JP2019151603A - ピレンを基本骨格とした無洗浄タンパク質ゲル染色剤 - Google Patents
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Abstract
Description
ペプチド及びタンパク質は通常、ゲル電気泳動を使用して、溶液定量化アッセイによって、又は固体支持体、例えば、フィルター膜上における検出によって、検出かつ評価される。少量のタンパク質は目視できないが、通常、それらを同定する前に染色されなければならない。
[1]ピレン誘導体を含有する、無洗浄タンパク質ゲル染色剤。
R1は、−OH、−C1-6アルキル、−OC1-6アルキル、−OTs、−N3、−NH2からなる群から選択され;そして
mは、0〜10の整数である)
を有する、[2]に記載の無洗浄タンパク質ゲル染色剤。
R2は、−OH、−C1-6アルキル、−OC1-6アルキル、−OTs、−N3、−NH2からなる群から選択され;そして
nは、0〜10の整数である)
を有する、[2]に記載の無洗浄タンパク質ゲル染色剤。
前記ピレン−フルオレセイン結合体が、以下:
本発明のゲル染色剤に含まれるピレン誘導体としては、限定されないが、1−ピレンメタノール、ピレニルメチルエーテル誘導体、1−ピレンカルボン酸誘導体、糖修飾ピレニルメチル誘導体、及びピレン−フルオレセイン結合体などが挙げられる。これらのピレン誘導体は、市販のものを用いるか、又は後述する実施例1に記載のように、常法により合成したものを使用に合わせて適宜用いてもよい。
糖修飾ピレニルメチル誘導体は、典型的には、下記の構造であり得る。
本発明によれば、ゲル上で電気泳動後に分離された生物学的試料を視認できるようにする染色剤として、上記のピレン誘導体を用いることを特徴とする。本発明中で使用するとき、「ゲル」とは、生物学、化学、医学、薬学、バイオサイエンス等の分野において、生体物質や化学物質を分離分析するための分子ふるい素材のことをいい、好ましくは、電気泳動法による試料成分の分布支持体をいう。ゲルの素材としては、特に制限されないが、例えば、ポリアクリルアミドやアガロース等が挙げられる。本発明の染色方法に用いるゲルとしては、好ましくは、タンパク質の1次元又は2次元の電気泳動後のゲルが挙げられる。ここで、タンパク質の電気泳動としては、特に制限されないが、従来電気泳動、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)、ドデシル硫酸ナトリウムを添加したポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)、オファーレルの2次元電気泳動法、RFHRの二次元電気泳動法等が挙げられる。ゲルの大きさや形状もまた制限されず、ディスク式の円柱状のものであっても、スラブ式のシート状のものであってもよい。なお、ゲルを用いた各種電気泳動用の装置及び手段は、当業者に周知である。
本発明によれば、ゲル上を電気泳動させたタンパク質を、固定液を用いて該ゲル上で固定し、上記ゲル染色剤を含む染色液、すなわち、ピレン誘導体水溶液を用いてタンパク質を染色し、染色後の脱色及び洗浄を伴わずに、紫外(UV)光を照射後、ゲル画像を得ることができる。ここで、固定液として用いることができる固定化剤としては、生体試料を腐敗から保護するために使用される化学薬品が挙げられる。このような固定化剤は、試料に生じる生物学的反応を防ぐことができ、試料の機械的強度と安定性を増加させる。一実施形態において、種々の固定化剤を固定液に含めることができ、例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトン、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、EDTA、界面活性剤、金属塩、金属イオン、尿素、及びアミノ化合物などが挙げられる。また、上記の固定化剤は、酸性条件下で使用することができる。より具体的には、電気泳動後のゲル上のタンパク質の固定化は、限定されないが、容器中でゲルを1〜10%酢酸水溶液を含む40〜70%メタノール中に浸し、5分〜1時間程度の振とうさせることによって達成することができる。さらに、固定化工程は、1回に限定されず、数回繰り返してもよい。
本発明によれば、タンパク質染色検出用キットが提供される。該タンパク質染色検出用キットは、染色剤として本発明のピレン誘導体水溶液の他、タンパク質を固定するための固定液、染色前に使用する洗浄液を含むことができる。
本実施例では、各種ピレン誘導体を合成した。合成に使用した有機合成試薬は、和光純薬工業株式会社、東京化学工業株式会社、Aldrich Chemical Co.、関東化学より購入した。また、有機合成反応の追跡及び確認、並びに所望のピレン誘導体の精製及び合成確認には、シリカゲル薄層クロマトグラフィー、1H NMR測定、13C NMR測定、及びシリカゲルクロマトグラフィーにより行った。より具体的には、シリカゲル薄層クロマトグラフィーでは、Silica gel 60 F254(Merck)を用い、反応の追跡、確認には、UV(254nm)、(365nm)の照射、又は発色試薬として1%Ce(SO4)2−1.5%(NH4)6Mo7O24・4H2O−10%H2SO4水溶液に浸し、電熱器を用いて発色させ、検出した。また、単離精製には、Silica Gel C−60、又はWako Gel C−300、Silica Gel 60Nを用いた。さらに、合成確認においては、1H NMR測定では、OXFORD NMR AS500(500MHz)、又はJEOLJNX−EX−270(270MHz)を用いて測定した。化学シフトは、CDCl3中のテトラメチルシラン(δ 1H=0ppm)溶媒ピークを用い内部標準として示した。
化合物2:Rf 0.54 (Hexane-EtOAc, 5:1) 1H NMR (500 MHz, Chloroform-d) δ 8.37 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 8.20 (t, J = 7.7 Hz, 2H), 8.18-8.13 (m, 2H), 8.08-7.99 (m, 4H), 5.19 (s, 2H), 3.52 (s, 3H).
化合物4:Rf 0.17 (Hexane-EtOAc, 1:1) 1H NMR (500 MHz, Chloroform-d) δ 9.26 (d, J = 9.4 Hz, 1H), 8.65 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 8.30-8.22 (m, 3H), 8.20-8.16 (m, 2H), 8.12-8.04 (m, 2H), 4.72-4.67 (m, 2H), 4.00-3.96 (m, 2H), 3.84-3.79 (m, 2H), 3.75-3.72 (m, 2H), 2.10 (s, 1H).
化合物5:Rf 0.50 (Hexane-EtOAc, 1:1) 1H NMR (500 MHz, Chloroform-d) δ 9.12 (d, J = 9.5 Hz, 2H), 8.50 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 8.10 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 8.06 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 8.01 (d, J = 9.4 Hz, 2H), 7.96- 7.91 (m, 4H), 7.77 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.73 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 4.74 (t, J = 4.6 Hz, 4H), 4.12-4.08 (m, 4H).
化合物6:Rf 0.73 (Hexane-EtOAc, 1:1) 1H NMR (500 MHz, Chloroform-d) δ 9.54 (d, J = 9.4 Hz, 2H), 8.92 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 8.40-8.33 (m, 6H), 8.30-8.24 (m, 4H), 8.18-8.11 (m, 4H).
化合物7:Rf 0.38 (EtOAc) 1H NMR(500 MHz, Chloroform-d) δ 8.40 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 8.23-8.13 (m, 4H), 8.09-7.99 (m, 4H), 5.29 (s, 2H), 3.78-3.70 (m, 6H
), 3.61 (t, J = 4.5 Hz, 2H), 2.30 (s, 1H).
化合物8:Rf 0.15 (Hexane-EtOAc, 4:1) 1H NMR (500 MHz, Chloroform-d) δ 8.37 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 8.23-8.18 (m, 2H), 8.17-8.12 (m, 2H), 8.08-7.99 (m, 4H), 7.78-7.74 (m, 2H), 7.22 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 5.25 (s, 2H), 4.19-4.15 (m, 2H), 3.72-3.68 (m, 4H), 3.67-3.63 (m, 2H), 2.33 (s, 3H).
化合物9:Rf 0.70 (Hexane-EtOAc, 1:4) 1H NMR (500 MHz, Chloroform-d) δ 8.40 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 8.23-8.17 (m, 2H), 8.17-8.12 (m, 2H), 8.08-7.99 (m, 4H), 7.75 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.25-7.23 (m, 2H, with CHCl3), 5.28 (s, 2H), 4.13-4.09 (m, 2H), 3.76-3.72 (m, 2H), 3.69-3.63 (m, 4H), 3.61-3.55 (m, 4H), 2.36 (s, 3H).
化合物10:Rf 0.56 (Hexane-EtOAc, 2:1) 1H NMR (500 MHz, Chloroform-d) δ 8.41 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 8.20 (t, J = 8.2 Hz, 2H), 8.17-8.13 (m, 2H), 8.08-7.99 (m, 4H), 5.30 (s, 2H), 3.80-3.76 (m, 2H), 3.75-3.71 (m, 2H), 3.70-3.66 (m, 2H), 3.39 (t, J = 5.1 Hz, 2H).
化合物11:Rf 0.40 (Hexane-EtOAc, 2:1) 1H NMR (500 MHz, Chloroform-d) δ 8.41 (dd, J = 9.3, 1H), 8.20 (t, J = 7.7 Hz, 2H), 8.17-8.13 (m, 2H), 8.08-7.99 (m, 4H), 5.30 (s, 2H), 3.79-3.75 (m, 2H), 3.74-3.70 (m, 2H), 3.69-3.61 (m, 6H), 3.32 (t, J = 5.1 Hz, 2H).
化合物12:Rf 0.05 (DCM-MeOH, 95:5) 1H NMR (500 MHz, Chloroform-d) δ 8.41 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 8.20 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 8.17-8.12 (m, 2H), 8.08-7.98 (m, 4H), 5.29 (s, 2H), 3.77-3.73 (m, 2H), 3.70-3.64 (m, 2H), 3.49 (t, J = 5.2 Hz, 2H), 2.84 (t, J = 5.2, 2H).
化合物13:Rf 0.05 (DCM-MeOH, 95:5) 1H NMR (500 MHz, Chloroform-d) δ 8.41 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 8.20 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 8.17-8.12 (m, 2H), 8.08-7.98 (m, 4H), 5.29 (s, 2H), 3.79-3.74 (m, 2H), 3.74-3.69 (m, 2H), 3.68-3.63 (m, 2H) 3.63-3.58 (m, 2H), 3.46 (t, J = 5.2 Hz, 2H), 2.84-2,76 (m, 2H).
化合物15:Rf 0.51 (DCM-MeOH, 9:1) 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 10.4-9.94 (m, 3H), 8.39 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 8.31-8.21 (m, 5H), 8.18-8.03 (m, 5H), 7.69 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.13 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 6.66 (d, J = 2.3 Hz, 2H), 6.57 (d, J = 8.8 Hz 2H), 6.55-6.51 (m, 2H), 5.23 (s, 2H), 3.81-3.76 (m, 2H), 3.74-3.62 (m, 6H).
化合物16:Rf 0.44 (DCM-MeOH, 9:1) 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 10.1(s, 2H), 10.0 (s, 1H), 8.38 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 8.32-8.21 (m, 5H), 8.16 (s, 2H), 8.11-8.04 (m, 3H), 7.69 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.14 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 6.66 (d, J = 2.3 Hz, 2H), 6.57 (d, 8.7 Hz, 2H), 6.53 (dd, J = 8.7 Hz, 2.3 Hz, 2H), 5.20 (s, 2H), 3.75-3.70 (m, 2H), 3.70-3.55 (m, 10H).
化合物14:1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 10.10 (s, 1H), 8.23 (s, 1H), 8.15 (s, 1H), 7.72 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.15 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 6.64-6.59 (m, 4H), 6.53 (dd, J = 8.7, 2.3 Hz, 2H), 3.61-3.57 (m, 2H), 3.54-3.51 (m, 2H), 3.50-3.36 (m, 4H).
化合物18及び化合物19を以下の合成スキームに従って合成した。
化合物19:Rf 0.55 (Hexane-EtOAc, 1:1) 1H NMR (500 MHz, Chloroform-d) δ 8.32 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 8.22 (d, J = 7.7 Hz, 2H), 8.17-8.01 (m, 5H), 7.96 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 5.64 (d, J = 12.3 Hz), 5.31 (d, J = 12.4 Hz, 1H), 5.16-5.01 (m, 3H), 4.53 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 4.33 (dd, J = 12.2, 4.6 Hz, 1H), 4.25 (dd, J = 12.2, 2.5 Hz, 1H), 3.68-3.63 (m,1H), 2.17 (s, 3H), 2.00 (s, 3H), 1.94 (s, 3H), 1.70 (s, 3H).
化合物18:Rf 0.70 (DCM-MeOH, 4:1) 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 8.45 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 8.34-8.16 (m, 7H), 8.08 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 5.57 (d, J = 12.1 Hz, 1H), 5.30 (d, J = 12.1 Hz, 1H), 5.11 (d, J = 4.8 Hz, 1H), 5.00-4.93 (m, 2H), 4.68-4.63 (m, 1H), 4.40 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 3.81-3.75 (m, 1H), 3.58-3.51 (m, 1H), 3.46-3.39 (m, 1H), 3.21-3.06 (m, 4H).
(1)各種溶液の調製
30%アクリルアミドモノマー溶液の調製:アクリルアミドモノマー 9.93g、N−N’−メチレンビスアクリルアミド 0.27g、ミリQ水を加え、合計34mLの溶液を調製した。10%アクリルアミドモノマー溶液の調製:30%アクリルアミドモノマー 33mL、ミリQ水 16mL、0.75M TrisHCl 50mL、10%SDS 1mLをそれぞれ加え、合計100mLの溶液を調製した。濃縮ゲル溶液は、30%アクリルアミドモノマー 7.5mL、ミリQ水 29mL、0.25M TrisHCl(pH6.8)37.5mL、10%SDS 0.75mLをそれぞれ加え、合計75mLの溶液として調製した。
10%アクリルアミドモノマー溶液20mLに、25%APS 67μL、TEMED 16μLを加え、電気泳動用ガラス板に混合溶液を流し込み、ゲル化させた。30分後、ミリQ水 2mLを加え、ゲル板を洗浄した。次に、濃縮ゲル溶液7.5mL、25%APS 25μL、TEMED 6μLを加え、濃縮ゲルとして先述のゲル層の上に濃縮ゲルを注ぎ、ゲル化させた。次に、ゲル電気泳動用サンプルとして、BSA(1mg/mL)を100μL、2×ローディングバッファー100μLの計200μLの混合溶液を調整し、99℃で5分間加熱し、SDS−PAGEに用いるサンプルとした。各レーンに10μL(BSA 5μg)ずつ導入し、150V、約100分の条件でゲル電気泳動を行った。その後、ゲルを電気泳動用ガラス板から取り出し、各レーンを短冊状に切り出し、10μM、約10mL(1%DMSO)のピレン誘導体の染色剤水溶液に浸し、1時間振とうさせた。ただし、化合物2においては濃度を22μMとした。振とう後、洗浄を行わずに泳動像を撮影した。
UVトランスイルミネーターMD−25(λex 312nm)を用い、ゲルの下側からUV光を照射し、デジタルカメラを用いてゲル画像を撮影した。得られた泳動像を、ImageJ(画像解析ソフトウェア)を用いて、BSAバンドのシグナル強度を算出した。化合物1〜19について染色実験を行ったところ、良好な染色能を示す化合物1、2、及び7を見出した(図1)。
本実施例で用いたピレン誘導体の疎水性度と染色能の相関を調べるため、疎水性パラメーターであるLog P値をChemDrawを用いて予測値として求めた。染色能が良好結果を与えた化合物2、1、及び7については、予測Log P値がおよそ3.5〜4.5の範囲にあり、疎水性度と染色能に一定の相関関係があることが示唆された(図2)。
(1)泳動サンプル調製
CelLyicB(Sigma−Aldrich)で破砕した大腸菌の菌体サンプルを、2Dクリーンアップキット(GE Healthcare)を用いて脱塩処理した後に、2D Quantキット(GE Healthcare)を用いてタンパク質量を定量した。そのうち50μg分を1回の2次元電気泳動に用いた。
1次元目は、Immobiline Dry Strip(GE Healthcare)を用いて等電点電気泳動を行った後に、2次元目は、NuPAGE 4−12%Bis−Tris ZOOMゲル(Thermo Fisher Scientific)を用いて泳動した。
泳動後のゲルを50%メタノール、7%酢酸水溶液に浸し、30分振とうした。この操作を2回繰り返した。その後、ミリQ水に浸し、10分振とうした。
固定化後のゲルを、Sypro Ruby(Sigma−Aldrich)溶液又は10μMピレン誘導体水溶液40mLに浸し、終夜振とうして染色した。ピレン誘導体には、ピレニルメチルメチルエーテル(化合物2)及び1−ピレンメタノール(化合物1)を使用した。その後、比較対象のSypro Rubyについてのみ、洗浄及び脱色のために、10%メタノール、7%酢酸水溶液に浸し30分震とうし、その後、ミリQ水に浸して30分振とうさせ脱色を行った。上記の通り、染色後、比較対象のSypro Rubyについては脱色を行った後に撮影を行い、一方、ピレン誘導体染色剤については洗浄を行わず撮影を行った。撮影は、Typhoon FLA9500(GE Healthcare)を用い、励起波長473nm、LPG(575nmロングパスフィルター)を使用してスキャンした。結果を図2に示す。さらに、Image Masterを用いてスポットの数をカウントすると、対照のSypro Rubyによって染色した画像では、スポット数が1,247個であるのに対して、ピレニルメチルメチルエーテル(化合物2)を用いた場合には922個であり、1−ピレンメタノール(化合物1)を用いた場合には683個であった。これらの結果から、本発明のピレン誘導体を用いると、洗浄及び脱色操作なしに2次元電気泳動ゲルを染色できることが見出された。
Claims (10)
- ピレン誘導体を含有する、無洗浄タンパク質ゲル染色剤。
- 前記ピレン誘導体が、1−ピレンメタノール、ピレニルメチルエーテル誘導体、1−ピレンカルボン酸誘導体、糖修飾ピレニルメチル誘導体、及びピレン−フルオレセイン結合体からなる群から選択される、請求項1に記載の無洗浄タンパク質ゲル染色剤。
- 前記ピレニルメチルエーテル誘導体が、以下の構造:
R1は、−OH、−C1-6アルキル、−OC1-6アルキル、−OTs、−N3、−NH2からなる群から選択され;そしてmは、0〜10の整数である)
を有する、請求項2に記載の無洗浄タンパク質ゲル染色剤。 - 前記ピレニルメチルエーテル誘導体が、以下:
- 前記1−ピレンカルボン酸誘導体が、以下の構造:
R2は、−OH、−C1-6アルキル、−OC1-6アルキル、−OTs、−N3、−NH2からなる群から選択され;そしてnは、0〜10の整数である)
を有する、請求項2に記載の無洗浄タンパク質ゲル染色剤。 - 前記1−ピレンカルボン酸誘導体が、以下:
- 前記糖修飾ピレニルメチル誘導体が、以下:
- 前記ピレン−フルオレセイン結合体が、以下:
- ゲル上を電気泳動させたタンパク質を、固定液を用いて前記ゲル上に固定し、請求項1〜8のいずれか1項に記載の無洗浄タンパク質ゲル染色剤を含む染色液を用いて、ゲル上に固定されたタンパク質を染色し、染色後の脱色及び洗浄を伴わずに、紫外(UV)光を照射後、ゲル画像を得ることを特徴とするタンパク質染色検出方法。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載の無洗浄タンパク質ゲル染色剤を含む、タンパク質染色検出用キット。
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