色体分画の比率を数式７で計算した後、その値が０．７〜１．４である場合には、性染色体をＸＹと決定し、１．４〜２．６である場合には、性染色体をＸＹＹであると決定することを特徴とする：
他の観点において、本発明は、妊婦の生体試料からＤＮＡを抽出して抽出されたＤＮＡから配列情報を解読する解読部と、獲得した配列情報（ｒｅａｄｓ）を標準遺伝子配列データベース（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｏｍｅ ｄａｔａｂａｓｅ）に整列（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）する整列部と、整列された配列情報（ｒｅａｄｓ）に対してＱ‐スコア（Ｑ‐ｓｃｏｒｅ）を計算し、基準値（ｃｕｔ‐ｏｆｆ ｖａｌｕｅ）以下の配列情報のみを選別する品質管理部と、選別された配列情報（ｒｅａｄｓ）に対してＧ‐スコア（Ｇ‐ｓｃｏｒｅ）を計算し、参照染色体の組み合わせと比較して、胎児の性別およびコピー数異常を決定する性別およびコピー数異常決定部と、を含む、胎児の性別およびコピー数異常検出装置に関する。
本発明において、上記選別された配列情報が染色体１３である場合、参照染色体の組み合わせは、これに限定されないが、４番および６番染色体であってもよく、選別された配列情報が染色体１８である場合、参照染色体の組み合わせは、これに限定されないが、４番、７番、１０番および１６番であってもよく、選別された配列情報が染色体２１である場合、参照染色体の組み合わせは、これに限定されないが、７番、１１番、１４番および２２番であってもよく、選別された配列情報が染色体Ｘである場合、参照染色体の組み合わせは、これに限定されないが、１６番および２０番染色体であってもよく、選別された配列情報が染色体Ｙである場合、参照染色体の組み合わせは、これに限定されないが、１番、２番、３番、４番、５番、６番、７番、８番、９番、１０番、１１番、１２番、１４番、１５番、１７番および１９番染色体であることを特徴とする。
本発明において、前記解読部は、（ｉ）胎児および母体の核酸混合物を、羊水検査（ａｍｎｉｏｃｅｎｔｅｓｉｓ）により獲得された羊水（ａｍｎｉｏｔｉｃ ｆｌｕｉｄ）、絨毛膜絨毛採取（ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ ｖｉｌｌｉ ｓａｍｐｌｉｎｇ）により獲得された絨毛（ｖｉｌｌｕｓ）、経皮下臍帯血採取（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｂｌｏｏｄ ｓａｍｐｌｉｎｇ）により獲得された臍帯血（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ）、自然流産された胎児組織（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｍｉｓｃａｒｒｙｉｎｇ ｆｅｔｕｓ ｔｉｓｓｕｅ）、またはヒトの末梢血（ｈｕｍａｎ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ）から取得するサンプル採取部と、（ｉｉ）採取された胎児および母体の核酸混合物から、塩析法（ｓａｌｔｉｎｇ‐ｏｕｔ ｍｅｔｈｏｄ）、カラムクロマトグラフィー法（ｃｏｌｕｍｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｍｅｔｈｏｄ）、ビーズ法（ｂｅａｄ−ｂａｓｅｄ ｍｅｔｈｏｄ）によりタンパク質、脂肪、およびその他の残余物を除去することで、精製された核酸を取得する核酸取得部と、（ｉｉｉ）精製された核酸、または酵素的切断、粉砕、ハイドロシェア法（ｈｙｄｒｏｓｈｅａｒ ｍｅｔｈｏｄ）によりランダム断片化（ｒａｎｄｏｍ ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）された核酸に対して、シングルエンドシーケンシング（ｓｉｎｇｌｅ‐ｅｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）またはペアエンドシーケンシング（ｐａｉｒ‐ｅｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）ライブラリー（ｌｉｂｒａｒｙ）を製作するライブラリー製作部と、ｉｖ）製作されたライブラリーを次世代シーケンサー（ｎｅｘｔ‐ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）に反応させる次世代シーケンサーと、（ｖ）次世代シーケンサーで核酸の配列情報（ｒｅａｄｓ）を獲得する配列情報獲得部と、を含むことを特徴とする。
本発明において、前記次世代シーケンサー（ｎｅｘｔ‐ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）は、これに制限されないが、Ｈｉｓｅｑシステム（イルミナ株式会社製）、Ｍｉｓｅｑシステム（イルミナ株式会社製）、ゲノム分析機（ＧＡ）システム（イルミナ株式会社製）、４５４ＦＬＸ（ロシュカンパニー製）、ＳＯＬｉＤシステム（アプライドバイオシステムズ製）、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔシステム（ライフテクノロジーズ製）であってもよい。
本発明において、前記整列部は、これに制限されないが、ＢＷＡアルゴリズムまたはＧＲｃｈ３８配列を利用するものであってもよい。
本発明において、前記品質管理部は、
（ｉ）各整列された核酸配列の領域を特定する領域特定部と、
（ｉｉ）マッピングクオリティスコア（ｍａｐｐｉｎｇ ｑｕａｌｉｔｙ ｓｃｏｒｅ）とＧＣ比率の基準値を満たす配列を特定する配列特定部と、
（ｉｉｉ）前記特定された配列のうち、任意の事例１の染色体Ｎ（ＣｈｒＮ）の分率を下記の数式１によって計算する染色体分率計算部と、
（ｉｖ）染色体Ｎ番領域のＺ‐スコアを下記の数式２によって計算するＺ‐スコア計算部と、
（ｖ）任意の事例１の１３、１８、２１番染色体にあたる領域のＺ‐スコアを除き、残りの染色体領域に対するＺ‐スコア（Ｚ‐ｓｃｏｒｅ）の標準偏差をＱ‐スコア（Ｑ‐ｓｃｏｒｅ）として計算するＱ‐スコア（Ｑ‐ｓｃｏｒｅ）計算部と、
（ｖｉ）Ｑ‐スコアの基準値を決定し、計算されたＱ‐スコア値が基準値を超える場合、基準未達である判定し、該当サンプルから配列情報（ｒｅａｄｓ）を再生産する品質整理部と、を含むことを特徴とする。
本発明において、前記領域特定部で核酸配列の領域は、これに制限されないが、２０ｋｂ〜１ＭＢであってもよい。
本発明において、前記配列特定部のマッピングクオリティスコア（ｍａｐｐｉｎｇ ｑｕａｌｉｔｙ ｓｃｏｒｅ）は、所望の基準によって変わり得るが、好ましくは１５〜７０スコア、さらに好ましくは５０〜７０スコアであってもよく、最も好ましくは６０スコアであってもよい。
本発明において、前記配列特定部のＧＣ比率は、所望の基準によって変わり得るが、好ましくは２０〜７０％、最も好ましくは３０〜６０％であることを特徴とする。
本発明において、前記品質整理部の基準値は、４であり、好ましくは３、最も好ましくは２であることを特徴とする。
本発明において、前記事例グループは、胎児の性別および染色体コピー数異常を検出するためのサンプルを意味し、参照グループは、これに限定されないが、標準遺伝子配列データベースのように比較できるｒｅｆｅｒｅｎｃｅ染色体グループを意味する。
本発明において、前記性別およびコピー数異常常決定部のコピー数異を決定するコピー数異常決定部は、
（ｉ）１番から２２番染色体から、ランダムに参照染色体を選別するランダム置換（ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）部と、
（ｉｉ）任意の染色体Ｎの分率値を下記の数式３によって計算する染色体分率計算部と、
（ｉｉｉ）任意の事例１の染色体Ｎ番のＧ‐スコア（Ｇ‐ｓｃｏｒｅ）を下記の数式４によって計算するＧ‐スコア計算部と、
（ｉｖ）前記（ｉ）〜（ｉｉｉ）装置の動作を繰り返して行うことで、正常群と非正常群とのＧ‐スコア値差を最大にする染色体の組み合わせを選別する参照染色体組み合わせ選別部と、
（ｖ）前記参照染色体組み合わせ選別部で選別された染色体の組み合わせを用いてＧ‐スコアを計算し、計算されたＧ‐スコア値が基準値より低い場合には、コピー数減少と決定し、基準値より高い場合には、コピー数増加と決定するコピー数異常決定部と、を含むことを特徴とする。
本発明において、前記最適参照染色体組み合わせＧ‐スコア計算部の繰り返して行う回数は、１００回以上、好ましくは１，０００回以上、最も好ましくは１００，０００回以上であってもよい。
本発明において、前記コピー数異常決定部のＧ‐スコアの基準値は、正常染色体で計算した値であれば制限されずに用いることができるが、好ましくは−２または２、最も好ましくは−３または３であることを特徴とする。
本発明において、前記性別およびコピー数異常決定部は、（ｉ）コピー数異常を決定する前記性別およびコピー数異常決定部の（ｉ）〜（ｉｖ）装置の動作を、胎児の核型が４６、ＸＸまたは４６、ＸＹである母の参照グループで行うことで、ＸおよびＹ染色体のＧ‐スコア基準値を獲得するＧ‐スコア基準値計算部と、（ｉｉ）任意の事例のＸおよびＹ染色体のＧ‐スコアを前記基準値と比較して性別を決定する性別決定部と、を含むことを特徴とする。
本発明において、前記ＸおよびＹ染色体に対するＧ‐スコアが基準値は、これに限定されないが、−２または２、最も好ましくは−３または３であることを特徴とし、Ｘ染色体に対するＧ‐スコアが基準値より低い場合には、性染色体をＸＯと決定し、基準値より高い場合には、Ｘ染色体が３つ以上であると決定して、Ｙ染色体に対するＧ‐スコアが基準値以上である場合には、Ｙ染色体が１つ以上であると決定することを特徴とする。
本発明において、前記Ｙ染色体が１つ以上である場合、Ｘ染色体の胎児分画を数式５によって、Ｙ染色体の胎児分画を数式６によって計算し、Ｘ染色体分画に対するＹ染色体分画の比率を数式７で計算した後、その値が０．７〜１．４である場合には、性染色体をＸＹと決定し、１．４〜２．６である場合には、性染色体をＸＹＹであると決定することを特徴とする：
さらに他の観点において、本発明は、コンピュータ読み取り可能な媒体として、胎児の性別およびコピー数異常を検出するプロセッサにより実行されるように構成される命令を含むが、ａ）妊婦の生体試料からＤＮＡを抽出して抽出されたＤＮＡから配列情報を獲得するステップと、ｂ）獲得した配列情報（ｒｅａｄｓ）を標準遺伝子配列データベース（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｏｍｅ ｄａｔａｂａｓｅ）に整列（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）するステップと、ｃ）整列された配列情報（ｒｅａｄｓ）に対してＱ‐スコア（Ｑ‐ｓｃｏｒｅ）を計算し、基準値（ｃｕｔ‐ｏｆｆ ｖａｌｕｅ）以下の配列情報のみを選別するステップと、ｄ）選別された配列情報（ｒｅａｄｓ）に対してＧ‐スコア（Ｇ‐ｓｃｏｒｅ）を計算し、参照染色体の組み合わせと比較して、胎児の性別およびコピー数異常を決定するステップと、を含む方法により、胎児の性別およびコピー数異常を検出するプロセッサにより実行されるように構成される命令を含むコンピュータ読み取り可能な媒体に関する。
以下、本発明を実施例を挙げて詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当業者において通常の知識を有する者にとって自明である。
実施例１．妊婦の血液からＤＮＡを抽出し、次世代シーケンシングを行う
総３５８人の妊婦から母体血液を１０ｍＬずつ採取してＥＤＴＡ Ｔｕｂｅに保管し、採取後２時間以内に、１２００ｇ、４℃、１５分の条件で血漿部分のみを一次遠心分離した後、一次遠心分離された血漿を１６０００ｇ、４℃、１０分の条件で二次遠心分離することで、沈殿物を除いた血漿上清を分離した。分離された血漿から、ＱＩＡａｍｐ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｋｉｔを用いてｃｅｌｌ‐ｆｒｅｅ ＤＮＡを抽出し、２‐４ｎｇのＤＮＡをライブラリーに製作し、ＮｅｘｔＳｅｑ装備で配列情報データを生産した。
実施例２．配列情報データの品質管理
母体‐胎児の遺伝物質が混合された塩基配列情報を前処理し、Ｚ‐スコアを計算する前に次の一連の過程を行った。次世代シーケンサー（ＮＧＳ）装備で生成されたＢｃｌファイル（塩基配列情報を含む）をｆａｓｔｑ形式に変換した後、ｆａｓｔｑファイルを、ＢＷＡ‐ｍｅｍアルゴリズムを用いて参照染色体Ｈｇ１９配列を基準としてライブラリー配列を整列した。ライブラリー配列の整列時にエラーが発生する可能性があるため、エラーを校正するための３つの過程を行った。先ず、重複されたライブラリー配列の除去作業を実施した後、ＢＷＡ‐ｍｅｍアルゴリズムにより整列されたライブラリー配列のうち、マッピングクオリティスコア（ｍａｐｐｉｎｇ ｑｕａｌｉｔｙ ｓｃｏｒｅ）が６０に達していない配列を除去し、最後に、マッパビリティ（Ｍａｐｐａｂｉｌｉｔｙ）値が０．７５以下である領域は除去し、ＬＯＥＳＳアルゴリズムを用いて染色体毎のＧＣ比率に応じて整列されたライブラリー配列の数字を校正した。一連の過程を経た後、整列エラーに対する校正が全て終わったｂｅｄファイルを生成した。
シーケンシングエラーの品質管理のために、次の一連の過程を行った。先ず、それぞれ染色体の相対的分率を計算する。例えば、１番染色体の相対的分率は次のように表現することができる。
染色体の相対的分率の計算が全て終わった後、事例１のＮ番染色体領域のＺ‐スコアは、次のように表現することができる。
１３、１８、２１番染色体にあたる領域のＺ‐スコアを除き、残りの染色体領域に対するＺ‐スコアの標準偏差をＱ‐スコアで表現することができる。
したがって、事例１のＺ‐スコア値の分布の標準偏差値が２を上回る場合、ＱＣ‐ｆａｉｌ（シーケンシングエラー）と判定して再実験およびデータ再生産を行い、前記のＱＣ過程を経た結果、図２および図３に示されているように、ｒｅａｄの分布が一定になることを確認することができた。
実施例３．Ｒａｎｄｏｍ Ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎを用いたＧ‐スコアの計算および胎児の性別／コピー数異常の決定
Ｇ‐スコアを計算するために、下記の過程を行った。先ず、関心染色体の相対的分率を計算する。例えば、特定染色体の相対的分率は次のように表現することができる：
このような特定染色体の相対的分率は、下記の数式３によって表現されてもよい：
また、全ての染色体に対して、対象者ＡのＧ‐スコアは次のように表現することができる：
このようなＧ‐スコアは、下記の数式４によって表現されてもよい：
健常者グループと対象者ＡのＮ番染色体のＧ‐スコア差の絶対値を求めてランダム置換（Ｒａｎｄｏｍ Ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）を行うことで、絶対値が最大値を満たす参照染色体の組み合わせを決定した。ランダム置換を徐々に増やしながら結果を比較したところ、多数のランダム置換の分析時に、表１のように５０％以上向上した結果を得ることができた。
参照染色体の組み合わせは、毎回の分析毎の最適化作業によって変更されることができ、１３番、１８番、２１番、Ｘ、Ｙ染色体のＧ‐スコアを決定するための１０回の作業のうち５回以上検出される組み合わせを、表２のように導出することができた。
検査サンプルの関心染色体に対して染色体異数性の有無を判定するために、正常群のＧ‐スコア範囲を計算および設定し、正常群のＧ‐ｓｃｏｒｅの最大値と最小値の範囲を外れる異常値（Ｏｕｔｌｉｅｒ）が発見される場合には、染色体異数性が検出されたと判定し、正常群のＧ‐スコアの最大値より大きい場合には、該当染色体のコピー数が付加されたと判定し、正常群のＧ‐スコアの最小値より小さい場合には、該当染色体のコピー数が消失されたと判定することと決定した。前記方法により染色体異常群（Ｔｒｉｓｏｍｙ ２１、Ｔｒｉｓｏｍｙ １８、Ｔｒｉｓｏｍｙ １３）と正常群を比較した結果、染色体異常群と正常群のＧ‐スコアの最大値／最小値が一致しないことを確認することができた（図４）。また、表３に示されているように、染色体異数性に対するＧ‐スコアの基準値がそれぞれ３（Ｔｒｉｓｏｍｙ ２１）、２．５５（Ｔｒｉｓｏｍｙ １８）、３．５（Ｔｒｉｓｏｍｙ １３）である際に、染色体異常（コピー数増加）を１００％の敏感度および特異度で検出したことを確認することができ、特異度の９５％信頼区間の下限値が９８％以上を上回ることを確認することができた。
以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業界における通常の知識を持った者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物により定義されると言える。
本発明による胎児の性別および染色体コピー数異常を区別する方法は、次世代シーケンシング（Ｎｅｘｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、ＮＧＳ）を用いて男女区分の正確度を高めるだけでなく、検出が困難であったＸＯ、ＸＸＸ、ＸＸＹなどの性染色体異常に対する検出正確度を高めることで、商業的活用度を高めることができる。したがって、本発明の方法は、胎児の性染色体数の異常に起因する奇形の有無を早期に判断することができる出生前診断において有用である。

Claims (14)

  1. ａ）妊婦の生体試料からＤＮＡを抽出して抽出されたＤＮＡから配列情報を獲得するステップと、
    ｂ）獲得した配列情報（ｒｅａｄｓ）を標準遺伝子配列データベース（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｏｍｅ ｄａｔａｂａｓｅ）に整列（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）するステップと、
    ｃ）整列された配列情報に対してＱ‐スコア（Ｑ‐ｓｃｏｒｅ）を計算し、基準値（ｃｕｔ‐ｏｆｆ ｖａｌｕｅ）以下の配列情報のみを選別するステップと、
    ｄ）選別された配列情報に対してＧ‐スコア（Ｇ‐ｓｃｏｒｅ）を計算し、参照染色体の組み合わせと比較して、胎児の性別およびコピー数異常を決定するステップと、
    を含む、胎児の性別およびコピー数異常検出方法。
  2. 前記ｄ）ステップの参照染色体の組み合わせは、選別された配列情報が染色体１３である場合、４番および６番染色体であり、選別された配列情報が染色体１８である場合、４番、７番、１０番および１６番染色体であり、選別された配列情報が染色体２１である場合、７番、１１番、１４番および２２番染色体であり、選別された配列情報が染色体Ｘである場合、１６番および２０番染色体であり、選別された配列情報が染色体Ｙである場合、１番、２番、３番、４番、５番、６番、７番、８番、９番、１０番、１１番、１２番、１４番、１５番、１７番および１９番染色体であることを特徴とする請求項１に記載の胎児の性別およびコピー数異常検出方法。
  3. 前記ａ）ステップは、
    （ｉ）胎児および母体の核酸混合物を、羊水検査（ａｍｎｉｏｃｅｎｔｅｓｉｓ）により獲得された羊水（ａｍｎｉｏｔｉｃ ｆｌｕｉｄ）、絨毛膜絨毛採取（ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ ｖｉｌｌｉ ｓａｍｐｌｉｎｇ）により獲得された絨毛（ｖｉｌｌｕｓ）、経皮下臍帯血採取（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｂｌｏｏｄ ｓａｍｐｌｉｎｇ）により獲得された臍帯血（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ）、自然流産された胎児組織（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｍｉｓｃａｒｒｙｉｎｇ ｆｅｔｕｓ ｔｉｓｓｕｅ）、またはヒトの末梢血（ｈｕｍａｎ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ）から取得するステップと、
    （ｉｉ）採取された胎児および母体の核酸混合物から、塩析法（ｓａｌｔｉｎｇ‐ｏｕｔ ｍｅｔｈｏｄ）、カラムクロマトグラフィー法（ｃｏｌｕｍｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｍｅｔｈｏｄ）、ビーズ法（ｂｅａｄ-ｂａｓｅｄ ｍｅｔｈｏｄ）によりタンパク質、脂肪、およびその他の残余物を除去することで、精製された核酸を取得するステップと、
    （ｉｉｉ）精製された核酸、または酵素的切断、粉砕、ハイドロシェア法（ｈｙｄｒｏｓｈｅａｒ ｍｅｔｈｏｄ）によりランダム断片化（ｒａｎｄｏｍ ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）された核酸に対して、シングルエンドシーケンシング（ｓｉｎｇｌｅ‐ｅｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）またはペアエンドシーケンシング（ｐａｉｒ‐ｅｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）ライブラリーを製作するステップと、
    （ｉｖ）製作されたライブラリーを次世代シーケンサー（ｎｅｘｔ‐ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）に反応させるステップと、
    （ｖ）次世代シーケンサーで核酸の配列情報を獲得するステップと、を含むことを特徴とする請求項１に記載の胎児の性別およびコピー数異常検出方法。
  4. 前記ｃ）ステップは、
    （ｉ）各整列された核酸配列の領域を特定するステップと、
    （ｉｉ）マッピングクオリティスコア（ｍａｐｐｉｎｇ ｑｕａｌｉｔｙ ｓｃｏｒｅ）とＧＣ比率の基準値を満たす配列を特定するステップと、
    （ｉｉｉ）前記特定された配列のうち、任意の事例１の染色体Ｎ（ＣｈｒＮ）の分率を下記の数式１によって計算するステップと、
    （ｉｖ）染色体Ｎ番領域のＺ‐スコア（Ｚ‐ｓｃｏｒｅ）を下記の数式２によって計算するステップと、
    （ｖ）任意の事例１の１３、１８、２１番染色体にあたる領域のＺ‐スコアを除き、残りの染色体領域に対するＺ‐スコアの標準偏差をＱ‐スコアとして計算するステップと、
    （ｖｉ）Ｑ‐スコアの基準値を決定し、計算されたＱ‐スコア値が基準値を超える場合、基準未達である判定し、該当サンプルから配列情報を再生産するステップと、を含むことを特徴とする請求項１に記載の胎児の性別およびコピー数異常検出方法。
  5. 前記マッピングクオリティスコアは１５〜７０であり、前記ＧＣ比率は３０〜６０％であることを特徴とする請求項４に記載の胎児の性別およびコピー数異常検出方法。
  6. 前記（ｖｉ）ステップの基準値は、４であることを特徴とする請求項４に記載の胎児の性別およびコピー数異常検出方法。
  7. 前記（ｄ）ステップは、
    （ｉ）１番から２２番染色体から、ランダムに参照染色体を選別するステップと、
    （ｉｉ）任意の染色体Ｎの分率値を下記の数式３によって計算するステップと、
    （ｉｉｉ）事例１の染色体Ｎ番のＧ‐スコアを下記の数式４によって計算するステップと、
    （ｉｖ）前記（ｉ）〜（ｉｉｉ）ステップを繰り返して行うことで、正常群と非正常群とのＧ‐スコア値差を最大にする染色体の組み合わせを選別するステップと、
    （ｖ）前記（ｉｖ）ステップで得た染色体の組み合わせを用いてＧ‐スコアを計算し、計算されたＧ‐スコア値が基準値より低い場合には、コピー数減少と決定し、基準値より高い場合には、コピー数増加と決定するステップと、を含むことを特徴とする請求項１に記載の胎児の性別およびコピー数異常検出方法。
  8. 前記（ｄ）ステップの胎児の性別を決定するステップは、
    （ｉ）請求項７に記載の（ｉ）〜（ｉｖ）ステップを、胎児の核型が４６、ＸＸまたは４６、ＸＹである妊婦の参照グループで行うことで、ＸおよびＹ染色体のＧ‐スコア基準値を獲得するステップと、
    （ｉｉ）任意の事例のＸおよびＹ染色体のＧ‐スコアを前記基準値と比較して性別を決定するステップと、を含むことを特徴とする請求項１に記載の胎児の性別およびコピー数異常検出方法。
  9. 前記Ｘ染色体に対するＧ‐スコアが基準値より低い場合には、性染色体をＸＯと決定し、基準値より高いである場合には、Ｘ染色体が３つ以上であると決定して、Ｙ染色体に対するＧ‐スコアが基準値以上である場合には、Ｙ染色体が１つ以上であると決定することを特徴とする請求項８に記載の胎児の性別およびコピー数異常検出方法。
  10. 前記Ｙ染色体が１つ以上である場合、Ｘ染色体の胎児分画を数式５によって、Ｙ染色体の胎児分画を数式６によって計算し、Ｘ染色体分画に対するＹ染色体分画の比率を数式７で計算した後、その値が０．７〜１．４である場合には、性染色体をＸＹと決定し、１．４〜２．６である場合には、性染色体をＸＹＹであると決定することを特徴とする請求項９に記載の胎児の性別およびコピー数異常検出方法:
  11. 前記基準値は、−２または２であることを特徴とする請求項７〜１０のいずれかに記載の胎児の性別およびコピー数異常検出方法。
  12. 前記（ｉｖ）ステップの繰り返して行う回数は、１００回以上であることを特徴とする請求項７に記載の胎児の性別およびコピー数異常検出方法。
  13. 妊婦の生体試料からＤＮＡを抽出して抽出されたＤＮＡから配列情報を解読する解読部と、
    獲得した配列情報を標準遺伝子配列データベースに整列する整列部と、
    整列された配列情報に対してＱ‐スコアを計算し、基準値以下の配列情報のみを選別する品質管理部と、
    選別された配列情報に対してＧ‐スコアを計算し、参照染色体の組み合わせと比較して、胎児の性別およびコピー数異常を決定する性別およびコピー数異常決定部と、を含む、胎児の性別およびコピー数異常検出装置。
  14. コンピュータ読み取り可能な媒体として、胎児の性別およびコピー数異常を検出するプロセッサにより実行されるように構成される命令を含むが、
    ａ）妊婦の生体試料からＤＮＡを抽出して配列情報を獲得するステップと、
    ｂ）獲得した配列情報を標準遺伝子配列データベースに整列するステップと、
    ｃ）整列された配列情報に対してＱ‐スコアを計算し、基準値以下の配列情報のみを選別するステップと、
    ｄ）選別された配列情報に対してＧ‐スコアを計算し、参照染色体の組み合わせと比較して、胎児の性別およびコピー数異常を決定するステップと、により、胎児の性別およびコピー数異常を検出するプロセッサにより実行されるように構成される命令を含むコンピュータ読み取り可能な媒体。
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