JP2019099560A

JP2019099560A - 大腸菌及びエンテロコッカス・フェカーリスを含む皮膚科組成物

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Publication number: JP2019099560A
Application number: JP2018220475A
Authority: JP
Inventors: ミュラー，ハンス・ヨルク; Mueller Hans-Joerg; ミハエルシュミッツ，トーマス; Michael Schmidts Thomas; ツィンマーマン，クルト; Zimmermann Kurt; ルッシュ，フォルカー; Rusch Volker
Original assignee: Symbiogruppe & Co KG GmbH; Symbiogruppe GmbH and Co KG
Current assignee: Symbiogruppe & Co KG GmbH; Symbiogruppe GmbH and Co KG
Priority date: 2017-11-29
Filing date: 2018-11-26
Publication date: 2019-06-24
Also published as: US20190160116A1; KR20190063422A; EP3492089A1; RU2018142254A3; US10933103B2; ES2861306T3; PL3492089T3; CN109846907A; CA3024590A1; DK3492089T3; EP3492089B1; RU2018142254A

Abstract

【課題】皮膚科的な状態や疾患の治療，補助療法，又は予防において使用するための組成物の提供。【解決手段】不活性化された大腸菌及びエンテロコッカス・フェカーリスの混合物の有効量並びに薬剤学的に許容し得る助剤及び／又は担体を含んでなる組成物。【選択図】なし

Description

本発明は，皮膚科組成物に関し，特に大腸菌及びエンテロコッカス・フェカーリスを含む，皮膚科的な状態や皮膚科疾患の治療及び予防のための組成物に関する。

皮膚の最も重要な機能は，バリア機能，即ち，生体を乾燥や種々の外的影響から防護することである。外側の皮膚層（表皮）は，その機能において役割を本来演じている。表皮は，外部環境とのインターフェースであり，絶えず柔らかくしなやかであり続けなければならない。ここで，皮膚の水和が非常に重要な役割を演じている。皮膚の水分は，表皮において，皮膚の再生過程で恒常的なベースで補充を受けている脂質とタンパク質による諸構造からなる系において，柔軟剤として働いている。

乾燥肌をもたらす種々の皮膚疾患があり，皮膚が上記バリア機能を提供するのを妨げている。

この問題を解決するための薬剤学及び化粧品の面からの様々のアプローチは，障害された皮膚を，水分提供組成物により及び／又は保護層で水分損失を防ぐことにより再水和する物質の使用に基づいている。

本発明の目的は，従って，皮膚科的な状態や疾患の治療，補助療法，又は予防において使用される新規の組成物を提供することである。

上記の目的は，特許請求の範囲の各請求項に係る主題によって達成される。

即ち，皮膚科的な状態や疾患の治療，補助療法，又は予防において使用するための，不活性化された大腸菌（Escherichia coli）及びエンテロコッカス・フェカーリス（Enterococcus faecalis）の混合物の有効量並びに薬剤学的に許容し得る助剤及び／又は担体を含んでなる薬剤組成物が開示される。

当該組成物は，局所適用可能な形態であってよい。

大腸菌及びエンテロコッカス・フェカーリスは，溶菌物として提供してよい。

大腸菌及びエンテロコッカス・フェカーリスの混合物は，組成物全体の１〜９５重量％，２０〜８０重量％，４０〜６０重量％，又は４５〜５５重量％の量で含まれていることができる。

上記混合物中，大腸菌及びエンテロコッカス・フェカーリスは，０．５：１．５〜１．５：０．５，０．７５：１．２５〜１．２５：０．７５，又は１．１５：０．８５〜０．８５：１．１５，又は１．０５：０．９５〜０．９５：１．０５の比率で含まれていることができる。

大腸菌及びエンテロコッカス・フェカーリスは，総質量１００ｇ当たり，各々０．５×１０^７〜１０×１０^７個，１．０×１０^７〜７×１０^７個，１．５×１０^７〜４．５×１０^７個の細胞数で含まれていることができる。

皮膚科的疾患又は皮膚科的状態は，乾燥肌，経表皮水分損失，炎症性皮膚疾患，神経皮膚炎，またはそれらの組合せから選ばれることができる。

本組成物は，軟膏，液体，エマルジョン，又は溶液の形態であることができる。

更に開示されているのは，不活性化された大腸菌及びエンテロコッカス・フェカーリスの混合物の有効量を含んでなる化粧用組成物である。

当該化粧用組成物は，局所適用可能な形態であることができる。

当該化粧用組成物中，エンテロコッカス・フェカーリスは，溶解物の形態で含まれていることができる。

当該化粧用組成物中，大腸菌とエンテロコッカス・フェカーリスとの混合物は，組成物全体の１〜９５重量％，２０〜８０重量％，４０〜６０重量％，又は４５〜５５重量％の量で含まれていることができる。

当該化粧用組成物中，大腸菌とエンテロコッカス・フェカーリスは，０．５：１．５〜１．５：０．５，０．７５：１．２５〜１．２５：０．７５，又は１．１５：０．８５〜０．８５：１．１５，又は１．０５：０．９５〜０．９５：１．０５の比率で含まれていることができる。

当該化粧用組成物中，大腸菌とエンテロコッカス・フェカーリスは，総質量１００ｇ当たり，各々０．５×１０^７〜１０×１０^７個，１．０×１０^７〜７×１０^７個，１．５×１０^７〜４．５×１０^７個の細胞数で含まれていることができる。

当該化粧用組成物の適応する用途は，乾燥肌又は経表皮水分損失から選ばれることができる。

当該化粧用組成物は，軟膏，液体，エマルジョン，又は溶液の形態であることができる。

薬剤組成物又は化粧用組成物の製造のための方法が更に開示され，当該方法によれば，不活性化された大腸菌及びエンテロコッカス・フェカーリスの混合物の有効量と薬剤学的に又は化粧品として許容し得る助剤及び／又は担体が，上記の皮膚科的に有効な薬剤組成物又は化粧用組成物を得るように混合される。

１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦαによる処置（対照（Control）はＴＮＦα不使用），及び被験物質（ＰＳＦ）又はヒドロコーチゾン（ＨＣ）と共に（別途示さない限り）７２時間インキュベートした後のＨａＣａＴ細胞における，ＩＬ−８の定量：平均値±標準誤差，ｎ＝３（それぞれ３重に測定）。１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦαによる処置（対照（ControlはＴＮＦα不使用），及び被験物質（ＰＳＦ）又はヒドロコーチゾン（ＨＣ）と共に（別途示さない限り）７２時間インキュベートした後のＨａＣａＴ細胞における，対照との相対比較でのＴＮＦα（７２時間）によるＩＬ−８分泌：平均値±標準誤差，ｎ＝３（それぞれ３重に測定）。１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦαによる処置（対照（Control）はＴＮＦα不使用），及び被験物質（ＰＳＦ）又はヒドロコーチゾン（ＨＣ）と共に（別途示さない限り）７２時間インキュベートした後のＨａＣａＴ細胞における，ＩＬ−６の定量：平均値±標準誤差，ｎ＝３（それぞれ３重に測定）。１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦαによる処置（対照（Control）はＴＮＦα不使用），及びＰＳＦ又はヒドロコーチゾン（ＨＣ）と共に（別途示さない限り）７２時間インキュベートした後のＨａＣａＴ細胞における，対照との相対比較でのＴＮＦα（７２時間）によるＩＬ−６分泌：平均値±標準誤差，ｎ＝３（それぞれ３重に測定）。

不活性化された細菌の混合物とは，生存可能でない，即ち，もはや代謝を行っておらず及び／又は増殖能力がない細菌の混合物をいう。不活性化された細菌は，放射線又は紫外線の照射，加熱，凍結，界面活性剤又は塩類等のような細菌の外被に孔をあける物質による処理，溶解，例えば，細胞膜を破壊する急減圧（例えば，フレンチプレス）により得ることができる。

溶解物は，所望の数の細菌を含む液体培養物を１０〜２０，１２〜１８，１３〜１７，又は１４〜１６分間，例えば，５０〜１５０，７０〜１３０，又は８０〜１２０ｒｐｍで撹拌してホモジナイズすることによる溶解によって製造することができる。ホモジナイズされた液体培養物は，次いで，例えば１２１℃（例えば，１２１℃〜１３０℃，１２１℃〜１２５℃，又は１２１℃〜１２３℃）で少なくとも２０分間（例えば，２０〜４０分間，２０〜３０分間，又は２０〜２５分間），慣用のオートクレーブ処理に付され，即ち滅菌される。得られた溶解物は，次いで冷却される（例えば，１８〜２０℃）。

有効量とは，望む治療効果を得るに十分な成分量をいう。

数字の前に「約」を付したときは，問題の数値の±２０％の範囲の値，より好ましくは±１０％の範囲の値をいい，又は特に好ましくは±５％の値の範囲をいう。

各セクション見出しは，本開示の理解を容易にするためのものであり，ある開示を他の開示から分離するものではない。特に，あるセクション見出しに続く各開示は，１つ又は２つ以上の他のセクション見出しに続く開示と組み合わせることができる。

〔組成物〕
不活性化された大腸菌及びエンテロコッカス・フェカーリスの混合物の有効量を含んでなる組成物が開示される。当該組成物は，薬剤組成物又は化粧用組成物であることができる。

好ましくは，大腸菌は，E. coli DSM 17252である。

好ましくは，エンテロコッカス・フェカーリスは，Enterococcus faecalis DSM 16440である。

好ましくは，当該混合物は，E.coli DSM 17252とEnterococcus faecalis DSM 16440との混合物である。

当該組成物は，溶解物の形態であることができる。好ましくは，溶解物は，それらの細菌の溶解性及び非溶解性の全ての成分を含んでなり，従って，水性懸濁液の形態である。当該溶解物は，例えば上述のようにして得ることができる。

大腸菌とエンテロコッカス・フェカーリスとの混合物は，組成物全体の１〜９５重量％，１０〜９０重量％，２０〜８０重量％，３０〜７０重量％，４０〜６０重量％，４５〜５５重量％，５０〜５４重量％，又は５２〜５３重量％の量で含まれていることができる。

混合物中，大腸菌及びエンテロコッカス・フェカーリスは，０．５：１．５〜１．５：０．５，０．７５：１．２５〜１．２５：０．７５，又は１．１５：０．８５〜０．８５：１．１５，又は１．０５：０．９５〜０．９５：１．０５の比率で含まれていることができる。

大腸菌及びエンテロコッカス・フェカーリスは，総質量１００ｇ当たりそれぞれの細胞につき，０．５×１０^７〜１０×１０^７個，１．０×１０^７〜７×１０^７個，１．５×１０^７〜４．５×１０^７個の細胞数で含まれていることができる。細胞数の語は，細胞不含の溶解物の場合，当該溶解物を製造するのに用いた細胞数をいう。

薬剤学的組成物又は化粧用組成物は，薬剤学的に許容し得る助剤及び／又は担体を含む。

当該組成物は，従って，所望により次のものを含むことができる（名称は「化粧品成分の国際命名法」，ＩＮＣＩ，に従い，ここに，一般に用いられている場合には慣用のドイツ製品名も示す。）：

Simmondsia chinensis （ホホバ）種油，特に０．５〜１０重量％又は約３．００重量％のSimmondsia chinensis種油（天然のホホバワックス）。

カプリル酸／カプリン酸トリグリセリド，特に，１〜２０重量％又は約１６．８０重量％のカプリル酸／カプリン酸トリグリセリド（中鎖トリグリセリド）。

ミツロウ，特に，０．１〜３．０重量％，又は好ましくは約０．５０重量％のミツロウ。

水添ヒマシ油，特に，０．１〜３．０重量％，又は約２．０重量％の水添ヒマシ油。

セチルＰＥＧ／ＰＰＧ−１０／１ジメチコン，特に，１．０〜４．０重量％又は約２．０重量％のセチルＰＥＧ／ＰＰＧ−１０／１ジメチコン（Abil EM 180）。

パルミチン酸セチル，特に，０．１〜３．０重量％又は約０．３重量％のパルミチン酸セチル。

ジベヘン酸グリセリル，トリベヘニン，ベヘン酸グリセリル，スクワラン，セラミド３，セラミド３Ｂ，セラミド６，及びコレステロールの混合物，特に，ジベヘン酸グリセリル，トリベヘニン，ベヘン酸グリセリル，スクワラン，セラミド３，セラミド３Ｂ，セラミド６，コレステロール，及びフィトスフィンゴシンの混合物の０．１〜１０．０重量％又は約０．５重量％（ここに，当該混合物は，約５６．０〜７５．０重量％のスクワランと，ジベヘン酸グリセリル，トリベヘニン及びベヘン酸グリセリルの重量で約１：１：１の混合物の約５．０〜１５．０重量％と，セラミド３及びセラミド３Ｂの重量比で約１：１の混合物の１．０〜５．０重量％，約０．１〜１．０重量％のセラミド６，及びコレステロールとフィトスフィンゴシンの重量比で約１：１の混合物の約５．０〜１５．０重量％を含む混合物であって，全ての含量の合計は１００重量％である）。

メマツヨイグサ油，特に，０．５〜１０重量％又は約２．００重量％のメマツヨイグサ油（所望により，酸化防止に十分な量の所望のトコフェロール，ビタミンＥで安定化されたイブニングプリムローズオイルを含む）。

スクワラン，特に１．０〜２０重量％又は約６．０重量％のスクワラン（このスクワラン量は，組成物中に含まれる他の量のスクワランに追加される），

アーモンドオイル，特に，０．５〜２０重量％又は約２．５０重量％のアーモンドオイル，

アボガドオイル，特に，０．５〜１０重量％又は約２．００重量％のアボガドオイル（精製アボガドオイル），

酢酸トコフェロール，特に，０．１〜５重量％又は約０．５重量％の酢酸トコフェロール（ビタミンＥアセテート），

シアバター，特に，０．１〜５重量％又は約０．５重量％のシアバター，

ペンチレングリコール，特に１．０〜５．０重量％又は約４．０重量％のペンチレングリコール，

グリセロール，特に，１．０〜５．０重量％又は約４．０重量％のグリセロール（グリセロール９９％），

ヒアルロン酸ナトリウム，特に，０．０１〜０．５重量％又は約０．１０重量％のヒアルロン酸ナトリウム，

パンテノール，特に，０．１〜５．０重量％又は約１．０重量％のパンテノール（７５％デクスパンテノール），

ベタイン，特に，０．１〜５．０重量％又は約０．３重量％のベタイン，

硫酸マグネシウム，特に，０．１〜３．０重量％又は約０．８重量％の硫酸マグネシウム（硫酸マグネシウム七水和物），

乳酸ナトリウム，特に，０．０５〜１．００重量％又は約０．１０重量％の５０％乳酸ナトリウム（乳酸ナトリウム５０％），

グルコン酸ナトリウム，特に，０．０５〜３．００重量％又は約０．１０重要％のグルコン酸ナトリウム，及び／又は

乳酸，特に０．０１〜１．００重量％の乳酸（９０％）（乳酸９０％）。

好ましくは，当該組成物は，上述の全ての助剤を含んでなる。上述の助剤のうちの１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１及び２２種の全ての組合せも開示されている。

好ましくは，当該組成物は，１０，９，８，７，６，５，４，３，２，１，０．１，０．００１，又は０．０００１重量％の不飽和脂肪酸又は０重量％の不飽和脂肪酸を，遊離の及び／又はエステル化された形で含む。不飽和脂肪酸は，少なくとも１個の二重結合を有する脂肪酸であり，ここに，本開示中のセラミドは当該不飽和脂肪酸のうちには含まれず，従って，当該組成物に含まれることができる。

当該組成物のｐＨは４〜６又は４．５〜５である。ｐＨは，好ましくは，薬剤学的に許容し得る酸，好ましくは薬剤学的に許容し得る有機酸の添加により調整される。特に好ましくは，ｐＨ調整に用いられる酸は，乳酸である。

〔皮膚科的な状態及び疾患〕

当該薬剤組成物は，皮膚科的な状態や疾患の治療，補助療法，又は予防において使用される。好ましくは，皮膚科的な状態及び皮膚科の疾患は，乾燥肌，経表皮水分損失，炎症性皮膚疾患，及び神経皮膚炎から選ばれる。

特に，当該薬剤組成物又は化粧用組成物は，インターロイキン８の（おそらく亢進した）放出により特徴づけられる皮膚疾患又は皮膚状態の治療に適している。インターロイキン８の亢進した放出とは，健康な皮膚をもつ患者におけるインターロイキン８の分泌を少なくとも５％，１０％，２０％，３０％，４０％，５０％又は１００％上回る放出をいう。本発明の組成物は，インターロイキン８の放出を少なくとも１０％，２０％，３０％，４０％，５０％又は１００％だけ減少させることができる。インターロイキン８は，炎症を起こした組織で放出され，従って，上述の皮膚科疾患又は皮膚科的状態において放出される。インターロイキン８の放出の減少は，罹患した組織における炎症緩解の特徴である。

「乾燥肌」という皮膚科的な状態及び皮膚科疾患は，過度に低い油脂及び／又は水分の含量と，くすんだ，色褪せた皮膚の外観，弾性の低下，緊張の感覚，及び痒みという症状により特徴づけられる。

経表皮水分損失（ＴＥＷＬ）とは，皮膚からの水の蒸発をいい，但し発汗を含めない，というのも，水は発汗及び受動的拡散という２つのルート仕方で皮膚を介して放出され得るからである。皮膚を介した受動的拡散のプロセスは，経表皮水分損失という。ＴＥＷＬは，角質層の健全性に強く依存している。従って，ＴＥＷＬは，皮膚の状態を評価するのに用いることができる値である。本発明の組成物は，ＴＥＷＬを減少，特に，少なくとも５％，１０％，１５％，２０％，２５％，３０％，４０％又は５０％減少させるのに適している。

この目的のために知られている如何なる方法も，ＴＥＷＬを測定するために使用することができ，例えば，無換気チャンバー，換気チャンバー，蒸気圧グラジエント（例えば，テヴァメーター（Tewameter））又はコルネオメーターを用いることができる。

コルネオメーターを用いた測定の原理において，表皮の「外側層」（角質層）の皮膚の水和を定量するために，静電容量測定が行われる。この原理は，水と他の物質との間の比誘電率の差に基づく。対応して構成された測定用コンデンサが，その測定体積中に配置された種々の静電容量を有するサンプルと反応し，サンプルの静電容量が，装置により完全自動で検出され評価される。活性プローブは，特殊なガラスでコートされており，測定すべき皮膚部位に押し当てられ，１秒後には，コルネオメーター測定値，即ち皮膚表面の水和の程度を，表示装置が示す。特殊な設計により，いつの場合もプローブの活性な端面が，全ての届かない皮膚部位も含め，様々な皮膚部位に対し一定の力で押し当てられることが保証されている。

コルネオメーターは，電極ハウジングとこれに付随する測定用センサーから構成されている。このセンサーは，特別のコネクターを備えた螺旋形ケーブルを介して電極ハウジングに接続されている。測定値は，電極ハウジングにある表示領域に最大３桁を有する数として表示される。表示領域はまた，追加の情報機能も行う。

測定用センサーは正方形である。その活性末端は，特殊なガラスでコートされており，軸方向に可動で，少なくとも３ｍｍのシフト幅を有している。測定原理は，端面が一定の圧力下に平らに置かれることを必要とする。そのことができるだけ再現可能であることを保証するよう，測定用ヘッドの端面は非常に小さいものであるようにく（７×７ｍｍ）構成されている。内側の可動部分，即ち活性な端面は，バネにより，何れの場合も３．５Ｎの力で皮膚に押し当てられる。

コルネオメーターは全自動であることができる。測定を行うためには，測定すべき皮膚部位に測定ヘッドが押し当てられる。１秒後，測定値が表示される。

コルネオメーターの表示値は，例えば，化粧品又は薬剤製品による皮膚の処置の前後における皮膚表面の水和の程度を示す，即ち，この装置は，皮膚表面の水和の変化の状態を示す。

測定は，組成物の塗布後の一定時間窓の範囲内で行うことができる。

炎症性皮膚疾患は，種々のアレルゲンによって引き起こされる皮膚疾患，蕁麻疹，肥満細胞腫，湿疹，皮膚炎，薬物発疹，苔癬，結節性紅斑，若年性黄色肉芽腫，環状肉芽腫，壊疽性膿皮症，及び／又はリポイド類壊死症である。特に，湿疹は，アトピー性湿疹（神経皮膚炎ともいう），アトピー性皮膚炎，及び内因性湿疹を含む。

〔適用形態〕

本組成物は，特に，組成物を皮膚に外用することにより，局所適用することができ，ここに皮膚は，粘膜，特に鼻腔粘膜を含まない。

適用は，１，２，３，４，５，６，又は７日の期間にわたって行うことができる。適用は，１，２，３，４，５，６，又は７週の期間にわたって，好ましくは４週間にわたって行うことができる。適用は，１日当たり１，２，３，４，又は５回行うことができ，好ましくは１日２回行なうことができる。１に複数回適用する場合，それらの適用は，好ましくはほぼ等間隔で行う。

特に好ましくは，組成物の適用は，４週間にわたって１日２回の投与（好ましくは１２時間間隔で）行われる。

〔製造方法〕

更に開示されているのは，薬剤組成物又は化粧用組成物の製造方法であり，ここに大腸菌及びエンテロコッカス・フェカーリスの有効量が，薬剤学的に又は化粧品として許容し得る助剤及び／又は担体と，上述の皮膚科的に有効な薬剤組成物又は化粧用組成物を得るために混合される。

好ましくは，得られる組成物はエマルジョンである。

エマルジョンは，周知の方法で製造することができる。例えば，エマルジョンは，次の方法で製造することができ，ここに使用量は，不活性化させた大腸菌及びエンテロコッカス・フェカーリスの混合物について及び助剤について上述した量に対応する：

ペンチレングリコールとグリセロール中にヒアルロン酸ナトリウムを分散させ，Ｃ相を得る。

不活性化させた大腸菌及びエンテロコッカス・フェカーリスを含むこの混合物を，水溶液の形で，パンテノール，ベタイン，硫酸マグネシウム，乳酸ナトリウム，グルコン酸ナトリウム及び乳酸と混合し，Ｄ相を得る。次いでＤ相をＣ相に加え，Ｅ相を得る；

Ｅ相を，ヒアルロン酸ナトリウムが（澄明に）溶解するまで撹拌する。

Ｅ相を有機酸，例えば乳酸で，ｐＨ４．０〜５．５又は４．５〜５．０に調整する；

Ｅ相を約７５℃に加熱する。

成分として，ホホバ種油，カプリル酸／カプリン酸トリグリセリド，ミツロウ，水添ヒマシ油，セチルＰＥＧ／ＰＰＧ−１０／１ジメチコン，パルミチン酸セチル，ジベヘン酸グリセリル，トリベヘニン，ベヘン酸グリセリル，スクワラン，セラミド３，セラミド３Ｂ，セラミド６，コレステロール，及びフィトスフィンゴシンを混合することにより，Ａ相を得る。Ａ相を約７５℃に加熱する。Ａ相を約７５℃に加熱する。

成分として，メマツヨイグサ油，スクワラン，アーモンドオイル，アボガドオイル，酢酸トコフェロール，及びシアバターを混合することにより，Ｂ相を得る。Ｂ相を約５０℃に加熱する。

加熱したＥ相をＡ相に加え，混合してＡＥ相を得る。加熱したＢ相をＡＥ相に加え，ホモジナイズし，油中水型エマルジョンを得る。

得られたエマルジョンを撹拌しつつ約３０℃（最高３０℃）に冷却し，この温度に維持する。

エマルジョンを約３０℃（最高３０℃）で約５分間ホモジナイズし，本発明の組成物をエマルジョンとして得る。

混合ステップは，撹拌機中で約７５ｒｍｐで行うことができる。ホモジナイズステップは，１９，０００ｒｐｍのホモジナイザーで行われる。

〔化粧方法〕

更に開示されているのは，上記の発明による組成物を用いた皮膚の弾性及び／又は水和を高めるための化粧方法である。この方法は，皮膚に病変が全くないヒトに適している。

化粧方法において，本発明の組成物は，局所に，特に，皮膚への外側からの組成物の塗布によって適用され，ここに皮膚は粘膜，特に鼻腔粘膜を含まない。

〔実施例１〕ＨａＣａＴ細部におけるインターロイキン類の分泌に対する不活性化された大腸菌及びエンテロコッカス・フェカーリスの効果

皮膚疾患の治療のための本発明の組成物の有用性を実証するため，サイトカイン分泌の減少に対する試験を行った。

例として，インターロイキン６（ＩＬ−６）及びインターロイキン８（ＩＬ−８）の分泌を定量した。ＴＮＦαによる刺激（１０ｎｇ／ｍＬ）で，種々の細胞タイプにおいてインターロイキンを産生させることができる。インターロイキンの産生は，抗炎症薬又は免疫調節薬の適用により影響を受け得る。ＨａＣａＴ細胞（ヒト成人低カルシウム高温角化細胞）に対する免疫調節特性を試験した。ヒトの非悪性角化細胞（即ち，正常皮膚）から得られた細胞株ＨａＣａＴ（自ら不死化）は，男性患者の健康な皮膚から誘導され，本質的に表皮基底角化細胞の性質を有する。

物質の抗炎症特性又は免疫調節特性は，in vitroで細胞株によって調べることができる。この試験設計において，炎症（インターロイキン産生のアップレギュレーション）は，細胞において外的刺激により誘発される。

被験物質１は，次の組成のものであった：

不活性化させた形態の天然の腸内細菌であるエンテロコッカス・フェカーリス及び大腸菌。１ｍＬの懸濁液は次のものを含む：１．５〜４．５×１０^７個の大腸菌（DSM 17252）及び１．５〜４．５×１０^７個のエンテロコッカス・フェカーリス（DSM 16440）から調製された細菌溶解物。

刺激した細胞に２通りに希釈した被験物質１を適用し，インターロイキン産生（ＩＬ−６，ＩＬ−８）の下方制御又は調節を調べた。評価は，ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）により行った。対照物質として抗炎症薬であるヒドロコーチゾンも試験した。２４ウェルの組織培養プレートに，ウェル当たり２０，０００個の細胞密度でＨａＣＴ細胞を播種した。２４時間後，ＨａＣａＴ細胞をＴＮＦα（１０ｎｇ／ｍＬ）で刺激し（ＩＬ−８等のインターロイキン産生の誘導），被験物質を添加した。７２時間インキュベート下の後，２種の炎症マーカー（ＩＬ−８及びＩＬ−６）を，ＥＬＩＳＡにより定量した。

抗炎症薬の活性を検出するために，３つの独立した試験を３重に行った。

ＴＮＦαによるＨａＣａＴ細胞の刺激は，７２時間後に対照に比べて係数２．５でインターロイキン８の分泌を増加させた（図１＋２）。被験物質のみとインキュベートしたときのＨａＣａＴ細胞によるＩＬ−８の分泌（１：１０，対照はＴＮＦα不含）は，７２時間において対照と比べて平均で約１０％低かった。ＴＮＦαと被験物質（１：１０）の同時添加において，ＩＬ−８分泌は，７２時間後，ＴＮＦαを用いた対照と比べて約２７％（１：１０）減少した。

被験物質（１：１００）の使用では，ＴＮＦαを用いた対照に比べた７２時間後のＩＬ−８分泌の変化を平均として検出することはできなかった。

ＴＮＦαによる刺激後のインターロイキン６の分泌は，ＨａＣａＴ細胞におけるインターロイキン８と比べて有意に低かった（図３＋４）。ＴＮＦαの添加なし（対照）での２４時間後には，ＩＬ−６分泌は検出限界以下であった。ＴＮＦαと被験物質（１：１０）の同時添加では，７２時間後，ＴＮＦαによる対照に比べて，ＩＬ−６分泌が平均で２４％と僅かに増加するのが見られた。

ＩＬ−６の分泌において，被験物質１：１００希釈では，７２時間後，処置された対照と同等であった。ＩＬ−８の分泌とは対照的に，ヒドロコーチゾン（１０^−７Ｍ）は，７２時間後，処置された対照と比較してＩＬ−６の有意な減少（４０％）を誘導した。

炎症過程に対する被験物質の効果の試験は，ＩＬ−８とＩＬ−６の双方について濃度依存性の放出調節を示した。被験物質の１：１０希釈では，ＴＮＦαの対照に比べ，ＩＬ−８分泌は２７だけ減少したが，ＩＬ−６分泌の分泌は２４％増加した。被験物質の１：１００希釈では，ＩＬ−８分泌及びＩＬ−６分泌の両方とも，ＴＮＦαによる対照の範囲内であった。

炎症は，ＴＮＦαにより惹起され得る。ＴＮＦαは，炎症に加えて免疫反応及びアポトーシスを調節する多機能サイトカインである。ＴＮＦαは，更なる細胞分裂を開始させることにより免疫応答を活性化させ，炎症マーカーであると考えられている。ＩＬ−６は，ＴＮＦαによる刺激後に体内で（in vivo）形成され，種々の免疫反応に影響を及ぼす。例えば，ＩＬ−６は，Ｃ反応性タンパク質の生成を刺激し，それは急性炎症パラメーターとしてしばしば使用される。ＩＬ−８は，種々の組織及び血球により発現されている走化性サイトカインである。炎症調節因子として，ＩＬ−８は，好中性顆粒球を動員し活性化させ，それらの脱顆粒をサポートする。Ｔリンパ球，好中性顆粒球，及び表皮細胞間の相互作用は，乾癬などのような炎症性皮膚疾患の病理学において決定的な役割を演じているものと思われる。

ＴＮＦαによる刺激の後にＨａＣａＴ細胞で行われた試験は，in vitroでのインターロイキン分泌に対し，被験物質１が濃度依存的な効果を有することを示した。

〔実施例２〕ヒトの皮膚における経表皮水分損失（ＴＥＷＬ）に対する，不活性化された大腸菌及びエンテロコッカス・フェカーリスの効果

皮膚の経表皮水分損失は，皮膚の防護機能を評価するための最も重要なパラメーターの１つである。このプロセスは，発汗により失われる水を含まない，身体の内側からの水分の蒸発を伴う。皮膚のバリア機能を維持し又は改善する組成物は，経表皮水分損失を低下させる。皮膚からの水分蒸発の低下は，皮膚の水和を維持するという良好な作用に対応する。

皮膚の経表皮水分損失の定量は，蒸発計を用いて行われる。蒸発計の測定プローブは，２つの温度及び湿度センサーを備え，一方は先端にそして他方は小さな距離をあけて取り付けられた，先端の開いたチューブで構成されている。それら２個の湿度センサーは，皮膚上方の拡散帯における水蒸気圧勾配を直接に測定する。コンピュータにより，フィックの法則に従って水分放出がｇ／ｈｍ^２単位で計測される：

ここに，
ｄｍ／ｄｔ＝拡散流
Ｄ＝拡散係数
Ａ＝面積
ｄｃ／ｄｘ＝密度勾配

皮膚の経表皮水分損失の試験は，Tewameter（Courage + Khazaka Electronic GmbH）を用いて行った。

測定しようとする皮膚領域に対しテフロン（登録商標）チューブの縁が皮膚と同一面となるように，圧をかけないようにして，測定プローブが当てられる。試験領域毎に，１つの測定シリーズの合計２０回の測定サイクル（これは記録され装置により平均される）が行われる。複数の試験領域が表面に位置決めされ，各々の測定区域は直径約３ｍｍであった。これらの区域の３つの異なった部位で測定が行われ，測定値は平均された。得られた測定値を表に示す。

被検者は，２３〜６６歳の２０名からなった。被験者は，被験物質２を４週間の間毎日朝夕規則的に使用するように指導された。

被検者は，試験表面において極度の乾燥肌又は神経皮膚炎になりそうな（医療は必要としない）皮膚を示していた。

被験物質２は次の組成を有していた。
３．００重量％のホホバ油，
１６．８０重量％のカプリル酸／カプリン酸トリグリセリド，
０．５０重量％のミツロウ，
０．８０重量％の水添ヒマシ油，
セチルＰＥＧ／ＰＥＧ−１０／１ジメチコン，
０．３重量％のパルミチン酸セチル，
０．５重量％の，次のものの混合物：ジベヘン酸グリセリル，トリベヘニン，ベヘン酸グリセリル，スクアラン，セラミド３，セラミド３Ｂ，セラミド６，コレステロール及びフィトスフィンゴシン（ここに，各成分は，それぞれ等しい割合で含まれる）
２．００重量％のメマツヨイグサ油（トコフェロールで安定化），
６．０重量％のスクワラン，
２．５０重量％のアーモンド油，
２．００重量％のアボガドオイル，
０．５重量％の酢酸トコフェロール，
０．５重量％のシアバター，
４．０重量％のペンチレングリコール，
４．０重量％のグリセロール（９９％），
０．１０重量％のヒアルロン酸ナトリウム，
５２．１９重量％の被験物質１（実施例１を参照），
１．０重量％のパンテノール，
０．３重量％のベタイン，
０．８重量％の硫酸マグネシウム，
０．１０重量％の乳酸ナトリウム，
０．１０重量％のグルコン酸ナトリウム，又は
ｐＨを４．５〜５に調整するための乳酸

次の表は，４週間の規則的な塗布の前後の試験表面のＴＥＷＬ測定の平均値（単位：ｇ／ｈｍ^２）を示す。

負の値は，皮膚の経表皮水分損失が，第１の測定値から第２の測定値へと低下したときに得られた。

表１：２０名の被験者における調製物の４週間の塗布の前後での測定結果（ＴＥＷＬ値）及び前後の差の算出。身体の右半分。

調製物の塗布によるＴＥＷＬ値における平均変化（％）は，２０名の被験者個々での結果を平均したものである。測定されたＴＥＷＬの平均値の差は，−４．７である。この値は，調製物の塗布後に放出される水分低下の平均値である。開始時の平均ＴＥＷＬ値は１７．６であるから，これは皮膚の経表皮水分損失の−２６．７０％という低下に相当する。

表２：２０名の被験者における調製物の４週間の塗布の前後での測定結果（ＴＥＷＬ値）及び前後の差の算出。身体の左半分。

調製物の塗布によるＴＥＷＬ値における平均変化（％）は，２０名の被験者個々での結果を平均したものである。測定されたＴＥＷＬの平均値の差は，−３．０である。この値は，調製物の塗布後に放出される水分低下の平均値である。開始時の平均ＴＥＷＬ値は１６．９であるから，これは皮膚の経表皮水分損失の０１７．７５％という低下に相当する。

表３：２０名の被験者における４週間の塗布の前後での対照表面（即ち，被験物質２を塗布せず）についての測定結果（ＴＥＷＬ値）及び前後での差の算出

無処置の対照表面におけるＴＥＷＬ値の平均値の変化（％）は，２０名の被験者個々での結果を平均したものである。測定されたＴＷＥＬ値の平均値の差は，−０．５である。この値は，調製物の塗布なしでの水分放出の低下の平均値である。開始時の平均ＴＥＷＬ値は１０．３であるから，これは皮膚の経表皮水分損失のー４．８５％という低下に相当する。

表４：観察期間における平均変化の要約

こうして，顕著な乾燥肌のヒトにおいて被験物質２が経表皮水分損失の低下を引き起こすことが確認できる。

〔実施例３〕皮膚の水和に対する不活性化された大腸菌及びエンテロコッカス・フェカーリスの混合物の作用

コルネオメーターを用いた測定の原理において，皮膚の表皮の「外側層」（角質層）の水和を判定するために静電容量測定が行われる。この原理は，水と他の物質との比誘電率の差に基づいている。対応するように構成した測定用コンデンサが，測定体積中に配置されたサンプルに対し様々な静電容量の変動を以て反応し，それが装置により全自動で検出され評価される。特殊なガラスでコートされたものである活性プローブが，測定すべき皮膚部位に押し当てられ，１秒後，表示装置がコルネオメーター測定値，即ち皮膚表面の水和の程度を，表示する。特殊な設計により，いつの場合もプローブの活性な端面が，全ての届かない皮膚部位も含め，様々な皮膚部位に対し一定の力で押し当てられることが保証されている。

測定用センサーは正方形である。その活性末端は，特殊なガラスでコートされており，軸方向に可動で，少なくとも３ｍｍのシフト幅を有している。測定原理は，端面が一定の圧力下に平らに置かれることを必要とする。そのことができるだけ再現可能であるよう保証するために，測定用ヘッドの端面は非常に小さいものであるようにく（７×７ｍｍ）構成されている。内側の可動部分，即ち活性な端面は，バネにより，何れの場合も３．５Ｎの力で皮膚に押し当てられる。

測定は，製品の使用後に一定時間窓の範囲内で行うことができる。

被験者は，試験の継続のためには特定の期間中被験物質のみを用いるよう指導された。
測定は次のようにして行われた：

１．被検者は，温度２２℃，相対湿度６０％に４５分間慣らされる。
２．皮膚測定値は，３つの異なった部位においてそれぞれの試験区域にて測定される。得られた値は平均される。
３．試験において，無処置の皮膚表面が対照として用いられる。
４．測定は，実施例２の被験組成物２の４週間にわたる塗布の開始前及び終了後に行われる。それぞれの測定は，先に用いられた製品又は被験製品の最終の塗布の１０〜１２時間後に行われる。

試験区域毎の皮膚水和値及び時間点が，それぞれ決定される。それぞれの値が次の表に示されている。

連続番号，年齢及び性別，により特定されている被験者の平均値と標準偏差が決定される。

（文献：L. Sachs, “Statistische Methoden“ [Statistical Methods], 6th edition, Springer Verlag Berlin Heidelberg 1988）.
差＝皮膚水和値の差．
差（％）＝開始時の値に対する，使用による水和値平均の変化パーセント。

対応する表は，決定されたそれぞれの値を示す。

試験表面において，被検者は非常に乾燥した肌又は神経皮膚炎になりそうな皮膚（医療は必要としない）を示す。

表５：治療された表面における皮膚水和測定（身体の右半分）

表６：治療された表面における皮膚水和測定（身体の左半分）

表７：無処置対象表面における皮膚水和測定

表８：皮膚水和測定値の総合評価

上記４週間の塗布試験において，被験物質２は，合計２０名の被検者に皮膚科学的／臨床的基準に従って問題がなく，認容性であった。試験表面には，望まれない変化や病的変化の症例は全くなかった。

皮膚の水和に対する被験物質２の作用を試験するためのコルネオメトリーは，２０名の被験者においてコルネオメーター・プローブＣＭ８２５（Courage + Khazakaにより製造）により行った。

皮膚水和値の変化は，調製物の４週間にわたる規則的塗布の前後の皮膚表面及び無処対照表面について測定された。処置された表面は，皮膚水和の５１．３７％（身体の右半分）及び５３．６７％（身体の左半分）という改善を示した。無処置の皮膚表面の水和の平均変化は５．２３％であった。

被験物質２は，従って，皮膚水和の明確な改善をもたらした。

Claims

不活性化された大腸菌及びエンテロコッカス・フェカーリスの混合物の有効量並びに薬剤学的に許容し得る助剤及び／又は担体を含んでなる，皮膚科的な状態及び皮膚科疾患の治療，補助療法又は予防に使用するための薬剤組成物。
局所投与可能な形態である，請求項１の薬剤組成物。
大腸菌及びエンテロコッカス・フェカーリスが溶解物の形態で含まれるものである，請求項１又は２の薬剤組成物。
該大腸菌及びエンテロコッカス・フェカーリスの混合物が，組成物全体の１〜９５重量％，２０〜８０重量％，４０〜６０重量％，又は４５〜５５重量％で含まれる，請求項１〜３の何れかの薬剤組成物。
該混合物中，大腸菌及びエンテロコッカス・フェカーリスが，０．５：１．５〜１．５：０．５，０．７５：１．２５〜１．２５：０．７５，又は１．１５：０．８５〜０．８５：１．１５，又は１．０５：０．９５〜０．９５：１．０５の比率で含まれ，所望により，大腸菌及びエンテロコッカス・フェカーリスが，総質量１００ｇ当たり，それぞれ０．５×１０^７〜１０×１０^７個，１．０×１０^７〜７×１０^７個，又は１．５×１０^７〜４．５×１０^７個の細胞カウント数で含まれる，請求項１〜４の何れかの薬剤組成物。
皮膚科疾患及び皮膚科的状態が，乾燥肌，経表皮水分損失，炎症性皮膚疾患，及び神経皮膚炎から選ばれるものである，請求項１〜５の何れかの薬剤組成物。
軟膏，液体，エマルジョン，又は溶液の形態である，請求項１〜６の何れかの薬剤組成物。
不活性化された大腸菌及びエンテロコッカス・フェカーリスの混合物の有効量を含んでなる化粧用組成物。
局所適用可能な形態である，請求項８の化粧用組成物。
大腸菌及びエンテロコッカス・フェカーリスが溶解物の形態で含まれるものである，請求項８又は９の化粧用組成物。
大腸菌及びエンテロコッカス・フェカーリスの混合物が，組成物全体の１〜９５重量％，２０〜８０重量％，４０〜６０重量％，又は４５〜５５重量％の量で含まれるものである，請求項８〜１０の何れかの化粧用組成物。
大腸菌及びエンテロコッカス・フェカーリスが，０．５：１．５〜１．５：０．５，０．７５：１．２５〜１．２５：０．７５，又は１．１５：０．８５〜０．８５：１．１５，又は１．０５：０．９５〜０．９５：１．０５の比率で含まれ，所望により，大腸菌及びエンテロコッカス・フェカーリスが，総質量１００ｇ当たり，それぞれ０．５×１０^７〜１０×１０^７個，１．０×１０^７〜７×１０^７個，又は１．５×１０^７〜４．５×１０^７個の細胞カウント数で含まれるものである，請求項８〜１１の何れかの化粧用組成物。
適応する用途が，乾燥肌又は経表皮水分損失から選ばれるものである，請求項８〜１２の何れかの化粧用組成物。
軟膏，液体，エマルジョン，又は溶液の形態である，請求項８〜１３の何れかの化粧用組成物。
請求項１〜７の何れかの薬剤組成物の又は請求項８〜１４の何れかの化粧用組成物の製造方法であって，不活性化された大腸菌及びエンテロコッカス・フェカーリスの有効量並びに薬剤学的に又は化粧品として許容し得る助剤及び／又は担体を，該皮膚科的薬剤組成物又は化粧用組成物を与えるように混合することを含んでなる，製造方法方法。