JP2019181373A - フィールドフローフラクショネーション装置 - Google Patents
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Abstract
【課題】粒子の拡散係数の違いのみを利用して分離する従来のフィールドフローフラクショネーション装置よりも分離性能の向上したフィールドフローフラクショネーション装置を提供する。【解決手段】フィールドフローフラクショネーション装置は、両端に入口ポートと出口ポートが設けられ、前記入口ポートと前記出口ポートとの間でキャリア流体が流れる空間をなす分離チャネルと、前記分離チャネル内を前記入口ポートから前記出口ポートに向かってキャリア流体が流れるチャネルフローに平行な前記分離チャネルの壁面をなし、前記キャリア流体を透過させて分離対象の粒子を透過させない性質を有する分離膜と、前記半透膜を透過したキャリア流体を外部へ排出する排出ポートと、を少なくとも備えている。前記分離膜は、その表面の少なくとも一部にイオン交換性を有する官能基が修飾されたものである。【選択図】 図１
Description
本発明は、フィールドフローフラクショネーション（Field-Flow）を利用して流体に含まれる微粒子を分離・分取するためのフィールドフローフラクショネーション装置に関する。
溶液中に分散されている１ｎｍ〜５０μｍ程度の広い範囲の粒径の微粒子を分離して検出したり分取したりするための手法として、従来から、いわゆるクロスフロー方式のフィールドフローフラクショネーションが知られている（例えば、特許文献１参照。）。
非対称チャネル構造を採用したクロスフロー方式のフィールドフローフラクショネーション装置は、サンプルを分離するための分離チャネルを有する。分離チャネルを形成する壁面の１つは、ＲＣ（再生セルロース）やＰＥＳ（ポリエーテルスルホン）など細孔のある半透膜となっており、さらにその半透膜の外側にフリットと呼ばれる多孔質の平板が設けられている。この壁面をチャネル内に導入されたキャリア流体が透過することにより、分離チャネルの入口ポートから出口ポートへ流れる順方向の流れ（チャネルフロー）に対して垂直な方向の流れ（クロスフロー）が生じる。以下、分離チャネルにおいてフリットが設けられている壁面側を下側と定義する。
分離チャネルには、チャネルフローに対向する流れ（フォーカスフロー）が必要に応じて形成される。分離チャネルの壁面をなす半透膜から透過したキャリア流体は、分離チャネルの出口ポートとは別の出口ポート（排出ポート）から排出される。フリットからの排出量は、排出ポート側に設けられたＭＦＣ（マスフローコントローラ）により制御される。
サンプルは入口ポートからサンプルインジェクターを介して分離チャネル内に導入される。このとき、分離チャネル内では、入口ポートから供給されるキャリア流体によるチャネルフローと入口ポートとは別の出口ポート側のポートから供給されるキャリア流体による対向流（フォーカスフロー）が形成されており、分離チャネル内に導入されたサンプルはチャネルフローとフォーカスフローとの境界部分に収集される。これをフォーカシングという。
フォーカシングにより、対向流の境界部分に収集されたサンプル粒子は、流体力学的半径の差により拡散係数の差が生じるので、拡散されやすいものほど分離チャネルの上側に集められる。これをリラクゼーションという。その後、フォーカスフローが停止され、分離チャネル内の流れがチャネルフローとクロスフローのみになると、ストークス流れにより、小さいサンプル粒子から順に出口ポートを介して分離チャネルから排出される。分離チャネルの出口ポートには、紫外線吸光度検出器などの検出器が接続されており、例えば紫外線領域（１９０ｎｍ〜２８０ｎｍ）での吸光度が小さいサンプル粒子から順に検出器によって測定されることで、フラクトグラムが得られる。
上述のように、従来のフィールドフローフラクショネーション装置は、粒子の拡散係数の違いを利用してサンプルを分離するものである。しかし、例えば、塩基性のタンパク質（例えば、リゾチーム）と酸性のタンパク質（例えば、牛血清アルブミン（ＢＳＡ））を分離しようとする場合など、粒子の拡散係数の違いだけではうまく分離することができない場合がある。
そこで、本発明は、粒子の拡散係数の違いのみを利用して分離する従来のフィールドフローフラクショネーション装置よりも分離性能の向上したフィールドフローフラクショネーション装置を提供することを目的とするものである。
本発明に係るフィールドフローフラクショネーション装置は、両端に入口ポートと出口ポートが設けられ、前記入口ポートと前記出口ポートとの間でキャリア流体が流れる空間をなす分離チャネルと、前記分離チャネル内を前記入口ポートから前記出口ポートに向かってキャリア流体が流れるチャネルフローに平行な前記分離チャネルの壁面をなし、前記キャリア流体を透過させて分離対象の粒子を透過させない性質を有する分離膜と、前記半透膜を透過したキャリア流体を外部へ排出する排出ポートと、を少なくとも備えている。そして、前記分離膜は、その表面の少なくとも一部にイオン交換性を有する官能基が修飾されたものである。
前記分離膜は、互いに異なるイオン交換性を有し、前記チャネルフローに沿うように並んで配置された複数のイオン交換性領域を有するものであってもよい。そうすれば、分離チャネル内においてサンプル粒子との間で起こさせる相互作用を変更することができ、サンプルに応じた多様な分離を実現することができる。
本発明に係るフィールドフローフラクショネーション装置では、チャネルフローに平行な分離チャネルの壁面をなす分離膜の表面の少なくとも一部にイオン交換性を有する官能基が修飾されているので、粒子の拡散係数の違いだけでなく、粒子と分離膜との間のイオン的相互作用によって粒子を分離することができる。これにより、塩基性タンパク質と酸性タンパク質など、これまで完全な分離が困難であった粒子も分離することができるようになり、分離性能が向上する。
以下、フィールドフローフラクショネーション装置の一実施例について、図面を用いて説明する。
まず、図１を用いてこの実施例のフィールドフローフラクショネーション装置の構成について説明する。
この実施例のフィールドフローフラクショネーション装置は、サンプル粒子を分離するための分離チャネル２を備え、その分離チャネル２に入口ポート４、出口ポート６、及び中間ポート８が通じている。入口ポート４は分離チャネル２の一端に通じており、出口ポート６は分離チャネル２の他端に通じている。中間ポート８は入口ポート４と出口ポート６の間に位置している。図示は省略されているが、分離チャネル２は、例えば複数の基板が積層されて構成されるブロックの内部に形成されており、各ポート４、６及び８はそのブロックに設けられた孔によって構成されている。
分離チャネル２は略菱形の形状を有する。分離チャネル２の一端部と他端部は角部となっており、その平面形状における幅寸法は、一端側から他端側へ行くにしたがって一旦は広くなり、途中から他端へ行くにしたがって幅が狭くなっていき、他端部において収束している。
入口ポート４には、容器１８内に貯留されたキャリア流体を送液する送液ポンプ１４が、サンプルインジェクション１２を介して接続されている。分離対象であるサンプル粒子はサンプルインジェクション１２を通じて注入され、送液ポンプ１４によって送液されるキャリア流体とともに入口ポート４から分離チャネル２内に導入される。出口ポート６は検出器２０に通じている。
分離チャネル２内において、入口ポート４から出口ポート６へ向かう流体の流れを「チャネルフロー」と称する。このチャネルフローに平行な分離チャネル２の一壁面（図において下側の壁面）は、キャリア流体を透過させるがサンプル粒子を透過させない性質を有する分離膜１０によって構成されている。分離チャネル２に導入されたキャリア流体の一部は分離膜１０を透過するため、分離チャネル２内には、図において矢印で示されている方向、すなわちチャネルフローに直交する方向の流れが生じる。この流れを「クロスフロー」と称する。なお、分離膜１０の詳細については後述する。
分離膜１０を透過したキャリア流体は、分離チャネル２の下方に設けられた廃液チャンバ２２を流れ、廃液ポート２４を通じて外部へ排出される。廃液ポート２４に接続された流路上にマスフローコントローラ（ＭＦＣ）２６が設けられており、廃液チャンバ２２から排出されるキャリア流体の流量がＭＦＣ２６によって検出される。
中間ポート８には、容器１８からキャリア流体を送液する送液ポンプ１６が接続されている。送液ポンプ１６は、入口ポート４へキャリア流体を供給する送液ポンプ１４とは独立して設けられており、必要に応じて中間ポート８から分離チャネル２内にキャリア流体を供給する。入口ポート４と中間ポート８から同時に分離チャネル２内にキャリア流体が供給されると、分離チャネル２内ではキャリア流体による対向した流れが生じる。この流れを「フォーカスフロー」と称する。
なお、この実施例では、入口ポート４と中間ポート８にそれぞれ別々の送液ポンプ１４、１６が接続されているが、これらのポートにロータリーバルブ等の切替機構を介して共通の送液ポンプを接続し、その切替機構によって送液ポンプが、入口ポート４のみに接続された状態とサンプルポート４及び中間ポート８の両方に接続された状態との間で切り替えられるように構成されていてもよい。
また、必ずしも中間ポート８が設けられている必要はなく、分離チャネル２内でフォーカスフローを形成する際に、必要に応じて出口ポート６からキャリア流体が供給されるように構成されていてもよい。
ここで、分離膜１０について説明する。
分離膜１０は、例えば再生セルロース（ＲＣ）やポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）など、複数の細孔を有する半透膜の表面に、陽イオン交換性又は陰イオン交換性を有する官能基が修飾されたものである。
分離膜１０は、例えば再生セルロース（ＲＣ）やポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）など、複数の細孔を有する半透膜の表面に、陽イオン交換性又は陰イオン交換性を有する官能基が修飾されたものである。
陰イオン交換性を有する分離膜１０としては、例えばＲＣ膜の表面をカチオン化剤によって修飾したものが挙げられる。カチオン化剤としては、例えばグリシジルトリメチルアンモニウムクロライド（２，３−エポキシプロピルトリメチルアンモニウムクロライド）を主成分とするＳＹ−ＧＴＡ８０（坂本薬品工業株式会社の製品）が挙げられる。このほか、陰イオン交換性を有する分離膜１０としては、ＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）セルロースなどが挙げられる。
上記のような陰イオン交換性を有する分離膜１０を用いることで、分離膜１０とサンプル粒子との間のイオン的相互作用によって、本来は分離膜１０によって強く保持される塩基性タンパク質の保持時間が短くなり、分離性能が向上する。
また、陽イオン交換性を有する分離膜１０としては、例えば表面をスルホン化したＰＥＳ膜を挙げることができる。このほか、陽イオン交換性を有する分離膜１０としては、表面にカルボキシメチル基が架橋されたＲＣ膜などが挙げられる。
上記のような陽イオン交換性を有する分離膜１０を用いることで、分離膜１０とサンプル粒子との間のイオン的相互作用によって、本来は分離膜１０によってほとんど保持されない塩基性タンパク質の保持時間が長くなり、分離性能が向上する。
この実施例のフィールドフローフラクショネーション装置によるサンプルの分離動作について説明する。
サンプル粒子は、キャリア流体とともに入口ポート４を介して分離チャネル２内に導入される。このとき、分離チャネル２内には中間ポート８からもキャリア流体が供給されてフォーカスフロー（対向流）が生じている。このフォーカスフローにより、入口ポート４から導入されたサンプル粒子は、入口ポート４からのキャリア流体の流れと中間ポート８からのキャリア流体の流れとの境界部分に収集（フォーカシング）される。分離チャネル内では、分離膜１０を透過するキャリア流体の流れによるクロスフローも生じており、入口ポート４からのキャリア流体の流れと中間ポート８からのキャリア流体の流れとの境界部分においてサンプル粒子のリラクゼーションが行われる。
フォーカシング及びリラクゼーションが終了した後、送液ポンプ１６は停止され、フォーカスフローはなくなる。分離チャネル２内では、入口ポート４から出口ポート６へ流れるキャリア流体によるチャネルフローと、分離膜１０を透過するキャリア流体によるクロスフローが生じている。
この実施例では、フォーカシング及びリラクゼーションが終了した後の送液ポンプ１４の動作速度は一定に制御され、ＭＦＣ２６によって排出ポート２４から排出されるキャリア流体の流量、すなわちクロスフローの流量が制御される。これにより、出口ポート６から流出するキャリア流体の流量が一定になる。なお、排出ポート２４からの流路上に、ＭＦＣ２６に代えて流量計を設け、その流量計の検出流量に基づいて、出口ポート６から流出するキャリア流体の流量が一定になるように、送液ポンプ１６の動作が制御されるように構成されていてもよい。
この実施例では、フォーカシング及びリラクゼーションが終了した後の送液ポンプ１４の動作速度は一定に制御され、ＭＦＣ２６によって排出ポート２４から排出されるキャリア流体の流量、すなわちクロスフローの流量が制御される。これにより、出口ポート６から流出するキャリア流体の流量が一定になる。なお、排出ポート２４からの流路上に、ＭＦＣ２６に代えて流量計を設け、その流量計の検出流量に基づいて、出口ポート６から流出するキャリア流体の流量が一定になるように、送液ポンプ１６の動作が制御されるように構成されていてもよい。
フォーカシング及びリラクゼーションによって所定位置に収集されたサンプル粒子は、分離膜１０との間におけるイオン的相互作用による影響とクロスフローによる影響を受けながら出口ポート６側へ流れ、それらの影響が少ない粒子から順に検出器２０に導入され、検出される。
図２はフィールドフローフラクショネーション装置によるサンプルとしてＢＳＡとリゾチームの混合試料のフラクトグラムであり、（Ａ）は比較例、（Ｂ）は実施例である。（Ａ）の比較例では、分離膜１０に代えてイオン交換性をもたないＲＣ膜を用いており、（Ｂ）の実施例では、分離膜１０として陽イオン交換膜（ＳＰＥＳ：スルホン化ポリエーテルスルホン膜）を用いている。
図２（Ａ）に示されているように、イオン交換性をもたないＲＣ膜を用いた場合には、ＢＳＡとリゾチームの保持時間が接近しており、これらのタンパク質を完全に分離することが難しい。これに対し、同図（Ｂ）に示されているように、分離膜１０として陽イオン交換膜を用いることで、酸性のタンパク質であるＢＳＡの保持時間が短くなり、塩基性のタンパク質であるリゾチームの保持時間が長くなった結果、これらのタンパク質を完全に分離することができるようになった。
したがって、分離膜１０にイオン交換性をもたせることによって、拡散係数の違いのみでは十分に分離することができないような粒子であっても、イオン的相互作用を利用して分離することが可能になり、フィールドフローフラクショネーション装置の分離性能が向上することがわかった。
なお、以上において説明した実施例では、分離膜全体の表面が同一のイオン交換性官能基によって修飾されているが、図３に示されているように、分離膜をキャリア流体の流れ方向に沿って複数の領域に分割し、それらの領域に異なるイオン交換性をもつ官能基を修飾させていてもよい。
２ 分離チャネル
４ 入口ポート
６ 出口ポート
８ 中間ポート
１０，１０ａ 分離膜
１２ サンプルインジェクション
１４，１６ 送液ポンプ
１８ キャリア流体用の容器
２０ 検出器
２２ 廃液チャンバ
２４ 排出ポート
２６ マスフローコントローラ
２８ 上流側領域
３０ 下流側領域
４ 入口ポート
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１０，１０ａ 分離膜
１２ サンプルインジェクション
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２４ 排出ポート
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３０ 下流側領域
Claims (2)
- 両端に入口ポートと出口ポートが設けられ、前記入口ポートと前記出口ポートとの間でキャリア流体が流れる空間をなす分離チャネルと、
前記分離チャネル内を前記入口ポートから前記出口ポートに向かってキャリア流体が流れるチャネルフローに平行な前記分離チャネルの壁面をなし、前記キャリア流体を透過させて分離対象の粒子を透過させない性質を有する分離膜と、
前記分離膜を透過したキャリア流体を外部へ排出する排出ポートと、を少なくとも備え、
前記分離膜は、その表面の少なくとも一部にイオン交換性を有する官能基が修飾されたものであるフィールドフローフラクショネーション装置。 - 前記分離膜は、互いに異なるイオン交換性を有し、前記チャネルフローに沿うように並んで配置された複数のイオン交換性領域を有する請求項１に記載のフィールドフローフラクショネーション装置。
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