JP2019216717A - N末端切断型インターロイキン−38 - Google Patents
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Abstract
Description
a.細胞を得る工程と、
b.前記細胞を微生物関連分子パターン(MAMP)、病原体関連分子パターン(PAMP)又はアポトーシス細胞上清(ACM)と接触させる工程と、
c.前記細胞を本発明の切断型IL-38タンパク質及び候補調節因子と更に接触させる工程と、
d.前記細胞のJNK活性化を求める工程と、
を含み、
対照細胞又は参照値と比べ、前記細胞のJNK活性化の増大により、前記候補調節因子が切断型IL-38のアンタゴニストであることが示され、対照細胞又は参照値と比べ、JNK活性化の低下により、前記候補調節因子が切断型IL-38のアゴニストであることが示される、方法に関する。
本発明は、種々の疾患の治療又は予防の治療薬として使用することができる切断型IL-38タンパク質を提供する。本発明によれば、化合物及び組成物は、病的に活性化した免疫応答又は炎症応答を特徴とする病態の治療及び/又は予防に特に有用である。特に、本発明は、広範囲の一連の慢性炎症障害及び自己免疫障害に関与することが示された、インターロイキン-6及びインターロイキン-17等のサイトカインの病的活性を特徴とする病態を治療しようと試みている。
本出願の別の態様は、自己免疫疾患又は炎症性疾患の治療又は予防のための組成物及びキットに関する。1つの実施の形態において、組成物は、場合により薬学的に許容される担体と合わせて本明細書に記載のタンパク質、核酸又は組換え細胞等の化合物を含む。
MCSLPMARYYIIKYADQKALYTRDGQLLVGDPVADNCCAEKICILPNRGLARTKVPI
FLGIQGGSRCLACVETEEGPSLQLEDVNIEELYKGGEEATRFTFFQSSSGSAFRLEAAA
WPGWFLCGPAEPQQPVQLTKESEPSARTKFYFEQSW
配列番号2
LYTRDGQLLVGDPVADNCCAEKICILPNRGLARTKVPIFLGIQGGSRCLACVETEEGP
SLQLEDVNIEELYKGGEEATRFTFFQSSSGSAFRLEAAAWPGWFLCGPAEPQQPVQLT
KESEPSARTKFYFEQSW
インハウスELISA(in-house ELISA)を行い、腫瘍細胞株により産生されたIL-38のレベルを求めるとき、本発明者らは、アポトーシス細胞死の誘導により上清内のIL-38分泌が著しく増大していることに気づいた。生存A549肺癌又はMDA.231乳癌細胞の上清(VCM)に比べ、壊死細胞上清(NCM)ではないアポトーシス細胞上清(ACM)はおよそ10倍高いIL-38のレベルが含まれていた(図1A)。これはまた初代ヒト好中球又はPBMCでも同様あったが、アポトーシス中のIL-38の放出の増加はそれほど大きくはなかった(図1A)。IL-38分泌の動態を分析するため、A549細胞上清のIL-38濃度をアポトーシス誘導時の様々な時間点において測定した。IL-38分泌の上昇がアポトーシス誘導の12時間後に観察され(図1B)、同時にA549細胞内にアポトーシスマーカーの発生を観察した(データは示さず)。
アポトーシス細胞由来のメディエーターは、サイトカイン産生を含む食細胞応答を調節する能力を有する(26)。本発明者らはLPSによるマクロファージ活性化時に又はアポトーシス細胞と相互作用する際に産生される一群のサイトカインの産生におけるIL-38の役割を分析した(27)。これらのうち、IL-6及びIL-8産生は、IL-38によって調節された。LPSのみに比べ、LPS刺激マクロファージに組換えIL-38を加えることにより、IL-6及びIL-8の産生が増大した(図2A)。興味深いことに、ヒトマクロファージを、A549細胞のACMのみ又は組換えヒトIL-38と組み合わせたACMで刺激したとき、反対の作用が観察された(図2B)。IL-38は、マクロファージ由来のACM誘導性IL-6及びIL-8の分泌を抑制した。ACMが既にIL-38を含有していることから、本発明者らは、内因性IL-38がマクロファージのサイトカイン産生(macrophage cytokine production)に影響を及ぼしているかについて考えた。この疑問を解決するため、IL-38をA549細胞において過剰発現させ、又はノックアウトさせた後ACMを作製した。実際に、ヒトマクロファージを、IL-38を過剰発現させたA549細胞から作製したACMで刺激することにより、IL-6及びIL-8の分泌が減少したが、IL-38ノックダウンA549細胞のACMで刺激することにより、高濃度のIL-6及びIL-8が得られた(図2C)。顕著な転写因子のうち、サイトカイン産生を調節し、IL-1ファミリーにより調節される因子は、NFκB及びAP1である。マクロファージとアポトーシス細胞とが相互作用した後、NFκBが遮断されるため(28)、本発明者らは、内因性IL-38がACMに応答してAP1の活性化を調節するかどうかを考えた。対照ACMに比べ、IL-38ノックダウンA549細胞のACMを、AP1ルシフェラーゼレポーター構築物をトランスフェクトしたマクロファージと作用させるとき、本発明者らは、IL-38のレベルが低いACMがより著名なAP1活性化を誘導することに気づいた(図2D)。結論として、内因性IL-38は、アポトーシス細胞上清に応答した炎症によるマクロファージ活性化を制限していた。
本発明者らは、IL-38が受容体アンタゴニストとして作用することによりACM誘導性サイトカイン産生を阻害するという仮説を立てた。それゆえ、本発明者らは、IL-38に関連したIL-1受容体ファミリーの候補物質を分析した。IL-38がIL-1R6に結合することが示され(19)、本発明者らは、オーファン受容体のIL-1RAPL1がACM刺激後にマクロファージのサイトカイン産生を調節することを観察した(16)。本発明者らははじめにIL1R6の発現を求め、マクロファージのIL-1RAPL1におけるmRNAレベルを、qPCRを用いて(図3A)及びACM又はLPS刺激後の細胞表面アベイラビリティのレベルをFACSにより(図3B)求めた。IL1R6発現は概ね低く(図3C)、ACM又はLPS刺激後のmRNAレベルを更に下方調節したにも関わらず、これは細胞表面の発現レベルでは明らかではなかった。これに対して、IL-1RAPL1の発現は増大し(図3C)、LPS処理の6時間後並びにACM処理の6時間後及び24時間後(図3A、B)のmRNAレベルにおいて及び細胞表面においての両方で更に誘導された。さらに、細胞表面のIL-1RAPL1発現は、LPSで24時間刺激した後に減少した。これらの実験は、少なくともIL-38の作用に対する更なる候補物質としてのIL-1RAPL1を示唆した。次に、本発明者らは、競合アッセイ及び受容体結合アッセイの両方を行うことによりIL-38がIL-1RAPL1に結合するか否かを分析した。競合アッセイにおいて、ヒトマクロファージを組換えヒトIL-38とインキュベーションした後、IL-1R6又はIL-1RAPL1の表面発現を分析した。IL-1R6の表面発現レベルが低いことから、IL-38のプレインキュベーションによる細胞表面の発現の差を観察することを確かめることが困難であった(図3C、D)。しかし、IL-1RAPL1において、本発明者らはIL-38がFACS染色に用いた抗体と競合した(図3C、D)ことを観察し、IL-38がIL-1RAPL1に結合する可能性があることが示された。これらの結果を立証するため、直接受容体結合アッセイを行った。プレートをIL-1R6-Fc及びIL-1RAPL1-Fcキメラを用いてコーティングし、様々な濃度のIL-38をウェルに添加し、IL-38の結合を視覚化した。最近報告したように(19)、実際にIL-38はIL-1R6に結合した(図3E)。さらに、IL-38はIL-1RAPL1にも結合した(図3E)。これらの結果によりIL-38がIL-1RAPL1に結合することによってサイトカイン産生を調節し得ることが示唆されたとして、本発明者らはACM誘導性サイトカイン産生におけるIL-1RAPL1の役割について考えた。ヒトマクロファージのIL-1R6又はIL-1RAPL1の一時的なノックダウンを行い、ACM刺激後のマクロファージ培養上清中のIL-6及びIL-8のレベルを測定した。ACM刺激後のIL-6及びIL-8の産生は、IL-1RAPL1依存性であった(図4A)が、IL-1R6は、本発明者らのモデルにおけるサイトカイン産生に関与しなかった(図4B)。
次に、本発明者らは、T細胞活性化に対するマクロファージ上清の影響を分析することによって、マクロファージのサイトカイン産生に対するIL-38依存性抑制の下流の結果について考えた。本発明者らは初代ヒトT細胞を単離し、抗CD3/抗CD28ビーズを用いてこれらの細胞を刺激し、ACM及びIL-38ノックダウンA549細胞のACMを用いて予め刺激したマクロファージ上清と繰り返しこれらの細胞をインキュベーションした。培養7日後にT細胞上清のIL-10、IL-17及びIFN-γのレベルを測定した。マクロファージをACMで刺激すると、マクロファージ上清により、T細胞によるIFN-γ及びIL-10の産生が減少し、IL-17レベルが僅かに上昇した(図5A)。それにも関わらず、マクロファージをIL-38切断ACMで刺激すると、マクロファージ上清により、T細胞によるIL-17産生が大きく上昇し、IL-10濃度が更に低下した(図5A)。これらの作用は、T細胞増殖の差とは関連のないものであった。ACM処理はT細胞の増殖数に影響を及ぼさなかった(図5B)が、分裂前T細胞が分裂する数に影響を及ぼしており、これはIFN-γ及びIL-10のレベルの減少で説明することができた(図5C)。しかし、T細胞増殖における、ACMがIL-38を含有するか否かについての差はなかった(図5B、C)。これらのデータは、アポトーシス細胞由来のIL-38がマクロファージ依存性のTh17細胞の産生を制限し、IL-10発現を維持することを示す。
IL-1Raを除くIL-1ファミリーの全てのメンバーは前駆体として産生され、この前駆体のN末端が切断されて完全な活性が得られる。最近では、N末端のプロドメインの大きさに従って、IL-38はIL-36のサブファミリーに分類されていた(4、19)。このIL-36のサブファミリーの一メンバーとしてのIL-38はコンセンサスモチーフを保持するが、これによりN末端の切断部位が決定されると推定されている(図6A)。アポトーシスがIL-38プロセシングを誘導するか否かを求めるために、C末端をmycタグ化したIL-38を腫瘍細胞において過剰発現させ、これらの細胞からACMを作製した。免疫沈降後、IL-38の2Dゲル電気泳動を行い、IL-38アイソフォームを視覚化した。2つのIL-38アイソフォームをゲル内で同定することに成功し、IL-38が実際にアポトーシス中にプロセシングされることが示された(図6B)。推定上のIL-38アイソフォームを表す2つのスポットを選定し、質量分析法(MS)により分析した。完全長のIL-38と予測された、分子量の大きいスポットにおいて、2つのN末端ペプチドがMS分析において認められ、1つは9個〜18個のアミノ酸であり、もう1つは24個〜41個のアミノ酸であり、一方、分子量の小さいサンプルでは、24個〜41個のアミノ酸のペプチドのみが認められた(図6C)。したがって、アポトーシス細胞のIL-38はN末端プロセシングされている。
完全長及び切断型のIL-38が異なる生物学的活性を有するか否かを求めるため、IL-1βのみ又は様々な濃度の完全長IL-38(IL-38aa1-152)若しくは切断型IL-38(IL-38aa20-152)と組み合わせて刺激したヒトマクロファージ上清中のIL-6濃度を求めた。IL-β刺激後、高濃度のIL-38aa1-152(20 ng/ml、10 ng/ml)はIL-6産生を顕著に増大させたが、IL-38aa20-152は低濃度で行ったときでもIL-6産生を低下させた(図7A)。ACM中のIL-38がIL-1RAPL1と相互作用することによってIL-6産生を調節することから、本発明者らはサイトカイン産生において相反する役割を有する両方のIL-38アイソフォームがIL-1RAPL1に結合するか否かを考えた。本発明者らは、上記で説明したように受容体結合アッセイを行った。このアッセイでは、両方のIL-38アイソフォームがIL-1RAPL1に結合した(図7B)。しかし、結合動態は僅かに異なるようであった。IL-38aa1-152及びIL-38aa20-152がサイトカイン産生に対して相反する役割を発揮するが、これらはともにIL-1RAPL1に結合することができると考えるとき、IL-6産生に対する作用がともにIL-1RAPL1依存性であるか否かが分析の更なるキーポイントとなった。これを実現するため、マクロファージにおいて一時的なIL-1RAPL1ノックダウンを行い、その上清のIL-6濃度をIL-1βのみ又はIL-38aa1-152若しくはIL-38aa20-152と組み合わせて刺激した後に測定した。マクロファージのIL-1RAPL1ノックダウンにより、完全長のIL-38によるIL-6誘導及び切断型IL-38によるIL-6抑制の両方が無効となった(図7C)。
本発明者らはアポトーシス細胞と相互作用する際にIL-38がマクロファージのAP1を調節する証拠を得た(図2D)。IL-38がIL-1RAPL1との相互作用に対して影響を及ぼすシグナル伝達経路を分析するため、本発明者らははじめにHEK293T細胞の受容体過剰発現モデルを利用した。細胞にIL-1RAPL1の過剰発現構築物及びAP1又はNFκBレポーター構築物を共トランスフェクトした。レポーター構築物をトランスフェクトしたがIL-1RAPL1を過剰発現しないHEK細胞を対照として使用した。はじめに、IL-1RAPL1過剰発現細胞モデル及び対照細胞を特徴付けるため、これらの細胞をIL-1βで刺激し、AP1(図8A)又はNFκB(図8B)活性を測定した。IL-1βをオーファン受容体IL-1RAPL1の低親和性リガンドとして使用した(14)。IL-1β刺激後、対照細胞においてNFκBの顕著な誘導が観察されたが、AP1活性は観察されなかった。それにも関わらず、IL-1RAPL1が過剰発現すると、AP1の活性化及びNFκB活性の上昇が観察された。したがって、IL-1βのみではIL-1RAPL1に非依存的にNFκB活性化を誘導するが、AP1を活性化させず、AP1活性化にはIL-1RAPL1を必要とした。興味深いことに、何らかの刺激がなくても、対照細胞に対してAP1及びNFκB活性を増大させるには、IL-1RAPL1があれば十分であった(図8A、B)。それゆえ、HEK細胞をIL-1β刺激後のIL-1RAPL1はAP1を活性化させるがNFκBを活性化させず、また外因性リガンドを添加することなく過剰発現させるとAP1及びNFκBの活性化を誘導する。これを確認するため、様々な転写因子結合部位において点変異を含む、又は含まないIL-6プロモーター構築物(AP1、NFκB、CREB及びCEBPβ)を使用した。HEK細胞に、IL1RAPL1過剰発現プラスミド及びIL-6レポーター構築物を共トランスフェクトした(29)。また、この条件において、IL-1RAPL1の過剰発現は、HEK対照細胞と比べIL-6プロモーターを活性化させた。このIL-6プロモーター誘導は、AP1及びNFκB結合部位が変異したとき無効となった(図8C)。これはHEK細胞により産生されたIL-1RAPL1に対する内因性リガンドが存在することを示唆する。次に、本発明者らは、IL-38aa1-152及びIL-38aa20-152がIL-1RAPL1の下流にてAP1及びNFκBの活性に影響を及ぼすか否かについて考えた。この条件におけるNFκBプロモーター活性はIL-38により調節されなかった(図8D)が、AP1誘導は両方のIL-38アイソフォームにより負の方向に調節された(図3E)。IL-38aa20-152が完全長のタンパク質に比べ低濃度にてAP1誘導を調節することができたことは重要なことであった。IL-1RAPLにより誘導されたAP1活性をIL-38依存的に抑制するシグナル伝達を分析するため、対照HEK細胞に対するIL-1RAPL1過剰発現細胞のリン酸化JNK及びp38の細胞内染色を行った。IL-1RAPL1の過剰発現後、リン酸化JNKにおいて誘導が観察されたが、p38においては観察されなかった。この誘導は、IL-38aa20-152によって顕著に減少したが、IL-38aa1-152によっては減少せず、切断型IL-38の調節の役割が大きいことを確認した。
次に、本発明者らは、本発明者らのHEKモデルのデータをマクロファージ条件に移行させた。ヒトマクロファージにAP1又はNFκBレポーター構築物をトランスフェクトし、ヒトマクロファージをIL-1βのみ又はIL-38aa20-152若しくはIL-38aa1-152と組み合わせて刺激した。HEK細胞と同じく、IL-38aa20-152はマクロファージのAP1活性を低下させたが、NFκB活性は低下させず、その一方で、IL-38aa1-152は効果がなかった(図9)。したがって、切断型IL-38のみがマクロファージのAP-1活性を抑制し、このことはIL-38を欠失するアポトーシス細胞上清で刺激したマクロファージが高いAP1活性レベルを示した(図2D)本発明者らの発見と一致するものである。最後に本発明者らは、IL-38aa1-152がマクロファージをIL-1β刺激した後にIL-6産生を増大させるかについての疑問に取り組んだ(図7A)が、HEK細胞モデルでは、IL-38aa1-152はAP1及びNFκBのどちらの活性化も増大させなかった。この矛盾を検討するため、マクロファージにIL-6レポーター構築物をトランスフェクトし、マクロファージをIL-1βのみ、又は両方のIL-38アイソフォームと組み合わせて刺激した。予想した通り、IL-38aa20-152はIL-6プロモーター活性を減少させるが、IL-38aa1-152はIL-6プロモーター誘導に全く影響を与えず(図9)、IL-38aa1-152が介在したIL-6産生の増大は、転写により調節されなかったことが示唆された。
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Claims (15)
- 単離された切断型IL-38タンパク質又はその機能的変異体であって、該切断型IL-38タンパク質が配列番号1によるアミノ酸配列に対してN末端切断型であり、該切断が配列番号1の1位〜30位の少なくとも10個の隣接するアミノ酸を含む、切断型IL-38タンパク質又はその機能的変異体。
- 前記切断型IL-38タンパク質は野生型IL-38タンパク質(配列番号1)に対しN末端にて2個〜50個のアミノ酸が切断されている、請求項1に記載の単離された切断型IL-38タンパク質。
- 前記切断型IL-38タンパク質は配列番号1に示すタンパク質に対して、N末端にて11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個又は20個のアミノ酸が切断されている、請求項2に記載の単離された切断型IL38タンパク質。
- 配列番号1の最初の100個、50個、30個、20個又は19個のアミノ酸と同一でないN末端を有する、請求項1〜3のいずれか一項に記載の切断型IL-38タンパク質。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載の切断型IL-38タンパク質をコードする配列を含む核酸。
- 発現したときに請求項1〜4のいずれか一項に記載の前記切断型IL-38タンパク質からなるポリペプチドを産生するが、配列番号1による完全長のIL-38タンパク質でない、配列を含む、請求項5に記載の核酸。
- 請求項5又は6に記載の核酸を含むベクター。
- 発現可能な配列がプロモーターに操作可能に結合する、請求項7に記載のベクター。
- 請求項5若しくは6に記載の核酸又は請求項7若しくは8に記載のベクターを含む組換え細胞。
- 医療において使用するための、免疫疾患又は炎症性疾患の治療又は予防に使用するための、請求項1〜4のいずれか一項に記載の切断型IL-38タンパク質又は請求項5若しくは6に記載の核酸又は請求項7若しくは8に記載のベクター又は請求項9に記載の組換え細胞を含む医薬組成物。
- 細胞の免疫応答を調節するin-vitroの方法であって、該細胞と請求項1〜4のいずれか一項に記載の切断型IL-38タンパク質とを接触させること、又は該細胞において請求項5若しくは6に記載の核酸を発現させることを含む、方法。
- 前記免疫応答の調節は、JNKシグナル伝達の阻害、又はIL-6放出及びTH17産生の阻害である、請求項11に記載の方法。
- 切断型IL-38の活性の調節因子をスクリーニングする方法であって、
a.細胞を得る工程と、
b.前記細胞を微生物関連分子パターン(MAMP)、病原体関連分子パターン(PAMP)又はアポトーシス細胞上清(ACM)と接触させる工程と、
c.前記細胞を請求項1〜4のいずれか一項に記載の切断型IL-38タンパク質及び候補調節因子と更に接触させる工程と、
d.前記細胞のJNK活性化を求める工程と、
を含み、
対照細胞又は参照値と比べ、前記細胞のJNK活性化の増大により、前記候補調節因子が切断型IL-38のアンタゴニストであることが示され、対照細胞又は参照値と比べ、JNK活性化の低下により、前記候補調節因子が切断型IL-38のアゴニストであることが示される、方法。 - 例えば、前記細胞においてIL-1RAPL1を異所的に発現させることにより、該細胞が細胞表面に切断型IL-38の受容体を発現する、請求項13に記載の方法。
- 前記JNK活性化がAP-1レポーター構築物を用いて求められる、請求項13又は14に記載の方法。
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