JP2019207201A - 細胞取得方法および細胞取得装置 - Google Patents
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Abstract
Description
発明者らは、図3に示した工程をどのような条件下で行えばよいかを検討した。
まず、各検討における共通の手順(1)〜(8)について説明する。以下の(1)〜(8)の工程は、図3のステップS11〜S18に対応する。
がんFFPE試料をミクロトームで薄切し、薄切切片を作成した。薄切切片を1.5mLチューブに採取した。
切片作製工程で得られた薄切り切片に対して、下記表1に示す順序と繰り返し回数で、溶液添加、静置、および上清除去を順次行い、脱パラフィン処理および親水化処理を行った。
98℃に予備加熱した賦活化溶液(1/200イムノセイバー希釈溶液)を添加し、98℃で60分間静置した。室温で10分間除冷したのち、上清を除去した。0.5%BSA/PBSを添加後、1分間静置し上清を除去する工程を2回実施した。
破砕処理用の容器に試料を移送し、0.5%BSA/PBSを4mL添加した。氷冷しながら所定の回転速度で所定の時間、破砕装置の破砕部材により細胞の分散を行った。
破砕部材と容器を破砕装置から取り出し、2000gで3分間遠心分離処理を行った。上清を除去して0.5%BSA/PBSに再懸濁する。セルストレイナーII(40μmメッシュ)と卓上遠心機によるメッシュ処理を実施し、未破砕の残渣を除去した。フィルタ通過物を遠心処理し、上清を除去した。4%BSA/PBSを添加して懸濁し、30分間静置した。
はじめに、細胞内の抗体の染色を行った。上記懸濁試料を96ウェルVボトムプレート(染色用容器)に分注した。遠心分離処理を行い、上清を除去した。続いて、1次抗体処理を行った。1次抗体処理において、1次抗体溶液(抗体濃度は1/100、希釈バッファは10% normal goat serum、4%BSA/PBS)を添加して懸濁し、室温で一時間静置した。遠心分離処理を行い、上清を除去した。0.5%BSA/PBSを添加して懸濁し、遠心分離処理を行い、上清を除去した。このような工程を合計2度実施した。続いて2次抗体処理を行った。2次抗体処理において、2次抗体溶液(抗体濃度は1/1000、希釈バッファは5% normal goat serum、4%BSA/PBS)を添加して懸濁し、室温暗所で30分間静置した。遠心分離処理を行い、上清を除去した。0.5%BSA/PBSを添加して懸濁し、遠心分離処理を行い、上清を除去した。このような工程を合計2度実施した。こうして、細胞内の抗体が染色された。
フローサイトメトリー法に基づいて細胞から生じた光を光検出器またはカメラで受光し、光検出器の検出信号に基づく光強度またはカメラの撮像信号に基づく撮像画像を取得した。光検出器による光強度の取得を行う場合には、フローサイトメーターとしてFACverse(BD)を用いた。この場合のフローサイトメーターを、以下「第1フローサイトメーター」と称する。カメラによる撮像画像の取得を行う場合には、フローサイトメーターとしてAmnis ImageStream(Merck)を用いた。この場合のフローサイトメーターを、以下「第2フローサイトメーター」と称する。
測定工程において第1フローサイトメーターを用いた場合には、解析装置としてFlowjo(トミーデジタルバイオロジー)を用いた。測定工程において第2フローサイトメーターを用いた場合には、解析装置としてIDEAS Application version 6.0(Merck)を用いた。
次に、発明者らは、上記共通の手順に対し所定の手順を変更および追加して、条件の検討を行った。
この検討では、2つの異なる乳がんFFPE試料を用いた。上記共通の手順の(4)分散工程において力学的な細胞の分散と酵素的な細胞の分散とをそれぞれ別々に行って、Ki67(Ki−S5、MIB−1)染色およびアイソタイプコントロール(IC、mouse G3A1 IgG)染色を実施し、上記共通の手順の(7)測定工程において第1フローサイトメーターによる光強度の取得を行った。そして、FSC、SSC、DAPIの検出信号に基づいて細胞を抽出し、抽出した細胞の抗体染色に基づく検出信号をヒストグラムにより評価した。力学的分散においては、破砕部材を5000rpmで5分間動作させた。酵素的分散においては、DispaseI+II(GIBCO)溶液を6.4U、4U、1Uとなるように添加した。
次に、発明者らは、力学的分散に用いる装置の検討を行った。この検討において、発明者らは、以下の表2に示すように2種類の破砕装置を用いて力学的分散を行った。
次に、発明者らは、力学的分散条件の検討を行った。この検討において、発明者らは、以下のような処理を行った。
次に、発明者らは、事前の検討により、脱パラフィン処理を経て得られた組織は、破砕部材や容器に対する吸着性が高いことを見いだした。そこで、発明者らは、以下のように容器等への細胞の吸着抑制の検討を行った。この検討において、発明者らは、以下のような処理を行った。
次に、発明者らは、薄切切片の厚みの検討を行った。この検討において、発明者らは、以下のような処理を行った。
次に、発明者らは、実際に第1フローサイトメーターで測定されると推定される推定細胞数を取得し、推定細胞数が診断または検査に必要な細胞数以上であるか否かの検討を行った。この検討において、発明者らは、以下のような処理を行った。
11 破砕部材
11a 第1破砕部材
11b 第2破砕部材
11c 間隙
12 回転駆動部
110 容器
110a、110b 間隙
221、321 刃
400 フローサイトメーター
Claims (19)
- ホルマリン固定パラフィン包埋組織に対して脱パラフィン処理を行って得られた組織から分散された細胞を取得する方法であって、
前記組織を力学的に破砕することにより、前記組織に含まれる前記細胞をフローサイトメーターで測定するために分散させる分散工程を含む、細胞取得方法。 - 前記分散工程において、回転する破砕部材を用いて前記組織を力学的に破砕する、請求項1に記載の細胞取得方法。
- 前記組織が、容器に収容され、
前記分散工程における前記組織の力学的な破砕は、前記容器内で行われる、請求項2に記載の細胞取得方法。 - 前記容器と前記破砕部材との間に間隙が設けられる、請求項3に記載の細胞取得方法。
- 前記破砕部材および前記容器の内面の少なくともいずれか一方が、タンパク質および界面活性剤の少なくともいずれか一方で予め処理されている、請求項3または4に記載の細胞取得方法。
- 前記破砕部材の回転速度が、5000rpm以下である、請求項2ないし5の何れか一項に記載の細胞取得方法。
- 前記破砕部材は、前記組織を力学的に破砕するための刃を備える、請求項2ないし6の何れか一項に記載の細胞取得方法。
- 前記破砕部材が、回転中心から外側の第1破砕部材と、内側の第2破砕部材を含む、請求項2ないし7の何れか一項に記載の細胞取得方法。
- 前記第1破砕部材と前記第2破砕部材との間に間隙が設けられる、請求項8に記載の細胞取得方法。
- 前記破砕部材が、ポリマー樹脂を素材として含む、請求項2ないし9の何れか一項に記載の細胞取得方法。
- 前記破砕部材が、ディスポーザブル部品である、請求項2ないし10の何れか一項に記載の細胞取得方法。
- 前記破砕部材に付着した細胞を、遠心により回収する回収工程をさらに含む、請求項2ないし11の何れか一項に記載の細胞取得方法。
- 前記分散工程により分散された前記細胞の所定部位を染色する染色工程をさらに含む、請求項1ないし12の何れか一項に記載の細胞取得方法。
- 前記分散工程により分散された前記細胞の光学的情報を前記フローサイトメーターにより取得する測定工程をさらに含む、請求項1ないし13の何れか一項に記載の細胞取得方法。
- 前記測定工程で取得された前記細胞の前記光学的情報に基づいて、前記細胞を解析する解析工程をさらに含む、請求項14に記載の細胞取得方法。
- 前記解析工程において、前記細胞の割合を所定の閾値と比較し、前記組織が陽性検体および陰性検体のいずれであるかを判定する、請求項15に記載の細胞取得方法。
- 前記ホルマリン固定パラフィン包埋組織が、薄切された切片である、請求項1ないし16の何れか一項に記載の細胞取得方法。
- 前記切片の厚みが、25μm以上100μm以下である、請求項17に記載の細胞取得方法。
- ホルマリン固定パラフィン包埋組織に対して脱パラフィン処理を行って得られた組織から分散された細胞を取得する細胞取得装置であって、
容器に収容された組織に接触した状態で回転して前記組織を力学的に破砕することにより、前記組織に含まれる前記細胞をフローサイトメーターで測定するために分散させる破砕部材と、
前記破砕部材を回転させる回転駆動部と、を備える、細胞取得装置。
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