JP2019172586A - ブタcd4を認識するモノクローナル抗体 - Google Patents
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Abstract
Description
(1) ブタCD4Bを認識し、ヒト末梢血、マウス末梢血及びコモンマーモセット末梢血を認識しない、モノクローナル抗体。
(2) ブタCD4Aを認識する、(1)に記載のモノクローナル抗体。
(3) ブタCD4Aを認識しない、(1)に記載のモノクローナル抗体。
(4) ブタCD4Bを発現する細胞を免疫原として免疫動物を免疫し、前記免疫動物から取得した抗体産生細胞が産生する抗体である、(1)から(3)の何れか一に記載のモノクローナル抗体。
(5) 重鎖のアミノ酸配列として配列番号2に記載のアミノ酸配列を含み、軽鎖のアミノ酸配列として配列番号4に記載のアミノ酸配列を含む、(1)から(4)の何れか一に記載のモノクローナル抗体。
(6) 重鎖のアミノ酸配列として配列番号6に記載のアミノ酸配列を含み、軽鎖のアミノ酸配列として配列番号8に記載のアミノ酸配列及び/又は配列番号10に記載のアミノ酸配列を含む、(1)から(4)の何れか一に記載のモノクローナル抗体。
(7) 受領番号NITE AP−02666又は受領番号NITE AP−02667を有するハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体。
(8) 受領番号NITE AP−02666又は受領番号NITE AP−02667を有するハイブリドーマ。
(9) (1)から(7)の何れか一に記載のモノクローナル抗体と、ブタCD4を含む試料又はブタCD4を発現する細胞とを接触させる工程を含む、ブタCD4を検出する方法。
本発明以前に、ブタCD4Bの発現確認に関しては、非特許文献1及び非特許文献2にあるように、mRNAのRT−PCR法を用いるしか手段がなく、それらの手法を用いて発明者らもマイクロミニピッグコロニーにおけるCD4亜型の優位な存在を確認した。しかし、mRNAの発現とタンパク質の発現、特に細胞表面上への発現は必ずしも一致せず、タンパク質の挙動を明らかにすることはできなかった。また、これらの分子のシグナル伝達の上での機能的な差違についても明らかにすることができなかった。
本発明のモノクローナル抗体の第一の例としては、ブタCD4A及びブタCD4Bを認識し、ヒト末梢血、マウス末梢血及びコモンマーモセット末梢血を認識しないモノクローナル抗体を挙げることができる。
本発明のモノクローナル抗体の第二の例としては、ブタCD4Aを認識せず、ブタCD4Bを認識し、ヒト末梢血、マウス末梢血及びコモンマーモセット末梢血を認識しないモノクローナル抗体を挙げることができる。
モノクローナル抗体の作製は、当業者に既知の方法により行うことができる。
所望の抗原や所望の抗原を発現する細胞を感作抗原として使用して、通常の免疫方法にしたがって免疫動物を免疫する。免疫動物としては、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、サル、などの哺乳動物を用いることができる。免疫動物への抗原の投与は常法に従って行う。例えば完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバントなどのアジュバントと抗原との懸濁液もしくは乳化液を調製し、これを動物の静脈、皮下、皮内、腹腔内等に数回投与することによって動物を免疫化することができる。
BALB/cマウスは、日本クレアから8週齢のメスを購入した。
ブタ血液は国内の大学などから入手した。スクリーニングにおいて二次抗体として用いたAnti−mouse IgG APC抗体はBioLegend社 のものを使用した。細胞融合には、PEG溶液とP3X63−U1ミエローマ細胞株を用いた。ハイブリドーマ培養のための選択培地はSIGMA社のHATサプリメントとGibco(登録商標)のHTサプリメントを使用した。モノクローナル抗体のアイソタイプはRoche社のIsoStripTMマウスモノクローナル抗体アイソタイピングキットを使用し決定した。
(1)トランスフェクション
CD4AおよびCD4B遺伝子は、発明者らのグループが解析したマイクロミニピッグのCD4遺伝子のmRNA配列 (非特許文献1)(CD4A:GeneBank登録番号LC064059.1;CD4B:GeneBank登録番号LC064060.1)よりプライマーを設計し、マイクロミニピッグのtotal RNAを用いてcDNA合成後、コンストラクトを作製した。ベクターとしては、modified S/MAR (scaffold/matrix attachment region) episomal vectorを用いた(Modified S/MAR episomal vectors for stably expressing fluorescent-protein tagged transgenes with small cell-to-cell fluctuations. Akiko Mizutani, Eri Kikkawa, Akira Matsuno, Atsuko Shigenari, Hiroko Okinaga, Mineko Murakami, Hideyuki Ishida, Masafumi Tanaka, Hidetoshi Inoko Analytical Biochemistry. 2013; 443(1):113-6. PMID: 23969013 doi: 10.1016/j.ab.2013.08.009)。コンストラクトの遺伝子配列は、配列番号11〜15に示す。
配列番号12:CD4A(cDNA)
配列番号13:CD4B(cDNA)
配列番号14:Lig 13−117(CD4Aを組み込んだ発現ベクター)
配列番号15:Lig 13−118(CD4Bを組み込んだ発現ベクター)
ブタ末梢血よりLYMPHOPREPを用いて単核球を採取した。RBC Lysis Bufferで赤血球を溶解し、mitomycin C(MMC)処理を37℃で40分間行った後、3x106個の細胞をBALB/cマウスへ2週間の間隔を開け、腹腔内投与した。さらに2週間後、上記の方法でCD4B遺伝子を導入したA20細胞をMMC処理した後、腹腔内投与を行った。この追加免疫を2回行った後、MMC処理を行ったブタ末梢血単核球を2週間の間隔を開けて2回投与した。マウスの抗体価はHEK293細胞とHEK293細胞を親株としたCD4A/B導入細胞にマウスの血漿を添加し、二次抗体としてanti−mouse IgG APCを用いて染色し、マウス血漿中のポリクローナル抗体の産生を確認した。
ハイブリドーマ作製法は申請者らが行う常法を用いた(Production of a Locus and Allele-Specific Monoclonal Antibody for the Characterisation of SLA-1*0401 mRNA and Protein Expression Levels in MHC-Defined Microminipigs. Yoshie Kametani*, Shino Ohshima, Asuka Miyamoto, Atsuko Shigenari, Masaki Takasu, Noriaki Imaeda, Tatsuya Matsubara, Masafumi Tanaka, Takashi Shiina, Hiroshi Kamiguchi, Ryuji Suzuki, Hitoshi Kitagawa, Jerzy K. Kulski, Noriaki Hirayama, Hidetoshi Inoko, Asako Ando PLOS ONE 2016 11(10):e0164995. doi: 10.1371/journal.pone.0164995.)。
HEK293細胞と該細胞を親株としたCD4AあるいはCD4B導入細胞を用いてスクリーニングを行った。
スクリーニング前日にHEK293細胞とHEK293 CD4A/B導入細胞の混合細胞を1×104/wellずつ、Thurmoの96wellプレートに分注し、5%CO2濃度の37℃インキュベーター内で培養を行った。スクリーニング当日にハイブリドーマ培養上清を160μL取り出した。
ヒトリンパ球、マイクロミニブタリンパ球、マウスリンパ球はそれぞれ末梢血からフィコール(ヒト)、あるいはLYMPHOPREPTM(マイクロミニブタ・マウス)を用いた比重分離により単核球画分を採取した。1次抗体としてスクリーニングにより得られたクローンの培養上清を用いて染色を以下の様に行い、上記と同様の方法でフローサイトメトリーにより解析を行った。陽性コントロールとしては、ブタCD4抗体(SouthenBiotech社 74−12−4)を用いた。
ハイブリドーマより抽出したtotal RNA由来のcDNAを用いてPCRを行い、特定のバンドが増幅される事を確認した後、次世代シークエンサーにて遺伝子配列を解析した。cDNA代表配列に識別されたリードIDをソートし、長いもののみを抜粋してGenetyx(登録商標)等のソフトで全長配列を確定した。
(1)ブタCD4A/B両者を特異的に認識する抗体作成の為の免疫
BALB/cマウスに、CD4Bホモタイプのブタ末梢血単核球を2回免疫し、さらにCD4B遺伝子導入A20細胞を免疫したBALB/cマウス血漿中には、CD4B遺伝子導入HEK293細胞の他、CD4A遺伝子導入HEK293細胞にも結合し得る抗体を産生されていることが示された(図1A、B)。
図2は、12匹の免疫マウスそれぞれにPBMC 2回免疫後、CD4A遺伝子導入A20細胞を用いて免疫を行ったマウス血漿のCD4AおよびCD4Bトランスフェクタントとの交差性を示している。図2では、多くのマウスでCD4Aを免疫してもCD4Bとも交差する抗体を産生していることが示されている。
同様の免疫方法およびチェック方法を用いて、CD4AB両者を認識する抗体の力価が上昇したマウスを得た。これらを用いて脾細胞融合を行った。その後、Array scanにて陽性細胞を選択した。
モノクローナル抗体b1D7を産生するハイブリドーマ細胞は、受領番号:NITE AP−02667して、2018年3月7日に、独立行政法人 製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター(〒292−0818、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2−5−8)に寄託されている。
<1>CD4ABを認識するクローンx1E10
(1)FCMによる特異性の解析
HEK293-CD4AおよびHEK293−CD4B両トランスフェクタントを用いて、特異性の解析を行った。その結果、x1E10はCD4AおよびCD4Bの両トランスフェクタントを認識した。その結果、x1E10はCD4A及びCD4B両者に特異的であり、CD4AとCD4Bを共通して認識することが明らかとなった(図3A)。また、本クローンの抗体は、ヒト、マウス、コモンマーモセット(CM)の末梢血を認識せず、ブタ末梢血単核球のみと反応した(図3B)。従って、本モノクローナル抗体は、ブタのみに特異的であることが明らかとなった。
本抗体のハイブリドーマmRNAより次世代シークエンサーによって遺伝子配列解析を行った。CD4ABを認識するクローンx1E10の重鎖の塩基配列とアミノ酸配列と、x1E10の軽鎖の塩基配列とアミノ酸配列とを以下に記載する。
塩基配列(配列番号1)
CGCTCTCACTGGAGGCTGATCTCTGAAGATAAGGAGGTGTAGCCTAAAAGATGAGAGTGCTGATTCTTTTGTGGCTGTTCACAGCCTTTCCTGGTATCCTGTCTGATGTGCAGCTTCAGGAGTCGGGACCTGGCCTGGTGAAACCTTCTCAGTCTCTGTCCCTCACCTGCACTGTCACTGGCTACTCAATCATCAGTGATTATGCCTGGAACTGGATCCGGCAGTTTCCAGGAAACAAGATGGAGTGGATGGGCTACATACTCTACAGTGGAACCACTAACTACAACCCCTCTCTCAAAAGTCGAATCTCTATCACTCGAGACACATCCAAGAACCAGTTCTTCCTGCAGTTGAATTCTGTGACTACTGAGGACACAGCCACATATTACTGTGCACGAAGGACCTACTATGATTACGATTACTATGGTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGCCAAAACAACAGCCCCATCGGTCTATCCACTGGCCCCTGTGTGTGGAGATACAACTGGCTCCTCGGTGACTCTAGGATGCCTGGTCAAGGG
MRVLILLWLFTAFPGILSDVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSIISDYAWNWIRQFPGNKMEWMGYILYSGTTNYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCARRTYYDYDYYGMDYWGQGTSVTVSSAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVK
塩基配列(配列番号3)
TCCTCAGGCTGTCTCCTCAGGTTGCCTCCTCAAAATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTGATGTTCTGGATTCCTGCTTCCAGCAGTGATGTTTTGATGACCCAAATTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGACCATTGTCCATAGTCTTGGTAACACCTATTTAGAATGGTACCTACAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCATTGGCAGTGGATCCGGGACAGACTTCACACTCAAGATCACCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAGGGTTCACATGTTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAA
MKLPVRLLVLMFWIPASSSDVLMTQIPLSLPVSLGDQASISCRSSQTIVHSLGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFIGSGSGTDFTLKITRVEAEDLGVYYCFQGSHVPWTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQL
(1)FCMによる特異性の解析
HEK293-CD4AおよびHEK293−CD4B両トランスフェクタントを用いて、特異性の解析を行ったところ、本クローンは図4に示す通り、CD4Aトランスフェクタントは認識せず、CD4Bトランスフェクタントのみを高い結合能を持って認識した。以上の結果、b1D7はCD4Bのみに特異的であり、CD4Aを認識しないことが明らかとなった。
本抗体のハイブリドーマmRNAより次世代シークエンサーによって遺伝子配列解析を行った。ブタCD4Bを特異的に認識するクローンb1D7の重鎖の塩基配列とアミノ酸配列と、b1D7の軽鎖の塩基配列とアミノ酸配列とを以下に記載する。本抗体には2種類の軽鎖が存在することが明らかになった。これらの軽鎖はクローニングによっても常に2つ発現しており、2つのB細胞が1ミエローマと融合したクローンである可能性が高いと考えられた。
塩基配列(配列番号5)
CACTGGAGGCTGATCTCTGAAGATAAGGAGGTGTAGCCTAAAAGATGAGAGTGCTGATTCTTTTGTGGCTGTTCACAGCCTTTCCTGGTATCCTGTCTGATGTGCAGCTTCAGGAGTCGGGACCTGGCCTGGTGAAACCTTCTCAGTCTCTGTCCCTCACCTGCACTGTCACTGGCTACTCAATCACCAGTGATTATGCCTGGAACTGGATCCGGCAGTTTCCAGGAAACAAACTGGAGTGGATGGGCTACATAAGCTTCAGTGGTAGCACTAGCTACAACCCATCTCTCAAAAGTCGAATCTCTATCACTCGAGACACATCCAAGAACCAGTTCTTCCTGCAGTTGAATTCTGTGACTACTGAGGACACAGCCACATATTACTGTGCAAGACAGGGCTATGGAGATTACGACCCCTTTCCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCT[G|T]GTCAA[G|A]GG
MRVLILLWLFTAFPGILSDVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSDYAWNWIRQFPGNKLEWMGYISFSGSTSYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCARQGYGDYDPFPYWGQGTLVTVSAAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVK
塩基配列(配列番号7)
IGKV6-20_IGKJ2_CGQGYSYPYTFの予測DNA配列
TAGAGGCCAGCCCAGCTGTCCATGATTTATAACCTAGGCCTTTGCAGTGAGATCTGAAATGCATCAGACCAGCATGGGCATCAAGATGGAATCACAGACTCTGGTCTTCATATCCATACTGCTCTGGTTATATGGAGCTGATGGGAACATTGTAATGACCCAATCTCCCAAATCCATGTCCATGTCAGTAGGAGAGAGGGTCACCTTGACCTGCAAGGCCAGTGAGAATGTGGTTACTTATGTTTCCTGGTATCAACAGAAACCAGAGCAGTCTCCTAAACTGCTGATATACGGGGCATCCAACCGGTACACTGGGGTCCCCGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGCAACAGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTTGCAGATTATCACTGTGGACAGGGTTACAGCTATCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAA
MESQTLVFISILLWLYGADGNIVMTQSPKSMSMSVGERVTLTCKASENVVTYVSWYQQKPEQSPKLLIYGASNRYTGVPDRFTGSGSATDFTLTISSVQAEDLADYHCGQGYSYPYTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQL
塩基配列(配列番号9)
AAGAACTGACTAGACTCTATCTTGCTATTTGCATATTACATTTTCAGTAACCACAAATATCTCACAGTTGGTTTATAGCAAAGTACTTATGAGAATAGTAGTAATTAGCTAGGGACCAAAGTTCAAAGACAAAATGGATTTTCAAGTGCAGATTTTCAGCTTCCTGCTAATCAGTGCCTCAGTCATACTGTCCAGAGGACAAATTGTTCTCACCCAGTCTCCAACAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTTAGTTACATGTACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGATCCTCCCCCAGACTCCTGATTTATGACACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTGTTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCCGAATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTAGTTACCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAA
MDFQVQIFSFLLISASVILSRGQIVLTQSPTIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMYWYQQKPGSSPRLLIYDTSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQWSSYPYTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQL
Claims (9)
- ブタCD4Bを認識し、ヒト末梢血、マウス末梢血及びコモンマーモセット末梢血を認識しない、モノクローナル抗体。
- ブタCD4Aを認識する、請求項1に記載のモノクローナル抗体。
- ブタCD4Aを認識しない、請求項1に記載のモノクローナル抗体。
- ブタCD4Bを発現する細胞を免疫原として免疫動物を免疫し、前記免疫動物から取得した抗体産生細胞が産生する抗体である、請求項1から3の何れか一項に記載のモノクローナル抗体。
- 重鎖のアミノ酸配列として配列番号2に記載のアミノ酸配列を含み、軽鎖のアミノ酸配列として配列番号4に記載のアミノ酸配列を含む、請求項1から4の何れか一項に記載のモノクローナル抗体。
- 重鎖のアミノ酸配列として配列番号6に記載のアミノ酸配列を含み、軽鎖のアミノ酸配列として配列番号8に記載のアミノ酸配列及び/又は配列番号10に記載のアミノ酸配列を含む、請求項1から4の何れか一項に記載のモノクローナル抗体。
- 受領番号NITE AP−02666又は受領番号NITE AP−02667を有するハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体。
- 受領番号NITE AP−02666又は受領番号NITE AP−02667を有するハイブリドーマ。
- 請求項1から7の何れか一項に記載のモノクローナル抗体と、ブタCD4を含む試料又はブタCD4を発現する細胞とを接触させる工程を含む、ブタCD4を検出する方法。
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