JP2019112379A - 抗酸化用組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
アンペロプシンを含む植物である藤茶は、中国を主産地とするブドウ科蛇葡萄属に分類され、中国名を顕歯蛇葡萄という。学名は、Ampelopsis grossedentataである。この植物は、主には中国の広西、広東、雲南、貴州、湖南、湖北、江西、福建などの省並びに自治区に分布している。中国の広西、湖南などの省や自治区の壮族や瑶族の人々がこの茎および葉から作った飲料をお茶として常用しており(これを「藤茶」と呼んでいる)、また風邪、のどの痛みなどにも利用されている。アンペロプシンは、藤茶の示す各種生理活性や薬理活性、例えば肝臓疾患の治療作用(特許文献1)、リパーゼ阻害作用(特許文献2)、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害作用(特許文献3)、抗菌作用(特許文献4)、香料の劣化防止作用(特許文献5)、色素の褪色防止作用(特許文献6)等の作用や活性の本体として特定されている。
本発明は、この知見に基づきなされたものであって、アスコルビン酸とアンペロプシンを含有する新たな抗酸化用組成物を提供することを課題とする。
(1)アスコルビン酸とアンペロプシンを含有する抗酸化用組成物。
(2)アスコルビン酸90質量部に対しアンペロプシンを0.5〜10質量部含有する(1)に記載の抗酸化用組成物。
(3)アンペロプシンが藤茶抽出物由来であることを特徴とする(1)または(2)に記載の抗酸化用組成物。
(4)抗酸化作用が一重項酸素消去作用である(1)〜(3)のいずれかに記載の抗酸化用組成物。
すなわち、乾燥させた藤茶の枝葉部を含水エタノールで抽出した抽出物を濃縮し、例えば多孔性樹脂(DIAION HP−20)を用いたカラムクロマトグラフィーにかけ、80容量%含水メタノールで溶出される分画にアンペロプシンが得られる。これを逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィーや再結晶により、更に精製することができる。精製されたアンペロプシンは、試薬としても販売されており、これを用いることもできる。
乾燥した藤茶の葉又は茎の粉砕物又は粉末を抽出原料とし、水若しくは親水性有機溶媒又はこれらの混合溶媒に投入し、室温乃至溶媒の沸点以下の温度で任意の装置を用いて抽出することにより得ることができる。
また、これら親水性有機溶媒と水との混合溶媒などを用いることができる。なお、水と親水性有機溶媒との混合系溶媒を使用する場合には、低級アルコールの場合は水10質量部に対して30〜90質量部、低級脂肪族ケトンの場合は水10質量部に対して10〜40質量部、多価アルコールの場合は水10質量部に対して10〜90質量部添加することが好ましい。
したがって、上記の藤茶から抽出しアンペロプシンの濃度を高めた抽出物も本発明の組成物として使用可能である。
・試料溶液の調整
HPLC法で調整したメンブランフィルターでのろ過前に試料溶液(24μg/ml)を30%メタノール(0.5%アスコルビン酸含有)にて正確に5倍希釈し、0.2μmのメンブランフィルターでろ過したものを標準溶液とする。
試料約30mgを精秤し、30%メタノール(0.5%アスコルビン酸含有)を加えて超音波にて溶解し、正確に50mLとする。この溶液1mLを30%メタノール(0.5%アスコルビン酸含有)にて25mLに正確に希釈し、0.45μmのメンブランフィルターでろ過したものを試料溶液とする(24μg/ml)。
HPLC法で調整した8μg/ml標準溶液を30%メタノール(0.5%アスコルビン酸含有)にて正確に5倍希釈し、1.6μg/ml標準溶液を調整する。これを30%メタノール(0.5%アスコルビン酸含有)にて正確に5倍希釈し、0.32μg/ml標準溶液を調整する。8μg/ml標準溶液、1.6μg/ml標準溶液、0.32μg/ml標準溶液を0.2μmのメンブランフィルターでろ過し、標準溶液とする。
標準品10.00mgを精秤し、メタノール(0.5%アスコルビン酸含有)を適量加えて超音波処理して溶解し、メタノール(0.5%アスコルビン酸含有)を加えて正確に25mLとする。その溶液を5mlとり12.5%メタノール(0.5%アスコルビン酸含有)を加えて正確に25mlとする。その溶液を4mlとり30%メタノール(0.5%アスコルビン酸含有)を加えて正確に20mlとし、16μg/mL標準溶液を調整する。これを正確に2倍希釈し、8μg/ml標準溶液とする。これを正確に2倍希釈し、4μg/ml標準溶液とした。0.45μmのメンブランフィルターでろ過したものを標準溶液とする。
LC装置:ACQUITY UPLC (Waters)
MS装置:TOD(Waters)
カラム:ACQUITY UPLC BEH C18(1.7 μm, 100x2.1 mm i.d., Waters)
カラム温度:40 ℃
移動相:A) 0.1% formic acid/Ultra Pure Water,
B) 0.1% formicacid/MeCN
10%B溶液で、7分間イソクラティック分析。その後カラム洗浄のため、2分間かけてリニアで90%B溶液まで上げ、0.5分で10%B溶液にリニアで戻し、4分間10%B溶液で再安定化させてから次の分析を実施する。
流速:0.4 mL/min
注入量:2.0 μL
検出器:UV 290 nm, MS(M.w. 319.0434)
MS条件:Polarity ES-(capillary voltage 1.8 kV, sampling cone 40 V, extraction cone 4.0 kV, cone Voltage: 20 V, source temp. 150℃, desolvation temp. 400℃, cone gas flow 50 L/h, desolvation gas flow 1000 L/h, Mass scan range: 100-1000 Da, Scan time: 0.2 sec-1.
MRM condition:precursor ion>production:318.83>192.90
検出感度の点からPolarity ES-を使用した。
オートサンプラー:5℃
標準品成績書に記載の純度(HPLC純度・水分値)で補正し算出する。
1.試験方法
評価は、ESR(電子スピン共鳴)測定によって行った。試験対象物はアスコルビン酸及び藤茶より精製したアンペロプシンである。
<ESR測定条件>
ESR−JES−RE1X:日本電子製を用いた。
ESRスペクトルは、試料中の有機ラジカルを示している。
使用したESRの測定条件を示す。
共鳴周波数:9.40GH
出力:4.0mW
磁場変調:100kH
観測磁場:335.5±5mT
測定時間:1.0min
変調幅:0.1mT
増幅率:500
応答時間:0.1sec
SLL−4100S RGB((有)シマテック製)を用いた。
一検体における試薬の添加量を以下に示す。各評価検体は適宜、40%(v/v)DMF溶媒で希釈して評価検体とした。
下記に示す1)〜4)の順番で試薬溶液を加えていった。
1)評価検体 溶媒:40%(v/v)N,N−ジメチルホルムアミド(DMF)100μL
2)生理食塩水 20μL
3)4−OH TEMP 溶媒:40%(v/v)DMF100mM、40μL(終濃度20mM)
4)ローズベンガル溶媒:40%(v/v)DMF100μM、40μL(終濃度20μM)
評価濃度1点につき、n=3を設定した。全量200μlを96well plateに滴下し、緑色光(λmax:525nm)照射によるローズベンガルの光増感反応によって反応する一重項酸素と、溶液中に存在している4−OH TEMP(2,2,6,6−tetramethyl−4−piperidinol)とのadduct(≒付加体)[2,2,6,6−tetramethyl−4−hydoxy−piperidinyloxy(4−OH TEMPO)radical]についてESR(電子スピン共鳴)測定をおこなった。光照射装置はLED(Light Emitting Diode Green(ΙMAX=530nm)光源のSLL−4100S RGB((有)シマテック製)を用い、照射時間20minのESRシグナル強度(Sn)から次の計算式で一重項酸素消去率を求めた。
一重項酸素消去率(%)=100−100×(Sn(検体濃度X)/Sn(コントロール)
フリーラジカル解析システム Win−RAD(ラジカルリサーチ製)を用いてESRスペクトルのデータ取り込みとシグナル比Sn(有機ラジカル/Mnマーカーのシグナル比)の数値化を行った。
各検体の各濃度における消去能%に基づき、IC50(50%消去濃度)およびIC30(30%消去濃度)を算出した。
[各検体における抗酸化成分濃度] vs [F/1−F]
*F/(1−F)・・・(F=(1/100)×Q、Qは一重項酸素消去率)
x軸→[抗酸化成分濃度] y軸→[F/1−F]をプロットして、y=1に対するx値(濃度)からIC50(50%消去)濃度を、y=0.429に対するx値(濃度)からIC30(30%消去)濃度を求めた。1点の濃度についてn=3で測定し、最低3点の濃度における結果から導かれた近似式に基づいて50%消去濃度や30%消去濃度を算出した。図1にアスコルビン酸の一重項酸素消去能を求めるための検量線を図示する。
(1)IC30値
アンペロプシン及びアスコルビン酸のIC30(30%消去濃度)は下記の表1の値を示した。
アスコルビン酸0.00147質量%に対して、アンペロプシンを1/90の濃度(0.0000163質量%)になるように添加した場合の一重項酸素消去能を測定した結果を下記の表2に示す。
Claims (4)
- アスコルビン酸とアンペロプシンを含有する抗酸化用組成物。
- アスコルビン酸90質量部に対しアンペロプシンを0.5〜10質量部含有する請求項1に記載の抗酸化用組成物。
- アンペロプシンが藤茶抽出物由来であることを特徴とする請求項1または2に記載の抗酸化用組成物。
- 抗酸化作用が一重項酸素消去作用である請求項1〜3のいずれかに記載の抗酸化用組成物。
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