JP2019068790A - 薬剤および／または放射線に対する癌細胞の感受性および／または抵抗性評価方法 - Google Patents

Abstract

【課題】患者の組織や器官の臨床におけるがんの性質を正確に反映できる、がん細胞の薬剤および／または放射線に対する感受性および／または抵抗性を評価するためのツールや方法を提供する。【解決手段】がん患者由来のがん細胞の初代培養細胞を含む、がん細胞の薬剤および／または放射線に対する感受性および／または抵抗性を評価するためのパネル、患者のがん組織由来のがん細胞の初代培養細胞にインビトロで薬剤および／または放射線を作用させ、がん細胞に対する薬剤および／または放射線の作用を評価する工程を含む、がん細胞の薬剤および／または放射線に対する感受性および／または抵抗性を評価するための方法、ならびにそのためのキット。【選択図】なし

Description

本発明はがん細胞の薬剤および／または放射線に対する感受性および／または抵抗性を評価するための方法およびそれらに用いるパネルやキットに関する。

近年、抗がん剤治療を行う場合に、抗がん剤や放射線に対する感受性や抵抗性を評価することによって期待される治療効果を予測し、その予測に基づいて投与または照射する抗がん剤や放射線を選択する「個別化がん治療」が注目されている。患者の抗がん剤や放射線に対する感受性や抵抗性を評価する方法として、患者由来がん組織を用いる、個々の患者の病態を反映する動物モデルであるＰＤＸモデル（patient-derived xenograft、免疫不全マウスにヒトがん組織を移植したモデル）を利用する方法が知られている。しかしながら、ＰＤＸモデルの確立には動物実験を行い最短でも数ヶ月を要し、結果として確立できない場合もあることから、臨床での応用は現実的ではない。そのため、細胞を用いて簡便に短時間で感受性や抵抗性を評価できる方法が求められている。

一般的に、基礎的研究で用いられるがん細胞株は、不死化して増殖能を獲得したがん細胞であり、多様性をもつ臨床に近い「がん」の状態を反映しているわけではない。さらに、がん細胞の増殖、悪性化や薬剤耐性等には、液性因子や細胞間接着等によるストローマ細胞とがん細胞の相互作用等が影響しており、がん微小環境を考慮して評価することが望ましい。

患者の組織や器官の臨床におけるがんの性質を正確に反映できる細胞アッセイ系として、患者から採取した組織や器官から直接培養する初代培養細胞がある。しかし、初代培養は技術的に極めて困難であり、未だに確立された方法がないのが現状で、例えば大腸がんの初代培養の成功率は１０〜３０％程度であることが報告されている（非特許文献１〜４）。また、がん組織由来細胞を初代培養する方法（特許文献１）が報告されているが、その成功率も十分ではなく、さらなる改善が求められていた。

特開２０１０−２２７０８８号公報

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患者の組織や器官の臨床におけるがんの性質を正確に反映できる、がん細胞の薬剤および／または放射線に対する感受性および／または抵抗性を評価するためのツールや方法が求められていた。

本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。その結果、特定の方法により患者のがん組織から得られた初代培養細胞にインビトロで薬剤および／または放射線を作用させ、がん細胞に対する薬剤および／または放射線の作用を評価することによって上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成させるに至った。

本発明は以下のものに関する。
（１）がん患者由来のがん細胞の初代培養細胞を含む、がん細胞の薬剤および／または放射線に対する感受性および／または抵抗性を評価するためのパネル。
（２）初代培養細胞が、下記工程：
（ａ）患者由来のがん組織を細分化し、細分化されたがん組織から挟雑物を除去し、
（ｂ）工程（ａ）で得られた組織塊を浮遊培養に供し、次いで
（ｃ）工程（ｂ）で得られた培養物を接着培養に供する
を含む方法により得られたものである、（１）記載のパネル。
（３）初代培養細胞が、下記工程：
（ａ）患者由来のがん組織を細分化し、細分化されたがん組織から挟雑物を除去し、次いで
（ｂ）工程（ａ）で得られた組織塊を接着培養に供する
を含む方法により得られたものである、（１）記載のパネル。
（４）工程（ａ）における挟雑物の除去が篩い分けにより行われ、篩い分けによって得られる細胞塊のサイズの下限が約２０μｍ〜約１００μｍ、上限が約２００μｍ〜約５００μｍである、（２）または（３）記載のパネル。
（５）薬剤が抗腫瘍剤である、（１）〜（４）のいずれかに記載のパネル。
（６）がん細胞の放射線感受性および／または抵抗性を評価するための、（１）〜（４）のいずれかに記載のパネル。
（７）患者のがん組織由来のがん細胞の初代培養細胞を含むパネルを作成するための容器、ポアサイズが約２０μｍ〜約１００μｍのフィルター、およびポアサイズが約２００μｍ〜約５００μｍのフィルターを含む、がん細胞の薬剤および／または放射線に対する感受性および／または抵抗性を評価するためのキット。
（８）薬剤が抗腫瘍剤である、（７）記載のキット。
（９）がん細胞の放射線感受性および／または抵抗性を評価するための、（７）記載のキット。
（１０）患者のがん組織由来のがん細胞の初代培養細胞にインビトロで薬剤および／または放射線を作用させ、がん細胞に対する薬剤および／または放射線の作用を評価する工程を含む、がん細胞の薬剤および／または放射線に対する感受性および／または抵抗性を評価するための方法。
（１１）初代培養細胞が、下記工程：
（ａ）患者由来のがん組織を細分化し、細分化されたがん組織から挟雑物を除去し、
（ｂ）工程（ａ）で得られた組織塊を浮遊培養に供し、次いで
（ｃ）工程（ｂ）で得られた培養物を接着培養に供する
を含む方法により得られたものである、（１０）記載の方法。
（１２）初代培養細胞が、下記工程：
（ａ）患者由来のがん組織を細分化し、細分化されたがん組織から挟雑物を除去し、次いで
（ｂ）工程（ａ）で得られた組織塊を接着培養に供する
を含む方法により得られたものである、（１０）記載の方法。
（１３）工程（ａ）における挟雑物の除去が篩い分けにより行われ、篩い分けによって得られる細胞塊のサイズの下限が約２０μｍ〜約１００μｍ、上限が約２００μｍ〜約５００μｍである、（１１）または（１２）記載の方法。
（１４）（１）〜（６）のいずれかに記載のパネルまたは（７）〜（９）のいずれかに記載のキットを用いることを含む、（１０）〜（１３）のいずれかに記載の方法。
（１５）薬剤が抗腫瘍剤である（１０）〜（１４）のいずれかに記載の方法。
（１６）がん細胞の放射線感受性および／または抵抗性を評価するための、（１０）〜（１４）のいずれかに記載の方法。
（１７）がん細胞に対する薬剤および／または放射線の作用の評価が画像解析によるものである（１０）〜（１６）のいずれかに記載の方法。

本発明において用いられるのは一般的ながん細胞株ではなく、がん細胞の初代培養細胞である。初代培養細胞は後で説明するような方法により得られたものが好ましい。このような初代培養細胞は調製が簡単で長期間を要しない。また、がんの初代培養細胞は、組織や器官の臨床におけるがんの性質を正確に反映する。さらに、がんの初代培養細胞は、ごく少量の生検サンプルからでも取得でき、安定的に再現よく培養および継代できる。そのため、本発明によれば、個々の患者のがん細胞の薬剤および／または放射線に対する感受性や抵抗性を、インビトロにおいて簡便に短時間で予測／判定することができる。本発明により得られる結果は、組織や器官の臨床におけるがんの性質を正確に反映したものである。したがって、個々の患者に対して効果が期待できる薬剤および／または放射線を的確かつ迅速に予測／判定することができる。

図１は、大腸がん患者由来のがん細胞の初代培養細胞の５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）およびオキサリプラチンに対する感受性と、臨床的結果との比較を示す。

本発明は、１の態様において、がん患者由来のがん細胞の初代培養細胞を含む、がん細胞の薬剤および／または放射線に対する感受性および／または抵抗性を評価するためのパネルを提供する。

がん患者は、がんを有する動物である。好ましくはヒト、サル、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギなどの哺乳動物であり、より好ましくはヒトである。

がんの種類はいずれの種類であってもよく、例えば、大腸がん、小腸がん、胃がん、食道がん、肛門がん、膵がん、肝がん、胆管がん、消化器内分泌腫瘍、消化管間質腫瘍（GIST）、乳がん、肺がん、中皮腫、胸腺がん、腎がん、尿路上皮がん、精巣腫瘍、前立腺がん、子宮体がん、子宮頚がん、子宮肉腫、卵巣悪性腫瘍、舌がん、歯肉がん、口腔底がん、咽頭がん、喉頭がん、唾液腺がん、甲状腺がん、骨肉種、Ewing肉腫、軟部肉腫、骨髄異形成症候群、皮膚がん、神経芽細胞腫、悪性神経膠腫（グリオブラストーマ）、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫などが例示されるが、これらに限定されない。

本明細書において、がん細胞の初代培養細胞は、患者のがん組織から採取した細胞の培養物であって、継代操作を行う前の培養物、ならびに継代操作を行う前の性質（形態学的性質、遺伝学的性質、生理学的性質など）を変化させない回数の継代操作を経た培養物をいう。初代培養細胞の作製方法は公知である。本発明に使用するがん細胞の初代培養細胞はいずれの方法によって得られたものであってもよい。患者から採取した組織をナイフ、はさみ、カッター等で細分化し、コラゲナーゼ、トリプシン、パパイン、ディスパーゼなどの酵素で処理して得られた細胞または細胞塊を培地に播いて培養することにより、初代培養細胞を得てもよい。

本発明に使用する好ましいがん細胞の初代培養細胞は、下記工程：
（ａ）患者由来のがん組織を細分化し、細分化されたがん組織から挟雑物を除去し、
（ｂ）工程（ａ）で得られた組織塊を浮遊培養に供し、次いで
（ｃ）工程（ｂ）で得られた培養物を接着培養に供する
を含む方法により得られたものである。

上記方法の工程（ａ）について説明する。生体は、生きた動物を意味し、好ましくは哺乳動物であり、典型的にはがんを有するヒトである。生体からのがん組織の取得はいずれの手段・方法によって行ってもよく、例えば、外科手術時に採取または摘出することによって、あるいは生検を行うことによって得てもよい。

生体から得られたがん組織をそのまま細分化してもよく、細分化前に動物細胞培養用培地にて維持してもよい。動物細胞培養用培地としてはＤ−ＭＥＭ、Ｅ−ＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０などが例示されるが、これらに限定されない。この段階での培地中での維持は適当時間行うことができ、例えば数時間〜４８時間維持してもよい。

細分化の前に、がん組織を洗浄してもよい。洗浄は、生理食塩水中、あるいはリン酸緩衝液、酢酸緩衝液、トリス緩衝液などの緩衝液中で行うことができる。

細分化はいずれの手段・方法によって行ってもよく、ナイフ、はさみ、カッターなどを用いて行うことができる。例えば、剪刀を用いてがん組織を細断してもよい。あるいは、適切なサイズの注射針を備えたシリンジにがん組織の懸濁液を繰り返し出し入れすることにより、細分化を行ってもよい。好ましくは、組織塊が肉眼で見えなくなる程度（直径約１ｍｍ以下）まで細断する。

細分化されたがん組織を酵素処理して、結合組織等を除去してもよい。酵素としてはコラゲナーゼ、トリプシン、パパイン、ディスパーゼなどを単独または組み合わせて用いることができるが、これらに限定されない。

細分化したがん組織からの挟雑物の除去は、いずれの手段／方法にて行ってもよい。挟雑物は雑菌類やがん組織以外の組織片などであるがこれら以外のものであってもよい。挟雑物の除去方法には上述のような洗浄や酵素処理も含まれるが、好ましくは、挟雑物の除去が篩い分けを含む方法により行われることが好ましい。

篩い分けはいずれの手段・方法を用いて行ってもよく、好ましくは、滅菌されたフィルターを用いて行う。がんの種類や組織型によって篩い分けによって得られる細胞塊のサイズの下限および上限を選択することができる。下限が約２０μｍ〜約１００μｍで、上限が約２００μｍ〜約５００μｍであることが好ましい。例えば、下限が約２０μＭ、約３０μｍ、約４０μｍ、約５０μｍ、約６０μｍ、約７０μｍ、約８０μｍ、約９０μｍまたは約１００μｍであってもよく、上限が約２００μｍ、約２５０μｍ、約３００μｍ、約３５０μｍ、約４００μｍ、約４５０μｍまたは約５００μｍであってもよい。

このようなサイズの細胞塊を得るために、２種類の適切なポアサイズのフィルターを選択して、逐次用いることができる。様々なポアサイズのフィルターが市販されている。所望サイズの細胞塊を得るために、ポアサイズが約２０μｍ〜約１００μｍのフィルター、例えば、ポアサイズが約２０μｍ、約３０μｍ、約４０μｍ、約５０μｍ、約６０μｍ、約７０μｍ、約８０μｍ、約９０μｍまたは約１００μｍのフィルター、およびポアサイズが約２００μｍ〜約５００μｍのフィルター、例えば、ポアサイズが約２００μｍ、約２５０μｍ、約３００μｍ、約３５０μｍ、約４００μｍ、約４５０μｍまたは約５００μｍのフィルターを用いてもよい。例えば、ポアサイズ約２００μｍのフィルターを通過し、ポアサイズ約２０μｍのフィルターを通過しないで残った細胞塊を生理食塩水または動物細胞培養用培地に懸濁し、その後例えば遠心分離を行って、所望サイズの細胞塊を回収することができる。

細胞塊のサイズを上記のようなサイズにすることにより、コンタミネーションを効率良く防止できるほか、細胞塊中の生細胞の割合も高くなる。したがって、次工程である浮遊培養工程、および次々工程である接着培養工程を経て得られる癌細胞の初代培養の効率が高まる。また、細胞塊のサイズを上記のようなサイズにすることにより、線維芽細胞等の割合を減らすことができ、接着培養後に得られる初代培養細胞は、実際の臨床組織に類似したものとなる。

上記方法の工程（ｂ）は、上記のようにして得られたがん細胞塊を浮遊培養に供する工程である。浮遊培養は、がん細胞塊が培養容器に接着しない条件下での培養である。浮遊培養は当業者に公知である。浮遊培養用の培養容器は、表面に細胞または細胞塊が付着し難い処理をしたものが市販されており、これらを用いてもよい。また、培養容器の形状やサイズも、がん細胞の種類や必要量などの条件に応じて選択することができる。様々なサイズのフラスコ、ボトル、ディッシュ、チューブ、プレートなどが市販されているので、これらを用いることができる。浮遊培養の培地の組成、培養温度、静置か撹拌または振盪を行うかなどの浮遊培養に関するその他の条件も、がん細胞の種類その他の条件に応じて当業者が適宜定めうるものである。

上記方法において、浮遊培養を適当時間行うことで接着培養に移行させ得る細胞をより選択的に選別することができる。浮遊培養を約２４時間ないし約４８時間行うことが好ましい。より好ましくは浮遊培養を約２８時間〜約４４時間、より好ましくは約３２時間〜約４０時間、より好ましくは約３６時間〜約３８時間行う。例えば、浮遊培養を約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４１、約４２、約４３、約４４、約４５、約４６、約４７または約４８時間行う。

これらの時間浮遊培養されたがん細胞塊を次の接着培養に供して得られる初代培養細胞は、臨床組織に類似した形態、性質となり、遺伝子の変異も見られないか、あってもごくわずかである。

上記方法の工程（ｃ）は、上記のごとく浮遊培養されたがん細胞塊を接着培養に供する工程である。接着培養は、がん細胞塊が培養容器に接着する条件下での培養である。接着培養は当業者に公知である。接着培養用の培養容器は、表面に細胞または細胞塊が付着し易い処理をしたものが市販されており、これらを用いてもよい。がんの種類や組織型によってはラミニン５１１、可溶性Ｅカドヘリン等を固層化したプレートに播種してもよい。また、培養容器の形状やサイズも、がん細胞の種類や必要量などの条件に応じて選択することができる。様々なサイズのフラスコ、ボトル、ディッシュ、チューブ、プレートなどが市販されているので、これらを用いることができる。接着培養の培地も、がん細胞の種類その他の条件に応じて選択することができる。培地の種類、培養温度などの接着培養に関するその他の条件も、当業者が適宜定めうるものである。

接着培養を適当時間行うことにより細胞を増殖させて、多くのがん細胞の初代培養細胞を得ることができる。例えば、市販の接着培養用のプレートにて、３７℃、ＣＯ_２ ５％下で１〜２日おきに培地交換しながら、細胞がプレートの約５割〜約８割程度まで増殖するまで接着培養を行ってもよい。

上で説明した初代培養細胞の製造方法において、（ｂ）の浮遊培養を行う工程を省略してもよい。

上記のようにして得られた初代培養細胞を、さらに継代培養してもよい。具体的には、上記のようにして得られた初代培養細胞を培養容器から剥離させ、常法により継代培養することができる。継代培養を行うことにより、さらに多くの新鮮な初代培養細胞を得ることができる。継代は、初代培養細胞の性質（形態学的性質、遺伝学的性質、生理学的性質など）が変化しない回数行うことが好ましい。

上記方法によれば、がん細胞の初代培養細胞を多く得ることができる。上記方法により得られた初代培養細胞は、臨床組織に類似した形態、性質となり、遺伝子の変異も見られないか、あってもごくわずかであるので、体内のがん組織の状態をインビトロで再現することができる。

薬剤はいずれの薬剤であってもよく特に限定されない。典型的な薬剤の例として、抗腫瘍剤、抗炎症剤が挙げられる。薬剤は低分子化合物、ペプチド、抗体、オリゴヌクレオチド、核酸、糖類、天然物の抽出物、などであってもよく、これらに限定されない。抗腫瘍剤としてはセツキシマブ、パニツムマブ、ベバシズマブ、イマチニブ、リツキシマブ、ラパチニブ、ボルテゾミブ、ニボルマブ、トラメチニブ、ペムブロリズマブ、トラスツズマブなどの分子標的薬、５−フルオロウラシル、テガフール、ドキシフルリジン、ゲムシタビン、シタラビン、メトトレキサートなどの代謝拮抗薬、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチンなどの白金製剤、シクロホスファミド、テモゾロミド、ニムスチンなどのアルキル化薬、ドキソルビシン、アムルビシン、ブレオマイシン、マイトマイシンＣなどの抗生物質、イリノテカンなどのトポイソメラーゼ阻害薬、パクリタキセル、ドセタキセル、ビンクリスチン、タモキシフェンなどの微小管阻害薬、アナストロゾール、エキセメスタン、メドロキシプロゲステロン、リュープロレリン、デキサメタゾンなどのホルモン製剤、ウベニメクス、ピシバニールなどの免疫賦活薬、レナリドミド、ポマリドミドなどの免疫調節薬などが挙げられるがこれらに限定されない。

放射線はＸ線、電子線、ガンマ線、陽子線、重粒子線などであってもよく、これらに限定されない。放射線発生および照射のための様々な設備や装置が知られており、適宜選択して使用することができる。

がん細胞の初代培養細胞に対する薬剤の種類や投与量、放射線の種類、照射方法、線量などの条件は当業者が適宜決定することができる。

がん細胞の薬剤および／または放射線に対する感受性および／または抵抗性の評価方法は公知であり、細胞増殖能、細胞生存率、ＡＴＰ産生量、乳酸産生量、酵素活性、細胞形態などを測定することが例示されるが、これらに限定されない。がん細胞の薬剤および／または放射線に対する感受性および／または抵抗性の評価において、画像解析を用いてもよい。画像解析の手段、方法も当業者に公知である。細胞のサイズや形態を画像解析してもよい。評価系における発色、蛍光、燐光、放射線、磁力線などを測定し、画像解析してもよい。画像解析の方法は上記のものに限定されない。

がん細胞の初代培養細胞のパネルは、がん細胞の初代培養細胞を含んでいる複数の区画を含む容器、またはがん細胞の初代培養細胞を含んでいる複数の容器の集合体または組み合わせである。各区画または容器は同じ患者由来のがん細胞の初代培養細胞を含んでいてもよく、異なる患者由来のがん細胞の初代培養細胞を含んでいてもよい。パネルの形態はいずれの形態であってもよく、複数の穴を有するプレート（例えば２４ウェルプレート、９６ウェルプレート、３８４ウェルプレートなど）、複数のチューブのセット、複数のディッシュやプレートのセット、複数のボトルのセットなどが例示されるが、これらに限らない。本発明のパネルを用いてハイスループットシステムを用いた評価を行ってもよい。ロボットによる自動化システムを用いて評価を行ってもよい。

パネルに薬剤を添加して、がん細胞の薬剤感受性および／または抵抗性を評価することができる。パネルに添加する薬剤は１種類であってもよく、複数種類であってもよい。異なる量の薬剤をパネルに適用してもよい。

パネルに放射線を照射して、がん細胞の放射線感受性および／または抵抗性を評価することができる。パネルに照射する放射線は１種類であってもよく、複数種類であってもよい。異なる線量の放射線をパネルに適用してもよい。

薬剤と放射線を組み合わせてパネルに適用してもよい。

本発明は、もう１つの態様において、患者のがん組織由来のがん細胞の初代培養細胞を含むパネルを作成するための容器、ポアサイズが約２０μｍ〜約１００μｍのフィルター、例えば、ポアサイズが約２０μｍ、約３０μｍ、約４０μｍ、約５０μｍ、約６０μｍ、約７０μｍ、約８０μｍ、約９０μｍまたは約１００μｍのフィルター、およびポアサイズが約２００μｍ〜約５００μｍのフィルター、例えば、ポアサイズが約２００μｍ、約２５０μｍ、約３００μｍ、約３５０μｍ、約４００μｍ、約４５０μｍまたは約５００μｍのフィルターを含む、がん細胞の薬剤および／または放射線に対する感受性および／または抵抗性を評価するためのキットを提供する。通常、キットには取扱説明書を添付する。

上記のようなポアサイズのフィルターを用いることにより、細胞塊のサイズの下限を約２０μｍ〜約１００μｍ、例えば、約２０μｍ、約３０μｍ、約４０μｍ、約５０μｍ、約６０μｍ、約７０μｍ、約８０μｍ、約９０μｍまたは約１００μｍとし、上限を約２００μｍ〜約５００μｍ、例えば、約２００μｍ、約２５０μｍ、約３００μｍ、約３５０μｍ、約４００μｍ、約４５０μｍまたは約５００μｍとすることができる。上で説明したように、このようなサイズの細胞塊を用いることが好ましい。

本発明は、さらにもう１つの態様において、患者のがん組織由来のがん細胞の初代培養細胞にインビトロで薬剤および／または放射線を作用させ、がん細胞に対する薬剤および／または放射線の作用を評価する工程を含む、がん細胞の薬剤および／または放射線に対する感受性および／または抵抗性を評価する方法を提供する。

上記方法におけるがん細胞の初代培養細胞、薬剤、放射線、がん細胞の薬剤および／または放射線に対する感受性および／または抵抗性を評価する方法等については上で説明したとおりである。上記方法の実施において、がん患者由来のがん細胞の初代培養細胞を含むパネルを用いることにより、一度に多くの癌細胞、薬剤、放射線について調べることができる。また、上記方法の実施において、上記キットを用いてもよい。

以下に実施例を示して本発明をより詳細かつ具体的に説明するが、実施例は本発明の範囲を限定するものと解してはならない。

（１）がん細胞の初代培養細胞の調製
３名のステージＩＶの大腸がん患者（Ｐｔ２５、Ｐｔ２０、Ｐｔ１７）から、以下のようにしてがん細胞の初代培養細胞を得た。

手術時に癌組織を切除し、外科用メスにて細断し、生理食塩水で３回洗浄し、次いで１％ペニシリン／ストレプトマイシン／アンフォテリシンＢを含有する生理食塩水で洗浄した。洗浄した組織を剪刀にて約１ｍｍに細断し、１ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼ（C6885;Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Sigma-Aldrich）に分散させ、シェーカー（Bio Shakor, BR−13FP）にて２００ｒｐｍで１５分間３７℃で振盪した。分散した組織をポアサイズ２００μｍのフィルター（Sansho Co., Tokyo, Japan）にて濾過した。細胞を含む濾液をポアサイズ２０μｍのフィルター（Sansho Co., Tokyo, Japan）に供し、ＤＭＥＭにて洗浄し、フィルター上に残ったＤＭＥＭ中の細胞を４００ｘｇにて５分間遠心分離した。

得られた細胞ペレットを２ｍｌの下記組成の培地（ｉＣＣ培地）に懸濁し、ＲＯＣＫインヒビターＹ−２７６３２を添加した。３７℃で２４−４８時間浮遊培養を行った。

ＤＭＥＭ／Ｆ１２中
Knockout serum replacement (Thermo Fisher Scientific, cat. 10828028) （２０％）
炭酸水素ナトリウム （２５ｍＭ）
Ｌ−アスコルビン酸 （０．１ｍｇ／ｍＬ）
β−ＦＧＦ （４−１００ｎｇ／ｍＬ）
ＴＧＦ−β （２０−３０ｐＭ）
β−メルカプトエタノール （０．１ｍＭ）
４−アミノ酪酸 （１ｍＭ）
塩化リチウム（０．５−１ｍＭ）
ペニシリン・ストレプトマイシン（１％）
Ｌ−グルタミン（１−４ ｍＭ）

浮遊培養した細胞を、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Sigma-Aldrich）中０．０３％マトリゲル（Corning Inc., Corning, NY, USA）にてコーティングされたプレート上に播いた。培地を２日ごとに交換した。細胞がプレートの５割以上に増殖するまで接着培養を行った。

接着培養後、アキュターゼ（Nacalai Tesque, Kyoto, Japan）を用いて細胞を剥離させた。細胞の約３０％を集め、ｉＣＣ培地に再懸濁し、マトリゲルにてコーティングしたプレート上に播いて継代した。残りの約７０％の細胞をSTEM-CELLBANKER（Takara Bio Inc., Shiga, Japan）に再懸濁し、−８０℃で冷凍保存した。使用時に冷凍保存細胞を急速解凍し、ＤＭＥＭで洗浄後、ｉＣＣ培地に懸濁した。

上記接着培養にて得られたがん細胞の初代培養細胞およびその継代培養物は、臨床の癌組織と形態が類似しており、免疫組織化学的分析の結果も臨床の癌組織と同様であった。初代培養細胞およびその継代培養物の免疫細胞学的分析の結果も臨床組織の癌細胞と同様であった。初代培養細胞およびその継代培養物についてＰＣＲにて遺伝子変異解析（ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦ）したところ、臨床組織中の癌細胞と同じ遺伝子発現パターンを示した。

（２）がん細胞の初代培養細胞の薬剤感受性評価
上記の接着培養にて得られた３名の大腸がん患者由来の初代培養細胞（Ｐｔ２５由来のｉＣＣ６０２、Ｐｔ２０由来のｉＣＣ１２９、Ｐｔ１７由来のｉＣＣ２５Ｄ）および大腸がん細胞株ＨＣＴ１１６を実験に用いた。

マルチウェルプレートに１ウェルあたり５×１０^３個の上記大腸がん患者由来の初代培養細胞または大腸がん細胞株ＨＣＴ１１６を播種してパネルを作成した。薬剤９６種を１０ｍＭの濃度で添加して７２時間培養した。薬剤添加から９６時間後にTACS XTT Cell Proliferation Assayを用いて初代培養細胞の増殖能・生存率を測定し、薬剤感受性を評価した。初代培養細胞とＨＣＴ１１６で異なる薬剤感受性パターンを示した。また、個々の初代培養細胞でも異なるパターンを示した。個々の患者で薬剤に対する感受性が異なるものと推測された。

（３）本発明の臨床における有用性
上記３名の大腸がん患者は実際の臨床で標準化学療法として選択されている５−ＦＵおよびオキサリプラチンを投与されていた。これらの患者について、本発明の初代培養細胞によるインビトロでの薬剤感受性の予測／判定と臨床における治療効果を比較した。

結果を図１に示す。５−ＦＵまたはオキサリプラチンに対する薬剤感受性を初代培養細胞で評価したところ、インビトロで感受性が高い（図中goodと表記）と予測された１例（Ｐｔ２０（ｉＣＣ１２９））については、臨床においても腫瘍の縮小が認められＳＤ（stable disease；安定）と判定された。また、インビトロで感受性が低い（図中poorと表記）と予測された２例（Ｐｔ２５（ｉＣＣ６０２）およびＰｔ１７（ｉＣＣ２５Ｄ））については、臨床においても腫瘍の増大が認められＰＤ（progressive disease；進行）と判定された。以上より、３例ともインビトロでの予測／判定と臨床での治療効果が一致した。従って、本発明は個々の患者の薬剤感受性および／または抵抗性の予測／判定に有用であることがわかった。

本発明は、がんの研究やがんの治療薬の開発などにおいて有用である。

Claims (17)

1. がん患者由来のがん細胞の初代培養細胞を含む、がん細胞の薬剤および／または放射線に対する感受性および／または抵抗性を評価するためのパネル。
2. 初代培養細胞が、下記工程：
   （ａ）患者由来のがん組織を細分化し、細分化されたがん組織から挟雑物を除去し、
   （ｂ）工程（ａ）で得られた組織塊を浮遊培養に供し、次いで
   （ｃ）工程（ｂ）で得られた培養物を接着培養に供する
   を含む方法により得られたものである、請求項１記載のパネル。
3. 初代培養細胞が、下記工程：
   （ａ）患者由来のがん組織を細分化し、細分化されたがん組織から挟雑物を除去し、次いで
   （ｂ）工程（ａ）で得られた組織塊を接着培養に供する
   を含む方法により得られたものである、請求項１記載のパネル。
4. 工程（ａ）における挟雑物の除去が篩い分けにより行われ、篩い分けによって得られる細胞塊のサイズの下限が約２０μｍ〜約１００μｍ、上限が約２００μｍ〜約５００μｍである、請求項２または３記載のパネル。
5. 薬剤が抗腫瘍剤である、請求項１〜４のいずれかに記載のパネル。
6. がん細胞の放射線感受性および／または抵抗性を評価するための、請求項１〜４のいずれかに記載のパネル。
7. 患者のがん組織由来のがん細胞の初代培養細胞を含むパネルを作成するための容器、ポアサイズが約２０μｍ〜約１００μｍのフィルター、およびポアサイズが約２００μｍ〜約５００μｍのフィルターを含む、がん細胞の薬剤および／または放射線に対する感受性および／または抵抗性を評価するためのキット。
8. 薬剤が抗腫瘍剤である、請求項７記載のキット。
9. がん細胞の放射線感受性および／または抵抗性を評価するための、請求項７記載のキット。
10. 患者のがん組織由来のがん細胞の初代培養細胞にインビトロで薬剤および／または放射線を作用させ、がん細胞に対する薬剤および／または放射線の作用を評価する工程を含む、がん細胞の薬剤および／または放射線に対する感受性および／または抵抗性を評価するための方法。
11. 初代培養細胞が、下記工程：
    （ａ）患者由来のがん組織を細分化し、細分化されたがん組織から挟雑物を除去し、
    （ｂ）工程（ａ）で得られた組織塊を浮遊培養に供し、次いで
    （ｃ）工程（ｂ）で得られた培養物を接着培養に供する
    を含む方法により得られたものである、請求項１０記載の方法。
12. 初代培養細胞が、下記工程：
    （ａ）患者由来のがん組織を細分化し、細分化されたがん組織から挟雑物を除去し、次いで
    （ｂ）工程（ａ）で得られた組織塊を接着培養に供する
    を含む方法により得られたものである、請求項１０記載の方法。
13. 工程（ａ）における挟雑物の除去が篩い分けにより行われ、篩い分けによって得られる細胞塊のサイズの下限が約２０μｍ〜約１００μｍ、上限が約２００μｍ〜約５００μｍである、請求項１１または１２記載の方法。
14. 請求項１〜６のいずれかに記載のパネルまたは請求項７〜９のいずれかに記載のキットを用いることを含む、請求項１０〜１３のいずれかに記載の方法。
15. 薬剤が抗腫瘍剤である請求項１０〜１４のいずれかに記載の方法。
16. がん細胞の放射線感受性および／または抵抗性を評価するための、請求項１０〜１４のいずれかに記載の方法。
17. がん細胞に対する薬剤および／または放射線の作用の評価が画像解析によるものである請求項１０〜１６のいずれかに記載の方法。

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