JP2019150029A - 抗アンドロゲンペプチドおよび癌治療におけるその使用 - Google Patents

Abstract

【課題】前立腺癌療法と乳癌療法の両方においてアンドロゲンレセプター／Ｓｒｃ会合および新しい種類の化合物の発現を無効にするための、ヒトアンドロゲンレセプターの一部を含む、天然の、部位特異的突然変異、および合成ペプチドならびにその組成物、およびその使用方法の提供。【解決手段】以下の式：X-[(Pro)n-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys]m-Yで示される単離または精製または部分精製されたペプチド由来分子。【選択図】なし

Description

本発明は、ヒトアンドロゲンレセプターの一部を含む、天然の、部位特異的突然変異、
および合成ペプチドならびにその組成物に関する。本発明は、これらのペプチドに対して
産生された抗体およびこれらのペプチドをコードするポリヌクレオチドにも関する。これ
らのペプチドの誘導体を合成し、前立腺癌および／または乳癌の治療および／または予防
において抗アンドロゲン組成物としてそれらを使用するための方法、薬剤組成物の調製、
診断用キット、ならびに抗癌治療で使用する関連アッセイの開発も提供される。

ヒト前立腺癌および乳癌におけるアンドロゲンレセプター
アンドロゲンレセプター（ＡＲ）は、内在性アンドロゲンと共にその活性を通じて男性
の性的発育および機能の誘導を媒介するリガンド活性化転写調節タンパク質である（Ｒｏ
ｙら、１９９９年）。アンドロゲンは一般的に男性性ホルモンとして知られている。アン
ドロゲンホルモンはステロイドであり、これは精巣および副腎皮質により身体内で産生さ
れるまたは実験室で合成することができる。アンドロゲン性ステロイドは、筋肉と骨量、
前立腺成長、精子形成および男性髪型などの男性性徴の発達および維持を含む多くの生理
学的過程において重要な役割を果たしている（ＳｉｉｔｅｒｉとＷｉｌｓｏｎ、１９７４
年）。内在性ステロイド性アンドロゲンには、テストステロンおよびジヒドロテストステ
ロン（ＤＨＴ）が挙げられる。テストステロンは精巣により分泌される主要ステロイドで
あり、男性の血漿中に存在する一次循環アンドロゲンである。テストステロンは、多くの
末梢組織において酵素５−α−還元酵素によりＤＨＴに転換される。したがって、ＤＨＴ
は、大半のアンドロゲン作用のための細胞内媒介物としての働きをすると考えられている
。

他のステロイド性アンドロゲンには、シピオン酸、プロピオン酸、フェニルプロピオン
酸、シクロペンチルプロピオン酸、イソカルポレート（isocarporate）、エナント酸、お
よびデカン酸エステルなどのテストステロンのエステル、ならびに、７−メチル−ノルテ
ストステロンなどの他の合成アンドロゲンが挙げられる。

アンドロゲンレセプター（ＡＲ）を発現する２種類の主要な癌型は、前立腺癌および乳
癌である。他の癌もＡＲ陽性である可能性がある。最も一般的なＡＲ陽性癌は前立腺癌で
ある。前立腺癌のおよそ８０〜９０％が初期診断でアンドロゲンに依拠しており、前立腺
癌の内分泌療法は血清アンドロゲンの減少およびＡＲの阻害に向けられている（Ｄｅｎｉ
ｓとＧｒｉｆｆｉｔｈｓ、２０００年）。しかし、アンドロゲンアブレーション療法が最
終的に失敗すると、前立腺癌は進行してホルモン不応性状態になる。ＡＲは前立腺癌進行
の間ずっと発現され、ホルモン不応性病の大半の患者で持続する（Ｍｏｈｌｅｒら、１９
９６年；ｖａｎ ｄｅｒ Ｋｗａｓｔら、１９９１年；Ｓａｄｉら、１９９１年；Ｃｈｏ
ｄａｋら、１９９２年；Ｈｏｂｉｓｃｈら、１９９６年）。その上、ホルモン不応性前立
腺癌から同定されたＡＲ突然変異体の大半は、転写活性が可能である。これらの所見によ
れば、ＡＲ機能の喪失はアンドロゲンアブレーション失敗の主な原因ではなく、ＡＲ−陰
性前立腺癌細胞は顕著な増殖または延命効果を有さないことが示唆される。代わりに、入
手可能な臨床上および実験上の証拠によれば、シグナル伝達カスケードを通したＡＲ活性
の誤調節、ＡＲ共調節因子の発現の変化、ならびにＡＲがテストステロンおよびＤＨＴ以
外のリガンドに応答して転写的に活性になることを可能にするＡＲの突然変異体による正
常なアンドロゲン軸の変化を通して前立腺癌の進行が生じることが示唆される。血清アン
ドロゲンだけで前立腺発癌を促進することはないが、アンドロゲン作用およびＡＲの機能
的状態は前立腺癌進行の重要な媒介物である。新たに診断され治療を受けていない前立腺
癌に罹った男性の血清テストステロンレベルが低いことは、高くなったＡＲ発現、腫瘍内
の毛細血管密度の増加、および高くなったグリーソンスコアと関連があることが見出され
ている（Ｓｃｈａｔｚｌら、２００２年）。術前治療を受けていない患者から収集した臨
床的前立腺癌検体の最近の分析によっても、高ＡＲ発現は低下した無再発生存および疾患
憎悪と関連があることが実証された（Ｌｅｅ、２００３年）。前立腺癌の内分泌学的治療
は、主に、去勢手術またはエストロゲン（ジエチルスチルベストロール）およびＬＨＲＨ
（黄体形成ホルモン放出ホルモン）アゴニストを使用した化学的去勢による循環精巣アン
ドロゲンの欠乏を通じたＡＲ活性の調節を含む。ＡＲの活性は、抗アンドロゲンの投与単
独、または外科的もしくは化学的去勢との併用（併用アンドロゲン遮断と呼ばれる）のど
ちらかによっても遮断することができる。患者の８０％超が、アンドロゲンアブレーショ
ンに正の応答を示す。しかし、転移性前立腺癌の患者は、最終的にアンドロゲン枯渇療法
後平均１２〜１８カ月で疾患憎悪を経験する。これらの患者の腫瘍はホルモン不応性であ
るとみなされる。これらの腫瘍は、血清アンドロゲンの減少および／または抗アンドロゲ
ンでの治療にもかかわらず憎悪してしまったという意味で不応性ではあるが、これらの腫
瘍の大多数はアンドロゲンに対して完全に抵抗性というわけではなさそうである。ホルモ
ン不応性転移性前立腺癌の患者の９７％において、外来性アンドロゲン治療により疾患フ
レアおよび好ましくない応答が生じる（ＦｏｗｌｅｒとＷｈｉｔｍｏｒｅ、１９８２年に
概説されている）。ホルモン不応性前立腺癌の患者に対する二次療法も、大部分がアンド
ロゲン産生およびＡＲ機能を標的とし、二次抗アンドロゲンの投与、副腎アンドロゲン産
生の阻害、およびプロゲステロンまたはエストロゲン剤を使用した追加のＬＨ（黄体形成
ホルモン）阻害が含まれる（ＤａｗｓｏｎとＶｏｇｅｌｚａｎｇ、２０００年）。乳癌の
ような他の癌もＡＲ陽性である可能性がある（Ｍｏｉｎｆａｒら、２００３年）。アンド
ロゲンレセプターは乳管上皮内癌ならびに浸潤性乳癌において一般に発現されている。著
しい数の低分化乳癌は、ＥＲ（エストロゲンレセプター）陰性およびＰＲ（プロゲステロ
ンレセプター）陰性であるが、それでもＡＲ陽性である。前立腺癌同様、乳癌はホルモン
枯渇により治療されるが、この場合、ホルモン枯渇はエストロゲンおよびエストロゲンレ
セプターを阻止することにより実現される。時間とともに、乳癌はエストロゲンの必要性
なしに増殖する方法を探り致死的になる。ホルモン不応性になる乳癌は大多数の場合にＡ
Ｒを発現し続ける。二次ホルモン療法も失敗することがあるが、ＡＲに向けられた療法が
正の治療有用性を提供できることによって、ＡＲ活性は前立腺癌と乳癌両方の増殖と生存
の重要な媒介物であることが示唆される。

この点に関して、ステロイド性レセプターはシグナル伝達カスケードを活性化するとい
う証拠（Ｍｉｇｌｉａｃｃｉｏら、１９９６年）により、これらの癌の治療の新たな最前
線が開かれた。アンドロゲンならびにエストロゲンは、ＤＮＡ合成を刺激するにはＳｒｃ
／ｒａｓ／ｅｒｋ経路活性化を必要とすることが実証されている（Ｍｉｇｌｉａｃｃｉｏ
ら、２０００年）。ステロイド性レセプターと非レセプターチロシンキナーゼＳｒｃが直
接相互作用すると、そのような経路活性化が生じる。これらの相互作用に不可欠な部位は
すでに同定されている。

現行治療法
フルタミド（Ｅｕｌｅｘｉｎ（登録商標））、ビクルタミド（Ｃａｓｏｄｅｘ（登録商
標））またはニルタミド（Ａｎａｎｄｒｏｎ（登録商標））などの非ステロイド性抗アン
ドロゲンは、ホルモン応答性前立腺癌療法において使用されてきた。同様に、タモキシフ
ェン（Ｎｏｌｖａｄｅｘ（登録商標））またはＩＣＩ １８２，７８０（Ｆｕｌｖｅｓｔ
ｒａｎｔ（登録商標））による抗エストロゲン療法は、ホルモン応答乳癌において一般に
使用されている。不運なことに、これらのおよび類似するアプローチは、薬物抵抗性の発
現のために効き目が悪くなることが多い。さらに、これらの化合物には、心血管系合併症
の危険性の増加、および慢性使用の後の子宮癌の発生のわずかな増加のようないくつかの
好ましくない副作用がある。したがって、非毒性代替化合物を使用してもっと特異的な形
で前立腺癌および乳癌を治療する緊急の必要性が存在する。ホルモンまたは成長因子に刺
激されたアンドロゲンレセプターはチロシンキナーゼＳｒｃと相互作用をして、「インビ
トロ」で前立腺癌および乳癌細胞増殖を誘導することが最近見出された（Ｃａｓｔｏｒｉ
ａら、１９９９年；Ｍｉｇｌｉａｃｃｉｏら、１９９６年；２０００年；２００５年）。

ＷＯ９８／４６２５０は、大部分がＬｅｕモチーフにより特徴付けられる抗エストロゲ
ンホスホチロシンまたはマロニルチロシンペプチドを開示している。本発明はそのような
分子には言及していない。

ＷＯ００／０１８１３は、ヒトアンドロゲンレセプターのアミノ酸２３４〜３９１由来
のペプチドを開示している。開示されたペプチドの一部は本発明の分子とある程度配列類
似性を共有しているが、先行技術文献は、ＡＲ／Ｓｒｃ結合／活性化経路に関してそのよ
うなペプチドのアンタゴニスト活性を開示してはいない。さらに、ＷＯ００／０１８１３
に開示されたペプチドは、前立腺または乳房腫瘍細胞増殖を減少させまたは遮断すること
が明らかにされていない。前記ペプチドは本当の適用可能な抗腫瘍活性を発揮することが
明らかにされていない。

したがって、前立腺癌療法と乳癌療法の両方においてアンドロゲンレセプター／Ｓｒｃ
会合および新しい種類の化合物の発現を無効にするよう標的されたペプチドを提供する必
要性が存在する。

本発明は、前立腺癌および乳癌の治療において使用される新規の組成物および方法を提
供することにより先行技術に固有の落とし穴を克服する。本発明は、新規の合成ペプチド
を提供し、これはヒト前立腺および／または乳癌療法もしくは予防において使用される抗
アンドロゲンレセプター活性を示す。これらのペプチドはプロリンストレッチを含有して
おり、これはＡＲとチロシンキナーゼＳｒｃ（Ｍｉｇｌｉａｃｃｉｏら、２０００年）お
よび、潜在的には他のＳｒｃファミリーキナーゼのＳＨ３ドメインとの相互作用において
主要な役割を果たしていると関係付けられてきた。前記ＳＨ３ドメインは５０〜７０アミ
ノ酸長であり、真核生物シグナル伝達および細胞骨格タンパク質において認識されること
が多い（Ｋａｙら、２０００年）。前記ドメインはプロリンリッチなペプチドに結合し、
そのような相互作用を通じて、キナーゼ活性の調節ならびに局在化および基質認識におい
て主要な役割を果たしている。各Ｓｒｃキナーゼファミリーメンバーはその配列中にＳＨ
３ドメインを有する。このファミリーのメンバーは９種類であり（Ｗｉｌｌｉａｍｓら、
１９９８年）、他のメンバーも将来同定される可能性がある。アゴニスト占有アンドロゲ
ン（agonist-occupied androgen）およびプロゲステロンレセプターは、ＳｒｃのＳＨ３
ドメインと相互作用をすることができることが報告されている（Ｍｉｇｌｉａｃｃｉｏら
、２０００年；Ｂｏｏｎｙａｒａｔａｎａｋｏｒｎｋｉｔら、２００１年）。これらの会
合体はおそらくＳＨ３ドメインの阻害作用を取り除きＳｒｃ活性化を始動させる。したが
って、本発明に開示されるペプチドは、ＳｒｃのＳＨ３ドメインに結合し、ＡＲがＳｒｃ
と相互作用しシグナル伝達を活性化するのを阻止する。アンドロゲンとエストラジオール
レセプター（ＥＲ）は基本条件下で会合することが報告されている（Ｍｉｇｌｉａｃｃｉ
ｏら、２００５年）：前記２つのレセプターのうちの１つが、ステロイドアゴニストまた
は成長因子のいずれかにより活性化されると、前記２つのレセプターはＳｒｃと相互作用
をする。したがって、ＳｒｃとのＡＲ会合が阻止されると、このキナーゼとのＥＲ会合が
阻止され、ＥＲによるＳｒｃ活性化も阻止される。従って、本明細書に開示されるペプチ
ドは抗エストロゲン作用も有する。

本発明は、一般式：
によって示され、単離または精製または部分精製された状態のペプチド由来分子を提供す
る。
（式中、Ｘは、Ｈ、アセチル基もしくは任意の天然アミノ酸であるか、または遊離ＮＨ_２
基もしくは少なくともアセチル誘導体化ＮＨ_２基の付いたアミノ酸の配列であり、Ｙは、
ＯＨ基、ＮＨ_２基もしくは任意のアミノ酸であるか、またはＣ末端カルボキシ−アミド基
を有するアミノ酸の配列であり、「ｎ」は１〜１０の整数であり、「ｍ」は１〜３のうち
の整数である）

前記ペプチド由来分子は、アンドロゲンレセプター（ＡＲ）とチロシンキナーゼＳｒｃ
のＳＨ３ドメインとの相互作用を阻害または阻止することができる。

前記ペプチド由来分子は、インビトロまたはインビボで抗腫瘍活性を有する。

これらのペプチドの追加の変異体も本開示の対象である。実際、式Ｓ１で示される化合
物に由来し、類似の生物学的機能を果たすことができる化合物は、開示された直鎖状ペプ
チドの配列の２倍体化、３倍体化、またはもっと一般的には、多量体化のいずれによって
でも達成し、考案する（または誘導する）ことができる。例として、複数抗原ペプチドの
調製のためにＴａｍと共同研究者により報告される方法（ＴａｍとＳｐｅｔｚｌｅｒ Ｊ
Ｃ、１９９７年）、または鋳型集合合成タンパク質の調製のためにＭｕｔｔｅｒと共同研
究者により報告されている方法（ＴＡＳＰ、ＴｕｃｈｓｃｈｅｒｅｒとＭｕｔｔｅｒ、１
９９６年）に従って本発明のペプチドを改変してもよい。

こうして得られた分子は、トリフルオロ酢酸塩、酢酸塩、塩化水素塩、硫酸塩または当
業者が一般に使用している常用緩衝液に溶解することにより導き出される他のあらゆる塩
として、本出願の目的で使用することができる。本出願に開示されたポリペプチド配列の
例は表１に収載された配列である。

一実施形態では、本発明は、約４〜約３０程度のアミノ酸残基長の単離されたペプチド
であって、前記ペプチドはその配列内に一般式Ｓ１で示されるペプチドを含んでおり、各
アミノ酸はそのいかなる誘導体または類似体によっても置き換えることができるペプチド
を含む組成物に関する。

第２の実施形態では、本発明は、１０〜約５０程度のアミノ酸残基長の単離されたペプ
チドであって、前記ペプチドはその配列内に、
Pro-Pro-Pro-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys（配列番号１）
により表わされるアミノ酸配列を含み、各アミノ酸はそのいかなる誘導体または類似体に
よっても置き換えることができるペプチドを含む組成物に関する。

第３の実施形態では、本発明は、１２〜約５０程度のアミノ酸残基長の単離されたペプ
チドであって、前記ペプチドはその配列内に、
Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys（配列番号２）
により表わされるアミノ酸配列を含み、各アミノ酸はそのいかなる誘導体または類似体に
よっても置き換えることができるペプチドを含む組成物に関する。

第４の実施形態では、本発明は、１４〜約５０程度のアミノ酸残基長の単離されたペプ
チドであって、前記ペプチドはその配列内に、
Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys（配列番号３）
により表わされるアミノ酸配列を含み、各アミノ酸はそのいかなる誘導体または類似体に
よっても置き換えることができるペプチドを含む組成物に関する。

第５の実施形態では、本発明は、１６〜約５０程度のアミノ酸残基長の単離されたペプ
チドであって、前記ペプチドはその配列内に、
Gly-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys（配列番号４）
により表わされるアミノ酸配列を含み、各アミノ酸はそのいかなる誘導体または類似体に
よっても置き換えることができるペプチドを含む組成物に関する。

好ましいペプチド組成物は、細胞増殖に関するアンドロゲンレセプター活性を減少させ
るかまたは阻害する組成物である。この減少または阻害は、Ｓｒｃキナーゼ（ＳＨ３−バ
インダーペプチド（複数可））とのＡＲ相互作用を減少させるまたは無効にすることによ
り実現されることが発明者により明らかにされている。好ましくは、ペプチド組成物は７
と約５０程度のアミノ酸残基長由来であり、長さが１０アミノ酸から、約５５、５０、４
５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１４、１３または１２もしくは１１程度（同
値を含む）までのアミノ酸を有するようなペプチドをすべて含んでいてよい。

約１０、１２、１４、１６アミノ酸の例となるペプチドは、ＡＲ活性およびＤＮＡ合成
を低下させるのに特に有効であることが実証されている。そのような例となるペプチドは
、配列番号１から配列番号６の配列に開示されている。

本発明のペプチドは、随意に、開示されたペプチドのアミノ末端に１つもしくは複数の
アミノ酸、またはカルボキシ末端に１つもしくは複数のアミノ酸をさらに含んでいてよく
、あるいは代わりに、開示された抗アンドロゲンモチーフの両末端に１つまたは複数のア
ミノ酸をさらに含んでいてよい。そのようなアミノ酸は天然アミノ酸、アミノ酸誘導体、
または置換されたアミノ酸でもよく、ペプチドの一次アミノ酸配列の全長を、本明細書に
記載するＡＲ−Ｓｒｃ相互作用に関与するＡＲモチーフのアミノ末端、カルボキシ末端、
または両末端のいずれかで５、１０、１５、２０、又は２５程度の追加のアミノ酸だけ伸
長するものであってもよい。

したがって、好ましいペプチドの全長は、本明細書に開示するペプチドである限り、５
０、６０、７０、８０、９０、もしくは１００程度、またはそれ以上のアミノ酸（同値を
含む）まで及ぶものであってもよい。配列番号１から配列番号６までに示される配列のど
れかを含む、約７または約１０から、約１００程度（同値を含む）までのアミノ酸長の単
離されたペプチドが好ましい。前記ペプチド構造の重要な部分を模倣するよう立体的に類
似する他の化合物を考案してよいこと、およびこれらの化合物は、癌、特に前立腺および
乳房細胞癌の治療における本発明のペプチドと同じ用途を有している可能性があることも
、本発明は企図している。

本発明のペプチドは、少なくとも５つ以上の残基を含むと特徴付けてもよく、その配列
内に少なくとも２つ以上のプロリン残基を含む。

前記ペプチドは、Ｌ−アミノ酸（複数可）に代わりに１つまたは複数のＤ−アミノ酸（
複数可）を用いるか、または例えば、アシル化、アセチル化、またはアミノ化によりＮ末
端またはＣ末端に残基を付加することにより、治療での使用のために改変してよい。前記
ペプチドは、脂質、ナノカプセル、脂質複合体および／またはリポソーム内に被包するこ
ともできる。その上、前記ペプチドは徐放のために被膜カプセルに組み込むことができる
。

本発明のペプチド由来分子は、抗腫瘍剤として、好ましくは抗乳癌剤もしくは抗前立腺
癌剤として、またはアンドロゲンレセプターを単独でもしくはエストラジオールレセプタ
ーとともに発現している他の癌に対して使用してよい。

上記のペプチド由来分子を医薬的に許容可能かつ有効な量で含む薬剤組成物は、本発明
の目的である。

好ましい実施形態では、前記組成物において、ペプチドはＢＳＡもしくはＫＬＨなどの
担体分子に連結されており、かつ／または脂質粒子、ナノカプセル、リポソームもしくは
脂質ベシクルなどの脂質組成物中に医薬品賦形剤と共に含まれる。好ましくは、前記組成
物は少なくとも第２の抗癌剤をさらに含む。

本発明のペプチドは、薬物、またワクチンの調製のための、アンドロゲンレセプターペ
プチドに特異的に結合する抗体の調製にも使用してよい。

本発明の別の目的は、前記ペプチド由来分子を特異的に認識することができる抗体であ
る。

本発明の追加の態様は、ポリヌクレオチドもしくは組換えベクター、または本明細書に
開示する１つまたは複数のペプチド、ポリヌクレオチドもしくは組換えベクター組成物を
含む宿主細胞である。これらのそれぞれは、抗癌製剤の調製にも使用してよい。

本発明は、非経口、筋肉内、静脈内注射または経口、経鼻、もしくは局所的投与に適し
た１つまたは複数の開示された抗エストロゲンペプチド組成物を含むキットを提供する。
前記キットは、１つもしくは複数の追加の薬物、ペプチド模倣薬、または他の薬剤を含ん
でいてよい。前記ペプチドは、ワクチンまたは抗体の調製に使用してよい。

別の実施形態では、本発明は、細胞に一定量の抗アンドロゲンペプチドを与えて、細胞
中でアンドロゲンレセプター活性を減少させるための方法を提供する。前記細胞は培養さ
れていても、前立腺癌または乳癌などの癌と診断されている動物中に含まれていてもよい
。

本発明は、アンドロゲンレセプター／Ｓｒｃ会合を減少させるための方法も提供する。
本発明の追加の実施形態は、動物における癌の治療方法を提供する。この方法は、一般に
、前立腺癌または乳癌などの癌に罹った動物を同定すること、および、賦形剤またはリポ
ソームまたは他の脂質担体に処方されてもよい、ならびに従来のいずれかの送達手段を通
じた投与のために調製してよい抗アンドロゲンペプチド組成物を治療有効量で前記動物に
投与することを含む。

本発明は、治療有効量の抗エストロゲンペプチドを与えて、好ましくは動物内に含まれ
る腫瘍細胞を死滅させる方法も提供する。前記方法は、一般に、癌を有すると疑われる動
物を同定し、治療有効量の抗アンドロゲンペプチドを動物に投与することを含む。本発明
の製剤は、腫瘍細胞発生の予防に使用してもよい。

抗アンドロゲンペプチドの組成
本発明は、精製された、および好ましい実施形態では、実質的に精製された、抗癌特性
を有するプロリンリッチなペプチド誘導体を提供する。本明細書で使用する用語「精製さ
れたペプチド」は、前記ペプチドリッチなペプチドが、その天然に入手可能な状態と比べ
てどんな程度であれ精製されているタンパク質組成物に言及することを意図する。したが
って、精製されたペプチドまたはペプチドは、そのペプチドまたはタンパク質が天然に存
在する環境から遊離しているペプチドまたはタンパク質にも言及する。

一般に、「精製された」は、種々の非ペプチド誘導体成分を除去するために分画にかけ
られたペプチド組成物に言及することになる。

用語「実質的に精製された」が使用される場合、この用語は、ペプチドが組成物の主要
成分を形成する組成物（例えば、組成物中のタンパク質の約５０％以上を構成するなど）
に言及する。好ましい実施形態では、実質的に精製されたタンパク質は、組成物の６０％
、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％を超えるか、または９９．９％以上を構成す
ることになる。

本発明に適用される「均質に精製され」ているポリペプチドまたはタンパク質とは、前
記ポリペプチドまたはタンパク質に他のタンパク質および生物学的成分が実質的に含まれ
ない純度を前記ポリペプチドまたはタンパク質が有することを意味する。例えば、精製さ
れたポリペプチドは、分解性配列決定を十分うまく実施できる程度に他のペプチド成分が
含まれない場合が多い。

本発明は、一般式Ｓ１から誘導されるアミノ酸配列を含む、約５０程度までのアミノ酸
を含むペプチドを含む、少なくとも４以上の残基長の単離されたペプチドといった、プロ
リンリッチなペプチド誘導体に特に関係している。好ましくは、これらのペプチドはＳｒ
ｃ−ＳＨ３ドメインへのＡＲ会合を阻害し、ヒトなどの罹患動物における腫瘍ならびに前
立腺癌および乳癌の治療に活性である。治療法における小ペプチドの使用は種々の理由で
好ましい。これらの理由には、大規模調製の低コストおよび容易さ、ならびに産物の信頼
性が挙げられる。その上、ペプチドが容易に組織を浸透できること、その低い免疫原性、
ペプチドがプロテアーゼに比較的小さな標的を提示するために比較的長いバイオアベイラ
ビリティを与えるという事実から、その生物学的特性は好ましいものであり、さらにペプ
チドがＡＲ−Ｓｒｃ相互作用の防止に有効に機能して、抗アンドロゲン治療法として機能
することが予測される。

しかし、ある種の実施形態での使用には好ましいかもしれないが、プロリンリッチなＳ
Ｈ３バインダーペプチドは常にその最も精製された状態で提供されることは一般的に要求
されない。この点に関して、十分なレベルのペプチド純度が達成される限り、当業者に公
知のどんな精製方法でも用いることができる。

例えば、Ｌ−アミノ酸の代わりに１つもしくは複数のＤ−アミノ酸を用いることにより
、アシル化もしくはアミノ化などでＮ末端もしくはＣ末端に基を付加することにより、あ
るいは、脂質、ナノカプセル、脂質複合体および／もしくはリポソーム内に、または徐放
のために設計された生体適合性被膜中にペプチドを被包することにより、合成ペプチドを
改変することができる。本発明は、能動免疫と受動免疫の両方において使用するためのワ
クチンを企図している。これらのワクチンは、本明細書に開示する形で調製される免疫原
性ペプチドから、最も迅速に調製できる。

核酸セグメント
本発明は、ほとんどどんな供給源からも単離することができ、全ゲノムＤＮＡから遊離
しており、本明細書に開示する新規のペプチドの全体または一部をコードするＤＮＡセグ
メントにも関する。新規のペプチド種をコードするポリヌクレオチドは、当業者に公知の
方法を使用して完全にインビトロで合成できる。

用語「ＤＮＡセグメント」に含まれるのは、ＤＮＡセグメントおよびそのようなセグメ
ンとのさらに小さなフラグメント、ならびにプラスミド、コスミド、ファージミド、ファ
ージおよびウイルスなどを含む組換えベクターである。

同様に、単離されたまたは精製された抗アンドロゲンペプチドコード遺伝子を含むＤＮ
Ａセグメントは、ペプチドコード配列に加えて、他の天然に存在する遺伝子またはタンパ
ク質コード配列から実質的に単離された、調節配列などのある種の他のエレメントを含ん
でいる可能性のあるＤＮＡセグメントに言及する。この点に関して、用語「遺伝子」は、
単純化のため、機能的タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドをコードするユニッを
言及するのに使用される。当業者であれば理解するように、この機能的用語には、余分な
染色体ＤＮＡ配列を含むゲノム配列だけではなく、オペロン配列および／あるいは、タン
パク質、ポリペプチドもしくはペプチドを発現する、または発現するように適応させるこ
とができる工学的に改変された遺伝子セグメントも含まれる。

「他のコード配列から実質的に単離された」は、対象の遺伝子、この場合は、抗アンド
ロゲンポリペプチド遺伝子が前記ＤＮＡセグメントのコード領域のかなりの部分を形成す
ること、および、前記ＤＮＡセグメントが、大きな染色体フラグメントまたは他の機能的
遺伝子またはオペロンコード領域などの天然に存在するコードＤＮＡの大きな部分を含有
していないことを意味する。当然のことながら、これは最初に単離されているＤＮＡセグ
メントに言及しているが、後に人の手により該セグメントに付加される遺伝子、組換え遺
伝子、合成リンカー、またはコード領域を除外するものではない。

特定の実施形態では、本発明は、そのアミノ酸配列内に一般式Ｓ１に、またはポリペプ
チド配列番号１〜配列番号６の例に記載されたアミノ酸配列のいずれかを含む抗エストロ
ゲンペプチド種をコードするＤＮＡ配列を組み込んでいる単離されたＤＮＡセグメントお
よび組換えベクターに関する。さらに好ましくは、前記ＤＮＡ配列は、そのアミノ酸配列
内に、一般式Ｓ１にまたはペプチド配列番号１〜配列番号６に記載されたアミノ酸配列に
隣接する少なくとも１０アミノ酸配列を含む抗アンドロゲンペプチド種をコードする核酸
配列を含む。

用語「一般式Ｓ１にまたはポリペプチド配列番号１〜配列番号６の例に実質的に記載さ
れた配列」とは、配列が一般式Ｓ１またはポリペプチド配列番号１〜配列番号６の例の配
列の一部に実質的に一致しており、これらの配列のいずれかのアミノ酸と同一ではない比
較的少数のアミノ酸または生物学的機能上の等価物を有することを意味する。用語「生物
学的機能上の等価物」は当技術分野ではよく理解されており、本明細書においてさらに詳
細に定義されている。したがって、配列番号１〜配列番号６のいずれか１つのアミノ酸配
列に対して約７０％と約８０％の間、またはさらに好ましくは約８１％と約９０％の間、
またはさらに好ましくは約９１％と約９９％の間のアミノ酸配列同一性を有する配列もし
くは機能的同等性を有する配列である。

したがって、配列番号１〜配列番号６のいずれか１つのアミノ酸配列に対して約７０％
と約８０％の間、またはさらに好ましくは約８１％と約９０％の間、またはさらに好まし
くは約９１％と約９９％の間のアミノ酸配列同一性を有する配列もしくは機能的同等性を
有する配列は、配列番号１〜配列番号６のいずれか１つに実質的に記載されている配列に
なる。

アミノ酸および核酸配列は、追加のＮ末端もしくはＣ末端のアミノ酸などの追加の残基
、または５’もしくは３’配列を含んでいてもよいが、この配列がペプチド発現に関して
生物学的抗アンドロゲン活性の維持を含む上記の基準を満たす限り、本明細書に開示する
配列のうちの１つに実質的に記載されている可能性があることも理解されるであろう。末
端配列の付加は、例えば、コード領域の５’もしくは３’部分のどちらかに隣接する種々
の非コード配列を含んでもよく、または遺伝子内に存在することが分かっている種々の内
部配列、すなわちイントロンを含んでもよい核酸配列に特に当てはまる。

本発明の核酸セグメントは、コード配列それ自体の長さとは無関係に、プロモーター、
ポリアデニル化シグナル、追加の制限酵素部位、マルチプルクローニングサイト、他のコ
ードセグメント、およびその同類のものなど他のＤＮＡ配列と組み合わせてよく、それに
よってその全長がかなり変化してもよい。したがって、ほとんどどんな長さの核酸フラグ
メントを用いてもよく、全長は好ましくは意図される組換えＤＮＡプロトコルにおける調
製および使用の容易さにより制限されることが企図されている。例えば、配列番号１およ
び／または配列番号２に開示されたペプチド配列の全体もしくは一部をコードする短い隣
接ストレッチを含む、あるいは配列番号１および配列番号２に開示されたペプチドのいず
れかをコードするＤＮＡ配列と同一または相補的な核酸フラグメントを調製してよい。例
えば、約３０ヌクレオチドなどの、および約１０，０００以下、約５，０００以下、約３
，０００以下、約２，０００以下、約１，０００以下、約５００以下、約２００以下、約
１００以下、約５０以下、および約３０以下の塩基対長（その中間の長さすべてを含む）
であるＤＮＡ配列も有用であると予期される。

本発明は、本発明のペプチドをコードする、または配列番号１〜配列番号６のアミノ酸
配列をコードする特定の核酸配列に限定されるものではないことも理解されるであろう。

したがって、組換えベクターおよび単離されたＤＮＡセグメントは、ペプチドコード領
域それ自体、基本的コード領域に選択された改変物もしくは修飾物を含むコード領域を多
様に含んでよく、あるいは、組換えベクターおよび単離されたＤＮＡセグメントは、やは
りこれらのペプチドコード領域を含む比較的大きなポリペプチドをコードしてもよく、ま
たは変異アミノ酸配列を有する生物学的機能が等価のタンパク質もしくはペプチドをコー
ドしていてもよい。

本発明のＤＮＡセグメントは、生物学的機能が等価のペプチドを包含する。そのような
配列は、コドン重複性および機能的等価性の結果として生じる可能性があり、このような
コドン重複性および機能的等価性は、核酸配列および従ってこれにコードされるタンパク
質内に自然に存在することが分かっている。代わりに、機能的に等価なタンパク質または
ペプチドは、置換されるアミノ酸の特性についての考察に基づいて、タンパク質構造の変
化が工学的に作り出される組換えＤＮＡ技術の適用を介して作製してよい。部位特異的突
然変異誘発技術の適用により人が設計する変化を導入して、例えば、タンパク質の抗原性
に改善点を導入するか、または分子レベルで活性を調べるために突然変異体を試験するこ
ともできる。

必要であれば、例えば、ペプチドコード領域が同一発現ユニット内で、精製または免疫
検出目的などの所望の機能を有する他のタンパク質またはペプチドと並べられる、融合タ
ンパク質およびペプチドを調製してもよい。

組換えベクターは、本発明の追加の態様を形成する。特に有用なベクターは、ＤＮＡセ
グメントのコード部分が、完全長タンパク質をコードしていてももっと小さなペプチドを
コードしていても、プロモーターの制御下に位置付けられるベクターであると予期される
。プロモーターは、コードセグメントもしくはエクソンの上流に位置している５’非コー
ド配列を単離することにより得られる可能性があるので、本発明のペプチドをコードする
遺伝子と天然に結合しているプロモーターの形でよい。

ハイブリダイゼーションプローブおよびプライマーとしてのＤＮＡセグメント
本発明のペプチドの発現における使用に加えて、本明細書で企図される核酸配列は種々
の他の使用も有する。

例えば、前記核酸配列は、核酸ハイブリダイゼーションの実施形態においてプローブま
たはプライマーとしての有用性も有する。

そのような核酸プローブは、抗アンドロゲンペプチドコード化配列に特異的にハイブリ
ダイズするその能力のおかげで、所与の試料中の相補的配列の存在を検出する際に有用と
なり得る。しかし、突然変異種プライマー、または他の遺伝子構築物の調製における使用
のためのプライマーの調製のための配列情報の使用を含む他の使用が想定されている。

１０〜１４、１５〜２０、３０、５０、もしくは１００〜２００ヌクレオチド程度の隣
接ヌクレオチドストレッチからなる配列領域を有する核酸分子は、開示されたポリペプチ
ドをコードするＤＮＡ配列に対して同一でも相補的でも、特に、例えば、サザンおよびノ
ーザンブロッティングにおいて使用するためのハイブリダイゼーションプローブとして企
図されている。小さいフラグメントほど、隣接する相補的領域の長さが、約１０〜１４と
約１００〜２００ヌクレオチドの間など変化してもよいハイブリダイゼーション実施形態
においては一般に有用であるが、検出を望む相補的配列の長さ次第では比較的大きな隣接
する相補的ストレッチを使用してもよい。

約１４ヌクレオチド長のハイブリダイゼーションプローブを使用すれば、安定でありか
つ選択的である二重鎖分子の形成が可能になる。しかし、ハイブリッドの安定性および選
択性を増加させ、それによって、得られる特定のハイブリッド分子の質と程度を改善する
ためには、１４塩基長よりも大きなストレッチに及ぶ隣接する相補的配列を有する分子が
一般には好ましい。１５〜２０隣接ヌクレオチド、または必要であればさらに長い遺伝子
相補的ストレッチを有する核酸分子を設計する方が一般に好まれるであろう。

ある種の実施形態では、本発明の核酸配列を、ハイブリダイゼーションを判定するため
に、標識などの適切な手段と組み合わせて用いるのが有利であろう。検出シグナルを出す
ことができる蛍光、放射性、酵素的またはアビジン／ビオチンなどの他のリガンドを含む
、多種多様な適切な指示手段は当技術分野では公知である。好ましい実施形態では、放射
性または他の環境に好ましくない試薬の代わりに、蛍光標識またはウレアーゼ、アルカリ
ホスファターゼもしくはペルオキシダーゼなどの酵素タグを用いることがおそらく好まれ
るであろう。酵素タグの場合、相補的核酸含有試料との特異的ハイブリダイゼーションを
同定するために、比色指示基質を用いてヒトの目または分光光度計で検出可能な手段を提
供できることは公知である。

一般に、本明細書に記載するハイブリダイゼーションプローブは、溶液ハイブリダイゼ
ーションにおける試薬としても、ならびに固相を用いる実施形態においても有用であろう
と想定される。固相を含む実施形態では、試験ＤＮＡ（またはＲＮＡ）は選択されたマト
リックスまたは表面に吸着されるか、別の方法で付着される。次に、この固定された１本
鎖核酸は、望ましい条件下で選択されたプローブとの特異的ハイブリダイゼーションにか
けられる。選択された条件は、要求される特定の基準に基づく特定の状況に依拠すること
になる（例えば、Ｇ＋Ｃ含有量、標的核酸の種類、核酸の供給源、ハイブリダイゼーショ
ンプローブの大きさ、等に依拠する）。

組換えベクターおよびポリペプチド発現
本発明は、開示された抗アンドロゲンペプチドのいずれかを含む組成物も開示し、クレ
ームする。前記組成物は、抗アンドロゲンペプチドをコードする核酸セグメントを発現す
る１つもしくは複数の宿主細胞、前記ペプチドもしくは前記ペプチドを含む融合タンパク
質を発現する組換え宿主細胞、開示された抗アンドロゲンペプチドを含有する細胞懸濁液
、細胞抽出物、細胞封入体、または組織培養物もしくは培養抽出物、培養上清、破壊細胞
、細胞抽出物、細胞溶解物、細胞ホモジネート等に含まれていてもよい。前記組成物は、
水性形でも、代わりに、乾燥、半湿潤、もしくは細胞ペースト、細胞ペレットなどの類似
の形でも、代わりに、フリーズドライ化、粉末化、凍結乾燥、蒸発、または類似の方法で
乾燥した形をしてもよい。抗アンドロゲンペプチドを調製するためのそのような手段は、
タンパク質単離および精製の分野の当業者には公知である。ある種の実施形態では、抗ア
ンドロゲンペプチドは、精製しても、濃縮しても、他の試薬と混合しても、または目的の
最終的な形まで加工してもよい。好ましくは、前記組成物は、抗アンドロゲンペプチドを
約１重量％から約９０重量％の範囲で、さらに好ましくは、約５重量％から約５０重量％
の範囲で含むことになる。

好ましい実施形態では、本発明の抗アンドロゲンペプチド組成物は、そのようなペプチ
ドを産生するのに有効な条件下で抗アンドロゲンペプチドを発現する宿主細胞を培養し、
次に前記細胞から該ペプチドを得る段階を含むプロセスにより調製してよい。そのような
抗アンドロゲンペプチドを得ることは、前記ポリペプチドを精製したり、濃縮したり、加
工したり１つまたは複数の試薬内に混合することをさらに含んでもよい。好ましくは、抗
アンドロゲンペプチドは、約１重量％から約９０重量％の範囲で、さらに好ましくは、約
５重量％から約７０重量％の範囲で、より好ましくは、約１０重量％から約２０重量％か
ら約３０重量％、または約４０重量％もしくは５０重量％までの量で得られる。

本発明は、抗アンドロゲンペプチド組成物を調製する方法にも関する。そのような方法
は、一般に、前記ペプチドを産生するのに有効な条件下で抗アンドロゲンペプチドを発現
する宿主細胞を培養し、次にそのようにして産生されたポリペプチドを得る段階を含む。

本発明の組換えプラスミドベクターを使用して、他の適切な細菌または真核細胞を形質
転換して本発明の抗アンドロゲンポリペプチドを産生してよい。

ＮＩＨ３Ｔ３、ＣＯＳ７、およびＣＡＯＶ３を含む真核宿主細胞、ならびに酵母細胞は
、本発明のペプチド種の調製に特に有用であると予期される。同様に、大腸菌、シュード
モナス属種および関連する腸内細菌などのグラム陰性細胞を含む原核宿主細胞はすべて、
本発明の抗アンドロゲンペプチドの調製に有用であると予期される。

そのような実施形態では、コードＤＮＡセグメントを組換えまたは異種プロモーターの
制御下に位置付けることによりある種の利点が得られることが予期される。本明細書で使
用するように、組換えまたは異種プロモーターは、その自然環境において抗アンドロゲン
ペプチドをコードするＤＮＡセグメントとは通常は結合されていないプロモーターに言及
することを意図している。そのようなプロモーターは、通常は他の遺伝子と結合している
プロモーター、および／または任意の細菌、ウイルス、または真核細胞から単離されたプ
ロモーターを含んでいてよい。好ましい真核細胞は動物細胞であり、哺乳動物細胞、特に
ヒト細胞が最も好ましい。当然ながら、発現のために選ばれた細胞種、組織、生物、動物
、または組換え宿主細胞において前記ＤＮＡセグメントを有効に発現させるプロモーター
を用いることが重要になる。タンパク質発現のためのプロモーターと細胞型の組合せの使
用は、分子生物学の分野の当業者には一般に公知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、
１９８９年を参照されたい。用いるプロモーターは、構成的でも、誘導性でもよく、適切
な条件下で使用すれば、導入されたＤＮＡセグメントを高レベルで発現させることができ
、例えば、組換えタンパク質またはペプチドの大規模生産に有利である。

治療および診断用キット
本発明の治療キットは、本明細書に開示されるプロリンリッチなペプチドを含むタンパ
ク質、ペプチド、阻害剤、遺伝子、ベクターまたは他のペプチド結合タンパク質エフェク
ターを含むキットである。そのようなキットは、一般に、許容可能な製剤中に本明細書に
開示されるプロリンリッチなペプチドを含むタンパク質、ペプチド、阻害剤、遺伝子、ベ
クターもしくは他のペプチド結合タンパク質エフェクター、または、これらのいずれかを
発現させるベクターを含有する許容可能な製剤を適切な収容手段で含み、随意に他の抗癌
剤を含んでいてもよい。キットは、単一の容器手段を有してもよく、化合物ごとに別々の
容器手段を有してもよい。

キットの成分が１つまたは複数の液体溶液で提供される場合、前記液体溶液は水溶液で
あり、減菌水溶液が特に好ましい。前述の組成物は注入可能な組成物に処方してもよい。
この場合、容器手段それ自体が注射器、ピペット、または他のそのような器具でもよく、
これらの器具から製剤が身体の感染部位に適用されても、動物に注入されても、またはキ
ットのその他の成分に適用され、混合されてもよい。

しかし、キットの成分は、乾燥粉末として提供されてよい。試薬または成分が乾燥粉末
として提供される場合、その粉末は適切な溶剤を添加することにより再溶解することがで
きる。前記溶剤は別の容器手段で提供されてもよいと想定されている。第２の抗癌治療薬
が提供されるところでは、前記キットは一般に第２の容器を含有する。前記キットは許容
可能な希釈剤のための別の容器を含んでいてもよい。

核酸送達およびＤＮＡトランスフェクションの方法
ある種の実施形態では、本明細書に開示する核酸セグメントを使用して適切な宿主細胞
をトランスフェクトすることが企図されている。ＤＮＡを細胞に導入するための技術は当
業者には公知である。核セグメントを細胞に送達するための４種類の一般的方法としては
は、
（１）化学的方法（ＧｒａｈａｍとＶａｎＤｅｒＥｂ、１９７３年）
（２）マイクロインジェクション（Ｃａｐｅｃｃｈｉ、１９８０年）、エレクトロポレ
ーション（ＷｏｎｇとＮｅｕｍａｎｎ、１９８２年；Ｆｒｏｍｍら、１９８５年）および
遺伝子銃（Ｙａｎｇら、１９９０年）などの物理的方法
（３）ウイルスベクター（Ｃｌａｐｐ、１９９３年；Ｅｇｌｉｔｉｓら、１９８８年；
ＥｇｌｉｔｉｓとＡｎｄｅｒｓｏｎ、１９８８年）、ならびに
（４）レセプター媒介機構（Ｃｕｒｉｅｌら、１９９１年；Ｗａｇｎｅｒら、１９９２
年）
が考えられる。

リポソームおよびナノカプセル
ある種の実施形態では、発明者は、ペプチド組成物を宿主細胞に導入するためのリポソ
ームおよび／またはナノカプセルの使用を企図している。そのような製剤は、本明細書に
開示するポリペプチド、医薬品、および／または抗体の医薬的に許容可能な製剤の導入に
好ましいものであろう。リポソームの形成および使用は、一般に当業者には公知である（
例えば、細胞内細菌感染および疾病の標的抗体療法におけるリポソームおよびナノカプセ
ルの使用を記載している、Ｃｏｕｖｒｅｕｒら、１９７７年を参照）。さらに最近では、
血清安定性および循環半減時間が改良されたリポソームが開発された（Ｇａｂｉｚｏｎと
Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ、１９８８年；ＡｌｌｅｎとＣｈｏｕｎ、１９８７年）
。

図は本明細書の一部を形成し、本発明のある種の態様をさらに実証するために含まれる
。本発明は、本明細書に示される特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて１つまたは
複数のこれらの図を参照することによりさらによく理解される。

図１Ａ：ＡＲをモデルにしたＳｒｃ−ＳＨ３バインダーペプチド（配列番号１）によるヒト前立腺癌細胞のＤＮＡ合成阻害を示す図である。ヒト前立腺癌由来のＬＮＣａＰ細胞を、先の文献（Ｍｉｇｌｉａｃｃｉｏら、２０００年）の記載に沿って活性炭処理した血清を添加したフェノールレッド無添加培地で増殖させ、１０ｎＭ Ｒ１８８１合成アンドロゲンだけで、または１０００倍過剰量の抗アンドロゲンＣａｓｏｄｅｘ、もしくは１ｎＭのＳＨ３−バインダーペプチド（ＳＨ３、配列番号１）、もしくは１ｎＭ Ｓｓ（シャッフル配列：配列番号７）ペプチドの存在下で１０ｎＭ Ｒ１８８１合成アンドロゲンで２４時間処理した。ホルモン処理の終了時に、未処理の細胞（対照）あるいはＲ１８８１だけで（Ｒ１８８１）、またはｃａｓｏｄｅｘ（Ｃｄｘ）、もしくはＳＨ３バインダーペプチド（ＳＨ３、配列番号１）、もしくはペプチド配列番号１のシャッフル配列（Ｓｓ、配列番号７）の存在下でＲ１８８１で処理した細胞へのＢｒｄＵ取込みを、報告された通り（Ｃａｓｔｏｒｉａら、１９９９年）に評価した。データは、ＢｒｄＵを取り込んだ細胞の割合として６回の実験の平均値を求めて示している。 図１Ｂ：ＡＲ由来のＳＨ３バインダーペプチド（配列番号１）によるエストラジオール刺激ヒト乳癌細胞のＤＮＡ合成阻害を示す図である。ヒト乳癌由来ＭＣＦ−７細胞を、前述の通りに活性炭処理した血清を含有するフェノールレッド無添加培地で３日間維持し、１０ｎＭ １７βエストラジオールだけで、または１０００倍過剰量の抗エストロゲンＩＣＩ １８２，７８０、もしくは１ｎＭのＳＨ３バインダーペプチド配列番号１、もしくはペプチド配列番号１のシャッフル配列（Ｓｓ、配列番号７）の存在下で１０ｎＭ １７βエストラジオールで２４時間処理した。ホルモン処理の終了時に、未処理の細胞（対照）あるいはエストラジオールだけで（Ｅ２）、またはＩＣＩ １８２，７８０（ＩＣＩ）、もしくはＡＲ由来（ＳＨ３）、もしくはＳｓペプチドの存在下でエストラジオールで処理した細胞へのＢｒｄＵ取込みを評価した。データは、ＢｒｄＵを取り込んだ細胞の割合として６回の実験の平均値を求めて報告している。 図１Ｃ：ＡＲをモデルにしたＳＨ３バインダーペプチド（配列番号１）によるＥＧＦ−刺激ヒト前立腺癌細胞のＤＮＡ合成阻害を示す図である。ＬＮＣａＰ細胞を、前述の通りに活性炭処理した血清を添加したフェノールレッド無添加培地で増殖させ、１００ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦだけで、または１０μＭの抗エストロゲンＩＣＩ １８２，７８０、もしくは１ｎＭのＡＲ由来（ＳＨ３バインダー）ペプチド（配列番号１）、もしくはペプチド配列番号１のシャッフル配列（配列番号７）の存在下で１００ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦで２４時間処理した。成長因子処理の終了時に、未処理の細胞（対照）あるいはＥＧＦだけで（ＥＧＦ）、またはＩＣＩ １８２，７８０（ＩＣＩ）、もしくはＳＨ３−バインダー（ＳＨ３）、もしくはペプチド配列番号１のシャッフル配列（Ｓｓ）の存在下でＥＧＦで処理した細胞へのＢｒｄＵ取込みを評価した。データは、ＢｒｄＵを取り込んだ細胞の割合として報告している。 図１Ｄ：ＡＲをモデルにしたＳＨ３バインダーペプチド（配列番号１）によるＥＧＦ−刺激ヒト乳癌細胞のＤＮＡ合成阻害を示す図である。ＭＣＦ−７細胞を、前述の通りに活性炭処理した血清を添加したフェノールレッド無添加培地で増殖させ、１００ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦだけで、または１０μＭの抗エストロゲンＩＣＩ １８２，７８０、もしくは１ｎＭのＡＲ由来（ＳＨ３バインダー）ペプチド、もしくはペプチド配列番号１のシャッフル配列（配列番号７）の存在下で１００ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦで２４時間処理した。成長因子処理の終了時に、未処理の細胞（対照）あるいはＥＧＦだけで（ＥＧＦ）、またはＩＣＩ １８２，７８０（ＩＣＩ）、もしくはＳＨ３−バインダー（ＳＨ３）、もしくはペプチド配列番号１のシャッフル配列（Ｓｓ）の存在下でＥＧＦで処理した細胞へのＢｒｄＵ取込みを評価した。データは、ＢｒｄＵを取り込んだ細胞の割合として報告している。 図２Ａ：ＡＲ由来（Ｓｒｃ−ＳＨ３バインダー）ペプチド（配列番号１）によるＳｒｃとのアンドロゲン刺激ＡＲ会合の阻害を示す図である。ヒト前立腺癌ＬＮＣａＰ細胞を、無刺激のままにしておく、あるいは１０ｎＭ Ｒ１８８１だけで、または１０００倍過剰量のＣａｓｏｄｅｘ、もしくは１ｎＭのＳＨ３−バインダーペプチド、もしくはペプチド配列番号１のシャッフル配列（配列番号７）の存在下で１０ｎＭ Ｒ１８８１で２分間刺激しておいた。細胞ライセートは抗Ｓｒｃ抗体とともにインキュベートし、免疫沈降させたタンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロースフィルター上に移した。次に、フィルターは、抗Ｓｒｃまたは抗ヒトＡＲ抗体のいずれかでブロットしてＳｒｃに会合したＡＲを検出した。免疫複合体はＥＣＬ検出キットを使用して検出した。レーン１：無刺激細胞；レーン２：Ｒ１８８１処理細胞；レーン３：Ｃａｓｏｄｅｘ（Ｃｄｘ）の存在下Ｒ１８８１で処理した細胞；レーン４：ＳＨ３バインダーペプチド（ＳＨ３、配列番号１）の存在下Ｒ１８８１で処理した細胞；レーン５：ペプチド配列番号１のシャッフル配列（Ｓｓ、配列番号７）の存在下Ｒ１８８１で処理した細胞。 図２Ｂ：ＡＲ由来Ｓｒｃ−ＳＨ３バインダーペプチド（配列番号１）によるＳｒｃとのエストロゲン刺激ＡＲ会合の阻害を示す図である。ヒト乳癌ＭＣＦ−７細胞を、無刺激のままにしておく、あるいは１０ｎＭ １７βエストラジオールだけで、または１０００倍過剰量のＩＣＩ １８２，７８０、もしくは１ｎＭのＳＨ３−バインダーペプチド、もしくはペプチド配列番号１のシャッフル配列（配列番号７）の存在下で１０ｎＭ １７βエストラジオールで２分間刺激しておいた。細胞ライセートは抗Ｓｒｃ抗体とともにインキュベートし、免疫沈降させたタンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロースフィルター上に移した。次に、フィルターは、抗Ｓｒｃまたは抗ヒトＡＲ抗体のいずれかでブロットしてＳｒｃに会合したＡＲを検出した。免疫複合体はＥＣＬ検出キットを使用して検出した。レーン１：無刺激細胞；レーン２：エストラジオール（Ｅ２）処理細胞；レーン３：ＩＣＩ １８２，７８０（ＩＣＩ）の存在下Ｅ２で処理した細胞；レーン４：ＳＨ３バインダーペプチド（ＳＨ３）の存在下Ｅ２で処理した細胞；レーン５：ペプチド配列番号１のシャッフル配列（Ｓｓ）の存在下エストラジオールで処理した細胞。 図３Ａ：ＡＲ由来Ｓｒｃ−ＳＨ３バインダーペプチド（配列番号１）によるアンドロゲン誘導サイクリンＤ１発現の阻害を示す図である。静止ＭＣＦ−７およびＬＮＣａＰ細胞を未処理のままにしておく、あるいは１０ｎＭ Ｒ１８８１だけで、または５μＭ ＰＩ３−キナーゼ阻害剤ＬＹ２９４，００２、もしくは１ｎＭ ＡＲ由来ＳＨ３バインダー、もしくはペプチド配列番号１のシャッフル配列（配列番号７）の存在下で１０ｎＭ Ｒ１８８１で８時間処理しておいた。細胞ライセート由来タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、次にニトロセルロースフィルターに移した。内在性サイクリンＤ１は適切な抗体を使用して検出した。レーン１：無刺激細胞；レーン２：Ｒ１８８１処理細胞；レーン３：ＬＹ２９４，００２（ＬＹ）の存在下Ｒ１８８１で処理した細胞；レーン４：ＡＲ由来（ＳＨ３バインダー）ペプチド（ＳＨ３）の存在下Ｒ１８８１で処理した細胞；レーン５：ペプチド配列番号１のシャッフル配列（Ｓｓ）の存在下Ｒ１８８１で処理した細胞。 図３Ｂ：ＡＲ由来Ｓｒｃ−ＳＨ３バインダーペプチド（配列番号１）によるエストロゲン誘導サイクリンＤ１発現の阻害を示す図である。静止ＭＣＦ−７およびＬＮＣａＰ細胞を未処理のままにしておく、あるいは１０ｎＭ １７βエストラジオールだけで、または５μＭ ＰＩ３−キナーゼ阻害剤ＬＹ２９４，００２、もしくは１ｎＭのＳＨ３バインダー、もしくはペプチド配列番号１のシャッフル配列（配列番号７）の存在下で１０ｎＭ １７βエストラジオールで８時間処理しておいた。細胞ライセート由来タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、次にニトロセルロースフィルターに移した。内在性サイクリンＤ１は適切な抗体を使用して検出した。レーン１：無刺激細胞；レーン２：エストラジオール処理細胞；レーン３：ＬＹ２９４，００２（ＬＹ）の存在下エストラジオールで処理した細胞；レーン４：ＳＨ３バインダーペプチド（ＳＨ３）の存在下エストラジオールで処理した細胞；レーン５：ペプチド配列番号１のシャッフル配列（Ｓｓ）の存在下エストラジオールで処理した細胞。 図４Ａ：前立腺癌（ＬＮＣａＰ細胞）におけるアンドロゲンレセプター調節遺伝子転写に対するＡＲ由来（ＳＨ３バインダー）ペプチド（配列番号１）の無効性を示す図である。ＬＮＣａＰ細胞は、アンドロゲン応答性エレメント（ＡＲＥ３４１６）の制御下にあるルシフェラーゼ遺伝子をコードするレポーター遺伝子でトランスフェクトした（Ｃａｓｔｏｒｉａら、２００３年）。トランスフェクションの６時間後、細胞は１０ｎＭ Ｒ１８８１の不在下で、あるいは１０ｎＭ Ｒ１８８１だけの存在下で、または１０００倍過剰量のＣａｓｏｄｅｘと１０ｎＭ Ｒ１８８１で、または１ｎＭ ＳＨ３バインダーペプチド（配列番号１）もしくは１ｎＭペプチド配列番号１のシャッフル配列（配列番号７）と１０ｎＭ Ｒ１８８１でさらに２４時間維持した。次に、ルシフェラーゼ活性を細胞ライセートにおいて評価した。バー１：無刺激細胞；バー２：Ｒ１８８１処理細胞；バー３：Ｃａｓｏｄｅｘ（Ｃｄｘ）の存在下Ｒ１８８１で処理した細胞；バー４：ＳＨ３バインダーペプチド（ＳＨ３）の存在下Ｒ１８８１で処理した細胞；バー５：ペプチド配列番号１のシャッフル配列（Ｓｓ）の存在下Ｒ１８８１で処理した細胞。 図４Ｂ：乳癌（ＭＣＦ−７細胞）におけるエストロゲンレセプター調節遺伝子転写に対するＡＲ由来（ＳＨ３バインダー）ペプチド（配列番号１）の無効性を示す図である。ＭＣＦ−７細胞は、エストロゲン応答性エレメント（ｖｔ−ｔｋ−ＬＵＣ）の制御下にあるルシフェラーゼ遺伝子をコードするレポーター遺伝子でトランスフェクトした（Ｃａｓｔｏｒｉａら、２００３年）。トランスフェクションの６時間後、細胞は１０ｎＭ １７β−エストラジオール（Ｅ２）の不在下で、あるいは１０ｎＭ １７β−エストラジオール（Ｅ２）だけの存在下で、または１０００倍過剰量のＩＣＩ １８２，７８０と１０ｎＭ １７β−エストラジオールで、または１ｎＭ ＳＨ３バインダーペプチド（配列番号１）もしくは１ｎＭペプチド配列番号１のシャッフル配列（配列番号７）と１０ｎＭ １７β−エストラジオールでさらに２４時間維持した。次に、ルシフェラーゼ活性を細胞ライセートにおいて評価した。バー１：無刺激細胞；バー２：Ｅ２処理細胞；バー３：ＩＣＩ １８２，７８０（ＩＣＩ）の存在下Ｅ２で処理した細胞；バー４：ＳＨ３バインダーペプチド（ＳＨ３）の存在下Ｅ２で処理した細胞；バー５：ペプチド配列番号１のシャッフル配列（Ｓｓ）の存在下Ｅ２で処理した細胞。 図５Ａ：インビボでのヒト前立腺癌細胞に対するＳＨ３−バインダーペプチドの効果を示す図である。ＬＮＣａＰ前立腺癌細胞をオスのヌードマウスの皮下で増殖させた。腫瘍が２００〜４００ｍｍ^３の大きさに到達した後、マウスは、２００μｌの対照（ｃｔｒｌ）溶液（サークル）または２μＭのＳＨ３（ＳＨ３）バインダーペプチド配列番号１を含有する同一溶液（四角）の腹腔内注射で治療した。治療は０週目の開始時に始め、グループ当たり５匹の動物を使用して、ペプチドを隔日で４週間与えた。 図５Ｂ：インビボでのヒト乳癌細胞に対するＳＨ３−バインダーペプチドの効果を示す図である。ＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞をオスのヌードマウスの皮下で増殖させた。腫瘍が約１０００ｍｍ^３の大きさになると、マウスは、２００μｌの対照溶液（ｃｔｒｌ、サークル）または２μＭのＳＨ３バインダーペプチド配列番号１を含有する２００μｌの同一溶液（ＳＨ３、四角）の腹腔内注射で治療した。治療は０週目の開始時に始め、グループ当たり５匹の動物を使用して、ペプチドを隔日で５週間与えた。 図６Ａ：ヒト前立腺癌細胞におけるＫｉ−６７抗原発現およびアポトーシスに対するＳＨ３バインダーペプチドの効果を示す図である。オスのヌードマウスにおけるＬＮＣａＰ細胞異種移植片は、図５Ａに示される実験で使用した移植片と同じである。治療の終了時に、腫瘍検体をＫｉ−６７抗原発現およびアポトーシスについて評価した。左パネルはＫｉ−６７抗原の発現を、未治療（ｃｔｒｌ）マウスおよび配列番号１ペプチド治療（ＳＨ３）マウスにおけるＫｉ−６７陽性細胞の割合として示している。右パネルは、代表的な分野において観察されるＴＵＮＥＬアッセイ陽性細胞を示している。 図６Ｂ：ヒト乳癌細胞におけるＫｉ−６７抗原発現およびアポトーシスに対するＳＨ３バインダーペプチドの効果を示す図である。オスのヌードマウスにおけるＭＣＦ−７細胞異種移植片は、図５Ｂの実験で使用した移植片と同じである。治療の終了時に、腫瘍検体をＫｉ−６７抗原発現およびアポトーシスについて評価した。左パネルはＫｉ−６７抗原の発現を、未治療（ｃｔｒｌ）マウスおよび配列番号１ペプチド治療（ＳＨ３）マウスにおけるＫｉ−６７陽性細胞の割合として示している。右パネルは、代表的な分野において観察されるＴＵＮＥＬアッセイ陽性細胞を示している。

以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれる。しかし、当業
者であれば、本開示を考慮すると、開示されている特定の実施形態において多くの変更を
加えることができ、それでも本発明の精神と範囲から逸脱することなく同様のまたは類似
の結果が得られることを認識するはずである。

化学的合成によるＡＲ由来Ｓｒｃ−ＳＨ３バインダーペプチド（配列番号１）の調製
固相法（Ｂｏｄａｎｓｋｙ ＭとＢｏｄａｎｓｋｙ Ａ、１９９５年）および科学文献
に大部分が記載されており（ＣａｒｐｉｎｏとＨａｎ、１９７２年；ＦｉｅｌｄｓとＮｏ
ｂｌｅ、１９９０年）当業者には公知であるＦｍｏｃ／ｔＢｕ（Ｆｍｏｃ：９−フルオレ
ニル−メトキシカルボニル）化学を用いることにより、ペプチド１から４は都合よく手作
業で調製することができる。前記調製を迅速に処理し促進するために、自動多重ペプチド
合成装置（automatic multiple peptide synthesizer）を利用することができる。どんな
種類の化学的方法または単一もしくは複数のチャネルを備えた機械的合成装置も都合よく
使用しても、最終化合物の生物学的特性に影響を与えることなく、前記合成を実施するこ
とができる。

ペプチドの合成は、Ｃ末端にアミドペプチドを与えることができるＲＩＮＫリンカーで
適切に誘導体化された樹脂を使用して５０μモルのスケールで実施される（Ｒｉｎｋ、１
９８７年）。そのような樹脂の１つは、製品４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆ
ｍｏｃ−アミノメチル）−フェノキシ樹脂、１００〜２００メッシュ；スチレン１％ジ−
ビニルベンゼン共重合体）、置換０．５０ｍｍｏｌ／ｇ（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ社、カ
タログ番号０１−６４−５０２６）であり、当業者にはＲＩＮＫ ＡＭＩＤＥ樹脂として
も知られている。１００ｍｇの量の樹脂を使用する。前記樹脂は、底に濾過中隔を備えた
５ｍｌポリプロピレン反応容器（ＲＶ）（島津製作所、カタログ番号２９２−０５２５０
−０２）に設置する。典型的なプロトコルでは、樹脂は、攪拌下１０分間膨潤させ、次に
、１．０ｍＬの乾燥Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、ペプチド合成グレード、Ｌ
ａｂＳｃａｎ社、カタログ番号Ｈ６５３３）で複数回リンスし、わずかな減圧を用いて底
から前記溶剤を取り除く。次に、前記樹脂は、ＤＭＦを溶媒とする１．０ｍＬの２０％ｖ
／ｖのピペリジン溶液（ＢＩＯＳＯＬＶＥ社、カタログ番号１６１８３３０１）で攪拌下
室温で１５分間処理して、最初のＦｍｏｃ基を取り除き、そして１．０ｍＬの無水ＤＭＦ
で２分間の洗浄を数回（少なくとも４回）行って過剰な試薬を取り除く。

次に、以下の６段階を連続して実施する。
１．２５０μモル（１１７ｍｇ）のＦｍｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（Ｎｏｖａ
ｂｉｏｃｈｅｍ、カタログ番号０４−１２−１０２６）を５００μＬの無水ＤＭＦ中に溶
解する。
２．保護したアミノ酸を、４００μＬの溶液Ａおよび４００μＬの溶液Ｂを用いて、室
温で攪拌下４分間かけて前活性化する。
溶液Ａは、ＤＭＦ中に０．５Ｍの２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−イル）−１，１，
３，３−テトラメチル−ウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ、＞９９％，Ｃｈ
ｅｍ−Ｉｍｐｅｘ Ｉｎｔｌ、カタログ番号０２０５６）および０．５Ｍの１−ヒドロキ
シベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社、カタログ番号Ｈ２０
０６）を含有する。
溶液Ｂは、ＤＭＦ中に１Ｍのジイソプロピル−エチルアミン（ＤＩＥＡ、ＳＩＧＭＡ−
ＡＬＤＲＩＣＨ社、カタログ番号Ｄ−３８８７）を含有する。
３．前記溶液を樹脂上に移し、３０分間攪拌する。
４．前記試薬を減圧下で取り除き、前記樹脂は１．０ｍＬの無水ＤＭＦで４回洗浄する
。
５．前記樹脂は、再び、ＤＭＦを溶媒とする１．０ｍＬの２０％ｖ／ｖピペリジン溶液
で攪拌下室温で１５分間処理して、Ｎ−末端Ｆｍｏｃを取り除く。
６．前記樹脂は１．０ｍＬのＤＭＦで３回洗浄する。

次に、段階１において配列中で要求される対応する保護アミノ酸を変更して、段階１か
ら６を繰り返す。使用される保護誘導体は次の表ＩＩに示す。

最後のＦｍｏｃ基を取り除いたのち、樹脂は、攪拌下室温で３０分間、１．０Ｍ ＤＩ
ＥＡを含有する無水ＤＭＦを溶媒とする１．０Ｍ無水酢酸溶液（Ｆｌｕｋａ社、カタログ
番号４５８３０）で処理することによりアセチル化する。ＤＭＦで十分にリンスした後、
樹脂は以下のように洗浄する。

樹脂は窒素流を用いて乾燥させ、次に秤量する。樹脂の最終重量は２８０．０ｍｇであ
る。

３．０ｍＬのＴＦＡ−Ｈ_２Ｏ−ＴＩＳ（１００：５：５、ｖ／ｖ／ｖ）混合物（ＴＩＳ
、トリ−イソ−プロピルシラン、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社、カタログ番号２３，３
７８−１）を新たに調製し、樹脂に添加する。３時間攪拌後、樹脂は濾過して除き、酸性
溶液を、１５ｍＬの冷Ｅｔ_２Ｏを含有する１５ｍｌポリプロピレンチューブに直接回収す
る。３０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離により白い沈殿物を分離し、有機溶剤を捨てる
。沈殿物は５．０ｍＬの冷Ｅｔ_２Ｏで１回洗浄し、遠心分離後２．０ｍＬの脱イオン化Ｈ
_２Ｏに溶解させ、凍結乾燥する。白い固体を秤量する：１０２ｍｇ。

凍結乾燥させたペプチドは、例えば、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社が提供するＪｕｐｉｔｅ
ｒ２５×２．１ｃｍＩＤ Ｃ１８カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社、カタログ番号００Ｇ
−４０５３−Ｐ０）などの市販の調製用逆相Ｃ１８カラムを備えた、島津製作所製のＬＣ
−８システムなどの市販の高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システムを使用し
て逆相クロマトグラフィーにより都合よく精製することができる。ペプチド精製のための
典型的勾配は、脱イオン化Ｈ_２Ｏ、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、Ｓｉｇｍａ−Ａ
ｌｄｒｉｃｈ社、カタログ番号９１７００）およびアセトニトリル（ＣＨ_３ＣＮ、Ｌａｂ
Ｓｃａｎ社、カタログ番号Ｃ２５０３、０．１％ＴＦＡ）などの溶剤を利用して、２０ｍ
Ｌ／分の典型的動作流量で３５分間に渡り、典型的濃度は、５％〜６０％ＣＨ_３ＣＮ/０
．１％ＴＦＡである。これらの方法は当業者には公知であり、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｊ
ｕｐｉｔｅｒカラム、２５０×４．６ｍｍＩＤ ＲＰ−１８（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社、
カタログ番号００Ｇ−４０５３−Ｅ０）などの市販の分析用ＲＰ１８カラム上の分析用Ｈ
ＰＬＣ分析による測定において最大９５〜９９％の純度の精製ペプチドを提供することに
なる。勾配は、１．０ｍＬ／分の典型的流量で３５分間かけて、５％〜６０％ＣＨ_３ＣＮ
/０．１％ＴＦＡである。モニタリングは、典型的には、ＨＰＬＣシステムに装着され、
典型的な波長の２１４ｎｍに設定された紫外可視検出器を使用することにより実現される
。

最終ペプチドは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦおよびＥＳＩ−ＭＳなどの質量分析法により都合
よく特徴付けられる。典型的な例では、ＥＳＩ−ＭＳ質量分析器で測定される実験分子量
（ＭＷ）は、１１８９．５原子質量単位（ａｍｕ）であり、これは理論値１１８９．６８
ａｍｕ（モノアイソトピック種）に一致する。

ＡＲ由来Ｓｒｃ−ＳＨ３バインダーペプチド配列番号１の「インビトロ」抗腫瘍効果
１０ｎＭ Ｒ１８８１合成アンドロゲンでのヒト前立腺癌ＬＮＣａＰの治療はＤＮＡ合
成を劇的に促進することは実証されている。したがって、ＬＮＣａＰ細胞は、ルーチンで
、フェノールレッド、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（ＧＩＢＣＯ社）、ペニシリン（１００Ｕ
／ｍｌ）、ゲンタマイシン（５０μｌ／ｍｌ）、インスリン（ヒューマリンＩ ０．２Ｕ
．Ｉ／ｍｌ、Ｒｏｃｈｅ社）および１０％ウシ胎仔血清を補充したＲＰＭＩ １６４０培
地（ＧＩＢＣＯ社）中、大気中５％ＣＯ_２中で増殖させる。次に、細胞は、前もってゼラ
チン被膜したカバーガラス上に約４０％コンフルエンスで播種し、インスリンおよび活性
炭処理ウシ血清を含有するフェノールレッド無添加ＲＰＭＩ−１６４０中で維持し、３日
間ステロイド汚染が最小限度以下であることを確認する（Ｓｈｉら、１９９４年）。次に
、ＬＮＣａＰ細胞は、１０ｎＭの合成アンドロゲンＲ１８８１（Ａｓｔｒａ−Ｚｅｎｅｃ
ａ社）だけで、または１０００倍モル過剰の抗アンドロゲンＣａｓｏｄｅｘ（Ａｓｔｒａ
−Ｚｅｎｅｃａ社）もしくは表示されるペプチドの存在下で１０ｎＭの合成アンドロゲン
Ｒ１８８１で２４時間処理される。

６つの別々のアッセイから平均値をとった図１Ａに示す結果により、アンドロゲンが２
０から５４％ＢｒｄＵ取込み速度を増加させていることが示される。ホルモン刺激取込み
は、濃度１ｎＭのＳＨ３バインダーペプチド（ＳＨ３）により劇的に減少している（２５
％の残留ＢｒｄＵ取込み）。ＳＨ３ペプチドの効果を、同程度にＤＮＡ合成を減少させた
（２１％の残留ＢｒｄＵ取込み）純粋抗アンドロゲンＣａｓｏｄｅｘの効果と比較した。
配列番号１のシャッフル配列（shuffled sequence）（配列番号７）に対応する合成ペプ
チドも使用した（Ｓｓ）。細胞のアンドロゲン刺激中にこのペプチドを添加しても、ホル
モン依存性ＤＮＡ合成に対して無視できるほどの阻害効果しかない（４８％の残留Ｂｒｄ
Ｕ取込み）。上記のペプチドに加えて、ペプチド配列番号２〜配列番号４を試験した。そ
の阻害効果はペプチド配列番号１の阻害効果ほど強くはなかった。

ＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞のエストラジオール刺激ＤＮＡ合成に対するペプチド配列番号
１の効果も試験した。ＭＣＦ−７細胞は、フェノールレッド、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（
ＧＩＢＣＯ社）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ゲンタマイシン（５０μｌ／ｍｌ）、
ヒドロコルチゾン３．７５ｎｇ／ｍｌ、インスリン（ヒューマリンＩ ０．２Ｕ．Ｉ／ｌ
、Ｒｏｃｈｅ社）および５％ウシ胎仔血清を補充したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭ
ＥＭ、ＧＩＢＣＯ社）中、大気中５％ＣＯ_２中で増殖させた。次に、細胞は、前もってゼ
ラチン被膜したカバーガラス上に約４０％コンフルエンスで播種し、インスリンおよび活
性炭処理ウシ血清を含有するフェノールレッド無添加ＤＭＥＭ中で３日間維持する。次に
、ＭＣＦ−７細胞は、１０ｎＭ １７βエストラジオール（ＳＩＧＭＡ社、ミズリー州）
だけで、または１０００倍モル過剰の抗エストロゲンＩＣＩ １８２，７８０（Ａｓｔｒ
ａ−Ｚｅｎｅｃａ社）もしくは表示されるペプチドの存在下で１０ｎＭ １７βエストラ
ジオールで２４時間処理される。

６つの異なるアッセイから平均値をとった図１Ｂに示す結果により、エストラジオール
（Ｅ_２）が８から６１％ＢｒｄＵ取込み速度を増加させていることが示される。ホルモン
刺激取込みは、濃度１ｎＭのＳＨ３バインダーペプチド（ＳＨ３）により著しく減少して
いる（２３％の残留ＢｒｄＵ取込み）。ＳＨ３ペプチドの効果を、エストロゲン誘導ＤＮ
Ａ合成を停止させた（７％の残留ＢｒｄＵ取込み）純粋抗エストロゲンＩＣＩ １８２，
７８０の効果と比較する。ペプチド配列番号１のシャッフル配列（Ｓｓ）は、エストロゲ
ン誘導ＤＮＡ合成に対して著しい効果を及ぼさない。

ペプチド配列番号１について、ヒト前立腺癌ＬＮＣａＰ（１Ｃ）およびＭＣＦ−７（１
Ｄ）細胞におけるＥＧＦ誘導ＤＮＡ合成を減少させるまたは阻害するその能力を最終的に
評価する。ＬＮＣａＰおよびＭＣＦ−７細胞は上記のように培養し、次にカバーガラス上
に播種する。次に細胞を、１ｎＭペプチド配列番号１の不在下または存在下で、１００ｎ
ｇ／ｍｌの高純度ＥＧＦ（Ｂｏｈｅｒｉｎｇｅｒ社、カリフォルニア州）で刺激する。

図１Ｃでは、ＥＧＦがＢｒｄＵ取込みを８から２１％に刺激することが観察される。前
記ペプチドの添加により、５．８％までＢｒｄＵ取込みが減少するが、これは、純粋な抗
エストロゲン、ＩＣＩ １８２，７８０（７％の残留取込み）の場合と同程度である。ペ
プチド配列番号１のシャッフル配列（Ｓｓ）はＢｒｄＵ取込みにわずかな効果がある（１
５％の残留取込み）。ＭＣＦ−７細胞では、図１Ｄに示されるように、ＥＧＦもＢｒｄＵ
取込みを刺激し（６から３６％）、前記ペプチドの添加により１３％までＢｒｄＵ取込み
は減少し、ＩＣＩ １８２，７８０では残留取込みの９％まで減少する。これとは対照的
に、ペプチド配列番号１のシャッフル配列（Ｓｓ）ではＢｒｄＵ取込みは減少しない（４
８％の取込み）。

方法
ＤＮＡ合成は、１００μＭ（最終濃度）ＢｒｄＵ（Ｂｏｅｈｅｒｉｎｇｅｒ社）での６
時間パルスにより単細胞で評価される。カバーガラス上の細胞を固定し、希釈（ＰＢＳ中
１：１）フルオレセイン結合マウス抗ＢｒｄＵ ｍＡｂｓ（Ｂｏｈｅｒｉｎｇｅｒ Ｍａ
ｎｎｈｅｉｍ社製、インディアナ州のクローンＢＭＣ９３１８）とともにインキュベート
し、次に、ＰＢＳで３回洗浄する。マウス抗体は、希釈（ＰＢＳ中１：２００）Ｔｅｘａ
ｓ−ｒｅｄ結合ヤギ抗マウス抗体（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社、カリフォルニア州）を使用
して検出する。カバーガラスはすべてＰＢＳで３回洗浄し、反転させてスライドガラス上
でＭｏｖｉｏｌ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社、カリフォルニア州）でマウントする。スライ
ドはＡｘｉｏｐｈｏｔ蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ社）を使用して分析する。

ＡＲ由来（Ｓｒｃ−ＳＨ３バインダー）ペプチド（配列番号１）によるＳｒｃへのアンド
ロゲン刺激ＡＲ会合の阻害
ホルモン結合ＡＲは、おそらくプロリンストレッチを通じてＳｒｃキナーゼのＳＨ３ド
メインと相互作用することはすでに実証されている（Ｍｉｇｌｉａｃｃｉｏら、２０００
年）。この相互作用の結果として、前記キナーゼおよび下流シグナル経路は活性化され、
最終的に、ＤＮＡ合成が活性化される。この相互作用に関与するＡＲのドメインを模倣す
る小ペプチド配列を使用すれば、競合によりＡＲ−Ｓｒｃ会合を阻害しＤＮＡ合成を遮断
することができるはずである。この仮説を試験するために、ＬＮＣａＰ細胞は、ルーチン
で、フェノールレッド、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（ＧＩＢＣＯ社）、ペニシリン（１００
Ｕ／ｍｌ）、ゲンタマイシン（５０μｌ／ｍｌ）、インスリン（０．２Ｕ．Ｉ．／ｍｌ）
および１０％ウシ胎仔血清を補充したＲＰＭＩ １６４０培地（ＧＩＢＣＯ社）中、大気
中５％ＣＯ_２中で増殖させる。次に、前記細胞は、フェノールレッドなしで、上記のグル
タミン、ペニシリン、ゲンタマイシンおよびインスリンを補充され、１０％活性炭処理ウ
シ胎仔血清を含有するＲＰＭＩ １６４０でさらに４日間維持する。次に、細胞は、１０
ｎＭ Ｒ１８８１だけで、または１０００倍過剰量の抗アンドロゲンＣａｓｏｄｅｘ、も
しくは１ｎＭの配列番号１ペプチドもしくは１ｎＭのペプチド配列番号１のシャッフル配
列（配列番号７）の存在下で１０ｎＭ Ｒ１８８１で２分間刺激し、溶解する。細胞ライ
セートは、マウスモノクロナール抗Ｓｒｃ抗体（クローン３２７、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ社、マンハセット、ニューヨーク州）を使用して免疫沈降に付する。免疫沈
降タンパク質は１２％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分離し、その後ニトロセルロース
フィルター上に移す。前記フィルターは、抗Ｓｒｃ抗体またはマウスモノクロナール抗Ａ
Ｒ抗体のいずれかとともにインキュベートする。ニトロセルロースフィルター上の免疫複
合体は、化学発光基質（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社、イリノイ州）結合ペルオ
キシダーゼ連結抗マウス抗体を使用して検出する。

予想通り、ホルモン処理細胞では、ＡＲは、抗Ｓｒｃ抗体により共免疫沈降される（図
２Ａ、レーン２）。ＡＲとＳｒｃ間の会合は、ＬＮＣａＰ細胞がＣａｓｏｄｅｘの存在下
ホルモンで刺激されると阻害される（レーン３）。同様に、アンドロゲンおよびＳＨ３バ
インダーペプチドで処理された細胞では、抗Ｓｒｃ抗体によりＡＲは共免疫沈降されない
。これとは対照的に、ホルモン刺激Ｓｒｃ−ＡＲ会合は、同一濃度のペプチド配列番号１
のシャッフル配列（配列番号７）での処理によりごくわずかな影響しか受けない。

方法
細胞ライセートの調製。細胞は１ｍｌの溶解用緩衝液：５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１５０ｍ
Ｍ ＮａＣｌ、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含有する５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、ｐＨ７．４０に懸濁し、４℃で２分間穏やかな振盪下に置く。次に、懸濁液を約８０
０ｇで３０分間遠心分離し、上清を回収して免疫沈降に使用する。

ＡＲ由来（Ｓｒｃ−ＳＨ３バインダー）ペプチド（配列番号１）によるＳＲＣへのエス
トロゲン刺激ＥＲ会合の阻害
ＥＲはＡＲと一緒にＳｒｃと三元複合体を形成することは以前明らかにされている（Ｍ
ｉｇｌｉａｃｃｉｏら、２０００年）。ＥＲまたはＡＲのいずれかとＳｒｃの相互作用を
阻害すると、この三元複合体は破壊され、Ｓｒｃ媒介シグナル伝達が阻害される。したが
って、ＳＨ３バインダーペプチド（複数可）によりＡＲ−Ｓｒｃ相互作用を阻害すれば、
ＳｒｃとのＥＲα会合およびエストラジオール誘導シグナル伝達も阻害されるはずである
。この点に取り組むために、乳癌由来ＭＣＦ−７細胞を、フェノールレッド、２ｍＭ Ｌ
−グルタミン（ＧＩＢＣＯ社）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ゲンタマイシン（５０
μｌ／ｍｌ）、ヒドロコルチゾン（３．７５ｎｇ／ｍｌ）、インスリン（０．２Ｕ．Ｉ．
／ｍｌ）および５％ウシ胎仔血清を補充したＤＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ社）中、大気中５
％ＣＯ_２中で増殖させる。次に、前記細胞を、フェノールレッドなしの、上記のグルタミ
ン、ペニシリン、ゲンタマイシンおよびインスリンを補充され、５％活性炭処理ウシ胎仔
血清を含有するＤＭＥＭでさらに４日間維持する。次に、前期細胞を、１０ｎＭ １７β
エストラジオールだけで、または１０００倍過剰量の抗エストロゲンＩＣＩ １８２，７
８０、もしくは１ｎＭの配列番号１ペプチド、もしくはペプチド配列番号１のシャッフル
配列の存在下で１０ｎＭ １７βエストラジオールで３分間刺激し、溶解する。細胞ライ
セートは、マウスモノクロナール抗Ｓｒｃ抗体（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ社、
マンハセット、ニューヨーク州）を使用して免疫沈降に付する。免疫沈降タンパク質は１
２％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分離し、その後ニトロセルロースフィルター上に移
す。前記フィルターを、抗Ｓｒｃ抗体またはマウスモノクロナール抗ＡＲ抗体のいずれか
とともにインキュベートする。ニトロセルロースフィルター上の免疫複合体は、上記の化
学発光基質付きのペルオキシダーゼ連結抗マウス抗体を使用して検出する。

予想通り、ホルモン処理細胞では、ＥＲは、抗Ｓｒｃ抗体により共免疫沈降される（図
２Ｂ、レーン２）。ＥＲとＳｒｃ間の会合は、ＭＣＦ−７細胞がＩＣＩ １８２，７８０
の存在下ホルモンで刺激されると阻害される（レーン３）。濃度１ｎＭのアンドロゲンお
よびＳＨ３バインダーペプチドで処理された細胞では、抗Ｓｒｃ抗体によりＥＲは共免疫
沈降されない。Ｓｒｃ−ＡＲ会合は、１ｎＭのペプチド配列番号１（Ｓｓ）のシャッフル
配列での処理によりごくわずかな影響しか受けない。

前立腺癌（ＬＮＣＡＰ）および乳癌（ＭＣＦ−７）細胞におけるＡＲ−Ｙ（ＳＨ３バイ
ンダー）ペプチド（配列番号１）によるアンドロゲン刺激サイクリン−ｄ発現の阻害
エストロゲンおよびアンドロゲンレセプターはＳｒｃを刺激し、次にＳｒｃがホスファ
チジル−３−キナーゼ（ＰＩ３−Ｋ）経路を活性化する（Ｃａｓｔｏｒｉａら、２０００
年）。ＰＩ３−Ｋを活性化すれば、ＰＫＢ／Ａｋｔキナーゼがリン酸化され、サイクリン
Ｄ１発現が増加する。これにより、ホルモン依存性細胞が細胞周期Ｇ１／Ｓ移行期に向け
て駆り立てられる（Ｃａｓｔｏｒｉａら、２０００年）。ＳｒｃまたはＰＩ３−Ｋが阻害
されると、細胞がＧ１期に停滞しＤＮＡ合成が遮断される。したがって、ＳＨ３バインダ
ーペプチドを使用すれば、ＳｒｃキナーゼおよびＰＩ−３Ｋ依存性サイクリンＤ１発現を
阻害することができると考えられる。この可能性を立証するため、ＳＨ３バインダーペプ
チド（配列番号１）をアンドロゲンで刺激したＭＣＦ−７およびＬＮＣａＰ細胞に添加す
る。ＭＣＦ−７およびＬＮＣａＰ細胞はルーチンで上記の通りに増殖させる。次に、細胞
は、上記の通りに補充され、ステロイド濃度を最小限にとどめるためにデキストラン被膜
活性炭処理ウシ胎仔血清を添加したレッドフェノール無添加培地で少なくとも４日間維持
する。次に、細胞は、１０ｎＭ Ｒ１８８１だけで、または１ｎＭ ＳＨ３バインダーペ
プチド（ＳＨ３，配列番号１）、もしくは１ｎＭのペプチド配列番号１のシャッフル配列
（配列番号７）の存在下で１０ｎＭ Ｒ１８８１で６時間処理し、その後溶解し、抗サイ
クリンＤ１抗体を使用したウェスタンブロットに付する（図３Ａ、上および下パネル）。
予想通り、アンドロゲンはＭＣＦ−７およびＬＮＣａＰ細胞においてサイクリンＤ１発現
を刺激する。濃度５μＭのＰＩ３−Ｋ阻害剤（ＬＹ２９４，００２）およびＳｒｃ阻害剤
（ＰＰ２）（非表示）はホルモン刺激サイクリン発現を阻害する。１ｎＭ ＳＨ３バイン
ダーペプチド（配列番号１）（ＳＨ３）を添加するとＲ１８８１によるサイクリンＤ誘導
も抑制されるが、ペプチド配列番号１のシャッフル配列（Ｓｓ）はこの効果を部分的に減
少させるだけである。

前立腺（ＬＮＣＡＰ）および乳（ＭＣＦ−７）癌細胞におけるＡＲ由来（Ｓｒｃ−ＳＨ
３バインダー）ペプチド（配列番号１）によるエストロゲン刺激サイクリン−ｄ１発現の
阻害
エストロゲン刺激サイクリンＤ１発現に対するＳＨ３バインダーペプチド（配列番号１
）の効果を試験するため、このペプチドを１０ｎＭ １７βエストラジオールで刺激した
ＬＮＣａＰおよびＭＣＦ−７細胞に添加する（図３Ｂ）。ＭＣＦ−７およびＬＮＣａＰ細
胞はルーチンで上記の通りに増殖させる。次に、細胞は、上記の通りに補充され、ステロ
イド濃度を最小限にとどめるためにデキストラン被膜活性炭処理ウシ胎仔血清を添加した
レッドフェノール無添加培地で少なくとも４日間維持する。次に、細胞を、１０ｎＭ １
７βエストラジオールだけで、またはＰＩ−３Ｋ阻害剤のＬＹ２９４，００２（５μＭ）
、もしくは１ｎＭのＳＨ３バインダーペプチド（配列番号１）、もしくは１ｎＭのペプチ
ド配列番号１のシャッフル配列（配列番号７）のいずれかの存在下で１０ｎＭ １７βエ
ストラジオールで６時間処理し（図３Ｂ、上および下パネル）、その後溶解し、上記のよ
うに抗サイクリンＤ１抗体を使用したウェスタンブロットに付する。アンドロゲンと同様
に、１７βエストラジオールはサイクリンＤ１発現を刺激する。ＰＩ３−Ｋ阻害剤のＬＹ
２９４，００２は、この場合もホルモン刺激サイクリン発現を阻害する。１ｎＭのＳＨ３
バインダーペプチド（配列番号１）（ＳＨ３）はエストロゲンによるサイクリンＤ誘導を
完全に抑制するが、並べ替えペプチド配列番号１（Ｓｓ）はわずかな効果しかない。

前立腺癌（ＬＮＣａＰ）および乳癌（ＭＣＦ−７）細胞におけるアンドロゲンレセプタ
ー依存性遺伝子転写に対するＡＲ由来（Ｓｒｃ−ＳＨ３バインダー）ペプチド（配列番号
１）の無効性
ステロイド系レセプターは一般にリガンド活性化転写因子として知られている。したが
って、ＳＨ３バインダー抗アンドロゲンペプチド効果がアンドロゲンレセプターの転写活
性に関与するかどうかを評価することは重要である。ＬＮＣａＰ細胞を、フェノールレッ
ド、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（ＧＩＢＣＯ社）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ゲンタ
マイシン（５０μｌ／ｍｌ）、インスリンおよび１０％ウシ胎仔血清を補充したＲＰＭＩ
１６４０培地（ＧＩＢＣＯ社）中、大気中５％ＣＯ_２中で維持し、アンドロゲン応答性
エレメント（ＡＲＥ３４１６）の制御下のルシフェラーゼ遺伝子を含むｐＳＧ５発現ベク
ターに工学的に組み込まれたレポーター遺伝子でトランスフェクトする（Ｖｅｒｒｉｊｄ
ｔら、２０００年）。トランスフェクションの６時間後、培地を新しい培地と交換し、細
胞は、１０ｎＭ Ｒ１８８１の不在下で、あるいは１０ｎＭ Ｒ１８８１だけの存在下で
、または１０００倍過剰量のＣａｓｏｄｅｘ、１ｎＭ ＳＨ３バインダーペプチド配列番
号１、もしくは１ｎＭの組換えたペプチド配列番号１（配列番号７）と１０ｎＭ Ｒ１８
８１の存在下でさらに２４時間維持した。細胞ライセートのルシフェラーゼ活性を評価す
る。同一実験が繰り返して、ヒト乳癌細胞におけるエストロゲンレセプターの転写活性に
対する抗アンドロゲンペプチド効果を分析する。ＭＣＦ−７細胞を、フェノールレッド、
２ｍＭ Ｌ−グルタミン（ＧＩＢＣＯ社）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ゲンタマイ
シン（５０μｌ／ｍｌ）、ヒドロコルチゾン（３．７５ｎｇ／ｍｌ）、インスリン（０．
２Ｕ．Ｉ．／ｍｌ）および５％ウシ胎仔血清を補充したＤＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ社）中
、大気中５％ＣＯ_２中で維持し、アンドロゲン応答性エレメント（ＡＲＥ３４１６）の制
御下のルシフェラーゼ遺伝子を含むｐＳＧ５発現ベクターにクローニングしたレポーター
遺伝子ＱＵＡＬＥでトランスフェクトする。最終的に、細胞ライセートのルシフェラーゼ
活性を評価する。

図４Ａは、未処理ＬＮＣａＰ細胞（バー１）、Ｒ１８８１だけで刺激した細胞（バー２
）で、または過剰量Ｃａｓｏｄｅｘ、もしくはＳＨ３ペプチド（ＳＨ３）、もしくは組み
換えられたペプチド配列番号１（Ｓｓ）のいずれかの存在下でＲ１８８１で刺激した細胞
（それぞれ（バー３）（バー４）（バー５））におけるルシフェラーゼ活性を示している
。

図４Ｂは、未処理ＭＣＦ−７細胞（バー１）、１７βエストラジオールだけで刺激した
細胞（バー２）で、またはＩＣＩ １８２，７８０過剰、もしくはペプチド配列番号１（
ＳＨ３）、もしくはペプチド配列番号１のシャッフル配列（Ｓｓ）のいずれかの存在下で
１７βエストラジオールで刺激した細胞（それぞれ（バー３）（バー４）（バー５））に
おけるルシフェラーゼ活性を示している。

従来の抗アンドロゲンは、レポーター遺伝子のアンドロゲン誘導転写を完全に阻害する
が、ＳＨ３ペプチドもペプチド配列番号１のシャッフル配列もＡＲの転写活性に影響を与
えないことが観察される。

ＡＲ由来Ｓｒｃ−ＳＨ３バインダーペプチド（配列番号１）の「インビボ」抗腫瘍効果
インビトロおよびインビボ腫瘍増殖研究の結果は多岐にわたることがあるために、イン
ビボでの抗アンドロゲンペプチドに対するＬＮＣａＰおよびＭＣＦ−７細胞の増殖応答性
を試験した。ＬＮＣａＰ癌細胞を、上記のルーチン条件下で増殖させ、無菌ＰＢＳ中５０
％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）マトリゲル溶液（ｐＨ７．４）中に懸濁し、ホルモン刺激なしで２
．５×１０^６細胞／動物（ＣＤマウス、Ｃｈａｒｌｅｓ−Ｒｉｖｅｒ社）でオス胸腺欠損
マウスの背側後方領域に皮下注射する。

１４〜２１日後、同程度の大きさの腫瘍を持つ動物を、さらに５週間、ＳＨ３バインダ
ーペプチド、配列番号１、または溶媒だけによる治療に無作為に割り分ける。治療は、腫
瘍がおよそ２００〜４００ｍｍ^３の大きさになった時点で開始する。治療ありまたは治療
なしでのＬＮＣａＰ細胞異種移植片の腫瘍容積を、キャリパーにより測定し、式Ｄ×ｄ^２
×０．５に従って記録する（式中、Ｄは腫瘍の長さであり、ｄは腫瘍の幅である）。

各動物のペプチド治療では、０．１％ＤＭＳＯに溶解した２０ｎＭ ＳＨ３バインダー
ペプチド（配列番号１）２００μｌまたは同量の溶媒のみを隔日でマウスに腹腔内投与す
る。そのような研究は、ヒト悪性腫瘍で一般的に見られるアンドロゲンレセプターレベル
を発現するヒト前立腺および乳癌細胞の潜在的治療薬としてのペプチドの有効性を評価す
るのに特に重要である。これらのペプチド（一般式Ｓ１および配列番号１から配列番号６
）の用量、種類および大きさならびにペプチドの送達ルートはすべて当技術分野の通常技
術を使用して決定できる要素である。

図５Ａは、ＳＨ３バインダーペプチド（ＳＨ３）でまたは溶媒だけ（ｃｔｒｌ）で治療
されたオスのヌードマウスにおけるＬＮＣａＰ細胞異種移植片の増殖速度を示している。

本発明者らは、このモデルでは、対照グループと比べるとＳＨ３治療グループでは腫瘍
の大きさが有意に小さいことを観察した。溶媒溶液で治療したマウスの体重とペプチドで
治療したマウスの体重の間に差は見られない（データ非表示）。

ヌードマウスに定着させた乳癌ＭＣＦ−７細胞異種移植片に対する抗アンドロゲンペプ
チドの効果も分析する（図５Ｂ）。この場合、ＭＣＦ−７細胞は、あらかじめ上記の通り
に増殖させ、無菌ＰＢＳ中５０％マトリゲル（ｖｏｌ／ｖｏｌ）溶液中に懸濁し、胸腺欠
損オスマウスに２．５×１０^６細胞／動物で皮下注射する。

１４〜２１日後、同程度の大きさの腫瘍を持つ動物を、さらに５週間、ＳＨ３バインダ
ーペプチド配列番号１、または溶媒だけによる治療に無作為に割り分ける。治療開始時の
腫瘍はおよそ１０００ｍｍ^３ある。０．１％ＤＭＳＯ中２０ｎＭ ＳＨ３バインダーペプ
チド２００μｌまたは同量の溶媒のみを隔日でマウスに腹腔内投与する。治療ありまたは
治療なしのＭＣＦ−７癌細胞異種移植片の腫瘍容積を上記のように測定して記録する。対
照マウスとペプチド治療マウスの間に体重差は認められない。

ＬＮＣａＰ細胞異種移植片モデルに対して観察されたことと同様に、本発明者らは、Ｍ
ＣＦ−７細胞異種移植片モデルでも、対照グループと比べるとＳＨ３治療グループでは腫
瘍サイズが小さいことを見出した。溶媒溶液で治療したマウスと前記ペプチドで治療した
マウスの体重の間に差は見られない（データ非表示）。

治療の終了時に、動物を屠殺し、腫瘍検体をＫｉ６７抗原およびアポトーシス細胞につ
いて評価する。簡単に述べると、各検体由来の切片を３〜５ミクロンに切断し、ガラス上
にマウントし、３７℃で一晩乾燥させる。次に、全切片をキシレン中で脱パラフィンし、
段階的アルコール系列を通じて再水和し、ＰＢＳで洗浄する。この緩衝液は、その後の全
ての洗浄および抗体希釈に使用する。ヘマトキシリン／エオジンおよびヘマトキシリン／
ファンギーソンで染色後、光学顕微鏡検査を行う。免疫組織化学的検査では、各組織切片
をクエン酸緩衝液（ｐＨ６）に浸した状態で電子レンジで７００Ｗにて５分間の加熱を２
度繰り返し、次に、標準的ストレプトアビジン−ビオチン−免疫ペルオキシダーゼ法（Ｄ
ＡＫＯ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｋｉｔ、ＤＡＫＯ社、カーピンテリア、カリフォルニア州
、米国）で処理する。ＤＡＫＯ社製ウサギ抗ヒトＫｉ６７は１：１００希釈率で使用する
。一次抗体を室温で１時間インキュベートした。ジアミノ−ベンジジンを最終色素として
、ヘマトキシリンを核対比染色として使用する。各組織切片のネガティブコントロールは
、一次抗体を除外して実施する。各実験に含まれるポジティブコントロールは、対象の抗
原を発現することが以前明らかにされている組織で構成される。２人の観察者が、２種類
のタンパク質の染色パターンを別々に評価し、切片全体をスキャンし、高倍率視野１０×
２０で視認できる陽性細胞の数を測定することにより各検体におけるタンパク質発現を点
数化する。観察者間で合意された割合として表現される一致のレベルは９２％である。そ
の残りの検体では、共同で見直して同意した後に点数が付けられる。ペルオキシダーゼベ
ースＡｐｏｐｔａｇキット（Ｏｎｃｏｒ社、ゲイサーズバーグ、メリーランド州、米国）
を使用してＴＵＮＥＬ反応を行う。ＴＵＮＥＬ陽性細胞は、供給業者の使用説明書に従っ
て、ジアミノ−ベンジジンおよびＨ_２Ｏ_２で検出する。２人の観察者が、２種類のタンパ
ク質の染色パターンを別々に評価し、切片全体をスキャンし高倍率視野１０×２０で視認
できる陽性核の数を測定することにより各検体におけるタンパク質発現を点数化する。観
察者間で合意された割合として表現される一致のレベルは１００％である。

本発明者らは、ＬＮＣａＰ腫瘍異種移植片検体において、対照グループとの比較におい
て、ＳＨ３治療グループでは、Ｋｉ−６７抗原陽性細胞の割合に有意の減少（Ｐ＜０．０
０２、図６Ａ、左パネル）、およびＴＵＮＥＬ陽性細胞の数に有意の増加（Ｐ＜０．００
９、図６Ａ、右パネル）を観察した。ＭＣＦ−７腫瘍異種移植片検体でも同様の結果が認
められた（図６Ｂ、左と右パネル）。

抗体組成物の調製
上記の合成ペプチドおよび組換えペプチドは、動物またはヒトにおける免疫応答の発生
に、およびこれらのエピトープに特異的な抗体の調製に使用できる。ワクチンおよび抗体
の調製は、上記本明細書に記載するように、当業者には公知である。簡単に述べると、本
発明の新規のペプチドは、以下のようにして動物における抗原として使用することができ
る：
各ペプチドはkeyhole limpet hemocyanin（ＫＬＨ）に結合させ、ＢＡＬＢ／ｃマウス
を皮下免疫するのに使用してよい。最初の注射は２５０ｐｇタンパク質を含み、マウスは
７週間後にそれぞれのＫＬＨ結合ペプチド２５０μｇで追加免疫し、次に、１週間後に採
血する。注射されたマウスにより産生されるポリクロナール抗体について、ＥＬＩＳＡア
ッセイでペプチド抗原を認識する能力を試験する。また、前記抗体について、ＡＲ誘導Ｄ
ＮＡ合成を阻害する能力も評価する。

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Yang et al. 1990 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 9568-9572
以下に、本願の当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
［１］
一般式：
によって示され、単離または精製または部分精製された状態のペプチド由来分子。
（式中、Ｘは、Ｈ、アセチル基もしくは任意の天然アミノ酸であるか、または遊離ＮＨ _２ 基もしくは少なくともアセチル誘導体化ＮＨ _２ 基が付加したアミノ酸の配列であり、Ｙは、ＯＨ基、ＮＨ _２ 基もしくは任意のアミノ酸であるか、またはＣ末端カルボキシ−アミド基を有するアミノ酸の配列であり、「ｎ」は１〜１０の整数であり、「ｍ」は１〜３の整数である）
［２］
アンドロゲンレセプター（ＡＲ）とチロシンキナーゼＳｒｃのＳＨ３ドメインとの相互作用を阻害または阻止することができる、［１］に記載のペプチド由来分子。
［３］
インビトロまたはインビボで抗腫瘍活性を有する、［１］または［２］に記載のペプチド由来分子。
［４］
配列番号１のアミノ酸配列を有する、［１］から［３］のいずれか１項に記載のペプチド由来分子。
［５］
配列番号２のアミノ酸配列を有する、［１］から［３］のいずれか１項に記載のペプチド由来分子。
［６］
配列番号３のアミノ酸配列を有する、［１］から［３］のいずれか１項に記載のペプチド由来分子。
［７］
配列番号４のアミノ酸配列を有する、［１］から［３］のいずれか１項に記載のペプチド由来分子。
［８］
薬物として使用するための、［１］から［７］のいずれか１項に記載のペプチド由来分子。
［９］
抗腫瘍剤として使用するための、［１］から［７］のいずれか１項に記載のペプチド由来分子。
［１０］
抗乳癌剤もしくは抗前立腺癌剤として、またはアンドロゲンレセプターを単独でもしくはエストラジオールレセプターとともに発現している他の癌に対して使用するための、［９］に記載のペプチド由来分子。
［１１］
［１］から［７］のいずれか１項に記載のペプチド由来分子を医薬的に許容可能かつ有効な量で含む薬剤組成物。
［１２］
前記ペプチドが、ＢＳＡもしくはＫＬＨなどの担体分子に連結されており、かつ／または脂質粒子、ナノカプセル、リポソームもしくは脂質ベシクルなどの脂質組成物に医薬品賦形剤と共に含まれる、［１１］に記載の組成物。
［１３］
少なくとも第２の抗癌剤をさらに含む、［１１］または［１２］に記載の組成物。
［１４］
抗アンドロゲンポリペプチドに対する抗体を産生するための抗原としての、［１］から［７］のいずれか１項に記載のペプチド由来分子の使用。
［１５］
薬物を調製するための、［１］から［７］のいずれか１項に記載のペプチド由来分子の使用。
［１６］
前記薬物がワクチンである、［１５］に記載の使用。
［１７］
［１］から［７］のいずれか１項に記載のペプチド由来分子を特異的に認識することができる抗体。
［１８］
［１］から［７］のいずれか１項に記載のペプチドをコードする核酸配列。
［１９］
［１］から［７］に記載のペプチドを発現する組換えベクター。
［２０］
［１９］に記載の組換えベクターを含む、哺乳動物、ヒトまたは細菌宿主細胞。
［２１］
［１］から［７］のいずれか１項に記載のペプチド由来分子を癌細胞に提供することを含む、癌細胞を死滅させる方法。
［２２］
前記細胞が乳房細胞または前立腺細胞である、［２１］に記載の方法。
［２３］
前記細胞に少なくとも第２の抗癌剤を提供することをさらに含む、［２１］または［２２］に記載の方法。
［２４］
［１］から［７］のいずれか１項に記載のペプチド由来分子を治療量で癌を患う動物に投与することを含む、癌を患う動物を治療するための方法。
［２５］
［１１］から［１３］のいずれか１項に記載の組成物を治療量で癌を患う動物に投与することを含む、癌を患う動物を治療するための方法。
［２６］
前記動物がヒトである、［２４］または［２５］に記載の方法。
［２７］
単一または複数の容器内に検出可能な標識および免疫検出試薬に機能的に結合された、［１７］に記載の抗体を含むキット。

Claims (27)

1. 一般式：
   によって示され、単離または精製または部分精製された状態のペプチド由来分子。
   （式中、Ｘは、Ｈ、アセチル基もしくは任意の天然アミノ酸であるか、または遊離ＮＨ_２
   基もしくは少なくともアセチル誘導体化ＮＨ_２基が付加したアミノ酸の配列であり、Ｙは
   、ＯＨ基、ＮＨ_２基もしくは任意のアミノ酸であるか、またはＣ末端カルボキシ−アミド
   基を有するアミノ酸の配列であり、「ｎ」は１〜１０の整数であり、「ｍ」は１〜３の整
   数である）
2. アンドロゲンレセプター（ＡＲ）とチロシンキナーゼＳｒｃのＳＨ３ドメインとの相互
   作用を阻害または阻止することができる、請求項１に記載のペプチド由来分子。
3. インビトロまたはインビボで抗腫瘍活性を有する、請求項１または２に記載のペプチド
   由来分子。
4. 配列番号１のアミノ酸配列を有する、請求項１から３のいずれか１項に記載のペプチド
   由来分子。
5. 配列番号２のアミノ酸配列を有する、請求項１から３のいずれか１項に記載のペプチド
   由来分子。
6. 配列番号３のアミノ酸配列を有する、請求項１から３のいずれか１項に記載のペプチド
   由来分子。
7. 配列番号４のアミノ酸配列を有する、請求項１から３のいずれか１項に記載のペプチド
   由来分子。
8. 薬物として使用するための、請求項１から７のいずれか１項に記載のペプチド由来分子
   。
9. 抗腫瘍剤として使用するための、請求項１から７のいずれか１項に記載のペプチド由来
   分子。
10. 抗乳癌剤もしくは抗前立腺癌剤として、またはアンドロゲンレセプターを単独でもしく
    はエストラジオールレセプターとともに発現している他の癌に対して使用するための、請
    求項９に記載のペプチド由来分子。
11. 請求項１から７のいずれか１項に記載のペプチド由来分子を医薬的に許容可能かつ有効
    な量で含む薬剤組成物。
12. 前記ペプチドが、ＢＳＡもしくはＫＬＨなどの担体分子に連結されており、かつ／また
    は脂質粒子、ナノカプセル、リポソームもしくは脂質ベシクルなどの脂質組成物に医薬品
    賦形剤と共に含まれる、請求項１１に記載の組成物。
13. 少なくとも第２の抗癌剤をさらに含む、請求項１１または１２に記載の組成物。
14. 抗アンドロゲンポリペプチドに対する抗体を産生するための抗原としての、請求項１か
    ら７のいずれか１項に記載のペプチド由来分子の使用。
15. 薬物を調製するための、請求項１から７のいずれか１項に記載のペプチド由来分子の使
    用。
16. 前記薬物がワクチンである、請求項１５に記載の使用。
17. 請求項１から７のいずれか１項に記載のペプチド由来分子を特異的に認識することがで
    きる抗体。
18. 請求項１から７のいずれか１項に記載のペプチドをコードする核酸配列。
19. 請求項１から７に記載のペプチドを発現する組換えベクター。
20. 請求項１９に記載の組換えベクターを含む、哺乳動物、ヒトまたは細菌宿主細胞。
21. 請求項１から７のいずれか１項に記載のペプチド由来分子を癌細胞に提供することを含
    む、癌細胞を死滅させる方法。
22. 前記細胞が乳房細胞または前立腺細胞である、請求項２１に記載の方法。
23. 前記細胞に少なくとも第２の抗癌剤を提供することをさらに含む、請求項２１または２
    ２に記載の方法。
24. 請求項１から７のいずれか１項に記載のペプチド由来分子を治療量で癌を患う動物に投
    与することを含む、癌を患う動物を治療するための方法。
25. 請求項１１から１３のいずれか１項に記載の組成物を治療量で癌を患う動物に投与する
    ことを含む、癌を患う動物を治療するための方法。
26. 前記動物がヒトである、請求項２４または２５に記載の方法。
27. 単一または複数の容器内に検出可能な標識および免疫検出試薬に機能的に結合された、
    請求項１７に記載の抗体を含むキット。