JP2019015702A - 分析装置及び焦点合わせ方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】合焦精度の高い検体中の有形成分の画像を得る。【解決手段】有形成分を含む液体の流路を有するフローセルと、流路を流れる液体を撮像する撮像部と、撮像部の光軸方向、及び、流路を液体が流れる方向について、撮像部に対するフローセルの相対位置を調整する調整部と、相対位置が異なる複数の位置において撮像部によって撮像された液体の画像中にある合焦状態の有形成分の数に基づいて、光軸方向及び液体が流れる方向の少なくとも一方におけるフローセルの撮像位置を決定する制御部と、を備える。【選択図】図８
Description
本発明は、分析装置及び焦点合わせ方法に関する。
採取した尿の検査において、検体をフローセルに流しつつ尿検体を撮像し、撮像された画像を解析することにより尿中の沈渣成分（血球、上皮細胞、円柱、細菌、結晶などの尿中の有形（固形）成分）の分析を行う方法が知られている（例えば、特許文献１参照）。
フローセルを流れる検体中の有形成分を撮像するに当たり、合焦法の一つであるコントラスト法に基づいてオートフォーカス制御を行うことが考えられる。しかし、コントラスト法では、コントラストが低く、且つ、撮像範囲に対して対象物が比較的小さい場合に合焦精度が低くなる問題があった。尿中の沈渣成分は尿液とのコントラストが低く、微小なサイズの物体であるので、コントラスト法を用いるのに適さない被写体である。
本発明の目的は、合焦精度の高い検体中の有形成分の画像を得ることを可能とする装置及び方法を提供することである。
本発明の態様の一つは、有形成分を含む液体の流路を有するフローセルと、前記流路を流れる前記液体を撮像する撮像部と、前記撮像部の光軸方向、及び、前記流路を前記液体が流れる方向について、前記撮像部に対する前記フローセルの相対位置を調整する調整部と、前記相対位置が異なる複数の位置において前記撮像部によって撮像された前記液体の画像中にある有形成分の合焦状態を判定し、合焦状態にあると判定された有形成分の数に基づいて、前記光軸方向及び前記液体が流れる方向の少なくとも一方における前記フローセルの撮像位置を決定する制御部と、を備える分析装置である。
また、分析装置は、前記撮像部の１回の露光時間内に複数回発光する撮像用光源を更に備えることができる。
また、前記制御部は、前記撮像部によって撮像した画像中の１つの有形成分及びその周辺の背景を含む画像である切り出し画像と、前記切り出し画像にブラー処理を施したブラー画像と、前記切り出し画像中の背景にマスク処理を施したマスク画像と、前記切り出し画像の画素値と前記ブラー画像の画素値との差分画像と、を生成し、前記差分画像を前記マスク画像でマスクした際にマスクされない範囲にある、閾値以上の画素値を有する画素数が、所定数以上の場合に前記切り出し画像中の有形成分が合焦状態であると判定することができる。
また、前記制御部は、前記撮像部によって撮像した画像中の１つの有形成分及びその周辺の背景を含む画像である切り出し画像と、前記切り出し画像にブラー処理を施したブラー画像と、前記切り出し画像中の背景にマスク処理を施したマスク画像と、前記切り出し画像の画素値と前記ブラー画像の画素値との差分画像と、を生成し、前記マスク画像でマ
スクされた前記差分画像のうちマスクされない範囲にある画素の画素値の標準偏差と、マスクされる範囲にある画素の画素値の標準偏差との差分が閾値以上の場合に前記切り出し画像中の有形成分が合焦状態であると判定することができる。
スクされた前記差分画像のうちマスクされない範囲にある画素の画素値の標準偏差と、マスクされる範囲にある画素の画素値の標準偏差との差分が閾値以上の場合に前記切り出し画像中の有形成分が合焦状態であると判定することができる。
また、本発明の態様は、上記した分析装置に対応する方法の発明を含む。
本発明によれば、合焦精度の高い検体中の有形成分の画像を得ることができる。
以下に図面を参照して、本発明を実施するための形態を説明する。ただし、この実施形態に記載されている構成部品の寸法、材質、形状、その相対配置などは、特に記載がない限りは、この発明の範囲をそれらのみに限定する趣旨のものではない。
（第１の実施形態）
図１は、第１の実施形態に係る撮像装置１の概略構成を示した図である。撮像装置１は、検体として例えば尿を撮像し、撮像された画像を解析することにより例えば尿中の有形成分の分析を行う分析装置に用いる。ただし、撮像装置１は、例えば細胞や体液などの尿以外の液体検体中の有形成分の分析に対して適用することも可能である。
図１は、第１の実施形態に係る撮像装置１の概略構成を示した図である。撮像装置１は、検体として例えば尿を撮像し、撮像された画像を解析することにより例えば尿中の有形成分の分析を行う分析装置に用いる。ただし、撮像装置１は、例えば細胞や体液などの尿以外の液体検体中の有形成分の分析に対して適用することも可能である。
撮像装置１は、検体を撮像するカメラ１１、撮像用の光源１２、及びフローセルユニット１３を備える。フローセルユニット１３は、検体が流通するフローセル１３Ａを固定配置するステージ１３Ｂを備える。フローセル１３Ａはステージ１３Ｂに対して脱着自在としてもよい。なお、図１に示す撮像装置１の長さ方向を直交座標系におけるＸ軸方向、幅方向をＹ軸方向、高さ方向をＺ軸方向とする。検体はフローセル１３Ａ内でＹ軸方向に流れる。後述するレンズ１１Ａの光軸１１Ｂは、Ｚ軸方向に配置されている。
フローセルユニット１３は、フローセル１３Ａと、フローセル１３Ａが固定配置されたステージ１３Ｂとをカメラ１１に対してＹ軸方向及びＺ軸方向に相対的に移動させるアクチュエータを含む焦点調整機構１３Ｃを備える。但し、アクチュエータを有せず、手動によりステージ１３Ｂを移動させる構成が採用されてもよい。また、焦点調整機構１３Ｃがステージ１３Ｂの代わりにカメラ１１を移動させる機構を備えてもよく、ステージ１３Ｂ及びカメラ１１の双方が移動する機構が採用されもよい。要するに、焦点調整機構１３Ｃは、カメラ１１とフローセル１３Ａとの少なくとも一方をＹ軸方向及びＺ軸方向に移動さ
せて、カメラ１１に対するフローセル１３Ａの相対位置を変更できる機構を備えていればよい。なお、カメラ１１は「撮像部」の一例である。また、焦点調整機構１３Ｃは「調整部」の一例である。
せて、カメラ１１に対するフローセル１３Ａの相対位置を変更できる機構を備えていればよい。なお、カメラ１１は「撮像部」の一例である。また、焦点調整機構１３Ｃは「調整部」の一例である。
図２は、第１の実施形態に係る撮像装置１のブロック図である。撮像装置１には、コントローラ１４が設けられている。コントローラ１４は、ＣＰＵ１４Ａ、ＲＯＭ１４Ｂ、ＲＡＭ１４Ｃ、ＥＥＰＲＯＭ１４Ｄ、およびインターフェイス回路１４Ｅを備えており、バス線１４Ｆにより相互に接続されている。
ＣＰＵ（central processing unit ）１４Ａは、ＲＯＭ（read only memory）１４Ｂに格納されてＲＡＭ（random access memory）１４Ｃに読み込まれたプログラムに基づいて動作し、撮像装置１の全体を制御する。ＲＯＭ１４Ｂには、ＣＰＵ１４Ａを動作させるためのプログラムやデータが格納されている。ＲＡＭ１４Ｃは、ＣＰＵ１４Ａにワーク領域を提供するとともに、各種のデータやプログラムを一時的に記憶する。ＥＥＰＲＯＭ１４Ｄは、各種の設定データなどを記憶する。インターフェイス回路１４Ｅは、ＣＰＵ１４Ａと各種回路との間の通信を制御する。
インターフェイス回路１４Ｅには、カメラ１１、光源１２、焦点調整機構１３Ｃ、及び、第一ポンプ１５Ａ及び第二ポンプ１５Ｂが接続されており、これらの機器が、コントローラ１４によって制御される。第一ポンプ１５Ａは、第一供給管１３２Ａを介してフローセル１３Ａにシース液を供給するポンプであり、第二ポンプ１５Ｂは、第二供給管１３３Ａを介してフローセル１３Ａに検体を供給するポンプである。シース液とは、フローセル１３Ａ中の検体の流れを制御する液体であり、例えば検体が尿である場合に生理食塩水が適用される。但し、生理食塩水以外の溶液をシース液として用いてもよい。
カメラ１１は、接眼レンズと対物レンズとを有するレンズ１１Ａを含む。但し、レンズ１１Ａが結像レンズをさらに有する場合もある。カメラ１１でフローセル１３Ａを流通する検体中の有形成分の静止画像を撮像する。光源１２の点灯時間は検体の流速に依存する。例えば０．５〜１０μｓｅｃでパルス点灯させている。光源１２の点滅タイミングは、検体の流速と光源１２の点灯時間との関係を考慮して決定する。光源１２をパルス点灯させることにより、１露光に対して、光源１２が複数回発光し、一画像に含まれる有形成分の数を多くしている。光源は、例えばキセノンランプまたは白色ＬＥＤを採用することができるが、これに限らず、他の光源を採用することも可能である。
また、カメラ１１の焦点を合わせるために、フローセル１３Ａに焦点調整テスト用の溶液（以下、テスト検体という）をシース液と共に流通させ、このテスト検体に含まれる有形成分に焦点が合うように焦点調整機構１３Ｃを調整する。そして、合焦点位置で焦点を固定し、その後に分析対象の検体をシース液と共にフローセル１３Ａに流通させて検体の撮像を実施する。
なお、撮像は、拡大撮像であり、光源１２の点灯時間とカメラ１１の撮像時間（露光時間）は、コントローラ１４により同期される。テスト検体を用いた焦点の調整は、所定時間毎に行ってもよく、検体を分析した回数に応じて行ってもよく、検体を分析する毎に行ってもよく、撮像装置１の起動毎に行ってもよい。また、焦点調整する頻度は、要求される焦点の精度によって変更してもよい。
テスト検体は液体と有形成分とを含み、液体として例えばＰＢＳ（リン酸緩衝液）を主成分とした液体が採用される。テスト検体の有形成分として、実際の検体の有形成分のサイズに近いサイズ（例えば直径１０μｍ程度）の物体を使用する。物体として、例えば人の赤血球や、ガラス又は樹脂製のビーズを適用できる。樹脂は例えば、ＰＣ（ポリカーボ
ネイド）、ＰＭＭＡ（アクリル樹脂）等である。但し、テスト検体としてテスト用に用意した実際の検体（尿）を適用する場合もあり得る。以下に説明する合焦点方法におけるフローセル１３Ａ内のテスト検体の挙動（流域制御）は、実際の検体を用いた場合でも生じる。
ネイド）、ＰＭＭＡ（アクリル樹脂）等である。但し、テスト検体としてテスト用に用意した実際の検体（尿）を適用する場合もあり得る。以下に説明する合焦点方法におけるフローセル１３Ａ内のテスト検体の挙動（流域制御）は、実際の検体を用いた場合でも生じる。
次に、コントローラ１４による合焦点方法について説明する。この合焦点方法では、Ｙ軸方向の合焦点位置を検出した後、Ｚ軸方向の合焦点位置を検出する。そこで、まずは、Ｙ軸方向において、有形成分が多く見つかる位置を合焦点位置として検出する。
図３は、フローセル１３Ａの概略構成を示した図である。フローセル１３Ａは、第一板１３０と第二板１３１とを接合することにより形成されている。フローセル１３Ａの材料には、ＰＭＭＡ（アクリル樹脂）、ＣＯＰ（シクロオレフィンポリマー）、ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）、ＰＰ（ポリプロピレン）、ガラスといった例えば９０％以上の可視光透過性がある材料を採用することができる。
第一板１３０には、シース液を供給するための第一供給口１３２、テスト検体を供給するための第二供給口１３３、シース液及びテスト検体を排出するための排出口１３４が設けられている。第一供給口１３２は第一板１３０の長手方向の一端側に設けられており、第二供給口１３３は第一板１３０の長手方向の他端側に設けられおり、排出口１３４は第一板１３０の長手方向の第一供給口１３２と第二供給口１３３との間に設けられている。
第一供給口１３２、第二供給口１３３、排出口１３４は、互いに通路１３５Ａ、１３５Ｂ、１３６、１３８によって連通されている。これら通路１３５Ａ、１３５Ｂ、１３６、１３８は、第一板１３０の接合面側の表面から断面が矩形となるように凹んで形成されている。また、これら通路１３５Ａ、１３５Ｂ、１３６、１３８の断面は、深さ方向（図１のＺ軸方向）よりも幅方向（図１のＸ軸方向）のほうが大きくなるように形成されている。
第一供給口１３２には、第一通路１３５Ａ及び第二通路１３５Ｂが接続されている。第一通路１３５Ａ及び第二通路１３５Ｂは、夫々逆回りに、第一板１３０の外縁に沿って第二供給口１３３側に向かい、合流部１３７において合流している。また、第二供給口１３３には、第三通路１３６が接続されており、第三通路１３６は、合流部１３７において、第一通路１３５Ａ及び第二通路１３５Ｂと合流している。合流部１３７は、第四通路１３８を介して排出口１３４に接続されている。第四通路１３８には、合流部１３７から排出口１３４に向かって第四通路１３８の深さ（第一板１３０の板厚方向の長さであり、Ｚ軸）が徐々に小さくなるテーパ形状に形成されたテーパ部１３８Ａが形成されている。
第一供給口１３２には、図１に示した第一供給管１３２Ａが接続され、第二供給口１３３には、図１に示した第二供給管１３３Ａが接続され、排出口１３４には、図１に示した排出管１３４Ａが接続されている。第一供給管１３２Ａから第一供給口１３２に供給されたシース液は、第一通路１３５Ａ及び第二通路１３５Ｂを流通する。第二供給管１３３Ａから第二供給口１３３に供給されたテスト検体は第三通路１３６を流通する。そして、シース液及びテスト検体が合流部１３７において合流して第四通路１３８を流通し、排出口１３４から排出管１３４Ａに排出される。図４は、合流部１３７付近の概略構成を示した図である。合流部１３７においては、第三通路１３６が第二板１３１側に偏って配置されており、テスト検体は、合流部１３７において、第二板１３１に沿って流れる。
図５は、第四通路１３８を流通するシース液とテスト検体の分布を示した図である。図５における上側からシース液とテスト検体とが別々に供給された後、合流部１３７で合流している。合流部１３７においてシース液とテスト検体とが合流した直後では、シース液
内のテスト検体は、第二板１３１の壁面側の比較的狭い範囲に集中している（図５のＡ−Ａ断面参照）。その後、テスト検体がテーパ部１３８Ａを流通すると、テスト検体がシース液に押されて第二板１３１の壁面近くで壁面に沿って扁平状に広がる（図５のＢ−Ｂ断面参照）。さらにテスト検体が流れると、Tubular-pinch効果によりテスト検体が第二板
１３１の壁面から離れて、第四通路１３８の中央方向へ持ち上げられる（図５のＣ−Ｃ断面参照）。
内のテスト検体は、第二板１３１の壁面側の比較的狭い範囲に集中している（図５のＡ−Ａ断面参照）。その後、テスト検体がテーパ部１３８Ａを流通すると、テスト検体がシース液に押されて第二板１３１の壁面近くで壁面に沿って扁平状に広がる（図５のＢ−Ｂ断面参照）。さらにテスト検体が流れると、Tubular-pinch効果によりテスト検体が第二板
１３１の壁面から離れて、第四通路１３８の中央方向へ持ち上げられる（図５のＣ−Ｃ断面参照）。
環境が変化した場合や各部材の固定状態が変化した場合、各部材のバランスがくずれた場合等には、フローセル１３Ａにおいてテスト検体の分布が変化したり、テスト検体の流れの均一性が低下したりする場合がある。有形成分の分布はテスト検体の分布の影響を受ける。撮像時には、より多くの有形成分を撮像可能な個所において撮像を行うことにより、有形成分の分析精度を高めることができる。フローセル１３Ａ中では、図５の断面図に示されるように、Ｙ軸方向の位置によってテスト検体の流れが変化する。図５のＣ−Ｃ断面の位置では、Ｂ−Ｂ断面の位置よりも、Ｚ軸方向における検体の幅が大きくなる。図５のＣ−Ｃ断面の位置では、テスト検体中の有形成分がＺ軸方向に広がって分布するため、有形成分の撮影には不向きである。一方、図５のＢ−Ｂ断面の位置では、上方からシース液がテスト検体を第二板１３１に押しつけるように流れ、テスト検体がシース液で押しつぶされて薄く広がる。そのため、図５のＢ−Ｂ断面の位置では、テスト検体中の有形成分がＺ軸方向に広がらずに存在しており、焦点を合わせやすい。Ｙ軸方向にフローセル１３Ａを動かすことにより、Ｂ-Ｂ断面の位置にカメラ１１の撮像位置を合わせることができ
る。
る。
Ｙ軸方向にフローセル１３Ａを複数回移動させ、各位置でカメラ１１による撮像を行い、撮像した画像を解析して焦点の合った有形成分の個数を各位置で求める。そして、焦点の合った有効成分の個数が最も多い画像が撮像された位置をＹ軸方向の合焦点位置として検出する。
具体的には、焦点調整機構１３Ｃは、フローセル１３Ａを固定配置するステージ１３Ｂを有し、このステージ１３ＢをＹ軸方向に所定のピッチで移動させ、移動毎に撮像を行う動作を繰り返す。ピッチは例えば５μｍであり、移動距離は移動開始位置から例えば±２０μｍ移動する。そして、各位置で焦点が合った有形成分の数（以下、合焦点数ともいう。）を算出し、合焦点数が最大となる位置をＹ軸方向の合焦点位置とする。
次に、Ｚ軸方向において、有形成分が多く見つかる位置を合焦点位置として検出する。Ｚ軸方向は、カメラ１１に含まれる対物レンズの光軸１１Ｂ方向である。カメラ１１に対してフローセル１３ＡをＺ軸方向に相対移動させることにより、対物レンズの焦点位置を光軸１１Ｂ方向にずらして、被写界深度の範囲で有形成分が多く見つかる位置を検出する。対物レンズの被写界深度の範囲に、より多くの有形成分が存在すれば、有形成分の分析精度が高まる。
具体的には、ステージ１３ＢをＹ軸方向の合焦点位置からＺ軸方向に所定のピッチで移動させ、移動毎に撮像を行う。この際のピッチも例えば５μｍであり、移動範囲も移動開始位置（Ｙ軸方向の合焦点位置）から例えば±２０μｍである。そして、各位置での合焦点数を算出し、合焦点数が最大となる位置をＺ軸方向の合焦点位置とする。Ｙ軸及びＺ軸方向の両軸について定めた合焦点位置が検体の撮像位置として固定される。なお、上記説明では、Ｙ軸方向の合焦点位置を先に求め、次いでＺ軸方向の合焦点位置を求めているが、これに代えて、Ｚ軸方向の合焦点位置を先に求め、次いでＹ軸方向の合焦点位置を求めてもよい。
フローセルユニット１３を移動するときのピッチは、例えば５μｍであるが、このピッ
チは、その方向における合焦点位置を所望の精度で求めるために必要となるピッチとして予め設定されている。また、移動する範囲は、例えば±２０μｍであるが、この移動範囲は、その方向における合焦点位置を所望の精度で求めるために必要となる移動範囲として予め設定されている。
チは、その方向における合焦点位置を所望の精度で求めるために必要となるピッチとして予め設定されている。また、移動する範囲は、例えば±２０μｍであるが、この移動範囲は、その方向における合焦点位置を所望の精度で求めるために必要となる移動範囲として予め設定されている。
なお、ピッチを狭くする、または、移動範囲を大きくすることにより合焦点位置の検出精度を高めることができるが、より多くの撮像及び計算が必要となるため、時間がかかる虞がある。一方、ピッチを広くする、または、移動範囲を小さくすることにより撮像及び計算に要する時間を短縮することができるが、合焦点位置の検出精度が低下する虞がある。そのため、撮像及び計算に要する時間と、要求される検出精度と、のどちらをどれだけ優先するのかによって、移動の際のピッチ及び移動範囲を決定してもよい。また、Ｙ軸方向のピッチは、実験またはシミュレーション等により求めてもよい。Ｚ軸方向のピッチは、被写界深度に応じて設定してもよい。
次に、上述した合焦点位置の決定に用いる画像処理及び画像分析の方法について説明する。画像処理及び分析のために、ＣＰＵ１４Ａは、プログラムの実行によって、次の５ステップを実行する。
１．撮像：Ｙ軸方向またはＺ軸方向に所定のピッチで移動した各位置において、カメラ１１を用い、所定数（例えば１００−５００枚）の画像を撮像する。なお、夫々の位置における撮像数は同じにする。各撮像画像のデータは、例えばＲＡＭ１４Ｃに記憶される。
２．背景画像の作成：ＣＰＵ１４Ａは、記憶された撮像画像のデータを用いて、撮像画像ごとに、各画素の画素値を平均化したものを背景画像として作成する。画素値は各画素の輝度でも良くＲＧＢ値でもよい。
３．切り出し処理：ＣＰＵ１４Ａは、背景画像と撮像した画像とを比較し、差異があり且つサイズが例えば１０μｍ程度の画像を切り出して、ＲＡＭ１４Ｃに保存する。なお、上記説明では、例えば１０μｍ程度の画像を切り出しているが、これは、テスト検体に含まれる有形成分の大きさが例えば１０μｍ程度であるからであり、したがって有形成分の大きさに応じて切り出す画像のサイズを設定すればよい。
４．合焦点判定処理：ＣＰＵ１４Ａは、ＲＡＭ１４Ｃに保存されている切り出された画像を、焦点の合った画像である合焦点画像と、焦点が合っていない画像である非合焦点画像とに分類する。
５．合焦点位置検出：ＣＰＵ１４Ａは、各位置において合焦点画像の数をカウントして合焦点数を求め、各軸の他の位置と合焦点数を比較し、合焦点数が最大となる位置を、その軸の合焦点位置とする。
上記合焦点判定処理の詳細を説明する。図６は、合焦点判定処理を説明するための図である。合焦点判定処理は、ＣＰＵ１４Ａによって行われる。切り出し画像３１は、切り出し処理によって切り出された画像である。切り出し画像３１は、撮像した画像に含まれる有形成分の１つを四角で囲ってその内部を切り出した画像に相当する。
次に、切り出し画像３１から、マスク画像３２を作成する。マスク画像３２の作成には、例えば判別分析法、Ｃａｎｎｙフィルタ等の任意の方法を用いることができる。マスク画像３２は、切り出し画像３１中の背景（有形成分以外の領域）をマスクした画像に相当する。一方、切り出し画像３１に対するブラー（Ｂｌｕｒ）画像３３を作成する。ブラー画像３３の作成には、例えばガウスフィルタ等の任意の方法を用いることができる。この
ブラー画像３３は、被写体のエッジ部がぼけた画像であり、有形成分と背景との境界をぼかした画像に相当する。
ブラー画像３３は、被写体のエッジ部がぼけた画像であり、有形成分と背景との境界をぼかした画像に相当する。
次に、ブラー画像３３と、切り出し画像３１との差分画像３４を作成する。差分画像３４は、ブラー画像３３と切り出し画像３１とで対応する画素の画素値の差分を求めることにより得られる画像である。ここで、焦点が合っている画像の場合には、この画素値の差分が比較的大きな画素が多くなる。すなわち、焦点が合っていない画像であれば、有形成分と背景との境界がもともとぼけているため、切り出し画像３１とブラー画像３３との画素値の差が小さい。
次に、差分画像３４をマスク画像３２でマスクした際にマスクされない範囲（図６の点線内の範囲）にある、画素値が閾値以上の画素をカウントする。この閾値は、焦点が合っている画素値の下限値であり、予め定めておく。このようにしてカウントされた画素数が閾値以上であれば、合焦点画像と判定する。ここでいう閾値は、合焦点であるとする画素数の下限値である。
Ｙ軸方向及びＺ軸方向に所定ピッチで移動した各位置において、撮像した全ての画像について合焦点画像の個数、すなわち、合焦点数をカウントし、他の位置の合焦点数と比較する。図７は、焦点位置と合焦点数との関係を示した図である。例えば、このようなヒストグラムを作成し、合焦点数の最も多い焦点位置を合焦点位置として検出する。なお、図７は上記の移動範囲の説明（±２０μｍ）と異なり、−２５μｍ移動させた場合の合焦店数の測定結果も含まれている。
図７に示したようなヒストグラムにおいて、合焦点数の最大値が移動範囲の両端（すなわち、図７中の−２５μｍ及び２０μｍ）になければ、合焦点数が最大値の焦点位置が合焦点位置であると考えられるが、合焦点数の最大値が、移動範囲の両端（すなわち、図７中の−２５μｍ及び２０μｍ）にある場合には、この移動範囲よりも外側に、合焦点数が最大値となる焦点位置が存在する可能性もある。その場合には、移動範囲値をさらに広げて合焦点数が最大値となる焦点位置を検出してもよい。
また、合焦点数が最大値となる位置を合焦点位置としているが、移動するピッチによっては、移動中に通り過ぎる位置において合焦点数が最大値となる位置が存在する場合もある。したがって、図７に示したヒストグラムから、焦点位置と合焦点数との関係式を求めて、この式を用いて、合焦点数が最大となる位置を求めてもよい。
図８は、合焦点位置を求めるフローを示したフローチャートである。本フローチャートは、合焦点位置を求める必要が生じたときにコントローラ１４のＣＰＵ１４Ａがプログラムを実行することによって行われる。第１の実施形態ではコントローラ１４が合焦点位置を検出する制御部として動作する。
ステップＳ１０１では、ＣＰＵ１４Ａは、焦点調整機構１３Ｃを制御し、フローセルユニット１３のステージ１３Ｂに固定配置されたフローセル１３Ａを初期位置に移動させる。初期位置は、合焦点位置となり得る範囲において、予め実験等またはシミュレーション等により最適位置を求めておく。また、前回に求めた合焦点位置を、今回の初期位置として設定してもよい。ステップＳ１０１の処理が終了するとステップＳ１０２へ進む。
ステップＳ１０２では、ＣＰＵ１４Ａは、Ｙ軸方向の各位置での撮像画像（ＲＡＭ１４Ｃに保存）を用いて、ＣＰＵ１４Ａが合焦点数算出処理を実行し、合焦点数を算出する。これについては、後述する。そして、ステップＳ１０２の処理が終了するとステップＳ１０３へ進んで、ＣＰＵ１４Ａは、合焦点数をＹ軸方向の位置と関連付けてＲＡＭ１４Ｃに
保存する。ステップＳ１０３の処理が終了すると、ステップＳ１０４へ進む。
保存する。ステップＳ１０３の処理が終了すると、ステップＳ１０４へ進む。
ステップＳ１０４では、ＣＰＵ１４Ａは、Ｙ軸方向について合焦点数を算出した位置（回数）が所定数（例えば、９〜１０）に達したか否か判定する。所定数は、上記ピッチと移動範囲によって決まる。ステップＳ１０４で肯定判定がなされると、ステップＳ１０５へ進み、一方、否定判定がなされると、ステップＳ１０６へ進む。
ステップＳ１０６では、ＣＰＵ１４Ａは、焦点調整機構１３Ｃを制御し、フローセル１３ＡのＹ軸方向の位置を所定ピッチ（例えば５μｍ）で移動させる。ステップＳ１０６の処理が終了すると、ステップＳ１０２へ戻る。すなわち、Ｙ軸方向について合焦点数を算出した位置が所定数に達するまで、焦点調整機構１３Ｃによりフローセル１３ＡのＹ軸方向の位置が移動され、各位置において、合焦点数算出処理が実施される。
一方、ステップＳ１０５では、ＣＰＵ１４Ａは、Ｙ軸方向の合焦点位置の判定を行う。すなわち、ＲＡＭ１４Ｃに保存された各位置での撮像画像を用いてＣＰＵ１４Ａが上述した画像処理及び画像分析を行い、各位置における合焦点数のうち、最も数の多い位置をＹ軸方向の合焦点位置であると判定する。ステップＳ１０５の処理が終了すると、ステップＳ１０７へ進む。
ステップＳ１０７では、ＣＰＵ１４Ａは、焦点調整機構１３Ｃを制御し、フローセル１３ＡをＹ軸方向の合焦点位置に移動させる。ステップＳ１０７の処理が終了すると、ステップＳ１０８へ進んで、ＣＰＵ１４Ａは、焦点調整機構１３Ｃを制御してフローセル１３ＡをＺ軸方向に所定のピッチ（例えば５μｍ）で移動させる。ステップＳ１０８の処理が終了すると、ステップＳ１０９へ進む。
ステップＳ１０９では、ＣＰＵ１４Ａは、Ｚ軸方向の各位置での撮像画像（ＲＡＭ１４Ｃに保存）を用いて、ＣＰＵ１４Ａが合焦点数算出処理を実行し、合焦点数を算出する。合焦点数算出処理の方法自体はＹ軸方向において撮像された画像に対する処理と同じである。ステップＳ１０９の処理が終了するとステップＳ１１０へ進んで、ＣＰＵ１４Ａは、合焦点数をＺ軸方向の位置と関連付けてＲＡＭ１４Ｃに保存する。ステップＳ１１０の処理が終了すると、ステップＳ１１１へ進む。
ステップＳ１１１では、ＣＰＵ１４Ａは、Ｚ軸方向について合焦点数を算出した位置（回数）が所定数（例えば、９〜１０）に達したか否か判定する。所定数は、上記ピッチと移動範囲によって決まる。ステップＳ１１１で肯定判定がなされると、ステップＳ１１２へ進み、一方、否定判定がなされると、ステップＳ１０８へ進む。すなわち、Ｚ軸方向について合焦点数を算出した位置が所定数に達するまで、焦点調整機構１３Ｃによりフローセルユニット１３のＺ軸方向の位置が移動され、各位置において、合焦点数算出処理が実施される。
ステップＳ１１２では、ＣＰＵ１４Ａは、Ｚ軸方向の合焦点位置の判定を行う。すなわち、ＲＡＭ１４Ｃに保存された各位置における合焦点数のうち、最も数の多い位置を、Ｚ軸方向の合焦点位置であると判定する。ステップＳ１１２の処理が終了すると、本フローチャートを終了させる。このようにして求まるＺ軸方向の合焦点位置はＹ軸方向の合焦点位置でもあるため、両軸において焦点の合う最終的な合焦点位置となる。
次に、ステップＳ１０２及びステップＳ１０９における合焦点数算出処理について説明する。図９は、合焦点数算出処理のフローを示したフローチャートである。本フローチャートは、図８に示したフローチャートのステップＳ１０２及びステップＳ１０９において、コントローラ１４のＣＰＵ１４Ａがプログラムを実行することによって行われる。
ステップＳ２０１では、ＣＰＵ１４Ａは、撮像画像ループを実行する。撮像画像ループは、撮像画像数が規定数（例えば１００〜５００枚）に達するまで反復する。ステップＳ２０２では、切り出し処理が実施される。
ステップＳ２０３では、ＣＰＵ１４Ａは、検体ループを実行する。検体ループは、有形成分の切り出し個数が規定数に達するまで反復する。ここでいう規定数は、合焦点位置を所望の精度で求めるために必要となる切り出し個数として予め設定されており、例えば、２０００〜３０００個であるが、撮像した画像に含まれる全ての有形成分に相当する数であってもよい。
ステップＳ２０４では、ＣＰＵ１４Ａは、対象の切り出し画像が合焦点画像であるか否か判定する。すなわち、合焦点判定処理を行う。これについては、後述する。ステップＳ２０４で肯定判定がなされた場合には、ステップＳ２０５へ進んで、ＣＰＵ１４Ａは合焦点数をカウントアップし、その後、検体ループを反復する。一方、ステップＳ２０４で否定判定がなされた場合には、そのまま検体ループを反復する。
このようにしてＣＰＵ１４Ａは、各焦点位置において、撮像枚数に達するまで撮像した各画像の合焦点数をカウントする。
次に、合焦点判定処理について説明する。図１０は、第１の実施形態に係る合焦点判定処理のフローを示したフローチャートである。本フローチャートは、図９に示したフローチャートのステップＳ２０４において、コントローラ１４のＣＰＵ１４Ａがプログラムを実行することによって行われる。
ＣＰＵ１４Ａは、ステップＳ３０１においてマスク画像３２を作成し、ステップＳ３０２においてブラー画像３３を作成し、ステップＳ３０３において差分画像３４を作成する。そして、ＣＰＵ１４Ａは、ステップＳ３０４において、差分画像３４をマスク画像３２でマスクした際にマスクされない範囲（図６の点線内の範囲）にある、画素値が閾値以上の画素数Ｐ１を算出する。
次に、ステップＳ３０５では、ＣＰＵ１４Ａは、ステップＳ３０４で算出した画素数Ｐ１が閾値以上であるか否か判定する。ＣＰＵ１４Ａは、ステップＳ３０５で肯定判定がなされた場合には、ステップＳ３０６へ進んで、合焦点画像（合焦状態である）と判定し、一方、否定判定がなされた場合には、ステップＳ３０７へ進んで、非合焦点画像（合焦状態でない）と判定する。
以上説明したように、第１の実施形態によれば、コントラストが低く、且つ、撮像範囲に対して対象物が比較的小さい画像の合焦点精度を高めることができる。すなわち、コントラスト法では好適な合焦精度が得られない尿検体について、好適な合焦精度を有する撮像画像を得ることができる。
（第２の実施形態）
第２の実施形態では、合焦点判定処理が第１の実施形態と異なる。その他の装置や制御等は第１の実施形態と同じため説明を省略する。ここで、第１の実施形態に示した合焦点判定処理は、処理が簡素であり計算速度は速くなるが、信号対ノイズ比が低い画像に対してのロバスト性が低い。そのため、第２の実施形態では、マスク画像の内外を比較することによりロバスト性を向上する。
第２の実施形態では、合焦点判定処理が第１の実施形態と異なる。その他の装置や制御等は第１の実施形態と同じため説明を省略する。ここで、第１の実施形態に示した合焦点判定処理は、処理が簡素であり計算速度は速くなるが、信号対ノイズ比が低い画像に対してのロバスト性が低い。そのため、第２の実施形態では、マスク画像の内外を比較することによりロバスト性を向上する。
図１１は、合焦点判定処理を説明するための図である。マスク画像３２の作成、ブラー
画像３３の作成、差分画像３４の作成については、第１の実施形態と同じである。なお、以下では、図１１のマスク画像３２におけるマスクされている範囲（黒く塗られた範囲）に対応する範囲を「マスク画像外」といい、図１１のマスク画像３２におけるマスクされていない範囲（白く塗られた範囲）に対応する範囲を「マスク画像内」という。
画像３３の作成、差分画像３４の作成については、第１の実施形態と同じである。なお、以下では、図１１のマスク画像３２におけるマスクされている範囲（黒く塗られた範囲）に対応する範囲を「マスク画像外」といい、図１１のマスク画像３２におけるマスクされていない範囲（白く塗られた範囲）に対応する範囲を「マスク画像内」という。
合焦点状態では、マスク画像内で、切り出し画像３１とマスク画像３２との画素値の差が大きい箇所が存在するので、マスク画像内の差分画像３４（図１１の点線内の範囲）の画素値の標準偏差が大きくなる。一方、マスク画像外の差分画像３４（図１１の点線外の範囲）の画素値の標準偏差は小さい。そのため、マスク画像内の差分画像３４の画素値の標準偏差と、マスク画像外の差分画像３４の画素値の標準偏差と、の差は、焦点が合っていれば、大きくなる傾向にある。
したがって、マスク画像内の差分画像３４の画素値の標準偏差と、マスク画像外の差分画像３４の画素値の標準偏差と、の差を算出し、この差が閾値以上であれば、合焦点画像と判定することができる。この閾値は、焦点が合っている上記標準偏差の差の下限値であり、予め定めておく。このように、マスク画像外のデータも使用することにより、合焦点精度をさらに向上させる。
図１２は、第２の実施形態に係る合焦点判定処理のフローを示したフローチャートである。本フローチャートは、図９に示したフローチャートのステップＳ２０４において、コントローラ１４のＣＰＵ１４Ａがプログラムを実行することによって行われる。なお、図１０と同じ処理がなされるステップについては、同じ符号を付して説明を省略する。
図１２に示すフローチャートでは、ステップＳ３０３の処理が終了するとステップＳ４０１へ進み、ＣＰＵ１４Ａは、マスク画像内の差分画像３４の画素値の標準偏差Ｓ１を算出する。ステップＳ４０１の処理が終了するとステップＳ４０２へ進み、ＣＰＵ１４Ａは、マスク画像外の差分画像３４の画素値の標準偏差Ｓ２を算出する。
ステップＳ４０２の処理が終了するとステップＳ４０３へ進み、ＣＰＵ１４Ａは、マスク画像内の差分画像３４の画素値の標準偏差Ｓ１と、マスク画像外の差分画像３４の画素値の標準偏差Ｓ２との差が、閾値以上であるか否か判定する。ここでいう閾値は、マスク画像内の差分画像３４の画素値の標準偏差Ｓ１と、マスク画像外の差分画像３４の画素値の標準偏差Ｓ２との差が合焦点であることを示す値の下限値である。この閾値は、実験またはシミュレーション等により求めておく。
ＣＰＵ１４Ａは、ステップＳ４０３で肯定判定がなされた場合にはステップＳ３０６へ進んで、合焦点画像と判定し、一方、否定判定がなされた場合にはステップＳ３０７へ進んで、非合焦点画像と判定する。
このように、マスク画像外のデータを用いた判定を行うことにより、信号対ノイズ比が低い画像に対してのロバスト性を高めることができる。したがって、合焦点精度を高めることができる。
上記実施形態では、フローセル１３Ａでの液体が流れる方向及び光軸１１Ｂ方向の２方向について、撮像位置を調整したが、どちらか一方向だけについて撮像位置を調整してもよい。なお、上記実施形態では、フローセル１３Ａのテーパ部１３８Ａ通過後のテスト検体は、フローセル１３Ａの壁面に接触している態様を一例として説明したが、フローセルの構造及びテスト検体の流れについてはこの態様だけに限定されない。例えば、フローセル１３Ａのテーパ部１３８Ａ通過後に、テスト検体の周りをシース液が取り囲み、シース液の中心部でテスト検体が薄く引き伸ばされる構造のフローセルを用いてもよい。この場
合には、カメラとテスト検体の間にシース液が介在するが、その場合であっても焦点を精度よく合わせることができる。
合には、カメラとテスト検体の間にシース液が介在するが、その場合であっても焦点を精度よく合わせることができる。
１ 撮像装置
１１ カメラ
１１Ａ レンズ
１２ 光源
１３ フローセルユニット
１３Ａ フローセル
１３Ｂ ステージ
１３Ｃ 焦点調整機構
１４ コントローラ
１１ カメラ
１１Ａ レンズ
１２ 光源
１３ フローセルユニット
１３Ａ フローセル
１３Ｂ ステージ
１３Ｃ 焦点調整機構
１４ コントローラ
Claims (7)
- 有形成分を含む液体の流路を有するフローセルと、
前記流路を流れる前記液体を撮像する撮像部と、
前記撮像部の光軸方向、及び、前記流路を前記液体が流れる方向について、前記撮像部に対する前記フローセルの相対位置を調整する調整部と、
前記相対位置が異なる複数の位置において前記撮像部によって撮像された前記液体の画像中にある有形成分の合焦状態を判定し、合焦状態にあると判定された有形成分の数に基づいて、前記光軸方向及び前記液体が流れる方向の少なくとも一方における前記フローセルの撮像位置を決定する制御部と、
を備える分析装置。 - 前記撮像部の１回の露光時間内に複数回発光する撮像用光源を更に備える
請求項１に記載の分析装置。 - 前記制御部は、前記撮像部によって撮像した画像中の１つの有形成分及びその周辺の背景を含む画像である切り出し画像と、前記切り出し画像にブラー処理を施したブラー画像と、前記切り出し画像中の背景にマスク処理を施したマスク画像と、前記切り出し画像の画素値と前記ブラー画像の画素値との差分画像と、を生成し、前記差分画像を前記マスク画像でマスクした際にマスクされない範囲にある、閾値以上の画素値を有する画素数が、所定数以上の場合に前記切り出し画像中の有形成分が合焦状態であると判定する
請求項１または２に記載の分析装置。 - 前記制御部は、前記撮像部によって撮像した画像中の１つの有形成分及びその周辺の背景を含む画像である切り出し画像と、前記切り出し画像にブラー処理を施したブラー画像と、前記切り出し画像中の背景にマスク処理を施したマスク画像と、前記切り出し画像の画素値と前記ブラー画像の画素値との差分画像と、を生成し、前記マスク画像でマスクされた前記差分画像のうちマスクされない範囲にある画素の画素値の標準偏差と、マスクされる範囲にある画素の画素値の標準偏差との差分が閾値以上の場合に前記切り出し画像中の有形成分が合焦状態であると判定する
請求項１または２に記載の分析装置。 - フローセルの流路を流れる液体を撮像部の光軸方向の複数の位置において撮像する工程と、
前記光軸方向の複数の位置において撮像された画像中にある有形成分の合焦状態を判定する工程と、
前記光軸方向の複数の位置において合焦状態にあると判定された有形成分の数に基づいて前記光軸方向の合焦点位置を検出する工程と、
前記流路を前記液体が流れる方向の複数の位置において撮像する工程と、
前記液体が流れる方向の複数の位置において撮像された画像中にある有形成分の合焦状態を判定する工程と、
前記液体が流れる方向の複数の位置において合焦状態にあると判定された有形成分の数に基づいて前記液体が流れる方向の合焦点位置を検出する工程と、
を含む焦点合わせ方法。 - 撮像した画像から１つの有形成分及びその周辺の背景を含む画像である切り出し画像を生成する工程と、
前記切り出し画像にブラー処理を施したブラー画像を生成する工程と、
前記切り出し画像中の背景にマスク処理を施したマスク画像を生成する工程と、
前記切り出し画像の画素値と前記ブラー画像の画素値との差分画像を生成する工程と、
前記差分画像を前記マスク画像でマスクした際にマスクされない範囲にある、閾値以上の画素値を有する画素数が、所定数以上の場合に前記切り出し画像中の有形成分が合焦状態であると判定する工程と、
を含む請求項５に記載の焦点合わせ方法。 - 撮像した画像から１つの有形成分及びその周辺の背景を含む画像である切り出し画像を生成する工程と、
前記切り出し画像にブラー処理を施したブラー画像を生成する工程と、
前記切り出し画像中の背景にマスク処理を施したマスク画像を生成する工程と、
前記切り出し画像の画素値と前記ブラー画像の画素値との差分画像を生成する工程と、
前記マスク画像でマスクされた前記差分画像のうちマスクされない範囲にある画素の画素値の標準偏差と、マスクされる範囲にある画素の画素値の標準偏差との差分が閾値以上の場合に前記切り出し画像中の有形成分が合焦状態であると判定する工程と、
を含む請求項５に記載の焦点合わせ方法。
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