多数の実施形態が、本明細書全体を通じて詳述され、当該技術分野に精通した読者にとって明白になるであろう。本発明は、その任意の特定の実施形態に限定されるものとして解釈されるべきでない。
(2S)−2−エトキシ−N−[5−[[(3R)−1−ピリダジン−3−イルピロリジン−3−イル]アミノ]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]−2−[3−(トリフルオロメトキシ)フェニル]アセトアミド;
(2R)−2−[4−フルオロ−3−(トリフルオロメトキシ)フェニル]−2−メトキシ−N−[5−[[(3R)−1−ピリダジン−3−イルピロリジン−3−イル]アミノ]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]アセトアミド;
(2S)−2−[4−フルオロ−3−(トリフルオロメトキシ)フェニル]−2−メトキシ−N−[5−[[(3R)−1−ピリダジン−3−イルピロリジン−3−イル]アミノ]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]アセトアミド;および
(2S)−[3−(ジフルオロメトキシ)フェニル]−2−エトキシ−N−[5−[[(3R)−1−ピリダジン−3−イルピロリジン−3−イル]アミノ]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]アセトアミド;
からなる群から選択される化合物、またはその薬学的に許容できる塩もまた提供される。
用語「薬学的に許容できる」は、対象(例えば塩、剤形、希釈剤または担体)が患者における使用に適することを明示するために用いられる。薬学的に許容できる塩の事例リストが、Handbook of Pharmaceutical Salts:Properties,Selection and Use,P.H.Stahl and C.G.Wermuth,editors,Weinheim/Zuerich:Wiley−VCH/VHCA,2002(その全体が参照により援用される)中に見出すことができる。式(I)の化合物の好適な薬学的に許容できる塩は、例えば酸付加塩である。式(I)の化合物の酸付加塩は、化合物を当業者に公知の条件下で好適な無機酸もしくは有機酸と接触状態にすることにより形成されてもよい。酸付加塩は、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、およびリン酸などの無機酸を用いて形成されてもよい。酸付加塩はまた、例えば、トリフルオロ酢酸、メタンスルホン酸、またはベンゼンスルホン酸などの有機酸を用いて形成されてもよい。
したがって、一実施形態では、式(I)の化合物またはその薬学的に許容できる塩が提供され、ここで薬学的に許容できる塩は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、トリフルオロ酢酸、メタンスルホン酸、またはベンゼンスルホン酸の塩である。
式(I)の化合物のさらなる好適な薬学的に許容できる塩は、塩基付加塩である。式(I)の化合物の塩基付加塩は、化合物を当業者に公知の条件下で好適な無機塩基もしくは有機塩基と接触状態にすることにより形成されてもよい。塩基付加塩は、例えば、アルカリ金属水酸化物(ナトリウム、カリウム、またはリチウム水酸化物など)またはアルカリ土類金属水酸化物(水酸化カルシウムまたは水酸化マグネシウムなど)などの無機塩基を用いて形成されてもよい。塩基付加塩はまた、例えば、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、ピペリジン、モルホリン、またはトリス−(2−ヒドロキシエチル)アミンなどの有機塩基を用いて形成されてもよい。
したがって、一実施形態では、式(I)の化合物またはその薬学的に許容できる塩が提供され、ここで薬学的に許容できる塩は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、ピペリジン、モルホリン、またはトリス−(2−ヒドロキシエチル)アミンの塩である。
一実施形態では、式(I)の化合物またはその薬学的に許容できる塩が提供され、ここで薬学的に許容できる塩は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、トリフルオロ酢酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、ピペリジン、モルホリン、またはトリス−(2−ヒドロキシエチル)アミンの塩である。
さらなる実施形態は、本明細書で定義される実施形態(例えば請求項1の実施形態)のいずれかを、実施例1(a)、1(b)、2(a)、2(b)、3(a)、3(b)、4(a)、4(b)、5(a)、5(b)、6(a)、6(b)、7(a)、7(b)、8(a)、8(b)、9(a)、9(b)、10(a)、10(b)、11(a)、11(b)、12(a)、12(b)、13(a)、13(b)、14(a)、14(b)、15(a)、15(b)、16(a)、16(b)、17(a)、17(b)、18(a)、18(b)、19(a)、19(b)、20(a)、20(b)、21(a)、21(b)、22(a)、22(b)、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45(a)、45(b)、46(a)、46(b)、47(a)、47(b)、48(a)、48(b)、49(a)、49(b)、50(a)、50(b)、51(a)、51(b)、52(a)、52(b)、53(a)、53(b)、54(a)、および54(b)からなる群から選択される1つ以上の特定の実施例(例えば、1つ、2つもしくは3つの特定の実施例、または代替的に1つの特定の実施例)が個別に請求されないという条件で提供する。
式(I)中の変数群の一部の値は以下の通りである。さらなる実施形態を提供するため、かかる値は、本明細書で定義される定義、請求項(例えば請求項1)、または実施形態のいずれかと組み合わせて用いられてもよい。
本明細書に記載の化合物および塩は、溶媒和形態および非溶媒和形態で存在してもよい。例えば、溶媒和形態は、水和形態、例えば、半水化物、一水和物、二水和物、三水和物またはその代替量であってもよい。本発明は、式(I)の化合物のすべてのかかる溶媒和および非溶媒和形態を包含する。
本明細書に記載の化合物および塩は、互変異性体の混合物として存在してもよい。「互変異性体」は、水素原子の転位に起因する平衡状態で存在する構造異性体である。本発明は、式(I)の化合物のあらゆる互変異性体を含む。
一実施形態では、≧95%、≧98%または≧99%のジアステレオマー過剰率(%de)の単一のジアステレオマーである、式(I)の化合物、またはその薬学的に許容できる塩が提供される。一実施形態では、単一のジアステレオマーは、≧99%のジアステレオマー過剰率(%de)で存在する。
GLS1を阻害すると考えられる化合物、すなわち、式(I)の化合物、およびその薬学的に許容できる塩は、治療、例えば少なくとも一部にはGLS1により媒介される疾患または医学的状態、例えばがんの治療において有用であることが想定される。
「GLS1阻害活性」は、式(I)の化合物、またはその薬学的に許容できる塩の存在に対する直接的または間接的応答としてのGLS1の活性における、式(I)の化合物、またはその薬学的に許容できる塩の不在下でのGLS1の活性に対する減少を指す。活性におけるかかる減少は、式(I)の化合物、もしくはその薬学的に許容できる塩とGLS1との直接的相互作用に起因する、または式(I)の化合物、もしくはその薬学的に許容できる塩とGLS1活性に次々に影響する1つ以上の他の因子との相互作用に起因することがある。例えば、式(I)の化合物、またはその薬学的に許容できる塩は、GLS1に直接的に結合することにより;別の因子によるGLS1活性の減少を(直接的または間接的に)引き起こすことにより;または細胞もしくは生物に存在するGLS1の量を(直接的または間接的に)低減することにより、GLS1を減少させることがある。
用語「治療」は、疾患を治療するかまたは基礎的病理を矯正もしくは補正するというその正常な意味を有することが意図される。用語「治療」はまた、「予防」を、それに対する具体的な指示がない限り、含む。用語「治療的な」および「治療的に」は、対応する様式で解釈されるべきである。
用語「治療有効量」は、被験者における治療法を提供するのに有効である、本明細書中の実施形態のいずれかに記載のような式(I)の化合物の量を指す。がんの場合、治療有効量は、上記の「治療法」、「治療」および「予防」の定義において記載の通り、被験者において観測可能または測定可能な変化のいずれかを引き起こすことがある。例えば、有効量は、がんまたは腫瘍細胞の数を低減し得る;総腫瘍サイズを低減し得る;腫瘍細胞の例えば軟部組織および骨を含む末梢臓器への浸潤を阻害または停止し得る;腫瘍転移を阻害および停止し得る;腫瘍成長を阻害および停止し得る;がんに関連する症状の1つ以上をある程度軽減し得る;罹患率および死亡率を低減し得る;生活の質を改善し得る;またはかかる効果の組み合わせであり得る。有効量は、GLS1活性の阻害に対して応答する疾患の症状を低減するのに十分な量であってもよい。がん療法については、インビボでの有効性は、例えば、生存の持続時間、疾患進行までの時間(TTP)、応答速度(RR)、応答の持続時間、および/または生活の質を評価することにより測定され得る。当業者によって理解されるように、有効量は、投与経路、賦形剤の使用、および他の薬剤との同時使用に応じて変動してもよい。例えば、併用療法が用いられる場合、本明細書に記載の式(I)の化合物または薬学的に許容できる塩の量および他の薬学的活性剤の量は、組み合わされるとき、動物患者における標的化された障害を治療するのに一緒に有効である。これに関連して、組み合わされた量は、組み合わされるとき、上記のようなGLS1活性の阻害に対して応答する疾患の症状を低減するのに十分である場合、「治療有効量」に含まれる。典型的には、かかる量は、例えば、式(I)の化合物または薬学的に許容できる塩についての本明細書に記載の用量範囲に始まり、他の薬学的活性化合物の認可されたまたはそうでなければ公表された用量範囲により、当業者によって決定されてもよい。
用語「予防」は、その正常な意味を有することが意図され、疾患の発生を予防するための一次予防および疾患が既に発生しており、患者が疾患の増悪または悪化に対して一時的または持続的に保護される場合の二次予防を含む。
用語「治療」は、「治療法」と同義的に用いられる。同様に、用語「治療する」は、「治療法」が本明細書で定義される通りである場合での治療法を適用するものとして見なされ得る。
一実施形態では、式(I)の化合物、またはその薬学的に許容できる塩、および少なくとも1つの薬学的に許容できる希釈剤もしくは担体を含む医薬組成物が提供される。一実施形態では、医薬組成物は、遊離塩基としての式(I)の化合物を含む。別の実施形態では、医薬組成物は、式(I)の化合物の薬学的に許容できる塩を含む。
一実施形態では、GLS1によって媒介される疾患の治療に用いられる、式(I)の化合物、またはその薬学的に許容できる塩が提供される。一実施形態では、GLS1によって媒介される疾患はがんである。一部の実施形態では、がんは、乳がん(例えばトリプルネガティブ乳がん)、肺がん(例えば非小細胞肺がん)、膵がん、腎がん、または肝細胞がんであり得る。
「トリプルネガティブ乳がん」は、ストロゲン受容体、プロゲステロン受容体およびHer2/neuにおける遺伝子を発現しない、または過小発現する任意の乳がんである。
一実施形態では、GLS1によって媒介される疾患の治療用の薬剤の製造における、式(I)の化合物、またはその薬学的に許容できる塩の使用が提供される。一実施形態では、GLS1によって媒介される疾患はがんである。一部の実施形態では、がんは、乳がん(例えばトリプルネガティブ乳がん)、肺がん(例えば非小細胞肺がん)、膵がん、腎がん、または肝細胞がんであり得る。
一実施形態では、GLS1の阻害がかかる治療を必要とする温血動物において有利である疾患を治療するための方法であって、式(I)の化合物、またはその薬学的に許容できる塩を治療有効量で温血動物に投与するステップを含む、方法が提供される。
一実施形態では、かかる治療を必要とする温血動物におけるがんを治療するための方法であって、式(I)の化合物、またはその薬学的に許容できる塩を治療有効量で温血動物に投与するステップを含む、方法が提供される。一部の実施形態では、がんは、乳がん(例えばトリプルネガティブ乳がん)、肺がん(例えば非小細胞肺がん)、膵がん、腎がん、または肝細胞がんであり得る。
本明細書に記載のがんにおける治療は、唯一の治療として適用されてもよく、または式(I)の化合物の投与に加えて、通常の手術、放射線療法、もしくは化学療法;もしくはかかる追加的な治療法の組み合わせを含んでもよい。かかる通常の手術、放射線療法、または化学療法は、式(I)の化合物を用いる治療に対して、同時に、連続的に、または別々に施されてもよい。
したがって、一実施形態では、がんの治療に用いられる、式(I)の化合物、またはその薬学的に許容できる塩、および少なくとも1つの追加的な抗腫瘍物質が提供される。
一実施形態では、がんの同時の、別々のまたは連続的な治療に用いられる、式(I)の化合物、またはその薬学的に許容できる塩、および少なくとも1つの追加的な抗腫瘍物質が提供される。
一実施形態では、がんの治療に用いられる、式(I)の化合物、またはその薬学的に許容できる塩が提供され、ここで式(I)の化合物は、少なくとも1つの追加的な抗腫瘍物質に対して同時に、別々に、または連続的に投与される。
一実施形態では、かかる治療を必要とする温血動物におけるがんを治療する方法であって、式(I)の化合物、またはその薬学的に許容できる塩および少なくとも1つの追加的な抗腫瘍物質を温血動物に投与するステップを含む、方法が提供され、ここで式(I)の化合物、またはその薬学的に許容できる塩、および追加的な抗腫瘍物質の量は、抗がん効果をもたらす上で一緒に有効である。
一実施形態では、かかる治療を必要とする温血動物におけるがんを治療する方法であって、式(I)の化合物、またはその薬学的に許容できる塩を温血動物に投与するステップと、少なくとも1つの追加的な抗腫瘍物質を同時に、別々にまたは連続的に温血動物に投与するステップと、を含む、方法が提供され、ここで式(I)の化合物、またはその薬学的に許容できる塩、および追加的な抗腫瘍物質の量は、抗がん効果をもたらす上で一緒に有効である。
式(I)の化合物、およびその薬学的に許容できる塩は、1つ以上の薬学的に許容できる希釈剤もしくは担体を含む医薬組成物として投与されてもよい。したがって、一実施形態では、式(I)の化合物、またはその薬学的に許容できる塩、および少なくとも1つの薬学的に許容できる希釈剤もしくは担体を含む医薬組成物が提供される。
組成物は、経口使用(例えば、錠剤、トローチ剤、硬もしくは軟カプセル剤、水性もしくは油性懸濁液、乳剤、分散性散剤もしくは顆粒剤、シロップ剤またはエリキシル剤として)、局所使用(例えば、クリーム、軟膏剤、ゲル剤、または水性もしくは油性の溶液または懸濁液として)、吸入による投与(例えば、微粉化粉末または液体エアロゾルとして)、ガス注入による投与(例えば、微粉化粉末として)または非経口投与(例えば、静脈内、皮下、筋肉内投与用の滅菌水性もしくは油性溶液として)、または坐剤として好適な形態であってもよい。組成物は、通常の医薬賦形剤を用いる通常の手順により得てもよい。したがって、経口使用を意図した組成物は、例えば、1つ以上の着色剤、甘味剤、香味剤、および/または防腐剤を含有してもよい。
一実施形態では、治療に用いられる、式(I)の化合物、またはその薬学的に許容できる塩、および少なくとも1つの薬学的に許容できる希釈剤もしくは担体を含む医薬組成物が提供される。
一実施形態では、がんの治療に用いられる、式(I)の化合物、またはその薬学的に許容できる塩、および少なくとも1つの薬学的に許容できる希釈剤もしくは担体を含む医薬組成物が提供される。一部の実施形態では、がんは、乳がん(例えばトリプルネガティブ乳がん)、肺がん(例えば非小細胞肺がん)、膵がん、腎がん、または肝細胞がんであり得る。
様々な実施形態が以下の実施例によって例示される。本発明は、実施例に限定されるものとして解釈されるべきではない。
実施例の調製に際して、一般に次のことが言える。
a)操作は、特に指定のない限り、環境温度、すなわち約17〜30℃の範囲内でかつ窒素などの不活性ガスの雰囲気下で実施した;
b)回転蒸発または真空でGenevac機器を利用することにより蒸発を行い、固形残留物の濾過による除去後に精査手順を実施した;
c)フラッシュクロマトグラフィー精製は、Grace Resolveプレパックシリカカラムを用いた自動化されたIsco Combiflash Companion、RediSep Gold C18カラムを用いたIsco Combiflash Rf(逆相フラッシュ)上で実施した;
d)収量(存在する場合)は必ずしも最大の達成可能な収量とは限らない;
e)式(I)の最終生成物の構造は、δスケールで測定されるNMR化学シフトを用いた核磁気共鳴(NMR)分光により確認した。プロトン磁気共鳴スペクトルは、Bruker Avance 700(700MHz)、Bruker Avance 500(500MHz)、Bruker 400(400MHz)またはBruker 300(300MHz)機器を用いて測定し;19F NMRは、282MHzまたは376MHzで測定し;13C NMRは、75MHzまたは100MHzで測定し;測定値は、特に指定されない限り、約20〜30℃で取得し;以下の略称:s,一重線;d,二重線;t,三重線;q,四重線;m,多重線;dd,二重線の二重線;ddd,二重線の二重線の二重線;dt,三重線の二重線;bs,幅広いシグナル、を用いている;
f)式(I)の最終生成物はまた、2996 PDAおよび2000 amu ZQ単一四重極質量分析計を有するWaters 2790/95LCシステムに基づくHPLCシステムを用いての液体クロマトグラフィー後の質量分析(LCMS)により特徴づけた。用いた溶媒は、A=水、B=アセトニトリル、C=50:50のアセトニトリル:水/0.1%ギ酸およびD=50:50のアセトニトリル:水/0.1%水酸化アンモニウムであった。1.1mL/分の流速で、試料5μLを50×2.1 5μmのPhenomenex Gemini NXカラム上に注入した。勾配は、4.0分間で95%のAから95%のBへ移行し、C(酸分析用、Dは塩基分析用に用いる)の5%一定注入を伴った。開始条件に戻す前、95%のBで0.5分間フローを保持した。データは、質量分析計で正および負モードの双方にて150〜850amu、およびPDAで220〜320nmが得られた。LCMSはまた、サンプルマネージャーを有するWaters Acquity Binaryポンプ、Acquity PDAおよびSQD質量分析計を用いたUPLCシステム上で実施した。用いた溶媒は、A1=0.1%ギ酸(水性)、B1 アセトニトリル中0.1%ギ酸、A2=0.1%水酸化アンモニウム(水性)およびB2 アセトニトリル中0.1%水酸化アンモニウムであった。1mL/分の流速で、試料1μLは、50×2.1 1.7umのWaters BEHカラム(40℃)上に注入した。0.2分間保持され、開始条件に戻す前、勾配は1.30分かけて97%のA1から97%のB1へ移行した(塩基分析においては、A1およびB1をA2およびB2に置き換える)。データは、質量分析計で正および負イオンモードにて150〜1000amu、およびPDAで245〜320amuが得られた。
g) 中間体は、完全に特徴づけることは一般的でなく、純度は、薄層クロマトグラフィー、質量スペクトル、HPLCおよび/またはNMR分析により評価した;
h)以下の略称:h=時間;r.t.=室温(約17〜30℃);conc.=濃縮された;FCC=シリカを用いたフラッシュカラムクロマトグラフィー;AIBN=アゾビスイソブチロニトリル;DCM=ジクロロメタン;DIPEA=ジ−イソプロピルエチルアミン;DMA=N,N−ジメチルアセトアミド;DMF=N,N−ジメチルホルムアミド;DMSO=ジメチルスルホキシド;EDC=1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド;Et2O=ジエチルエーテル;EtOAc=酢酸エチル;EtOH=エタノール;HATU=1−[ビス(ジメチルアミノ)メチレン]−1H−1,2,3−トリアゾロ[4,5−b]ピリジニウム3−オキシドヘキサフルオロホスフェート;HOBT=ヒドロキシベンゾトリアゾール;K2CO3=炭酸カリウム;MeOH=メタノール;MeCN=アセトニトリル;MgSO4=無水硫酸マグネシウム;Na2SO4=無水硫酸ナトリウム;NBS=N−ブロモスクシンイミド;TFA=トリフルオロ酢酸;THF=テトラヒドロフラン;sat.=飽和水溶液、を用いている。
以下の幾つかの例では、化合物のジアステレオマー対を記述する。例えば、実施例1(a)および実施例1(b)の化合物は、単一の反応の生成物中の混合物として形成され、その後分離される、化合物のジアステレオマー対を表す。かかる実施例では、立体化学の任意の指定は絶対的なものではない。実例として、実施例1(a)および1(b)は、名付けられた化合物の(2S,3R)および(2R,3R)ジアステレオマーに関連するが、実施例1(a)が(2S,3R)ジアステレオマーとして、また実施例1(b)が(2R,3R)ジアステレオマーとして明確に指定されることを述べる意図はない。
実施例1(a)および1(b)
(2S)−2−[3−(3−フルオロアゼチジン−1−イル)フェニル]−2−メトキシ−N−[5−[[(3R)−1−ピリダジン−3−イルピロリジン−3−イル]アミノ]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]アセトアミドおよび(2R)−2−[3−(3−フルオロアゼチジン−1−イル)フェニル]−2−メトキシ−N−[5−[[(3R)−1−ピリダジン−3−イルピロリジン−3−イル]アミノ]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]アセトアミド
HATU(351mg、0.92ミリモル)を、室温でN−メチル−2−ピロリジノン(2mL)およびDMF(3mL)中、[2−[3−(3−フルオロアゼチジン−1−イル)フェニル]−2−メトキシ−アセチル]オキシリチウム(中間体17、170mg、0.71ミリモル)、N2−[(3R)−1−ピリダジン−3−イルピロリジン−3−イル]−1,3,4−チアジアゾール−2,5−ジアミン(中間体1、187mg、0.71ミリモル)およびDIPEA(0.372mL、2.13ミリモル)に添加した。得られた溶液を室温で45分間撹拌した。この溶液をMeOH(15mL)で希釈し、MeOH、次いでMeOH中1N NH
3を流しながら、20gのSCXカートリッジに通過させ、生成物を溶出させた。溶媒を低圧下で蒸発させ、粗生成物を得て、それをMeOH/DCMに溶解し、シリカゲル上で蒸発させた。残渣をFCC(SiO
2、DCM中MeOH0〜12%)により精製した。純粋画分を蒸発させて乾燥し、ジアステレオ異性体の混合物をガム状物として得た(280mg)。ジアステレオ異性体を分取HPLC(Phenomenex Lux C4カラム、20μm、50mm×250mm、120mL/分でのMeOH)により分離し、次を得た。
第1溶出異性体の実施例1(a)、2−[3−(3−フルオロアゼチジン−1−イル)フェニル]−2−メトキシ−N−[5−[[(3R)−1−ピリダジン−3−イルピロリジン−3−イル]アミノ]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]アセトアミド(65mg,23%)。1H NMR(400MHz,DMSO−d6,30℃)δ 2.07(1H,dq),2.23−2.32(1H,m),3.40−3.59(3H,m),3.71−3.78(1H,m),3.80−3.93(2H,m),4.14(2H,dt),4.37(1H,dt),4.87(1H,s),5.48(1H,dtt),6.43(1H,dd),6.58(1H,s),6.80(1H,d),6.85(1H,dd),7.17(1H,t),7.32(1H,dd),7.64(1H,d),8.47(1H,dd),12.10(1H,s).m/z:ES+[M+H]+485.
第2溶出異性体の実施例1(b) 2−[3−(3−フルオロアゼチジン−1−イル)フェニル]−2−メトキシ−N−[5−[[(3R)−1−ピリダジン−3−イルピロリジン−3−イル]アミノ]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]アセトアミド(68mg,24%)。1H NMR(400MHz,DMSO−d6,30℃)δ 2.06(1H,dd),2.28(1H,td),3.42−3.59(3H,m),3.75(1H,dd),3.8−3.93(2H,m),4.14(2H,dt),4.37(1H,dt),4.88(1H,s),5.48(1H,ddd),6.44(1H,dd),6.57−6.61(1H,m),6.81(1H,d),6.86(1H,dd),7.18(1H,t),7.32(1H,dd),7.65(1H,d),8.47(1H,dd),12.12(1H,s).m/z:ES+[M+H]+485.
実施例2(a)および2(b)
(2S)−2−[3−(3,3−ジフルオロアゼチジン−1−イル)フェニル]−2−メトキシ−N−[5−[[(3R)−1−ピリダジン−3−イルピロリジン−3−イル]アミノ]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]アセトアミドおよび(2R)−2−[3−(3,3−ジフルオロアゼチジン−1−イル)フェニル]−2−メトキシ−N−[5−[[(3R)−1−ピリダジン−3−イルピロリジン−3−イル]アミノ]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]アセトアミド
HATU(225mg、0.59ミリモル)を、室温でN−メチル−2−ピロリジノン(2mL)およびDMF(3mL)中、2−[3−(3,3−ジフルオロアゼチジン−1−イル)フェニル]−2−メトキシ−酢酸(中間体22、117mg、0.46ミリモル)、N2−[(3R)−1−ピリダジン−3−イルピロリジン−3−イル]−1,3,4−チアジアゾール−2,5−ジアミン(中間体1、120mg、0.46ミリモル)およびDIPEA(0.239mL、1.37ミリモル)に添加した。得られた溶液を室温で45分間撹拌した。この溶液をMeOH(15mL)で希釈し、MeOHを流しながら、20gのSCXカートリッジに通過させ、不純物を除去し、次いでMeOH中NH
3の1N溶液を流すことで、生成物を溶出させた。溶媒を低圧下で蒸発させ、粗生成物を得て、それをFCC(SiO2、DCM中MeOH0〜6%)により精製した。純粋画分を蒸発させ、ジアステレオ異性体の混合物としての生成物をガム状物として得た(135mg)。ジアステレオ異性体を分取HPLC(Phenomenex Lux C2カラム、20μm、50mm×250mm、120mL/分でのMeOH/EtOH)により分離し、次を得た。
第1溶出異性体の実施例2(a) 2−[3−(3,3−ジフルオロアゼチジン−1−イル)フェニル]−2−メトキシ−N−[5−[[(3R)−1−ピリダジン−3−イルピロリジン−3−イル]アミノ]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]アセトアミド(55mg,41%)。1H NMR(400MHz,DMSO−d6,30℃)δ 2.07(1H,dt),2.22−2.32(1H,m),3.48(1H,dd),3.51−3.59(2H,m),3.74(1H,dd),4.25(4H,t),4.37(1H,dq),4.89(1H,s),6.49−6.56(1H,m),6.67(1H,d),6.81−6.91(2H,m),7.21(1H,t),7.31(1H,dd),7.64(1H,d),8.46(1H,dd),12.11(1H,s).m/z:ES+[M+H]+503.
第2溶出異性体の実施例2(b) 2−[3−(3,3−ジフルオロアゼチジン−1−イル)フェニル]−2−メトキシ−N−[5−[[(3R)−1−ピリダジン−3−イルピロリジン−3−イル]アミノ]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]アセトアミド(61mg,45%)。1H NMR(400MHz,DMSO−d6,30℃)2.00−2.11(1H,m),2.22−2.31(1H,m),3.48(1H,dd),3.52−3.59(2H,m),3.74(1H,dd),4.25(4H,t),4.36(1H,dt),4.88(1H,s),6.52(1H,dd),6.66(1H,s),6.82−6.91(2H,m),7.21(1H,t),7.31(1H,dd),7.61(1H,d),8.47(1H,dd),12.11(1H,s).m/z:ES+[M+H]+503.
実施例3(a)および3(b)
(2S)−2−メトキシ−2−[3−(3−メトキシアゼチジン−1−イル)フェニル]−N−[5−[[(3R)−1−ピリダジン−3−イルピロリジン−3−イル]アミノ]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]アセトアミドおよび(2R)−2−メトキシ−2−[3−(3−メトキシアゼチジン−1−イル)フェニル]−N−[5−[[(3R)−1−ピリダジン−3−イルピロリジン−3−イル]アミノ]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]アセトアミド
HATU(216mg、0.57ミリモル)を、室温でN−メチル−2−ピロリジノン(2mL)およびDMF(3mL)中、2−メトキシ−2−[3−(3−メトキシアゼチジン−1−イル)フェニル]酢酸(中間体25、110mg、0.44ミリモル)、N2−[(3R)−1−ピリダジン−3−イルピロリジン−3−イル]−1,3,4−チアジアゾール−2,5−ジアミン(中間体1、115mg、0.44ミリモル)およびDIPEA(0.229mL、1.31ミリモル)に添加した。得られた溶液を室温で45分間撹拌した。この溶液をMeOH(15mL)で希釈し、MeOH、次いでMeOH中NH
3の1N溶液を流しながら、20gのSCXカートリッジに通過させ、不純物を除去し、生成物を溶出させた。溶媒を低圧下で蒸発させ、粗生成物を得た。粗生成物をMeOH/DCMに溶解し、シリカゲル上で蒸発させた。残渣をFCC(SiO
2、DCM中MeOH0〜10%)により精製した。純粋画分を蒸発させて乾燥し、ジアステレオ異性体の混合物としての生成物をガム状物として得た(140mg)。結合したジアステレオ異性体を分取HPLC(Lux C4カラム、20μm、50mm×250mm、120mL/分での100%MeOH)により分離し、次を得た。
第1溶出異性体の実施例3(a) 2−メトキシ−2−[3−(3−メトキシアゼチジン−1−イル)フェニル]−N−[5−[[(3R)−1−ピリダジン−3−イルピロリジン−3−イル]アミノ]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]アセトアミド(74mg,15%)。1H NMR(400MHz,DMSO−d6,30℃)δ 2.13(1H,td),2.3−2.38(1H,m),3.30(3H,s),3.35(3H,s),3.54(1H,dd),3.58−3.67(4H,m),3.81(1H,dd),4.05−4.12(2H,m),4.37(1H,ddd),4.44(1H,dq),4.92(1H,s),6.45(1H,dd),6.61(1H,d),6.82(1H,d),6.91(1H,dd),7.21(1H,t),7.38(1H,dd),7.71(1H,d),8.53(1H,dd),12.16(1H,s).m/z:ES+[M+H]+497.
第2溶出異性体の実施例3(b) 2−メトキシ−2−[3−(3−メトキシアゼチジン−1−イル)フェニル]−N−[5−[[(3R)−1−ピリダジン−3−イルピロリジン−3−イル]アミノ]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]アセトアミド(67mg,14%)。1H NMR(400MHz,DMSO−d6,30℃)δ 2.11(1H,dq),2.33(1H,dt),3.29(3H,s),3.34(3H,s),3.54(1H,dd),3.58−3.66(4H,m),3.80(1H,dd),4.05−4.12(2H,m),4.36(1H,ddd),4.4−4.47(1H,m),4.91(1H,s),6.44(1H,dd),6.60(1H,s),6.82(1H,d),6.91(1H,dd),7.20(1H,t),7.37(1H,dd),7.69(1H,d),8.53(1H,dd),12.15(1H,s).m/z:ES+[M+H]+497.
実施例4(a)および4(b)
(2S)−2−(3,5−ジメトキシフェニル)−2−メトキシ−N−[5−[[(3R)−1−(6−メチルピリダジン−3−イル)ピロリジン−3−イル]アミノ]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]アセトアミドおよび(2R)−2−(3,5−ジメトキシフェニル)−2−メトキシ−N−[5−[[(3R)−1−(6−メチルピリダジン−3−イル)ピロリジン−3−イル]アミノ]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]アセトアミド
HATU(329mg、0.87ミリモル)を、窒素下、21℃でDMF(6mL)中、2−(3,5−ジメトキシフェニル)−2−メトキシ−酢酸(中間体28、196mg、0.87ミリモル)、N2−[(3R)−1−(6−メチルピリダジン−3−イル)ピロリジン−3−イル]−1,3,4−チアジアゾール−2,5−ジアミン(中間体6、200mg、0.72ミリモル)およびDIPEA(0.252mL、1.44ミリモル)に添加した。得られた溶液を21℃で2時間撹拌した。粗混合物をSCXカラムを用いるイオン交換クロマトグラフィーにより精製した。所望される生成物を、MeOH中1M NH
3を用いてカラムから溶出させ、純粋画分を蒸発させて乾燥し、粗生成物を得て、それをFCC(SiO
2、DCM中MeOH0〜12%)により精製した。純粋画分を蒸発させて乾燥し、褐色ガム状物を得て、それをFCC(SiO
2、DCM中MeOH0〜8%)により精製した。純粋画分を蒸発させて乾燥し、ジアステレオ異性体の混合物を黄色ガム状物として得た。ジアステレオ異性体を分取HPLC(Lux C2カラム、20μm、50mm×250mm、120mL/分での100%MeOH)により分離し、次を得た。
第1溶出異性体の実施例4(a) 2−(3,5−ジメトキシフェニル)−2−メトキシ−N−[5−[[(3R)−1−(6−メチルピリダジン−3−イル)ピロリジン−3−イル]アミノ]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]アセトアミド(21mg,6%)。1H NMR(400MHz,DMSO−d6,27℃)δ 1.98−2.10(1H,m),2.18−2.31(1H,m),2.40(3H,s),3.30(9H,s),3.43(1H,m),3.47−3.61(2H,m),3.72(1H,m),4.36(1H,m),4.87(1H,s),6.45(1H,t),6.62(2H,d),6.81(1H,d),7.21(1H,d),7.64(1H,s),12.12(1H,s).m/z:ES+[M+H]+486.
第2溶出異性体の実施例4(b) 2−(3,5−ジメトキシフェニル)−2−メトキシ−N−[5−[[(3R)−1−(6−メチルピリダジン−3−イル)ピロリジン−3−イル]アミノ]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]アセトアミド(18mg,5%)。1H NMR(400MHz,DMSO−d6,27℃)δ 1.98−2.10(1H,m),2.18−2.31(1H,m),2.40(3H,s),3.30(9H,s),3.43(1H,m),3.47−3.61(2H,m),3.72(1H,m),4.36(1H,m),4.87(1H,s),6.45(1H,t),6.62(2H,d),6.81(1H,d),7.21(1H,d),7.64(1H,s),12.12(1H,s).m/z:ES+[M+H]+486.
実施例5(a)および5(b)
(2R)−3−メトキシ−2−(3−メトキシフェニル)−N−[5−[[(3R)−1−ピリダジン−3−イルピロリジン−3−イル]アミノ]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]プロパンアミドおよび(2S)−3−メトキシ−2−(3−メトキシフェニル)−N−[5−[[(3R)−1−ピリダジン−3−イルピロリジン−3−イル]アミノ]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]プロパンアミド
DIPEA(0.1mL、0.57ミリモル)、HATU(173.28mg、0.456ミリモル)および3−メトキシ−2−(3−メトキシフェニル)プロパン酸(中間体29、0.09g、0.418ミリモル)を、DMF(4mL)中、N2−[(3R)−1−ピリダジン−3−イルピロリジン−3−イル]−1,3,4−チアジアゾール−2,5−ジアミン(中間体1、0.1g、0.38ミリモル)の溶液に添加した。混合物を室温で18時間撹拌した。これを水(5mL)で希釈し、DCMに抽出し(10mL)、蒸発させ、分取HPLC(SunFire C18カラム、5μm、50mm×19mm、流速25mL/分)により精製した。減少する極性比率の0.1%ギ酸を含有する水およびMeCNを移動相として用いた。純粋画分を、SCXカートリッジに通過させ、メタノールで洗浄し、次にMeOH中2M NH
3で溶出した。塩基性画分を蒸発させて乾燥し、ジアステレオ異性体の混合物をSFC(Lux C1カラム、5μm、21.2mm×250mm、40℃、50mL/分の流速での0.1%v/v NH
3を含有する50:50のMeOH:CO
2)により分離し、次を得た。
第1溶出異性体の実施例5(a) 3−メトキシ−2−(3−メトキシフェニル)−N−[5−[[(3R)−1−ピリダジン−3−イルピロリジン−3−イル]アミノ]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]プロパンアミド(25.3mg,14.6%)。1H NMR(400MHz,DMSO−d6,25℃)δ 2.00−2.12(1H,m),2.22−2.31(1H,m),3.25(3H,s),3.45−3.59(4H,m),3.71−3.79(4H,m),3.97(1H,t),4.03−4.10(1H,m),4.31−4.43(1H,m),6.83−6.94(4H,m),7.26(1H,t),7.33(1H,dd),7.68(1H,d),8.48(1H,dd),12.23(1H,s).m/z:ES+[M+H]+456.
第2溶出異性体の実施例5(b) 3−メトキシ−2−(3−メトキシフェニル)−N−[5−[[(3R)−1−ピリダジン−3−イルピロリジン−3−イル]アミノ]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]プロパンアミド(22.3mg,12.8%)。1H NMR(400MHz,DMSO−d6,25℃)δ 2.00−2.14(1H,m),2.22−2.36(1H,m),3.25(3H,s),3.43−3.52(2H,m),3.52−3.61(2H,m),3.69−3.78(4H,m),3.97(1H,t),4.01−4.10(1H,m),4.31−4.43(1H,m),6.79−6.95(4H,m),7.26(1H,t),7.33(1H,dd),7.68(1H,d),8.47(1H,dd),12.23(1H,s).m/z:ES+[M+H]+456.
実施例6(a)および6(b)
(2S)−2−(3,5−ジメトキシフェニル)−2−エトキシ−N−[5−[[(3R)−1−ピリダジン−3−イルピロリジン−3−イル]アミノ]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]アセトアミドおよび(2R)−2−(3,5−ジメトキシフェニル)−2−エトキシ−N−[5−[[(3R)−1−ピリダジン−3−イルピロリジン−3−イル]アミノ]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]アセトアミド
N2−[(3R)−1−ピリダジン−3−イルピロリジン−3−イル]−1,3,4−チアジアゾール−2,5−ジアミン(中間体1、0.2g、0.76ミリモル)および2−(3,5−ジメトキシフェニル)−2−エトキシ−酢酸(中間体33、0.18g、0.76ミリモル)を、N
2下、室温でDMF(2mL)に溶解した。混合物を、DIPEA(0.34mL、1.943ミリモル)およびHATU(0.29g、0.76ミリモル)の添加前5分間、次に室温で1時間撹拌した。粗混合物を5gのSCXカラムに通過させ、MeOHで洗浄し、次にMeOH中2N NH
3で溶出した。塩基性画分を分取HPLC(SunFire C18カラム、5μm、50mm×19mm、流速25mL/分)により精製した。減少する極性比率の0.1%ギ酸を含有する水およびMeCNを移動相として用いた。純粋画分を低圧下で蒸発させ、2gのSCXカラムに通過させ、MeOHで洗浄し、次にMeOH中2N NH
3で溶出した。塩基性画分を低圧下で蒸発させ、ジアステレオ異性体の混合物としての生成物をベージュ泡状物として得た。ジアステレオ異性体をSFC(Amy−Cカラム、5μm、20mm×250mm、50mL/分での修飾因子としてNH
3を含有するMeOH/CO
2(45%))により分離し、次を得た。
第1溶出異性体の実施例6(a) 2−(3,5−ジメトキシフェニル)−2−エトキシ−N−[5−[[(3R)−1−ピリダジン−3−イルピロリジン−3−イル]アミノ]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]アセトアミド(70mg,19%)。1H NMR(400MHz,DMSO−d6,21℃)δ 1.16(3H,t),2.04(1H,dq),3.38−3.50(3H,m),3.51−3.58(2H,m),3.66−3.78 (7H,m),4.35(1H,q),4.96(1H,s),6.44(1H,t),6.62(2H,d),6.84(1H,dd),7.30(1H,dd),7.67(1H,d),8.45(1H,dd),11.96(1H,s).m/z:ES+[M+H]+486.
第2溶出異性体の実施例6(b) 2−(3,5−ジメトキシフェニル)−2−エトキシ−N−[5−[[(3R)−1−ピリダジン−3−イルピロリジン−3−イル]アミノ]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]アセトアミド(74mg,20%)。1H NMR(400MHz,DMSO−d6,21℃)δ 1.18(3H,t),2.07(1H,dt),2.27(1H,dt),3.60−3.39(5H,m),3.79−3.70(6H,m),4.38(1H,q),4.99(1H,s),6.47(1H,t),6.64(2H,d),6.88(1H,dd),7.34(1H,dd),7.71(1H,d),8.48(1H,dd),12.15(1H,s).m/z:ES+[M+H]+486.
実施例7(a)および7(b)
(2S)−2−[4−フルオロ−3−(3−メトキシアゼチジン−1−イル)フェニル]−2−メトキシ−N−[5−[(3R)−3−(ピリダジン−3−イルアミノ)ピロリジン−1−イル]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]アセトアミドおよび(2R)−2−[4−フルオロ−3−(3−メトキシアゼチジン−1−イル)フェニル]−2−メトキシ−N−[5−[(3R)−3−(ピリダジン−3−イルアミノ)ピロリジン−1−イル]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]アセトアミド
N2−[(3R)−1−ピリダジン−3−イルピロリジン−3−イル]−1,3,4−チアジアゾール−2,5−ジアミン(中間体1、108mg、0.41ミリモル)および2−[4−フルオロ−3−(3−メトキシアゼチジン−1−イル)フェニル]−2−メトキシ−酢酸(中間体34、110mg、0.41ミリモル)を、窒素下、室温でDMF(3.5mL)に溶解した。混合物を、DIPEA(0.11mL、0.61ミリモル)およびHATU(186mg、0.49ミリモル)の添加前5分間、次に室温で一晩撹拌した。粗混合物を水(50mL)で希釈し、次にDCMに抽出した(3×50mL)。有機層を乾燥し(MgSO
4)、濾過し、次に蒸発させ、オレンジガム状物を得て、それを分取HPLC(SunFire C18カラム、5μm、50mm×19mm、流速25mL/分)により精製した。減少する極性比率の0.1%ギ酸を含有する水およびMeCNを移動相として用いた。所望される生成物を含有する画分を結合させ、蒸発させ、5gのSCXカラムに通過させ、MeOHで洗浄し、次にMeOH中2M NH
3で溶出した。塩基性画分を蒸発させ、ジアステレオ異性体の混合物を得た。ジアステレオ異性体を次にSFC(Lux C3カラム、5μm、21.2Mm×250mm、NH
3修飾因子を含有するMeOH/CO
2(30%)、50mL/分)により分離し、次を得た。
第1溶出異性体の実施例7(a) 2−[4−フルオロ−3−(3−メトキシアゼチジン−1−イル)フェニル]−2−メトキシ−N−[5−[(3R)−3−(ピリダジン−3−イルアミノ)ピロリジン−1−イル]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]アセトアミド(11mg,5%)。1H NMR(400MHz,DMSO−d6,21℃)δ 1.94−2.12(1H,m),2.19−2.36(1H,m),3.23(3H,s),3.27(3H,s),3.43−3.61(3H,m),3.62−3.77(3H,m),4.07−4.19(2H,m),4.22−4.30(1H,m),4.32−4.43(1H,m),4.87(1H,s),6.66(1H,dd),6.73−6.84(1H,m),6.86(1H,dd),7.04(1H,dd),7.32(1H,dd),7.70(1H,d),8.47(1H,dd),12.18(1H,s).m/z:ES+[M+H]+515.
第2溶出異性体の実施例7(b) 2−[4−フルオロ−3−(3−メトキシアゼチジン−1−イル)フェニル]−2−メトキシ−N−[5−[(3R)−3−(ピリダジン−3−イルアミノ)ピロリジン−1−イル]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]アセトアミド(11mg,5%)。1H NMR(400MHz,DMSO−d6,21℃)δ 2.00−2.13(1H,m),2.22−2.34(1H,m),3.23(3H,s),3.28(3H,s),3.42−3.60(3H,m),3.63−3.80(3H,m),4.09−4.18(2H,m),4.24−4.33(1H,m),4.43−4.45(1H,m),4.87(1H,s),6.67(1H,dd),6.75−6.83(1H,m),6.87(1H,dd),7.05(1H,dd),7.33(1H,dd),7.70(1H,d),8.48(1H,dd),12.18(1H,s).m/z:ES+[M+H]+515.
実施例8(a)および8(b)
(2S)−2−[4−フルオロ−3−(3−フルオロアゼチジン−1−イル)フェニル]−2−メトキシ−N−[5−[[(3R)−1−ピリダジン−3−イルピロリジン−3−イル]アミノ]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]アセトアミドおよび(2R)−2−[4−フルオロ−3−(3−フルオロアゼチジン−1−イル)フェニル]−2−メトキシ−N−[5−[[(3R)−1−ピリダジン−3−イルピロリジン−3−イル]アミノ]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]アセトアミド
N2−[(3R)−1−ピリダジン−3−イルピロリジン−3−イル]−1,3,4−チアジアゾール−2,5−ジアミン(中間体1、100mg、0.38ミリモル)および2−[4−フルオロ−3−(3−フルオロアゼチジン−1−イル)フェニル]−2−メトキシ−酢酸リチウム(中間体38、100mg、0.38ミリモル)を、N
2下、室温でDMF(2.0mL)に溶解した。混合物を、DIPEA(0.10mL、0.57ミリモル)およびHATU(173mg、0.46ミリモル)の添加前5分間撹拌し、次に室温で一晩撹拌した。粗混合物を5gのSCXカラムに通過させ、MeOHで洗浄し、次にMeOH中2M NH
3で溶出した。塩基性画分を蒸発させ、オレンジガム状物を得た。粗生成物を分取HPLC(SunFire C18カラム、5μm、50mm×19mm、25mL/分)により精製した。減少する極性比率の0.1%ギ酸を含有する水およびMeCNを移動相として用いた。生成物を含有する画分を結合させ、蒸発させ、5gのSCXカラムに通過させ、MeOHで洗浄し、次にMeOH中2M NH
3で溶出した。塩基性画分を蒸発させ、ジアステレオ異性体の混合物をオフホワイト固体として得た(94mg)。ジアステレオ異性体を分取HPLC(Lux C4カラム、20μm、50mm×250mm、120mL/分でのMeOH/EtOH)により分離し、次を得た。
第1溶出異性体の実施例8(a) 2−[4−フルオロ−3−(3−フルオロアゼチジン−1−イル)フェニル]−2−メトキシ−N−[5−[[(3R)−1−ピリダジン−3−イルピロリジン−3−イル]アミノ]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]アセトアミド(33mg,17%)。1H NMR(400MHz,DMSO,31℃)2.03−2.13(1H,m),2.24−2.33(1H,m),3.49(1H,dd),3.54−3.61(2H,m),3.75(1H,dd),3.97(2H,dd),4.19−4.31(2H,m),4.35−4.43(1H,m),4.89(1H,s),5.36−5.56(1H,m),6.71(1H,dd),6.8−6.89(2H,m),7.07(1H,dd),7.32(1H,dd),7.65(1H,d),8.48(1H,dd),12.13(1H,s).m/z:ES+[M+H]+503.
第2溶出異性体の実施例8(b) 2−[4−フルオロ−3−(3−フルオロアゼチジン−1−イル)フェニル]−2−メトキシ−N−[5−[[(3R)−1−ピリダジン−3−イルピロリジン−3−イル]アミノ]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]アセトアミド(34mg,18%)。1H NMR(400MHz,DMSO,30℃)2.01−2.11(1H,m),2.24−2.34(1H,m),3.47−3.61(3H,m),3.76(1H,dd),3.97(2H,dd),4.18−4.32(2H,m),4.35−4.43(1H,m),4.88(1H,s),5.35−5.57(1H,m),6.71(1H,dd),6.81−6.89(2H,m),7.07(1H,dd),7.33(1H,dd),7.64(1H,d),8.48(1H,d),12.14(1H,s),21に割り当てられたHs:プラスOMeプロトンは、3.30ppmで溶媒により観察されず不明瞭.m/z:ES+[M+H]+503.
実施例9(a)および9(b)
(2S)−N−[5−[[(3R)−1−(6−フルオロピリダジン−3−イル)ピロリジン−3−イル]アミノ]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]−2−メトキシ−2−[3−(3−メトキシアゼチジン−1−イル)フェニル]アセトアミドおよび(2R)−N−[5−[[(3R)−1−(6−フルオロピリダジン−3−イル)ピロリジン−3−イル]アミノ]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]−2−メトキシ−2−[3−(3−メトキシアゼチジン−1−イル)フェニル]アセトアミド
N2−[(3R)−1−(6−フルオロピリダジン−3−イル)ピロリジン−3−イル]−1,3,4−チアジアゾール−2,5−ジアミン(中間体9、0.11g、0.389ミリモル)および[2−メトキシ−2−[3−(3−メトキシアゼチジン−1−イル)フェニル]アセチル]オキシリチウム(中間体24、0.12g、0.466ミリモル)を、N
2下、室温でDMF(2mL)に溶解した。混合物を、DIPEA(0.34mL、1.943ミリモル)、およびHATU(0.4mL、0.389ミリモル)の添加前5分間、次に室温で2時間撹拌した。粗混合物を一晩静置状態にし、次に5gのSCXカラムに通過させ、MeOHで洗浄し、次にMeOH中2N NH
3で溶出した。塩基性画分を蒸発させ、オレンジガム状物を得て、それを分取HPLC(SunFire C18カラム、5μm、50mm×19mm、流速25mL/分)により精製した。減少する極性比率の0.1%ギ酸を含有する水およびMeCNを移動相として用いた。純粋画分を結合させ、蒸発させ、1gのSCXカラムに通過させ、MeOHで洗浄し、次にMeOH中2N NH
3で溶出し、ジアステレオ異性体の混合物をオフホワイト固体として得た。ジアステレオ異性体の混合物を分取キラルHPLC(Phenomenex Lux C4カラム、20μm、50mm×250mm、120mL/分での溶出剤MeOH)により分離し、次を得た。
第1溶出異性体の実施例9(a) N−[5−[[(3R)−1−(6−フルオロピリダジン−3−イル)ピロリジン−3−イル]アミノ]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]−2−メトキシ−2−[3−(3−メトキシアゼチジン−1−イル)フェニル]アセトアミド(39.1mg,19.5%)。1H NMR(400MHz,DMSO−d6,21℃)δ 2.07(1H,dt),2.27(1H,dt),3.24(3H,s),3.28(3H,s),3.46(1H,dd),3.50−3.61(4H,m),3.73(1H,dd),4.00−4.07(2H,m),4.27−4.42(2H,m),4.84(1H,s),6.39(1H,dd),6.55(1H,s),6.76(1H,d),7.12−7.20(2H,m),7.36(1H,dd),7.63(1H,d),12.16(1H,s).m/z:ES+[M+H]+515.
第2溶出異性体の実施例9(b) N−[5−[[(3R)−1−(6−フルオロピリダジン−3−イル)ピロリジン−3−イル]アミノ]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]−2−メトキシ−2−[3−(3−メトキシアゼチジン−1−イル)フェニル]アセトアミド(42.8mg,21.4%)。1H NMR(400MHz,DMSO−d6,21℃)δ 2.05(1H,td),2.27(1H,dt),3.24(3H,s),3.28(3H,s),3.47(1H,dd),3.5−3.6(4H,m),3.73(1H,dd),3.99−4.07(2H,m),4.27−4.4(2H,m),4.83(1H,s),6.39(1H,dd),6.55(1H,d),6.77(1H,d),7.12−7.2(2H,m),7.36(1H,dd),7.59(1H,d),12.17(1H,s).m/z:ES+[M+H]+515.
実施例10(a)および10(b)
(2S)−2−[3−(3−フルオロアゼチジン−1−イル)−5−メトキシ−フェニル]−2−メトキシ−N−[5−[[(3R)−1−ピリダジン−3−イルピロリジン−3−イル]アミノ]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]アセトアミドおよび(2R)−2−[3−(3−フルオロアゼチジン−1−イル)−5−メトキシ−フェニル]−2−メトキシ−N−[5−[[(3R)−1−ピリダジン−3−イルピロリジン−3−イル]アミノ]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]アセトアミド
N2−[(3R)−1−ピリダジン−3−イルピロリジン−3−イル]−1,3,4−チアジアゾール−2,5−ジアミン(中間体1、134mg、0.51ミリモル)および2−[3−(3−フルオロアゼチジン−1−イル)−5−メトキシ−フェニル]−2−メトキシ−酢酸リチウム(中間体40、137mg、0.51ミリモル)を、N
2下、室温でDMF(2mL)に溶解した。混合物を、DIPEA(0.13mL、0.76ミリモル)およびHATU(232mg、0.61ミリモル)の添加前5分間撹拌し、次に室温で一晩撹拌した。粗混合物を5gのSCXカラムに通過させ、MeOHで洗浄し、次にMeOH中2M NH
3で溶出した。塩基性画分を蒸発させ、オレンジガム状物を得て、それを分取HPLC(SunFire C18カラム、5μm、50mm×19mm、流速25mL/分)により精製した。減少する極性比率の0.1%ギ酸を含有する水およびMeCNを移動相として用いた。所望される質量を含有する画分を結合させ、蒸発させ、5gのSCXカラムに通過させ、MeOHで洗浄し、次にMeOH中2M NH
3で溶出した。塩基性画分を蒸発させ、ジアステレオ異性体の混合物をオフホワイト固体として得た(123mg)。ジアステレオ異性体を分取HPLC(Lux C4カラム、20μm、50mm×250mm、120mL/分での100%MeOH)により分離し、次を得た。
第1溶出異性体の実施例10(a) 2−[3−(3−フルオロアゼチジン−1−イル)−5−メトキシ−フェニル]−2−メトキシ−N−[5−[[(3R)−1−ピリダジン−3−イルピロリジン−3−イル]アミノ]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]アセトアミド(45mg,17%)。1H NMR(400MHz,DMSO,22℃)2.07(1H,dq),2.28(1H,dt),3.28(3H,s),3.49(1H,dd),3.52−3.59(2H,m),3.71(3H,s),3.74(1H,dd),3.80−3.86(1H,m),3.86−3.92(1H,m),4.06−4.20(2H,m),4.37(1H,dt),4.82(1H,s),5.47(1H,dtd),5.98(1H,t),6.13−6.21(1H,m),6.39−6.45(1H,m),6.86(1H,dd),7.33(1H,dd),7.67(1H,d),8.48(1H,dd),12.13(1H,s).m/z:ES+[M+H]+515.
第2溶出異性体の実施例10(b) 2−[3−(3−フルオロアゼチジン−1−イル)−5−メトキシ−フェニル]−2−メトキシ−N−[5−[[(3R)−1−ピリダジン−3−イルピロリジン−3−イル]アミノ]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]アセトアミド(46mg,17%)。1H NMR(400MHz,DMSO,22℃)2.06(1H,dq),2.27(1H,dt),3.28(3H,s),3.49(1H,dd),3.53−3.59(2H,m),3.71(3H,s),3.75(1H,dd),3.80−3.86(1H,m),3.87−3.92(1H,m),4.13(2H,dt),4.37(1H,dt),4.81(1H,s),5.47(1H,dtt),5.97(1H,t),6.13−6.23(1H,m),6.38−6.45(1H,m),6.87(1H,dd),7.33(1H,dd),7.64(1H,d),8.48(1H,dd),12.15(1H,s).m/z:ES+[M+H]+515.
実施例11(a)および11(b)
(2S)−2−メトキシ−2−[3−メトキシ−5−(トリフルオロメトキシ)フェニル]−N−[5−[[(3R)−1−ピリダジン−3−イルピロリジン−3−イル]アミノ]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]アセトアミドおよび(2R)−2−メトキシ−2−[3−メトキシ−5−(トリフルオロメトキシ)フェニル]−N−[5−[[(3R)−1−ピリダジン−3−イルピロリジン−3−イル]アミノ]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]アセトアミド
N2−[(3R)−1−ピリダジン−3−イルピロリジン−3−イル]−1,3,4−チアジアゾール−2,5−ジアミン(中間体1、100mg、0.38ミリモル)および2−メトキシ−2−[3−メトキシ−5−(トリフルオロメトキシ)フェニル]酢酸(中間体44、191mg、0.68ミリモル)を、N
2下、室温でDMF(3.5mL)に溶解した。混合物を、DIPEA(0.1mL、0.57ミリモル)およびHATU(173mg、0.46ミリモル)の添加前5分間撹拌し、次に室温で一晩撹拌した。粗混合物を水(50mL)で希釈し、DCMに抽出した(50mL×2)。有機層を乾燥させ(MgSO
4)、濾過し、蒸発させ、オレンジガム状物を得て、それを分取HPLC(SunFire C18カラム、5μm、50mm×19mm、流速25mL/分)により精製した。減少する極性比率の0.1%ギ酸を含有する水およびMeCNを移動相として用いた。所望される質量を含有する画分を結合させ、蒸発させ、5gのSCXカラムに通過させ、MeOHで洗浄し、次にMeOH中2M NH
3で溶出した。塩基性画分を蒸発させ、黄色固体を得た。ジアステレオ異性体の混合物を分取HPLC(Phenomenex Lux C2カラム、20μm、50mm×250mm、120mL/分での溶出剤としてEtOH/MeOHの50/50混合物を使用)により分離し、次を得た。
第1溶出異性体の実施例11(a) 2−メトキシ−2−[3−メトキシ−5−(トリフルオロメトキシ)フェニル]−N−[5−[[(3R)−1−ピリダジン−3−イルピロリジン−3−イル]アミノ]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]アセトアミド(9.1mg,4.5%)。1H NMR(400MHz,CDCl3,30℃)δ 2.28(1H,dd),2.35−2.47(1H,m),3.48(3H,s),3.56−3.71(2H,m),3.73−3.83(4H,m),3.87(1H,dd),4.52(1H,s),4.84(1H,s),6.25(1H,s),6.56(1H,dd),6.71−6.76(1H,m),6.89−6.95(2H,m),7.11(1H,dd),8.48(1H,dd).m/z:ES+[M+H]+526.
第2溶出異性体の実施例11(b) 2−メトキシ−2−[3−メトキシ−5−(トリフルオロメトキシ)フェニル]−N−[5−[[(3R)−1−ピリダジン−3−イルピロリジン−3−イル]アミノ]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]アセトアミド(10.2mg5.1%)。1H NMR(400MHz,CDCl3,30℃)δ 2.20−2.31(1H,m),2.35−2.47(1H,m),3.47(3H,s),3.56−3.78(3H,m),3.80(3H,s),3.84−3.93(1H,m),4.50(1H,s),4.84(1H,s),6.14(1H,s),6.57(1H,d),6.73(1H,s),6.92(2H,d),7.12(1H,dd),8.49(1H,s).m/z:ES+[M+H]+526.
実施例12(a)および12(b)
(2S)−2−メトキシ−2−[3−(3−メトキシアゼチジン−1−イル)フェニル]−N−[5−[[(3R)−1−(6−メチルピリダジン−3−イル)ピロリジン−3−イル]アミノ]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]アセトアミドおよび(2R)−2−メトキシ−2−[3−(3−メトキシアゼチジン−1−イル)フェニル]−N−[5−[[(3R)−1−(6−メチルピリダジン−3−イル)ピロリジン−3−イル]アミノ]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]アセトアミド
N2−[(3R)−1−(6−メチルピリダジン−3−イル)ピロリジン−3−イル]−1,3,4−チアジアゾール−2,5−ジアミン(中間体6、0.11g、0.389ミリモル)および[2−メトキシ−2−[3−(3−メトキシアゼチジン−1−イル)フェニル]アセチル]オキシリチウム(中間体24、0.12g、0.466ミリモル)を、N
2下、室温でDMF(2mL)に溶解した。混合物を、DIPEA(0.34mL、1.943ミリモル)、およびHATU(0.4mL、0.389ミリモル)の添加前5分間、次に室温で2時間撹拌した。粗混合物を、5gのSCXカラムに通過させ、MeOHで洗浄し、次にMeOH中2N NH
3で溶出した。塩基性画分を蒸発させ、分取HPLC(SunFire C18カラム、5μm、50mm×19mm、25mL/分)により精製した。減少する極性比率の0.1%ギ酸を含有する水およびMeCNを移動相として用いた。純粋画分を結合させ、蒸発させ、1gのSCXカラムに通過させ、MeOHで洗浄し、次にMeOH中2N NH
3で溶出し、ジアステレオ異性体の混合物をオフホワイト固体として得た(98mg)。ジアステレオ異性体を分取HPLC(Lux C4カラム、20μm、50mm×250mm、120mL/分での100%MeOH)により分離し、次を得た。
第1溶出異性体の実施例12(a) 2−メトキシ−2−[3−(3−メトキシアゼチジン−1−イル)フェニル]−N−[5−[[(3R)−1−(6−メチルピリダジン−3−イル)ピロリジン−3−イル]アミノ]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]アセトアミド(34mg,18%)。1H NMR(400MHz,DMSO,30℃)2.00−2.11(1H,m),2.30(1H,dt),2.41(3H,s),3.25(3H,s),3.45(1H,dd),3.49−3.62(4H,m),3.73(1H,dd),4.04(2H,t),4.28−4.41(2H,m),4.86(1H,s),6.40(1H,d),6.55(1H,s),6.77(1H,d),6.82(1H,d),7.15(1H,t),7.22(1H,d),7.62(1H,d),12.06(1H,s); m/z:ES+[M+H]+511.
第2溶出異性体の実施例12(b) 2−メトキシ−2−[3−(3−メトキシアゼチジン−1−イル)フェニル]−N−[5−[[(3R)−1−(6−メチルピリダジン−3−イル)ピロリジン−3−イル]アミノ]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]アセトアミド(38mg,19%)。1H NMR(400MHz,DMSO,30℃)2.05(1H,dt),2.27(1H,dt),2.42(3H,s),3.25(3H,s),3.46(1H,dd),3.5−3.61(4H,m),3.74(1H,dd),4.04(2H,t),4.28−4.41(2H,m),4.85(1H,s),6.39(1H,dd),6.55(1H,s),6.77(1H,d),6.82(1H,d),7.15(1H,t),7.22(1H,d),7.58(1H,d),12.09(1H,s).m/z:ES+[M+H]+511.
実施例13(a)および13(b)
(2S)−2−メトキシ−2−[3−(3−メトキシアゼチジン−1−イル)フェニル]−N−[5−[[(3R)−1−(1,2,4−トリアジン−3−イル)ピロリジン−3−イル]アミノ]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]アセトアミドおよび(2R)−2−メトキシ−2−[3−(3−メトキシアゼチジン−1−イル)フェニル]−N−[5−[[(3R)−1−(1,2,4−トリアジン−3−イル)ピロリジン−3−イル]アミノ]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]アセトアミド
2−メトキシ−2−[3−(3−メトキシアゼチジン−1−イル)フェニル]アセチル]オキシリチウム(中間体24、0.12g、0.475ミリモル)およびN2−[(3R)−1−(1,2,4−トリアジン−3−イル)ピロリジン−3−イル]−1,3,4−チアジアゾール−2,5−ジアミン(中間体12、0.13g、0.475ミリモル)を丸底フラスコ中で秤量した。DMF(3mL)およびDIPEA(0.15g、1.187ミリモル)、次いでHATU(0.18g、0.475ミリモル)を添加し、得られた溶液をN
2下、室温で15時間撹拌しておいた。反応混合物をSCXカートリッジに添加し、MeOHで洗浄し、次にMeOH中2M NH
3で溶出した。塩基性画分を低圧下で蒸発させ、残渣を分取HPLC(SunFire C18カラム、5μm、50mm×19mm、25mL/分)により精製した。減少する極性比率の0.1%ギ酸を含有する水およびMeCNを移動相として用いた。所望される質量を含有する画分を低圧下で蒸発させ、ジアステレオ異性体の混合物をオレンジガム状物として得た。ジアステレオ異性体を分取キラルHPLC(Lux C1カラム、5μm、21mm×250mm、21mL/分での0.1%NH
3を含有する20:80のヘプタン:EtOHの溶出剤)により分離し、次を得た。
第1溶出異性体の実施例13(a) 2−メトキシ−2−[3−(3−メトキシアゼチジン−1−イル)フェニル]−N−[5−[[(3R)−1−(1,2,4−トリアジン−3−イル)ピロリジン−3−イル]アミノ]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]アセトアミド(55.2mg,16.5%)。1H NMR(400MHz,DMSO−d6,30℃)δ 2.09(1H,s),2.30(1H,d),3.24(3H,s),3.29(3H,s),3.53−3.90(6H,m),4.03(2H,tt),4.27−4.42(2H,m),4.86(1H,s),6.40(1H,ddd),6.55(1H,s),6.74− 6.80(1H,m),7.15(1H,t),7.70(1H,d),8.32(1H,d),8.61(1H,d),12.17(1H,s).m/z:ES+[M+H]+498.
第2溶出異性体の実施例13(b) 2−メトキシ−2−[3−(3−メトキシアゼチジン−1−イル)フェニル]−N−[5−[[(3R)−1−(1,2,4−トリアジン−3−イル)ピロリジン−3−イル]アミノ]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]アセトアミド(54.2mg,13.7%)。1H NMR(400MHz,DMSO−d6,30℃)δ 1.98−2.08(1H,m),2.19−2.28 (1H,m),3.18(3H,s),3.22(3H,s),3.47−3.84(6H,m),3.93−4.02(2H,m),4.21−4.36(2H,m),4.80(1H,s),6.34(1H,ddd),6.49(1H,s),6.67−6.74(1H,m),7.09(1H,t),7.64(1H,d),8.26(1H,d),8.55(1H,d),12.11(1H,s).m/z:ES+[M+H]+498.
実施例14(a)および14(b)
(2S)−2−[3−(3,3−ジフルオロアゼチジン−1−イル)フェニル]−2−メトキシ−N−[5−[[(3R)−1−(1,2,4−トリアジン−3−イル)ピロリジン−3−イル]アミノ]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]アセトアミドおよび(2R)−2−[3−(3,3−ジフルオロアゼチジン−1−イル)フェニル]−2−メトキシ−N−[5−[[(3R)−1−(1,2,4−トリアジン−3−イル)ピロリジン−3−イル]アミノ]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]アセトアミド
N2−[(3R)−1−(1,2,4−トリアジン−3−イル)ピロリジン−3−イル]−1,3,4−チアジアゾール−2,5−ジアミン(中間体12、0.06g、0.232ミリモル)、[2−[3−(3,3−ジフルオロアゼチジン−1−イル)フェニル]−2−メトキシ−アセチル]オキシリチウム(中間体21、0.06g、0.232ミリモル)を丸底フラスコ中で秤量した。DMF(2mL)およびDIPEA(0.1mL、0.579ミリモル)、次いでHATU(0.09g、0.232ミリモル)を添加し、得られた溶液を室温で15時間撹拌しておいた。反応混合物をSCXカートリッジに添加し、MeOHで洗浄し、次にMeOH中2M NH
3で溶出した。塩基性画分を低圧下で蒸発させ、残渣を分取HPLC(SunFire C18カラム、5μm、50mm×19mm、25mL/分)により精製した。減少する極性比率の0.1%ギ酸を含有する水およびMeCNを移動相として用いた。溶媒を低圧下で除去し、ジアステレオ異性体の混合物をクリーム状固体として得た。ジアステレオ異性体をキラル分取HPLC(Amy Cカラム、5μm、20mm×250mm、21mL/分での0.1%NH
3を含有する20:80のヘプタン:EtOHの溶出剤)により分離し、次を得た。
第1溶出異性体の実施例14(a) 2−[3−(3,3−ジフルオロアゼチジン−1−イル)フェニル]−2−メトキシ−N−[5−[[(3R)−1−(1,2,4−トリアジン−3−イル)ピロリジン−3−イル]アミノ]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]アセトアミド(22.1mg,18.9%)。1H NMR(400MHz,DMSO−d6,30℃)δ 2.02−2.12(1H,m),2.23−2.34(1H,m),3.29(3H,s),3.77(4H,s),4.20−4.42(5H,m),4.89(1H,s),6.49−6.57(1H,m),6.67(1H,t),6.86−6.92(1H,m),7.22(1H,t),7.67(1H,d),8.32(1H,d),8.61(1H,d),12.19(1H,s).m/z:ES+[M+H]+504.
第2溶出異性体の実施例14(b) 2−[3−(3,3−ジフルオロアゼチジン−1−イル)フェニル]−2−メトキシ−N−[5−[[(3R)−1−(1,2,4−トリアジン−3−イル)ピロリジン−3−イル]アミノ]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]アセトアミド(20.8mg,17.8%)。1H NMR(400MHz,DMSO−d6,30℃)δ 2.02−2.13(1H,m),2.24−2.35(1H,m),3.29(3H,s),3.77(4H,s),4.20−4.42(5H,m),4.89(1H,s),6.50−6.56(1H,m),6.65−6.69(1H,m),6.86−6.91(1H,m),7.22(1H,t),7.69(1H,d),8.31(1H,d),8.61(1H,d),12.19(1H,s).m/z:ES+[M+H]+504.
実施例15(a)および15(b)
(2S)−2−[3−(3−フルオロアゼチジン−1−イル)フェニル]−2−メトキシ−N−[5−[[(3R)−1−(1,2,4−トリアジン−3−イル)ピロリジン−3−イル]アミノ]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]アセトアミドおよび(2R)−2−[3−(3−フルオロアゼチジン−1−イル)フェニル]−2−メトキシ−N−[5−[[(3R)−1−(1,2,4−トリアジン−3−イル)ピロリジン−3−イル]アミノ]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]アセトアミド
N2−[(3R)−1−(1,2,4−トリアジン−3−イル)ピロリジン−3−イル]−1,3,4−チアジアゾール−2,5−ジアミン(中間体12、0.05g、0.17ミリモル)、[2−[3−(3−フルオロアゼチジン−1−イル)フェニル]−2−メトキシ−アセチル]オキシリチウム(中間体17、0.04g、0.17ミリモル)を丸底フラスコ中で秤量した。DMF(2mL)およびHATU(0.06g、0.17ミリモル)、次いでDIPEA(0.07mL、0.426ミリモル)を添加し、得られた溶液を室温で15時間撹拌しておいた。反応混合物をSCXカートリッジに添加し、MeOHで洗浄し、次にMeOH中2M NH
3で溶出した。塩基性画分を低圧下で蒸発させ、残渣を分取HPLC(SunFire C18カラム、5μm、50mm×19mm、25mL/分)により精製した。減少する極性比率の0.1%ギ酸を含有する水およびMeCNを移動相として用いた。溶媒を低圧下で除去し、ジアステレオ異性体の混合物をクリーム状固体として得た。ジアステレオ異性体を分取キラルHPLC(Amy−Cカラム、5μm、20mm×250mm、21mL/分での0.1%NH
3を含有する20:80のヘプタン:EtOHの溶出剤)により分離し、次を得た。
第1溶出異性体の実施例15(a) 2−[3−(3−フルオロアゼチジン−1−イル)フェニル]−2−メトキシ−N−[5−[[(3R)−1−(1,2,4−トリアジン−3−イル)ピロリジン−3−イル]アミノ]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]アセトアミド(17.9mg,21.7%)。1H NMR(400MHz,DMSO−d6,30℃)δ 2.04−2.13(1H,m),2.23−2.35(1H,m),3.28(3H,s),3.47− 3.94(6H,m),4.06−4.20(2H,m),4.35(1H,s),4.84(1H,s),5.55(1H,tt),6.39−6.46(1H,m),6.58(1H,t),6.80(1H,dt),7.16(1H,t),7.62(1H,s),8.31(1H,d),8.60(1H,d),12.18(1H,s).m/z:ES+[M+H]+486.
第2溶出異性体の実施例15(b) 2−[3−(3−フルオロアゼチジン−1−イル)フェニル]−2−メトキシ−N−[5−[[(3R)−1−(1,2,4−トリアジン−3−イル)ピロリジン−3−イル]アミノ]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]アセトアミド(19mg,23%)。1H NMR(400MHz,DMSO−d6,30℃)δ 2.03−2.13(1H,m),2.23−2.34(1H,m),3.28(s,3H),3.50−3.93(6H,m),4.08−4.21(2H,m),4.36(1H,s),4.87(1H,s),5.38−5.58(1H,m),6.41−6.46(1H,m),6.58(1H,t),6.77−6.83(1H,m),7.17(1H,t),7.68(1H,d),8.32(1H,d),8.61(1H,d),12.18(1H,s).m/z:ES+[M+H]+486.
実施例16(a)および16(b)
(2S)−2−(3,5−ジメトキシフェニル)−2−メトキシ−N−[5−[[(3R)−1−(1,2,4−トリアジン−3−イル)ピロリジン−3−イル]アミノ]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]アセトアミドおよび(2R)−2−(3,5−ジメトキシフェニル)−2−メトキシ−N−[5−[[(3R)−1−(1,2,4−トリアジン−3−イル)ピロリジン−3−イル]アミノ]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]アセトアミド
DIPEA(0.1mL、0.568ミリモル)を、DMF(3mL)中、2−(3,5−ジメトキシフェニル)−2−メトキシ−酢酸(中間体28、0.13g、0.568ミリモル)およびN2−[(3R)−1−(1,2,4−トリアジン−3−イル)ピロリジン−3−イル]−1,3,4−チアジアゾール−2,5−ジアミン(中間体12、0.15g、0.568ミリモル)に添加した。HATU(0.22g、0.568ミリモル)を溶液に添加し、反応混合物を窒素下、室温で24時間撹拌しておいた。溶媒を低圧下で除去し、暗いオレンジ油を得て、それをDCMに溶解し、シリカ上に吸収させ、FCC(SiO
2、DCM中MeOH1〜10%)により精製した。純粋画分を結合させ、溶媒を低圧下で除去し、暗いオレンジ油を得て、それを分取HPLC(SunFire C18カラム、5μm、50mm×19mm、流速25mL/分)によりさらに精製した。減少する極性比率の0.1%ギ酸を含有する水およびMeCNを移動相として用いた。純粋画分を結合させ、低圧下で蒸発させ、2gのSCXカラムに通過させ、MeOHで洗浄し、次にMeOH中2N NH
3で溶出した。塩基性画分を蒸発させて乾燥し、ジアステレオ異性体の混合物をオフホワイト泡状物として得た(132mg)。ジアステレオ異性体を分取HPLC(Lux C4カラム、5μm、20mm×250mm、21mL/分でのジエタノールアミン修飾因子を含有する溶出剤MeOH)により分離した。分離したジアステレオ異性体DCMに溶解し、水で洗浄し、有機層を蒸発させ、次を得た。
第1溶出異性体の実施例16(a) 2−(3,5−ジメトキシフェニル)−2−メトキシ−N−[5−[[(3R)−1−(1,2,4−トリアジン−3−イル)ピロリジン−3−イル]アミノ]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]アセトアミド(23.2mg,8.6%)。1H NMR(400MHz,DMSO−d6,21℃)δ 2.09(1H,d)2.30(1H,dd),3.30(3H,d),3.74(6H,s),3.55−3.91(4H,m),4.38(1H,s),4.89(1H,s),6.47(1H,t),6.64(2H,d),7.71(1H,d),8.32(1H,d),8.61(1H,d),12.17(1H,s).m/z:ES+[M+H]+472.
第2溶出異性体の実施例16(b) 2−(3,5−ジメトキシフェニル)−2−メトキシ−N−[5−[[(3R)−1−(1,2,4−トリアジン−3−イル)ピロリジン−3−イル]アミノ]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]アセトアミド(28.3mg,10.5%)。1H NMR(400MHz,DMSO−d6,21℃)δ 2.12(1H,s),2.31(1H,d),3.33(3H,s),3.60−3.73(3H,m),3.77(6H,s),3.80−3.89(1H,m),4.40(1H,s),4.92(1H,s),6.50(1H,t),6.67(2H,d),7.73(1H,d),8.35(1H,d),8.64(1H,d),12.19(1H,s).m/z:ES+[M+H]+472.
実施例17(a)および17(b)
(2S)−[3−(ジフルオロメトキシ)フェニル]−2−エトキシ−N−[5−[[(3R)−1−ピリダジン−3−イルピロリジン−3−イル]アミノ]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]アセトアミドおよび(2R)−[3−(ジフルオロメトキシ)フェニル]−2−エトキシ−N−[5−[[(3R)−1−ピリダジン−3−イルピロリジン−3−イル]アミノ]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]アセトアミド
2−[3−(ジフルオロメトキシ)フェニル]−2−エトキシ−酢酸(中間体47、0.14g、0.57ミリモル)およびN2−[(3R)−1−ピリダジン−3−イルピロリジン−3−イル]−1,3,4−チアジアゾール−2,5−ジアミン(中間体1、0.15g、0.57ミリモル)を丸底フラスコ中で秤量した。DMF(3mL)およびDIPEA(0.18g、1.424ミリモル)、次いでHATU(0.22g、0.57ミリモル)を添加し、得られた溶液をN
2下、室温で3時間撹拌しておいた。溶媒を低圧下で除去した。残留ガム状物をDCMに溶解し、シリカ上に吸収させ、FCC(SiO
2、DCM中MeOH1〜8%)により精製した。低圧下での純粋画分蒸発により、黄色ガム状物を得て、それを分取キラルSFC(Amy−Cカラム、5μm、20mm×250mm、修飾因子として40%NH
3を含有する溶出剤MeOH/CO
2。流速は210nmの波長で50mL/分であった)により分離し、次を得た。
第1溶出異性体の実施例17(a) [3−(ジフルオロメトキシ)フェニル]−2−エトキシ−N−[5−[[(3R)−1−ピリダジン−3−イルピロリジン−3−イル]アミノ]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]アセトアミド(23mg,8.2%)。1H NMR(400MHz,DMSO−d6,30℃)δ 1.19(3H,t),2.02−2.10(1H,m),2.21−2.36(1H,m),3.37−3.63(5H,m),3.74(1H,dd),4.40−4.36(1H,m),5.12(1H,s),6.87(1H,dd),7.16(1H,dd),7.25(1H,t),7.28−7.29(1H,m),7.30−7.38(2H,m),7.45(1H,t),7.72(1H,d),8.48(1H,dd),12.27(1H,s).m/z:ES+[M+H]+492.
第2溶出異性体の実施例17(b) [3−(ジフルオロメトキシ)フェニル]−2−エトキシ−N−[5−[[(3R)−1−ピリダジン−3−イルピロリジン−3−イル]アミノ]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]アセトアミド(0.025g、8.9%)。1H NMR(400MHz,DMSO−d6,30℃)δ 1H NMR(400MHz,DMSO−d6)δ 1.19(3H,t),2.03−2.10(1H,m),2.24−2.32(1H,m),3.38−3.62(5H,m),3.74(1H,dd),4.36−4.40(1H,m),5.12(1H,s),6.86(1H,dd),7.16(1H,t),7.24(1H,t),7.26−7.38(3H,m),7.45(1H,t),7.72(1H,d),8.48(1H,dd),12.27(1H,s).m/z:ES+[M+H]+492.
実施例18(a)および18(b)
(2S)−2−メトキシ−2−[3−(オキセタン−3−イル)フェニル]−N−[5−[[(3R)−1−ピリダジン−3−イルピロリジン−3−イル]アミノ]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]アセトアミドおよび(2R)−2−メトキシ−2−[3−(オキセタン−3−イル)フェニル]−N−[5−[[(3R)−1−ピリダジン−3−イルピロリジン−3−イル]アミノ]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]アセトアミド
HATU(520mg、1.37ミリモル)を、N
2下、21℃でDMF(8mL)中、N2−[(3R)−1−ピリダジン−3−イルピロリジン−3−イル]−1,3,4−チアジアゾール−2,5−ジアミン(中間体1、300mg、1.14ミリモル)、2−メトキシ−2−[3−(オキセタン−3−イル)フェニル]酢酸(中間体48、304mg、1.37ミリモル)およびDIPEA(0.198mL、1.14ミリモル)に添加した。得られた溶液を21℃で2時間撹拌した。粗生成物を、SCXカラムを用いるイオン交換クロマトグラフィーにより精製した。所望される生成物をMeOH中1M NH
3を用いてカラムから溶出し、純粋画分を蒸発させた。粗生成物をFCC(SiO
2、EtOAc中MeOH中1M NH
30〜15%)により精製した。純粋画分を蒸発させて乾燥し、固体を得た。粗生成物を分取HPLC(Waters XBridge OBD C18カラム、5μm、30mm×100mm)により精製した。1%NH
4OHを含有する水およびMeCNの減少する極性の混合物を移動相として用いた。所望される化合物を含有する画分を蒸発させて乾燥し、生成物をジアステレオ異性体の混合物として得た。ジアステレオ異性体を分取HPLC(Phenomenex Lux C4カラム、20μm、50mm×250mm、120mL/分での50/50のMeOH/IPA)により分離し、次を得た。
第1溶出異性体の実施例18(a) 2−メトキシ−2−[3−(オキセタン−3−イル)フェニル]−N−[5−[[(3R)−1−ピリダジン−3−イルピロリジン−3−イル]アミノ]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]アセトアミド(45mg,8%)。1H NMR(400MHz,DMSO,30℃)δ 2.12(1H,td),2.23−2.40(1H,m),3.38(3H,s),3.46−3.69(3H,m),3.74−3.86(1H,m),4.26−4.35(1H,m),4.41−4.50(1H,m),4.65(2H,ddd),4.90−5.11(3H,m),6.91(1H,dd),7.27−7.49(4H,m),7.57(1H,s),7.70(1H,d),8.53(1H,dd),12.24(1H,s).m/z:ES+[M+H]+468.
第2溶出異性体の実施例18(b) 2−メトキシ−2−[3−(オキセタン−3−イル)フェニル]−N−[5−[[(3R)−1−ピリダジン−3−イルピロリジン−3−イル]アミノ]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]アセトアミド(38mg,7%)。1H NMR(400MHz,DMSO,30℃)δ 2.12(1H,td),2.23−2.40(1H,m),3.38(3H,s),3.46−3.69(3H,m),3.74−3.86(1H,m),4.26−4.35(1H,m),4.41−4.50(1H,m),4.65(2H,ddd),4.90−5.11(3H,m),6.91(1H,dd),7.27−7.49(4H,m),7.57(1H,s),7.70(1H,d),8.53(1H,dd),12.24(1H,s).m/z:ES+[M+H]+468.
実施例19(a)および19(b)
(2S)−2−エトキシ−N−[5−[[(3R)−1−ピリダジン−3−イルピロリジン−3−イル]アミノ]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]−2−[3−(トリフルオロメトキシ)フェニル]アセトアミドおよび(2R)−2−エトキシ−N−[5−[[(3R)−1−ピリダジン−3−イルピロリジン−3−イル]アミノ]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]−2−[3−(トリフルオロメトキシ)フェニル]アセトアミド
DIPEA(0.15mL、0.85ミリモル)、HATU(260mg、0.68ミリモル)および2−エトキシ−2−[3−(トリフルオロメトキシ)フェニル]酢酸(中間体51、180mg、0.68ミリモル)を、DMF(4mL)中N2−[(3R)−1−ピリダジン−3−イルピロリジン−3−イル]−1,3,4−チアジアゾール−2,5−ジアミン(中間体1、150mg、0.57ミリモル)の溶液に添加した。混合物を室温で18時間撹拌した。次にこれを水(5mL)で希釈し、次にDCM(10mL)で抽出し、蒸発させ、分取HPLC(XBridge OBD C18カラム、5μm、50mm×19mm、流速は25mL/分であった)により精製した。減少する極性比率の、0.3mL/LのNH
4OHを含有する水およびMeCNを移動相として用いた。純粋画分を蒸発させ、SCXカートリッジに通過させ、MeOHで洗浄し、次にMeOH中2M NH
3で溶出した。塩基性画分を蒸発させ、真空で乾燥し、生成物をジアステレオ異性体の混合物として得た。次にジアステレオ異性体をHPLC(Lux C4カラム、5μm、20mm×250mm、NH
3修飾因子を含有するMeOH、21mL/分)により分離し、次を得た。
第1溶出異性体の実施例19(a) 2−エトキシ−N−[5−[[(3R)−1−ピリダジン−3−イルピロリジン−3−イル]アミノ]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]−2−[3−(トリフルオロメトキシ)フェニル]アセトアミド(46mg,16%)。1H NMR(400MHz,DMSO−d6,21℃)δ 1.19(3H,t),1.97−2.15(1H,m),2.18−2.36(1H,m),3.40−3.65(5H,m),3.65−3.81(1H,m),4.32−4.46(1H,m),5.17(1H,s),6.87(1H,dd),7.28−7.40(2H,m),7.40−7.59(3H,m),7.74(1H,d),8.48(1H,dd),12.32(1H,s).m/z:ES+[M+H]+510.
第2溶出異性体の実施例19(b) 2−エトキシ−N−[5−[[(3R)−1−ピリダジン−3−イルピロリジン−3−イル]アミノ]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]−2−[3−(トリフルオロメトキシ)フェニル]アセトアミド(39mg,14%)。1H NMR(400MHz,DMSO−d6,21℃)δ 1.19(3H,t),2.06(1H,m),2.20−2.35(1H,m),3.39−3.63(5H,m),3.74(1H,m),4.34−4.44(1H,m),5.17(1H,s),6.88(1H,dd),7.28−7.41(2H,m),7.42−7.58(3H,m),7.73(1H,d),8.48(1H,d),12.32(1H,s).m/z:ES+[M+H]+510.
実施例20(a)および20(b)
(2R)−2−[4−フルオロ−3−(トリフルオロメトキシ)フェニル]−2−メトキシ−N−[5−[[(3R)−1−ピリダジン−3−イルピロリジン−3−イル]アミノ]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]アセトアミドおよび(2S)−2−[4−フルオロ−3−(トリフルオロメトキシ)フェニル]−2−メトキシ−N−[5−[[(3R)−1−ピリダジン−3−イルピロリジン−3−イル]アミノ]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]アセトアミド
DIPEA(0.12mL、0.71ミリモル)、HATU(216mg、0.568ミリモル)および2−[4−フルオロ−3−(トリフルオロメトキシ)フェニル]−2−メトキシ−酢酸(中間体52、0.13g、0.474ミリモル)を、DMF(4mL)中、N2−[(3R)−1−ピリダジン−3−イルピロリジン−3−イル]−1,3,4−チアジアゾール−2,5−ジアミン(中間体1、0.12g、0.474ミリモル)の溶液に添加した。混合物を室温で18時間撹拌した。次にこれを水(5mL)で希釈し、DCM(10mL)中に抽出し、蒸発させ、分取HPLC(SunFire C18カラム、5μm、50mm×19mm、25mL/分)により精製した。減少する極性比率の0.1%ギ酸を含有する水およびMeCNを移動相として用いた。純粋画分を、SCXカートリッジに通過させ、MeOHで洗浄し、次にMeOH中2M NH
3で溶出した。塩基性画分を蒸発させた。その材料を分取HPLC(XBridge OBD C18カラム、5μm、50mm×19mm、流速25mL/分)により再精製した際、不純物もさらに認められた。減少する極性比率の0.3mL/LのNH
4OHを含有する水およびMeCNを移動相として用いた。純粋画分を蒸発させて乾燥し、ジアステレオ異性体の混合物を分取キラルHPLC(Phenomenex Lux C2カラム、20μm、50mm×250mm、110mL/分での溶出剤MeOH)により分離し、次を得た。
第1溶出異性体の実施例20(a) 2−[4−フルオロ−3−(トリフルオロメトキシ)フェニル]−2−メトキシ−N−[5−[[(3R)−1−ピリダジン−3−イルピロリジン−3−イル]アミノ]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]アセトアミド(18.4mg,7.5%)。1H NMR(400MHz,DMSO−d6,22℃)2.06(1H,dq),2.28(1H,dt),3.34(3H,s),3.45−3.60(3H,m),3.75(1H,dd),4.34−4.42(1H,m),5.03(1H,s),6.87(1H,dd),7.33(1H,dd),7.51−7.57(2H,m),7.60−7.69(2H,m),8.48(1H,dd),12.35(1H,s).m/z:ES+[M+H]+514.
第2溶出異性体の実施例20(b) 2−[4−フルオロ−3−(トリフルオロメトキシ)フェニル]−2−メトキシ−N−[5−[[(3R)−1−ピリダジン−3−イルピロリジン−3−イル]アミノ]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]アセトアミド(19.2mg,7.9%)。1H NMR(400MHz,DMSO−d6,22℃)2.07(1H,dd),2.28(1H,dt),3.49(1H,d),3.53−3.60(2H,m),3.74(1H,dd),4.33−4.43(1H,m),5.04(1H,s),6.87(1H,d),7.33(1H,dd),7.52−7.57(2H,m),7.63(1H,d),7.68(1H,d),8.48(1H,d),12.35(1H,s).m/z:ES+[M+H]+514.
実施例21(a)および21(b)
(2S)−2−(3,5−ジメトキシフェニル)−2−メトキシ−N−[5−[[(3R)−1−ピリダジン−3−イルピロリジン−3−イル]アミノ]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]アセトアミドおよび(2R)−2−(3,5−ジメトキシフェニル)−2−メトキシ−N−[5−[[(3R)−1−ピリダジン−3−イルピロリジン−3−イル]アミノ]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]アセトアミド
HATU(433mg、1.14ミリモル)を、窒素下、21℃でDMF(8mL)中、2−(3,5−ジメトキシフェニル)−2−メトキシ−酢酸(中間体28、215mg、0.95ミリモル)、N2−[(3R)−1−ピリダジン−3−イルピロリジン−3−イル]−1,3,4−チアジアゾール−2,5−ジアミン(中間体1、250mg、0.95ミリモル)およびDIPEA(0.332mL、1.90ミリモル)に添加した。得られた溶液を21℃で2時間撹拌した。粗生成物を、SCXカラムを用いてイオン交換クロマトグラフィーにより精製した。所望される生成物を1M NH
3/MeOHを用いてカラムから溶出し、純粋画分を蒸発させて乾燥し、粗生成物を得た。粗生成物をフラッシュシリカクロマトグラフィーにより精製した(溶出勾配0〜12%のDCM中1M NH
3/MeOH)。純粋画分を蒸発させて乾燥し、ベージュ泡状物を得た。LCMSは、9%の化学不純物を示した。粗生成物をフラッシュシリカクロマトグラフィーによりさらに精製した(溶出勾配0〜8%のDCM中MeOH)。純粋画分を蒸発させて乾燥し、生成物をジアステレオ異性体の混合物として得た(180mg)。
ジアステレオ異性体を分取HPLC(Luc C4カラム、20μmのシリカ、50mmの直径、250mmの長さ、100%MeOH、120mL/分)により分離した。分離したジアステレオ異性体をDCMに溶解し、水で洗浄し、有機層を蒸発させ、次を得た。
第1溶出異性体としての実施例21(a)(固体、74mg、16%)。1H NMR(400MHz,DMSO,27℃)δ 2.06(1H,m),2.21−2.38(1H,m),3.30(9H,d),3.41−3.62(3H,m),4.28−4.47(1H,m),4.87(1H,s),6.46(1H,t),6.63(2H,s),6.85(1H,d),7.31(1H,dd),7.65(1H,d),8.47(1H,dd),12.13(1H,s).m/z:ES+[M+H]+472.
第2溶出異性体としての実施例21(b)(固体、75mg、17%)。1H NMR(400MHz,DMSO,27℃)δ 2.06(1H,m),2.21−2.38(1H,m),3.30(9H,d),3.41−3.62(3H,m),4.28−4.47(1H,m),4.87(1H,s),6.46(1H,t),6.63(2H,s),6.85(1H,d),7.31(1H,dd),7.65(1H,d),8.47(1H,dd),12.13(1H,s).m/z:ES+[M+H]+472.
実施例22(a)および22(b)
(2S)−2−エトキシ−2−[3−(3−メトキシアゼチジン−1−イル)フェニル]−N−[5−[[(3R)−1−ピリダジン−3−イルピロリジン−3−イル]アミノ]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]アセトアミドおよび(2R)−2−エトキシ−2−[3−(3−メトキシアゼチジン−1−イル)フェニル]−N−[5−[[(3R)−1−ピリダジン−3−イルピロリジン−3−イル]アミノ]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]アセトアミド
HATU(0.13g、0.332ミリモル)およびN2−[(3R)−1−ピリダジン−3−イルピロリジン−3−イル]−1,3,4−チアジアゾール−2,5−ジアミン(中間体1、0.07g、0.276ミリモル)を、N
2下、室温でDMF(2mL)に溶解した。混合物を、DIPEA(0.07mL、0.414ミリモル)および2−エトキシ−2−[3−(3−メトキシアゼチジン−1−イル)フェニル]酢酸リチウム(中間体56、0.07g、0.276ミリモル)の添加前5分間撹拌し、次に室温で一晩撹拌しておいた。粗混合物を5gのSCXカラムに通過させ、MeOHで洗浄し、次にMeOH中2N NH
3で溶出した。塩基性画分を蒸発させ、不純生成物をオレンジガム状物として得て、それを分取HPLC(SunFire C18カラム、5μm、50mm×19mm、25mL/分)により精製した。減少する極性比率の0.1%ギ酸を含有する水およびMeCNを移動相として用いた。所望される質量を含有する画分を結合させ、蒸発させ、5gのSCXカラムに通過させ、MeOHで洗浄し、次にMeOH中2N NH
3で溶出した。溶媒を真空で除去し、ジアステレオ異性体の混合物を得て、それを120mL/分で50/50のEtOH/MeOHでの分取キラルHPLC(Phenomenex Lux C4カラム、20μmのシリカ、50mmの直径、250mmの長さ)により分離した。所望される化合物を含有する画分を蒸発させて乾燥し、次を得た。
第1溶出異性体としての実施例22(a)(固体、21.4mg、15%)。
第2溶出異性体としての実施例22(b)(固体、20.4mg、14%)。
さらなる実施例
以下の実施例の化合物を、上の実施例に類似する様式で調製した。
実施例45(a)および45(b)
(2S)−3−メトキシ−N−[5−[[(3R)−1−(6−メチルピリダジン−3−イル)ピロリジン−3−イル]アミノ]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]−2−フェニル−プロパンアミドおよび(2R)−3−メトキシ−N−[5−[[(3R)−1−(6−メチルピリダジン−3−イル)ピロリジン−3−イル]アミノ]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]−2−フェニル−プロパンアミド
N2−[(3R)−1−(6−メチルピリダジン−3−イル)ピロリジン−3−イル]−1,3,4−チアジアゾール−2,5−ジアミン(中間体6、0.11g、0.389ミリモル)および3−メトキシ−2−フェニル−プロパン酸(0.08g、0.433ミリモル)を、N
2下、室温でDMF(2mL)に溶解した。混合物を、DIPEA(0.34mL、1.943ミリモル)、およびヘキサフルオロリン酸N−[(ジメチルアミノ)(3H−[1,2,3]トリアゾロ[4,5−b]ピリジン−3−イルオキシ)メチリデン]−N−メチルメチルアミニウム、HATU(0.4mL、0.361ミリモル)の添加前5分間撹拌し、次に室温で一晩静置状態にした。粗混合物を5gのSCX−2カラムに通過させ、MeOHで洗浄し、次にMeOH中2M NH
3で溶出した。純粋画分を結合させ、溶媒を低圧下で除去し、残渣を分取HPLC(SunFire C18カラム、5μm、50mm×19mm、25mL/分の流速)によりさらに精製した。減少する極性比率の0.1%ギ酸を含有する水およびMeCNを移動相として用いた。純粋画分を結合させ、低圧下で蒸発させ、SCX−2カラムに通過させ、MeOHで洗浄し、次にMeOH中2M NH
3で溶出した。塩基性画分を蒸発させて乾燥し、ジアステレオ異性体の混合物を淡黄色固体として得た。ジアステレオ異性体を、120mL/分で溶出剤としてMeCN/MeOHの95/5混合物を用いる分取HPLC(Phenomonex Lux C1カラム、20μmのシリカ、50mmの直径、250mmの長さ)により分離した。所望される化合物を含有する画分を蒸発させて乾燥し、次を得た。
第1溶出異性体の実施例45(a) 3−メトキシ−N−[5−[[(3R)−1−(6−メチルピリダジン−3−イル)ピロリジン−3−イル]アミノ]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]−2−フェニル−プロパンアミド(31.7mg,20%)。1H NMR(400MHz,DMSO,30℃)1.95−2.12(1H,m),2.21−2.35(1H,m),2.42(3H,s),3.26(3H,s),3.4−3.63(4H,m),3.74(1H,dd),3.98(1H,t),4.12(1H,dd),4.31−4.43(1H,m),6.82(1H,d),7.15−7.46(6H,m),7.62(1H,d),12.18(1H,s).m/z:ES+[M+H]+440
第2溶出異性体の実施例45(b) 3−メトキシ−N−[5−[[(3R)−1−(6−メチルピリダジン−3−イル)ピロリジン−3−イル]アミノ]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]−2−フェニル−プロパンアミド(28.3mg,18%)。1H NMR(400MHz,DMSO,30℃)1.99−2.12(1H,m),2.2−2.36(1H,m),2.41(3H,s),3.26(3H,s),3.39−3.62(4H,m),3.73(1H,dd),3.98(1H,t),4.12(1H,dd),4.31−4.42(1H,m),6.82(1H,d),7.17−7.46(5H,m),7.62(1H,d),12.19(1H,s).m/z:ES+[M+H]+440.
さらなる実施例
以下の実施例の化合物を、上の実施例に類似する様式で調製した。
中間体1
N’−[(3R)−1−ピリダジン−3−イルピロリジン−3−イル]−1,3,4−チアジアゾール−2,5−ジアミン
1Lの丸底フラスコ内に、DMF(400mL)中の(3R)−1−ピリダジン−3−イルピロリジン−3−アミンジヒドロクロリド(中間体2、10.5g、44.29ミリモル)、5−ブロモ−1,3,4−チアジアゾール−2−アミン(7.94g、44.10ミリモル)およびDIPEA(17.07g、132.08ミリモル)の溶液を入れた。溶液を80℃で4時間撹拌した。得られた混合物を真空で濃縮した。粗生成物をエタノール/EtOAcからの再結晶化により精製し、N’−[(3R)−1−ピリダジン−3−イルピロリジン−3−イル]−1,3,4−チアジアゾール−2,5−ジアミンを淡黄色固体として得た(11g、94%)。1H NMR(500MHz,DMSO−d6,30℃)δ 2.04(1H,td),2.22−2.31(1H,m),3.43−3.62(3H,m),3.72(1H,dd),4.28(1H,dq),6.27(2H,s),6.86(1H,dd),7.07(1H,d),7.33(1H,dd),8.48(1H,dd).m/z:ES
+[M+H]
+264.28.
中間体1はまた、以下の代替手順に従って大規模に調製した。
(R)−1−(ピリダジン−3−イル)ピロリジン−3−アミン(中間体3、遊離塩基形態、25.5g、150.63ミリモル)および5−ブロモ−1,3,4−チアジアゾール−2−アミン(29.8g、165.70ミリモル)をDIPEA(39.4mL、225.95ミリモル)とともに、45℃でMeOH(200mL)中スラリーとして撹拌した。スラリーを20℃に冷却し、固体を真空濾過により単離した。50mLのMeOHをフィルターケーキの置換洗浄として用い、次にそれを40℃の真空乾燥器内で一晩乾燥させた。中間体1(32.9g、83%)を自由流動性ベージュ粉末として得た。
中間体2
(3R)−1−ピリダジン−3−イルピロリジン−3−アミンジヒドロクロリド
1Lの丸底フラスコ内に、ジオキサン(200mL)中、tert−ブチルN−[(3R)−1−ピリダジン−3−イルピロリジン−3−イル]カルバメート(中間体4、20g、75.66ミリモル)および濃縮HCl(100mL)の溶液を入れた。溶液を室温で30分間撹拌した。得られた混合物を真空で濃縮した。粗生成物を1:2の比でMeOH/EtOAcから再結晶化した。これにより、(3R)−1−ピリダジン−3−イルピロリジン−3−アミンジヒドロクロリドをオフホワイト固体として得た(13.4g,75%)。
1H NMR(300MHz,DMSO−d6,26℃)δ 2.25−2.43(2H,m),3.66−3.74(1H,m),3.78−3.90(3H,m),4.02−4.10(1H,m),7.75(1H,d),7.94(1H,dd),8.66(1H,d),8.77−8.98(3H,brm).m/z:ES
+[M+H]
+165.
中間体3(遊離塩基形態)を以下の手順に従って調製した。ピリジン(400mL)中のtert−ブチルN−[(3R)−1−(6−クロロピリダジン−3−イル)ピロリジン−3−イル]カルバメート(中間体5、20g、107.38ミリモル)を、炭素上パラジウム水酸化物(Pearlman触媒、27.5g、25.84ミリモル)およびMeOH(1375mL)中1−メチル−1,4−シクロヘキサジエン(31.0mL、276.13ミリモル)と混合した。次に反応混合物を65℃に90分間加熱した。完全な変換が認められると、反応物を冷却して環境温度に戻し、触媒を濾過により除去した。次に、MeOH中3M HCl(184mL、552.27ミリモル)を反応混合物に負荷し、溶液を65℃に1時間加熱した。完全な変換が認められると、反応溶液を冷却して環境温度に戻し、10×50gのSCXカラムに通過させた(それはMeOHで予備溶出した)。化合物を、MeOH中1M NH3を用いてSCXから放出させた。得られた溶液をトルエン(1L)で希釈し、回転蒸発を介して乾燥するまで濃縮し、自由流動性固体を得た。(3R)−1−ピリダジン−3−イルピロリジン−3−アミンを、遊離塩基として97%w/wの強度で単離した。
中間体4
tert−ブチルN−[(3R)−1−ピリダジン−3−イルピロリジン−3−イル]カルバメート
2Lの丸底フラスコ内に、MeOH(800mL)中のtert−ブチルN−[(3R)−1−(6−クロロピリダジン−3−イル)ピロリジン−3−イル]カルバメート(中間体5、23g、76.98ミリモル)および炭素上パラジウム(2g)の溶液を入れた。系を水素ガスでパージし、維持した。得られた溶液を室温で4時間撹拌した。固体を濾過除去した。得られた混合物を真空で濃縮し、tert−ブチルN−[(3R)−1−ピリダジン−3−イルピロリジン−3−イル]カルバメート(20g、84%)を黄色固体として得た。
1H NMR(300MHz,CDCl
3,24℃)δ 1.44(9H,s),2.25−2.35(2H,m),3.48−3.56(1H,m),3.70−4.10(3H,m),4.35−4.42(1H,m),7.26−7.32(1H,m),7.70−7.75(1H,m),8.53−8.55(1H,m).m/z:ES
+[M+H]
+265.
中間体5
tert−ブチルN−[(3R)−1−(6−クロロピリダジン−3−イル)ピロリジン−3−イル]カルバメート
1Lの丸底フラスコ内に、ピリジン(400mL)中のtert−ブチルN−[(3R)−ピロリジン−3−イル]カルバメート(20g、107.38ミリモル)および3,6−ジクロロピリダジン(16g、107.40ミリモル)の溶液を入れた。得られた溶液を加熱し、一晩還流させた。得られた混合物を真空で濃縮した。粗生成物を、1:3の比でのエタノール/Et
2Oからの再結晶化により精製し、tert−ブチルN−[(3R)−1−(6−クロロピリダジン−3−イル)ピロリジン−3−イル]カルバメート(23g、72%)を黄色固体として得た。
1H NMR(400MHz,CDCl
3,30℃)δ 1.45(9H,s),2.02(1H,dq),2.31(1H,td),3.41(1H,dd),3.54−3.70(2H,m),3.78(1H,dd),4.37(1H,s),4.76(1H,s),6.61(1H,d),7.17(1H,d).m/z:ES
+[M+H]
+299.
中間体6
N2−[(3R)−1−(6−メチルピリダジン−3−イル)ピロリジン−3−イル]−1,3,4−チアジアゾール−2,5−ジアミン
5−ブロモ−1,3,4−チアジアゾール−2−アミン(912mg、5.07ミリモル)、(3R)−1−(6−メチルピリダジン−3−イル)ピロリジン−3−アミン(中間体7、860mg、4.83ミリモル)およびDIPEA(0.924mL、5.31ミリモル)をDMF(10mL)に溶解した。反応物を100℃に1時間加熱し、次に室温で一晩放置した。粗生成物を、SCXカラムを用いてイオン交換クロマトグラフィーにより精製した。所望される生成物をMeOH中1M NH
3を用いてカラムから溶出し、純粋画分を蒸発させて乾燥し、粗生成物を得た。これをDCM/MeOHに溶解し、シリカに吸着させ、FCC(SiO
2、DCM中MeOH0〜20%)により精製した。純粋画分を蒸発させて乾燥し、N2−[(3R)−1−(6−メチルピリダジン−3−イル)ピロリジン−3−イル]−1,3,4−チアジアゾール−2,5−ジアミン(350mg,26%)を褐色ガム状物として得た。m/z:ES
+[M+H]
+278.
中間体7
(3R)−1−(6−メチルピリダジン−3−イル)ピロリジン−3−アミン
トリフルオロ酢酸(12mL)を、窒素下、21℃でDCM(60mL)中のtert−ブチルN−[(3R)−1−(6−メチルピリダジン−3−イル)ピロリジン−3−イル]カルバメート(中間体8、2.1g、7.54ミリモル)に添加した。得られた溶液を21℃で2時間撹拌した。粗生成物を、SCXカラムを用いてイオン交換クロマトグラフィーにより精製した。所望される生成物をMeOH中7M NH
3を用いてカラムから溶出し、純粋画分を蒸発させて乾燥し、(3R)−1−(6−メチルピリダジン−3−イル)ピロリジン−3−アミン(1.6g、119%)を、時間とともに凝固する黄色油として得た。
1H NMR(400MHz,DMSO−d6,27℃)δ 1.56−1.8(1H,m),2.04(1H,m),2.39(3H,s),3.07(1H,m),3.37−3.43(1H,m),3.47−3.66(3H,m),4.08(1H,s),6.73(1H,d),7.19(1H,d).m/z:ES
+[M+H]
+179.
中間体8
tert−ブチルN−[(3R)−1−(6−メチルピリダジン−3−イル)ピロリジン−3−イル]カルバメート
DIPEA(8.49mL、48.62ミリモル)、tert−ブチルN−[(3R)−ピロリジン−3−イル]カルバメート(3.62g、19.45ミリモル)、3−クロロ−6−メチルピリダジン(2.5g、19.45ミリモル)およびn−ブタノール(30mL)の混合物を130℃で12時間撹拌し、次に週末にかけて冷却放置した。反応混合物を蒸発させ、粗生成物をFCC(SiO
2、EtOAc中MeOH中1M NH
30〜10%)により精製した。純粋画分を蒸発させて乾燥し、tert−ブチルN−[(3R)−1−(6−メチルピリダジン−3−イル)ピロリジン−3−イル]カルバメート(2.1g、38.8%)を黄色固体として得た。
1H NMR(400MHz,DMSO−d6,27℃)δ 1.39(9H,s),1.88(1H,m),2.14(1H,m),2.40(3H,s),3.23(1H,m),3.37−3.45(1H,m),3.47−3.58(1H,m),3.61(1H,m),3.99−4.2(1H,m),6.77(1H,d),7.20(2H,m).m/z:ES
+[M+H]
+279.
中間体9
N2−[(3R)−1−(6−フルオロピリダジン−3−イル)ピロリジン−3−イル]−1,3,4−チアジアゾール−2,5−ジアミン
DIPEA(3.48mL、19.96ミリモル)を、室温で無水DMF(40mL)中の5−ブロモ−1,3,4−チアジアゾール−2−アミン(1.797g、9.98ミリモル)および(3R)−1−(6−フルオロピリダジン−3−イル)ピロリジン−3−アミン(中間体10、2g、10.98ミリモル)に添加した。得られた溶液を80℃で4時間撹拌した。粗生成物を、SCXカラムを用いてイオン交換クロマトグラフィーにより精製した。所望される生成物をMeOH中1M NH
3を用いてカラムから溶出し、純粋画分を蒸発させて乾燥し、N2−[(3R)−1−(6−フルオロピリダジン−3−イル)ピロリジン−3−イル]−1,3,4−チアジアゾール−2,5−ジアミン(2.9g、103%)を褐色固体として得た。
1H NMR(400MHz,DMSO−d6,30℃)δ 1.90−2.12(1H,m),2.23(1H,dtd),3.42(1H,dd),3.47−3.61(2H,m),3.69(1H,dd),4.25(1H,dq),6.25(2H,s),7.04(1H,d),7.14(1H,dd),7.33(1H,dd).m/z:ES
+[M+H]
+282.
中間体10
(3R)−1−(6−フルオロピリダジン−3−イル)ピロリジン−3−アミン
tert−ブチルN−[(3R)−1−(6−フルオロピリダジン−3−イル)ピロリジン−3−イル]カルバメート(中間体11、6g、21.25ミリモル)を、25℃でDCM(70mL)およびTFA(14.00mL)に添加した。得られた溶液を25℃で4時間撹拌した。粗生成物を、SCXカラムを用いてイオン交換クロマトグラフィーにより精製した。所望される生成物をMeOH中1M NH
3を用いてカラムから溶出し、純粋画分を蒸発させて乾燥し、(3R)−1−(6−フルオロピリダジン−3−イル)ピロリジン−3−アミン(2.0g、52%)を淡黄色ガム状固体として得た。
1H NMR(400MHz,DMSO−d6,30℃)δ 1.55−1.83(1H,m),1.98−2.13(1H,m),2.89−3.14(1H,m),3.29−3.43(1H,m),3.54(3H,ddt),7.06(1H,dd),7.30(1H,dd).m/z:ES
+[M+H]
+183.
中間体11
tert−ブチルN−[(3R)−1−(6−フルオロピリダジン−3−イル)ピロリジン−3−イル]カルバメート
3,6−ジフルオロピリダジン(6.06g、52.21ミリモル)、tert−ブチルN−[(3R)−ピロリジン−3−イル]カルバメート(9.72g、52.21ミリモル)、DIPEA(22.80mL、130.53ミリモル)およびn−ブタノール(140mL)の混合物を130℃で10時間撹拌した。反応混合物をEtOAc(750mL)で希釈し、水(150mL)で2回洗浄した。有機層をNa
2SO
4上で乾燥させ、濾過し、蒸発させ、粗生成物を得た。次にこれをDCMに溶解し、粗生成物をFCC(SiO
2、ヘプタン中EtOAc30〜65%)により精製した。純粋画分を蒸発させて乾燥し、tert−ブチルN−[(3R)−1−(6−フルオロピリダジン−3−イル)ピロリジン−3−イル]カルバメート(15g、102%)をクリーム状固体として得た。
1H NMR(400MHz,CDCl
3,30℃)δ 1.46(9H,s),1.91−2.13(1H,m),2.32(1H,dq),3.40(1H,dd),3.56−3.72(2H,m),3.78(1H,dd),4.37(1H,s),4.70(1H,s),6.78(1H,dd),6.98(1H,dd).m/z:ES
+[M+H]
+283.
中間体12
N2−[(3R)−1−(1,2,4−トリアジン−3−イル)ピロリジン−3−イル]−1,3,4−チアジアゾール−2,5−ジアミン
5−ブロモ−1,3,4−チアジアゾール−2−アミン(1.31g、7.264ミリモル)および(3R)−1−(1,2,4−トリアジン−3−イル)ピロリジン−3−アミン(中間体13、1.2g、7.264ミリモル)を、N
2下、室温で、DMF(15mL)中で結合させた。混合物を室温で一晩撹拌した。次にそれを蒸発させて乾燥し、FCC(SiO
2、DCM中MeOH中2N NH
35〜10%)により精製し、N2−[(3R)−1−(1,2,4−トリアジン−3−イル)ピロリジン−3−イル]−1,3,4−チアジアゾール−2,5−ジアミンをベージュ泡状物として得た(1.7g、88%)。
1H NMR(400MHz,DMSO,30℃)δ 1.80−1.85(1H,m),1.98−2.05(1H,m),3.40(4H,brs),4.03(1H,brs),6.09(2H,s),6.88(1H,d),8.10(1H,d),8.38(1H,d).
中間体13
(3R)−1−(1,2,4−トリアジン−3−イル)ピロリジン−3−アミン
tert−ブチルN−[(3R)−1−(1,2,4−トリアジン−3−イル)ピロリジン−3−イル]カルバメート(中間体14、2.39g、9.01ミリモル)をDCM(20mL)およびトリフルオロ酢酸(5mL)の混合物に溶解し、溶液を低圧下で蒸発させる前に室温で1時間静置しておいた。残渣をMeOHに溶解し、20gのSCXカートリッジに通過させ、MeOH、次いでMeOH中3N NH
3を流し、生成物を取り出した。溶媒を低圧下で蒸発させ、(3R)−1−(1,2,4−トリアジン−3−イル)ピロリジン−3−アミン(1.460g、98%)を黄色固体として得た。
1H NMR(400MHz,CDCl
3,27℃)δ 1.80−1.92(1H,m),2.18−2.29(1H,m),3.45(1H,s),3.6−4.01(4H,m),8.13(1H,d),8.50(1H,d).m/z:ES
+[M+H]
+166.
中間体14
tert−ブチルN−[(3R)−1−(1,2,4−トリアジン−3−イル)ピロリジン−3−イル]カルバメート
3−メチルスルファニル−1,2,4−トリアジン(中間体15、1.5g、11.80ミリモル)、およびtert−ブチルN−[(3R)−ピロリジン−3−イル]カルバメート(2.64g、14.15ミリモル)をエタノール(12mL)に溶解し、マイクロ波管内に密封した。反応物をマイクロ波反応器内で100℃に24時間加熱し、室温に冷却した。LC/MSは、61%の生成物および34%の未反応トリアジンを示した。さらに、tert−ブチルN−[(3R)−ピロリジン−3−イル]カルバメート(0.52g)を添加し、マイクロ波下、100℃での加熱を15時間継続した。LC/MSは、76%の生成物および18%の未反応トリアジンを示した。溶媒を低圧下で除去し、残渣をEtOAcおよび水性重炭酸ナトリウム間で分配した。水層を新しいEtOAcで再抽出し、結合した有機物を乾燥し(MgSO
4)、濾過し、低圧下で蒸発させた。粗生成物をFCC(SiO
2、ヘプタン中EtOAc0〜80%)により精製した。関連画分を蒸発させ、tert−ブチルN−[(3R)−1−(1,2,4−トリアジン−3−イル)ピロリジン−3−イル]カルバメート(2.390g、76%)を黄色固体として得た。
1H NMR(400MHz,CDCl
3,27℃)δ 1.46(9H,s),1.96−2.07(1H,m),2.26−2.37(1H,m),3.55(1H,s),3.75(2H,s),3.90(1H,s),4.39(1H,s),4.69(1H,s),8.14(1H,d),8.53(1H,d).m/z:ES
− [M−H]
− 264.
中間体15
3−メチルスルファニル−1,2,4−トリアジン
氷/水(400mL)中、メチルヒドラジンカルビミドチオエートヨウ化水素酸塩(中間体16、7.5g、32.18ミリモル)の溶液を、0℃に冷却した氷/水(400mL)中、40%オキサルアルデヒド(14.70mL、128.71ミリモル)、および重炭酸ナトリウム(6.76g、80.45ミリモル)の撹拌溶液に添加した。得られた溶液を0℃で5時間撹拌し、次にDCM(2×150mL)で抽出した。抽出物を結合させ、1Mクエン酸(50mL)で洗浄し、乾燥し(MgSO
4)、蒸発させ、3−メチルスルファニル−1,2,4−トリアジン(3.60g、88%)を黄色固体として得た。
1H NMR(400MHz,CDCl
3,27℃)δ 2.68(3H,s),8.38(1H,d),8.94(1H,d).
中間体16
ヒドラジンカルビミドチオエートヨウ化水素酸塩
ヨードメタン(0.623mL、10.00ミリモル)を、エタノール(10mL)中のヒドラジンカルボチオアミド(0.911g、10ミリモル)に添加した。得られた混合物を70℃で30分間撹拌した。反応物を室温に冷却しておいた。次に、反応混合物をナイロンフィルターカップを通して濾過した。次に、得られた固体をEt
2Oで洗浄し、真空で一晩乾燥し、メチルヒドラジンカルビミドチオエートヨウ化水素酸塩(1.810g、78%)を白色固体として得て、それをさらに精製せずに用いた。
中間体17
[2−[3−(3−フルオロアゼチジン−1−イル)フェニル]−2−メトキシ−アセチル]オキシリチウム
2−[3−(3−フルオロアゼチジン−1−イル)フェニル]−2−メトキシ−酢酸メチル(中間体18、0.26g、1.034ミリモル)および水酸化リチウム一水和物(0.07g、1.552ミリモル)をMeOH(5mL)および水(2mL)の混合物に溶解した。反応物を室温で2時間撹拌した。次にそれを蒸発させ、週末にかけて真空で乾燥し、[2−[3−(3−フルオロアゼチジン−1−イル)フェニル]−2−メトキシ−アセチル]オキシリチウムを白色固体として得た(270mg,100%)。
1H NMR(400MHz,DMSO−d6,27℃)δ 3.35(3H,s),4.08−3.91(2H,m),4.29(2H,ddd),4.42(1H,s),5.78−5.56(1H,m),6.50(1H,ddd),6.68(1H,t),6.93(1H,dt),7.25(1H,t).m/z:ES
+[M+H]
+240.
中間体18
2−[3−(3−フルオロアゼチジン−1−イル)フェニル]−2−メトキシ−酢酸メチル
トルエン(20mL)中の2−(3−ブロモフェニル)−2−メトキシ酢酸メチル(中間体19、500mg、1.93ミリモル)および3−フルオロアゼチジン塩酸塩(215mg、1.93ミリモル)の混合物に、Ruphosパラジウム(II)塩化フェネチルアミン(58.3mg、0.07ミリモル)、ジシクロヘキシル(2’,6’−ジイソプロポキシ−[1,1’−ビフェニル]−2−イル)ホスフィン(29.7mg、0.06ミリモル)および炭酸セシウム(2.20mg、6.75ミリモル)を添加した。反応物に窒素を約5分間散布し、次に窒素下で一晩撹拌しながら90℃に加熱した。反応物を、EtOAcおよび水で希釈する前、室温に冷却した。有機層を乾燥し(MgSO
4)、濾過し、溶媒を低圧下で蒸発させた。FCC(SiO
2、ヘプタン中EtOAc0〜25%)により精製した。生成物を含有する画分を低圧下で蒸発させ、2−[3−(3−フルオロアゼチジン−1−イル)フェニル]−2−メトキシ−酢酸メチル(330mg,67%)を油として得た。
1H NMR(400MHz,CDCl
3,30℃)δ 3.40(3H,s),3.72(3H,s),3.90−4.02(2H,m),4.19(2H,ddd),4.71(1H,s),5.30−5.51(1H,m),6.44(1H,ddd),6.54−6.56(1H,m),6.83(1H,d),7.21(1H,t).m/z:ES
+[M+H]
+254.
中間体19
2−(3−ブロモフェニル)−2−メトキシ酢酸メチル
ナトリウム(0.345g、15.00ミリモル)をN
2下で乾燥MeOH(50mL)に溶解し、この溶液に、乾燥MeOH(10mL)中、2−ブロモ−2−(3−ブロモフェニル)酢酸メチル(中間体20、4.2g、13.64ミリモル)の溶液を添加した。反応混合物を、40℃で2時間加熱し、次に低圧下で蒸発させた。残渣を水性塩化アンモニウム溶液で処理し、混合物をEtOAc(50mL×2)で抽出した。結合した有機物を乾燥し(MgSO
4)、濾過し、低圧下で蒸発させ、粗生成物を得て、それをFCC(SiO
2、ヘプタン中EtOAc0〜12%)により精製した。生成物を含有する画分を蒸発させて乾燥し、2−(3−ブロモフェニル)−2−メトキシ酢酸メチル(2.95g、83%)を油として得た。
1H NMR(400MHz,CDCl
3,30℃)δ 3.42(3H,s),3.74(3H,s),4.73(1H,s),7.24(1H,t),7.36−7.39(1H,m),7.47(1H,ddd),7.61(1H,t).m/z:TOF MS EI
+257.9880.
中間体20
2−ブロモ−2−(3−ブロモフェニル)酢酸メチル
四塩化炭素(50mL)下の2−(3−ブロモフェニル)酢酸メチル(4g、17.46ミリモル)およびNBS(3.26g、18.33ミリモル)および(E)−2,2’−(ジアゼン−1,2−ジイル)ビス(2−メチルプロパンニトリル)(0.143g、0.87ミリモル)の混合物を加熱し、4時間還流し、次に室温に冷却した。固体を濾過除去し、廃棄し、濾液を低圧下で蒸発させた。FCC(SiO
2、ヘプタン中0〜5%EtOAc)により精製した。生成物を含有する画分を低圧下で蒸発させ、2−ブロモ−2−(3−ブロモフェニル)酢酸メチル(4.2g、78%)を油として得た。
1H NMR(400MHz,CDCl
3,30℃)δ 3.80(3H,s),5.28(1H,s),7.21−7.26(1H,m),7.45−7.48(1H,m),7.48−7.5(1H,m),7.70(1H,t).m/z:TOF MS EI
+305.8891.
中間体21
[2−[3−(3,3−ジフルオロアゼチジン−1−イル)フェニル]−2−メトキシ−アセチル]オキシリチウム
2−[3−(3,3−ジフルオロアゼチジン−1−イル)フェニル]−2−メトキシ−酢酸メチル(中間体23、0.08g、0.295ミリモル)および水酸化リチウム一水和物(0.01g、0.354ミリモル)をメタノール(3mL)および水(2mL)の混合物に溶解した。反応物を室温で2時間撹拌した。反応混合物を、低圧下で蒸発させ、週末にかけて真空乾燥器内で乾燥し、[2−[3−(3,3−ジフルオロアゼチジン−1−イル)フェニル]−2−メトキシ−アセチル]オキシリチウムを得た。
1H NMR(400MHz,DMSO−d6)δ 3.19(3H,s),4.24−4.17(4H,m),6.42−6.35(1H,m),6.57(1H,s),6.82(1H,d),7.09(1H,t).
中間体22
2−[3−(3,3−ジフルオロアゼチジン−1−イル)フェニル]−2−メトキシ−酢酸
MeOH(4mL)中、2−[3−(3,3−ジフルオロアゼチジン−1−イル)フェニル]−2−メトキシ−酢酸塩(中間体23、270mg、1.00ミリモル)の溶液を、水(2mL)中、水酸化リチウム一水和物(84mg、1.99ミリモル)の溶液で処理し、混合物を室温で2時間撹拌した。MeOHを低圧下で蒸発させ、水層を鹹水(2mL)で希釈し、酢酸で中和し、2−メチルテトラヒドロフラン(4×5mL)で抽出した。結合した有機物を乾燥し(MgSO
4)、濾過し、低圧下で蒸発させ、2−[3−(3,3−ジフルオロアゼチジン−1−イル)フェニル]−2−メトキシ−酢酸(130mg,50.8%)をガム状物として得た。m/z:ES
+[M+H]
+258.
中間体23
2−[3−(3,3−ジフルオロアゼチジン−1−イル)フェニル]−2−メトキシ−酢酸メチル
トルエン(20mL)中の2−(3−ブロモフェニル)−2−メトキシ酢酸メチル(中間体19、473mg、1.83ミリモル)および3,3−ジフルオロアゼチジン塩酸塩(236mg、1.83ミリモル)の混合物に、Ruphosパラジウム(II)塩化フェネチルアミン(55.2mg、0.07ミリモル)、ジシクロヘキシル(2’,6’−ジイソプロポキシ−[1,1’−ビフェニル]−2−イル)ホスフィン(28.1mg、0.06ミリモル)および炭酸セシウム(2.08g、6.39ミリモル)を添加した。反応物にN
2を約5分間散布し、次にN
2下で一晩撹拌しながら90℃に加熱した。反応物を、EtOAc(20mL)および水(20mL)で希釈する前、室温に冷却した。有機層を乾燥し(MgSO
4)、濾過し、溶媒を低圧下で蒸発させた。FCC(SiO
2、ヘプタン中EtOAc0〜20%)により精製した。生成物を含有する画分を低圧下で蒸発させ、2−[3−(3,3−ジフルオロアゼチジン−1−イル)フェニル]−2−メトキシ−酢酸メチル(280mg,57%)を油として得た。
1H NMR(400MHz,DMSO−d6,30℃)δ 3.62(3H,s),4.25(4H,t),4.82(1H,s),6.51−6.56(2H,m),6.79(1H,d),7.19−7.25(1H,m).m/z:ES
+[M+H]
+272.
中間体24
[2−メトキシ−2−[3−(3−メトキシアゼチジン−1−イル)フェニル]アセチル]オキシリチウム
2−メトキシ−2−[3−(3−メトキシアゼチジン−1−イル)フェニル]酢酸メチル(中間体26、0.24g、0.886ミリモル)および水酸化リチウム一水和物(0.06g、1.329ミリモル)を、メタノール(5mL)および水(2mL)の混合物に溶解した。反応物を室温で2時間撹拌し、次に低圧下で蒸発させ、週末にかけて真空で乾燥した。
1H NMR(400MHz,DMSO−d6)δ 2.96(3H,s),3.03(3H,s),3.37−3.26(2H,m),3.80(2H,dd),4.01(1H,s),4.09(1H,tt),6.06(1H,dd),6.25(1H,t),6.49(1H,dt),6.83(1H,t).
中間体25
2−メトキシ−2−[3−(3−メトキシアゼチジン−1−イル)フェニル]酢酸
MeOH(7mL)中、2−メトキシ−2−[3−(3−メトキシアゼチジン−1−イル)フェニル]酢酸メチル(中間体26、450mg、1.61ミリモル)の溶液を、水(3mL)中、水酸化リチウム一水和物(135mg、3.22ミリモル)の溶液で処理し、混合物を室温で一晩撹拌した。MeOHを低圧下で蒸発させ、水性残渣をエーテルで抽出した。水層を酢酸で酸性化し、固体塩化ナトリウムで処理して飽和溶液を得て、EtOAc(3×10mL)で抽出した。有機層を乾燥し(MgSO
4)、濾過し、低圧下で蒸発させ、2−メトキシ−2−[3−(3−メトキシアゼチジン−1−イル)フェニル]酢酸(236mg,58.3%)をガム状物として得た。
1H NMR(400MHz,DMSO−d6,30℃)δ 3.23(3H,s),3.26(3H,s),3.51−3.59(2H,m),3.97−4.06(2H,m),4.26−4.34(1H,m),4.59(1H,s),6.38(1H,dd),6.43(1H,s),6.69(1H,d),7.13(1H,t).m/z:ES
+[M+H]
+252.
中間体26
2−メトキシ−2−[3−(3−メトキシアゼチジン−1−イル)フェニル]酢酸メチル
トルエン(20mL)中、2−(3−ブロモフェニル)−2−メトキシ酢酸メチル(中間体19、524mg、2.02ミリモル)および3−メトキシアゼチジン塩酸塩(250mg、2.02ミリモル)の混合物に、Ruphosパラジウム(II)塩化フェネチルアミン(61.1mg、0.07ミリモル)、ジシクロヘキシル(2’,6’−ジイソプロポキシ−[1,1’−ビフェニル]−2−イル)ホスフィン(31.2mg、0.07ミリモル)および炭酸セシウム(2307mg、7.08ミリモル)を添加した。反応物に窒素を約5分間散布し、次に窒素下で一晩撹拌しながら90℃に加熱した。反応物を、EtOAcおよび水で希釈する前、室温に冷却した。有機層を乾燥し(MgSO
4)、濾過し、溶媒を低圧下で蒸発させた。FCC(SiO
2、ヘプタン中EtOAc0〜25%)による精製により、2−メトキシ−2−[3−(3−メトキシアゼチジン−1−イル)フェニル]酢酸メチル(450mg,84%)を油として得た。
1H NMR(400MHz,CDCl
3,30℃)δ 3.33(3H,s),3.39(3H,s),3.68−3.74(5H,m),4.07−4.13(2H,m),4.29−4.36(1H,m),4.70(1H,s),6.43(1H,ddd),6.51−6.54(1H,m),6.79(1H,d),7.19(1H,t).m/z:ES
+[M+H]
+266.
中間体27
2−エトキシ−2−(3−メトキシフェニル)酢酸
0℃でエタノール(40mL)中、3−メトキシベンズアルデヒド(5.0g、36.72ミリモル)およびブロモホルム(3.85mL、44.06ミリモル)の撹拌混合物に、エタノール(60mL)中、水酸化カリウム(11.33g、201.98ミリモル)の溶液を1時間かけて液滴添加した。添加の完了後、混合物を室温で一晩撹拌放置した。形成された沈殿物を濾過により除去し、濾液を蒸発させ、ペーストを得て、それを水(100mL)に取り込ませ、EtOAc(2×100mL)で抽出した。次に水相を2M HClでpH=2に酸性化し、EtOAc(2×100mL)で抽出した。結合した有機物を乾燥し(MgSO
4)、濾過し、蒸発させ、薄茶色油を得た。これをシリカ上に吸収させ、FCC(SiO
2、DCM中MeOH5%)により精製し、2−エトキシ−2−(3−メトキシフェニル)酢酸(3.1g、40%)を薄茶色油として得た。
1H NMR(400MHz,CDCl
3,21℃)δ 1.28(3H,t),2.09(1H,s),3.64−3.52(2H,m),3.81(3H,s)4.86(1H,s),6.89(1H,ddd),6.99(1H,m),7.03(1H,m),7.29(1H,t).m/z:ES
−[M−H]
−209.
中間体28
2−(3,5−ジメトキシフェニル)−2−メトキシ−酢酸
MeOH(80mL)中、水酸化カリウム(9.79g、174.43ミリモル)の溶液を、0℃でMeOH(40mL)中、3,5−ジメトキシベンズアルデヒド(5.27g、31.71ミリモル)およびブロモホルム(3.33mL、38.06ミリモル)の撹拌混合物に2時間かけて少しずつ添加した。次に、混合物を室温に温めておき、一晩撹拌放置した。固体を低圧下で濾過し、MeOH(40mL)ですすいだ。濾液を蒸発させて濃厚白色ペーストにし、次に水(150mL)に再溶解した。これをEt
2O(200mL)で洗浄し、水性部分を2M HClでpH=2に酸性化した。水相をEtOAc(500mL)で抽出した。結合した有機物を乾燥し(MgSO
4)、濾過し、低圧下で蒸発させ、2−(3,5−ジメトキシフェニル)−2−メトキシ−酢酸を黄色ガム状物として得た(5.00g,70%)。
1H NMR(400MHz,DMSO−d6,27℃)δ 3.72(9H,s),4.68(1H,s),6.45(1H,s),6.52(2H,s).
中間体29
3−メトキシ−2−(3−メトキシフェニル)プロパン酸
3−メトキシ−2−(3−メトキシフェニル)プロピオン酸エチル(中間体30、0.3g、1.259ミリモル)を水(5mL)に懸濁し、水酸化リチウム(0.3g、12.59ミリモル)で処理し、次に60℃で3時間加熱した。反応混合物を室温に冷却しておいた。水性物をEtOAc(20mL)で抽出し、有機物を廃棄した。水性物を1M HClでpH=1に酸性化し、EtOAc(2×20mL)で抽出した。有機物を乾燥し(MgSO
4)、濾過し、低圧下で蒸発させ、無色ガム状物を得て、それをFCC(SiO
2、シクロヘキサン中EtOAc0〜100%)により精製した。所望される化合物を含有する画分を結合させ、蒸発させ、3−メトキシ−2−(3−メトキシフェニル)プロパン酸(88mg,33%)を得た。
1H NMR(400MHz,DMSO−d6,30℃)δ 3.25(s,3H),3.49(1H,dd),3.74(3H,s),3.88−3.76(2H,m),6.93−6.80(3H,m),7.32−7.17(1H,m),12.51(1H,s).m/z:ES
+[M+H]
+211.
中間体30
3−メトキシ−2−(3−メトキシフェニル)プロピオン酸エチル
丸底フラスコ内、MeCN(2mL)中、3−ヒドロキシ−2−(3−メトキシフェニル)プロピオン酸エチル(中間体31、0.38g、1.695ミリモル)の溶液に、酸化銀(0.5g、2.14ミリモル)を添加した。溶液を0℃に冷却し、ヨードメタン(0.17mL、2.676ミリモル)で処理した。反応混合物を、暗所、室温で2.5日間撹拌しておいた。LCMS分析によると、一部が生成物であるが主に出発物質であることが示された。さらに、0.53mLのヨードメタンおよび0.15gの酸化銀を添加し、撹拌を24時間継続した。さらに7日間撹拌放置したことから、反応はさらに進行していた。LCMS分析によると、完全な変換が示された。混合物をセライトを通して濾過し、溶媒を低圧下で除去した。残渣をシリカに吸着させ、FCC(SiO
2、シクロヘキサン中EtOAc0〜40%)により精製した。適切な画分を低圧下で蒸発させ、3−メトキシ−2−(3−メトキシフェニル)プロピオン酸エチルを無色油として単離した(0.3g、74%)。
1H NMR(400MHz,CDCl
3,21℃)δ 1.23(3H,t),3.37(3H,s),3.58(1H,dd),3.80(3H,s),3.84(1H,dd),3.97(1H,t),4.24−4.08(2H,m),6.82(1H,ddd),6.95−6.85(2H,m),7.23(1H,d).m/z:ES
+[M+H]
+239.
中間体31
3−ヒドロキシ−2−(3−メトキシフェニル)プロピオン酸エチル
2−(3−メトキシフェニル)酢酸エチル(1.0g、5.149ミリモル)を、炭酸水素ナトリウム(0.02g、0.257ミリモル)を有する丸底フラスコ中で秤量した。DMSO(8mL)、次いでパラホルムアルデヒド(0.39mL、5.149ミリモル)を添加した。得られた懸濁液を室温で24時間撹拌しておき、次に反応物を60℃で3時間加熱し、無色溶液を得た。反応混合物を冷却し、水(100mL)で希釈し、0.5M HClで中和した。水性物をEtOAc(3×50mL)で抽出し、乾燥し(MgSO
4)、低圧下で蒸発させ、無色油を得て、それをFCC(SiO
2、シクロヘキサン中EtOAc0〜50%)により精製した。溶媒を低圧下で除去し、3−ヒドロキシ−2−(3−メトキシフェニル)プロピオン酸エチルを無色油として得た(0.38g、33%)。
1H NMR(400MHz,CDCl
3,21℃)δ 1.23(3H,t),2.26(1H,s),3.86−3.76(5H,m),4.28−4.06(3H,m),6.89−6.79(3H,m),7.30−7.22(1H,m).m/z:ES
+[M+H]
+225.
中間体32
2−メトキシ−2−[3−(トリフルオロメトキシ)フェニル]酢酸
MeOH(10mL)中、水酸化カリウム(1.851g、33.00ミリモル)の溶液を、0℃でMeOH(5.00mL)中、3−(トリフルオロメトキシ)ベンズアルデヒド(1.141g、6ミリモル)およびブロモホルム(0.630mL、7.20ミリモル)の撹拌混合物に2時間かけて少しずつ添加した。次に、混合物を室温に温めておき、一晩撹拌放置した。反応混合物中に白色沈殿物が形成した。MeOH(15mL)を用いてフィルターケーキをすすぎながら、固体を低圧下で濾過除去した。濾液を蒸発させて濃厚白色ペーストにし、次に水(50mL)に再溶解した。次にこれをEt
2O(50mL)で洗浄した。水相をpH=2に酸性化し(約5mLの2M HCl溶液)、次にEtOAc(3×50mL)中に抽出した。結合した有機物を乾燥し(MgSO
4)、濾過し、低圧下で蒸発させ、無色油を得た。粗生成物をFCC(SiO
2、ヘプタン中EtOAc10〜50%)により精製した。純粋画分を蒸発させて乾燥し、2−メトキシ−2−[3−(トリフルオロメトキシ)フェニル]酢酸(0.832g、55%)を無色油として得た。
1H NMR(400MHz,CDCl
3,30℃)δ 3.47(3H,s),4.81(1H,s),7.20−7.24(1H,m),7.33(1H,s),7.37−7.46(2H,m).m/z:ES
−[M−H]
−249.4.
中間体33
2−(3,5−ジメトキシフェニル)−2−エトキシ−酢酸
0℃でエタノール(15mL)中、3,5−ジメトキシベンズアルデヒド(2.16mL、15.04ミリモル)およびブロモホルム(1.58mL、18.054ミリモル)の撹拌混合物に、エタノール(30mL)中、水酸化カリウム(4.64g、82.747ミリモル)の溶液を30分かけて液滴添加した。添加の完了後、混合物を撹拌放置し、室温に一晩温めた。翌朝、沈殿物を濾過により除去した。濾液を蒸発させ、ペーストを得て、それを水(75mL)に取り込ませ、EtOAc(2×75mL)で抽出した。次に水相を2N HClでpH=2に酸性化した。それをEtOAc(2×100mL)で抽出した。結合した有機物を乾燥し(MgSO
4)、蒸発させ、粗生成物を得た。FCC(SiO
2、DCM中MeOH0〜5%)により精製した。純粋画分を結合させ、低圧下で蒸発させ、2−(3,5−ジメトキシフェニル)−2−エトキシ−酢酸をオレンジガム状物として得た(2.46g、68%)。
1H NMR(400MHz,DMSO−d6,25℃)δ 1.15(3H,t),3.37−3.42(1H,m),3.48−3.55(1H,m),3.73(6H,s),4.78(1H,s),6.29(1H,s),6.53(1H,s),6.54(1H,s),12.76(1H,s).m/z:ES
−[M−H]
−239.
中間体34
2−[4−フルオロ−3−(3−メトキシアゼチジン−1−イル)フェニル]−2−メトキシ−酢酸
2−[4−フルオロ−3−(3−メトキシアゼチジン−1−イル)フェニル]−2−メトキシ−酢酸メチル(中間体35、250mg、0.88ミリモル)を水(1.5mL)に懸濁し、水酸化リチウム(42mg、1.77ミリモル)で処理し、40℃で2時間加熱した。反応混合物を室温に冷却しておき、MeOHを低圧下で蒸発させた。水相を鹹水(5mL)で希釈し、飽和水性クエン酸の添加によりpH=5に調整した。水性物を、5%MeOHを含有するDCM(3×10mL)で抽出した。結合した有機抽出物を乾燥し(MgSO
4)、濾過した。水性物を、ギ酸の添加によりpH=3にさらに酸性化し、次にEtOAc(4×10mL)で再抽出した。EtOAc抽出物を結合させ、乾燥し(MgSO
4)、濾過し、DCM/MeOH抽出物と結合させ、次に低圧下で蒸発させた。ガム状残留物をEt
2Oから2倍に濃縮し、2−[4−フルオロ−3−(3−メトキシアゼチジン−1−イル)フェニル]−2−メトキシ−酢酸(221mg,93%)を淡黄色ガラス状固体として得た。
1H NMR(400MHz,CDCl
3,21℃)δ 3.33(3H,s),3.41(3H,s),3.80−3.83(2H,m),4.19−4.23(2H,m),4.29−4.33(1H,m),4.68(1H,s),6.50(1H,dd),6.75(1H,ddd),6.94(1H,dd).m/z:ES
+[M+H]
+270.1.
中間体35
2−[4−フルオロ−3−(3−メトキシアゼチジン−1−イル)フェニル]−2−メトキシ−酢酸メチル
2−(3−ブロモ−4−フルオロ−フェニル)−2−メトキシ−酢酸メチル(中間体36、600mg、2.17ミリモル)を、シュバシール、N
2流入口および還流コンデンサーを備えた3首丸底フラスコで秤量した。フラスコにN
2を5分間流し、次に3−メトキシアゼチジン塩酸塩(0.27g、2.17ミリモル)および炭酸セシウム(2.47g、7.58ミリモル)を添加した。別々のフラスコにおいて、2−ジシクロヘキシルホスフィノ−2,6−ジ−イソ−プロポキシビフェニル、(Ruphos、0.04g、0.087ミリモル)およびRuphos Pd G2(0.06g、0.077ミリモル)を乾燥トルエンに溶解した。溶液を、ニードルを通じてN
2で5分間脱気し、次にシュバシールを通じて3首丸底フラスコ内の他の試薬に添加した。反応混合物を90℃で20時間加熱した。反応混合物を室温に冷却しておき、EtOAc(20mL)および水(20mL)で希釈した。有機層を収集し、水性物をEtOAcのさらなる一部(20mL)で洗浄した。有機物を鹹水(50mL)で洗浄し、分離し、低圧下で蒸発させた。残渣をFCC(SiO
2、石油エーテル中EtOAc0〜70%)により精製した。純粋画分を結合させ、低圧下で蒸発させ、2−[4−フルオロ−3−(3−メトキシアゼチジン−1−イル)フェニル]−2−メトキシ−酢酸メチル(136mg,22%)を無色油として得た。
1H NMR(400MHz,CDCl
3,21℃)δ 3.33(3H,s),3.38(3H,s),3.72(3H,s),3.78−3.83(2H,m),4.19−4.23(2H,m),4.29−4.33(1H,m),4.67(1H,s),6.55(1H,dd),6.75(1H,ddd),6.92(1H,dd).m/z:ES
+[M+H]
+284.0.
中間体36
2−(3−ブロモ−4−フルオロ−フェニル)−2−メトキシ−酢酸メチル
ナトリウム(93mg、4.05ミリモル)を、N
2下でMeOH(12mL)に溶解した。MeOH(3mL)中、2−ブロモ−2−(3−ブロモ−4−フルオロ−フェニル)酢酸メチル(中間体37、1.20g、3.68ミリモル)の溶液を添加し、反応混合物を40℃に2時間加熱した。反応混合物を室温に冷却し、低圧下で蒸発させた。残渣を飽和NH
4Cl(水性)(10mL)で処理し、EtOAc(3×10mL)で抽出した。結合した有機抽出物を乾燥し(MgSO
4)、濾過し、低圧下で蒸発させた。残渣をFCC(SiO
2、石油エーテル中EtOAc0〜10%)により精製した。純粋画分を結合させ、低圧下で蒸発させ、2−(3−ブロモ−4−フルオロ−フェニル)−2−メトキシ−酢酸メチル(616mg,60%)を無色油として得た。
1H NMR(400MHz,CDCl
3,21℃)δ 3.42(3H,s),3.74(3H,s),4.73(1H,s),7.12(1H,t),7.37(1H,ddd),7.67(1H,dd).
中間体37
2−ブロモ−2−(3−ブロモ−4−フルオロ−フェニル)酢酸メチル
四塩化炭素(50mL)中、2−(3−ブロモ−4−フルオロ−フェニル)酢酸メチル(5.0g、20.24ミリモル)の溶液を調製し、N−ブロモサクシニミド(3.78g、21.25ミリモル)、次いで2,2’−アゾビス(2−メチルプロピオニトリル)(0.17g、1.01ミリモル)を添加した。反応物を加熱して4時間還流し、室温に冷却しておいた。沈殿物を濾過除去し、溶液を低圧下で蒸発させた。粗製残渣をFCC(SiO
2、石油エーテル中EtOAc0〜10%)により精製した。純粋画分を結合させ、低圧下で蒸発させ、2−ブロモ−2−(3−ブロモ−4−フルオロ−フェニル)酢酸メチル(5.30g、80%)を無色油として得た。
1H NMR(400MHz,CDCl
3,21℃)δ 3.81(3H,s),5.28(1H,s),7.12(1H,t),7.49(1H,ddd),7.78(1H,dd).
中間体38
2−[4−フルオロ−3−(3−フルオロアゼチジン−1−イル)フェニル]−2−メトキシ−酢酸リチウム
水酸化リチウム(99.86mg、4.16ミリモル)を水(10mL)およびメタノール(33mL)に懸濁し、2−[4−フルオロ−3−(3−フルオロアゼチジン−1−イル)フェニル]−2−メトキシ−酢酸メチル(中間体39、565mg、2.08ミリモル)で処理し、窒素下、45℃で2時間加熱した。反応混合物を室温に冷却しておき、MeOHおよび水を、乾燥器内で1日間真空で乾燥する前に低圧下で除去した。これにより、2−[4−フルオロ−3−(3−フルオロアゼチジン−1−イル)フェニル]−2−メトキシ−酢酸リチウムを得た(0.60g、75%)。
1H NMR(400MHz,DMSO−d6)δ 3.18(3H,s),3.95−3.50(3H,m),4.18−4.11(1H,m),4.21(1H,s),5.58−5.32(1H,m),6.60(1H,dd),6.77−6.70(1H,m),6.96−6.88(1H,m).m/z:ES
+[M+H]
+263.1.
中間体39
2−[4−フルオロ−3−(3−フルオロアゼチジン−1−イル)フェニル]−2−メトキシ−酢酸メチル
シュバシール、マグネチックスターラーバー、窒素流入口および還流コンデンサーを備えた2首丸底フラスコ内に、Ruphos Pd G1メチル−t−ブチルエーテル付加体(0.16g、0.193ミリモル)、2−ジシクロヘキシルホスフィノ−2,6−ジイソプロポキシビフェニル、(Ruphos、0.09g、0.193ミリモル)、3−フルオロアゼチジン塩酸塩(0.5g、4.461ミリモル)および炭酸セシウム(4.24g、13.01ミリモル)を添加し、フラスコに窒素ガスを5分間流し、次に別々の丸底フラスコ内に、2−(3−ブロモ−4−フルオロ−フェニル)−2−メトキシ−酢酸メチル(中間体36、1.03g、3.717ミリモル)を入れた。フラスコにシュバシールを装備し、トルエン(25mL)を窒素下で添加した。得られた溶液を5分間、窒素をそれを通じて通気することにより脱気し、次にそれを、他の試薬を含有する2首丸底フラスコに窒素下で添加した。反応混合物を90℃で48時間加熱し、次に室温に冷却しておき、低圧下で蒸発させた。残渣をEtOAc(100mL)および水(100mL)間で分配した。水層をEtOAcのさらなる一部(200mL)で抽出した。有機物を結合させ、MgSO
4で乾燥し、濾過し、低圧下で蒸発させ、淡褐色油を得て、それをEtOAcに溶解し、シリカ上に吸収させ、次にフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製し、シクロヘキサン中EtOAc0〜100%で溶出した。適切な画分の蒸発により、2−[4−フルオロ−3−(3−フルオロアゼチジン−1−イル)フェニル]−2−メトキシ−酢酸メチル、(565mg,33%)を淡黄色液体として得た。1H NMR(400MHz,DMSO−d6)δ 3.28(3H,s),3.63(3H,s),4.02−3.84(2H,m),4.31−4.17(2H,m),4.84(1H,s),5.57−5.31(1H,m),6.62−6.53(1H,m),6.79−6.71(1H,m),7.07(1H,dd).m/z:ES
+[M+H]
+271.2.
中間体40
2−[3−(3−フルオロアゼチジン−1−イル)−5−メトキシ−フェニル]−2−メトキシ−酢酸リチウム
水酸化リチウム(0.02g、0.932ミリモル)を水(1mL)およびMeOH(3mL)に懸濁し、2−[3−(3−フルオロアゼチジン−1−イル)−5−メトキシ−フェニル]−2−メトキシ−酢酸メチル(中間体41、0.13g、0.466ミリモル)で処理した。混合物をN
2下で45℃に2時間加熱した。次にそれを室温に冷却しておき、溶媒を真空で3日間乾燥する前に低圧下で除去し、2−[3−(3−フルオロアゼチジン−1−イル)−5−メトキシ−フェニル]−2−メトキシ−酢酸リチウムを得た(137mg,101%)。m/z:ES
+[M+H]
+269.3.
中間体41
2−[3−(3−フルオロアゼチジン−1−イル)−5−メトキシ−フェニル]−2−メトキシ−酢酸メチル
丸底フラスコ内に、2−(3−ブロモ−5−メトキシ−フェニル)−2−メトキシ−酢酸メチル(中間体42、0.3g、1.038ミリモル)を入れた。フラスコにシュバシールを装備し、トルエン(6.5mL)をN
2下で添加した。得られた溶液を5分間、N
2をそれを通じて通気することにより脱気した。シュバシール、マグネチックスターラーバー、窒素流入口および還流コンデンサーを備えた2首丸底フラスコ内に、Ruphos Pd G1メチル−t−ブチルエーテル付加体(0.04g、0.054ミリモル)、2−ジシクロヘキシルホスフィノ−2,6−ジイソプロポキシビフェニル、(Ruphos、0.03g、0.054ミリモル)、3−フルオロアゼチジン塩酸塩(0.14g、1.245ミリモル)および炭酸セシウム(1.18g、3.632ミリモル)を添加した。フラスコに、シュバシールを通じてトルエン中、2−(3−ブロモ−5−メトキシ−フェニル)−2−メトキシ−酢酸メチル(0.3g、1.038ミリモル)の脱気溶液の添加前、N
2を5分間流した。反応混合物を、90℃で48時間加熱し、次に室温に冷却しておき、低圧下で蒸発させた。残渣をEtOAc(100mL)および水(100mL)間で分配した。水層をEtOAcのさらなる一部(200mL)で抽出した。有機物を結合させ、乾燥し(MgSO
4)、濾過し、蒸発させ、淡褐色油を得て、それをEtOAcに溶解し、シリカ上に吸収させた。それをFCC(SiO
2、シクロヘキサン中EtOAc0〜50%)により精製した。適切な画分の蒸発により、2−[3−(3−フルオロアゼチジン−1−イル)−5−メトキシ−フェニル]−2−メトキシ−酢酸メチル(132mg,42%)を淡黄色液体として得た。
1H NMR(400MHz,DMSO−d6,30℃)δ 3.27(3H,s),3.62(3H,s),3.71(3H,s),3.78−3.96(2H,m),4.05−4.21(2H,m),4.77(1H,s),5.35−5.57(1H,m),5.98(1H,s),6.05(1H,s),6.29(1H,s).m/z:ES
+[M+H]
+283.3.
中間体42
2−(3−ブロモ−5−メトキシ−フェニル)−2−メトキシ−酢酸メチル
2−(3−ブロモ−5−メトキシ−フェニル)−2−メトキシ−酢酸(中間体43、2.77g、10.06ミリモル)をMeOH(30mL)に溶解し、濃硫酸(0.17mL、2.014ミリモル)で処理し、次に65℃に2時間加熱した。混合物を室温に冷却し、蒸発させ、次に水(5mL)、次いで飽和水性重炭酸ナトリウム(20mL)で希釈した。水性物を、DCM、次いでEtOAc中に抽出した。結合した有機物を蒸発させ、粗製材料をFCC(SiO
2、シクロヘキサン中EtOAc0〜40%)により精製した。生成物を含有する画分を蒸発させ、2−(3−ブロモ−5−メトキシ−フェニル)−2−メトキシ−酢酸メチルを得た(1.2g、41%)。(400MHz,DMSO−d6,30℃)δ 3.31 (s,3H),3.65(3H,s),3.78(3H,s),4.94(1H,s),6.90−6.95(1H,m),7.11−7.14(1H,m),7.15(1H,dd).m/z:ES
+[M+H]
+290.
中間体43
2−(3−ブロモ−5−メトキシ−フェニル)−2−メトキシ−酢酸
0℃でメタノール(15mL)中、水酸化カリウム(2.87g、51.15ミリモル)およびブロモホルム(0.98mL、11.16ミリモル)の撹拌混合物に、メタノール(60mL)中、3−ブロモ−5−メトキシ−ベンズアルデヒド(0.75mL、9.301ミリモル)の懸濁液を10分間かけて添加した。添加後、混合物を、一晩で室温に温まるように撹拌放置した。次に、反応混合物をDCM(60mL)で処理し、沈殿物を濾過により除去した。濾液を蒸発させ、ペーストを得て、それを水(200mL)に取り込ませ、DCM(200mL)で抽出した。次に水相を2M HClでpH2に酸性化し、DCM(2×100mL)およびEtOAc(2×100mL)で抽出した。結合した有機物を低圧下で蒸発させ、クロマトグラフにかけた(SiO
2、EtOAc0〜30%−シクロヘキサン)。生成物を含有する画分を蒸発させ、2−(3−ブロモ−5−メトキシ−フェニル)−2−メトキシ−酢酸を得た(0.84g、33%)。
1H NMR(400MHz,DMSO−d6)δ 3.30(s,3H)3.77(s,3H),4.78(s,1H),6.94−6.91(m,1H),7.14−7.10(m,2H),13.04(s,1H).m/z:ES
+[M+H]
+275.1.
中間体44
2−メトキシ−2−[3−メトキシ−5−(トリフルオロメトキシ)フェニル]酢酸
0℃でMeOH(1mL)中、3−メトキシ−5−(トリフルオロメトキシ)ベンズアルデヒド(中間体45、0.15g、0.681ミリモル)およびブロモホルム(0.07mL、0.81ミリモル)の撹拌混合物に、MeOH(2mL)中、水酸化カリウム(0.207g、3.75ミリモル)の溶液を30分かけて液滴添加した。混合物を撹拌し、室温に一晩温めた。得られた沈殿物を濾過により除去した。濾液を蒸発させ、ペーストを得て、それを水(100mL)に取り込ませ、EtOAc(2×100mL)で抽出し、未反応アルデヒドを除去した。次に水相を2N塩酸でpH=2に酸性化し、EtOAc(2×100mL)で抽出した。結合した有機物を乾燥し(MgSO
4)、濾過し、低圧下で蒸発させ、粗生成物を得て、それをFCC(SiO
2、DCM中MeOH0〜10%)により精製し、2−メトキシ−2−[3−メトキシ−5−(トリフルオロメトキシ)フェニル]酢酸を黄色固体として得た(191mg,34%)。m/z:ES
+[M+H]
+280.
中間体45
3−メトキシ−5−(トリフルオロメトキシ)ベンズアルデヒド
DCM(18mL)中、[3−メトキシ−5−(トリフルオロメトキシ)フェニル]メタノール(中間体46、330mg、1.49ミリモル)の撹拌溶液に、活性化二酸化マンガン(646mg、7.43ミリモル)を添加し、反応混合物を室温で3時間撹拌した。反応混合物を水(50mL)で希釈し、DCM(3×50mL)で抽出し、鹹水(100mL)で洗浄し、乾燥し(MgSO
4)、濾過し、低圧下で蒸発させ、粗生成物を得て、それをFCC(SiO
2、シクロヘキサン中EtOAc0〜50%)により精製し、3−メトキシ−5−(トリフルオロメトキシ)ベンズアルデヒドを(0.15g、45%)無色油として得た。
1H NMR(400MHz,DMSO−d6,21℃)δ 3.83(3H,s),7.24−7.27(1H,m),7.39−7.42(1H,m),7.46−7.48(1H,m),9.94(1H,s).m/z:ES
+[M+H]
+222.
中間体46
[3−メトキシ−5−(トリフルオロメトキシ)フェニル]メタノール
窒素下、0℃でTHF(10mL)中、3−メトキシ−5−(トリフルオロメトキシ)安息香酸(0.50g、2.12ミリモル)の撹拌溶液に、水素化アルミニウムリチウム(THF中1M、2.33mL、2.33ミリモル)を10分かけて液滴添加した。反応混合物を撹拌し、窒素下で室温に3時間温めた。反応混合物を水(10mL)、次いで2N NaOH(30mL)溶液で希釈し、形成された塩を濾過により除去した。濾液をDCM(3×100mL)で抽出し、乾燥し(MgSO
4)、濾過し、低圧下で蒸発させ、粗生成物を得て、FCC(SiO
2、シクロヘキサン中EtOAc0〜50%)により精製し、[3−メトキシ−5−(トリフルオロメトキシ)フェニル]メタノール(0.33g、67%)を白色固体として得た。m/z:ES
+[M+H]
+222.
中間体47
2−[3−(ジフルオロメトキシ)フェニル]−2−エトキシ−酢酸
0℃でエタノール(40mL)中、3−(ジフルオロメトキシ)ベンズアルデヒド(2.0g、11.619ミリモル)およびブロモホルム(1.22mL、13.94ミリモル)の撹拌混合物に、エタノール(20mL)中、水酸化カリウム(3.59g、63.90ミリモル)の溶液を1時間かけて液滴添加した。添加後、混合物を撹拌放置し、室温に一晩温めた。沈殿物を濾過により除去し、濾液を低圧下で蒸発させ、ペーストを得て、それを水(100mL)に取り込ませ、EtOAc(2×75mL)で抽出した。次に水相を2M HClでpH=1に酸性化し、EtOAc(2×75mL)で抽出した。結合した有機物を乾燥し(MgSO
4)、濾過し、蒸発させ、薄茶色油を得て、それをFCC(SiO
2、95:5のシクロヘキサン:EtOAc+0.1%ギ酸が8:2のEtOAc:シクロヘキサン+0.1%ギ酸に増加)により精製した。適切な画分を低圧下で蒸発させ、2−[3−(ジフルオロメトキシ)フェニル]−2−エトキシ−酢酸を無色油として得た(1.8g、62%)。
1H NMR(400MHz,CDCl
3,21℃)δ 1.29(3H,t),3.49−3.70(2H,m),4.89(1H,s),6.52(1H,t),7.07−7.15(1H,m),7.21−7.26(1H,m),7.28−7.35(1H,m),7.34−7.41(1H,m).m/z:ES
−[M−H]
−245.
中間体48
2−メトキシ−2−[3−(オキセタン−3−イル)フェニル]酢酸
MeOH(30mL)中、水酸化カリウム(1.427g、25.43ミリモル)の溶液を、0℃でMeOH(15mL)中、3−(オキセタン−3−イル)ベンズアルデヒド(中間体49、750mg、4.62ミリモル)およびブロモホルム(0.485mL、5.55ミリモル)の撹拌混合物に2時間かけて少しずつ添加した。次に混合物を室温に温めておき、一晩撹拌放置した。固体を低圧下で濾過し、固体をMeOH(15mL)ですすいだ。濾液を蒸発させて濃厚白色ペーストにし、次に水(150mL)に再溶解した。これをEt
2O(200mL)で洗浄し、次に2MでpH=2に酸性化した。水相をEtOAc(300mL)中に抽出し、結合した有機物を乾燥し(MgSO
4)、濾過し、低圧下で蒸発させ、2−メトキシ−2−[3−(オキセタン−3−イル)フェニル]酢酸を無色油として得て(1.0g、97%)、それをさらに精製せずに用いた。
1H NMR(400MHz,DMSO,30℃)δ 3.31(3H,s),4.18−4.35(1H,m),4.58(2H,m),4.77(1H,s),4.94(1H,m),7.22−7.57(4H,m).
中間体49
3−(オキセタン−3−イル)ベンズアルデヒド
酸化マンガン(IV)(14.30g、164.43ミリモル)を、窒素下、21℃でDCM(70mL)中の(3−(オキセタン−3−イル)フェニル)メタノール(中間体50、1.5g、8.22ミリモル)に添加した。得られた混合物を21℃で16時間撹拌した。次に反応物をセライトを通して濾過し、DCMで洗浄し、蒸発させてガム状物にした。粗生成物をFCC(SiO
2、ヘプタン中EtOAc10〜60%)により精製した。純粋画分を蒸発させて乾燥し、3−(オキセタン−3−イル)ベンズアルデヒド(800mg,60%)を無色ガム状物として得た。
1H NMR(400MHz,DMSO,30℃)δ 4.21−4.51(1H,m),4.64(2H,m),4.98(2H,m),7.60(1H,t),7.74(1H,d),7.79−7.85(1H,d),7.94(1H,s),10.03(1H,s).
中間体50
(3−(オキセタン−3−イル)フェニル)メタノール
水素化アルミニウムリチウム(THF中1M、1.94mL、1.95ミリモル)を、窒素下、0℃でTHF(10mL)中の3−(オキセタン−3−イル)安息香酸ナトリウム(300mg、1.50ミリモル)に液滴添加した。得られた混合物を0℃で20分間、次いで25℃で18時間撹拌した。有機層を乾燥し(Na
2SO
4)、濾過し、蒸発させる前、5%水性HClを添加し、混合物をEtOAc(100mL)で抽出し、2M水性Na
2CO
3溶液で洗浄した。粗生成物をFCC(SiO
2、ヘプタン中EtOAc50〜100%、次いでEtOAc中MeOH中1M NH
310%)により精製した。純粋画分を蒸発させて乾燥し、(3−(オキセタン−3−イル)フェニル)メタノール(140mg,57%)を無色ガム状物として得た。
1H NMR(400MHz,DMSO,30℃)δ 4.20(1H,m),4.51(2H,d),4.62(2H,m),4.95(2H,m),5.16(1H,t),7.17−7.29(2H,m),7.31−7.41(2H,m).
中間体51
2−エトキシ−2−[3−(トリフルオロメトキシ)フェニル]酢酸
0℃でエタノール(15mL)中、水酸化カリウム(1.62g、28.93ミリモル)およびブロモホルム(0.55mL、6.31ミリモル)の撹拌混合物に、エタノール(30mL)中、3−(トリフルオロメトキシ)ベンズアルデヒド(0.75mL、5.26ミリモル)の溶液を緩徐に10分間かけて添加した。添加後、混合物を撹拌放置し、室温に一晩温めた。沈殿物を濾過により除去した。濾液を蒸発させ、ペーストを得て、それを水(200mL)に取り込ませ、DCM(100mL)で抽出した。これにより乳剤を形成し、次に水相を2M HCl(10mL)で酸性化し、分離した。次にそれをEtOAc(100mL)でさらに抽出した。結合した有機物を低圧下で蒸発させ、FCC(SiO
2、シクロヘキサン中EtOAc0〜50%)により精製した。純粋画分を結合させ、低圧下で蒸発させ、2−エトキシ−2−[3−(トリフルオロメトキシ)フェニル]酢酸を得た(690mg,49%)。
1H NMR(400MHz,DMSO−d6,21℃)δ 1.16(3H,t),3.38−3.50(1H,m),3.53−3.66(1H,m),4.99(1H,s),7.28−7.39(2H,m),7.45(1H,d),7.53(1H,t),13.04(1H,s).m/z:ES
+[M+H]
+265.
中間体52
2−[4−フルオロ−3−(トリフルオロメトキシ)フェニル]−2−メトキシ−酢酸
水酸化リチウム(0.02g、0.9ミリモル)を水(1mL)およびメタノール(3mL)に懸濁し、2−[4−フルオロ−3−(トリフルオロメトキシ)フェニル]−2−メトキシ−酢酸エチル(中間体53、0.13g、0.45ミリモル)で処理し、45℃で2時間加熱した。反応混合物を室温に冷却しておき、MeOHを低圧下で除去した。水相を鹹水(20mL)で希釈し、ギ酸の添加によりpH3に調整し、次にEtOAc(3×20mL)で抽出した。結合したEtOAc抽出物を鹹水(30mL)で洗浄し、MgSO
4上で乾燥させ、濾過し、溶媒を低圧下で除去し、2−[4−フルオロ−3−(トリフルオロメトキシ)フェニル]−2−メトキシ−酢酸を得た(0.127g、105%)。
1H NMR(400MHz,CDCl
3−d6,25℃)δ 3.47(3H,s),4.78(1H,s),7.23(1H,dd),7.37−7.46(2H,m).m/z:ES+[M+H]+268.98.
中間体53
2−[4−フルオロ−3−(トリフルオロメトキシ)フェニル]−2−メトキシ−酢酸エチル
N
2下の丸底フラスコ内にナトリウム(0.04g、1.66ミリモル)を添加し、メタノール(12mL)を乾燥させた。この溶液に、N
2下でメタノール(3mL)中、2−ブロモ−2−[4−フルオロ−3−(トリフルオロメトキシ)フェニル]酢酸メチル(中間体54、0.5g、1.51ミリモル)を添加した。反応混合物を40℃で2時間加熱した。溶媒を低圧下で除去し、残留ガム状物を飽和塩化アンモニウム溶液(50mL)およびEtOAc(50mL)間で分配した。水層をEtOAc(50mL)のさらなる一部で抽出した。有機物を結合させ、MgSO
4で乾燥し、濾過し、溶媒を低圧下で除去した。残留油を、フラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製し、シクロヘキサン中、100%シクロヘキサンから15%EtOAcで溶出した。適切な画分の蒸発により、2−[4−フルオロ−3−(トリフルオロメトキシ)フェニル]−2−メトキシ−酢酸エチルを得た(0.127g,28%)。
1H NMR(400MHz,CDCl
3−d6,25℃)δ 1.23(3H,t),3.44(3H,s),4.12−4.28(2H,m),4.74(1H,d),7.20(1H,dd),7.39(1H,dddd),7.42−7.48 (m,1H).
中間体54
2−ブロモ−2−[4−フルオロ−3−(トリフルオロメトキシ)フェニル]酢酸メチル
2−[4−フルオロ−3−(トリフルオロメトキシ)フェニル]酢酸メチル(中間体55、0.65g、2.578ミリモル)およびN−ブロモサクシニミド(4.08g、22.919ミリモル)を丸底フラスコ中で秤量し、四塩化炭素(6mL)中、2,2−アゾビス(2−メチルプロピオニトリル)、(AIBN、0.02g、0.129ミリモル)を添加した。反応物を加熱し、4時間還流し、室温に冷却しておいた。沈殿物を濾過除去し、溶液をシリカで処理し、低圧下で蒸発させ、フラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製し、シクロヘキサン中、30%EtOAcに漸増する100%シクロヘキサンで溶出した。適切な画分を低圧下で蒸発させ、2−ブロモ−2−[4−フルオロ−3−(トリフルオロメトキシ)フェニル]酢酸メチルを淡黄色油として得た(1.1g、129%)。
1H NMR(400MHz,CDCl
3−d6,25℃)δ 3.81(3H,s),5.29(1H,s),7.17−7.24(1H,m,),7.46−7.52(1H,m),7.53−7.59(1H,m).
中間体55
2−[4−フルオロ−3−(トリフルオロメトキシ)フェニル]酢酸メチル
4−フルオロ−3−(トリフルオロメトキシ)フェニル酢酸(1.0g、4.199ミリモル)をメタノール(10mL)に懸濁し、硫酸(0.07mL、0.84ミリモル)で処理し、45℃で2時間加熱した。反応混合物を室温に冷却しておき、メタノールを低圧下で除去した。残渣を鹹水(20mL)で希釈し、次にEtOAc(3×20mL)で抽出した。結合したEtOAc抽出物を鹹水(30mL)で洗浄し、MgSO
4上で乾燥させ、濾過し、溶媒を低圧下で除去し、2−[4−フルオロ−3−(トリフルオロメトキシ)フェニル]酢酸メチルを得た(0.65g,61%)。
1H NMR(400MHz,DMSO−d6)δ 3.63(3H,s),3.78(2H,s),7.33−7.39(1H,m),7.42−7.53(2H,m).m/z:ES
+[M+H]
+253.
生物検定
本明細書に記載の化合物の効果を測定するため、以下のアッセイ:a)GLS酵素効力アッセイ;b)GLS細胞効力アッセイ;c)GLS細胞増殖アッセイを用いた。アッセイの説明に際して、一般に次のことが言える。
i.以下の略称:CO2=二酸化炭素;DMEM=ダルベッコ変法イーグル培地;DMSO=ジメチルスルホキシド;EDTA=エチレンジアミン四酢酸;EGTA=エチレングリコールテトラ酢酸;FCS= 胎児子ウシ血清;h=時間;NBS=非結合表面;SDS=ドデシル硫酸ナトリウム;TRIS=トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン、を用いている。
ii.IC50値を、Genedataのスマートフィッティングモデルを用いて算出した。IC50値は、生物学的活性の50%を阻害する試験化合物の濃度であった。
アッセイa):GLS酵素効力アッセイ
化合物がインビトロでGLS1に結合し、GLS1の活性を阻害する能力を測定するため、グルタミン酸オキシダーゼ/AmplexRed共役アッセイを用いた。大腸菌(E.Coli)中で発現される6Hisタグ化GLSタンパク質(アミノ酸63〜669)を精製し、一定分量を−80℃で貯蔵した。GLS1を2×作業濃度に希釈し、室温でインキュベートし、四量体/二量体型が定常状態に達することを可能にした。アッセイ測定は、50mMトリス(pH7.8)、100mM NaPO4、pH7.8、0.001%v/vのツイーン20を含む緩衝液中で実施した。精製した組換えGLS1タンパク質をアッセイ緩衝液で12nMに希釈し、室温で30分間予備インキュベートした。試験化合物を100%DMSOでの希釈により調製し、12点濃度応答における正確な用量範囲および適切な容量(2.5〜60nl)を得て、Labcyte Echo 555アコースティックディスペンサーを用いて384ウェルマイクロアッセイプレート(Greinerの製品コード784900)に分注した。DMSO濃度を、DMSO溶液の戻し充填により2%で維持した。次に、希釈したGLS1タンパク質(12nM)3μLを、BioRaptr自動ディスペンサー(Beckman−Coulter)を用いて各ウェルに分注し、室温で15分間インキュベートした。次に、アッセイ緩衝液で希釈した100mMのグルタミン3μLを添加し、反応物を室温で60分間インキュベートした。次に、100mMトリス(pH7.5)中、45μMの6−(2−ブロモエチニル)−2,3−ジメチル−キナゾリン−4−オン、75μMのAmplex Red、0.375単位/mLの西洋わさびペルオキシダーゼ、0.12単位/mLのグルタミン酸オキシダーゼの添加により反応を停止させた。暗所、室温で30分後、535/590nmの光学フィルターを用いてのPerkin Elmer EnVisionでプレートを読み取り、生データをGenedataを用いて分析し、IC50値を得た。また、アッセイ成分に対する非特異的効果を除外するため、6Hisタグ化GLSタンパク質およびグルタミンをアッセイ緩衝液と交換する場合のアッセイのアーチファクトバージョンを用いた。
アッセイb):GLS細胞効力アッセイ
化合物を、細胞のGLS活性をそれらが阻害する可能性について、細胞のグルタミン酸枯渇を測定するPC3共役アッセイの使用により評価した。試験化合物を100%DMSOでの希釈により調製し、12点濃度応答における正確な用量範囲および適切な容量(5〜120nl)を得て、Labcyte Echo 555アコースティックディスペンサーを用いて384ウェルマイクロアッセイプレート(Corningの製品コード3712)に分注した。DMSO濃度を、DMSO溶液の戻し充填により0.3%で維持した。PC3細胞を、フェノールを含まないDMEM、10%透析FCS、2mMグルタミンで成長させ、トリプシン処理による分散後、分注した化合物を含有する384ウェルアッセイプレート内に直接的に増殖培地40μl中、5.6×103個の細胞/ウェルで蒔いた。37℃、5%CO2で6時間のインキュベーション後、増殖培地を吸引し、10mMトリス(pH7.4)、100mM NaCl、1mM EDTA、1mM EGTA、1mM NaF、20mM Na4P2O7、2mM Na3VO4、1%トリトンX100、10%グリセロール、0.1%SDSおよび0.5%デオキシコール酸塩を含有する緩衝液15μlに細胞を溶解した。次に、細胞可溶化物4μlを384ウェルNBSプレート(Corningの製品コード3575)に移し、35μlの27.5μM Amplex Red、0.1375U/mLの西洋わさびペルオキシダーゼ、0.044U/mLのグルタミン酸オキシダーゼ、100mMトリス(pH7.5)を添加した。暗所、室温で30分後、535/590nmの光学フィルターを用いてPerkin Elmer EnVisionでプレートを読み取り、生データを専売ソフトウェアを用いて分析し、IC50値を得た。
アッセイc):GLS細胞増殖アッセイ
化合物が細胞成長を阻害する能力を、384ウェルプレートNCI−H1703細胞増殖アッセイを用いて測定した。NCI−H1703細胞を、フェノールレッドを含まないRPMI1640、10%FCSおよび2mMグルタミンで成長させ、クリアボトム384ウェルアッセイプレート(Corningの製品コード3712)内に増殖培地40μl中、750細胞/ウェルの密度で播種し、37℃、5%CO2で24時間インキュベートした。試験化合物を100%DMSOでの希釈により調製し、12点濃度応答における正確な用量範囲および適切な容量(5〜120nl)を得て、蒔いた細胞を含有するアッセイプレート内に直接的に分注した。DMSO濃度を、DMSO溶液の戻し充填により0.3%で維持した。プレートを37℃、5%CO2で5日間インキュベートし、Sytoxグリーンおよびサポニンを各最終濃度が2μMおよび0.25%になるまで添加し、分析前に6時間インキュベートした。488nmの励起および放射用のFITCフィルターセット(500〜530nm)を用いてAcumen eX3(TTP Labtech)でプレートを読み取った。IC50値を、GeneDataソフトウェア分析を用いて、0日目成長の最大阻害に対するカーブフィッティングを行うことにより算出した。
アッセイa)〜c)からの結果を表1に示す。