WO2022190495A1 - ゲノム配列上のコピー数のバリアントの区切り点の候補の機械的検出 - Google Patents

ゲノム配列上のコピー数のバリアントの区切り点の候補の機械的検出 Download PDF

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WO2022190495A1
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segment
bin
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genome sequence
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克 田中
喜行 桜庭
陽子 長井
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Ｖａｒｉｎｏｓ株式会社
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    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B30/00—ICT specially adapted for sequence analysis involving nucleotides or amino acids

Definitions

  • the present invention relates to mechanical detection of candidate breakpoints for copy number variants on the genome sequence.
  • Non-Patent Document 1 discloses PGT-A, Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidy, as a method for detecting the copy number of a region on the genome sequence of pre-implantation embryonic cells. Detecting the presence or absence of copy number variants in PGT-A is sometimes referred to as a call.
  • Patent Document 1 discloses a method for determining the presence or absence of copy number variants in cells of a subject. Such methods determine the sequence of the genome and obtain a distribution of the determined sequences. Next, identify the breakpoint at which the number of arrays changes. At this time, breakpoint candidates are set in advance, and appropriate breakpoints are narrowed down based on run tests for regions before and after the candidate breakpoints. Next, the presence or absence of copy number variants in the region sandwiched by the breakpoints is determined.
  • Illumina, Inc. "A Technical Guide to Aneuploidy Calling with VeriSeq PGS", September 2014 Francesca Romana Grati, Gloria Gallazzi, Lara Branca, Federico Maggi, Giuseppe Simoni, Yuval Yaron, “An evidence-based scoring system for prioritizing mosaic aneuploid embryos following preimplantation genetic screening”, Reproductive Biomedicine Online, February 1, 2018, Volume 36 , ISSUE 4, P442-449
  • An object of the present invention is to provide a means for mechanically detecting breakpoints of copy number variants on a genome sequence, that is, breakpoint candidates. Such breakpoint candidates are useful for determining the presence or absence of copy number variants from the information on the copy number distribution on the genome sequence of the cells to be tested. It is a further object of the present invention to provide a means of scoring copy number variants for embryo-to-embryo comparison.
  • a method for mechanically detecting breakpoint candidates of copy number variants on a genome sequence comprising: Electronic data of chromosomal DNA fragment sequences obtained from cell samples, hereinafter referred to as specimen data, is automatically processed by a computer as follows.
  • Counting the fragment sequences each contained in a region continuously set on the genome sequence hereinafter referred to as a bin, having a size larger than the size of the fragment sequence; Measuring the distribution of the copy number ratio on the genome sequence with the interval between the bins as the resolution, Obtaining the slope of the change in the copy number ratio with respect to the position of the bin on the genomic sequence for each pair of adjacent bins, hereinafter referred to as a bin-pair; dividing the bin-pairs into a set with a large absolute value of the slope and a set with a small absolute value of the slope, and determining that the set with a large absolute value of the slope includes the increase/decrease interval of the copy number ratio; A method of generating electronic data containing the position of the copy number ratio increase/decrease interval on the genome sequence as a candidate breakpoint of the copy number variant on the genome sequence, hereinafter referred to as candidate data.
  • ⁇ 2> To identify the bin-pair containing the increase/decrease interval, Determine z for each bin-pair according to the formula: If z>2 or z ⁇ 2, the absolute value of the slope is determined to be large, x is the slope, x includes positive and negative values rather than absolute values, ⁇ is the mean of x in the population of bin-pairs, and ⁇ is the standard deviation of x in the population. The method according to ⁇ 1>.
  • ⁇ 4> Determining whether the set with the small absolute value of the slope does not include the copy number ratio increase/decrease interval or is unknown, along with the determination of the set with the large absolute value of the slope; The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 3>.
  • the bin-pairs are continuous on the chromosome, but the bin-pairs in which the bins are adjacent to each other and the bin-pairs in which the bins are not adjacent to each other but are spaced apart;
  • the genome sequence is not newly obtained from the cell sample, but is data of the whole genome sequence or a part thereof previously obtained from cells other than the cell sample.
  • the cell sample is a cell population obtained by biopsy of one embryo, Whole genome amplification in a mixed state of chromosomal DNA obtained by lysing the cell sample or spontaneously releasing the cell sample, Obtaining the sample data from the amplified product with a DNA sequencer; or the cell sample is one cell obtained by biopsy of one embryo, whole-genome amplification of chromosomal DNA obtained by lysing the cell sample or spontaneously releasing the cell sample; Obtaining the sample data from the amplified product with a DNA sequencer; The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 6>.
  • the DNA sequencer sends the sample data to the server, the server records the sample data and sends the sample data to the computer upon request of the computer; The method according to ⁇ 7>.
  • ⁇ 10> Generate the candidate data by the method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 9>, and further, by a computer, Acquiring a copy number ratio after correction by correcting the raw data of the sample data, slicing the genomic sequence at the candidate breakpoints to generate segments, wherein the segments include one of the bins or a plurality of consecutive bins; Furthermore, information obtained by classifying each segment with a predetermined threshold value regarding the copy number ratio, hereinafter referred to as a mosaic level, is obtained, A method of generating electronic data, hereinafter referred to as decision data, including the identification of the segments and the mosaic levels.
  • a correction that divides the genome sequence into only segments containing the predetermined number or more of the bins by integrating a segment containing the bins that is less than the predetermined number into any of the adjacent segments before and after it, and a correction that meets a predetermined base length A correction that divides the genome sequence only into segments of a predetermined base length or more by integrating segments that do not have a After performing at least one of the above, perform the correction, The method according to ⁇ 10>.
  • the cell samples are obtained from a plurality of embryos, Generate the determination data by the method according to ⁇ 10> or ⁇ 11>, and further with a computer, scoring the plurality of embryos according to the mosaic level of the segment; A method of generating electronic data comprising said scoring.
  • ⁇ 14> In the scoring, when the discrepancy of the copy number ratio for one chromosome is 100%, the discrepancy is greater than a predetermined value of more than 0% and less than 100% among the gains. , hereinafter referred to as High Level segments, which distinguish between embryos that do not have segments with copy number ratios higher than euploid, and embryos that do.
  • High Level segments which distinguish between embryos that do not have segments with copy number ratios higher than euploid, and embryos that do.
  • the total base length of the high-level segment is a predetermined percentage or more selected from the range of 10 to 50% chromosome distinguishing between low and high embryos, wherein said high-level segments include both higher and lower than euploid copy number ratios; Furthermore, among embryos with a predetermined proportion or more of chromosomes selected from the range of 10 to 50% of the total base length of the high-level segment, the copy number ratio of the high-level segment on the side higher than that of the euploid Differentiate between embryos with a small number of chromosomes with a total base length of a predetermined proportion or more and embryos with a large number of chromosomes, The method according to ⁇ 14>.
  • the cell samples are obtained from a plurality of embryos, generating the determination data by the method according to ⁇ 10> or ⁇ 11>; in a computer, scoring the plurality of embryos according to the mosaic level of the segment; A method in which a practitioner sequentially transplants the plurality of embryos into the uterus with reference to the scoring.
  • a program for detecting breakpoint candidates of copy number variants on a genome sequence A program that causes a computer to process electronic data of chromosomal DNA fragment sequences obtained from cell samples, including: counting the fragment sequences each contained in the bin; measuring the distribution of the copy number ratio on the genome sequence with the interval between the bins as the resolution; Obtaining the slope of the change in the copy number ratio with respect to the position of the bin on the genomic sequence for each pair of adjacent bins, hereinafter referred to as a bin-pair; dividing the bin-pairs into the high absolute slope set and the low absolute slope set, and determining that the high absolute slope set includes the copy number ratio increase/decrease interval; Generating electronic data including the position on the genome sequence of the interval of increase/decrease in the copy number ratio as a breakpoint candidate for the copy number variant on the genome sequence.
  • the present invention provides a means for mechanically detecting breakpoints of copy number variants on the genome sequence, that is, breakpoint candidates. These breakpoint candidates are useful for determining the presence or absence of copy number variants from the information on the copy number distribution on the genome sequence of the cells to be tested.
  • the invention further provides a means of scoring copy number variants for embryo-to-embryo comparison.
  • CNV Code Number Variation
  • CNV chart of Mosaic Example 1 CNV chart of mosaic example 2.
  • breakpoint candidates for copy number variants on the genome sequence are mechanically detected. Also, the mosaic level of the segment sandwiched between the breakpoint candidates is determined. Also score the cell population based on the level of mosaicism.
  • Each process is mechanically performed by a computer, but each process may be shared by a separate computer, or may be performed intensively by a single computer.
  • Figure 1 schematically shows cells, fragment sequences, and genome sequences.
  • chromosomal DNA is obtained from cell samples (Cells) and DNA sequencing is performed.
  • chromosomal DNA is obtained by lysing a cell sample.
  • the chromosomal DNA is chromosomal DNA that has been exuded into culture media and other buffers from cells that have not yet been lysed.
  • exudation is performed by the cell sample spontaneously releasing chromosomal DNA.
  • the process of spontaneous release is apoptosis.
  • a cell sample is a cell from a tissue that you want to test for the presence of copy number variants.
  • the cell sample consists of a plurality of homogeneous cells. In this case, copy number mosaics may exist among the cells in the cell sample.
  • the cell sample is one cell obtained by biopsy of one embryo.
  • the embryo is an in vitro fertilized embryo.
  • the embryo is a blastocyst.
  • the cell sample is a population of cells obtained by biopsy of a single embryo.
  • multiple embryos are provided and a cell sample is obtained from each embryo. CNV analysis of cell samples allows comparison between multiple embryos.
  • DNA sequencing is performed by the Sanger method or NGS (Next generation sequencing). This provides electronic data of fragment sequences of chromosomal DNA from cell samples. Such electronic data may be hereinafter referred to as specimen data.
  • chromosomal DNA obtained from a population of cells is whole genome amplified prior to DNA sequencing.
  • whole genome amplification is performed on mixed chromosomal DNA obtained from a population of cells.
  • Sample data is obtained from the amplified product using a DNA sequencer.
  • a DNA sequencer sends specimen data to a computer.
  • a computer automatically processes the specimen data.
  • a DNA sequencer sends specimen data to a server.
  • Server records specimen data.
  • the server sends sample data to the computer in response to the computer's request.
  • a computer automatically processes the specimen data.
  • Figure 1 schematically shows the relationship between the genome sequence (Genome) and the fragment sequence (Fragment).
  • a genomic sequence is an entire genome sequence or a portion thereof.
  • the genomic sequence is obtained from cells other than the cell sample.
  • the genome sequence is not newly obtained from a cell sample, but data of the entire genome sequence or a portion thereof previously obtained from cells other than the cell sample.
  • Genomic sequences may be obtained from public genome databases. As shown in the figure, it is not necessary for the fragment sequences in the sample data to completely fill the genome sequence.
  • Bins are set continuously on the genome sequence as shown in Figure 1.
  • the term "bin” conceptually describes regions having sequences homologous to fragment sequences, as if they were "containers" for incorporating fragment sequences.
  • the bins represent regions into which the genomic sequence was divided for CNV analysis.
  • a bin represents a Chromosomal Window.
  • bins are associated with window scales.
  • all bins are used for CNV analysis.
  • several bins are selected for use in CNV analysis.
  • the bins have a size greater than the size of the fragment sequences.
  • Count the fragment sequences contained in the set bins In the figure, there are 3, 2 and 2 fragment sequences in order from the left bin. The number of fragment sequences may be even greater.
  • the figures are schematic.
  • the base length of each bin may be the same or different.
  • Adjacent bins may be arranged without gaps on the chromosome, or may be separated from each other.
  • the data is corrected in consideration of the base length of the bin and the position on the genome sequence.
  • the “location on the genomic sequence” is specified in units of base pairs.
  • the genomic sequence position of the bin is any position at the 5' end, the 3' end, or the middle of the bin.
  • Figure 2 shows the CNV chart of human embryos.
  • Gender is female (XX).
  • the vertical axis of the CNV chart indicates the copy number ratio.
  • the data was corrected to give a copy number ratio of 2 in the bin corresponding to the euploid.
  • the data is raw data.
  • the raw data is the number of fragment sequences measured based on chemical and optical techniques, a so-called raw count.
  • the corrected copy number ratio may be called Bin_Copy.
  • this correction is made by reference to sequence copy number data previously obtained from embryos or non-embryonic cells in separate experiments.
  • this correction is performed using BlueFuse Multi SoftwareTM or other software provided by Illumina.
  • the sex chromosome haploid is defined as euploid, and this copy number ratio is 1.
  • the autosomal diploid is assumed to have a copy number ratio of 2.
  • the horizontal axis of the CNV chart shown in Figure 2 is the position on the genome sequence. Represents an order of 2,500 bins.
  • the distribution of copy number ratios over the genome sequence is measured from the number of fragment sequences in the bins described above. In one aspect, the spacing between adjacent bins is the resolution of the CNV chart.
  • An experimental method for obtaining a CNV chart is Veri Seq PGS (trademark) provided by Illumina.
  • the copy number ratio linearity is discontinuous.
  • Fig. 3 shows how the linearity of the copy number ratio is interpolated. Interpolate for each pair of adjacent bins. Hereinafter, this pair will be referred to as a bin-pair in this embodiment.
  • the line segment generated by interpolation represents the slope of the change in copy number ratio with respect to the position on the genomic sequence. Positions on the genomic sequence are in units of base pairs.
  • Figure 4 shows the linear slope for each bin-pair position on the genome sequence.
  • the bin-pairs are contiguous on the chromosome, but the bins within the bin-pairs themselves are not adjacent to each other, but are spaced apart.
  • the bins in a bin-pair are adjacent to each other.
  • the population consisting of bin-pairs is normalized with an average slope of 0 and a standard deviation of 1, that is, standardization. Normalization here treats the population of bin-pairs as being normally distributed. The bin-pairs after normalization therefore have a standard normal distribution. Also, in one embodiment, the bin-pairs that make up the population are contiguous throughout a chromosome or part of a cluster.
  • the bin-pairs in the population are further divided into groups with a large absolute value of slope and groups with a small absolute value of slope.
  • the magnitude of the absolute value of the slope is determined based on the frequency distribution of the slope values.
  • it is determined that a set of slopes with a large absolute value includes a copy number ratio increase/decrease interval. Also, it is determined that it is unknown whether a set with a small absolute value of slope does not include an increase/decrease interval of the copy number ratio or includes an increase/decrease interval.
  • DNA is a double helix molecule in which the 5' to 3' direction is reversed between complementary strands. So which is 5' and which is 3' is also a matter of convenience.
  • the increase or decrease in copy number ratio is a convenient definition.
  • the copy number ratios in the intervals between the increase and decrease intervals, the segments described later, are measured and evaluated separately. Therefore, in one aspect of the present embodiment, the copy number ratio increase/decrease interval is treated simply as a breakpoint candidate for the copy number variant.
  • intervals of increased copy number ratio are adjacent to each other. That is, it is possible that the copy number ratio increases after increasing. Adjacent intervals of copy number ratio reduction can occur. That is, it is possible that the copy number ratio is reduced and then further reduced.
  • outliers are candidates for copy number variant breakpoints.
  • An outlier indicates that the bin-pair with that outlier has a copy number ratio increase or decrease interval. This is hereinafter referred to as the outlier method. Compare with other methods for obtaining candidate breakpoints.
  • non-hierarchical clustering, hierarchical clustering, and linearly interpolated copy number ratio smoothing are applied to a population of bin-pairs to obtain breakpoint candidates. do either.
  • the candidate breakpoints provided by these processes may provide candidate breakpoints that are difficult for humans to interpret.
  • the outlier method provides breakpoint candidates that are easier for humans to interpret. Therefore, after the outlier method is performed, it is easy to manually add/delete breakpoint candidates on the genome sequence, that is, post-editing.
  • the outlier method can be performed with simpler calculations than the above non-hierarchical clustering and other processes.
  • any of non-hierarchical clustering, hierarchical clustering, and smoothing of linearly interpolated copy number ratios are combined with the outlier method to the extent that the benefits provided by the outlier method are not compromised.
  • Fig. 5 shows a model of the frequency distribution of the slope. It is represented by a normal distribution.
  • bin-pairs with slopes, or outliers, outside the range of ⁇ 2SD are determined to have an up-and-down interval. After obtaining z for each bin-pair according to the following formula, if z>2 or z ⁇ -2, it is determined that the absolute value of the slope of that bin-pair is large.
  • the absolute value of the z threshold is set to 2 here, this value is merely an example. In other embodiments, the absolute value of the threshold for z is greater than zero and less than two. In one embodiment, the absolute value of the z threshold is 0.5, 1 and 1.5.
  • the absolute value of the threshold for z is greater than two. In one aspect, the absolute value of the threshold for z is 4 or less. In one aspect, the absolute value of the z threshold is any of 2.5, 3 and 3.5. Bin-pairs with z that are outliers have an up-and-down interval. As mentioned above, the increase/decrease intervals are candidate breakpoints for copy number variants.
  • x is the slope. x includes positive and negative values, not absolute values. ⁇ is the mean of x for the population of bin-pairs. ⁇ is the standard deviation of x for that population.
  • Figure 6 shows an enlarged CNV chart.
  • the vertical axis represents the copy number ratio (Bin_Copy).
  • the bin corresponding to the euploid is corrected to have a copy number ratio of 2.
  • the copy number ratios of each bin are distributed roughly in the range of 2.0 to 2.7. It is expected that they form a so-called mosaic of trisomy and disomy. In a strict examination, the presence of tetrasomy, monosomy, and other aneuploidy in each cell in the cell sample must also be considered.
  • the mosaic of aneuploidy shown in FIG. 6 results in one aspect from the fact that the cell sample is a cell population with copy number mosaic. In other embodiments, if the cell sample is a single cell, mosaicism will not occur and the normalized copy number ratio will be an integer.
  • FIG. 7 shows the result of superimposing the increase/decrease interval on the copy number ratio distribution shown in FIG.
  • the increment and decrement intervals carve the genome sequence to generate segments.
  • Increase/decrease intervals are candidate breakpoints for copy number variants. It is further determined in a later step whether the segment sandwiched between the increase/decrease intervals represents an interval in which a copy number variant occurs, or whether it is caused by another variation.
  • electronic data is generated that includes the position of the copy number ratio increase/decrease interval on the genome sequence as a breakpoint candidate for the copy number variant on the genome sequence. Such data may be referred to as candidate data.
  • Fig. 8 shows calling segments using candidate data. Ellipses surround the dots that indicate the bins contained within each segment. Each segment contains at least one bin. In one aspect, a segment includes multiple bins, and these bins are contiguous within the segment. In one aspect, there are no extra bins between segments that are not sorted by the segment.
  • the copy number ratio of the segment is defined.
  • the segment copy number ratio represents the average copy number ratio of the bins within the segment.
  • the side where the copy number ratio of the segment is greater than 2 is referred to as gain.
  • the side where the copy number ratio of the segment is smaller than 2 is referred to as loss. Note that any segment in FIG. 8 is either gain or roughly euploid.
  • the segment centered on the bin with a copy number ratio of 2.5 or more and less than 2.8 is defined as a high-level copy number as a segment with a variant of
  • the degree of deviation from the euploid copy number ratio is called the degree of divergence.
  • An example lower deviation threshold for making a high level call is +0.5. Some segments in FIG. 8 have copy number ratios around 2.6. These segments are expected to be close to trisomy.
  • the lower deviation threshold for making a high level call is greater than 0 and less than 0.5.
  • the lower threshold of deviation is any one of 0.1, 0.2, 0.3 and 0.4.
  • the lower deviation threshold for making a high level call is greater than 0.5 and less than 1.
  • the lower threshold of the degree of divergence is any one of 0.6, 0.7, 0.8 and 0.9.
  • the upper deviation threshold for making a low level call is greater than 0 and less than 0.5.
  • the upper threshold of deviation is any one of 0.1, 0.2, 0.3 and 0.4.
  • the upper deviation threshold for making a low-level call is greater than 0.5 and less than 1.
  • the upper threshold of deviation is any one of 0.6, 0.7, 0.8 and 0.9.
  • the upper deviation threshold for making a low level call matches the lower deviation threshold for making a high level call.
  • FIG. 8 shows an example of a call on the gain side.
  • a deviation threshold is set for the loss-side call as well. At this time, the deviation threshold takes a negative value.
  • Adjacent segments may have the same copy number ratio, or they may have copy number variants. Increase and decrease intervals are only possible breakpoints for copy number variants. In one aspect, it is useful to distinguish these gain and loss intervals into breakpoints for copy number variants and those that are not. Such a distinction is not essential in other embodiments.
  • Fig. 9 shows a CNV chart and mosaics related to certain chromosomes (Chromosomes) in cell samples (Cells).
  • a revision operation is performed to reduce the number of segments and enlarge the segments until the desired state is obtained that facilitates understanding the distribution of mosaic levels on the chromosome. This diagram will be explained again in a later section.
  • Fig. 10 shows the mode of integration of segments. After generating the segments as described above, the small segment is integrated with any of the adjacent segments before and after it.
  • a small segment is a segment containing less than a predetermined number of bins.
  • a small segment contains only one or two bins.
  • the third segment from the right contains only two bins. So merge this into the 4th segment from the right.
  • small segments are segments that are less than a predetermined base length.
  • the predetermined base length is 10 Mbp or less.
  • the predetermined base length is any of 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 and 9 Mbp.
  • the segment with the shorter base length and the shorter distance between any of the segments before and after it is integrated with the small segment.
  • the segment that deviates more from the euploid and the segment that deviates less from the euploid are merged.
  • the small segment when the small segment is closer to the telomere than the centromere, the small segment is merged with the segment farther from the telomere. In other embodiments, when the small segment is closer to the centromere than the telomere, the small segment is merged with the segment farther from the centromere.
  • the mosaic level is determined after segment integration. In another aspect, the mosaic level is determined without segment consolidation.
  • the mosaic level of cell samples is determined. First, let me explain the mosaic level.
  • the cells contained in the cell sample are homogeneous in that they originate from the same cell, that is, a fertilized egg. Also the number is specified. Therefore, the mosaic state can be determined from the copy number ratio.
  • the mosaic state information is referred to as a mosaic level.
  • the cell sample consists of 5 cells.
  • the two segments are separated into the first half and the second half on the chromosome by a breakpoint near 1.25 ⁇ 10 8 bp.
  • the first half segment has a copy number ratio of 2.0.
  • the latter segment has a copy number ratio of 2.4.
  • mosaic levels are derived from genetic mosaics between cells in a population of cells.
  • the level of mosaicism results from the inclusion of cells in which copy number variants occur and those in which they do not occur in the population. Alternatively, it occurs when cells with different copy number variant patterns are included.
  • Mosaic levels are obtained from specific cell samples.
  • the cell sample is a population of cells obtained by biopsying multiple cells in an embryo.
  • the mosaic level is obtained from the copy number ratio of the integrated segment.
  • their copy number ratios may differ between the integrated segment and the pre-integrated segment. Therefore, the copy number ratio is obtained again after the integration.
  • the average value of the copy number ratios of each bin included in the integrated segment is taken as the copy number ratio of the integrated segment.
  • the integrated segments are classified based on the contrast between their corrected copy number ratios and a predetermined threshold.
  • a plurality of thresholds are set according to the mosaic level.
  • the thresholds are:
  • the thresholds are as follows.
  • Tetrasomy, Trisomy and other terms do not specify aneuploidy of individual cells in a population. These expressions only represent the level of aneuploidy of the cell population.
  • the computer generates electronic data that includes the identification of the segment and the mosaic level of that segment.
  • this data will be referred to as determination data.
  • a correction is performed by merging adjacent segments with the same mosaic level into one segment. Such corrections are added to the judgment data.
  • the diagnostician uses the judgment data obtained for each cell sample. For example, the ranking is performed directly by the diagnostician. The practitioner sequentially implants the ranked embryos into the uterus with reference to the ranking.
  • the computer provides the diagnostic data itself to the diagnostician.
  • a computer scores each cell sample, ie, each embryo, based on the judgment data to aid in ranking by the diagnostician.
  • the computer provides the scoring results to the diagnostician.
  • the computer adds the scoring results to the judgment data and provides them to the diagnostician. In the following, first, processing for judgment data for scoring will be described.
  • the segment whose mosaic level is euploid-equivalent or the segment closest to euploid-equivalent is the baseline segment. If a segment with a copy number ratio higher than that of the euploid and a segment with a copy number ratio lower than that of the euploid coexist, the segment corresponding to the euploid is used as the baseline segment.
  • Baseline segments are used for determination at the whole chromosome level. Non-baseline segments are used for segment level determination. As described above, determination results as chromosomes are obtained.
  • one type of chromosome has a segment with a mosaic level of 2.0 and a segment with a mosaic level of 2.4.
  • a segment whose mosaic level corresponds to euploid is regarded as a baseline segment.
  • a baseline segmental determination of 2.0 is used for determination at the whole chromosome level.
  • this chromosome is determined to be Euploid or Disomy.
  • the non-baseline segment is the 2.4 segment.
  • this chromosome is determined to be "Low Level Mosaic Gain”.
  • the determination result as a chromosome is obtained by considering both determination at the whole chromosome level and determination at the segment level.
  • the chromosome-wide level of this chromosome is Euploid or Disomy.
  • This chromosomal segment level judgment is "Low Level Mosaic Gain”.
  • This chromosome has a segment that deviates from the baseline. Therefore, the word "Segmental” is added to the judgment result.
  • the determination result for this chromosome as a chromosome is that the Euploid or Disomy chromosome has a "Low Level Segmental Mosaic Gain" copy number variant.
  • the processing from detection of breakpoint candidates to determination of mosaic level can be performed for each cell sample. In one embodiment, these treatments are performed on multiple cell samples. In one aspect, the cell samples are each obtained from a plurality of embryos.
  • Fig. 11 shows the ranks of mosaics.
  • the left side represents the rank of mosaicism across all chromosomes.
  • this is referred to as whole chromosome mosaic score.
  • the right side shows the rank according to the degree of divergence of the segment showing the highest value when the degree of divergence from the euploid equivalent of the copy number ratio of the segment is expressed as a percentage.
  • this is referred to as a mosaic rate score.
  • Scoring is performed according to the whole chromosome mosaic score and percentage mosaic score.
  • the diagnostician judges that the lower these scores, the higher the priority. In other embodiments, diagnosticians do not consider these low scores to be high priority.
  • the diagnostician determines that the pan-chromosomal mosaic score takes precedence over the percentage mosaic score. In other embodiments, the diagnostician does not judge the pan-chromosomal mosaic score to take precedence over the percentage mosaic score.
  • Fig. 12 shows the CNV chart of Mosaic Example 1.
  • FIG. 13 shows the CNV chart of Mosaic Example 2.
  • FIG. 14 shows the CNV chart of Mosaic Example 3.
  • FIG. 15 shows the difference between high and low mosaic levels.
  • FIG. 16 shows the scoring results.
  • Mosaic Example 1 to Mosaic Example 3 represent the copy number ratio distributions on the male (XY) genome sequence.
  • Gain is assigned a pan-chromosomal mosaic score of 5-9 as shown in FIG. Even if they have segments with copy number ratios lower than the euploid level, they are classified as gains if they have segments with high copy number ratios.
  • a cell sample whose polyploidy is at the euploid level over the entire genome sequence of all chromosomes is particularly called Euploid. Its pan-chromosomal mosaic score is 0 as shown in FIG. Cell samples with aneuploidy in one or more chromosomes are specifically referred to as aneuploids. Its pan-chromosomal mosaic score is 10 as shown in FIG.
  • the following mosaic level thresholds are used in this embodiment. That is, when the discrepancy of the copy number ratio for one chromosome is 100%, the mosaic level of the segment with the discrepancy of the copy number ratio of 50% or more is taken as a high level. A segment with a degree of deviation of less than 50% is defined as a low level (low level).
  • the threshold is set to 50% here, the threshold can be appropriately set within a range of more than 0% and less than 100%.
  • the threshold can be any of 10, 20, 30, 40, 60, 70, 80 and 90%.
  • pan-chromosomal mosaic score is 5.
  • Mosaic Example 2 shown in FIG. 13 and Mosaic Example 3 shown in FIG. 14 segments of high level gain can be seen. Therefore, their pan-chromosomal mosaic score is 6 or higher.
  • High-level Chromosomal Loss is used when a high-level segment extends over the entire chromosome in one type of chromosome of the Loss cell sample.
  • High-level Chromosomal Gain is defined as a high-level gain segment spanning the entire chromosome in one type of chromosome in the Ross cell sample.
  • mosaic example 2 shown in FIG. 13 a high-level gain segment is seen in part of chromosome 16. Therefore, the pan-chromosomal mosaic score is 6.
  • Mosaic example 3, shown in FIG. 14, shows high-level gain segments throughout chromosome 1. Therefore, the pan-chromosomal mosaic score is 7.
  • a mosaic ratio score is given according to the maximum degree of deviation from the euploid copy number ratio between segments.
  • the maximum copy number ratio discrepancy is obtained from the combined population of both the higher than euploid copy number ratio side and the lower than euploid copy number ratio side.
  • the maximum value of the divergence on the side where the copy number ratio is higher than that of the euploid is less than 50% for each chromosome.
  • the maximum divergence on the lower than euploid copy number ratio is over 60% on chromosome 4. Therefore, the copy number ratio is set to 0.6 in consideration of the side lower than that of the euploid.
  • Fig. 16 shows the scoring results.
  • the total score of mosaic example 1 shown in FIG. 12 is 5.6, so it is ranked first.
  • the total score of mosaic example 2 shown in FIG. 13 is 6.6, so it is second.
  • Mosaic example 3 shown in FIG. 14 has a total score of 7.6, so it is ranked third.
  • "Low-risk Complex” shows high-level segments in 3 or more chromosomes.
  • the total base length of high-level segments in one chromosome is equal to or greater than a predetermined ratio.
  • the predetermined percentage is any value greater than 0% and less than 100%. In one aspect thereof, the predetermined percentage is any of 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 and 90. In one aspect thereof, the predetermined percentage is selected from the range of 10-50%. In scoring, embryos with fewer chromosomes with such mosaics are distinguished from embryos with more chromosomes in the loss. Although three thresholds are used here, two may be used.
  • FIG. 17 shows the CNV chart of Mosaic Example 4.
  • Mosaic example 4 shows high-level segments on the lower than euploid copy number ratios on chromosomes 3, 6 and 9. No high-level segments on the higher than euploid copy number ratio side are seen. The total base length of these segments accounts for 40% or more of each chromosome. Although the predetermined ratio is set to 40% here as an example, the selection of this numerical value does not limit the present invention.
  • Mosaic example 4 is classified as "Low-risk Complex”. Its pan-chromosome mosaic score is 4. If there are no more than two chromosomes with such mosaics, the pan-chromosome mosaic score is 1 to 3.
  • Example 4 and Mosaic Example 5 and Mosaic Example 6 described below represent the distribution of copy number ratios on male (XY) genome sequences.
  • FIG. 18 shows the CNV chart of Mosaic Example 5.
  • Mosaic example 5 shows a high level segment at number 3 on the side where the copy number ratio is higher than euploid. High-level segments on the lower than euploid copy number ratio are found on chromosomes 6 and 9. The total base length of these segments accounts for 40% or more of each chromosome. Although the predetermined ratio is set to 40% here as an example, the selection of this numerical value does not limit the present invention.
  • Mosaic example 5 is classified as "Middle-risk Complex". Its whole chromosome mosaic score is 8.
  • FIG. 19 shows the CNV chart of Mosaic Example 6.
  • Mosaic example 6 shows high-level segments on the side of the higher than euploid copy number ratio on chromosomes 3, 6 and 9. Segments with lower than euploid copy number ratios are not seen. The total base length of these segments accounts for 40% or more of each chromosome. Although the predetermined ratio is set to 40% here as an example, the selection of this numerical value does not limit the present invention.
  • Mosaic example 6 is classified as “High-risk Complex”. Its pan-chromosomal mosaic score is 9.
  • electronic data including scoring which is called ranking data
  • ranking data is generated from the judgment data.
  • the practitioner transfers the embryos to the uterus in order.
  • Scoring may be performed using the scoring system described in [2] or other scoring system resulting from retrospective sample-based analysis.
  • Another aspect of the invention is a program for executing the above processing on a computer.
  • Another aspect of the invention is a disk, tape, flash memory, and other non-volatile storage media storing the above program.
  • Another aspect of the invention is to provide the program for download via a network.
  • Another aspect of the invention is to receive a request via a network, execute the above program on a computer in response to the request, and provide a processing result via the network in response to the request.
  • the operations of the computer executing the program are performed on multiple devices connected by a network.

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Abstract

ゲノム配列上のコピー数のバリアントのブレークポイントの候補を機械的に検出する。 ゲノム配列上に連続的に設定される領域、以下ビンという、であって、断片配列のサイズよりも大きいサイズを有するものにそれぞれ含まれる断片配列を数える。ビン同士の間隔を分解能として、ゲノム配列上のコピー数比の分布を測る。ビンのゲノム配列上の位置に対する、コピー数比の変化の傾きを隣り合うビンの組、以下、これをビン－ペアという、ごとに取得する。ビン－ペアを傾きの絶対値の大きい組と傾きの絶対値の小さい組とに分け、傾きの絶対値の大きい組はコピー数比の増減区間を含むと判定する。コピー数比の増減区間のゲノム配列上の位置を、ゲノム配列上のコピー数のバリアントの区切り点の候補として含む電子データを生成する。さらにコピー数のバリアントに対してスコアリングを行うことで、胚同士の比較ができる。

Description

ゲノム配列上のコピー数のバリアントの区切り点の候補の機械的検出
　本発明はゲノム配列上のコピー数のバリアントの区切り点の候補の機械的検出に関する。
　コピー数のバリアントを有する領域と有しない領域とが１個の染色体上に分布することがある。非特許文献１は着床前の胚の細胞のゲノム配列上の領域のコピー数を検出する方法としてPGT-A、Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidyを開示している。PGT-Aにおいてコピー数のバリアントのあること又はバリアントのないことを検出することをコール（Call）と呼ぶ場合がある。
　上記技術について留意すべき点は、ゲノム配列上のコピー数比の分布の情報を得たとしても、それだけではコールしたことにはならないことである。すなわち正倍数体相当の領域を特定した上で、係る領域に対するコピー数比の閾値を設定することで、正倍数体相当の領域とバリアントを有する領域とを区別する必要がある。
　特許文献１は被験対象の細胞のコピー数のバリアントの有無を判定する方法を開示している。係る方法ではゲノムの配列を決定し、決定された配列の分布を得る。次に配列の個数が変化する区切り点を特定する。このとき、区切り点の候補を予め設定し、その前後の領域に対する連検定に基づき、適切な区切り点を絞り込む。次に区切り点に挟まれた領域中のコピー数のバリアントの有無を判定する。
特表２０１５－５０６６８４号公報
Illumina, Inc.，"A Technical Guide to Aneuploidy Calling with VeriSeq PGS"，2014年9月 Francesca Romana Grati，Gloria Gallazzi，Lara Branca，Federico Maggi，Giuseppe Simoni，Yuval Yaron，"An evidence-based scoring system for prioritizing mosaic aneuploid embryos following preimplantation genetic screening"，Reproductive Biomedicine Online, 2018年2月1日，Volume 36，ISSUE 4，P442-449
　本発明はゲノム配列上のコピー数のバリアントの区切り点、すなわちブレークポイントの候補を機械的に検出する手段を提供することを目的とする。係る区切り点の候補は、被験対象の細胞のゲノム配列上のコピー数の分布の情報からコピー数のバリアントの有無を判断するのに役立つものである。本発明はさらに胚同士の比較のため、コピー数のバリアントに対してスコアリングを行う手段を提供することを目的とする。
＜１＞　ゲノム配列上のコピー数のバリアントの区切り点の候補を機械的に検出する方法であって、
　細胞サンプルより得た染色体DNAの断片配列の電子データ、以下、これを検体データという、を以下の通りコンピューターで自動的に処理する、
　ゲノム配列上に連続的に設定される領域、以下ビンという、であって、前記断片配列のサイズよりも大きいサイズを有するものにそれぞれ含まれる前記断片配列を数える、
　前記ビン同士の間隔を分解能として、前記ゲノム配列上のコピー数比の分布を測る、
　前記ビンの前記ゲノム配列上の位置に対する、前記コピー数比の変化の傾きを隣り合う前記ビンの組、以下、これをビン－ペアという、ごとに取得する、
　前記ビン－ペアを前記傾きの絶対値の大きい組と前記傾きの絶対値の小さい組とに分け、前記傾きの絶対値の大きい組は前記コピー数比の増減区間を含むと判定し、
　前記コピー数比の増減区間のゲノム配列上の位置を、ゲノム配列上のコピー数のバリアントの区切り点の候補として含む電子データ、以下、これを候補データという、を生成する方法。
＜２＞　前記増減区間を含む前記ビン－ペアを特定するために、
　下記式に従い前記ビン－ペアごとにｚを求め、
　ｚ＞２又はｚ＜－２であれば前記傾きの絶対値が大きいと判定する、
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
 　ｘは傾きであり、ｘは絶対値ではなく正負を含み、μは前記ビン－ペアからなる母集団のｘの平均であり、σは前記母集団のｘの標準偏差である、
　＜１＞に記載の方法。
＜３＞　前記母集団を構成している前記ビン－ペアは、一つの染色体上の全体又は一かたまりの部分の中で切れ目なく連続している、
　＜２＞に記載の方法。
＜４＞　前記傾きの絶対値の大きい組に対する判定とともに、前記傾きの絶対値の小さい組はコピー数比の増減区間を含まないか又は不明と判定する、
　＜１＞～＜３＞のいずれかに記載の方法。
＜５＞　前記ビン－ペアは染色体上で切れ目なく連続しているが、
　前記ビン同士が互いに接している前記ビン－ペアと、前記ビン同士が互いに接してはおらず間隔を置いて分布するビン－ペアとが混在している、
　＜１＞～＜４＞のいずれかに記載の方法。
＜６＞　前記ゲノム配列は前記細胞サンプルから新規に取得されたものではなく、前記細胞サンプル以外の細胞から事前に取得された全ゲノム配列又はその部分のデータである、
　＜１＞～＜５＞のいずれかに記載の方法。
＜７＞　前記細胞サンプルは一つの胚を生検して得た細胞集団であり、
　前記細胞サンプルを溶解することで、若しくは前記細胞サンプルが自発的に放出することで得られた染色体DNAを混合した状態で全ゲノム増幅し、
　増幅産物からDNAシーケンサーにて前記検体データを取得する、
　又は
　前記細胞サンプルは一つの胚を生検して得た一つの細胞であり、
　前記細胞サンプルを溶解することで、若しくは前記細胞サンプルが自発的に放出することで得られた染色体DNAを全ゲノム増幅し、
　増幅産物からDNAシーケンサーにて前記検体データを取得する、
　＜１＞～＜６＞のいずれかに記載の方法。
＜８＞　前記DNAシーケンサーから前記コンピューターに前記断片配列の前記検体データを送る、
　＜７＞に記載の方法。
＜９＞　前記DNAシーケンサーが、サーバーに前記検体データを送り、
　前記サーバーが前記検体データを記録し、さらに前記コンピューターの求めに応じて前記コンピューターに前記検体データを送る、
　＜７＞に記載の方法。
＜１０＞　＜１＞～＜９＞のいずれかに記載の方法で前記候補データを生成し、さらに、コンピューターにて、
　前記検体データの生データを補正することで補正後のコピー数比を取得し、
　前記区切り点の候補で前記ゲノム配列を切り分けてセグメントを生成し、ここで前記セグメントには一つの前記ビン、又は連続する複数の前記ビンが含まれる、
　さらにコピー数比に関する所定の閾値で各セグメントを分類した情報、以下、これをモザイクレベルという、を取得し、
　前記セグメントの特定と、前記モザイクレベルとを含む電子データ、以下、これを判定データという、を生成する方法。
＜１１＞　セグメントを生成した後、
　所定個数未満の前記ビンを含むセグメントをその前後に隣接するいずれかのセグメントに統合することで、前記所定個数以上の前記ビンを含むセグメントだけで前記ゲノム配列を切り分ける修正、及び
　所定塩基長に満たないセグメントをその前後に隣接するいずれかのセグメントに統合することで、前記所定塩基長以上のセグメントだけで前記ゲノム配列を切り分ける修正、
　の少なくともいずれかを行ってから前記補正を行う、
　＜１０＞に記載の方法。
＜１２＞　前記細胞サンプルは複数の胚からそれぞれ得られたものであり、
　＜１０＞又は＜１１＞に記載の方法で前記判定データを生成し、さらにコンピューターにて、
　前記複数の胚を前記セグメントの前記モザイクレベルに応じてスコアリングし、
　前記スコアリングを含む電子データを生成する方法。
＜１３＞　前記スコアリングにおいて、コピー数比が正倍数体よりも高いセグメントを有しない胚を、有する胚、以下、これをゲイン（Gain）と区別する、
　＜１２＞に記載の方法。
＜１４＞　前記スコアリングにおいて、前記ゲインの中で、染色体一本分のコピー数比の乖離度を100%としたとき、乖離度が0%超、100%未満の所定の値以上であるセグメント、以下、これをハイレベル（High Level）のセグメントという、であってコピー数比が正倍数体よりも高いセグメント、を有しない胚と、これを有する胚とを区別する、
　＜１３＞に記載の方法。
＜１５＞　前記スコアリングにおいて、前記ゲインの中の、前記ハイレベルのセグメントを有する胚の中で、前記ハイレベルのセグメントの総塩基長が10～50％の範囲から選ばれる所定割合以上の染色体が少ない胚と、これが多い胚とを区別し、ただし、前記ハイレベルのセグメントはコピー数比が正倍数体よりも高い側及び低い側のいずれも含む、
　さらに、前記ハイレベルのセグメントの総塩基長が10～50％の範囲から選ばれる所定割合以上の染色体が多い胚の中で、コピー数比が正倍数体よりも高い側のハイレベルのセグメントの総塩基長が所定割合以上の染色体が少ない胚と、これが多い胚とを区別する、
　＜１４＞に記載の方法。
＜１６＞　前記スコアリングにおいて、コピー数比が正倍数体よりも高いセグメントを有しない胚であって、コピー数比が正倍数体よりも低いセグメントを有する胚をロス（Loss）とし、
　前記ゲイン及びロスの中で、前記セグメント間における、コピー数比の正倍数体の水準からの乖離度の最大値が小さい胚と、大きい胚とを区別する、ただし、前記正倍数体の水準からの乖離度はコピー数比が正倍数体よりも高い側及び低い側のいずれも含む、
　＜１３＞～＜１５＞のいずれかに記載の方法。
＜１７＞　前記細胞サンプルは複数の胚からそれぞれ得られたものであり、
　＜１０＞又は＜１１＞に記載の方法で前記判定データを生成し、
　コンピューターにて、前記複数の胚を前記セグメントの前記モザイクレベルに応じてスコアリングし、
　前記スコアリングを参考に施術者が前記複数の胚を順に子宮へ移植する方法。
＜１８＞　ゲノム配列上のコピー数のバリアントの区切り点の候補を検出するプログラムであって、
　細胞サンプルより得た染色体DNAの断片配列の電子データに対する、以下を含む処理をコンピューターに実行させるプログラム：
　上記ビンにそれぞれ含まれる前記断片配列を数えること、
　前記ビン同士の間隔を分解能として、前記ゲノム配列上のコピー数比の分布を測ること、
　前記ビンの前記ゲノム配列上の位置に対する、前記コピー数比の変化の傾きを隣り合う前記ビンの組、以下、これをビン－ペアという、ごとに取得すること、
　前記ビン－ペアを前記傾きの絶対値の大きい組と前記傾きの絶対値の小さい組とに分け、前記傾きの絶対値の大きい組は前記コピー数比の増減区間を含むと判定すること、及び
　前記コピー数比の増減区間のゲノム配列上の位置を、ゲノム配列上のコピー数のバリアントの区切り点の候補として含む電子データ、を生成すること。
　本発明はゲノム配列上のコピー数のバリアントの区切り点、すなわちブレークポイントの候補を機械的に検出する手段を提供する。これら区切り点の候補は、被験対象の細胞のゲノム配列上のコピー数の分布の情報からコピー数のバリアントの有無を判断するのに役立つものである。本発明はさらに胚同士の比較のため、コピー数のバリアントに対してスコアリングを行う手段を提供する。
ゲノム配列と断片配列の模式図。 CNV（Copy Number Variation）チャート。 コピー数比の線形の補間。 線形の傾きの抽出。 傾きの度数分布モデル。 拡大したCNVチャート。 セグメント化。 セグメントごとのコール。 モザイクとCNVチャート。 セグメントの統合。 モザイクの階級。 モザイク例１のCNVチャート。 モザイク例２のCNVチャート。 モザイク例３のCNVチャート。 ハイレベルとローレベルの説明。 スコアリング結果。 モザイク例４のCNVチャート。 モザイク例５のCNVチャート。 モザイク例６のCNVチャート。
　本実施形態ではゲノム配列上のコピー数のバリアントの区切り点の候補を機械的に検出する。また区切り点の候補で挟まれたセグメントのモザイクレベルを判定する。またモザイクレベルに基づき細胞集団をスコアリングする。以下の実施例を参照しつつ順に説明する。各処理はコンピューターにて機械的に行うが、別個のコンピューターにて各処理を分担してもよく、一個のコンピューターにて各処理を集中的に実行してもよい。
＜１．区切り点の候補の検出＞
　図１は細胞と断片配列とゲノム配列とを模式的に表している。まず細胞サンプル（Cells）より染色体DNAを得てDNAシーケンシングを行う。一態様において細胞サンプルを溶解することで染色体DNAを得る。他の態様において染色体DNAはまだ溶解されていない細胞から培養液及びその他の緩衝液に対して滲出してきた染色体DNAである。一態様において滲出は細胞サンプルが自発的に染色体DNAを放出することで行われる。一態様において自発的な放出の過程はアポトーシスである。
　図１において染色体DNAをDNAシーケンサーで解析する。細胞サンプルはコピー数のバリアントの有無を調べたい組織から得た細胞である。一態様において細胞サンプルはホモジーニアスな複数の細胞からなる。この場合、細胞サンプルに含まれる細胞間にはコピー数に関するモザイクが存在する可能性がある。一態様において、細胞サンプルは一つの胚を生検して得た一つの細胞である。一態様において胚は体外受精胚である。一態様において胚は胚盤胞である。一態様において、細胞サンプルは一つの胚を生検して得た複数の細胞からなる集団である。一態様において、複数の胚を用意するとともに、それぞれの胚から細胞サンプルを得る。細胞サンプルをCNV分析することで、複数の胚同士の比較を行う。
　図１において、DNAシーケンシングはサンガー法又はNGS（Next generation sequencing）で行う。これにより染色体DNAの断片配列の電子データを細胞サンプルより得る。係る電子データを以下、これを検体データという場合がある。一態様において、DNAシーケンシングの前に、細胞の集団から得られた染色体DNAを全ゲノム増幅する。一態様において全ゲノム増幅は細胞の集団から得られた染色体DNAを混合した状態で行う。増幅産物からDNAシーケンサーにて検体データを取得する。
　一態様においてDNAシーケンサーがコンピューターに検体データを送る。コンピューターが検体データを自動的に処理する。他の態様においてDNAシーケンサーが、サーバーに検体データを送る。サーバーが検体データを記録する。コンピューターの求めに応じてサーバーがコンピューターに検体データを送る。コンピューターが検体データを自動的に処理する。
　図１は、ゲノム配列（Genome）と断片配列（Fragment）との関係を模式的に表す。ゲノム配列は全ゲノム配列又はその部分である。一態様においてゲノム配列は細胞サンプル以外の細胞から取得されたものである。すなわちゲノム配列は、細胞サンプルから新規に取得されたものではなく、細胞サンプル以外の細胞から事前に取得された全ゲノム配列又はその部分のデータである。ゲノム配列は公共のゲノムデータベースから取得してもよい。図が表すように検体データ中の断片配列がゲノム配列を隙間なく埋め尽くす必要はない。
　図１に示すようにゲノム配列上に連続的にビン（Bin）を設定する。用語「ビン」は断片配列と相同する配列を有する領域を、あたかも断片配列を取り込む「容器」に見立てて、これを概念的に表現している。一態様においてビンはCNV解析のためにゲノム配列をいくつかに分割した領域を表す。一態様においてビンはChromosomal Windowのことを表す。一態様においてビンをウィンドウスケールと関連付ける。一態様において全てのビンをCNV解析に用いる。他の態様においていくつかのビンを選択してCNV解析に用いる。一態様においてビンは断片配列のサイズよりも大きいサイズを有する。設定されたビンに含まれる断片配列を数える。図中では左のビンから順に３個、２個及び２個の断片配列が存在する。断片配列の数はさらに多くてもよい。図は模式的なものである。各ビンの塩基長は同一でもよく、異なっていてもよい。隣り合う各ビンは染色体上で隙間なく並んでいてもよく、離れていてもよい。
　図１に示す一態様においてビンの塩基長やゲノム配列上の位置を考慮してデータの補正を行う。特に言及しない限り「ゲノム配列上の位置」は塩基対を単位として特定される。一態様においてビンのゲノム配列上の位置は、当該ビンの5′末端、3′末端及び中央のいずれかの位置である。
　図２はヒト胚のCNVチャートを示す。性別は女性（XX）である。CNVチャートの縦軸はコピー数比を示す。データの補正により正倍数体に対応するビンにおけるコピー数比を２としている。一態様において、データは生データである。一態様において、生データは、化学的な手法及び光学的な手法に基づき測定した断片配列数、いわゆるraw countと呼ばれる値である。一方、補正後のコピー数比をBin_Copyと呼ぶ場合がある。一態様においてこの補正は、別個の実験で胚又は胚以外の細胞から予め取得した配列のコピー数のデータを参照して行う。一態様において、この補正をイルミナ社から提供されるBlueFuse Multi Software（商標）又はその他のソフトウェアを用いて行う。なお男性の胚を取り扱う場合は、性染色体の一倍体を正倍数体とし、これをコピー数比１とする。また常染色体の２倍体をコピー数比２とする。
　図２に示すCNVチャートの横軸はゲノム配列上の位置である。2,500個のビンの順を表す。先に述べたビン中の断片配列の数から、ゲノム配列上のコピー数比の分布を測る。一態様において隣り合うビン同士の間隔がCNVチャートの分解能となる。CNVチャートを得るための実験手法としてIllumina社の提供するVeri Seq PGS（商標）が挙げられる。コピー数比の線形は不連続である。
　図３は、コピー数比の線形を補間した様子を示す。隣り合うビンの組ごとに補間を行う。以下、この組のことを本実施形態ではビン－ペアという。補間によって生じた線分は、ゲノム配列上の位置に対する、コピー数比の変化の傾きを表している。ゲノム配列上の位置は塩基対を単位とする。
　図４は線形の傾きをビン－ペアのゲノム配列上の位置ごとに表したものである。一態様においてビン－ペアは染色体上で切れ目なく連続しているが、ビン－ペアに含まれるビン自体は互いに接してはおらず、間隔を置いて分布する。他の態様においてビン－ペアに含まれるビン同士が互いに接している。一態様においてビン同士が互いに接している前記ビン－ペアと、ビン同士が互いに接しておらず間隔を置いて分布するビン－ペアとが混在している。
　図４においては、ビン－ペアからなる母集団に対して、傾きの平均を０とし、標準偏差を１とする正規化、いわゆる標準化を施している。ここでいう正規化においては、ビン－ペアからなる母集団が正規分布に従っているものとして、これを取り扱う。したがって正規化後のビン－ペアは標準正規分布を有する。また一態様において、母集団を構成しているビン－ペアは、一つの染色体上の全体又は一かたまりの部分の中で切れ目なく連続している。
　図４において、さらに母集団中のビン－ペアを傾きの絶対値の大きい組と傾きの絶対値の小さい組とに分ける。一態様において傾きの値の度数分布に基づき、傾きの絶対値の大小を判定する。一態様において、傾きの絶対値の大きい組はコピー数比の増減区間を含むと判定する。また傾きの絶対値の小さい組はコピー数比の増減区間を含まないか又は増減区間を含むか否かは不明と判定する。
　なお増減区間においては、5’から見てコピー数比が増加していれば、3’から見てコピー数比が減少している。5’から見てコピー数比が減少していれば、3’から見てコピー数比が増加している。またDNAはそもそも相補鎖同士で5’から3’の方向が逆方向になっている二重らせん分子である。したがってどちらが5’でどちらが3’であるかもまた便宜的なものである。
　このようにコピー数比の増減は便宜的な定義である。増減区間に挟まれた区間、後に述べるセグメント、におけるコピー数比は別個に測定し、また評価する。したがって本実施形態の一態様ではコピー数比の増減区間を単にコピー数のバリアントの区切り点の候補として取り扱う。
　コピー数比の増加区間が隣り合うことは起こり得る。すなわちコピー数比が増加した後さらに増加することは起こり得る。コピー数比の減少区間が隣り合うことは起こり得る。すなわちコピー数比が減少した後さらに減少することは起こり得る。
　一態様において、標準化に際して、所定の閾値を設定して傾きの外れ値を検出する。一態様において外れ値はコピー数バリアントの区切り点の候補となる。外れ値は、当該外れ値を有するビン－ペアが、コピー数比の増減区間を有することを表す。以下、これを外れ値法という。区切り点の候補を得るための他の方法と比較する。
　外れ値法と比較される態様において、区切り点の候補を得るために、ビン－ペアからなる母集団に対して非階層的クラスタリング、階層的クラスタリング、及び線形補間されたコピー数比の平滑化のいずれかを行う。これらの処理で提供される区切り点の候補は、人間が解釈しにくい区切り点の候補を提供することがある。
　これらに比べて外れ値法は、より人間が解釈しやすい区切り点の候補を提供する。したがって外れ値法の実行後に、人手により、ゲノム配列上に区切り点の候補を追加・削除すること、いわゆるポストエディットが容易である。
　また外れ値法は上記の非階層的クラスタリングを始めとする処理に比べて、より単純な計算によって実行できる。他の態様において、非階層的クラスタリング、階層的クラスタリング、及び線形補間されたコピー数比の平滑化のいずれかが、外れ値法によって得られる利益を損なわない範囲で外れ値法と併用される。
　図５は傾きの度数分布のモデルを示す。正規分布で表されている。一態様において±２SDの範囲を外れた傾き、すなわち外れ値を有するビン－ペアが増減区間を有すると判定する。下記式に従いビン－ペアごとにｚを求めた上で、ｚ＞２又はｚ＜－２であればそのビン－ペアの傾きの絶対値が大きいと判定する。ここでｚの閾値の絶対値を２としているが、この値は例示に過ぎない。他の態様においてｚの閾値の絶対値は0より大きく、2より小さい。その一態様においてｚの閾値の絶対値は0.5，1及び1.5のいずれかである。他の態様においてｚの閾値の絶対値は2より大きい。その一態様においてｚの閾値の絶対値は４以下である。その一態様においてｚの閾値の絶対値は2.5，3及び3.5のいずれかである。外れ値となるｚを有するビン－ペアは増減区間を有する。先に述べたように増減区間は、コピー数のバリアントの区切り点の候補である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000003
　ｘは傾きである。ｘは絶対値ではなく正負を含む。μはビン－ペアからなる母集団のｘの平均である。σは、その母集団のｘの標準偏差である。
　図６は拡大したCNVチャートを示す。縦軸がコピー数比（Bin_Copy）を表す。正倍数体に対応するビンのコピー数比を２とする補正を行っている。概ねコピー数比が２．０から２．７の範囲で各ビンのコピー数比が分布している。いわゆるトリソミーとダイソミーのモザイクになっていることが予想される。なお厳密な検討においては、細胞サンプル中の各細胞の有するテトラソミーやモノソミーやその他の異数性の存在も考慮しなければならない。
　図６に示す異数性のモザイクは、一態様において細胞サンプルがコピー数に関するモザイクを有する細胞集団であることに起因する。他の態様において細胞サンプルがシングルセルであればモザイクは生じず、正規化したコピー数比は整数となる。
　図７は、増減区間を図６に示すコピー数比の分布に重ね合わせた結果である。増減区間がゲノム配列を切り分けてセグメントを生成する。増減区間はコピー数のバリアントの区切り点の候補である。増減区間で挟まれたセグメントがコピー数にバリアントが生じている区間を表しているか、他の変動に起因するかどうかはさらに後の工程で判定する。まずは、コピー数比の増減区間のゲノム配列上の位置を、ゲノム配列上のコピー数のバリアントの区切り点の候補として含む電子データを生成する。係るデータを候補データという場合がある。
　図８は候補データを用いてセグメントをコールしたところを示す。楕円が、各セグメント内に含まれるビンを示すドットを囲んでいる。各セグメントには少なくとも一つのビンが含まれる。一態様において一つのセグメントには複数のビンが含まれ、またこれらのビンがセグメント内で連続する。一態様においてセグメント間にはセグメントで分類されないビンが余ることはない。
　一態様においてセグメントのコピー数比を定義する。一態様においてセグメントのコピー数比はセグメント内のビンのコピー数比の平均を表す。本実施形態ではセグメントのコピー数比が２より大きい側をゲインと称する。またセグメントのコピー数比が２より小さい側をロスと称する。なお図８中のいずれのセグメントもゲインであるか、概ね正倍数体であるかのいずれかである。
　図８において、正倍数体のコピー数比を２としたときに、コピー数比が２．５以上で、２．８未満のビンが中心となるセグメントを、ハイレベル（High Level）のコピー数のバリアントを有するセグメントとしてコールする。正倍数体のコピー数比からの離れ具合を乖離度という。ハイレベルのコールを行うための乖離度の下限の閾値の一例は＋0.5である。図８においていくつかのセグメントはコピー数比が２．６付近である。これらのセグメントはトリソミーに近いと予想される。他の態様においてハイレベルのコールを行うための乖離度の下限の閾値は0より大きく0.5より小さい。その一態様において乖離度の下限の閾値は0.1，0.2，0.3及び0.4のいずれかである。他の態様においてハイレベルのコールを行うための乖離度の下限の閾値は0.5より大きく1より小さい。その一態様において乖離度の下限の閾値を0.6，0.7，0.8及び0.9のいずれかである。
　図８において、正倍数体のコピー数比を２としたときに、コピー数比が２．２以上で、２．５未満のセグメントを、ローレベル（Low Level）のコピー数バリアントとしてコールする。ローレベルのコールを行うための乖離度の上限の閾値の一例は＋0.5である。図８においていくつかのセグメントのコピー数比が２．４以下である。これらのセグメントはダイソミーに近いと予想される。他の態様においてローレベルのコールを行うための乖離度の上限の閾値は0より大きく0.5より小さい。その一態様において乖離度の上限の閾値は0.1，0.2，0.3及び0.4のいずれかである。他の態様においてローレベルのコールを行うための乖離度の上限の閾値は0.5より大きく1より小さい。その一態様において乖離度の上限の閾値は0.6，0.7，0.8及び0.9のいずれかである。一態様においてローレベルのコールを行うための乖離度の上限の閾値は、ハイレベルのコールを行うための乖離度の下限の閾値と一致する。
　以下、正倍数体相当からの乖離度を、ハイレベル（High Level）及びローレベル（Low Level）で分類された結果をモザイクレベルという場合がある。なお図８ではゲイン側のコールの例を示した。他の態様において、ロス側のコールにおいても乖離度の閾値を設定する。この時、乖離度の閾値は負の値をとる。
　図８に示すように、隣り合うセグメントであってコピー数比がだいたい同じか、まったく同じものもある。これらのセグメント間の増減区間はコピー数バリアントの区切り点そのものかどうかは分からない。隣り合うセグメント同士のコピー数比は同一でもよく、さらにこれらがコピー数のバリアントを有していてもよい。増減区間はコピー数のバリアントの区切り点の候補に過ぎない。一態様において、これらの増減区間をコピー数のバリアントの区切り点と、そうではないものとに区別することは有用である。他の態様においてこのように区別することは必須ではない。
＜２．セグメントの統合＞
　図８では、増減区間から特定した、たくさんのセグメントをそのままコールする。このようなコールは、後に説明するモザイクレベルの判定を煩雑にする。そこでモザイクレベルの判定に先駆けてセグメントを統合する。
　図９はCNVチャートと細胞サンプル（Cells）中のある染色体（Chromosome）に関するモザイクとを並べたものである。一態様において、この図に示すように、染色体上でモザイクレベルの分布を把握しやすい所望の状態が得られるまで、セグメントの数を減らし、セグメントを拡大する修正作業を行う。本図については後のセクションで改めて説明する。
　図１０は、セグメントの統合の態様を示す。上述の通りセグメントを生成した後、小さなセグメント（Small Segment）をその前後に隣接するいずれかのセグメントに統合する。一態様において小さなセグメントは所定個数未満のビンを含むセグメントである。一態様において小さなセグメントはビンを１個又は２個しか含まない。図中では右から3番目のセグメントが2個のビンしか含んでいない。そこで右から4番目のセグメントにこれを統合する。このようにセグメントを統合することで、最終的に、所定個数以上のビンを含むセグメント、すなわち大きなセグメント（Big Segment）だけでゲノム配列を切り分ける状態を得る。
　他の態様において小さなセグメントは所定の塩基長に満たないセグメントである。一態様において所定の塩基長は10Mbp以下である。一態様において所定の塩基長は1,2,3,4,5,6,7,8及び9Mbpのいずれかである。このような小さなセグメントをその前後に隣接するセグメントに統合することで、所定塩基長以上のセグメントだけでゲノム配列を切り分ける。
　一態様において、小さなセグメントをその前後のいずれのセグメントに統合するかは、予め定めた基準に基づいて決定する。一態様において、その前後のいずれのセグメントとの間の距離、塩基長が短い方のセグメントと、小さなセグメントとを統合する。他の態様において、正倍数体からの乖離が大きい方のセグメントと、小さなセグメントとを統合する。
　一態様において小さなセグメントがセントロメアよりもテロメアに近い時、小さなセグメントをテロメアから遠いセグメントと統合する。他の態様において小さなセグメントがテロメアよりもセントロメアに近い時、小さなセグメントをセントロメアから遠いセグメントと統合する。
　一態様においてセグメントの統合を行った後にモザイクレベルを判定する。他の態様においてセグメントの統合をせずにモザイクレベルを判定する。
＜３．モザイクレベルの判定＞
　本実施例では細胞サンプルのモザイクレベルを判定する。初めにモザイクレベルを説明する。
　図９において、細胞サンプルに含まれる細胞は同一の細胞、すなわち受精卵を起源としている点でホモジーニアスである。またその数が特定されている。したがって、コピー数比からモザイクの状態が判定できる。本実施形態において係るモザイクの状態の情報をモザイクレベルという。
　図９において細胞サンプルは5個の細胞からなる。2本のセグメントが1.25×108 bp付近の区切り点を境にして染色体上の前半と後半とで分かれている。前半のセグメントはコピー数比が2.0である。後半のセグメントはコピー数比が2.4である。
　図９において、細胞サンプル中の細胞はいずれも、この染色体に関してダイソミーかトリソミーであると仮定する。この場合、これらの細胞中のモザイクは図の下段のように表される。すなわちゲノム配列上の前半のセグメントはいずれの細胞においてもダイソミーである。またゲノム配列上の後半のセグメントは5個中2個の細胞にてトリソミーであり、3個の細胞にてダイソミーである。
　図９にしめすように、モザイクレベルは細胞の集団における細胞間の遺伝学的モザイクに由来する。モザイクレベルは、集団中にコピー数のバリアントが生じている細胞と生じていない細胞とが含まれていることにより生じる。あるいはコピー数のバリアントのパターンが異なる細胞同士が含まれていることにより生じる。モザイクレベルは特定の細胞サンプルから得られる。一態様において、その細胞サンプルは一つの胚中の複数の細胞を生検して得た複数の細胞からなる集団である。
　モザイクレベルは統合されたセグメントのコピー数比から得る。ただし統合されたセグメントと統合前のセグメントとの間でそれらのコピー数比は異なることがある。したがって統合された後にコピー数比を改めて取得する。一態様において、統合されたセグメントに含まれる各ビンのコピー数比の平均値を、統合されたセグメントのコピー数比とする。
　統合されたセグメントを、それらの補正されたコピー数比と所定の閾値との対比に基づき分類する。閾値はモザイクレベルの高低によって複数設定される。一例において閾値は以下のとおりである。
Tetrasomy......3.8以上
Trisomy......2.8以上、3.8未満
High Level Mosaic Gain......2.5以上、2.8未満
Low Level Mosaic Gain......2.2以上、2.5未満
Euploid or Disomy......1.8超、2.2未満
Low Level Mosaic Loss......1.5超、1.8以下
High Level Mosaic Loss......1.2超、1.5以下
Monosomy......0.2超、1.2以下
Nullisomy......0.2以下
　他の例において閾値は以下の通りである。
Tetrasomy......3.7以上
Trisomy......2.7以上、3.7未満
High Level Mosaic Gain......2.4以上、2.7未満
Low Level Mosaic Gain......2.3以上、2.4未満
Euploid or Disomy......1.7超、2.3未満
Low Level Mosaic Loss......1.6超、1.7以下
High Level Mosaic Loss......1.3超、1.6以下
Monosomy......0.3超、1.3以下
Nullisomy......0.3以下
　上記は細胞集団におけるモザイクレベルを表している。TetrasomyやTrisomyやその他の用語は、集団中の個々の細胞の異数性を特定するものではない。これらの表現は細胞集団の異数性の水準を表すに過ぎない。
　コンピューターはセグメントの特定と、そのセグメントのモザイクレベルとを含む電子データを生成する。以下、これを判定データという。一態様において、モザイクレベルを判定後に、隣り合うセグメント同士であってモザイクレベルの等しいセグメントを互いに統合して一つのセグメントとする修正を行う。かかる修正を判定データに付け加える。
＜４．判定データの利用＞
　診断医は、細胞サンプルごとに得られた判定データを用いて、複数の胚をセグメントのモザイクレベルに応じて順位付けする。順位付けは例えば診断医が直接行う。施術者は順位付けされた複数の胚を、当該順位を参考に順に子宮へ移植する。一態様においてコンピューターは判定データそれ自体を診断医に提供する。他の態様において診断医が順位付けをしやすくなるように、コンピューターが判定データを元に各細胞サンプルを、すなわち各胚をスコアリングする。一態様においてコンピューターはスコアリング結果を診断医に提供する。一態様においてコンピューターはスコアリング結果を判定データに付加して診断医に提供する。以下において、まずスコアリングのための判定データに対する処理を説明する。
　モザイクレベルが正倍数体相当であるセグメント又は最も正倍数体相当に近いセグメントをベースラインのセグメントとする。コピー数比が正倍数体よりも高い側のセグメントと、コピー数比が正倍数体よりも低い側のセグメントとが混在する場合は、正倍数体相当のセグメントをベースラインのセグメントとする。ベースラインのセグメントは染色体全体レベルの判定に用いる。ベースライン以外のセグメントはセグメントレベルの判定に用いる。以上により染色体としての判定結果を得る。
　図９においては、一種類の染色体中に、モザイクレベルが2.0のセグメントと、2.4のセグメントが存在する。ここではモザイクレベルが正倍数体相当であるセグメントをベースラインのセグメントとするルールに従う。染色体全体レベルの判定ではベースラインである2.0のセグメントの判定を用いる。染色体全体レベルの判定の結果、この染色体はEuploid又はDisomyであると判定される。
　図９において、ベースラインではないセグメントは2.4のセグメントとなる。染色体のセグメントレベルの判定の結果、この染色体は“Low Level Mosaic Gain”であると判定される。
　染色体としての判定結果は、染色体全体レベルの判定とセグメントレベルの判定とをいずれも考慮して得る。図９において、この染色体の染色体全体レベルは、Euploid又はDisomyである。この染色体のセグメントレベルの判定は“Low Level Mosaic Gain”である。この染色体は、ベースラインから外れているセグメントを有する。したがって判定結果にSegmentalという語を追記する。この染色体に対する、染色体としての判定結果は、Euploid又はDisomyの染色体が“Low Level Segmental Mosaic Gain”のコピー数バリアントを有している、である。
＜５．スコアリング＞
　区切り点の候補の検出からモザイクレベルの判定までの処理は、細胞サンプルごとに行うことができる。一態様において複数の細胞サンプルに対してこれらの処理を行う。一態様において細胞サンプルは複数の胚からそれぞれ得られたものである。
　これらの細胞サンプルに対して判定データをもとにスコアリングを行う。セグメントは細胞サンプルごとに異なる場合がある。そこで細胞サンプル間の比較を、染色体ごとに行う。すなわち全ゲノムレベルまで拡大してモザイクの状態を判定する。
　図１１は、モザイクの階級を示す。左側は全ての染色体に渡るモザイクの階級を表す。以下、これを全染色体モザイクスコアという。右側はセグメントのコピー数比の正倍数体相当からの乖離度を百分率で表したときの、最高値を示すセグメントの乖離度に応じた階級を示す。以下、これをモザイク率スコアという。全染色体モザイクスコアとモザイク率スコアとに従いスコアリングを行う。一態様において、診断医は、これらのスコアが小さいほど優先度が高いものと判断する。他の態様において、診断医は、これらのスコアが小さくとも優先度が高いものとは判断しない。また一態様において、診断医は、全染色体モザイクスコアはモザイク率スコアに優先するものと判断する。他の態様において、診断医は、全染色体モザイクスコアはモザイク率スコアに優先するものとは判断しない。
　図１２は、モザイク例１のCNVチャートを示す。図１３は、モザイク例２のCNVチャートを示す。図１４は、モザイク例３のCNVチャートを示す。図１５は、モザイクレベルのハイレベル及びローレベルの違いを示す。図１６は、スコアリング結果を示す。モザイク例１～モザイク例３は男性（XY）のゲノム配列上のコピー数比の分布を表す。
　コピー数比が正倍数体よりも高いセグメントを有する胚をゲイン（Gain）という。図１１に示すようにゲインには５～９の全染色体モザイクスコアが付与される。コピー数比が正倍数体の水準よりも低いセグメントを有していても、高いセグメントを有していればゲインに分類する。
　コピー数比が正倍数体の水準よりも高いセグメントを有しない胚のうち、低いセグメントを有する胚をロス（Loss）という。図１１に示すようにロスには１～４の全染色体モザイクスコアが付与される。
　全染色体の全ゲノム配列に渡って倍数性が正倍数体の水準にある細胞サンプルを特に正倍数体（Euploid）と称する。図１１に示すようにその全染色体モザイクスコアは0である。一種類以上の染色体で異数性を有する細胞サンプルを特に異数体（Aneuploid）と称する。図１１に示すようにその全染色体モザイクスコアは10である。
　図１２に示すモザイク例１において１番及び５番染色体でコピー数比が上昇している。図１３に示すモザイク例２及び図１４に示すモザイク例３において、１番、５番及び１６番染色体でコピー数比が上昇している。これらのモザイク例はいずれもゲインである。
　図１５に示すように、本実施例では以下のモザイクレベルの閾値を利用している。すなわち染色体一本分のコピー数比の乖離度を100%としたとき、コピー数比の乖離度が50％以上であるセグメントのモザイクレベルをハイレベルとする。乖離度が50％未満であるセグメントをローレベル（ローレベル）とする。ここでは閾値を50%としたが、閾値は0%超、100%未満の範囲で適宜設定できる。閾値は10,20,30,40,60,70,80及び90%のいずれかでもよい。
　図１１に戻る。スコアリングにおいて、モザイクレベルがハイレベルのセグメントを有しない胚を、これを有する胚と区別する。モザイクレベルがハイレベルのセグメントを有しない胚は、これを有する胚よりも正常胚である可能性が高い。“Low-level Chromosomal Loss”の細胞サンプルはハイレベルのセグメントを有しない。“High-level Segmental Loss”、“High-level Chromosomal Loss”及び“Low-risk Complex”の細胞サンプルは、ハイレベルのセグメントを有する。“Low-level Chromosomal Loss”はこれらよりも小さい全染色体モザイクスコアを有する。
　図１１に示すように、スコアリングにおいて、“Low-level Chromosomal Gain”の細胞サンプルはハイレベルのセグメントを有しない。“High-level Segmental Gain”、“High-level Chromosomal Gain”、“Middle-risk Complex”及び“High-risk Complex”の細胞サンプルは、ハイレベルのセグメントを有する。“Low-level Chromosomal Gain”はこれらよりも小さい全染色体モザイクスコアを有する。
　図１２に示すモザイク例１においてハイレベルのゲインのセグメントは見られない。したがって、全染色体モザイクスコアは５である。図１３に示すモザイク例２及び図１４に示すモザイク例３において、ハイレベルのゲインのセグメントが見られる。したがって、これらの全染色体モザイクスコアは６以上である。
　さらに本実施例では、ロスの細胞サンプルの一種類の染色体中でハイレベルのセグメントが染色体全体に渡っている場合“High-level Chromosomal Loss”とする。ロスの細胞サンプルの一種類の染色体中でハイレベルのゲインのセグメントが染色体全体に渡っている場合“High-level Chromosomal Gain”とする。
　図１３に示すモザイク例２では、16番染色体の一部にハイレベルのゲインのセグメントが見られる。したがって全染色体モザイクスコアは６である。図１４に示すモザイク例３では1番染色体の全体にハイレベルのゲインのセグメントが見られる。したがって全染色体モザイクスコアは７である。
　本実施例では、モザイク率スコアが小さい胚を、大きい胚と区別する。モザイク率スコアは、セグメント間における、正倍数体のコピー数比からの乖離度の最大値に応じて付与される。コピー数比の乖離度の最大値は、コピー数比が正倍数体よりも高い側とコピー数比が正倍数体よりも低い側との両方を合わせた母集団から得る。
　例えば図１２に示すモザイク例１では各染色体についてコピー数比が正倍数体よりも高い側の乖離度の最大値は５０％に満たない。しかしながらコピー数比が正倍数体よりも低い側の乖離度の最大値は4番染色体で６０％を超える。したがってコピー数比が正倍数体よりも低い側を考慮し０．６とする。
　図１６はスコアリングの結果を示す。図１２に示すモザイク例１の総スコアは５．６なので１位である。図１３に示すモザイク例２の総スコアは６．６なので２位である。図１４に示すモザイク例３の総スコアは７．６なので３位である。
　図１１に示すロスの階級において、“Low-risk Complex”では3種類以上の染色体でハイレベルのセグメントが見られる。ただし、この『3種類以上の染色体』は、一つの染色体に占めるハイレベルのセグメントの総塩基長が所定割合以上である。所定割合は0%より大きく、100%より小さい任意の値である。その一態様において所定割合は10，20，30，40，50，60，70，80及び90のいずれかである。その一態様において所定割合は10～50％の範囲から選ばれる。スコアリングにおいては、ロスの内、このようなモザイクを有する染色体が少ない胚を、多い胚と区別する。ここで閾値を3本としたが、2本でもよい。
　図１７は、モザイク例４のCNVチャートを示す。モザイク例４では3番、6番及び9番染色体にコピー数比が正倍数体よりも低い側のハイレベルのセグメントが見られる。コピー数比が正倍数体よりも高い側のハイレベルのセグメントは見られない。これらのセグメントの総塩基長はそれぞれの染色体において40%以上を占める。ここでは一例として所定割合を40%としたが、この数値の選択は本発明を限定するものではない。モザイク例４はLow-risk Complex”に分類される。その全染色体モザイクスコアは４である。このようなモザイクを有する染色体が2種類以下であれば全染色体モザイクスコアは１～３である。モザイク例４並びに、以下に述べるモザイク例５及びモザイク例６は男性（XY）のゲノム配列上のコピー数比の分布を表す。
　図１１に示すゲインの階級において、“Middle-risk Complex”及び“High-risk Complex”では3種類以上の染色体でハイレベルのセグメントが見られる。ただし、この『3種類以上の染色体』は、一つの染色体に占めるハイレベルのセグメントの総塩基長が所定割合以上である。Complexであるか否かの判定では、コピー数比が正倍数体よりも高い側のハイレベルのセグメントも、コピー数比が正倍数体よりも低い側のハイレベルのセグメントも等しくカウントされる。これらのComplexに該当しない胚を、Complexの胚と区別する。
　さらにこれらのComplexの胚の中のスコアリングにおいては、一つの染色体に占めるコピー数比が正倍数体よりも高い側のハイレベルのセグメントの総塩基長が所定割合以上である染色体が少ない胚を、多い胚と区別する。スコアリングでは、コピー数比が正倍数体よりも高い側のハイレベルのセグメントをカウントするが、コピー数比が正倍数体よりも低い側のハイレベルのセグメントはカウントしない。
　図１８は、モザイク例５のCNVチャートを示す。モザイク例５では3番でコピー数比が正倍数体よりも高い側のハイレベルのセグメントが見られる。6番及び9番染色体にコピー数比が正倍数体よりも低い側のハイレベルのセグメントが見られる。これらのセグメントの総塩基長はそれぞれの染色体において40%以上を占める。ここでは一例として所定割合を40%としたが、この数値の選択は本発明を限定するものではない。モザイク例５は“Middle-risk Complex”に分類される。その全染色体モザイクスコアは８である。
　図１９は、モザイク例６のCNVチャートを示す。モザイク例６では3番、6番及び9番染色体にコピー数比が正倍数体よりも高い側のハイレベルのセグメントが見られる。コピー数比が正倍数体よりも低い側のセグメントは見られない。これらのセグメントの総塩基長はそれぞれの染色体において40%以上を占める。ここでは一例として所定割合を40%としたが、この数値の選択は本発明を限定するものではない。モザイク例６は“High-risk Complex”に分類される。その全染色体モザイクスコアは９である。
　上記の通り処理を行うことで、判定データからスコアリングを含む電子データ、これを順位データという、を生成する。さらにスコアリングを参考に順に施術者が子宮への胚の移植を行う。
　なお、本発明は上記実施の形態に限られたものではなく、趣旨を逸脱しない範囲で適宜変更することが可能である。スコアリングは非特許文献２に記載の又はその他の、サンプルに基づく遡及的分析の結果得られたスコアリングシステムを利用して行ってもよい。
　発明の他の観点は、上記処理をコンピューターで実行するためのプログラムである。発明の他の観点は、上記プログラムを格納するディスク、テープ、フラッシュメモリ、及びその他の不揮発性記憶媒体である。発明の他の観点は、上記プログラムを、ネットワークを介してダウンロード提供することである。発明の他の観点は、ネットワークを介して要求を受け取り、要求に応じて上記プログラムをコンピューター上で実行し、要求に応じて処理結果を、ネットワークを介して提供することである。一態様においてプログラムを実行するコンピューターの動作を、ネットワークで接続された複数の装置で実行する。
　この出願は、２０２１年３月８日に出願された日本出願特願2021-36092を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。

Claims (18)

  1. 　ゲノム配列上のコピー数のバリアントの区切り点の候補を機械的に検出する方法であって、
    　細胞サンプルより得た染色体DNAの断片配列の電子データ、以下、これを検体データという、を以下の通りコンピューターで自動的に処理する、
    　ゲノム配列上に連続的に設定される領域、以下ビンという、であって、前記断片配列のサイズよりも大きいサイズを有するものにそれぞれ含まれる前記断片配列を数える、
    　前記ビン同士の間隔を分解能として、前記ゲノム配列上のコピー数比の分布を測る、
    　前記ビンの前記ゲノム配列上の位置に対する、前記コピー数比の変化の傾きを隣り合う前記ビンの組、以下、これをビン－ペアという、ごとに取得する、
    　前記ビン－ペアを前記傾きの絶対値の大きい組と前記傾きの絶対値の小さい組とに分け、前記傾きの絶対値の大きい組は前記コピー数比の増減区間を含むと判定し、
    　前記コピー数比の増減区間のゲノム配列上の位置を、ゲノム配列上のコピー数のバリアントの区切り点の候補として含む電子データ、以下、これを候補データという、を生成する方法。
  2. 　前記増減区間を含む前記ビン－ペアを特定するために、
    　下記式に従い前記ビン－ペアごとにｚを求め、
    　ｚ＞２又はｚ＜－２であれば前記傾きの絶対値が大きいと判定する、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
     　ｘは傾きであり、ｘは絶対値ではなく正負を含み、μは前記ビン－ペアからなる母集団のｘの平均であり、σは前記母集団のｘの標準偏差である、
    　請求項１に記載の方法。
  3. 　前記母集団を構成している前記ビン－ペアは、一つの染色体上の全体又は一かたまりの部分の中で切れ目なく連続している、
    　請求項２に記載の方法。
  4. 　前記傾きの絶対値の大きい組に対する判定とともに、前記傾きの絶対値の小さい組はコピー数比の増減区間を含まないか又は不明と判定する、
    　請求項１～３のいずれかに記載の方法。
  5. 　前記ビン－ペアは染色体上で切れ目なく連続しているが、
    　前記ビン同士が互いに接している前記ビン－ペアと、前記ビン同士が互いに接してはおらず間隔を置いて分布するビン－ペアとが混在している、
    　請求項１～４のいずれかに記載の方法。
  6. 　前記ゲノム配列は前記細胞サンプルから新規に取得されたものではなく、前記細胞サンプル以外の細胞から事前に取得された全ゲノム配列又はその部分のデータである、
    　請求項１～５のいずれかに記載の方法。
  7. 　前記細胞サンプルは一つの胚を生検して得た細胞集団であり、
    　前記細胞サンプルを溶解することで、若しくは前記細胞サンプルが自発的に放出することで得られた染色体DNAを混合した状態で全ゲノム増幅し、
    　増幅産物からDNAシーケンサーにて前記検体データを取得する、
    　又は
    　前記細胞サンプルは一つの胚を生検して得た一つの細胞であり、
    　前記細胞サンプルを溶解することで、若しくは前記細胞サンプルが自発的に放出することで得られた染色体DNAを全ゲノム増幅し、
    　増幅産物からDNAシーケンサーにて前記検体データを取得する、
    　請求項１～６のいずれかに記載の方法。
  8. 　前記DNAシーケンサーから前記コンピューターに前記断片配列の前記検体データを送る、
    　請求項７に記載の方法。
  9. 　前記DNAシーケンサーが、サーバーに前記検体データを送り、
    　前記サーバーが前記検体データを記録し、さらに前記コンピューターの求めに応じて前記コンピューターに前記検体データを送る、
    　請求項７に記載の方法。
  10. 　請求項１～９のいずれかに記載の方法で前記候補データを生成し、さらに、コンピューターにて、
    　前記検体データの生データを補正することで補正後のコピー数比を取得し、
    　前記区切り点の候補で前記ゲノム配列を切り分けてセグメントを生成し、ここで前記セグメントには一つの前記ビン、又は連続する複数の前記ビンが含まれる、
    　さらにコピー数比に関する所定の閾値で各セグメントを分類した情報、以下、これをモザイクレベルという、を取得し、
    　前記セグメントの特定と、前記モザイクレベルとを含む電子データ、以下、これを判定データという、を生成する方法。
  11. 　セグメントを生成した後、
    　所定個数未満の前記ビンを含むセグメントをその前後に隣接するいずれかのセグメントに統合することで、前記所定個数以上の前記ビンを含むセグメントだけで前記ゲノム配列を切り分ける修正、及び
    　所定塩基長に満たないセグメントをその前後に隣接するいずれかのセグメントに統合することで、前記所定塩基長以上のセグメントだけで前記ゲノム配列を切り分ける修正、
    　の少なくともいずれかを行ってから前記補正を行う、
    　請求項１０に記載の方法。
  12. 　前記細胞サンプルは複数の胚からそれぞれ得られたものであり、
    　請求項１０又は１１に記載の方法で前記判定データを生成し、さらにコンピューターにて、
    　前記複数の胚を前記セグメントの前記モザイクレベルに応じてスコアリングし、
    　前記スコアリングを含む電子データを生成する方法。
  13. 　前記スコアリングにおいて、コピー数比が正倍数体よりも高いセグメントを有しない胚を、有する胚、以下、これをゲイン（Gain）と区別する、
    　請求項１２に記載の方法。
  14. 　前記スコアリングにおいて、前記ゲインの中で、染色体一本分のコピー数比の乖離度を100%としたとき、乖離度が0%超、100%未満の所定の値以上であるセグメント、以下、これをハイレベル（High Level）のセグメントという、であってコピー数比が正倍数体よりも高いセグメント、を有しない胚と、これを有する胚とを区別する、
    　請求項１３に記載の方法。
  15. 　前記スコアリングにおいて、前記ゲインの中の、前記ハイレベルのセグメントを有する胚の中で、前記ハイレベルのセグメントの総塩基長が10～50％の範囲から選ばれる所定割合以上の染色体が少ない胚と、これが多い胚とを区別し、ただし、前記ハイレベルのセグメントはコピー数比が正倍数体よりも高い側及び低い側のいずれも含む、
    　さらに、前記ハイレベルのセグメントの総塩基長が10～50％の範囲から選ばれる所定割合以上の染色体が多い胚の中で、コピー数比が正倍数体よりも高い側のハイレベルのセグメントの総塩基長が所定割合以上の染色体が少ない胚と、これが多い胚とを区別する、
    　請求項１４に記載の方法。
  16. 　前記スコアリングにおいて、コピー数比が正倍数体よりも高いセグメントを有しない胚であって、コピー数比が正倍数体よりも低いセグメントを有する胚をロス（Loss）とし、
    　前記ゲイン及びロスの中で、前記セグメント間における、コピー数比の正倍数体の水準からの乖離度の最大値が小さい胚と、大きい胚とを区別する、ただし、前記正倍数体の水準からの乖離度はコピー数比が正倍数体よりも高い側及び低い側のいずれも含む、
    　請求項１３～１５のいずれかに記載の方法。
  17. 　前記細胞サンプルは複数の胚からそれぞれ得られたものであり、
    　請求項１０又は１１に記載の方法で前記判定データを生成し、
    　コンピューターにて、前記複数の胚を前記セグメントの前記モザイクレベルに応じてスコアリングし、
    　前記スコアリングを参考に施術者が前記複数の胚を順に子宮へ移植する方法。
  18. 　ゲノム配列上のコピー数のバリアントの区切り点の候補を検出するプログラムであって、
    　細胞サンプルより得た染色体DNAの断片配列の電子データに対する、以下を含む処理をコンピューターに実行させるプログラム：
    　ゲノム配列上に連続的に設定される領域、以下ビンという、であって、前記断片配列のサイズよりも大きいサイズを有するものにそれぞれ含まれる前記断片配列を数えること、
    　前記ビン同士の間隔を分解能として、前記ゲノム配列上のコピー数比の分布を測ること、
    　前記ビンの前記ゲノム配列上の位置に対する、前記コピー数比の変化の傾きを隣り合う前記ビンの組、以下、これをビン－ペアという、ごとに取得すること、
    　前記ビン－ペアを前記傾きの絶対値の大きい組と前記傾きの絶対値の小さい組とに分け、前記傾きの絶対値の大きい組は前記コピー数比の増減区間を含むと判定すること、及び
    　前記コピー数比の増減区間のゲノム配列上の位置を、ゲノム配列上のコピー数のバリアントの区切り点の候補として含む電子データ、を生成すること。
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