JP2019178898A - フローサイトメーター及び粒子検出方法 - Google Patents

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Abstract

【課題】サンプル粒子の浪費を抑制可能なフローサイトメーターを提供する。【解決手段】フローセル１０と、サンプル粒子を含むサンプル液とは異なる液体をフローセル１０に送液する液体送液ユニット３０と、当該液体がフローセル１０に送液された後、サンプル液をフローセル１０に送液するサンプル液送液ユニット２０と、フローセル１０を流れるサンプル粒子を検出するための検出器と、を備えるフローサイトメーター。【選択図】図１

Description

本発明は、測定技術に関し、フローサイトメーター及び粒子検出方法に関する。
細胞及び微生物等の生物サンプルの解析に、フローサイトメーターが広く用いられている。フローサイトメーターでは、透明なフローセル内部を流れる生物サンプルが光学的に解析される。フローセル内部においては、生物サンプルを含むサンプル液の流れと、シース液の流れとが層流をなしており、サンプル液の流れは、フローセルの内壁に接するシース液の流れの中にある。フローセルの孔径、並びにサンプル液及びシース液の供給量を調整することにより、フローセル内部に生物サンプルを一つずつ流すことが可能となる。そのため、フローサイトメーターによれば、生物サンプル集団を構成する生物サンプルの一つ一つを光学的に解析することが可能である。
フローセル内部を流れる生物サンプルを光学的に正確に解析するためには、フローセル内部を流れる生物サンプルの流速を、光学的な解析装置の能力に合わせて適切に設定することが望ましい。例えば特許文献１は、フローセル内部の粒子に光を照射し、粒子で生じた散乱光や蛍光を光学格子で変調し、変調光の検出周期に基づいて、フローセル内部を流れる粒子の流速を算出することを開示している。さらに、特許文献１は、算出された粒子の速度に、電荷結合素子（ＣＣＤ）アレイにおける電荷転送タイミングを同期させて粒子を撮像する、ＴＤＩ（Ｔｉｍｅ Ｄｅｌａｙ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）撮像方法を開示している。
米国特許第６５０７３９１号明細書
フローサイトメーターで生物サンプルの解析をする際には、フローセル内部を流れるサンプル粒子の流速が安定した状態でサンプル粒子の光学的な解析を開始することが望ましい。
しかしながら、流速が安定するまで流されたサンプル粒子は解析されることなく無駄になってしまう。サンプル粒子には、例えば血中循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）のように、サンプル液中にわずかにしか含まれないものもあり、サンプル液に含まれるサンプル粒子を浪費することなく解析可能な技術が要望されている。そこで、本発明は、サンプル粒子の浪費を抑制可能なフローサイトメーター及び粒子検出方法を提供することを目的の一つとする。
本発明の態様によれば、フローセル１０と、サンプル粒子を含むサンプル液とは異なる液体をフローセル１０に送液する液体送液ユニット３０と、サンプル液とは異なる液体がフローセル１０に送液された後、サンプル液をフローセル１０に送液するサンプル液送液ユニット２０と、フローセル１０を流れるサンプル粒子を検出するための検出器２０１と、を備える、フローサイトメーターが提供される。
上記のフローサイトメーターによれば、サンプル液とは異なる液体をフローセル１０に送液中にフローセル１０への送液駆動を安定させることが可能となり、その後、フローセル１０にサンプル液が送液される。そのため、フローセル１０内の流速が安定するまでにサンプル液が流されて浪費されることを抑制できる。
上記のフローサイトメーターにおいて、液体送液ユニット３０及びサンプル液送液ユニット２０が、共通の流路を介して、サンプル液とは異なる液体及びサンプル液をそれぞれフローセル１０に送液してもよい。液体送液ユニット３０が、サンプル粒子とは異なる参照粒子を含む参照液をサンプル液とは異なる液体としてフローセルに送液する参照液送液ユニットであってもよい。サンプル液送液ユニット２０がサンプル液をフローセル１０に送液開始後も、参照液送液ユニットが参照液をフローセル１０に送液してもよい。サンプル液送液ユニット２０がサンプル液をフローセル１０に送液開始後、フローセル１０に送液されるサンプル液の流量と参照液の流量の合計流量が一定になるよう、サンプル液送液ユニット２０がサンプル液の送液量を増加させ、参照液送液ユニットが参照液の送液量を減少させてもよい。
上記のフローサイトメーターが、フローセル１０を流れる液体の流速に関する情報を取得するための流速測定器２００をさらに備え、流速に関する情報が基準を満たす場合、サンプル液送液ユニット２０がサンプル液をフローセル１０に送液してもよい。
上記のフローサイトメーターによれば、流速に関する情報が基準を満たす場合にサンプル液がフローセル１０に送液されるため、流速に関する情報が基準を満たすまでにサンプル液が浪費されることがない。
上記のフローサイトメーターが、流速に関する情報が基準を満たすまで、液体ユニットがサンプル液とは異なる液体をフローセル１０に送液してもよい。
上記のフローサイトメーターによれば、流速に関する情報が基準を満たすまでサンプル液とは異なる液体がフローセル１０に送液されるため、流速に関する情報が基準を満たすまでにサンプル液が浪費されることがない。
上記のフローサイトメーターにおいて、流速に関する情報が、流速の値及び流速のばらつきの値の少なくとも一方であってもよい。流速に関する情報が流速の値であり、流速の値が所定の範囲内である場合、サンプル液送液ユニット２０がサンプル液をフローセル１０に送液してもよい。流速に関する情報が流速のばらつきの値であり、流速のばらつきの値が所定の値以下である場合、サンプル液送液ユニット２０がサンプル液をフローセル１０に送液してもよい。流速のばらつきが、流速の変動係数であってもよい。
上記のフローサイトメーターによれば、流速の値が所定の範囲内又は流速のばらつきの値が所定の値以下である場合にサンプル液がフローセル１０に送液されるため、サンプル液の流速が安定している状態でサンプル粒子を測定できる。
上記のフローサイトメーターが、流速に関する情報が基準を満たす場合、サンプル液送液ユニット２０にサンプル液をフローセル１０に送液させ、流速に関する情報が基準を満たさない場合、サンプル液送液ユニット２０にサンプル液をフローセル１０に送液させない制御ユニット３０２をさらに備えていてもよい。
上記のフローサイトメーターによれば、サンプル液が浪費されないよう、サンプル液送液ユニット２０を制御することが可能である。
上記のフローサイトメーターが、流速に関する情報が基準を満たさない場合、流速に関する情報が基準を満たさないことを示す情報を出力する出力装置４０１をさらに備えていてもよい。流速に関する情報が基準を満たさない場合、出力装置４０１が、サンプル液をフローセル１０に送液することを中止するか問い合わせるための情報を出力してもよい。
上記のフローサイトメーターによれば、オペレーターが、フローサイトメーターの状態を把握し、フローサイトメーターによる解析の進行の可否を判断することが可能である。
上記のフローサイトメーターにおいて、液体送液ユニット３０が、第１の流量でサンプル液とは異なる液体をフローセル１０に送液し、次いで、第１の流量より小さい第２の流量でサンプル液とは異なる液体をフローセル１０に送液してもよい。
たとえばシースフロー式のフローサイトメーターにおいては、フローセルにシース液を流し始めた後に粒子をフローセルに供給すると、シース液の供給に起因してフローセル側が高圧な状態となっているため、フローセルに供給した粒子が逆流するおそれがある。このような逆流を防ぐため、シース液をフローセルに供給した後、最初に大流量の液体を流すプレドライブという工程を実施することが好ましい。ここで、プレドライブで大流量のサンプル液を流した場合には、貴重なサンプル液の浪費となる。これに対し、上記のフローサイトメーターによれば、サンプル液とは異なる液体を用いて第１の流量でプレドライブが実施されるため、サンプル液の浪費を抑制することが可能である。
上記のフローサイトメーターが、サンプル液送液ユニット２０に接続する、サンプル液が流れるサンプル液流路５１と、サンプル液流路５１と液体送液ユニット３０を接続する、サンプル液とは異なる液体が流れる液体流路５２と、サンプル液流路５１とフローセル１０を接続する、サンプル液とは異なる液体及びサンプル液が流れる供給流路５３と、をさらに備え、サンプル液流路５１の開口端５５から、サンプル液がサンプル液流路５１内部に供給されてもよい。サンプル液送液ユニット２０がサンプル液をサンプル液流路５１と液体流路５２の接続点５６よりサンプル液送液ユニット２０側まで吸引した後、液体送液ユニット３０がサンプル液とは異なる液体をフローセル１０に送液してもよい。
上記のフローサイトメーターによれば、サンプル液を内部に保持した状態で、サンプル液とは異なる液体をフローセル１０に送液することが可能である。
上記のフローサイトメーターにおいて、サンプル液送液ユニット２０が、サンプル液流路５１内部に内部液を充填した状態で空気を吸引し、空気に続いてサンプル液を吸引してもよい。
たとえばシースフロー式のフローサイトメーターにおいては、フローセルに高圧でシース液を流し始めると、サンプル液流路において内部液とサンプル液の間に存在する空気の圧力が変動する。そのため、シース液を送液した後、サンプル液とは異なる液体を送液せずにサンプル液の送液を開始すると、サンプル液流路内部の空気の圧力変動によりサンプル液の流速が不安定になり、サンプル液に含まれるサンプル粒子の検出を正確に行うことが困難になる。これに対し、上記のフローサイトメーターによれば、サンプル液を送液する前にサンプル液とは異なる液体が送液されるため、サンプル液とは異なる液体を送液中にサンプル液流路５１内部の空気の圧力変動が低減される。したがって、サンプル液の送液を開始する際に、サンプル液の流速が空気の圧力変動の影響を受けにくくなる。
上記のフローサイトメーターにおいて、流速測定器２００が、フローセル１０を流れる粒子の光学特性に基づき、流速を測定してもよい。上記のフローサイトメーターにおいて、流速測定器２００が、フローセル１０に光を照射する光源１２１と、フローセル１０内部の光を照射された粒子で生じた反応光を検出する反応光検出部１６１と、を備えていてもよい。流速測定器２００が、フローセル１０と反応光検出部１６１の間に配置された、反応光を変調させる光学格子１５１をさらに備えていてもよい。反応光が散乱光であってもよい。
上記のフローサイトメーターによれば、フローセル１０内部を流れる粒子の流速を正確に測定可能である。
上記のフローサイトメーターにおいて、サンプル粒子が生物サンプルであり、参照粒子が非生物粒子であってもよい。サンプル粒子は血中循環腫瘍細胞であってもよい。
上記のフローサイトメーターによれば、非生物粒子を用いてフローセル１０内部の流速を安定化させ、生物サンプルの浪費を抑制することが可能である。また、希少な血中循環腫瘍細胞の浪費を抑制することが可能となる。
上記のフローサイトメーターにおいて、検出器２０１がサンプル粒子を撮像する粒子撮像部であってもよい。
上記のフローサイトメーターによれば、フローセル１０を安定した速度で流れる粒子を撮像することが可能である。
また、本発明の態様によれば、サンプル粒子を含むサンプル液とは異なる液体をフローセル１０に送液することと、サンプル液とは異なる液体をフローセル１０に送液した後、サンプル液をフローセル１０に送液することと、フローセル１０を流れるサンプル粒子を検出することと、を含む、粒子検出方法が提供される。
上記の粒子検出方法によれば、サンプル液とは異なる液体をフローセル１０に送液中にフローセル１０への送液駆動を安定させることが可能となり、その後、フローセル１０にサンプル液が送液される。そのため、フローセル１０内の流速が安定するまでにサンプル液が流されて浪費されることを抑制できる。
上記の粒子検出方法において、サンプル液とは異なる液体は参照粒子を含む参照液であり、フローセル１０を流れる参照液の流速に関する情報を取得することをさらに含み、流速に関する情報が基準を満たす場合に、サンプル液をフローセル１０に送液してもよい。
上記の粒子検出方法によれば、流速に関する情報が基準を満たす場合にサンプル液がフローセル１０に送液されるため、流速に関する情報が基準を満たすまでにサンプル液が浪費されることがない。
本発明によれば、サンプル粒子の浪費を抑制可能なフローサイトメーター及び粒子検出方法を提供可能である。
実施形態に係るフローサイトメーターの流路等を示す模式図である。 実施形態に係るフローサイトメーターの光学系等を示す模式図である。 実施形態に係るフローサイトメーターの流路等を示す模式図である。 実施形態に係るフローサイトメーターの流路等を示す模式図である。 実施形態に係るフローサイトメーターの流路等を示す模式図である。 実施形態に係るフローサイトメーターの流路等を示す模式図である。 実施形態に係る光学格子を示す模式図である。 実施形態に係るフローサイトメーターの流路等を示す模式図である。 実施形態に係るフローサイトメーターにおける参照液とサンプル液の流量の時間変化を示す模式的なグラフである。 実施形態に係る粒子検出方法を示すフローチャートである。 実施形態に係る粒子検出方法を示すフローチャートの続きである。
以下、本発明の実施形態について図面を参照して説明する。以下の図面の記載において、同一又は類似の部分には同一又は類似の符号で表している。ただし、図面は模式的なものである。したがって、具体的な寸法等は以下の説明を照らし合わせて判断するべきものである。また、図面相互間においても互いの寸法の関係や比率が異なる部分が含まれていることはもちろんである。
以下に示す実施形態は、血液検体中に含まれる血中循環腫瘍細胞（ＣＴＣ：Circulating Tumor Cell）を撮像するための装置に本発明を適用したものである。進行したがん細胞は血液やリンパ液の流れに乗って循環しており、離れた臓器に転移をする。血液中に循環しているＣＴＣは極微量であり、血液１０ｍＬ中に数個から数十個程度しか存在しない。血液中のＣＴＣの検出は、乳がん、前立腺がん、大腸がん等の転移性のがん患者において、治療効果の判定及び予後予測に有用と認められている。
実施形態に係るフローサイトメーターは、図１に示すように、フローセル１０と、サンプル粒子を含むサンプル液とは異なる液体をフローセル１０に送液する液体送液ユニット３０と、サンプル液とは異なる液体がフローセル１０に送液された後、サンプル液をフローセル１０に送液するサンプル液送液ユニット２０と、フローセル１０を流れるサンプル粒子を検出するための図２に示す検出器２０１と、を備える。
サンプル粒子は、フローサイトメーターでその特性が解析される粒子であり、本実施形態ではＣＴＣである。ＣＴＣを含むサンプル液は、血液サンプルである。血液サンプルは、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子が組み込まれ、がん細胞内で特異的に増殖するウイルスで処理される。血液サンプルにＣＴＣが含まれていると、ＣＴＣはウイルスに感染し、ＣＴＣ内で蛍光タンパク質が発現する。ＣＴＣは、抗原特異的な蛍光プローブで標識されていてもよい。また、１７番染色体に結合するＣｈ１７プローブ及びＨｅｒ２遺伝子に結合するＨｅｒ２プローブを含む試薬でＣＴＣを染色してもよい。
サンプル液と異なる液体は、例えば、サンプル粒子とは異なる参照粒子を含む参照液である。参照粒子は、フローセル１０内部を流れる粒子の流速を監視するための非生物粒子であり、例えば、ラテックス等の重合体や、無機物等からなる。参照粒子は、例えば、光を照射された場合に、サンプル粒子よりも強い散乱光を生じさせる光学特性を有する。参照粒子を含む参照液の溶媒は、例えば、緩衝液である。
実施形態に係るフローサイトメーターは、フローセル１０内部を流れる少なくとも参照液の流速に関する情報を取得するための図２に示す流速測定器２００をさらに備えていてもよい。実施形態に係るフローサイトメーターにおいて、流速に関する情報が基準を満たすまで、図１に示す液体送液ユニット３０が参照液をフローセル１０に送液する。流速に関する情報が基準を満たすと、サンプル液送液ユニット２０がサンプル液のフローセル１０への送液を開始する。なお、流速に関する情報が基準を満たした後も、液体送液ユニット３０は参照液をフローセル１０に送液してもよい。液体送液ユニット３０が参照液をフローセル１０に送液する前に、サンプル液送液ユニット２０がサンプル液を浪費しない程度にサンプル液をフローセル１０への送液することは排除されない。また、流速が安定することができる時間を予め取得し、当該時間が経過した後、サンプル液送液ユニット２０がサンプル液のフローセル１０への送液を開始してもよい。この場合は、流速を測定しなくてもよい。さらに、実施形態に係るフローサイトメーターは、フローセル１０にシース液を送液するシース液送液ユニット４０を備える。
実施形態に係るフローサイトメーターは、サンプル液送液ユニット２０に接続する、サンプル液が流れるサンプル液流路５１と、サンプル液流路５１と液体送液ユニット３０を接続する、参照液が流れる液体流路５２と、サンプル液流路５１とフローセル１０を接続する、参照液及びサンプル液が流れる供給流路５３と、をさらに備える。液体流路５２及び供給流路５３は、サンプル液流路５１に同じ接続点５６で接続している。あるいは、液体流路５２及び供給流路５３は、サンプル液流路５１に異なる接続点で接続していてもよい。また、実施形態に係るフローサイトメーターは、シース液送液ユニット４０とフローセル１０を接続する、シース液が流れるシース液流路５４をさらに備える。
サンプル液送液ユニット２０は、例えば、シリンジ２１、シリンジ２１に挿入されたプランジャー及びピストン等の作動子２２、及び作動子２２を移動させるモーター等の駆動装置２３を備える。なお、サンプル液送液ユニット２０は、ダイヤフラムポンプであってもよいし、コンプレッサー等の圧力源に接続された電空変換器で発せられる気圧を用いて、サンプル液を送液してもよい。
図３に示すように、サンプル粒子の検出開始前においては、サンプル液流路５１及び供給流路５３には、緩衝液等の内部液２５１が充填されており、シース液流路５４には、シース液２５４が充填されている。シース液２５４は、例えば緩衝液であり、内部液２５１と同じ組成を有する。液体流路５２には、参照液２５２が充填されている。サンプル液送液ユニット２０の駆動装置２３が作動子２２を引くと、図４に示すように、サンプル液流路５１の開口端５５から、空気が吸引される。その後、サンプル液２５３が収容されたサンプル容器内にサンプル液流路５１の開口端５５が挿入され、図５に示すように、サンプル液送液ユニット２０は、サンプル液２５３と内部液２５１が混合してサンプル液２５３の濃度が希釈されないよう、サンプル液流路５１において、サンプル液２５３と内部液２５１の間に空気層を挟むようにしながら、サンプル液２５３をサンプル容器から吸引する。
サンプル液送液ユニット２０は、例えば、サンプル液流路５１内部において、サンプル液流路５１と液体流路５２及び供給流路５３の接続点５６よりもサンプル液送液ユニット２０側に、サンプル液を吸引する。なお、供給流路５３に空気が入ることを防止するために、サンプル液の一部が、接続点５６よりも開口端５５側に残ってもよい。液体流路５２及び供給流路５３が、サンプル液流路５１に異なる接続点で接続している場合は、サンプル液送液ユニット２０は、サンプル液流路５１内部において、サンプル液送液ユニット２０に近い側の接続点よりもサンプル液送液ユニット２０側に、サンプル液を吸引する。なお、サンプル液の一部が、接続点よりも開口端５５側に残ってもよい。
サンプル液流路５１には弁６０が設けられている。液体流路５２及び供給流路５３がサンプル液流路５１に同じ接続点５６で接続している場合、弁６０は、接続点５６近傍であって、接続点５６よりもサンプル液流路５１の開口端５５側に設けられる。液体流路５２及び供給流路５３が、サンプル液流路５１に異なる接続点で接続している場合、弁６０は、開口端５５側の接続点近傍であって、当該接続点よりも開口端５５側に設けられる。弁６０は、開口端５５からサンプル液をサンプル液流路５１内部に吸引する際には開かれている。弁６０は、サンプル液流路５１において、サンプル液が接続点５６あるいはサンプル液送液ユニット２０に近い側の接続点よりもサンプル液送液ユニット２０側に吸引された後、閉じられる。
弁６０が閉じられた後、シース液送液ユニット４０がシース液をフローセル１０に送液し、図６に示すように、液体送液ユニット３０が参照液をフローセル１０に送液する。液体送液ユニット３０は、シース液送液ユニット４０がシース液のフローセル１０への送液を開始した後に、参照液のフローセル１０への送液を開始する。液体送液ユニット３０は、シース液送液ユニット４０がシース液のフローセル１０への送液を開始するのと同時に、参照液のフローセル１０への送液を開始してもよい。
液体送液ユニット３０は、例えば、シリンジ３１、シリンジ３１に挿入された作動子３２、及び作動子３２を移動させるモーター等の駆動装置３３を備える。駆動装置３３が作動子３２を押すと、液体流路５２及び供給流路５３を介して、参照液がフローセル１０に送液される。なお、液体送液ユニット３０は、ダイヤフラムポンプであってもよいし、コンプレッサー等の圧力原に接続された電空変換器で発せられる気圧を用いて、参照液を送液してもよい。シース液送液ユニット４０は、例えば、シリンジ４１、シリンジ４１に挿入された作動子４２、及び作動子４２を移動させるモーター等の駆動装置４３を備える。駆動装置４３が作動子４２を押すと、シース液流路５４を介して、シース液がフローセル１０に送液される。なお、シース液送液ユニット４０は、ダイヤフラムポンプであってもよいし、コンプレッサー等の圧力原に接続された電空変換器で発せられる気圧を用いて、シース液をフローセル１０に送液してもよい。
フローセル１０は、石英等の透明材料からなる。フローセル１０内部において、参照液の流れと、シース液の流れとは、層流を形成し、シース液の流れに取り囲まれるようにして参照液が流れる。シース液送液ユニット４０は、液体送液ユニット３０にもシース液を送液し、フローセル１０内部において、シース液の圧力と参照液の圧力とを平衡にしてもよい。
図２に示すように、流速測定器２００は、フローセル１０内部を流れる参照粒子の光学特性に基づいて、参照粒子の流速を測定可能な光学系を備える。なお、図２において、フローセル１０は断面で示されている。フローセル１０内部を流れる参照粒子の流速を測定可能な光学系は、フローセル１０に光を照射する光源１２１を備える。光源１２１としては、レーザー及び発光ダイオード等が使用可能である。光源１２１から照射された光は、例えば、レンズ１３１によって集光され、ダイクロイックミラー１４１、１４２を透過してフローセル１０に集光される。フローセル１０内部を流れる参照粒子が、光が照射されると反応光としてミー散乱光を生じさせる光学特性を有する場合、散乱光が粒子で生じる。光源１２１が発した光の波長と同じ波長を有する散乱光は、例えばレンズ１３５で集光され、ダイクロイックミラー１４３で反射される。
ダイクロイックミラー１４３で反射される散乱光の光路には、光学格子１５１が配置されている。光学格子１５１は、図７に示すように、交互に配置された、複数の透明部分１５２ａ、１５２ｂ、１５２ｃ・・・と、複数の不透明部分１５３ａ、１５２３、１５３ｃ・・・とを備える。複数の透明部分１５２ａ・・・と、複数の不透明部分１５３ａ・・・とのそれぞれは、例えば矩形状である。光学格子１５１のピッチは一定であり、複数の透明部分１５２ａ・・・と、複数の不透明部分１５３ａ・・・とのそれぞれの幅は、例えば、図２に示すフローセル１０内部を流れる参照粒子の大きさに近似する。
フローセル１０内部で光源１２１が発した光を参照粒子が横切ると、参照粒子で生じた散乱光は、図７に示す光学格子１５１の複数の透明部分１５２ａ・・・と、複数の不透明部分１５３ａ・・・とを交互に横切る。そのため、散乱光の強度は、光学格子１５１によって変調される。光学格子１５１で生じた散乱光の変調光は、図２に示すレンズ１３６で集光され、反応光検出部１６１で検出される。反応光検出部１６１としては、光電子増倍管及びフォトダイオード等の光電変換素子を備える装置が使用可能である。
反応光検出部１６１が変調光を検出する周期は、フローセル１０内部を流れる参照粒子の流速に比例する。反応光検出部１６１は、図１に示す流速情報算出ユニット３０１に接続されている。流速情報算出ユニット３０１は、コンピューター３００に含まれる。流速情報算出ユニット３０１は、コンピューター３００において、メモリに格納されたプログラムをプロセッサが実行することにより実現される。なお、流速情報算出ユニット３０１は、例えば、ＰＬＣ（Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ Ｌｏｇｉｃ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ）等のハードウェアにより実現されてもよい。流速情報算出ユニット３０１は、例えば、高速フーリエ変換（ＦＦＴ）によって周期ｆを特定し、下記（１）式に基づいて、フローセル１０内部を流れる参照粒子の流速ｖの値を流速に関する情報として算出する。
ｖ＝ｆｐ （１）
（１）式において、ｐは光学格子１５１のピッチを表す。流速の値は、平均値であってもよい。平均値は、移動平均により算出されてもよい。また、流速情報算出ユニット３０１は、変動係数（ＣＶ）等の流速のばらつきの値を流速に関する情報として算出してもよい。あるいは、流速情報算出ユニット３０１は、粒子の流速ｖの値と流速のばらつきの値の両方を、流速に関する情報として算出してもよい。
なお、流速測定器の構成は、上記に限定されない。例えば、フローセル１０に照射された光のフローセル１０内部における既知のビーム径をＤB、参照粒子の既知の直径をＤS、参照粒子がビーム径を横切った時に生じる散乱光のパルス幅をＰWとして、下記（２）式に基づいて、フローセル１０内部を流れる粒子の流速ｖを算出してもよい。
ｖ＝（ＤB＋ＤS）／ＰW （２）
この場合、光学格子１５１は不要であり、流速情報算出ユニット３０１は、反応光検出部１６１が検出した反応光のパルス幅に基づいて、流速ｖを算出してもよい。
あるいは、流速測定器は、少なくとも２つの粒子検出器を備えていてもよい。この場合、流速情報算出ユニット３０１は、２つの粒子検出器の間の既知の距離と、上流側の粒子検出器で参照粒子が検出されてから下流側の粒子検出器で参照粒子が検出されるまでの時間に基づいて、粒子の流速ｖを算出してもよい。またあるいは、流速測定器は、フローセル１０の出口側に接続された流路に設けられた流量計を備えていてもよい。この場合、流速情報算出ユニット３０１は、流量計が計測した流量と、フローセル１０の口径と流路の口径の差等に基づき、粒子の流速ｖを算出してもよい。
図１に示すように、実施形態に係るフローサイトメーターは、シース液送液ユニット４０、液体送液ユニット３０及びサンプル液送液ユニット２０を制御する、制御ユニット３０２をさらに備える。制御ユニット３０２は、コンピューター３００に含まれる。制御ユニット３０２は、例えば、コンピューター３００において、メモリに格納されたプログラムをプロセッサが実行することにより実現される。ただし、制御ユニット３０２は、例えば、ＰＬＣ等のハードウェアにより実現されてもよい。
制御ユニット３０２は、流速情報算出ユニット３０１から流速に関する情報を受け取る。フローセル１０を流れる参照粒子の流速に関する情報が基準を満たす場合、制御ユニット３０２は、図８に示すように、サンプル液送液ユニット２０にサンプル液をフローセル１０に送液させる。駆動装置２３が作動子２２を押すと、サンプル液流路５１及び供給流路５３を介して、サンプル液がフローセル１０に送液される。フローセル１０を流れる参照粒子の流速に関する情報が基準を満たさない場合、制御ユニット３０２は、サンプル液送液ユニット２０にサンプル液をフローセル１０に送液させない。
流速に関する情報が流速の値である場合、フローセル１０を流れる参照粒子の流速に関する情報が基準を満たすとは、例えば、参照粒子の流速の値が所定の範囲内であることをいう。所定の範囲は、例えば、フローセル１０内部を流れるサンプル粒子を安定して解析可能な流速に基づいて、予め設定される。流速に関する情報が流速のばらつきの値である場合、フローセル１０を流れる参照粒子の流速に関する情報が基準を満たすとは、例えば、流速のばらつきの値が所定の値以下であることをいう。所定の値は、例えば、フローセル１０内部を流れるサンプル粒子を安定して解析可能な流速のばらつきの許容範囲の上限に基づいて、予め設定される。流速のばらつきが変動係数である場合、例えば変動係数が０．２以下である場合、制御ユニット３０２は、サンプル液送液ユニット２０にサンプル液をフローセル１０に送液させる。ただし、所定の値はこれに限定されない。
流速の値の所定の範囲や流速のばらつきの所定の上限値等の流速に関する基準を示す情報は、コンピューター３００が備えるメモリや、コンピューター３００に接続された記憶装置３５１に保存されている。また、この情報は、例えば、ユーザからの入力により変更されてもよい。
液体送液ユニット３０は、まず、シース液の供給に起因して高圧な状態になっているフローセル１０に対して、粒子が逆流しない大きさの第１の流量で参照液を送液する。この工程は、プレドライブと呼ばれることがある。その後、液体送液ユニット３０は、第１の流量より少ない第２の流量で参照液をフローセル１０に対して送液する。次いで、参照液の流速に関する情報が基準を満たした後、サンプル液送液ユニット２０がサンプル液をフローセル１０に送液を開始し、図９に示すように、液体送液ユニット３０とサンプル液送液ユニット２０は、参照液の流量とサンプル液の流量の合計が第２の流量と同じになるよう、参照液の流量を減少させ、サンプル液の流量を増加させる。サンプル液の流量が所定の流量に達した後、液体送液ユニット３０とサンプル液送液ユニット２０は、それぞれ、一定の流量で、参照液とサンプル液を送液する。これにより、フローセル１０を流れるサンプル液の流速を上記基準を満たした状態に維持することができる。
シース液送液ユニット４０が高圧なシース液の送液を開始すると、図５に示すサンプル液２５３と内部液２５１の間の空気層に圧力変動が生じうる。しかし、液体送液ユニット３０が第２の流量で参照液をフローセル１０に送液している間に、空気層の圧力変動が低減される。
参照粒子の光学特性がサンプル粒子よりも流速検出に適している場合や、サンプル粒子の数が比較的少なくサンプル粒子による流速検出が難しい場合、サンプル液の流量が一定になった後においても、一定の流量の参照液をフローセル１０に送液することにより、図１に示すフローセル１０内部を流れる粒子の流速を精度よく監視することが可能である。また、シース液送液ユニット４０は、サンプル液送液ユニット２０にシース液を送液し、フローセル１０内部において、シース液の圧力と、サンプル液の圧力と、を平衡にしてもよい。
実施形態に係るフローサイトメーターは、流速に関する情報が基準を満たさない場合、流速に関する情報が基準を満たさないことを出力する出力装置４０１をさらに備える。出力装置４０１は、流速に関する情報が基準を満たさない場合、サンプル液をフローセル１０に送液することを中止するかどうかをオペレーターに問い合わせる情報を出力する。出力装置４０１は、例えば、ディスプレイである。なお、プリンター及びスピーカー等も出力装置４０１として使用可能である。出力装置４０１はコンピューター３００に接続されている。ただし、出力装置４０１は、遠隔地に配置されていてもよい。
図２に示すように、検出器２０１は、フローセル１０内部を流れるサンプル粒子の画像を撮像可能な光学系を備える。フローセル１０内部を流れるサンプル粒子の画像を撮像可能な光学系は、上述した光源１２１に加えて、光源１２２、１２３、１２４をさらに備える。光源１２１は、例えば、ＧＦＰを励起させる波長λE1の光を照射する。ＣＴＣがＧＦＰで標識されていた場合、フローセル１０内部を流れるＣＴＣは、波長λF1の緑色蛍光を発する。
光源１２２は、波長λE1と異なる波長λE2の光を照射する。光源１２２が照射した光は、例えばレンズ１３２で集光され、ダイクロイックミラー１４１でフローセル１０の方向に反射され、ダイクロイックミラー１４２を透過してフローセル１０に到達する。光源１２２が照射した波長λE2の光で励起される蛍光色素でサンプル粒子が標識されていた場合、フローセル１０内部のサンプル粒子は波長λF2の蛍光を発する。波長λF2は、例えば、赤色の波長である。
光源１２３は、波長λE1〜E2と異なる波長λE3の光を照射する。光源１２３が照射した光は、例えばレンズ１３３で集光され、ダイクロイックミラー１４２でフローセル１０の方向に反射され、フローセル１０に到達する。光源１２３が照射した波長λE3の光で励起される蛍光色素でサンプル粒子が標識されていた場合、フローセル１０内部のサンプル粒子は波長λF3の蛍光を発する。波長λF3は、例えば、青色の波長である。
光源１２４は、波長λE1〜E3と異なる波長λE4の光を照射する。波長λE4の光は、例えば、可視光である。光源１２４が照射した光は、例えばレンズ１３４で集光され、フローセル１０に到達する。波長λE4の光は、フローセル１０内部のサンプル粒子を透過する。
フローセル１０内部のサンプル粒子で生じた波長λF1〜F3の蛍光と、波長λE4の透過光とは、レンズ１３５を経てダイクロイックミラー１４３を透過し、光学ユニット１４４に到達する。光学ユニット１４４においては、例えば、４枚のダイクロイックミラーが組み合わされている。４枚のダイクロイックミラーは、波長λF1〜F3の蛍光と、波長λE4の透過光とを、互いにわずかに異なる角度で撮像装置１６２に向けて反射する。光学ユニット１４４で反射された波長λF1〜F3の蛍光と、波長λE4の透過光とは、レンズ１３７で集光され、撮像装置１６２の受光面の異なる位置に到達する。
撮像装置１６２は、光電変換素子を備える装置であり、例えば、ＴＤＩ撮像装置であり、ＣＣＤアレイを備える。撮像装置１６２は、図１に示す流速情報算出ユニット３０１から、フローセル１０内部を流れる粒子の流速の値の情報を受け取る。図２に示す撮像装置１６２は、受け取った流速の値に同期して、波長λF1〜F3の蛍光に対応する３つの蛍光画像と、波長λE4の透過光に対応する明視野画像とを生成する。波長λF1の緑色蛍光を発するサンプル粒子の画像が生成された場合、当該サンプル粒子は、ＣＴＣであると判定可能である。また、ＣＴＣの１７番染色体とＨｅｒ２遺伝子を蛍光染色している場合には、１７番染色体に基づく輝点とＨｅｒ２遺伝子に基づく輝点とを含む細胞を抽出し、抽出した細胞の画像を解析して、Ｈｅｒ２遺伝子の増幅がある細胞をＣＴＣと判定してもよい。
次に図１０及び図１１を参照して実施形態に係る粒子検出方法を説明する。図１０に示すように、実施形態に係る粒子検出方法は、フローサイトメーターに検出開始を指示するステップＳ１０１と、フローセル１０にシース液の供給を開始するステップＳ１０２と、フローセル１０に参照液の送液を開始するステップＳ１０３と、フローセル１０内部を流れる参照液の流速に関する情報を取得するステップＳ１０４と、流速に関する情報が基準を満たすか判定するステップＳ１０５と、流速に関する情報が基準を満たす場合、フローセル１０にサンプル液の送液を開始するステップＳ１０６と、フローセル１０内部を流れるサンプル粒子を検出するステップＳ１０７と、を含む。
ステップＳ１０１で検出開始が指示されると、制御ユニット３０２の制御により、サンプル液送液ユニット２０は、サンプル液と内部液の間に空気層を挟みながらサンプル液をサンプル液流路５１内部に吸引する。サンプル液送液ユニット２０は、サンプル液を接続点５６よりサンプル液送液ユニット２０側まで吸引して、吸引を停止する。その後、制御ユニット３０２の制御により、弁６０が閉じられる。ステップＳ１０２で、制御ユニット３０２の制御により、シース液送液ユニット４０がフローセル１０へのシース液の送液を開始する。ステップＳ１０３で、液体送液ユニット３０が参照液のフローセル１０への送液を開始する。なお、ステップＳ１０２とステップＳ１０３は同時に実施されてもよい。
ステップＳ１０４で、図２に示す光源１２１はフローセル１０内部を流れる参照粒子に光を照射し、反応光検出部１６１は、参照粒子で生じた散乱光の光学格子１５１による変調光を検出する。図１に示す流速情報算出ユニット３０１は、変調光の周期に基づいて、流速に関する情報を算出する。ステップＳ１０５で、制御ユニット３０２は、メモリや記憶装置３５１等から流速に関する基準を示す情報を読み出し、流速に関する情報が基準を満たしているか否かを判定する。図１１に示すステップＳ２０１で基準を満たすと判定された場合、図１０のステップＳ１０６で、制御ユニット３０２の制御により、サンプル液送液ユニット２０がフローセル１０へのサンプル液の送液を開始し、ステップＳ１０７で、図２に示す撮像装置１６２が、サンプル粒子の画像の撮像を開始する。所定の量のサンプル液が解析されると、解析が終了する。
図１１に示すステップＳ２０１で基準を満たさないと判定された場合、ステップＳ３０１で、制御ユニット３０２は、参照液の送液を開始してからの時間が上限を超えているか否かを判定する。上限を超えていないと判定された場合、図１０のステップＳ１０４に戻り、参照粒子の流速の測定が継続される。図１１のステップＳ３０１で、上限を超えていると判定された場合、ステップＳ３０２で、出力装置４０１は、流速に関する情報が基準を満たさないことを示す警告を出力し、サンプル液をフローセル１０に送液することを中止するかオペレーターに問い合わせる情報を出力する。
ステップＳ３０３で、サンプル液のフローセル１０への送液を中止しないことをオペレーターが選択した場合、図１０のステップＳ１０４に戻り、参照粒子の流速の測定が継続される。図１１のステップＳ３０３で、中止することをオペレーターが選択した場合、制御ユニット３０２の制御により、液体送液ユニット３０は参照液をフローセル１０に送液することを停止する。この場合、サンプル液送液ユニット２０がサンプル液流路５１内部の未使用のサンプル液を送り返し、送り返されたサンプル液を再利用してもよい。
以上説明した実施形態に係るフローサイトメーターによれば、フローセル１０内部を流れる参照粒子の流速に関する情報が基準を満たすまでサンプル液がフローセル１０に送られないため、サンプル液の浪費を抑制することが可能である。また、フローセル１０内部を流れる参照粒子の流速に関する情報が基準を満たした後は、サンプル液がフローセル１０に送られ、サンプル液に含まれるサンプル粒子の解析を開始することが可能である。
例えば、実施形態に係るフローサイトメーターは、第１の流量である０．０７７４μＬ／秒で１０秒間、参照液をフローセル１０に流し、その後、流速が安定するまで、第２の流量である０．００６６μＬ／秒で９０秒間、参照液をフローセル１０に流す。この場合、流速が安定するまでに、１．３６６７μＬの参照液がフローセル１０を流れる。従来のフローサイトメーターは、これと同量のサンプル液が解析のために用いられず浪費されていたが、実施形態に係るフローサイトメーターは、これと同量のサンプル液中のサンプル粒子を解析のために用いることが可能である。したがって、ＣＴＣのような微量サンプルを浪費することなく検出することが可能である。
上記のように本発明を実施形態によって記載したが、この開示の一部をなす記述及び図面はこの発明を限定するものであると理解するべきではない。この開示から当業者には様々な代替実施形態、実施例及び運用技術が明らかになるはずである。例えば、上記の実施形態において、撮像対象をＣＴＣとする例を検出したが、本発明の検出対象はＣＴＣに限定されない。サンプル粒子は、ＣＴＣ以外の細胞及び微生物等の生物サンプルであってもよい。また、粒子の流速を測定する際に、光を照射された粒子で生じる反応光として散乱光を用いる例を説明した。しかし、粒子が蛍光を発する光学特性を有する場合は、反応光として蛍光を用いてもよい。さらに、上記の実施形態において、サンプル粒子を光学的に検出する例を説明した。これに対し、フローセルに対向する電極を設け、サンプル粒子が電極間を通過するときに生じる電極間の電気抵抗の変化を測定することによって、サンプル粒子を検出してもよい。このように、本発明はここでは記載していない様々な実施形態等を包含するということを理解すべきである。
１０・・・フローセル、２０・・・サンプル液送液ユニット、２１・・・シリンジ、２２・・・作動子、２３・・・駆動装置、３０・・・送液ユニット、３０・・・液体送液ユニット、３１・・・シリンジ、３２・・・作動子、３３・・・駆動装置、４０・・・シース液送液ユニット、４１・・・シリンジ、４２・・・作動子、４３・・・駆動装置、５１・・・サンプル液流路、５２・・・液体流路、５３・・・供給流路、５４・・・シース液流路、５５・・・開口端、５６・・・接続点、６０・・・弁、１２１・・・光源、１２２・・・光源、１２３・・・光源、１２４・・・光源、１３１・・・レンズ、１３２・・・レンズ、１３３・・・レンズ、１３４・・・レンズ、１３５・・・レンズ、１３６・・・レンズ、１３７・・・レンズ、１４１・・・ダイクロイックミラー、１４２・・・ダイクロイックミラー、１４３・・・ダイクロイックミラー、１４４・・・光学ユニット、１５１・・・光学格子、１５２・・・透明部分、１５３・・・不透明部分、１６１・・・反応光検出部、１６２・・・撮像装置、２００・・・流速測定器、２０１・・・検出器、２５１・・・内部液、２５２・・・参照液、２５３・・・サンプル液、２５４・・・シース液、３００・・・コンピューター、３０１・・・流速情報算出ユニット、３０２・・・制御ユニット、３５１・・・記憶装置、４０１・・・出力装置

Claims (28)

  1. フローセルと、
    サンプル粒子を含むサンプル液とは異なる液体を前記フローセルに送液する液体送液ユニットと、
    前記液体が前記フローセルに送液された後、前記サンプル液を前記フローセルに送液するサンプル液送液ユニットと、
    前記フローセルを流れる前記サンプル粒子を検出するための検出器と、
    を備える、フローサイトメーター。
  2. 前記液体送液ユニット及び前記サンプル液送液ユニットが、共通の流路を介して、前記液体及び前記サンプル液をそれぞれ前記フローセルに送液する、請求項１に記載のフローサイトメーター。
  3. 前記液体送液ユニットが、前記サンプル粒子とは異なる参照粒子を含む参照液を前記液体として前記フローセルに送液する参照液送液ユニットである、請求項１又は２に記載のフローサイトメーター。
  4. 前記サンプル液送液ユニットが前記サンプル液を前記フローセルに送液開始後も、前記参照液送液ユニットが前記参照液を前記フローセルに送液する、請求項３に記載のフローサイトメーター。
  5. 前記サンプル液送液ユニットが前記サンプル液を前記フローセルに送液開始後、前記フローセルに送液される前記サンプル液の流量と前記参照液の流量の合計流量が一定になるよう、前記サンプル液送液ユニットが前記サンプル液の送液量を増加させ、前記参照液送液ユニットが前記参照液の送液量を減少させる、請求項４に記載のフローサイトメーター。
  6. 前記フローセルを流れる前記液体の流速に関する情報を取得するための流速測定器をさらに備え、
    前記流速に関する情報が基準を満たす場合、前記サンプル液送液ユニットが前記サンプル液を前記フローセルに送液する、請求項１から５のいずれか１項に記載のフローサイトメーター。
  7. 前記流速に関する情報が基準を満たすまで、前記液体送液ユニットが前記液体を前記フローセルに送液する、請求項６に記載のフローサイトメーター。
  8. 前記流速に関する情報が、流速の値及び前記流速のばらつきの値の少なくとも一方である、請求項６又は７に記載のフローサイトメーター。
  9. 前記流速に関する情報が流速の値であり、前記流速の値が所定の範囲内である場合、前記サンプル液送液ユニットが前記サンプル液を前記フローセルに送液する、請求項８に記載のフローサイトメーター。
  10. 前記流速に関する情報が流速のばらつきの値であり、前記流速のばらつきの値が所定の値以下である場合、前記サンプル液送液ユニットが前記サンプル液を前記フローセルに送液する、請求項８に記載のフローサイトメーター。
  11. 前記流速のばらつきが、前記流速の変動係数である、請求項８又は１０に記載のフローサイトメーター。
  12. 前記流速に関する情報が基準を満たす場合、前記サンプル液送液ユニットに前記サンプル液を前記フローセルに送液させ、前記流速に関する情報が基準を満たさない場合、前記サンプル液送液ユニットに前記サンプル液を前記フローセルに送液させない制御ユニットをさらに備える、請求項６から１１のいずれか１項に記載のフローサイトメーター。
  13. 前記流速に関する情報が基準を満たさない場合、前記流速に関する情報が基準を満たさないことを示す情報を出力する出力装置をさらに備える、請求項６から１２のいずれか１項に記載のフローサイトメーター。
  14. 前記流速に関する情報が基準を満たさない場合、前記出力装置が、前記サンプル液を前記フローセルに送液することを中止するか問い合わせるための情報を出力する、請求項１３に記載のフローサイトメーター。
  15. 前記液体送液ユニットが、第１の流量で前記液体を前記フローセルに送液し、次いで、前記第１の流量より小さい第２の流量で前記液体を前記フローセルに送液する、請求項１から１４のいずれか１項に記載のフローサイトメーター。
  16. 前記サンプル液送液ユニットに接続する、前記サンプル液が流れるサンプル液流路と、
    前記サンプル液流路と前記液体送液ユニットを接続する、前記液体が流れる液体流路と、
    前記サンプル液流路と前記フローセルを接続する、前記液体及び前記サンプル液が流れる供給流路と、
    をさらに備え、
    前記サンプル液流路の開口端から、前記サンプル液が前記サンプル液流路内部に供給される、請求項１から１５のいずれか１項に記載のフローサイトメーター。
  17. 前記サンプル液送液ユニットが前記サンプル液を前記サンプル液流路と前記液体流路の接続点より前記サンプル液送液ユニット側まで吸引した後、
    前記液体送液ユニットが前記液体を前記フローセルに送液する、
    請求項１６に記載のフローサイトメーター。
  18. 前記サンプル液送液ユニットが、前記サンプル液流路内部に内部液が充填された状態で空気を吸引し、前記空気に続いて前記サンプル液を吸引する、請求項１６又は１７に記載のフローサイトメーター。
  19. 前記流速測定器が、前記フローセルを流れる粒子の光学特性に基づき、前記流速を測定する、請求項６から１３のいずれか１項に記載のフローサイトメーター。
  20. 前記流速測定器が、
    前記フローセルに光を照射する光源と、
    前記フローセル内部の前記光を照射された粒子で生じた反応光を検出する反応光検出部と、
    を備える、請求項１９に記載のフローサイトメーター。
  21. 前記流速測定器が、前記フローセルと前記反応光検出部の間に配置された、反応光を変調させる光学格子をさらに備える、請求項２０に記載のフローサイトメーター。
  22. 前記反応光が散乱光である、請求項２０又は２１に記載のフローサイトメーター。
  23. 前記サンプル粒子が生物サンプルである、請求項１から２２のいずれか１項に記載のフローサイトメーター。
  24. 前記サンプル粒子が血中循環腫瘍細胞である、請求項１から請求項２２のいずれか１項に記載のフローサイトメーター。
  25. 前記参照粒子が非生物粒子である、請求項３から５のいずれか１項に記載のフローサイトメーター。
  26. 前記検出器が前記サンプル粒子を撮像する粒子撮像部である、請求項１から２５のいずれか１項に記載のフローサイトメーター。
  27. サンプル粒子を含むサンプル液とは異なる液体をフローセルに送液することと、
    前記液体を前記フローセルに送液した後、前記サンプル液を前記フローセルに送液することと、
    前記フローセルを流れる前記サンプル粒子を検出することと、
    を含む、粒子検出方法。
  28. 前記液体は参照粒子を含む参照液であり、
    前記フローセルを流れる前記参照液の流速に関する情報を取得することをさらに含み、
    前記流速に関する情報が基準を満たす場合に、前記サンプル液を前記フローセルに送液する、請求項２７に記載の粒子検出方法。
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