JP2019017385A - ヒトａｒｃａｐトランスジェニックマウス - Google Patents

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Abstract

【課題】腫瘍を発生する非ヒトトランスジェニック動物の提供。
【解決手段】肝臓特異的プロモーターに作動可能に連結されたヒトＡＲＣＡＰをコードする核酸をそのゲノム中に含む、非ヒトトランスジェニック動物。該トランスジェニック動物は、ヒトＡＲＣＡＰタンパク質を発現し、肝臓、脾臓、腹部、又はリンパの腫瘍を発生する。また、ヒトＡＲＣＡＰ遺伝子を発現する非ヒトトランスジェニック動物に由来する細胞株も提供される。さらに、肝臓特異的プロモーターに作動可能に連結されたヒトＡＲＣＡＰ ｃＤＮＡを含むベクターを受精したマウス卵母細胞にマイクロインジェクションし、マイクロインジェクションを行った該マウス卵母細胞を里親マウスに移植することによって、トランスジェニックマウスを産生する方法が提供される。
【選択図】なし

Description

ヒトアンドロゲン受容体複合体関連タンパク質（ＡＲＣＡＰ：human Androgen Receptor Complex Associated Protein）遺伝子は、ベイト（bait）としてアンドロゲン受容体リガンド結合ドメインを使用する酵母ツーハイブリッドアッセイにより最初に単離された。ヒトＡＲＣＡＰ ｍＲＮＡは、計算上９５Ｋｄの分子量を有する８６０個のアミノ酸をコードする、２５８３個のヌクレオチドのオープンリーディングフレームを有する。ＮＣＢＩアクセッション番号ＤＱ７６８０８９と並んで、特許文献１及び特許文献２を参照されたい。ヒトＡＲＣＡＰ遺伝子の分析によって、その遺伝子が染色体１ｑ２３．２−ｑ２４．３領域の１３５ｋｂのゲノムＤＮＡに亘って１９個のエクソンを含むことが明らかになった。
研究によって、ヒトＡＲＣＡＰ遺伝子は肝癌細胞株で発現するが、正常なヒト肝臓細胞では発現しないことを示された。特許文献１及び特許文献２を参照されたい。
ヘパトーマの発症におけるＡＲＣＡＰの役割は、今のところわかっていない。
米国特許第６９７４６８３号 米国特許第７０８３９３５号
ヘパトーマ形成は複雑なプロセスである。正常な肝臓組織の肝臓腫瘍への移行に結びつく形態学的病変及び分子病変を調査するために動物モデルを開発することが必要とされている。
上に述べられた要求を満たすため、本明細書では、肝臓特異的プロモーターに作動可能に連結されたヒトＡＲＣＡＰをコードする核酸をそのゲノム中に含む、非ヒトトランスジェニック動物が提供される。該トランスジェニック動物は、ヒトＡＲＣＡＰタンパク質を発現し、肝臓、脾臓、腹部、又はリンパの腫瘍を発生する。
また、ヒトＡＲＣＡＰ遺伝子を発現する非ヒトトランスジェニック動物に由来する細胞株が提供される。
さらに、トランスジェニックマウスを産生する方法を開示する。該方法は、（ｉ）受精したマウス卵母細胞に、肝臓特異的プロモーターに作動可能に連結されたヒトＡＲＣＡＰ ｃＤＮＡを含むベクターをマイクロインジェクションすることと、（ｉｉ）マイクロインジェクションを行ったマウス卵母細胞を里親マウスに移植して、ヒトＡＲＣＡＰを発現するトランスジェニックマウスを産生することとを含む。トランスジェニックマウスは、肝臓、脾臓、腹部、又はリンパの腫瘍を発生する。
１以上の実施形態の詳細は、下記の説明及び実施例に述べられる。他の特徴、目的、及び利点は、幾つか実施形態の詳細な説明、また特許請求の範囲から明らかとなる。本明細書において引用される出版物及び特許文献はいずれも、それらの全体において引用することにより本発明の一部をなす。
以下の記載は、添付の図面を参照する。
ヒト組織におけるヒトＡＲＣＡＰ ｍＲＮＡのノーザンブロット分析のオートラジオグラムを示す図である。 指定される細胞株におけるヒトＡＲＣＡＰ ｍＲＮＡのノーザンブロット分析のオートラジオグラムを示す図である。Ａ２、Ｇ２、２２Ｔ、Ｈｅｐ３Ｂ、Ｓｋ−Ｈｅｐ−１は、ヒト肝癌細胞株であり、ＰＣ−３はヒト前立腺癌細胞株であり、２９３Ｔは不死化ヒト胎児由来腎臓細胞株である。グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）発現を内部対照として測定した。 ヒト肝臓腫瘍組織（Ｔ）、及び隣接する正常組織（Ａ）に由来する一対の組織におけるヒトＡＲＣＡＰ ｍＲＮＡ及びトランスフェリン対照のノーザンブロット分析を示す図である。 ヒトＡＲＣＡＰトランスジェニック動物を作製するためのプラスミドコンストラクトの図である。コンストラクトは、ネズミアルブミンプロモーター及びヒトＡＲＣＡＰ ｃＤＮＡを含む。 ヒトＡＲＣＡＰトランスジェニック動物を作製するための代わりのプラスミドコンストラクトの図である。コンストラクトは、ネズミホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）プロモーター及びヒトＡＲＣＡＰ ｃＤＮＡを含む。 ヒトＡＲＣＡＰタンパク質（Ｈ；配列番号２）、及びネズミＡＲＣＡＰタンパク質（Ｍ；配列番号４）のアミノ酸配列間のアラインメントを示す。
上に言及されるように、ヒトＡＲＣＡＰを発現する非ヒトトランスジェニック動物を本明細書に開示する。非ヒトトランスジェニック動物は哺乳動物であってもよい。例えば、非ヒトトランスジェニック動物は、霊長類、有蹄類、イヌ、ネズミ、又はネコであってもよい。特定の実施形態では、非ヒトトランスジェニック動物はマウスである。
導入遺伝子は、肝臓特異的プロモーターに作動可能に連結された、ヒトＡＲＣＡＰをコードする核酸を含む。肝臓特異的プロモーターは、限定されないが、アルブミンプロモーター、又はホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）プロモーターであってもよい。
ヒトＡＲＣＡＰタンパク質をコードする核酸は、配列番号２のアミノ酸配列、又は配列番号２と７５％〜９５％（例えば７５％、８０％、８５％、９０％、９５％）同一のアミノ酸配列をコードし得る。
ネズミＡＲＣＡＰタンパク質（配列番号４）は、ヒトＡＲＣＡＰタンパク質と８３％アミノ酸同一性を共有する。図５を参照されたい。ネズミＡＲＣＡＰタンパク質をコードする核酸（例えば配列番号３を参照されたい）は、本出願の範囲に含まれない。
ヒトＡＲＣＡＰタンパク質をコードする核酸は、配列番号１の配列、又は配列番号１に対して７５％〜９９％同一の配列を含み得る。特定の実施形態では、ヒトＡＲＣＡＰをコードする核酸は、配列番号１の配列を含む。
上に記載されるトランスジェニック動物は、ヒトＡＲＣＡＰタンパク質を発現し、肝臓、脾臓、腹部、又はリンパの腫瘍を発生する。腫瘍は、およそ４ヶ月齢においてこれらの動物で病理学的に同定され得る。
ネズミＡＲＣＡＰタンパク質を発現するトランスジェニックマウスは、ヒトＡＲＣＡＰタンパク質を発現するものとは異なり、腫瘍を発生しない。
上に記載される非ヒトトランスジェニック動物に由来する細胞株は、任意の組織から単離され得る。或る特定の実施形態では、細胞株は、肝臓、脾臓、腹部、又はリンパの腫瘍に由来する。
さらに、上に述べられるトランスジェニックマウスを産生する方法は、肝臓特異的プロモーターに作動可能に連結されたヒトＡＲＣＡＰ ｃＤＮＡを含むベクターを受精したマウス卵母細胞にマイクロインジェクションする工程を含む。
ヒトＡＲＣＡＰ ｃＤＮＡは、配列番号２のアミノ酸配列、又は配列番号２に対して７５％〜９５％（例えば７５％、８０％、８５％、９０％、９５％）同一のアミノ酸配列をコードし得る。ここでも、ネズミＡＲＣＡＰタンパク質（配列番号４）をコードする核酸は、本出願の範囲に含まれない。
ヒトＡＲＣＡＰ ｃＤＮＡは、配列番号１の配列、又は配列番号１に対して７５％〜９９％同一の配列を含み得る。或る特定の実施形態では、ヒトＡＲＣＡＰ ｃＤＮＡは、配列番号１の配列を含む。
ヒトＡＲＣＡＰ ｃＤＮＡは、肝臓特異的プロモーター、例えばネズミアルブミンプロモーター、又はネズミＰＥＰＣＫプロモーターに作動可能に連結される。
ヒトＡＲＣＡＰを発現するトランスジェニックマウスを産生するため、マイクロインジェクションされたマウス卵母細胞を里親マウスに移植する。トランスジェニックマウスは、肝臓、脾臓、腹部、又はリンパの腫瘍を発生する。
ここでも、ネズミＡＲＣＡＰタンパク質を発現するトランスジェニックマウスは、腫瘍を発生しない。
更に工夫を凝らさなくても、当業者は、本明細書の開示に基づいて、最大範囲で本開示を利用することができると考えられる。したがって、以下の具体的な実施例は単なる説明に過ぎず、開示の残り部分の何らの制限とされることはないと解釈されるべきである。
実施例１：ヒトＡＲＣＡＰの発現
組織におけるヒトＡＲＣＡＰ ｍＲＮＡの発現を評価するためにノーザンブロット分析を行った。結果を図１Ａに示す。ヒトＡＲＣＡＰ ｍＲＮＡは、心臓及び骨格筋において弱く発現される。ヒトＡＲＣＡＰ ｍＲＮＡは、正常な肝臓組織を含む大半の正常なヒト組織では発現されない。
ヒトＡＲＣＡＰ ｍＲＮＡ発現を培養肝癌細胞株で検討した。図１Ｂに示される結果は、ヒト肝癌細胞株ではＡＲＣＡＰが高度に発現されるが、前立腺癌細胞又は腎臓細胞では発現されないことを示した。
また、ヒトＡＲＣＡＰ ｍＲＮＡの発現を、肝細胞癌を患う患者に由来する一対の組織試料において検討した。結果を図１Ｃに示す。ヒトＡＲＣＡＰは、隣接する正常な肝臓組織と比較して、試験した１５個の肝細胞癌組織試料のうち１３個の組織試料において有意に高いレベルで発現された。このデータは、ヒトＡＲＣＡＰが、腫瘍形成、特に肝臓における腫瘍形成において役割を果たすことを示唆する。
実施例２：ヒトＡＲＣＡＰの過剰発現は、正常な肝細胞の癌性表現型を誘導する
正常な肝臓細胞の永久的トランスフェクション
２．８ｋｂの全長ヒトＡＲＣＡＰ ｃＤＮＡをベクターｐＬＸＳＮへクローニングし、それを使用して正常なネズミ肝臓ＢＮＬ細胞をトランスフェクトした。簡潔には、ＢＮＬ細胞を１０％ＣＯ２中、３７℃で増殖させた。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００及び培地と混合されたプラスミドＤＮＡコンストラクトを、６０％〜７０％のコンフルエンスに達する際に細胞に添加した。２４時間後、培地を新鮮培地と交換した。安定な形質移入体を選択するため、ジェネテシン（Geneticin）（Ｇ４１８）を培地に添加した。ＢＮＬ細胞をｐＬＸＳＮ−ＡＲＣＡＰでトランスフェクトし、Ｇ４１８で選択することで、ヒトＡＲＣＡＰを過剰発現する永久的にトランスフェクトされた細胞（ＢＮＬ−ＡＲＣＡＰ）を樹立した。対照細胞を空のプラスミドｐＬＸＳＮでトランスフェクトし、選択に供してＢＮＬ−ｐＬＸＳＮ細胞を作出した。ＢＮＬ細胞におけるヒトＡＲＣＡＰの発現を、細胞遊走、細胞侵入、及び足場非依存性クローン増殖に対するその効果について評価した。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ創傷治癒アッセイ
組織培養表面上での細胞遊走速度を測定するため、ｉｎ ｖｉｔｒｏ創傷治癒アッセイを使用した。このアッセイは、ｉｎ ｖｉｖｏでの創傷治癒の間の細胞遊走を模倣するものである。このアッセイは、細胞遊走に対する細胞−マトリクス及び細胞−細胞の相互作用の効果に関する研究に特に適している。
ＢＮＬ細胞、ＢＮＬ−ｐＬＸＳＮ細胞、及びＢＮＬ−ＡＲＣＡＰ細胞を、各々、組織培養フラスコ中の単層としてコンフルエンスまで増殖させた。細胞を欠く領域を作るため、単層の表面を２００μｌのピペットチップで穏やかにゆっくりと引っ掻いた。細胞を欠く領域への細胞の増殖及び遊走を、顕微鏡下で、定期的に撮影された写真により観察した。画像分析ソフトウェア（Ｉｍａｇｅ Ｊ）を使用して、細胞を含まない領域のサイズを測定した。結果を下記表１に示す。
ヒトＡＲＣＡＰを過剰発現するＢＮＬ細胞は、トランスフェクトされていないＢＮＬ細胞又はＢＮＬ−ｐＬＸＳＮ細胞と比較して、より迅速且つ完全に細胞を欠く領域を埋めた。
細胞遊走アッセイ
ポリ−Ｌ−リジンで上部のトランスウェルを覆うことにより、トランスウェル組織培養チャンバーを用意した。ＢＮＬ細胞、ＢＮＬ−ｐＬＸＳＮ細胞、及びＢＮＬ−ＡＲＣＡＰ細胞を、１ウェル当たり１×１０５細胞の細胞密度で別々の上部トランスウェルに蒔いた。トランスウェルチャンバーを、１０％ＣＯ２中、３７℃でインキュベートした。
２４時間細胞を増殖させた後、培地を上部のトランスウェルから除去した。上部ウェルに残った細胞、及び底部ウェルに遊走したものを、室温で１０分間、４％パラホルムアルデヒドで固定した。固定した細胞をＰＢＳで３回濯いだ後、１００％メタノールと共に１０分間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、０．０５％クリスタルバイオレットを１０分間添加して細胞を染色した。上部及び下部のトランスウェル中の細胞数を顕微鏡によって観察し、計数した。下記表２に結果を示す。
ＢＮＬ−ＡＲＣＡＰ細胞は、ＢＮＬ細胞及びＢＮＬ−ｐＬＸＳＮ細胞と比較して、トランスウェルのいたるところで有意に多い細胞遊走を示した。
軟寒天コロニー形成アッセイ
軟寒天コロニー形成アッセイを使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの足場非依存性細胞増殖を定量する。細胞の足場非依存性増殖は、それらの細胞の腫瘍化の可能性と相関する。
組織培養プレートの個々のウェルを、標準的な手順に従ってベースアガー及びトップアガーにより用意した。各ウェルに、培地中１×１０４細胞（ＨｅｐＧ２、ＢＮＬ、ＢＮＬ−ｐＬＸＳＮ、及びＢＮＬ−ＡＲＣＡＰ）で蒔き、１０％ＣＯ２、３７℃のインキュベータに入れた。２１日間〜２８日間に亘り、３日に１回培地を交換した。各ウェル中の細胞コロニーを０．００５％クリスタルバイオレットで染色し、ＰＢＳで洗浄した。細胞コロニーを顕微鏡検査によって観察し、計数した。結果を下記表３に示す。
ＢＮＬ−ＡＲＣＡＰ細胞は、試験した細胞の中で最も高度な足場非依存性増殖を示した。アッセイで試験したＨｅｐＧ２ヒト肝癌細胞は、ＢＮＬ−ＡＲＣＡＰ細胞が形成したコロニー数のおよそ３分の２のコロニーを形成した。対照ＢＮＬ細胞及びＢＮＬ−ｐＬＸＳＮ細胞は、このアッセイにおいて多数のコロニーを形成しなかった。
実施例３：トランスジェニックコンストラクト
標準的な技術を使用して、２．８ｋｂの全長ヒトＡＲＣＡＰ ｃＤＮＡをマウスアルブミンプロモーターの下流の発現ベクターにサブクローニングした。図２Ａを参照されたい。得られた５．８ｋｂのアルブミンプロモーター／ＡＲＣＡＰコンストラクトを、マイクロインジェクションに先立ってＮｏｔ Ｉ及びＳａｐ Ｉで消化した。
また、ＡＲＣＡＰ ｃＤＮＡをマウスＰＥＰＣＫプロモーターの下流の発現ベクターにクローニングした。図２Ｂを参照されたい。得られた５．７ｋｂのＰＥＰＣＫプロモーター／ＡＲＣＡＰコンストラクトを、マイクロインジェクションに先立ってＡｓｃ Ｉで消化した。
実施例４：前核マイクロインジェクション
台湾動物センター（台湾、台北）において、受精したＣ５７／ＢＬ６Ｊの雌性胎仔（０．５ｄｐｃの胎仔）にＡＲＣＡＰを含むＤＮＡをマイクロインジェクションした。注入された接合子は、標準プロトコルに従って雌里親マウスに戻した。トランスジェニックマウスを、標準的な特定病原体除去条件下で作製し、収容した。台北栄民総医院の動物施設の研究所において、動物実験委員会によって設立された規則に従い、全ての動物研究を行った。
実施例５：ｈＡＲＣＡＰを発現するトランスジェニックマウスは腫瘍を発生する
アルブミンプロモーターからヒトＡＲＣＡＰを発現する２０匹のトランスジェニックマウス、及びアルブミンプロモーターからヒトＡＲＣＡＰを発現する２０匹のマウスを分析した。４０匹全てのマウスが、出生から３か月以内に腫瘍を発生した。
重要なことには、各々肝臓特異的プロモーターの制御下でネズミＡＲＣＡＰ遺伝子を過剰発現する１０匹のトランスジェニックマウスは、２年間もの間腫瘍を有しなかった。
正常な肝臓、異常な肝臓、肝臓腫瘍、腹部腫瘍、正常な血液、異常な血液、正常な脾臓、脾腫、及び脾臓腫瘍から抽出されたヒトＡＲＣＡＰトランスジェニックマウスＲＮＡ試料に対してＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。正常組織は、組織学的に正常のようであった。結果を下記表４に示す。異常な組織は病理学的変化を示したが、明らかな（frank）腫瘍を示さなかった。例えば、正常な肝臓は予想された肝組織像を示した。異常な肝臓は、異常な色、わずかな肥大、及び結節の出現を示した。腫瘍試料を組織像によって悪性と確認した。
データは、アルブミンプロモーター／ヒトＡＲＣＡＰトランスジェニックマウスにおける肝臓、脾臓、及び腹部の腫瘍でＡＲＣＡＰが高発現されることを明らかにした。サイトケラチン１９（ＣＫ１９；細胞増殖のマーカー）、チロシンアミノ基転移酵素（ＴＡＴ；肝炎と関連）、及びα−フェトプロテイン（ＡＦＰ；肝臓癌のマーカー）の高発現も観察された。上記表４を参照されたい。
また、ＰＥＰＣＫプロモーター／ＡＲＣＡＰトランスジェニックマウスでは、ＲＴ−ＰＣＲ分析は、脾臓腫瘍組織における高レベルのＡＲＣＡＰ発現を示した。同上を参照されたい。また、高レベルのＣＤＫ１９、ＴＡＴ及びＡＦＰが、特に腹部腫瘍において注目された。
さらに、ヒトＡＲＣＡＰトランスジェニックマウスはいずれも、Ｂ型肝炎ウイルス及びＣ型肝炎ウイルスの感染を有しなかった。
他の実施形態
本明細書に開示される特徴の全ては、任意の組み合せで合わせられ得る。本明細書で開示されるそれぞれの特徴は、同一の、等価の、又は類似する目的を果たす代替的な特徴で置換され得る。したがって、特に明記されない限り、開示されるそれぞれの特徴は、総括的な一連の等価又は同様の特徴の例に過ぎない。
上記の記載より、当業者は、本開示の本質的な特性を容易に確認することができ、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、様々な用途及び条件に本発明を適応させるため、本開示の様々な変更及び修飾を行うことができる。したがって、他の実施形態もまた特許請求の範囲に含まれる。

Claims (17)

  1. 非ヒトトランスジェニック動物であって、肝臓特異的プロモーターに作動可能に連結されたヒトアンドロゲン受容体複合体関連タンパク質（ＡＲＣＡＰ）をコードする核酸をそのゲノム中に含み、前記トランスジェニック動物が、ヒトＡＲＣＡＰタンパク質を発現し、肝臓、脾臓、腹部、又はリンパの腫瘍を発生する、非ヒトトランスジェニック動物。
  2. 哺乳動物である、請求項１に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
  3. 前記哺乳動物が霊長類、有蹄類、イヌ、ネズミ、又はネコである、請求項２に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
  4. 前記哺乳動物がマウスである、請求項３の非ヒトトランスジェニック動物。
  5. 前記肝臓特異的プロモーターが、アルブミンプロモーター、又はホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）プロモーターである、請求項１に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
  6. 前記肝臓特異的プロモーターが、ネズミアルブミンプロモーター、又はネズミホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）プロモーターである、請求項４に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
  7. 前記核酸が配列番号１の配列を含む、請求項４に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
  8. 前記核酸が配列番号１の配列を含む、請求項６に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
  9. 請求項１に記載の非ヒトトランスジェニック動物に由来する細胞株。
  10. 前記細胞株が、肝臓、脾臓、腹部、又はリンパの腫瘍に由来する、請求項９に記載の細胞株。
  11. 請求項４に記載の非ヒトトランスジェニック動物に由来する細胞株。
  12. 前記細胞株が、肝臓、脾臓、腹部、又はリンパの腫瘍に由来する細胞株である、請求項１１に記載の細胞株。
  13. 請求項６に記載の非ヒトトランスジェニック動物に由来する細胞株。
  14. 前記細胞株が、肝臓、脾臓、腹部、又はリンパの腫瘍に由来する、請求項１３に記載の細胞株。
  15. トランスジェニックマウスを産生する方法であって、
    受精したマウス卵母細胞に、肝臓特異的プロモーターに作動可能に連結されたヒトアンドロゲン受容体複合体関連タンパク質（ＡＲＣＡＰ）ｃＤＮＡを含むベクターをマイクロインジェクションすることと、
    マイクロインジェクションを行ったマウス卵母細胞を里親マウスに移植し、それによってヒトＡＲＣＡＰを発現するトランスジェニックマウスを産生することと、
    を含み、
    前記トランスジェニックマウスが肝臓、脾臓、腹部、又はリンパの腫瘍を発生する、方法。
  16. 前記肝臓特異的プロモーターが、ネズミアルブミンプロモーター、又はネズミホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）プロモーターである、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記ｃＤＮＡが配列番号１の配列を含む、請求項１６に記載の方法。
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