KR101080851B1

KR101080851B1 - 동물 생식소에서의 스테로이드 합성 저해용 ａｒｒ19

Info

Publication number: KR101080851B1
Application number: KR1020090038430A
Authority: KR
Inventors: 이귀숙
Original assignee: 전남대학교산학협력단
Priority date: 2009-04-30
Filing date: 2009-04-30
Publication date: 2011-11-08
Also published as: KR20100119350A

Abstract

본 발명은 동물 생식소에서의 스테로이드 합성 저해용 ARR19(Androgen receptor corepressor-19kDa)에 관한 것으로, 보다 상세하게는 동물의 생식소내에서 호르몬인 테스토스테론(testosterone)의 합성을 저해하거나, 스테로이드 합성에 관여하는 효소인 StAR, 3β-HSD, P450scc, P450c17의 단백질 발현을 저해하는 것을 특징으로 하는 스테로이드 합성 저해용 ARR19에 관한 것이다.

본 발명의 스테로이드 합성 저해용 ARR19는 동물의 호르몬이 과다생성되어 나타나는 질병을 예방 및 치료하기 위하여 의약분야 등에 유용하게 사용될 수 있으며, 이를 통하여 체내의 항상성을 유지시키는 호르몬을 효과적으로 조절할 수 있는 부작용이 없는 조절제로서의 역할을 한다.

스테로이드 합성, ARR19(Androgen receptor corepressor-19kDa), StAR(steroid acute regulatory), 3β-HSD(hydroxysteroid dehydrogenase), P450scc, P450c17

Description

동물 생식소에서의 스테로이드 합성 저해용 ＡＲＲ19{Androgen receptor corepressor-19kDa as an inhibitor of steroid synthesis in animal reprpductive organ}

본 발명은 동물의 스테로이드 합성 저해용 ARR19(Androgen receptor corepressor-19kDa)에 관한 것으로, 보다 상세하게는 동물의 생식소내에서 호르몬인 테스토스테론(testosterone)의 합성을 저해하거나, 스테로이드 합성에 관여하는 효소인 StAR, 3β-HSD, P450scc, P450c17의 단백질 발현을 저해하는 것을 특징으로 하는 스테로이드 합성 저해용 ARR19에 관한 것이다.

내분비계는 호르몬의 작용에 의해 인체의 거의 모든 대사과정을 조절하는 시스템으로 우리 몸 속에서 분비되는 호르몬은 수천 가지가 넘는다. 내분비계는 아주 섬세하게 호르몬의 분비가 조절되는데 인체의 미세한 변화를 스스로 감지해서 부족한 호르몬을 더 분비하기도 하고, 호르몬의 작용이 조금이라도 과도해지는 경우는 아예 분비가 중단되기도 함으로써 항상성을 유지하고 있다. 그러한 이 항상성이 깨 짐으로 호르몬의 불균형이 오게 되면 많은 문제점을 초래하게 된다.

호르몬 중에서 남성의 성적인 발달과 생식을 담당하는 남성호르몬이 과다하게 분비되게 되면 전립선 비대증이나 전립선암, 탈모 등의 문제점등을 야기하게 된다. 따라서 이러한 문제점을 해결하기 위해 남성호르몬을 억제하는 치료법을 실시하게 되는데, 치료법으로는 일반적으로 남성호르몬이 많이 만들어지는 정소를 제거하는 수술을 실시하거나 방사선치료, 약물 치료를 실시하게 된다. 정소 제거 수술을 시행할 경우 남성으로서의 성기능을 상실하기도 하며, 수술의 부작용이 따른다. 수술 외에 방법으로 남성호르몬을 차단하기 위한 치료법으로 항안드로겐 물질이나 고나도트로핀-유리 호르몬(gonadotropin releasing hormone: GnRH) 아날로그 등을 사용하여 남성호르몬의 합성을 억제하는 약물치료를 하게 되는데 이러한 약물치료 후엔 얼굴이 화끈거리거나 가슴이 두근거리는 남성 갱년기 증상이 나타나며 유방이 여성처럼 커지기도 하는 부작용을 야기한다.

따라서 부작용이 많은 정소 제거 수술이나 고나도트로핀-유리 호르몬(gonadotropin releasing hormone: GnRH) 아날로그 사용 등에 의한 남성호르몬의 합성 억제 방법을 대체할 수 있는 새로운 치료법이 요구된다.

테스토스테론은 소, 말, 돼지 등의 고환에서 추출되는 스테로이드계의 웅성(雄性) 호르몬으로, 화학식 C19H28O2이며 콜레스테롤에서 디히드로에피안드로스테론(DHEA)을 거쳐 합성되고 웅성 생식기를 발육시키며 그 기능을 유지시킨다. 또한 웅성의 성징(性徵)을 발현시키며, 웅성 호르몬으로서 최초로 발견된 안드로스테론은 이 호르몬의 대사산물이다.

GFP는 green fluorescent protein의 약자로 Bioluminescent jellyfish라는 북태평양에 서식하는 해파리에서 395nm의 빛을 쬐면 510nm의 초록 형광(이 형광물질은 Calcium-binding photoprotein과 GFP의 두 단백질이 구성을 이룬다.)을 내는 Aequorin이라는 고유의 발광물질에서 추출해 낸 것이다. 실제로 어떤 유전자가 과발현 되었는지 알기 위해서는 항체 항원 반응을 이용한 immunocytochemistry과정을 거치며 직접 형광물질을 붙인 뒤에 관측해야하지만, GFP를 이용하면 그 단백질 자체에서 발광을 하는 특성을 가지고 있기 때문에 실험과정과 정량적으로 결과에 대한 측정을 더 쉽게 할 수 있다.

인체의 간장에서는 체내로 들어온 많은 화학물질들을 처리(산화, 분해, 변화 등)하여 체외로 배출할 수 있도록 하여준다. 이렇게 체내로 들어온 물질들을 간장에서 처리하는 것은 대체로 인체 내에서 어떤 작용, 특히 독성을 일으킬 물질들을 처리하여 무독한 물질로 만들려는 목적을 가지며, 이런 간장에서의 물질의 처리에 핵심 역할을 맡고 있는 것이 사이토크롬(시토크롬) P450 (cytochrome P450, 또는 간단히 CYP450) 이라고 불리는 효소이다.

이 CYP450 효소는 간장에서 가장 많이 발현되지만 간장에만 국한되어 존재하는 것은 아니고, 신장이나 내장의 표면세포 등 다양한 기관에서 발현되어 존재한다. 이들 중 하나인 P450scc는 C22및 C20위치에서 콜레스테롤의 수산화와 측쇄분해(side-chain cleavage, SCC)를 촉매하며 미토콘드리아 내막에 존재하는 효소이다. 또한 P450c17(CYP17, 17 alpha-hydroxylase/17,20 lyase)은 남성 호르몬 생산에 없어서는 안되는 핵심효소로 프레그네노론 (Pregnenolone)을 디히드로에피안드 로스테론(DHEA)로 전환시키는데 관여한다.

아데노바이러스는 1953년 W.P.로 및 휴브너 등이 인체에서 적출한 구개편도와 아데노이드의 조직배양에 의하여 발견한 바이러스로 1956년에 아데노바이러스라고 명명되었다. 현재 공통의 보체결합항원(補體結合抗原)을 가지며 혈청학적으로 식별되는 종류가 49형(型)까지 알려져 있다. 지름이 70nm 정도이며, 구형의 외형을 가진 아데노바이러스는 실험동물에게는 병원성(病原性)을 나타내지 않으나 사람에게는 호흡기나 눈의 점막, 또는 그 부근의 림프절에 침입하여 인두결막열(咽頭結膜熱), 유행성각결막염(流行性角結膜炎) 등의 질병을 일으키기도 한다.

본 발명의 목적은 부작용이 많은 정소 제거 수술이나 고나도트로핀-유리 호르몬(gonadotropin releasing hormone: GnRH) 아날로그 사용 등에 의한 호르몬의 합성 억제 방법을 대체할 수 있는 새로운 치료법을 제공하고자 함이다.

상기의 과제를 해결하고자, 본 발명은 동물의 생식소내에서 호르몬인 테스토스테론(testosterone)의 합성을 저해하거나, 스테로이드 합성에 관여하는 효소인 StAR, 3β-HSD, P450scc, P450c17의 단백질 발현을 저해하는 것을 특징으로 하는 스테로이드 합성 저해용 ARR19를 제공한다.

본 발명은 동물의 생식소에서 스테로이드의 합성을 저해하는 것을 특징으로 하는 스테로이드 합성 저해용 ARR19(Androgen receptor corepressor-19kDa)를 제공한다.

본 발명에서 상기 스테로이드 합성의 저해는 남성호르몬인 테스토스테론(testosterone)의 합성을 저해하는 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명에서 상기 스테로이드 합성의 저해는 스테로이드 합성에 관여하는 효소인 StAR(steroid acute regulatory), 3β-HSD(hydroxysteroid dehydrogenase), P450scc(side-chain cleavage) 및 P450c17(CYP17, 17 alpha-hydroxylase/17,20 lyase)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 단백질 발현을 저해하는 것을 특징으로 한다.

이하 본 발명의 스테로이드 합성 저해용 ARR19(Androgen receptor corepressor-19kDa)에 대하여 보다 상세하게 설명한다.

본 발명은 공지의 물질인 ARR19(Androgen receptor corepressor-19kDa)의 새로운 용도로의 발명으로서, 동물의 생식소에서 스테로이드 합성을 저해하는 용도에 관한 발명이라 할 수 있다.

본 발명은 바람직하게는 포유동물의 생식소에서 스테로이드 합성을 저해하는 용도에 관한 발명이라 할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 포유동물의 정소에서 스테로이드 합성을 저해하는 용도에 관한 발명이라 할 수 있다.

상기 ARR19(Androgen receptor corepressor-19kDa)는 고환과 전립선같은 남성 생식기관에서 발현되며, 마우스 cDNA 라이브러리에서 스크리닝을 통해 클로닝될 수 있다. ARR19은 안드로겐 수용체하고만 특이적으로 결합함으로써 안드로겐 수용체의 전사활성을 억제시키며, 이는 ARR19이 AR에 대한 히스톤 디아세틸레이즈 4(HDAC 4)를 끌어들임으로 인해서 일어난다. 본 발명은 상기의 물질을 이용하여 특정 스테로드계의 물질 합성을 저해하는 용도발명에 관한 것이다.

본 발명은 아데노바이러스를 매개로 한 ARR19(Androgen receptor corepressor-19kDa)를 이용하여 ARR19를 세포에서 과발현시켰을 때 남성호르몬인 테스토스테론(testosterone)의 합성을 저해할 뿐 아니라, 스테로이드 합성에 관여하는 단백질인 P450c17, P450scc, 3β-HSD, StAR의 발현을 저해한다는 것을 보여준다. 남성호르몬의 과생산에 의해 문제가 야기되는 경우 일반적으로 수술이나 방사선치료, 호르몬치료를 하게 되는데, 본 발명의 ARR19를 과발현시킴으로써 남성호르몬의 합성이 억제되고 남성호르몬을 합성하게 되는 효소의 발현도 저해하는 효과를 나타냄으로써 남성호르몬을 억제할 수 있는 새로운 치료제로 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

이하 본 발명의 실시예 및 실험예에 대하여 설명한다. 다만, 이하의 실시예 등은 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 권리범위를 이에 한정하고자 하는 것은 아니다.

<실시예> 재조합 아데노바이러스 ARR19(Androgen receptor corepressor-19kDa)의 제조

마우스(쥐)의 ARR19(Androgen receptor corepressor-19kDa) cDNA를 pAdTrack-CMV 셔틀 벡터로 클로닝 하여 pAdTrack-CMV-ARR19를 만들고, pAdTrack-CMV-ARR19와 아데노바이럴 유전자 운반 벡터를 AdEasy-BJ5138 컴피턴트 세포에 형질전환 시켜서 유전자 상동 재조합을 수행하였다. 재조합된 바이러스들만 선택하여 HEK-293 세포주에서 대조군으로 사용할 바이러스(Ad-GFP)와 함께 증폭시키고 세슘 클로라이드를 이용한 밀도구배 원심분리에 의해 재조합 바이러스를 정제한 후, 정제한 바이러스의 농도는 Adeno-Z Rapid titer (BD Bioscience, San Jose, CA)를 이용하여 측정하였다.

<실험예 1> 레이디그 세포주(Leydig cell)에서 ARR19의 과발현에 의한 남성호르몬 합성의 저해여부 실험

1. 실험방법

마우스(쥐)의 레이디그 세포주(Rat leydig cell)인 R2C 세포에 대조군인 아데노바이러스를 매개로 한 녹색형광단백질(GFP : Green fluorescent protein)과 실험군인 아데노바이러스를 매개로 한 ARR19(Androgen receptor corepressor-19kDa)를 감염시킨 후, 각 시간대별(0, 1, 2, 4, 6, 12, 24, 36시간)로 세포 배양액을 회수하여 방사면역측정법(radioimmune assay : RIA)을 통해 남성호르몬인 테스토스테론(testosterone)의 농도를 확인하였다.

2. 실험결과

실험결과 2, 4, 6시간에는 대조군에 비해 실험군에서 테스토스테론(testosterone)의 농도가 약간만 줄어들었으나 12시간째부터 대조군과 확연한 차이를 보였다. 36시간동안 아데노바이러스를 매개로 하여 ARR19(Androgen receptor corepressor-19kDa)를 과발현시켰을 때 남성호르몬인 테스토스테론(testosterone)의 합성이 대조군에 비해 2배 가까이 저해됨을 알 수 있었다(도 1 참조).

<실험예 2> 레이디그 세포주(Leydig cell)에서 ARR19의 과발현에 의한 스테로이스합성 효소 발현의 저해여부 실험

1. 실험방법

쥐의 레이디그 세포주(Rat leydig cell)인 R2C 세포에 대조군인 아데노바이러스를 매개로 한 녹색형광단백질(GFP : Green fluorescent protein)은 24시간 동안 감염시켰고, 실험군인 아데노바이러스를 매개로 한 ARR19(Androgen receptor corepressor-19kDa)는 일정시간동안(0, 1, 2, 4, 6, 12, 24시간) 감염시킨 후 세포를 회수하여 단백질을 추출하고 특수 단백질 검출 검사법(Western blot analysis)에 의해 스테로이드 합성에 관여하는 효소 단백질의 발현을 확인하였다. Actin은 단백질의 전체적인 양을 정량하기 위한 control로, ARR19(Androgen receptor corepressor-19kDa) 역시 ARR19이 확실히 과발현되며 발현되는 정도를 확인하기 위한 control로 사용하였다.

2. 실험결과

아데노바이러스를 매개로 한 녹색형광단백질(GFP : Green fluorescent protein)을 과발현시킨 대조군과 비교하였을 때, 0시간동안 아데노바이러스를 매개로 한 ARR19(Androgen receptor corepressor-19kDa)를 감염시킨 실험군에서는 대조군과 차이가 없으나 시간의 차이는 있으나 시간에 따라 P450c17, P450scc, 3β-HSD, StAR의 발현이 확실히 저해됨을 알 수 있었다. 특히 3β-HSD, StAR의 발현은 2시간째부터는 발현이 줄어들다가 다시 회복되는 양상을 보이고 있고, P450c17, P450scc의 발현은 시간에 따라 서서히 줄어들다가 24시간째에는 완전히 발현이 저해되었음을 알 수 있었다(도 2 참조).

<실험예 3> 쥐의 정소에서 ARR19의 과발현에 의한 남성호르몬 합성의 저해여부 실험

1. 실험방법

7주령의 C57BL/6 쥐의 정소에 대조군인 아데노바이러스를 매개로 한 녹색형광단백질(GFP : Green fluorescent protein)과 실험군인 아데노바이러스를 매개로 한 ARR19(Androgen receptor corepressor-19kDa)를 24시간동안 감염시킨 후 쥐의 정소를 회수하여 방사면역측정법(radioimmune assay : RIA)을 통해 남성호르몬인 테스토스테론(testosterone)의 농도를 확인하였다.

2. 실험결과

실험결과 대조군에 비해 ARR19를 과발현시킨 실험군에서 테스토스테 론(testosterone)의 농도가 줄어들었음을 알 수 있었다. 즉, 세포에서 실험한 것과 마찬가지로 동물에서도 ARR19의 과발현에 의해 남성호르몬의 합성이 저해되었음을 보여주었다(도 3 참조).

<실험예 4> 쥐의 정소에서 ARR19의 과발현에 의한 스테로이스합성 효소 발현이 저해여부 실험

1. 실험방법

7주령의 C57BL/6 쥐의 정소에 대조군인 아데노바이러스를 매개로 한 녹색형광단백질(GFP : Green fluorescent protein)과 실험군인 아데노바이러스를 매개로 한 ARR19(Androgen receptor corepressor-19kDa)를 24시간동안 감염시킨 후 쥐의 정소를 회수하여 단백질을 추출하고 특수 단백질 검출 검사법(Western blot analysis)에 의해 스테로이드 합성에 관여하는 효소 단백질의 발현을 확인하였다. Actin은 단백질의 전체적인 양을 정량하기 위한 control로, ARR19(Androgen receptor corepressor-19kDa) 역시 ARR19이 확실히 과발현며 발현되는 정도를 확인하기 위한 control로 사용하였다.

2. 실험결과

아데노바이러스를 매개로 한 녹색형광단백질(GFP : Green fluorescent protein)을 과발현시킨 대조군과 아데노바이러스를 매개로 한 ARR19(Androgen receptor corepressor-19kDa)를 감염시킨 실험군을 비교하였을 때, 대조군 1번 쥐 와 2번 쥐에서는 발현이 되고 있던 P450scc, P450c17이 ARR19를 과발현시킨 1번 쥐와 2번 쥐 모두에서 발현이 억제되었음을 보여주었다. 즉, 레이디그 세포주와 동물 실험 결과에서 ARR19의 과발현에 의해 스테로이드 합성에 관여하는 P450scc, P450c17 등의 단백질 발현이 확실히 저해됨으로 남성호르몬 합성이 억제될 수 있음을 보여주었다(도 4 참조).

본 발명인 ARR19의 스테로이드 합성 저해로의 용도는 기존의 남성호르몬 억제제 등의 부작용을 줄이고, 새로운 호르몬 치료제로서의 역할을 하여, 의약분야에서의 다양한 응용이 가능하며 궁극적으로는 국가의 산업발전에 이바지할 것으로 기대된다.

도 1은 쥐의 레이디그 세포주(Leydig cell)에서 ARR19의 과발현에 의한 남성호르몬 합성의 저해여부 실험결과로, 대조군인 아데노바이러스를 매개로 한 녹색형광단백질(GFP : Green fluorescent protein)과 실험군인 아데노바이러스를 매개로 한 ARR19(Androgen receptor corepressor-19kDa)를 감염시킨 후 각 시간대별(0, 1, 2, 4, 6, 12, 24, 36시간)로 세포 배양액을 회수하여 방사면역측정법(radioimmune assay : RIA)을 통해 남성호르몬인 테스토스테론(testosterone)의 농도를 확인한 결과를 나타낸다.

도 2는 쥐의 레이디그 세포주(Rat leydig cell)인 R2C 세포에 대조군인 아데노바이러스를 매개로 한 녹색형광단백질(GFP : Green fluorescent protein)은 24시간 동안 감염시켰고, 실험군인 아데노바이러스를 매개로 한 ARR19(Androgen receptor corepressor-19kDa)는 일정시간동안(0, 1, 2, 4, 6, 12, 24시간) 감염시킨 후 세포를 회수하여 단백질을 추출하고 특수 단백질 검출 검사법(Western blot analysis)에 의해 스테로이드 합성에 관여하는 효소 단백질의 발현을 확인한 결과를 나타낸다.

도 3은 쥐의 정소에서 ARR19의 과발현에 의한 남성호르몬 합성의 저해여부 실험으로, 대조군인 아데노바이러스를 매개로 한 녹색형광단백질(GFP : Green fluorescent protein)과 실험군인 아데노바이러스를 매개로 한 ARR19(Androgen receptor corepressor-19kDa)를 24시간동안 감염시킨 후 쥐의 정소를 회수하여 방사면역측정법(radioimmune assay : RIA)을 통해 남성호르몬인 테스토스테 론(testosterone)의 농도를 확인한 결과를 나타낸다.

도 4는 7주령의 C57BL/6 쥐의 정소에 대조군인 아데노바이러스를 매개로 한 녹색형광단백질(GFP : Green fluorescent protein)과 실험군인 아데노바이러스를 매개로 한 ARR19(Androgen receptor corepressor-19kDa)를 24시간동안 감염시킨 후 쥐의 정소를 회수하여 단백질을 추출하고 특수 단백질 검출 검사법(Western blot analysis)에 의해 스테로이드 합성에 관여하는 효소 단백질의 발현을 확인한 결과를 나타낸다.

<110> Chonnam University Academic Cooperation <120> Androgen receptor corepressor-19kDa as an inhibitor of steroid synthesis in animal reprpductive organ <140> 10-2009-0038430 <141> 2009-04-30 <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1107 <212> DNA <213> ARR19(Androgen receptor corepressor-19kDa) <400> 1 aggcccttga acaggtcagg agacaccagg ctctctctcg agctgggcct gttcagcgac 60 tgcagacaag gctgggcggt aggaagctga gaactacctg ctaacaacca tggcagcacc 120 gataaagttt ccatttcggc ccagaggagg tcagcccaga gaggacacga ccccaaaaag 180 ggggcttcga cgctatctat tggaattgaa agagagcaat aaagagttct ggctgtcagg 240 acacgccgtg ttcaagcttc tgtctttggg ctgcatgatc tctgcactag actactttga 300 aacaatgctc ccacatccgg tcctgatcct gctcatctgt atggaagcgg caatctgcat 360 attcttcatc ttccttaaca ccttagccat caacagatac attcccttcg tcttctggcc 420 tatggcggat atcttcaaca gcctgttctc ctgtgtgttc cttggaggtg gcatatactt 480 tgctttcaag gctagaagat tattgccaaa gccctactta actgctatga tcctcatggg 540 cgctgctgcg atctgttctt tcatcgacat gttacttcaa ttccaacact tcagaggcct 600 taggttaagg aagtggtaac tgtgacatct atgatctttt tcatcgtggg acaagcccct 660 gaaccatata tcgtcattac tgggtttgaa gtcaccatta ttttctgttt cgtagtcttg 720 tatatgtgca gacgtgacaa gataatgaaa tctttctttt ggcctttgct tgtaagtgat 780 gaacttcaac cttaaacctt aactaacttt cctgccttag gaagacacct tagtcaacta 840 cttgaatctc ctaaatcttt aaggtgatct ctgctcactg cttgggggat gctctcaggg 900 attcaggata cccacagaac ataagttctc tttactctat ctaccagtag gtatggctga 960 cctttctctt aactataaat gttatgaaat ataatctggt ggccggccgg ggtacctgga 1020 ggacccatgc caagctgtgc aactgagaaa taaaccccat gaaacagaaa aaaaaaaaaa 1080 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 1107

Claims

서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 ARR19(Androgen receptor corepressor-19kDa)를 이용하여 인간을 제외한 동물의 생식소에서 스테로이드의 합성을 저해 시키는 방법.
제1항에 있어서, 상기 스테로이드 합성의 저해는 테스토스테론(testosterone)의 합성을 저해하는 것을 특징으로 하는, 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 ARR19를 이용하여 인간을 제외한 동물의 생식소에서 스테로이드의 합성을 저해 시키는 방법.
제1항에 있어서, 상기 스테로이드 합성의 저해는 스테로이드 합성에 관여하는 효소인 StAR, 3β-HSD, P450scc 및 P450c17로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 단백질 발현을 저해하는 것을 특징으로 하는, 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 ARR19를 이용하여 인간을 제외한 동물의 생식소에서 스테로이드의 합성을 저해 시키는 방법.