JP2019058143A - 細胞の培養安定性を予測する方法 - Google Patents

Abstract

【課題】より簡便で安価な，細胞の培養安定性を予測する方法を提供する。【解決手段】培養条件を上限から下限を経て上限へ変化させた際、または，下限から上限を経て下限へ変化させた際の測定値をプロットして得られる２つのグラフにより形成される多角形のある部分の高さの差を指標として求め，この差が大きいほど細胞の培養安定性に優れると評価する方法、および、その方法を実装するプログラム，コンピュータ及びプログラムを記憶した情報記録媒体。【選択図】図２

Description

細胞を用いて医薬品を製造する工程において，複数の細胞を作出した後に医薬品製造に適した特徴を持つ細胞の選抜が実施される。例えば抗体医薬品製造を目的とする場合には，細胞が抗体を分泌する量が多いことや，分泌される抗体の品質が良好であることの他，細胞が長期の培養を経ても変化しにくい安定性を有することが求められる。細胞は通常１日に１回程度分裂し，その数を増やしていくが，この時親となる元の細胞と，分裂によって生じた子の細胞との間に差異が生じ，これが回数を重ねることによって無視できない程度まで増大することがあり，この変化の程度が少ない細胞ほど医薬品の製造工程に適している。現在，細胞の長期培養安定性を調べるために，実際に複数種類の細胞を長期間に渡って培養し続ける操作が実施されている。まず，長期間培養し続ける前の細胞の一部を凍結保存し，残りの一部を長期間培養する。そして長期間培養後の細胞について分析を実施し，長期間培養前の細胞と比較を行う。例えば抗体医薬品製造を目的とする場合には，細胞から分泌される抗体の量などが比較の対象となっている。長期間培養前後で差異の少ない細胞が長期培養安定性を有する細胞と判断され，事前に凍結保存しておいた長期間培養前の細胞を取り出して製造に用いる。

ここで，細胞の長期培養安定性を，実際に長期間培養することなしに予測する技術への要求が浮上してきた。細胞を長期間培養する工程は，細胞培養に必要な空間を長期間に渡って占有し，また，３日に１回程度継代と呼ばれる作業が細胞の世話に必要であるために実施にコストがかかる。従って，実際に長期間培養し続けることが可能な細胞の種類の数が，医薬品製造に適した細胞として選抜されることになる分母の細胞数を制限していた。もし細胞の長期培養安定性を長期間の培養に先立って予測することができれば，医薬品製造に適した細胞として選抜されることになる分母の細胞の種類の数を増大させることが可能となり，医薬品製造に適した細胞の開発費用対効果を向上させることができる。

特開２０１６−１３１０２号公報には，細胞を安定させる条件を定量評価する方法が記載されている。この方法は，薬剤濃度を変化させた際の細胞の遺伝子発現量を用いて，細胞を安定させる条件を定量評価する方法である。

特開２０１６−１３１０２号公報

特開２０１６−１３１０２号公報に記載された方法は，薬剤濃度を変化させる工程と遺伝子発現量を測定する工程が煩雑であり，特に高額な試薬を用いる場合は，多くのコストがかかるという問題があった。

そこで，本発明は，より簡便で安価な方法を用いて，細胞の培養安定性を予測する方法を提供することを目的とする。さらに本発明は，コンピュータを用いて，そのような方法を実行するためのプログラムや，そのようなプログラムを記録した情報記録媒体，そのようなプログラムを実装したコンピュータを提供することを目的とする。

本発明は，基本的には，温度といった制御しやすい環境条件を調整しつつ，細胞の直径といった測定しやすい要素を用いても，細胞の培養安定性を評価できるという実施例による知見に基づくものである。例えば，ある薬剤を用いた培養安定性を評価するといった場合であっても，薬剤の濃度を様々な濃度に変化させることなく，簡易な条件を変化させることにより，ある薬剤を用いた場合の培養安定性を評価できることとなる。そして，培養安定性の評価についても，培養条件を上限から下限を経て上限へ変化させた際であるか，下限から上限を経て下限へ変化させた際の測定値をプロットして得られる２つのグラフにより形成される多角形のある部分の高さを指標とすることができるという実施例による知見に基づく。

第１に本発明は，細胞培養の安定性を予測する方法に関する。換言すると，本発明は，ある条件における培養安定性の指標を得る方法である。

この方法は，（ｉ）培養環境条件の上限（ＣＵ）から，培養環境条件の下限（ＣＬ）へ，培養環境条件を複数点変化させ，それら複数の測定点における細胞の測定値を得る。次に，培養環境条件の下限（ＣＬ）から，培養環境条件の上限（ＣＵ）へ，培養環境条件を複数点変化させ，それら複数の測定点における細胞の測定値を得る。
培養環境条件の上限（ＣＵ）や培養環境条件の下限（ＣＬ）は，ユーザが適宜設定すればよい。

一方，培養環境条件を横軸とし，各測定点における測定値をプロットしてグラフ化する。
グラフ化を行うと出現した培養環境条件の下限（ＣＬ）における測定値（ＣＬＶ）を頂点のひとつとする多角形が出現する。ＣＬＶの対頂点である交点に相当する培養環境条件の値と，培養環境条件の下限（ＣＬ）との間の培養環境条件の値である規定値から垂線を引いた際の多角形の２つの交点の縦軸の値の差を求める。

上記とは逆に，（ｉｉ） 培養環境条件の下限（ＣＬ）から，培養環境条件の上限（ＣＵ）へ，培養環境条件を複数点変化させた際の複数の測定点における細胞の測定値を得て，
培養環境条件の上限（ＣＵ）から，培養環境条件の下限（ＣＬ）へ、培養環境条件を複数点変化させた際の複数の測定点における細胞の測定値を得て，
培養環境条件を横軸とし，各測定点における測定値をプロットしてグラフ化し，
グラフ化によって出現した培養環境条件の上限（ＣＵ）における測定値（ＣＵＶ）を頂点のひとつとする多角形における，ＣＵＶの対頂点である交点に相当する培養環境条件の値と，培養環境条件の上限（ＣＵ）との間の培養環境条件の値である規定値から垂線を引いた際の多角形の２つの交点の縦軸の値の差を求めてもよい。

培養環境条件は，培養環境の温度，酸性度，攪拌回転数（ＲＰＭ）,又は溶存酸素量（ＤＯ）である。細胞の培養環境は，公知である。通常，細胞は，培地を用いて培養される。対象となる細胞は，ヒト細胞であっても，ヒト以外の哺乳動物の細胞であってもかまわないし，植物細胞であってもかまわない。細胞の測定値は，細胞の直径，半径，面積，形状，アスペクト比，又は細胞からの光強度である。

規定値は，上記の（ｉ）の場合は，ＣＬと交点との中間値付近の測定点であることが好ましい。また，上記の（ｉｉ）の場合は，ＣＵと交点との中間値付近の測定点であることが好ましい。

多角形の面積を細胞の長期培養安定性を示す第２の指標としてもよい。多角形の面積を求めるプログラムは公知である。公知のプログラムを用いて多角形の面積を求めればよい。第２の指標は，他に求めた面積と比較することで，細胞の培養安定性に関する情報を得ることができる。面積が大きいほど，細胞の培養安定性に優れるといえる。

本発明は，細胞培養の安定性を予測するシステムをも提供する。このシステムは，細胞培養系３の培養環境条件を変化させるための培養環境条件調整装置５と，細胞培養系３の細胞の測定値を得るための測定系７と，培養環境条件調整装置５へ制御指令を出すとともに，測定系７からの測定情報を受け取る，制御装置９と，を含む。

制御装置９は，
（ｉ）培養環境条件調整装置５に対し，培養環境条件の上限（ＣＵ）から培養環境条件の下限（ＣＬ）へ，培養環境条件を複数点変化させるように指示を行うとともに，培養環境条件を複数点変化させた際の複数の測定点における細胞の測定値を測定系７から受け取り，
培養環境条件調整装置５に対し，培養環境条件の下限（ＣＬ）から培養環境条件の上限（ＣＵ）へ，培養環境条件を複数点変化させるように指示を行うとともに，培養環境条件を複数点変化させた際の複数の測定点における細胞の測定値を測定系７から受け取り，
培養環境条件を横軸とし，各測定点における測定値をプロットしてグラフ化し，
グラフ化によって出現した培養環境条件の下限（ＣＬ）における測定値（ＣＬＶ）を頂点のひとつとする多角形における，ＣＬＶの対頂点である交点に相当する培養環境条件の値と，培養環境条件の下限（ＣＬ）との間の培養環境条件の値である規定値から垂線を引いた際の多角形の２つの交点の縦軸の値の差を求めるか，
（ｉｉ）培養環境条件調整装置５に対し，培養環境条件の上限（ＣＵ）から培養環境条件の下限（ＣＬ）へ，培養環境条件を複数点変化させるように指示を行うとともに，培養環境条件を複数点変化させた際の複数の測定点における細胞の測定値を測定系７から受け取り，
培養環境条件調整装置５に対し，培養環境条件の下限（ＣＬ）から培養環境条件の上限（ＣＵ）へ，培養環境条件を複数点変化させるように指示を行うとともに，培養環境条件を複数点変化させた際の複数の測定点における細胞の測定値を測定系（７）から受け取り，
培養環境条件を横軸とし，各測定点における測定値をプロットしてグラフ化し，
グラフ化によって出現した培養環境条件の上限（ＣＵ）における測定値（ＣＵＶ）を頂点のひとつとする多角形における，ＣＵＶの対頂点である交点に相当する培養環境条件の値と，培養環境条件の上限（ＣＵ）との間の培養環境条件の値である規定値から垂線を引いた際の多角形の２つの交点の縦軸の値の差を求め，
培養環境条件は，培養環境の温度，酸性度，攪拌回転数（ＲＰＭ）,又は溶存酸素量（ＤＯ）であり，
細胞の測定値は，細胞の直径，半径，面積，形状，アスペクト比，又は細胞からの光強度であり，
２つの交点の縦軸の値の差を細胞の細胞培養の安定性を示す指標とする。

本発明はプログラムをも提供する。このプログラムは，コンピュータを，
（ｉ）培養環境条件調整装置５に対し，培養環境条件の上限（ＣＵ）から培養環境条件の下限（ＣＬ）へ，培養環境条件を複数点変化させるように指示を行い，
培養環境条件を複数点変化させた際の複数の測定点における前記細胞の測定値を前記測定系７から受け取り，
前記培養環境条件調整装置５に対し，前記培養環境条件の下限（ＣＬ）から培養環境条件の上限（ＣＵ）へ，培養環境条件を複数点変化させるように指示を行い，
培養環境条件を複数点変化させた際の複数の測定点における前記細胞の測定値を前記測定系７から受け取り，
培養環境条件を横軸とし，各測定点における前記測定値をプロットしてグラフ化し，
グラフ化によって出現した前記培養環境条件の下限（ＣＬ）における測定値（ＣＬＶ）を頂点のひとつとする多角形における，ＣＬＶの対頂点である交点に相当する培養環境条件の値を求め，
培養環境条件の下限（ＣＬ）との間の培養環境条件の値である規定値を求め，
前記規定値から垂線を引いた際の前記多角形の２つの交点の縦軸の値の差を求めるか，
（ｉｉ）培養環境条件調整装置５に対し，培養環境条件の下限（ＣＬ）から培養環境条件の上限（ＣＵ）へ，培養環境条件を複数点変化させるように指示を行い，
培養環境条件を複数点変化させた際の複数の測定点における前記細胞の測定値を前記測定系７から受け取り，
前記培養環境条件調整装置５に対し，前記培養環境条件の上限（ＣＵ）から培養環境条件の下限（ＣＬ）へ，培養環境条件を複数点変化させるように指示を行い，
培養環境条件を複数点変化させた際の複数の測定点における前記細胞の測定値を前記測定系７から受け取り，
培養環境条件を横軸とし，各測定点における前記測定値をプロットしてグラフ化し，
グラフ化によって出現した前記培養環境条件の上限（ＣＵ）における測定値（ＣＵＶ）を頂点のひとつとする多角形における，ＣＬＶの対頂点である交点に相当する培養環境条件の値を求め，
培養環境条件の下限（ＣＬ）との間の培養環境条件の値である規定値を求め，
前記規定値から垂線を引いた際の前記多角形の２つの交点の縦軸の値の差を求め，
前記培養環境条件は，前記培養環境の温度，酸性度，攪拌回転数（ＲＰＭ）,又は溶存酸素量（ＤＯ）であり，
前記細胞の測定値は，前記細胞の直径，半径，面積，形状，アスペクト比，又は前記細胞からの光強度であり，
前記２つの交点の縦軸の値の差を記憶するように機能させる，プログラムである。

本発明は，上記のプログラムを格納したコンピュータが読み取ることができる情報記録媒体をも提供する。記録媒体の例は，ＣＤ，ＣＤ−ＲＯＭ，ＤＶＤ，ＵＳＢメモリ，ハードディスク，ＳＤカード及びブルーレイディスクである。

本発明は，より簡便で安価な方法を用いて，細胞の培養安定性を予測する方法を提供することができる。さらに本発明は，コンピュータを用いて，そのような方法を実行するためのプログラムや，そのようなプログラムを記録した情報記録媒体，そのようなプログラムを実装したコンピュータを提供することができる。

図１は，コンピュータのブロック図である。 図２は，本発明のシステムの概念図である。 図３は，本発明の方法を説明するための概念図である。 図４は，時間，温度，及び平均直径の関係を示す図面に替るグラフである。 図５は，温度と細胞直径の測定値を示す図面に替るグラフである。 図６は，培養中に温度を変化させた際の細胞直径の変化量と，細胞の長期安定性を示すパラメータである抗体タンパク質の分泌量の長期培養前後の変化量とを比較するための図面に替るグラフである。 図７は，長期培養前後の抗体タンパク質の分泌量の変化が小さかった細胞の温度と細胞の直径の関係を示す図面に替るグラフである。 図８は，長期培養前後の抗体タンパク質の分泌量の変化が大きかった細胞の温度と細胞の直径の関係を示す図面に替るグラフである。

以下，図面を用いて本発明を実施するための形態について説明する。本発明は，以下に説明する形態に限定されるものではなく，以下の形態から当業者が自明な範囲で適宜修正したものも含む。

本発明の最初の側面は，細胞培養の安定性を予測する方法に関する。細胞培養の安定性とは，細胞培養を行った際に，細胞の変動が小さく，安定しているか否かを評価する方法である。

以下では，培養環境条件として培養系の温度，細胞の測定値として培養系において培養される細胞の平均直径を例として用いて説明する。図１は，コンピュータのブロック図である。図１に示されるように，コンピュータは，入出力部，制御部１１，演算部１３及び記憶部１５を有しており，各要素は，バスなどを用いて情報の授受を行うことができるようにされている。制御部１１は，入出力部から各種情報が入力されると，記憶部１５に記憶された制御プログラムを読み出す。そして，制御部１１は，適宜記憶部１５に記憶された情報を読み出し，入出力部から入力された情報を適宜用いて，演算部１３に演算を行わせ，得られた結果を，記憶部１５に記憶させるほか，適宜入出力部から出力する。また，制御部１１は，制御プログラムの指令に基づいて，記憶部から各種情報や制御情報を読み出して，入出力部から出力することで，コンピュータと接続された各種の装置を制御できる。

コンピュータにあらかじめ培養系において培養される細胞の培養温度を入力しておく。この際，コンピュータの記憶部は，培養温度の下限値（ＣＬ）と，培養温度の上限値（ＣＵ）を記憶する。この温度は，培養する細胞や，培養系に含まれる試薬等の種々の条件により変化させてもかまわない。コンピュータには，培養温度の変化値（ΔＴ），変化させる温度の数を記憶させるか，温度を変化させる際に，最初の温度，次の温度，・・・といった温度条件を記憶させてもよい。培養温度の下限値の例は，１０℃以上５００℃以下であり，２０℃以上４０℃以下でもよいし，２２℃以上３０℃以下でもよい。培養温度の上限値の例は，１５℃以上８００℃以下であり，２５℃以上８０℃以下でもよいし，３０℃以上４０℃以下でもよい。培養温度の変化値（Δ）の例は，２℃〜５０℃であり，培養温度の下限値（ＣＬ）と培養温度の上限値（ＣＵ）との間の温度の種類の例は，３種類以上１５種類以下であり，４種類以上１０種類以下が好ましく，４種類以上６種類以下でもよい。

コンピュータは，記憶部から設定された温度情報を読み出し，培養系の温度制御装置に，制御指令を出す。すると，培養系の温度制御装置は，制御指令に従って，培養系の温度を変化させる。その際，培養系には，温度計などのセンサがあり，測定情報がコンピュータまたは温度制御装置に伝えられる。伝えられた温度情報を用いて，温度制御装置は，培養系の温度を調整する。このようにして，コンピュータにより培養系の温度が制御される。このようにして，培養系を下限温度（ＣＬ）から上限温度（ＣＵ）へ，複数種類温度を変化させる。

細胞培養系には，例えば，ＣＣＤカメラといった測定系が存在する。そして，測定系は，温度を変化させるたびに，培養系における細胞を撮影する。そして，公知のプログラムを用いて，細胞系における細胞直径を測定し，その平均値を求める。求めた情報が，コンピュータに入力されてもよい。また，撮影した写真をコンピュータに入力し，コンピュータが，公知のプログラムを用いて，細胞直径や細胞直径の平均値を求めるようにしてもよい。求めた，細胞直径の値は，測定の際の温度とともに，コンピュータの記憶部に記憶される。

次に，コンピュータは，培養系を上限温度（ＣＵ）から下限温度（ＣＬ）へ，複数温度変化させるため，記憶部から設定された温度情報を読み出し，培養系の温度制御装置に，制御指令を出す。すると，上記と同様にして，複数の設定温度ごとに，細胞直径が求められ，温度情報とともに，適宜コンピュータの記憶部に記憶される。

コンピュータは，記憶部から，各温度と測定値に関する情報を読み出す。そして，コンピュータは，記憶部に記憶された制御プログラムを用いて，読み出した温度と測定値を用いてグラフを作成する。この際，例えば，横軸を温度，縦軸を細胞直径（の平均値）とする。コンピュータは，各値をプロットする。グラフを視覚化する場合には，下限温度（ＣＬ）から上限温度（ＣＵ）へ変化させた際の細胞直径の値と，上限温度（ＣＵ）から下限温度（ＣＬ）へ変化させた際の細胞直径の値とで，異なる記号を付してもよい。この処理を実行するためには，記憶部から２種類の異なる記号（例えば，＋と〇や，○と●）を読みだして，それぞれの測定点上に置くようにすればよい。グラフを視覚化しない場合は，プロットは仮想的なものであってもよく，実際にグラフを作成しなくてもかまわない。

グラフ化を行うと，温度条件の上限（ＣＵ）における測定値（ＣＵＶ）を頂点のひとつとする多角形が出現する。なお，測定値（ＣＵＶ）を頂点とする多角形よりも，面積が大きな多角形が存在する場合は，測定値（ＣＵＶ）を，上限（ＣＵ）側の交点のように読み替えればよい。以下では，多角形の一端が，温度条件の上限（ＣＵ）における測定値（ＣＵＶ）であるものに基づいて説明する。もう一つの端は，培養系を下限温度（ＣＬ）から上限温度（ＣＵ）へ変化させて得られる測定点をプロットしたグラフと，培養系を上限温度（ＣＵ）から下限温度（ＣＬ）へ変化させて得られる測定点をプロットしたグラフとの交点である。この交点を「ＣＵＶの対頂点」（Ｐ）とよぶ。多角形が四角形の場合は，この交点は，ＣＵＶの対頂点である。

コンピュータは，記憶部に各温度と測定値を記憶しているので，読み出したこれらの値を座標値として用いて，記憶部から読み出した制御プログラムを用いて，演算部に演算処理を行わせ，ＣＵＶの対頂点（又は多角形の交点）を求める。そして，求めたＣＵＶの対頂点を記憶部に記憶する。なお，多角形の頂点にＣＵＶを含まないものである場合も，同様にして交点を求めることができる。多角形の交点は，上限温度（ＣＵ）から下限温度（ＣＬ）へ変化させた際の細胞直径の値をプロットしたグラフと，下限温度（ＣＬ）から上限温度（ＣＵ）へ変化させた際の細胞直径の値をプロットしたグラフとが交わる点である。これらは，測定温度と測定値をｘ，ｙ座標として関数演算を行うことで求めることができる。

次に，コンピュータは，温度条件の上限（ＣＵ）の値と，ＣＵＶの対頂点における温度値とを読み出す。コンピュータは，制御プログラムの指令に基づいて，温度条件の上限（ＣＵ）の値と，ＣＵＶの対頂点における温度値の間の値である規定値を求める。この規定値という呼び名は便宜的なものであり，特に意味はない。コンピュータは求めた規定値を記憶部に記憶する。規定値は，温度条件の上限（ＣＵ）の値と，ＣＵＶの対頂点における温度値の間の値の任意の値が求められてもよい。また，コンピュータは，制御プログラムの制御指令に従って，ＣＵとＣＵＶの対頂点における温度値との平均値を求め，求めた平均値に最も近い温度（温度条件のひとつ）を，規定値（ＰＶ）としてもよい。このようにして，コンピュータは，規定値を求め，記憶部に記憶する。ここで規定値は，垂線を引くための垂線の足に相当する値である。

コンピュータは，（仮想的な）横軸が温度であり，縦軸が細胞直径であるグラムにおける横軸上の規定値の位置から垂線を引き，多角形との交点を求める。コンピュータは，規定値を求めるとともに，温度が規定値の前後にある温度と測定値とを読み出して，隣接する測定点の座標から隣接する測定点をつなぐ直線の式を求め，その直線におけるｘ座標が規定値のもののｙ座標を求めるようにしてもよい。また，規定値がある温度条件と一致する場合は，その温度における測定値を読み出してもよい。この作業を，培養系を下限温度（ＣＬ）から上限温度（ＣＵ）へ変化させて得られる測定点をプロットしたグラフと，培養系を上限温度（ＣＵ）から下限温度（ＣＬ）へ変化させて得られる測定点をプロットしたグラフの双方について行う。そして，コンピュータは，記憶した２つのｙ座標を読み出して，ｙ座標の大きいものから小さいものを引く演算を行うことにより，「規定値から垂線を引いた際の多角形の２つの交点の縦軸の値の差」を求める。そして，求めた差を記憶部に記憶する。記憶部には，複数の環境における環境の情報と，差の情報とが記憶されている。コンピュータは，環境の情報と，差とを読み出して，読み出した差の大きさを比較する。そして，差が大きい系ほど，細胞培養の安定性が高いと評価する。

また，コンピュータは，あらかじめ「差」の値に応じた，安定性の評価値を記憶部に記憶しておき，得られた差の値を用いて，記憶部から安定性の評価値を読み出して，読み出した安定性の評価値を出力する（例えば，モニタに表示する）ようにしてもよい。

上記は，培養系を下限温度（ＣＬ）から上限温度（ＣＵ）へ変化させた後に，培養系を上限温度（ＣＵ）から下限温度（ＣＬ）へ変化させる場合について説明した。培養系を上限温度（ＣＵ）から下限温度（ＣＬ）へ変化させた後に，培養系を下限温度（ＣＬ）から上限温度（ＣＵ）へ変化させる場合も上記と同様である。

培養環境条件は，培養環境の温度ではなく，培養環境の酸性度，攪拌回転数（ＲＰＭ）,又は溶存酸素量（ＤＯ）であっても，上記と同様である。酸性度のＣＬ及びＣＵは，培養する細胞に応じて調整すればよい。ＣＬの例は，ｐＨ１２〜ｐＨ５であり，ｐＨ１０〜ｐＨ７でもよい。ＣＵの例は，ｐＨ７〜ｐＨ１であり，ｐＨ６〜ｐＨ４でもよい。攪拌回数の例は，ＣＬ〜ＣＵが，１ＲＰＭ〜１００００ＲＰＭであり，２ＲＰＭ〜１００ＲＰＭでもよいし，３ＲＰＭ〜５０ＲＰＭでもよい。ＤＯの例は，ＣＬ〜ＣＵが０．１ｐｐｍ〜１０ｐｐｍであり，１ｐｐｍ〜５ｐｐｍでもよいし，１．５ｐｐｍ〜５ｐｐｍでもよい。培地の酸性度を調整する酸性度調整装置は，公知である。例えば，コンピュータからの制御指令に従って，ｐＨ調整剤を適宜培地に添加することにより，培地の酸性度を調整すればよい。そして，培養系には，ｐＨメータが存在し，ｐＨメータが測定した培地の酸性度が，酸性度調整装置またはコンピュータへ伝えられ，培地が所望の酸性度となるように調整されればよい。培地を攪拌培養する場合は，例えば，ロータ等の回転子により羽が回転し，培地を攪拌する。この際，コンピュータは培地の回転数を記憶しておき，読み出した回転数を回転子へ伝え，培地を所望の回転速度または回転数（ＲＰＭ）により，回転するように制御すればよい。培地の溶存酸素量についても同様である。培養系は，ガス供給手段と酸素濃度計とを有しており，コンピュータの指令に基づいて，ガス供給手段がガス（例えば，酸素や空気）を培地に供給しつつ，酸素濃度系が，培地の溶存酸素量を測定すればよい。そして，測定した溶存酸素量を用いて，所望のＤＯとなるようにバス供給手段を調整すればよい。

細胞の測定値が，細胞の直径以外の場合も，上記と同様に処理することができる。細胞の半径については，直径の半分の値であるから，細胞の直径と同様のアルゴリズムにより，処理できる。細胞の面積を用いる場合は，撮影した細胞の写真から，細胞面積を求める制御プログラムを用いることにより，細胞の面積や細胞の平均面積を求めることができる。細胞の形状については，例えば，細胞の種類ごとに，形状と形状に応じた点数を記憶して起き，撮影した細胞の写真から，細胞の形状を分析し，分析した細胞の形状に応じて点数を求め，求めた点数の平均値を求めるといった制御プログラムを用いればよい。細胞の形状に応じた点数の例は，細胞の形状が丸いほどよい細胞については，丸が５点，楕円のうちアスペクト比が１．２以上１．５以下が４点といったものである。測定値が細胞からの光強度の例は，細胞に所定の光を与え合ときの反射光や，細胞の蛍光や細胞からのりん光である。これらはフォトディテクタといった光検出器やＣＣＤといった光検出器を用いることで測定できる。

チャイニーズハムスター卵巣由来細胞株（CHO−K1）に抗体タンパク質をコードする遺伝子を導入した細胞株を２６株作成した．これらの細胞のそれぞれについて，その一部を凍結保存し，残りの一部を長期間の培養試験に供した．また，さらに残った一部について，８時間毎に温度を変化させながら培養し，温度を変化させるタイミングで細胞の顕微鏡写真を撮影してその解析から細胞の直径を測定した．培養温度の推移は，３７度，３３度，２９度，２７度，２９度，３３度，３７度と細胞培養に利用する人工気象装置の温度ツマミを８時間毎に変化させることで発生させた．そして，温度ツマミを操作する旅にそれぞれの細胞の一部を採取し，細胞の直径を測定した．

温度が推移する条件下で培養された細胞の直径は２７度に設定されるまで増大し，２７度に設定された後に減少した．また，再度２９度に設定された後もただちに以前２９度に設定された後と同等の細胞直径まで増大して戻ることはなく，再度３３度に設定した後に以前３３度に設定した後と同程度以上まで増大した（図４）．図４は，時間，温度，及び平均直径の関係を示す図面に替るグラフである。
以上の結果より，培養温度を変化させた際の細胞直径にヒステリシスが生じることが確認された．特に３３度から２９度に設定した後に測定した細胞の直径と，２７度から２９度に設定した後に測定した細胞の直径の差が大きく，以後，この差異の値を細胞の長期安定性を説明しうるパラメータ候補として利用する（図５，２７度に設定する前の細胞については"＋"にてプロットした．）．図５は，温度と細胞直径の測定値を示す図面に替るグラフである。

２６株すべての細胞について，その一部を長期間培養し，長期間培養の前後においてそれらの細胞が分泌する抗体タンパク質の量の比を測定した．以後，この差異の値を細胞の長期安定性を示すパラメータとして利用する．
上記のようにして測定された２つのパラメータ，すなわち，細胞の長期安定性を説明しうるパラメータ候補であると考えられる，培養中に温度を変化させた際の細胞直径の変化量と，細胞の長期安定性を示すパラメータである抗体タンパク質の分泌量の長期培養前後の変化量とを比較した。図６は，培養中に温度を変化させた際の細胞直径の変化量と，細胞の長期安定性を示すパラメータである抗体タンパク質の分泌量の長期培養前後の変化量とを比較するための図面に替るグラフである。その結果，細胞直径の変化と，抗体たんぱく質の分泌量の変化量との間に，相関関係が見出された（r = 0.5721036, p = 0.001468,）．

図７は，長期培養前後の抗体タンパク質の分泌量の変化が小さかった細胞の温度と細胞の直径の関係を示す図面に替るグラフである。図８は，長期培養前後の抗体タンパク質の分泌量の変化が大きかった細胞の温度と細胞の直径の関係を示す図面に替るグラフである。縦軸には細胞の直径を配置し（単位はμＭ），縦軸には細胞の直径を測定する８時間前に設定された人工気象装置の温度ツマミを配置した．人工気象装置の温度は３７度，３３度，２９度，２７度，３３度，３７度と変化し，一度減少した後に増大するように変化する．２７度に設定する前の細胞については"＋"にてプロットした．

本発明は，細胞培養を行うバイオ・医薬の分野において利用されうる。

３ 細胞培養系
５ 培養環境条件調整装置
７ 測定系
９ 制御装置

Claims (6)

1. 細胞培養の安定性を予測する方法であって，
   （ｉ） 培養環境条件の上限（ＣＵ）から，培養環境条件の下限（ＣＬ）へ，培養環境条件を複数点変化させた際の複数の測定点における前記細胞の測定値を得て，
   前記培養環境条件の下限（ＣＬ）から，培養環境条件の上限（ＣＵ）へ，培養環境条件を複数点変化させた際の複数の測定点における前記細胞の測定値を得て，
   培養環境条件を横軸とし，各測定点における前記測定値をプロットしてグラフ化し，
   グラフ化によって出現した前記培養環境条件の下限（ＣＬ）における測定値（ＣＬＶ）を頂点のひとつとする多角形における，ＣＬＶの対頂点である交点に相当する培養環境条件の値と，培養環境条件の下限（ＣＬ）との間の培養環境条件の値である規定値から垂線を引いた際の前記多角形の２つの交点の縦軸の値の差を求めるか，
   （ｉｉ） 前記培養環境条件の下限（ＣＬ）から，培養環境条件の上限（ＣＵ）へ，培養環境条件を複数点変化させた際の複数の測定点における前記細胞の測定値を得て，
   前記培養環境条件の上限（ＣＵ）から，培養環境条件の下限（ＣＬ）へ、培養環境条件を複数点変化させた際の複数の測定点における前記細胞の測定値を得て，
   培養環境条件を横軸とし，各測定点における前記測定値をプロットしてグラフ化し，
   グラフ化によって出現した前記培養環境条件の上限（ＣＵ）における測定値（ＣＵＶ）を頂点のひとつとする多角形における，ＣＵＶの対頂点である交点に相当する培養環境条件の値と，培養環境条件の上限（ＣＵ）との間の培養環境条件の値である規定値から垂線を引いた際の前記多角形の２つの交点の縦軸の値の差を求め，
   前記培養環境条件は，前記培養環境の温度，酸性度，攪拌回転数（ＲＰＭ）,又は溶存酸素量（ＤＯ）であり，
   前記細胞の測定値は，前記細胞の直径，半径，面積，形状，アスペクト比，又は前記細胞からの光強度であり，
   前記２つの交点の縦軸の値の差を細胞の細胞培養の安定性を示す指標とする，細胞培養の安定性を予測する方法。
2. 請求項１に記載の細胞培養の安定性を予測する方法であって，
   前記規定値は，
   （ｉ）前記ＣＬと前記交点との中間値付近の測定点であるか，
   （ｉｉ）前記ＣＵと前記交点との中間値付近の測定点である,方法。
3. 請求項１に記載の細胞培養の安定性を予測する方法であって，
   前記多角形の面積を細胞の長期培養安定性を示す第２の指標とする，方法。
4. 細胞培養系（３）の培養環境条件を変化させるための培養環境条件調整装置（５）と，
   前記細胞培養系（３）の前記細胞の測定値を得るための測定系（７）と，
   前記培養環境条件調整装置（５）へ制御指令を出すとともに，前記測定系（７）からの測定情報を受け取る，制御装置（９）と，
   を含む，細胞培養の安定性を予測するシステムであって，
   前記制御装置（９）は，
   （ｉ）前記培養環境条件調整装置（５）に対し，培養環境条件の上限（ＣＵ）から培養環境条件の下限（ＣＬ）へ，培養環境条件を複数点変化させるように指示を行うとともに，培養環境条件を複数点変化させた際の複数の測定点における前記細胞の測定値を前記測定系（７）から受け取り，
   前記培養環境条件調整装置（５）に対し，前記培養環境条件の下限（ＣＬ）から培養環境条件の上限（ＣＵ）へ，培養環境条件を複数点変化させるように指示を行うとともに，培養環境条件を複数点変化させた際の複数の測定点における前記細胞の測定値を前記測定系（７）から受け取り，
   培養環境条件を横軸とし，各測定点における前記測定値をプロットしてグラフ化し，
   グラフ化によって出現した前記培養環境条件の下限（ＣＬ）における測定値（ＣＬＶ）を頂点のひとつとする多角形における，ＣＬＶの対頂点である交点に相当する培養環境条件の値と，培養環境条件の下限（ＣＬ）との間の培養環境条件の値である規定値から垂線を引いた際の前記多角形の２つの交点の縦軸の値の差を求めるか，
   （ｉｉ）前記培養環境条件調整装置（５）に対し，培養環境条件の上限（ＣＵ）から培養環境条件の下限（ＣＬ）へ，培養環境条件を複数点変化させるように指示を行うとともに，培養環境条件を複数点変化させた際の複数の測定点における前記細胞の測定値を前記測定系（７）から受け取り，
   前記培養環境条件調整装置（５）に対し，前記培養環境条件の下限（ＣＬ）から培養環境条件の上限（ＣＵ）へ，培養環境条件を複数点変化させるように指示を行うとともに，培養環境条件を複数点変化させた際の複数の測定点における前記細胞の測定値を前記測定系（７）から受け取り，
   培養環境条件を横軸とし，各測定点における前記測定値をプロットしてグラフ化し，
   グラフ化によって出現した前記培養環境条件の上限（ＣＵ）における測定値（ＣＵＶ）を頂点のひとつとする多角形における，ＣＵＶの対頂点である交点に相当する培養環境条件の値と，培養環境条件の上限（ＣＵ）との間の培養環境条件の値である規定値から垂線を引いた際の前記多角形の２つの交点の縦軸の値の差を求め，
   前記培養環境条件は，前記培養環境の温度，酸性度，攪拌回転数（ＲＰＭ）,又は溶存酸素量（ＤＯ）であり，
   前記細胞の測定値は，前記細胞の直径，半径，面積，形状，アスペクト比，又は前記細胞からの光強度であり，
   前記２つの交点の縦軸の値の差を細胞の細胞培養の安定性を示す指標とする，システム。
5. コンピュータを，
   （ｉ）培養環境条件調整装置（５）に対し，培養環境条件の上限（ＣＵ）から培養環境条件の下限（ＣＬ）へ，培養環境条件を複数点変化させるように指示を行い，
   培養環境条件を複数点変化させた際の複数の測定点における前記細胞の測定値を前記測定系（７）から受け取り，
   前記培養環境条件調整装置（５）に対し，前記培養環境条件の下限（ＣＬ）から培養環境条件の上限（ＣＵ）へ，培養環境条件を複数点変化させるように指示を行い，
   培養環境条件を複数点変化させた際の複数の測定点における前記細胞の測定値を前記測定系（７）から受け取り，
   培養環境条件を横軸とし，各測定点における前記測定値をプロットしてグラフ化し，
   グラフ化によって出現した前記培養環境条件の下限（ＣＬ）における測定値（ＣＬＶ）を頂点のひとつとする多角形における，ＣＬＶの対頂点である交点に相当する培養環境条件の値を求め，
   培養環境条件の下限（ＣＬ）との間の培養環境条件の値である規定値を求め，
   前記規定値から垂線を引いた際の前記多角形の２つの交点の縦軸の値の差を求めるか，
   （ｉｉ）培養環境条件調整装置（５）に対し，培養環境条件の下限（ＣＬ）から培養環境条件の上限（ＣＵ）へ，培養環境条件を複数点変化させるように指示を行い，
   培養環境条件を複数点変化させた際の複数の測定点における前記細胞の測定値を前記測定系（７）から受け取り，
   前記培養環境条件調整装置（５）に対し，前記培養環境条件の上限（ＣＵ）から培養環境条件の下限（ＣＬ）へ，培養環境条件を複数点変化させるように指示を行い，
   培養環境条件を複数点変化させた際の複数の測定点における前記細胞の測定値を前記測定系（７）から受け取り，
   培養環境条件を横軸とし，各測定点における前記測定値をプロットしてグラフ化し，
   グラフ化によって出現した前記培養環境条件の上限（ＣＵ）における測定値（ＣＵＶ）を頂点のひとつとする多角形における，ＣＬＶの対頂点である交点に相当する培養環境条件の値を求め，
   培養環境条件の下限（ＣＬ）との間の培養環境条件の値である規定値を求め，
   前記規定値から垂線を引いた際の前記多角形の２つの交点の縦軸の値の差を求め，
   前記培養環境条件は，前記培養環境の温度，酸性度，攪拌回転数（ＲＰＭ）,又は溶存酸素量（ＤＯ）であり，
   前記細胞の測定値は，前記細胞の直径，半径，面積，形状，アスペクト比，又は前記細胞からの光強度であり，
   前記２つの交点の縦軸の値の差を記憶するように機能させる，プログラム。
6. 請求項５に記載されたプログラムを格納したコンピュータが読み取ることができる情報記録媒体。

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