CN108349966B

CN108349966B - 1,3,4-噻二唑化合物及其在治疗癌症中的用途

Info

Publication number: CN108349966B
Application number: CN201680067245.3A
Authority: CN
Inventors: M.R.V.芬莱; J.W.M.尼辛克; M.D.查尔斯
Original assignee: Cancer Research Technology Ltd; AstraZeneca AB
Current assignee: Cancer Research Technology Ltd; AstraZeneca AB
Priority date: 2015-11-30
Filing date: 2016-11-30
Publication date: 2022-02-15
Anticipated expiration: 2036-11-30
Also published as: PH12018501131A1; US20210246131A1; TW201733587A; US10323028B2; RU2018123714A; JP2018535986A; NI201800064A; CO2018006928A2; KR20180083942A; JP6999550B2; AU2016363718B2; WO2017093299A1; US20190389853A1; ES2914333T3; US20170152255A1; CL2018001407A1; TN2018000127A1; MX2018006532A; CN108349966A; EP3383873A1

Abstract

一种具有化学式(I)的化合物或其药学上可接受的盐，其中：Q可以是1,2,4‑三嗪‑3‑基、哒嗪‑3‑基、6‑甲基哒嗪‑3‑基、或6‑氟哒嗪‑3‑基；R¹可以是氢、甲氧基、三氟甲氧基、氧杂环丁烷‑3‑基、3‑氟氮杂环丁烷‑1‑基、3‑甲氧基氮杂环丁烷‑1‑基、或3,3‑二氟氮杂环丁烷‑1‑基；R²可以是氢或氟；R³可以是氢或甲氧基；并且R⁴可以是甲氧基、乙氧基、或甲氧基甲基；其条件是当R¹是氢、甲氧基或三氟甲氧基时，则R³不是氢，和/或R⁴是甲氧基甲基。该具有化学式(I)的化合物可以抑制谷氨酰胺酶，例如GLS1。

Description

1,3,4-噻二唑化合物及其在治疗癌症中的用途

技术领域

本说明书总体上涉及经取代的1,3,4-噻二唑化合物及其药学上可接受的盐。这些化合物作用于谷氨酰胺酶1酶(“GLS1”)，并且因此本说明书还涉及此类化合物及其盐治疗或预防GLS1介导的疾病(包括癌症)的用途。本说明书进一步涉及包含这些化合物和盐的药物组合物；包含这些化合物和盐的试剂盒；制备这些化合物和盐的方法；用于制备这些化合物和盐的中间体；以及使用这些化合物和盐治疗GLS1介导的疾病、包括癌症的方法。

背景

谷氨酰胺是最丰富的血浆氨基酸并且参与许多生长促进途径。特别地，谷氨酰胺参与TCA循环中的氧化和维持细胞氧化还原平衡，并且还提供氮用于核苷酸和氨基酸合成(库睿(Curi)等，生物科学前沿(Front.Biosc.)2007,12,344-57；德巴丁斯(DeBerardinis)和程(Cheng)，癌基因(Oncogene)2010,313-324，每者通过引用以其整体结合在此)。许多癌细胞依赖于谷氨酰胺代谢作为细胞代谢变化的结果，包括瓦伯格效应，其中糖酵解丙酮酸转化为乳酸而不是用于产生乙酰辅酶A(库珀诺(Koppenol)等人，自然综述(NatureReviews)2011,11,325-337，每者通过引用以其整体结合在此)。由于这种依赖于谷氨酰胺代谢的结果，这样的癌细胞对外源谷氨酰胺水平的变化敏感。此外，现有证据表明谷氨酰胺分解在某些癌症类型中起关键作用(亨斯利(Hensley)等人，临床研究期刊(J.Clin.Inves).2013,123,3678-3684，每者通过引用以其整体结合在此)，并且与已知的致癌驱动因子例如Myc相关(丹格(Dang)，癌症研究(CancerRes).2010,70,859-863，每者通过引用以其整体结合在此)。

谷氨酰胺分解代谢为谷氨酸的第一步由谷氨酰胺酶催化，谷氨酰胺酶以GLS1和GLS2这两种亚型存在，这两种亚型最初鉴定为分别在肾和肝中表达。已知肾谷氨酰胺酶(GLS1)比肝谷氨酰胺酶(GLS2)更普遍地表达，并且具有2种剪接变体，KGA和较短的GAC亚型，两者都位于线粒体中。(埃嘎迪(Elgadi)等人，生理与基因组学(Physiol.Genomics)1999,1,51-62；卡斯格(Cassago)等人，美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)2012,109,1092-1097，每者通过引用以其整体结合在此)。GLS1表达与许多疾病类型中的肿瘤生长和恶性肿瘤相关(王(Wang)等人，癌症细胞(Cancer Cell)2010,18,207-219；范德华(van derHeuval)等人，癌症生物学与治疗(Cancer Bio.Ther.)2012,13,1185-1194，每者通过引用以其整体结合在此)因此，预期GLS1的抑制剂可用于治疗癌症，作为单一疗法或与其他抗癌剂组合。

概述

在一个方面，提供了一种具有化学式(I)的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中：

Q可以是1,2,4-三嗪-3-基、哒嗪-3-基、6-甲基哒嗪-3-基、或6-氟哒嗪-3-基；

R¹可以是氢、甲氧基、三氟甲氧基、氧杂环丁烷-3-基、3-氟氮杂环丁烷-1-基、3-甲氧基氮杂环丁烷-1-基或3,3-二氟氮杂环丁烷-1-基；

R²可以是氢或氟；

R³可以是氢或甲氧基；并且

R⁴可以是甲氧基，乙氧基，或甲氧基甲基；

其条件是当R¹是氢、甲氧基或三氟甲氧基时，则R³不是氢，和/或R⁴是甲氧基甲基。

在另一方面，提供了选自下组的化合物或其药学上可接受的盐，该组由以下各项组成：

(2S)-2-乙氧基-N-[5-[[(3R)-1-哒嗪-3-基吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]-2-[3-(三氟甲氧基)苯基]乙酰胺；

(2R)-2-[4-氟-3-(三氟甲氧基)苯基]-2-甲氧基-N-[5-[[(3R)-1-哒嗪-3-基吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺；

(2S)-2-[4-氟-3-(三氟甲氧基)苯基]-2-甲氧基-N-[5-[[(3R)-1-哒嗪-3-基吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺；以及

(2S)-[3-(二氟甲氧基)苯基]-2-乙氧基-N-[5-[[(3R)-1-哒嗪-3-基吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺。

在另一方面，药物组合物包括如上所述的化合物或其药学上可接受的盐，和至少一种药学上可接受的稀释剂或载体。

在另一方面，提供了如上所述的化合物或其药学上可接受的盐，用于在治疗中使用。

在另一方面，提供了如上所述的化合物或其药学上可接受的盐，用于治疗癌症。

在另一方面，提供了如上所述的化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗癌症的药物中的用途。

在另一方面，用于在需要这种治疗的温血动物中治疗癌症的方法包括给予温血动物治疗有效量的如上所述的化合物或其药学上可接受的盐。

其他方面将从说明书和权利要求书中显而易见。

详细说明

许多实施例在整个说明书中详细描述并且对于本领域的读者将是显而易见的。本发明不应被解释为限于其任何特定一个或多个实施例。

提供具有化学式(I)的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中：

R¹可以是氢，甲氧基，三氟甲氧基，氧杂环丁烷-3-基，3-氟氮杂环丁烷-1-基；3-甲氧基氮杂环丁烷-1-基，或3,3-二氟氮杂环丁烷-1-基；

R²可以是氢或氟；

R³可以是氢或甲氧基；并且

R⁴可以是甲氧基，乙氧基，甲氧基甲基，或乙氧基甲基；

1,2,4-三嗪-3-基、哒嗪-3-基、6-甲基哒嗪-3-基、以及6-氟哒嗪-3-基环具有以下结构：

氧杂环丁烷-3-基、3-氟氮杂环丁烷-1-基；3-甲氧基氮杂环丁烷-1-基、以及3,3-二氟氮杂环丁烷-1-基环具有以下结构：

在一些实施例中，具有化学式(I)的化合物具有下化学式(Ia)：

其中Q、R¹、R²、R³、以及R⁴如上所定义。

一种化合物或其药学上可接受的盐，其选自下组，该组由以下各项组成：

(2S)-[3-(二氟甲氧基)苯基]-2-乙氧基-N-[5-[[(3R)-1-哒嗪-3-基吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺；

也被提供。

术语“药学上可接受的”用于指明物体(例如盐，剂型，稀释剂或载体)适合用于患者。药学上可接受的盐的实例列表可以发现于：药用盐手册：性质、选择和使用(theHandbook of Pharmaceutical Salts:Properties，Selection and Use)，P.H.斯塔尔(Stahl)和C.G.韦穆特(Wermuth)编辑，魏因海姆(Weinheim)/苏黎世(Zürich)：威利(Wiley)-VCH出版社/VHCA，2002，将其通过引用以其整体结合在此。具有化学式(I)的化合物的适合的药学上可接受的盐例如是酸加成盐。在技术人员已知的条件下，具有化学式(I)的化合物的酸加成盐可以通过使该化合物与适合的无机酸或有机酸接触来形成。酸加成盐可以使用例如无机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸和磷酸形成。酸加成盐也可以使用例如有机酸如三氟乙酸、甲磺酸或苯磺酸形成。

因此，在一个实施例中，提供具有化学式(I)的化合物或其药学上可接受的盐，其中该药学上可接受的盐是盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、磷酸盐、三氟乙酸盐、甲磺酸盐或苯磺酸盐。

在一个实施例中，提供了具有化学式(I)的化合物或其药学上可接受的盐，其中该药学上可接受的盐是盐酸盐或氢溴酸盐。

具有化学式(I)化合物的其他合适的药学上可接受的盐是碱-加成盐。具有化学式(I)的化合物的碱加成盐可以通过使该化合物与合适的无机碱或有机碱在本领域技术人员已知的条件下接触而形成。碱加成盐可以使用例如无机碱如碱金属氢氧化物(例如氢氧化钠、氢氧化钾或氢氧化锂)或碱土金属氢氧化物(例如氢氧化钙或氢氧化镁)形成。碱加成盐也可以使用例如有机碱如甲胺、二甲胺、三甲胺、哌啶、吗啉或三-(2-羟乙基)胺来形成。

因此，在一个实施例中，提供具有化学式(I)的化合物或其药学上可接受的盐，其中该药学上可接受的盐是氢氧化钠盐、氢氧化钾盐、氢氧化锂盐、氢氧化钙盐、氢氧化镁盐、甲胺盐、二甲胺盐、三甲胺盐、哌啶盐、吗啉盐或三-(2-羟乙基)胺盐。

在一个实施例中，提供具有化学式(I)的化合物或其药学上可接受的盐，其中该药学上可接受的盐是盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、磷酸盐、三氟乙酸盐、甲磺酸盐、苯磺酸盐、氢氧化钠盐、氢氧化钾盐、氢氧化锂盐、氢氧化钙盐、氢氧化镁盐、甲胺盐、二甲胺盐、三甲胺盐、哌啶盐、吗啉盐或三-(2-羟乙基)胺盐。

另一个实施例提供了本文所定义的任何实施例(例如如权利要求1所述的实施例)，其条件是选自由实例1(a)、1(b)、2(a)、2(b)、3(a)、3(b)、4(a)、4(b)、5(a)、5(b)、6(a)、6(b)、7(a)、7(b)、8(a)、8(b)、9(a)、9(b)、10(a)、10(b)、11(a)、11(b)、12(a)、12(b)、13(a)、13(b)、14(a)、14(b)、15(a)、15(b)、16(a)、16(b)、17(a)、17(b)、18(a)、18(b)、19(a)、19(b)、20(a)、20(b)、21(a)、21(b)、22(a)、22(b)、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45(a)、45(b)、46(a)、46(b)、47(a)、47(b)、48(a)、48(b)、49(a)、49(b)、50(a)、50(b)、51(a)、51(b)、52(a)、52(b)、53(a)、53(b)、54(a)、和54(b)组成的组中的一个或多个具体实例(例如一个、两个或三个具体实例、或可替代地一个具体实例)单独地被放弃。

化学式(I)中的可变基团的一些值如下。这些值可以与任何定义、权利要求(例如权利要求1)、或本文所定义的实施例组合使用以提供另外的实施例。

R¹可以是甲氧基或三氟甲氧基。

R¹可以是甲氧基并且R³可以是甲氧基。

R¹可以是氧杂环丁烷-3-基、3-氟氮杂环丁烷-1-基、3-甲氧基氮杂环丁烷-1-基吗、或3,3-二氟氮杂环丁烷-1-基。

R¹可以是氧杂环丁烷-3-基。

R¹可以是3-氟氮杂环丁烷-1-基。

R¹可以是3-甲氧基氮杂环丁烷-1-基。

R¹可以是3,3-二氟氮杂环丁烷-1-基。

R²可以是H。

R²可以是氟。

R³可以是甲氧基。

R⁴可以是甲氧基或乙氧基。

R⁴可以是甲氧基。

R⁴可以是甲氧基甲基。

Q可以是1,2,4-三嗪-3-基或哒嗪-3-基。

Q可以是1,2,4-三嗪-3-基。

Q可以是哒嗪-3-基。

Q可以是6-甲基哒嗪-3-基或6-氟哒嗪-3-基。

Q可以是6-甲基哒嗪-3-基。

Q可以是6-氟哒嗪-3-基。

在一个实施例中，提供了具有化学式(I)的化合物，或其药学上可接受的盐，其中：

Q是1,2,4-三嗪-3-基、哒嗪-3-基、6-甲基哒嗪-3-基、或6-氟哒嗪-3-基；

R¹是甲氧基、三氟甲氧基、氧杂环丁烷-3-基、3-氟氮杂环丁烷-1-基、3-甲氧基氮杂环丁烷-1-基、或3,3-二氟氮杂环丁烷-1-基；

R²是氢或氟；

R³是氢或甲氧基；并且

R⁴是甲氧基、乙氧基、或甲氧基甲基；

其条件是当R¹是甲氧基或三氟甲氧基时，则R³不是氢，和/或R⁴是甲氧基甲基。

Q是哒嗪-3-基；并且

R¹是甲氧基或三氟甲氧基。

Q是哒嗪-3-基；并且

R¹是氧杂环丁烷-3-基、3-氟氮杂环丁烷-1-基、3-甲氧基氮杂环丁烷-1-基、或3,3-二氟氮杂环丁烷-1-基。

Q是哒嗪-3-基；

R¹是甲氧基；并且

R³是甲氧基。

Q是6-甲基哒嗪-3-基或6-氟哒嗪-3-基；并且

R¹是3-氟氮杂环丁烷-1-基、3-甲氧基氮杂环丁烷-1-基、或3,3-二氟氮杂环丁烷-1-基。

在一个实施例中，提供了具有化学式(I)的化合物，或其药学上可接受的盐，其中所述化合物选自下组，该组由以下各项组成：

(2S)-2-[3-(3-氟氮杂环丁烷-1-基)苯基]-2-甲氧基-N-[5-[[(3R)-1-哒嗪-3-基吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺；

(2S)-2-(3,5-二甲氧基苯基)-2-甲氧基-N-[5-[[(3R)-1-(6-甲基哒嗪-3-基)吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺；

(2S)-2-[3-(3,3-二氟氮杂环丁烷-1-基)苯基]-2-甲氧基-N-[5-[[(3R)-1-哒嗪-3-基吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺；

(2S)-2-甲氧基-2-[3-(3-甲氧基氮杂环丁烷-1-基)苯基]-N-[5-[[(3R)-1-哒嗪-3-基吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺；

(2S)-2-(3,5-二甲氧基苯基)-2-甲氧基-N-[5-[[(3R)-1-(1,2,4-三嗪-3-基)吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺；

(2R)-3-甲氧基-2-(3-甲氧基苯基)-N-[5-[[(3R)-1-哒嗪-3-基吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]丙酰胺；

(2S)-2-(3,5-二甲氧基苯基)-2-乙氧基-N-[5-[[(3R)-1-哒嗪-3-基吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺；

(2S)-2-[4-氟-3-(3-甲氧基氮杂环丁烷-1-基)苯基]-2-甲氧基-N-[5-[(3R)-3-(哒嗪-3-基氨基)吡咯烷-1-基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺；

(2S)-N-[5-[[(3R)-1-(6-氟哒嗪-3-基)吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]-2-甲氧基-2-[3-(3-甲氧基氮杂环丁烷-1-基)苯基]乙酰胺；

(2S)-2-[3-(3-氟氮杂环丁烷-1-基)-5-甲氧基-苯基]-2-甲氧基-N-[5-[[(3R)-1-哒嗪-3-基吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺；

(2S)-2-甲氧基-2-[3-甲氧基-5-(三氟甲氧基)苯基]-N-[5-[[(3R)-1-哒嗪-3-基吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺；

(2R)-2-甲氧基-2-[3-甲氧基-5-(三氟甲氧基)苯基]-N-[5-[[(3R)-1-哒嗪-3-基吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺；

(2S)-2-(4-氟苯基)-2-甲氧基-N-[5-[[(3R)-1-(5-甲基哒嗪-3-基)吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺；

(2S)-2-甲氧基-2-[3-(3-甲氧基氮杂环丁烷-1-基)苯基]-N-[5-[[(3R)-1-(6-甲基哒嗪-3-基)吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺；

(2S)-2-[4-氟-3-(3-氟氮杂环丁烷-1-基)苯基]-2-甲氧基-N-[5-[[(3R)-1-哒嗪-3-基吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺；

(2S)-2-[3-(3,3-二氟氮杂环丁烷-1-基)苯基]-2-甲氧基-N-[5-[[(3R)-1-(1,2,4-三嗪-3-基)吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺；

(2S)-2-甲氧基-2-[3-(3-甲氧基氮杂环丁烷-1-基)苯基]-N-[5-[[(3R)-1-(1,2,4-三嗪-3-基)吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺；

(2S)-2-[3-(3-氟氮杂环丁烷-1-基)苯基]-2-甲氧基-N-[5-[[(3R)-1-(1,2,4-三嗪-3-基)吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺；以及

(2S)-2-甲氧基-2-[3-(氧杂环丁烷-3-基)苯基]-N-[5-[[(3R)-1-哒嗪-3-基吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺。

本说明书中描述的化合物和盐能以溶剂化形式和非溶剂化形式存在。例如，溶剂化形式可以是水合形式，如半水合物、一水合物、二水合物、三水合物或其可替代的数量。本发明包括所有这些溶剂化和非溶剂化形式的具有化学式(I)的化合物。

本说明书中描述的化合物和盐的原子能以不同的同位素形式存在。本发明包括具有化学式(I)的化合物的所有同位素形式，包括¹¹C或¹³C碳和¹H、²H(氘)或³H(氚)氢。

本说明书中所描述的化合物和盐可以按互变异构体的混合物存在。“互变异构体”是结构异构体，其存在于由氢原子的迁移产生的平衡中。本发明包括具有化学式(I)的化合物的所有互变异构体。

具有化学式(I)的化合物能以不同的非对映体形式制备。本发明包括具有化学式(I)的化合物的所有非对映体形式。

在一个实施例中，提供了具有化学式(I)的化合物，或其药学上可接受的盐，其为≥95％，≥98％或≥99％的非对映体过量(％de)的单一非对映异构体。在一个实施例中，单一非对映异构体以≥99％的非对映异构体过量(％de)存在。

认为抑制GLS1的化合物，即具有化学式(I)的化合物及其药学上可接受的盐预期在疗法(例如治疗至少部分由GLS1介导的疾病或医学病症，包括癌症)中是有用的。

在提及“癌症”的情况下，这包括非转移性癌症和转移性癌症两者，使得治疗癌症涉及治疗原发性肿瘤和肿瘤转移两者。

在一个实施例中，该癌症是转移性癌症。

在一个实施例中，该癌症是非转移性癌症。

“GLS1抑制活性”是指相对于在不存在具有化学式(I)的化合物或其药学上可接受的盐的情况下的GLS1的活性而言，作为对具有化学式(I)的化合物或其药学上可接受的盐的存在的直接或间接反应，GLS1的活性降低。这种活性的降低可以是由于具有化学式(I)的化合物或其药学上可接受的盐与GLS1的直接相互作用，或者由于具有化学式(I)的化合物或其药学上可接受的盐与转而影响GLS1活性的一种或多种其他因素的相互作用。例如，具有化学式(I)的化合物或其药学上可接受的盐可以通过直接结合GLS1、通过(直接或间接地)引起另一种因子降低GLS1活性、或通过(直接或间接地)降低细胞或生物体中存在的GLS1的量而降低GLS1。

术语“疗法”旨在具有其正常的含义：治疗疾病或矫正或补偿基础病理。术语“疗法”还包括“预防”，除非有相反的具体指示。术语“治疗的”和“治疗地”应以相应的方式被解释。

术语“治疗有效量”是指如本文任何实施例中所述的具有化学式(I)的化合物的量，该量在受试者中有效提供“治疗”。在癌症的情况下，如在以上“疗法”、“治疗”和“预防”的定义中所述的，治疗有效量可以在受试者中引起任何可观察的或可测量的变化。例如，该有效量可以减少癌症或肿瘤细胞的数量；减少整体肿瘤大小；抑制或阻止肿瘤细胞浸润到外周器官，包括例如软组织和骨；抑制和停止肿瘤转移；抑制和停止肿瘤生长；在一定程度上减轻与癌症相关的一种或多种症状；降低发病率和死亡率；提高生活质量；或这些效果的组合。有效量可以是足以减少响应于GLS1活性抑制的疾病的症状的量。对于癌症疗法，例如可以通过评估存活期、疾病进展时间(TTP)、应答率(RR)、响应期、和/或生命质量来测定体内疗效。如由本领域技术人员所认可的，有效量可以取决于给予途径、赋形剂的使用、以及与其他药剂共同使用而改变。例如，在使用联合疗法的情况下，在动物患者中，对于治疗靶向的失调，当联合时，本说明书中描述的具有化学式(I)的化合物或药学上可接受的盐的量和其他一种或多种药学上有活性的药剂的量是共同有效的。在本上下文中，如果当联合时，这些组合量足以降低对如上所述的GLS1活性的抑制有反应的疾病的症状，则这些组合量为“治疗有效量”。通常，这样的量可以由本领域技术人员通过例如从本说明书中描述的具有化学式(I)的化合物或其药学上可接受的盐的剂量范围开始来确定或从其他一种或多种药学活性化合物的批准的或公开的一个或多个剂量范围来确定。

术语“预防”旨在具有其正常含义，并包括防止疾病发展的初级预防和继发性预防，其中该疾病已经发展并且患者被暂时或永久保护对抗疾病的加重或恶化。

术语“治疗”(treatment)与“疗法”(therapy)同义地使用。类似地，术语“治疗”可以被认为是应用疗法，其中“疗法”如本文所定义。

在一个实施例中，提供了包含具有化学式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、以及至少一种药学上可接受的稀释剂或载体的药物组合物。在一个实施例中，药物组合物包括游离碱形式的具有化学式(I)的化合物。在另一个实施例中，药物组合物包括具有化学式(I)的化合物的药学上可接受的盐。

在一个实施例中，提供了具有化学式(I)的化合物，或其药学上可接受的盐，用于在疗法中使用。

在一个实施例中，提供了具有化学式(I)的化合物，或其药学上可接受的盐，用于治疗癌症。

在一个实施例中，提供了具有化学式(I)的化合物或其药学上可接受的盐用于生产治疗癌症的药物的用途。

在一个实施例中，提供了具有化学式(I)的化合物或其药学上可接受的盐，用于治疗由GLS1介导的疾病。在一个实施例中，由GLS1介导的疾病是癌症。在一些实施例中，癌症可以是乳腺癌(例如三阴性乳腺癌)、肺癌(例如非小细胞肺癌)、胰腺癌、肾癌或肝细胞癌。

“三阴性乳腺癌”是不表达或低表达雌激素受体，孕酮受体和Her2/neu的基因的任何乳腺癌。

在一个实施例中，提供具有化学式(I)的化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗由GLS1介导的疾病的药物中的用途。在一个实施例中，由GLS1介导的疾病是癌症。在一些实施例中，癌症可以是乳腺癌(例如三阴性乳腺癌)、肺癌(例如非小细胞肺癌)、胰腺癌、肾癌或肝细胞癌。

在一个实施例中，提供了抑制GLS1的方法，其包括给予具有化学式(I)的化合物。

在一个实施例中，提供了用于治疗其中GLS1的抑制在需要这种治疗的温血动物中是有益的疾病的方法，该方法包括向该温血动物给予治疗有效量的具有化学式(I)的化合物或其药学上可接受的盐。

“温血动物”包括例如人。

在一个实施例中，提供了用于在需要这种治疗的温血动物中治疗癌症的方法，该方法包括向该温血动物给予治疗有效量的具有化学式(I)的化合物或其药学上可接受的盐。在一些实施例中，癌症可以是乳腺癌(例如三阴性乳腺癌)、肺癌(例如非小细胞肺癌)、胰腺癌、肾癌或肝细胞癌。

在本说明书中所描述的癌症治疗可以作为单一疗法是有用的，或者除了给予具有化学式(I)的化合物以外，还可以包括常规手术、放射疗法或化学疗法；或这些另外的疗法的组合。这种常规手术、放射疗法或化学疗法可以与具有化学式(I)的化合物同时地、顺序地或分开地给予，以进行治疗。

因此，在一个实施例中，提供了具有化学式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、以及至少一种另外的抗肿瘤物质，用于在癌症的治疗中使用。

在一个实施例中，提供了具有化学式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、以及至少一种另外的抗肿瘤物质，用于在癌症的治疗中同时地、分开地或顺序地使用。

在一个实施例中，提供了具有化学式(I)的化合物或其药学上可接受的盐，用于在癌症的治疗中使用，其中具有化学式(I)的化合物与至少一种另外的抗肿瘤物质被同时地、分开地或顺序地给予。

在一个实施例中，提供了在需要这种治疗的温血动物中治疗癌症的方法，该方法包括向该温血动物给予具有化学式(I)的化合物或其药学上可接受的盐以及至少一种另外的抗肿瘤物质，其中具有化学式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、以及另外的抗肿瘤物质的量在产生抗癌作用方面是共同有效的。

在一个实施例中，提供了在需要这种治疗的温血动物中治疗癌症的方法，该方法包括向所述温血动物给予具有化学式(I)的化合物或其药学上可接受的盐，并且向所述温血动物同时地、分开地或顺序地给予至少一种另外的抗肿瘤物质，其中具有化学式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、以及另外的抗肿瘤物质的量在产生抗癌作用方面是共同有效的。

在任何实施例中，该另外的抗肿瘤物质是紫杉烷。在一个实施例中，紫杉烷是紫杉醇。在一个实施例中，紫杉烷是多西他赛。

在任何实施例中，另外的抗肿瘤物质是铂疗。在一个实施例中，铂疗是顺铂、奥沙利铂或卡铂。

根据另一个实施例，提供了试剂盒，其包含：

a)处于第一单位剂型的、具有化学式(I)的化合物或其药学上可接受的盐；

b)处于第二单位剂型的第二抗肿瘤物质；

c)用于容纳该第一和第二单位剂型的容器；以及任选地，

d)使用说明书。

具有化学式(I)的化合物及其药学上可接受的盐可以作为药物组合物被给予，这些药物组合物包含一种或多种药学上可接受的稀释剂或载体。因此，在一个实施例中，提供了包含具有化学式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、以及至少一种药学上可接受的稀释剂或载体的药物组合物。

这些组合物可处于适合于以下的形式：口服使用(例如作为片剂、锭剂、硬或软胶囊剂、水性或油性悬浮液、乳剂、可分散粉剂或颗粒剂、糖浆剂或酏剂)，局部使用(例如作为乳膏剂、软膏剂、凝胶剂、或者水性或油性溶液或悬浮液)，通过吸入给予(例如作为细碎粉末或液体气雾剂)，通过吹入给予(例如作为细碎粉末)，或肠胃外给予(例如作为用于静脉内、皮下、肌内给药的无菌水性或油性溶液)，或作为栓剂。可以通过常规程序使用常规药物赋形剂来获得这些组合物。因此，旨在口服使用的组合物可以含有例如一种或多种着色剂、甜味剂、调味剂和/或防腐剂。

在一个实施例中，提供了包含具有化学式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、以及至少一种药学上可接受的稀释剂或载体的药物组合物，用于在疗法中使用。

在一个实施例中，提供了包含具有化学式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、以及至少一种药学上可接受的稀释剂或载体的药物组合物，用于在癌症的治疗中使用。在一些实施例中，癌症可以是乳腺癌(例如三阴性乳腺癌)、肺癌(例如非小细胞肺癌)、胰腺癌、肾癌或肝细胞癌。

具有化学式(I)的化合物通常以5-5000mg/m²动物体面积，即约0.1-100mg/kg的单位剂量给予温血-动物，并且这通常提供治疗有效-剂量。单位剂型如片剂或胶囊剂通常含有例如1-250mg的活性成分。每日剂量将必然取决于所治疗的宿主、具体的给予途径、共给予的任何疗法、以及正在治疗的疾病的严重性而变化。因此，治疗任何具体患者的执业医生可以确定最佳剂量。[实例]

通过以下实例说明各种实施例。本发明不被解释为受限于这些实例。

在实例的制备期间，通常：

a)操作在环境温度下进行，即在约17℃至30℃的范围内和在惰性气体如氮气的气氛下进行，除非另有说明；

b)通过旋转蒸发或使用Genevac真空设备进行蒸发，并且在通过过滤去除残余固体之后进行后处理程序；

c)使用Grace Resolve预填充的二氧化硅柱在自动Isco Combiflash Companion上并且在使用Redisep Gold C18柱的(反相闪蒸)Isco Combiflash Rf上进行快速色谱纯化；

d)产率，在存在的情况下，不必是可达到的最大值；

e)具有化学式(I)的终产物的结构通过核磁共振(NMR)光谱法证实，伴随在δ规模上测量的NMR化学位移值。使用布鲁克高级(Bruker Avance)700(700MHz)，布鲁克高级(Bruker Avance)500(500MHz)，布鲁克400(400MHz)或布鲁克300(300MHz)仪器测定质子磁共振谱；¹⁹FNMR在282Mhz或376MHz测定；¹³CNMR在75MHz或100MHz测定；除非另有说明，测量在约20℃-30℃进行；使用以下缩写：s，单峰；d，双峰；t，三重峰；q，四重峰；m，多重峰；dd，双二重峰；ddd，双二重峰的双重峰；dt，双三重峰；bs，宽信号；

f)还使用基于具有2996 PDA和2000 amu ZQ单四极杆质谱仪的沃特斯(Waters)2790/95LC系统的HPLC系统，在液相色谱(LCMS)之后，通过质谱法表征具有化学式(I)的终产物。所用溶剂为A＝水，B＝乙腈，C＝50:50乙腈:水0.1％甲酸并且D＝50:50乙腈:水0.1％氢氧化铵。在1.1mL/min的流速下，将5μL样品注射到50×2.15μm Phenomenex Gemini NX柱上。梯度从95％A到95％B持续4.0分钟，恒定5％C输注(用于酸分析，D用于碱分析)。在返回开始条件之前，将流动保持在95％B下0.5分钟。在质谱仪上在正模式和负模式下在从150至850amu下并且在PDA上的220-320nm下获得数据。还在使用具有样品管理器、Acquity PDA和SQD质谱仪的沃特斯Acquity二元泵的UPLC系统上进行LCMS。所用溶剂为A1＝0.1％甲酸(水溶液)，B1 0.1％甲酸的乙腈溶液，A2＝0.1％氢氧化铵(水溶液)并且B20.1％氢氧化铵的乙腈溶液。在1mL/min的流速下，将1μL样品注射到50×2.1 1.7um沃特斯BEH柱(在40℃)。梯度经1.30分钟从97％A1至97％B1，然后保持0.2分钟并返回到开始条件(用A1和B1代替A2和B2用于碱分析)。在质谱仪上在正模式和负模式下在从150至1000amu下并且在PDA上的245-320nm下获得数据；

g)中间体通常没有完全表征，并且通过薄层色谱、质谱、HPLC和/或NMR分析评估纯度；

h)使用以下缩写：h＝小时；r.t.＝室温(约17℃-30℃)；conc.＝浓缩；FCC＝使用二氧化硅的快速柱色谱；AIBN＝偶氮二异丁腈；DCM＝二氯甲烷；DIPEA＝二异丙基乙胺；DMA＝N,N-二甲基乙酰胺；DMF＝N,N-二甲基甲酰胺；DMSO＝二甲基亚砜；EDC＝1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺；Et₂O＝乙醚；EtOAc＝乙酸乙酯；EtOH＝乙醇；HATU＝1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸盐；HOBT＝羟基苯并三唑；K₂CO₃＝碳酸钾；MeOH＝甲醇；MeCN＝乙腈；MgSO₄＝无水硫酸镁；Na₂SO₄＝无水硫酸钠；NBS＝N-溴琥珀酰亚胺；TFA＝三氟乙酸；THF＝四氢呋喃；sat.＝饱和水溶液。

在下面的许多实例中，描述了化合物的非对映体对。例如，实例1(a)和实例1(b)的化合物表示化合物的非对映体对，其在单一反应的产物中形成混合物，随后分离。在这样的实例中，立体化学的任何指定不是绝对的。作为说明，实例1(a)和1(b)涉及所述化合物的(2S,3R)和(2R,3R)非对映异构体；然而，并不意味着实例1(a)被确定地指定为(2S,3R)非对映异构体并且实例1(b)被确定为(2R,3R)非对映异构体。

实例1(a)和1(b)

(2S)-2-[3-(3-氟氮杂环丁烷-1-基)苯基]-2-甲氧基-N-[5-[[(3R)-1-哒嗪-3-基吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺和(2R)-2-[3-(3-氟氮杂环丁烷-1-基)苯基]-2-甲氧基-N-[5-[[(3R)-1-哒嗪-3-基吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺

在室温下，将HATU(351mg，0.92mmol)添加到在N-甲基-2-吡咯烷酮(2mL)和DMF(3mL)中的[2-[3-(3-氟氮杂环丁烷-1-基)苯基]-2-甲氧基-乙酰基]氧锂(中间体17，170mg，0.71mmol)，N2-[(3R)-1-哒嗪-3-基吡咯烷-3-基]-1,3,4-噻二唑-2,5-二胺(中间体1，187mg，0.71mmol)和DIPEA(0.372mL，2.13mmol)中。将所得溶液在室温下搅拌45分钟。将该溶液用MeOH(15mL)稀释并通过20g SCX柱，用MeOH冲洗，然后用1N NH₃的MeOH溶液洗脱产物。在减压下蒸发溶剂，得到粗产物，将其溶于MeOH/DCM中，并蒸发至硅胶上。将残余物通过FCC(SiO₂，0至12％MeOH的DCM溶液)纯化。将纯级分蒸发至干，得到为胶状物的非对映异构体混合物(280mg)。通过制备型HPLC(Phenomenex Lux C4柱，20μm，50mm×250mm，MeOH，120mL/min)分离非对映异构体，得到：

第一洗脱异构体实例1(a)，2-[3-(3-氟氮杂环丁烷-1-基)苯基]-2-甲氧基-N-[5-[[(3R)-1-哒嗪-3-基吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺(65mg，23％)。¹HNMR(400MHz,DMSO,30℃)δ2.232.32(1H,m),3.403.59(3H,m),3.71(1H,s),3.803.93(2H,m),4.14(2H,dd),4.37(1H,s),4.875.48(1H,m),6.43(1H,s),6.58(1H,dd),6.80(1H,ddd),6.85(1H,dd),7.17(1H,dd),7.32(1H,dd),7.64(1H,d),8.47(1H,dd),12.10(1H,s)；m/z:ES⁺[M+H]⁺485。

第二洗脱异构体实例1(b)2-[3-(3-氟氮杂环丁烷-1-基)苯基]-2-甲氧基-N-[5-[[(3R)-1-哒嗪-3-基吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺(68mg，24％)。¹HNMR(400MHz,DMSO-d6,30℃)δ2.06(1H,dd),2.28(1H,td),3.42-3.59(3H,m),3.75(1H,dd),3.8-3.93(2H,m),4.14(2H,dt),4.37(1H,dt),4.88(1H,s),5.48(1H,ddd),6.44(1H,dd),6.57-6.61(1H,m),6.81(1H,d),6.86(1H,dd),7.18(1H,t),7.32(1H,dd),7.65(1H,d),8.47(1H,dd),12.12(1H,s)。m/z:ES⁺[M+H]⁺485。

实例2(a)和2(b)

(2S)-2-[3-(3,3-二氟氮杂环丁烷-1-基)苯基]-2-甲氧基-N-[5-[[(3R)-1-哒嗪-3-基吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺和(2R)-2-[3-(3,3-二氟氮杂环丁烷-1-基)苯基]-2-甲氧基-N-[5-[[(3R)-1-哒嗪-3-基吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺

在室温下，将HATU(225mg，0.59mmol)添加到在N-甲基-2-吡咯烷酮(2mL)和DMF(3mL)中的2-[3-(3,3-二氟氮杂环丁烷-1-基)苯基]-2-甲氧基-乙酸(中间体22，117mg，0.46mmol)、N2-[(3R)-1-哒嗪-3-基吡咯烷-3-基]-1,3,4-噻二唑-2,5-二胺(中间体1，120mg，0.46mmol)和DIPEA(0.239mL，1.37mmol)中。将所得溶液在室温下搅拌45分钟。将该溶液用MeOH(15mL)稀释并通过20g SCX2柱，用MeOH冲洗以除去杂质，随后用1N NH₃的MeOH溶液洗脱产物。在减压下蒸发溶剂，得到粗产物，将其通过FCC(SiO₂，0至6％MeOH的DCM溶液)纯化。蒸发纯级分，得到为胶状物的非对映异构体的混合物的产物(135mg)。通过制备型HPLC(Phenomenex Lux C2柱，20μm，50mm×250mm，MeOH/EtOH，120mL/min)分离非对映异构体，得到：

第一洗脱异构体实例2(a)2-[3-(3,3-二氟氮杂环丁烷-1-基)苯基]-2-甲氧基-N-[5-[[(3R)-1-哒嗪-3-基吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺(55mg，41％)。¹HNMR(400MHz,DMSO-d6,30℃)δ2.07(1H,dt),2.22-2.32(1H,m),3.48(1H,dd),3.51-3.59(2H,m),3.74(1H,dd),4.25(4H,t),4.37(1H,dq),4.89(1H,s),6.49-6.56(1H,m),6.67(1H,d),6.81-6.91(2H,m),7.21(1H,t),7.31(1H,dd),7.64(1H,d),8.46(1H,dd),12.11(1H,s).m/z:ES⁺[M+H]⁺503。

第二洗脱异构体实例2(b)2-[3-(3,3-二氟氮杂环丁烷-1-基)苯基]-2-甲氧基-N-[5-[[(3R)-1-哒嗪-3-基吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺(61mg，45％)。¹HNMR(400MHz,DMSO-d6,30℃)2.00-2.11(1H,m),2.22-2.31(1H,m),3.48(1H,dd),3.52-3.59(2H,m),3.74(1H,dd),4.25(4H,t),4.36(1H,dt),4.88(1H,s),6.52(1H,dd),6.66(1H,s),6.82-6.91(2H,m),7.21(1H,t),7.31(1H,dd),7.61(1H,d),8.47(1H,dd),12.11(1H,s).m/z:ES⁺[M+H]⁺503。

实例3(a)和3(b)

(2S)-2-甲氧基-2-[3-(3-甲氧基氮杂环丁烷-1-基)苯基]-N-[5-[[(3R)-1-哒嗪-3-基吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺和(2R)-2-甲氧基-2-[3-(3-甲氧基氮杂环丁烷-1-基)苯基]-N-[5-[[(3R)-1-哒嗪-3-基吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺

在室温下，将HATU(216mg，0.57mmol)添加到在N-甲基-2-吡咯烷酮(2mL)和在DMF(3mL)中的2-甲氧基-2-[3-(3-甲氧基氮杂环丁烷-1-基)苯基]乙酸(中间体25，110mg，0.44mmol)、N2-[(3R)-1-哒嗪-3-基吡咯烷-3-基]-1,3,4-噻二唑-2,5-二胺(中间体1，115mg，0.44mmol)和DIPEA(0.229mL，1.31mmol)中。将所得溶液在室温下搅拌45分钟。将该溶液用MeOH(15mL)稀释并通过20g SCX2柱，用MeOH冲洗以除去杂质，随后用1N NH₃的MeOH溶液洗脱产物。在减压下蒸发溶剂，得到粗产物。将粗产物溶解于MeOH/DCM中，并蒸发至硅胶上。通过FCC(SiO₂，0至10％MeOH的DCM溶液)纯化残余物。将纯级分蒸发至干，得到为胶状物的非对映体混合物形式的产物(140mg)。通过制备型HPLC(Lux C4柱，20μm，50mm×250mm，100％MeOH，120mL/min)分离合并的非对映异构体，得到：

第一洗脱异构体实例3(a)2-甲氧基-2-[3-(3-甲氧基氮杂环丁烷-1-基)苯基]-N-[5-[[(3R)-1-哒嗪-3-基吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺(74mg，15％)。¹HNMR(400MHz,DMSO-d6,30℃)δ2.13(1H,td),2.3-2.38(1H,m),3.30(3H,s),3.35(3H,s),3.54(1H,dd),3.58-3.67(4H,m),3.81(1H,dd),4.05-4.12(2H,m),4.37(1H,ddd),4.44(1H,dq),4.92(1H,s),6.45(1H,dd),6.61(1H,d),6.82(1H,d),6.91(1H,dd),7.21(1H,t),7.38(1H,dd),7.71(1H,d),8.53(1H,dd),12.16(1H,s).m/z:ES⁺[M+H]⁺497。

第二洗脱异构体实例3(b)2-甲氧基-2-[3-(3-甲氧基氮杂环丁烷-1-基)苯基]-N-[5-[[(3R)-1-哒嗪-3-基吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺(67mg，14％)。¹HNMR(400MHz,DMSO-d6,30℃)δ2.11(1H,dq),2.33(1H,dt),3.29(3H,s),3.34(3H,s),3.54(1H,dd),3.58-3.66(4H,m),3.80(1H,dd),4.05-4.12(2H,m),4.36(1H,ddd),4.4-4.47(1H,m),4.91(1H,s),6.44(1H,dd),6.60(1H,s),6.82(1H,d),6.91(1H,dd),7.20(1H,t),7.37(1H,dd),7.69(1H,d),8.53(1H,dd),12.15(1H,s).m/z:ES⁺[M+H]⁺497。

实例4(a)和4(b)

(2S)-2-(3,5-二甲氧基苯基)-2-甲氧基-N-[5-[[(3R)-1-(6-甲基哒嗪-3-基)吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺和(2R)-2-(3,5-二甲氧基苯基)-2-甲氧基-N-[5-[[(3R)-1-(6-甲基哒嗪-3-基)吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺

在21℃下，在氮气下，将HATU(329mg，0.87mmol)添加到在DMF(6mL)中的2-(3,5-二甲氧基苯基)-2-甲氧基-乙酸(中间体28，196mg，0.87mmol)、N2-[(3R)-1-(6-甲基哒嗪-3-基)吡咯烷-3-基]-1,3,4-噻二唑-2,5-二胺(中间体6，200mg，0.72mmol)和DIPEA(0.252mL，1.44mmol)中。将所得溶液在21℃下搅拌2小时。使用SCX柱通过离子交换色谱法纯化粗混合物。使用1M NH₃的MeOH溶液将所需产物从柱上洗脱，将纯级分蒸发至干，得到粗产物，将其通过FCC(SiO₂，0至12％MeOH的DCM溶液)纯化。将纯级分蒸发至干，得到棕色胶状物，通过FCC(SiO₂，0至8％MeOH的DCM溶液)再纯化。将纯级分蒸发至干，得到为黄色胶状物的非对映异构体的混合物。非对映异构体通过制备型HPLC(Lux C2柱，20μm，50mm×250mm，100％MeOH，120mL/min)分离，得到：

第一洗脱异构体实例4(a)2-(3,5-二甲氧基苯基)-2-甲氧基-N-[5-[[(3R)-1-(6-甲基哒嗪-3-基)吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺(21mg，6％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d6,27℃)δ1.982.10(1H,m),2.182.31(1H,m),2.40(3H,s),3.30(9H,dd),3.43(1H,dd),3.47(2H,dd),3.724.36(1H,m),4.87(1H,s),6.45-7.40(1H,m),6.62(2H,dd),6.81(1H,d),7.21(1H,s),7.64(1H,s),12.12(1H,s)；m/z:ES⁺[M+H]⁺486。

第二洗脱异构体实例4(b)2-(3,5-二甲氧基苯基)-2-甲氧基-N-[5-[[(3R)-1-(6-甲基哒嗪-3-基)吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺(18mg，5％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d6,27℃)δ1.98-2.10(1H,m),2.18-2.31(1H,m),2.40(3H,s),3.30(9H,s),3.43(1H,m),3.47-3.61(2H,m),3.72(1H,m),4.36(1H,m),4.87(1H,s),6.45(1H,t),6.62(2H,d),6.81(1H,d),7.21(1H,d),7.64(1H,s),12.12(1H,s).m/z:ES⁺[M+H]⁺486。

实例5(a)和5(b)

(2R)-3-甲氧基-2-(3-甲氧基苯基)-N-[5-[[(3R)-1-哒嗪-3-基吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]丙酰胺和(2S)-3-甲氧基-2-(3-甲氧基苯基)-N-[5-[[(3R)-1-哒嗪-3-基吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]丙酰胺

将DIPEA(0.1mL，0.57mmol)、HATU(173.28mg，0.456mmol)和3-甲氧基-2-(3-甲氧基苯基)丙酸(中间体29，0.09g，0.418mmol)添加到在DMF(4mL)中的N2-[(3R)-1-哒嗪-3-基吡咯烷-3-基]-1,3,4-噻二唑-2,5-二胺(中间体1，0.1g，0.38mmol)溶液中。将混合物在室温下搅拌18小时。将其用水(5mL)稀释，萃取到DCM(10mL)中，蒸发并通过制备型HPLC(SunFire C18柱，5μm，50mm×19mm，流速25mL/min)纯化。使用极性比率渐减的含有0.1％甲酸的水和MeCN作为流动相。将纯级分通过SCX柱，用甲醇洗涤，然后用2M NH₃的MeOH溶液洗脱。将碱性级分蒸发至干，并通过SFC(Lux C1柱5μm，21.2mm×250mm，在40℃，50mL/min的流速，50:50MeOH:CO₂，包含0.1％v/vNH₃)分离非对映异构体的混合物，得到：

第一洗脱异构体实例5(a)3-甲氧基-2-(3-甲氧基苯基)-N-[5-[[(3R)-1-哒嗪-3-基吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]丙酰胺(25.3mg，14.6％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d6,25℃)δ2.00-2.12(1H,m),2.22-2.31(1H,m),3.25(3H,s),3.45-3.59(4H,m),3.71-3.79(4H,m),3.97(1H,t),4.03-4.10(1H,m),4.31-4.43(1H,m),6.83-6.94(4H,m),7.26(1H,t),7.33(1H,dd),7.68(1H,d),8.48(1H,dd),12.23(1H,s).m/z:ES⁺[M+H]⁺456。

第二洗脱异构体实例5(b)3-甲氧基-2-(3-甲氧基苯基)-N-[5-[[(3R)-1-哒嗪-3-基吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]丙酰胺(22.3mg，12.8％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d6,25℃)δ2.00-2.14(1H,m),2.22-2.36(1H,m),3.25(3H,s),3.43-3.52(2H,m),3.52-3.61(2H,m),3.69-3.78(4H,m),3.97(1H,t),4.01-4.10(1H,m),4.31-4.43(1H,m),6.79-6.95(4H,m),7.26(1H,t),7.33(1H,dd),7.68(1H,d),8.47(1H,dd),12.23(1H,s).m/z:ES⁺[M+H]⁺456。

实例6(a)和6(b)

(2S)-2-(3,5-二甲氧基苯基)-2-乙氧基-N-[5-[[(3R)-1-哒嗪-3-基吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺和(2R)-2-(3,5-二甲氧基苯基)-2-乙氧基-N-[5-[[(3R)-1-哒嗪-3-基吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺

在室温下，在N₂下，将N2-[(3R)-1-哒嗪-3-基吡咯烷-3-基]-1,3,4-噻二唑-2,5-二胺(中间体1，0.2g，0.76mmol)和2-(3,5-二甲氧基苯基)-2-乙氧基-乙酸(中间体33，0.18g，0.76mmol)溶解到DMF(2mL)中。将混合物搅拌5分钟，然后加入DIPEA(0.34mL，1.943mmol)和HATU(0.29g，0.76mmol)，然后在室温下搅拌1小时。使粗混合物通过5g SCX柱，用MeOH洗涤，然后用2N NH₃的MeOH溶液洗脱。将碱性级分通过制备型HPLC(SunFire C18柱，5μm，50mm×19mm，流速25mL/min)纯化。使用极性比率渐减的含有0.1％甲酸的水和MeCN作为流动相。将纯级分在减压下蒸发并通过2g SCX柱，用MeOH洗涤，然后用2N NH₃的MeOH溶液洗脱。在减压下蒸发碱性级分，得到产物为米色泡沫的非对映异构体的混合物。通过SFC(Amy-C柱，5μm，20mm×250mm，含有NH₃作为改性剂的MeOH/CO₂45％，50mL/min)分离非对映异构体，得到：

第一洗脱异构体实例6(a)2-(3,5-二甲氧基苯基)-2-乙氧基-N-[5-[[(3R)-1-哒嗪-3-基吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺(70mg，19％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d6,21℃)δ1.16(3H,t),2.04(1H,dq),3.38-3.50(3H,m),3.51-3.58(2H,m),3.66-3.78(7H,m),4.35(1H,q),4.96(1H,s),6.44(1H,t),6.62(2H,d),6.84(1H,dd),7.30(1H,dd),7.67(1H,d),8.45(1H,dd),11.96(1H,s).m/z:ES⁺[M+H]⁺486。

第二洗脱异构体实例6(b)2-(3,5-二甲氧基苯基)-2-乙氧基-N-[5-[[(3R)-1-哒嗪-3-基吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺(74mg，20％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d6,21℃)δ1.18(3H,t),2.07(1H,dt),2.27(1H,dt),3.60-3.39(5H,m),3.79-3.70(6H,m),4.38(1H,q),4.99(1H,s),6.47(1H,t),6.64(2H,d),6.88(1H,dd),7.34(1H,dd),7.71(1H,d),8.48(1H,dd),12.15(1H,s).m/z:ES⁺[M+H]⁺486。

实例7(a)和7(b)

(2S)-2-[4-氟-3-(3-甲氧基氮杂环丁烷-1-基)苯基]-2-甲氧基-N-[5-[(3R)-3-(哒嗪-3-基氨基)吡咯烷-1-基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺和(2R)-2-[4-氟-3-(3-甲氧基氮杂环丁烷-1-基)苯基]-2-甲氧基-N-[5-[(3R)-3-(哒嗪-3-基氨基)吡咯烷-1-基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺

在室温下，在氮气下，将N2-[(3R)-1-哒嗪-3-基吡咯烷-3-基]-1,3,4-噻二唑-2,5-二胺(中间体1，108mg，0.41mmol)和2-[4-氟-3-(3-甲氧基氮杂环丁烷-1-基)苯基]-2-甲氧基-乙酸(中间体34，110mg，0.41mmol)溶解到DMF(3.5mL)中。将混合物搅拌5分钟，然后加入DIPEA(0.11mL，0.61mmol)和HATU(186mg，0.49mmol)，然后在室温下搅拌过夜。将粗混合物用水(50mL)稀释，然后萃取到DCM(3×50mL)中。将有机层干燥(MgSO₄)，过滤，然后蒸发，得到橙色胶状物，将其通过制备型HPLC(SunFire C18柱，5μm，50mm×19mm，流速25mL/min)纯化。使用极性比率渐减的含有0.1％甲酸的水和MeCN作为流动相。合并含有所需产物的级分，蒸发并通过5g SCX柱，用MeOH洗涤，然后用2M NH₃的MeOH溶液洗脱。蒸发碱性级分，得到非对映异构体的混合物。然后通过SFC(LuxC3柱，5μm，21.2mm×250mm，含有NH₃改性剂的MeOH/CO₂30％，50mL/min)分离非对映异构体，得到：

第一洗脱异构体实例7(a)2-[4-氟-3-(3-甲氧基氮杂环丁烷-1-基)苯基]-2-甲氧基-N-[5-[(3R)-3-(哒嗪-3-基氨基)吡咯烷-1-基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺(11mg，5％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d6,21℃)δ1.94-2.12(1H,m),2.19-2.36(1H,m),3.23(3H,s),3.27(3H,s),3.43-3.61(3H,m),3.62-3.77(3H,m),4.07-4.19(2H,m),4.22-4.30(1H,m),4.32-4.43(1H,m),4.87(1H,s),6.66(1H,dd),6.73-6.84(1H,m),6.86(1H,dd),7.04(1H,dd),7.32(1H,dd),7.70(1H,d),8.47(1H,dd),12.18(1H,s).m/z:ES⁺[M+H]⁺515。

第二洗脱异构体实例7(b)2-[4-氟-3-(3-甲氧基氮杂环丁烷-1-基)苯基]-2-甲氧基-N-[5-[(3R)-3-(哒嗪-3-基氨基)吡咯烷-1-基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺(11mg，5％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d6,21℃)δ2.00-2.13(1H,m),2.22-2.34(1H,m),3.23(3H,s),3.28(3H,s),3.42-3.60(3H,m),3.63-3.80(3H,m),4.09-4.18(2H,m),4.24-4.33(1H,m),4.43-4.45(1H,m),4.87(1H,s),6.67(1H,dd),6.75-6.83(1H,m),6.87(1H,dd),7.05(1H,dd),7.33(1H,dd),7.70(1H,d),8.48(1H,dd),12.18(1H,s).m/z:ES⁺[M+H]⁺515。

实例8(a)和8(b)

(2S)-2-[4-氟-3-(3-氟氮杂环丁烷-1-基)苯基]-2-甲氧基-N-[5-[[(3R)-1-哒嗪-3-基吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺和(2R)-2-[4-氟-3-(3-氟氮杂环丁烷-1-基)苯基]-2-甲氧基-N-[5-[[(3R)-1-哒嗪-3-基吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺

在室温下，在N₂下，将N2-[(3R)-1-哒嗪-3-基吡咯烷-3-基]-1,3,4-噻二唑-2,5-二胺(中间体1，100mg，0.38mmol)和2-[4-氟-3-(3-氟氮杂环丁烷-1-基)苯基]-2-甲氧基-乙酸锂(中间体38，100mg，0.38mmol)溶解到DMF(2.0mL)中。将混合物搅拌5分钟，然后加入DIPEA(0.10mL，0.57mmol)和HATU(173mg，0.46mmol)，然后在室温下搅拌过夜。使粗混合物通过5g SCX柱，用MeOH洗涤，然后用2M NH₃的MeOH溶液洗脱。蒸发碱性级分，得到橙色胶状物。粗产物通过制备型HPLC(SunFire C18柱，5μm，50mm×19mm，25mL/min)纯化。使用极性比率渐减的含有0.1％甲酸的水和MeCN作为流动相。合并含有级分的产物，蒸发并通过5g SCX柱，用MeOH洗涤，然后用2M NH₃的MeOH溶液洗脱。蒸发碱性级分，得到为灰白色固体(94mg)的非对映异构体的混合物。非对映异构体通过制备型HPLC(Lux C4柱，20μm，50mm×250mm，MeOH/EtOH，120mL/min)分离，得到：

第一洗脱异构体实例8(a)2-[4-氟-3-(3-氟氮杂环丁烷-1-基)苯基]-2-甲氧基-N-[5-[[(3R)-1-哒嗪-3-基吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺(33mg，17％)。¹HNMR(400MHz,DMSO,31℃)2.03-2.13(1H,m),2.24-2.33(1H,m),3.49(1H,dd),3.54-3.61(2H,m),3.75(1H,dd),3.97(2H,dd),4.19-4.31(2H,m),4.35-4.43(1H,m),4.89(1H,s),5.36-5.56(1H,m),6.71(1H,dd),6.8-6.89(2H,m),7.07(1H,dd),7.32(1H,dd),7.65(1H,d),8.48(1H,dd),12.13(1H,s).m/z:ES⁺[M+H]⁺503。

第二洗脱异构体实例8(b)2-[4-氟-3-(3-氟氮杂环丁烷-1-基)苯基]-2-甲氧基-N-[5-[[(3R)-1-哒嗪-3-基吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺(34mg，18％)。¹HNMR(400MHz,DMSO,30℃)2.01-2.11(1H,m),2.24-2.34(1H,m),3.47-3.61(3H,m),3.76(1H,dd),3.97(2H,dd),4.18-4.32(2H,m),4.35-4.43(1H,m),4.88(1H,s),5.35-5.57(1H,m),6.71(1H,dd),6.81-6.89(2H,m),7.07(1H,dd),7.33(1H,dd),7.64(1H,d),8.48(1H,d),12.14(1H,s),21指定的Hs：加上未观察到的OMe质子-在3.30ppm下被溶剂遮蔽。m/z:ES⁺[M+H]⁺503。

实例9(a)和9(b)

(2S)-N-[5-[[(3R)-1-(6-氟哒嗪-3-基)吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]-2-甲氧基-2-[3-(3-甲氧基氮杂环丁烷-1-基)苯基]乙酰胺和(2R)-N-[5-[[(3R)-1-(6-氟哒嗪-3-基)吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]-2-甲氧基-2-[3-(3-甲氧基氮杂环丁烷-1-基)苯基]乙酰胺

在室温下，在N₂下，将N2-[(3R)-1-(6-氟哒嗪-3-基)吡咯烷-3-基]-1,3,4-噻二唑-2,5-二胺(中间体9，0.11g，0.389mmol)和[2-甲氧基-2-[3-(3-甲氧基氮杂环丁烷-1-基)苯基]乙酰基]氧锂(中间体24，0.12g，0.466mmol)溶解到DMF(2mL)中。将混合物搅拌5分钟，然后加入DIPEA(0.34mL，1.943mmol)和HATU(0.4mL，0.389mmol)，然后在室温下搅拌持续2小时。将粗混合物静置过夜，然后通过5g SCX柱，用MeOH洗涤，然后用2N NH₃的MeOH溶液洗脱。蒸发碱性级分，得到橙色胶状物，将其通过制备型HPLC(SunFire C18柱，5μm，50mm×19mm，流速25mL/min)纯化。使用极性比率渐减的含有0.1％甲酸的水和MeCN作为流动相。合并纯级分，蒸发并通过1g SCX柱，用MeOH洗涤，然后用2N NH₃的MeOH溶液洗脱，得到为灰白色固体的非对映异构体的混合物。非对映异构体的混合物通过制备型手性HPLC(Phenomenex Lux C4柱，20μm，50mm×250mm，洗脱液MeOH，120mL/min)分离，得到：

第一洗脱异构体实例9(a)N-[5-[[(3R)-1-(6-氟哒嗪-3-基)吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]-2-甲氧基-2-[3-(3-甲氧基氮杂环丁烷-1-基)苯基]乙酰胺(39.1mg，19.5％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d6,21℃)δ2.07(1H,dt),2.27(1H,dt),3.24(3H,s),3.28(3H,s),3.46(1H,dd),3.50-3.61(4H,m),3.73(1H,dd),4.00-4.07(2H,m),4.27-4.42(2H,m),4.84(1H,s),6.39(1H,dd),6.55(1H,s),6.76(1H,d),7.12-7.20(2H,m),7.36(1H,dd),7.63(1H,d),12.16(1H,s)。m/z:ES⁺[M+H]⁺515。

第二洗脱异构体实例9(b)N-[5-[[(3R)-1-(6-氟哒嗪-3-基)吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]-2-甲氧基-2-[3-(3-甲氧基氮杂环丁烷-1-基)苯基]乙酰胺(42.8mg，21.4％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d6,21℃)δ2.05(1H,td),2.27(1H,dt),3.24(3H,s),3.28(3H,s),3.47(1H,dd),3.5-3.6(4H,m),3.73(1H,dd),3.99-4.07(2H,m),4.27-4.4(2H,m),4.83(1H,s),6.39(1H,dd),6.55(1H,d),6.77(1H,d),7.12-7.2(2H,m),7.36(1H,dd),7.59(1H,d),12.17(1H,s).m/z:ES⁺[M+H]⁺515。

实例10(a)和10(b)

(2S)-2-[3-(3-氟氮杂环丁烷-1-基)-5-甲氧基-苯基]-2-甲氧基-N-[5-[[(3R)-1-哒嗪-3-基吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺和(2R)-2-[3-(3-氟氮杂环丁烷-1-基)-5-甲氧基-苯基]-2-甲氧基-N-[5-[[(3R)-1-哒嗪-3-基吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺

在室温下，在N₂下，将N2-[(3R)-1-哒嗪-3-基吡咯烷-3-基]-1,3,4-噻二唑-2,5-二胺(中间体1，134mg，0.51mmol)和2-[3-(3-氟氮杂环丁烷-1-基)-5-甲氧基-苯基]-2-甲氧基-乙酸锂(中间体40，137mg，0.51mmol)溶解到DMF(2mL)中。将混合物搅拌5分钟，然后加入DIPEA(0.13mL，0.76mmol)和HATU(232mg，0.61mmol)，然后在室温下搅拌过夜。使粗混合物通过5g SCX柱，用MeOH洗涤，然后用2M NH₃的MeOH溶液洗脱。蒸发碱性级分，得到橙色胶状物，将其通过制备型HPLC(SunFire C18柱，5μm，50mm×19mm，流速25mL/min)纯化。使用极性比率渐减的含有0.1％甲酸的水和MeCN作为流动相。合并含有所需物质的级分，蒸发并通过5g SCX柱，用MeOH洗涤，然后用2M NH₃的MeOH溶液洗脱。蒸发碱性级分，得到为灰白色固体(123mg)的非对映异构体的混合物。非对映异构体通过制备型HPLC(Lux C4柱，20μm，50mm×250mm，100％MeOH，120mL/min)分离，得到：

第一洗脱异构体实例10(a)2-[3-(3-氟氮杂环丁烷-1-基)-5-甲氧基-苯基]-2-甲氧基-N-[5-[[(3R)-1-哒嗪-3-基吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺(45mg，17％)。¹H NMR(400MHz,DMSO,22℃)2.07(1H,dq),2.28(1H,dt),3.28(3H,s),3.49(1H,dd),3.52-3.59(2H,m),3.71(3H,s),3.74(1H,dd),3.80-3.86(1H,m),3.86-3.92(1H,m),4.06-4.20(2H,m),4.37(1H,dt),4.82(1H,s),5.47(1H,dtd),5.98(1H,t),6.13-6.21(1H,m),6.39-6.45(1H,m),6.86(1H,dd),7.33(1H,dd),7.67(1H,d),8.48(1H,dd),12.13(1H,s).m/z:ES⁺[M+H]⁺515。

第二洗脱异构体实例10(b)2-[3-(3-氟氮杂环丁烷-1-基)-5-甲氧基-苯基]-2-甲氧基-N-[5-[[(3R)-1-哒嗪-3-基吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺(46mg，17％)。¹H NMR(400MHz,DMSO,22℃)2.06(1H,dq),2.27(1H,dt),3.28(3H,s),3.49(1H,dd),3.53-3.59(2H,m),3.71(3H,s),3.75(1H,dd),3.80-3.86(1H,m),3.87-3.92(1H,m),4.13(2H,dt),4.37(1H,dt),4.81(1H,s),5.47(1H,dtt),5.97(1H,t),6.13-6.23(1H,m),6.38-6.45(1H,m),6.87(1H,dd),7.33(1H,dd),7.64(1H,d),8.48(1H,dd),12.15(1H,s).m/z:ES⁺[M+H]⁺515。

实例11(a)和11(b)

(2S)-2-甲氧基-2-[3-甲氧基-5-(三氟甲氧基)苯基]-N-[5-[[(3R)-1-哒嗪-3-基吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺和(2R)-2-甲氧基-2-[3-甲氧基-5-(三氟甲氧基)苯基]-N-[5-[[(3R)-1-哒嗪-3-基吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺

在室温下，在N₂下，将N2-[(3R)-1-哒嗪-3-基吡咯烷-3-基]-1,3,4-噻二唑-2,5-二胺(中间体1，100mg，0.38mmol)和2-甲氧基-2-[3-甲氧基-5-(三氟甲氧基)苯基]乙酸(中间体44，191mg，0.68mmol)溶解到DMF(3.5mL)中。将混合物搅拌5分钟，然后加入DIPEA(0.1mL，0.57mmol)和HATU(173mg，0.46mmol)，然后在室温下搅拌过夜。将粗混合物用水(50mL)稀释并萃取到DCM(50mL×2)中。将有机层干燥(MgSO₄)，过滤并蒸发，得到橙色胶状物，将其通过制备型HPLC(SunFire C18柱，5μm，50mm×19mm，流速25mL/min)纯化。使用极性比率渐减的含有0.1％甲酸的水和MeCN作为流动相。合并含有所需物质的级分，蒸发并通过5g SCX柱，用MeOH洗涤，然后用2M NH₃的MeOH溶液洗脱。蒸发碱性级分，得到黄色固体。通过制备型HPLC(Phenomenex Lux C2柱，20μm，50mm×250mm，使用EtOH/MeOH的50/50混合物作为洗脱剂，120mL/min)分离非对映异构体的混合物，得到：

第一洗脱异构体实例11(a)2-甲氧基-2-[3-甲氧基-5-(三氟甲氧基)苯基]-N-[5-[[(3R)-1-哒嗪-3-基吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺(9.1mg，4.5％)。¹HNMR(400MHz,CDCl₃,30℃)δ2.28(1H,dd),2.35-2.47(1H,m),3.48(3H,s),3.56-3.71(2H,m),3.73-3.83(4H,m),3.87(1H,dd),4.52(1H,s),4.84(1H,s),6.25(1H,s),6.56(1H,dd),6.71-6.76(1H,m),6.89-6.95(2H,m),7.11(1H,dd),8.48(1H,dd).m/z:ES⁺[M+H]⁺526。

第二洗脱异构体实例11(b)2-甲氧基-2-[3-甲氧基-5-(三氟甲氧基)苯基]-N-[5-[[(3R)-1-哒嗪-3-基吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺(10.2mg5.1％)。¹HNMR(400MHz,CDCl₃,30℃)δ2.20-2.31(1H,m),2.35-2.47(1H,m),3.47(3H,s),3.56-3.78(3H,m),3.80(3H,s),3.84-3.93(1H,m),4.50(1H,s),4.84(1H,s),6.14(1H,s),6.57(1H,d),6.73(1H,s),6.92(2H,d),7.12(1H,dd),8.49(1H,s).m/z:ES⁺[M+H]⁺526。

实例12(a)和12(b)

(2S)-2-甲氧基-2-[3-(3-甲氧基氮杂环丁烷-1-基)苯基]-N-[5-[[(3R)-1-(6-甲基哒嗪-3-基)吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺和(2R)-2-甲氧基-2-[3-(3-甲氧基氮杂环丁烷-1-基)苯基]-N-[5-[[(3R)-1-(6-甲基哒嗪-3-基)吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺

在室温下，在N₂下，将N2-[(3R)-1-(6-甲基哒嗪-3-基)吡咯烷-3-基]-1,3,4-噻二唑-2,5-二胺(中间体6，0.11g，0.389mmol)和[2-甲氧基-2-[3-(3-甲氧基氮杂环丁烷-1-基)苯基]乙酰基]氧锂(中间体24，0.12g，0.466mmol)溶解到DMF(2mL)中。将混合物搅拌5分钟，然后加入DIPEA(0.34mL，1.943mmol)和HATU(0.4mL，0.389mmol)，然后在室温下搅拌持续2小时。使粗混合物通过5g SCX柱，用MeOH洗涤，然后用2N NH₃的MeOH溶液洗脱。蒸发碱性级分并通过制备型HPLC(SunFire C18柱，5μm，50mm×19mm，25mL/min)纯化。使用极性比率渐减的含有0.1％甲酸的水和MeCN作为流动相。合并纯级分，蒸发并通过1g SCX柱，用MeOH洗涤，然后用2N NH₃的MeOH溶液洗脱，得到为灰白色固体(98mg)的非对映异构体的混合物。非对映异构体通过制备型HPLC(Lux C4柱，20μm，50mm×250mm，100％MeOH，120mL/min)分离，得到：

第一洗脱异构体实例12(a)2-甲氧基-2-[3-(3-甲氧基氮杂环丁烷-1-基)苯基]-N-[5-[[(3R)-1-(6-甲基哒嗪-3-基)吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺(34mg，18％)。¹H NMR(400MHz,DMSO,30℃)2.00-2.11(1H,m),2.30(1H,dt),2.41(3H,s),3.25(3H,s),3.45(1H,dd),3.49-3.62(4H,m),3.73(1H,dd),4.04(2H,t),4.28-4.41(2H,m),4.86(1H,s),6.40(1H,d),6.55(1H,s),6.77(1H,d),6.82(1H,d),7.15(1H,t),7.22(1H,d),7.62(1H,d),12.06(1H,s)；m/z:ES⁺[M+H]⁺511。

第二洗脱异构体实例12(b)2-甲氧基-2-[3-(3-甲氧基氮杂环丁烷-1-基)苯基]-N-[5-[[(3R)-1-(6-甲基哒嗪-3-基)吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺(38mg，19％)。¹H NMR(400MHz,DMSO,30℃)2.05(1H,dt),2.27(1H,dt),2.42(3H,s),3.25(3H,s),3.46(1H,dd),3.5-3.61(4H,m),3.74(1H,dd),4.04(2H,t),4.28-4.41(2H,m),4.85(1H,s),6.39(1H,dd),6.55(1H,s),6.77(1H,d),6.82(1H,d),7.15(1H,t),7.22(1H,d),7.58(1H,d),12.09(1H,s).m/z:ES⁺[M+H]⁺511。

实例13(a)和13(b)

(2S)-2-甲氧基-2-[3-(3-甲氧基氮杂环丁烷-1-基)苯基]-N-[5-[[(3R)-1-(1,2,4-三嗪-3-基)吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺和(2R)-2-甲氧基-2-[3-(3-甲氧基氮杂环丁烷-1-基)苯基]-N-[5-[[(3R)-1-(1,2,4-三嗪-3-基)吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺

将2-甲氧基-2-[3-(3-甲氧基氮杂环丁烷-1-基)苯基]乙酰基]氧锂(中间体24，0.12g，0.475mmol)和N2-[(3R)-1-(1,2,4-三嗪-3-基)吡咯烷-3-基]-1,3,4-噻二唑-2,5-二胺(中间体12，0.13g，0.475mmol)称重到圆底烧瓶中。添加DMF(3mL)和DIPEA(0.15g，1.187mmol)，然后加入HATU(0.18g，0.475mol)，将所得溶液在室温下搅拌，在N₂下搅拌15小时，将反应混合物加入SCX柱并用MeOH洗涤，然后用2M NH₃的MeOH溶液洗脱。在减压下蒸发碱性级分，并通过制备型HPLC(SunFire C18柱，5μm，50mm×19mm，25mL/min)纯化残余物。使用极性比率渐减的含有0.1％甲酸的水和MeCN作为流动相。将含有所需物质的级分在减压下蒸发，得到为橙色胶状物的非对映异构体的混合物。通过制备型手性HPLC(LuxC1柱，5μm，21mm×250mm，洗脱液20:80庚烷:EtOH，含有0.1％NH₃，21mL/min)分离非对映异构体，得到：

第一洗脱异构体实例13(a)2-甲氧基-2-[3-(3-甲氧基氮杂环丁烷-1-基)苯基]-N-[5-[[(3R)-1-(1,2,4-三嗪-3-基)吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺(55.2mg，16.5％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d6,30℃)δ2.09(1H,s),2.30(1H,d),3.24(3H,s),3.29(3H,s),3.53-3.90(6H,m),4.03(2H,tt),4.27-4.42(2H,m),4.86(1H,s),6.40(1H,ddd),6.55(1H,s),6.74-6.80(1H,m),7.15(1H,t),7.70(1H,d),8.32(1H,d),8.61(1H,d),12.17(1H,s).m/z:ES⁺[M+H]⁺498。

第二洗脱异构体实例13(b)2-甲氧基-2-[3-(3-甲氧基氮杂环丁烷-1-基)苯基]-N-[5-[[(3R)-1-(1,2,4-三嗪-3-基)吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺(54.2mg，13.7％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d6,30℃)δ1.98-2.08(1H,m),2.19-2.28(1H,m),3.18(3H,s),3.22(3H,s),3.47-3.84(6H,m),3.93-4.02(2H,m),4.21-4.36(2H,m),4.80(1H,s),6.34(1H,ddd),6.49(1H,s),6.67-6.74(1H,m),7.09(1H,t),7.64(1H,d),8.26(1H,d),8.55(1H,d),12.11(1H,s).m/z:ES⁺[M+H]⁺498。

实例14(a)和14(b)

(2S)-2-[3-(3,3-二氟氮杂环丁烷-1-基)苯基]-2-甲氧基-N-[5-[[(3R)-1-(1,2,4-三嗪-3-基)吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺和(2R)-2-[3-(3,3-二氟氮杂环丁烷-1-基)苯基]-2-甲氧基-N-[5-[[(3R)-1-(1,2,4-三嗪-3-基)吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺

向圆底烧瓶中称取N2-[(3R)-1-(1,2,4-三嗪-3-基)吡咯烷-3-基]-1,3,4-噻二唑-2,5-二胺(中间体12，0.06g，0.232mmol)、[2-[3-(3,3-二氟氮杂环丁烷-1-基)苯基]-2-甲氧基-乙酰基]氧锂(中间体21，0.06g，0.232mmol)。添加DMF(2mL)和DIPEA(0.1mL，0.579mmol)，随后加入HATU(0.09g，0.232mmol)，将所得溶液在室温下搅拌15小时。将反应混合物加入SCX柱并用MeOH洗涤，然后用2M NH₃的MeOH溶液洗脱。在减压下蒸发碱性级分，并将残余物通过制备型HPLC(SunFire C18柱，5μm，50mm×19mm，25mL/min)纯化。使用极性比率渐减的含有0.1％甲酸的水和MeCN作为流动相。减压除去溶剂，得到为奶油状固体的非对映异构体的混合物。非对映异构体通过手性制备型HPLC(AmyC柱，5μm，20mm×250mm，洗脱液20:80庚烷:EtOH，含有0.1％NH₃的EtOH，21mL/min)分离，得到：

第一洗脱异构体实例14(a)2-[3-(3,3-二氟氮杂环丁烷-1-基)苯基]-2-甲氧基-N-[5-[[(3R)-1-(1,2,4-三嗪-3-基)吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺(22.1mg，18.9％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d6,30℃)δ2.02-2.12(1H,m),2.23-2.34(1H,m),3.29(3H,s),3.77(4H,s),4.20-4.42(5H,m),4.89(1H,s),6.49-6.57(1H,m),6.67(1H,t),6.86-6.92(1H,m),7.22(1H,t),7.67(1H,d),8.32(1H,d),8.61(1H,d),12.19(1H,s).m/z:ES⁺[M+H]⁺504。

第二洗脱异构体实例14(b)2-[3-(3,3-二氟氮杂环丁烷-1-基)苯基]-2-甲氧基-N-[5-[[(3R)-1-(1,2,4-三嗪-3-基)吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺(20.8mg，17.8％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d6,30℃)δ2.02-2.13(1H,m),2.24-2.35(1H,m),3.29(3H,s),3.77(4H,s),4.20-4.42(5H,m),4.89(1H,s),6.50-6.56(1H,m),6.65-6.69(1H,m),6.86-6.91(1H,m),7.22(1H,t),7.69(1H,d),8.31(1H,d),8.61(1H,d),12.19(1H,s).m/z:ES⁺[M+H]⁺504。

实例15(a)和15(b)

(2S)-2-[3-(3-氟氮杂环丁烷-1-基)苯基]-2-甲氧基-N-[5-[[(3R)-1-(1,2,4-三嗪-3-基)吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺和(2R)-2-[3-(3-氟氮杂环丁烷-1-基)苯基]-2-甲氧基-N-[5-[[(3R)-1-(1,2,4-三嗪-3-基)吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺

向圆底烧瓶中称取N2-[(3R)-1-(1,2,4-三嗪-3-基)吡咯烷-3-基]-1,3,4-噻二唑-2,5-二胺(中间体12，0.05g，0.17mmol)、[2-[3-(3-氟氮杂环丁烷-1-基)苯基]-2-甲氧基-乙酰基]氧锂(中间体17，0.04g，0.17mmol)。添加DMF(2mL)和HATU(0.06g，0.17mmol)，随后添加DIPEA(0.07mL，0.426mmol)，并将得到的溶液在室温下搅拌15小时。将反应混合物加入SCX柱并用MeOH洗涤，然后用2M NH₃的MeOH溶液洗脱。在减压下蒸发碱性级分，并将残余物通过制备型HPLC(SunFire C18柱，5μm，50mm×19mm，25mL/min)纯化。使用极性比率渐减的含有0.1％甲酸的水和MeCN作为流动相。减压除去溶剂，得到为奶油状固体的非对映异构体的混合物。非对映异构体通过制备型手性HPLC(Amy-C柱，5μm，20mm×250mm，洗脱液20:80庚烷:EtOH，含有0.1％NH₃，21mL/min)分离，得到：

第一洗脱异构体实例15(a)2-[3-(3-氟氮杂环丁烷-1-基)苯基]-2-甲氧基-N-[5-[[(3R)-1-(1,2,4-三嗪-3-基)吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺(17.9mg，21.7％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d6,30℃)δ2.04-2.13(1H,m),2.23-2.35(1H,m),3.28(3H,s),3.47-3.94(6H,m),4.06-4.20(2H,m),4.35(1H,s),4.84(1H,s),5.55(1H,tt),6.39-6.46(1H,m),6.58(1H,t),6.80(1H,dt),7.16(1H,t),7.62(1H,s),8.31(1H,d),8.60(1H,d),12.18(1H,s).m/z:ES⁺[M+H]⁺486。

第二洗脱异构体实例15(b)2-[3-(3-氟氮杂环丁烷-1-基)苯基]-2-甲氧基-N-[5-[[(3R)-1-(1,2,4-三嗪-3-基)吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺(19mg，23％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d6,30℃)δ2.03-2.13(1H,m),2.23-2.34(1H,m),3.28(s,3H),3.50-3.93(6H,m),4.08-4.21(2H,m),4.36(1H,s),4.87(1H,s),5.38-5.58(1H,m),6.41-6.46(1H,m),6.58(1H,t),6.77-6.83(1H,m),7.17(1H,t),7.68(1H,d),8.32(1H,d),8.61(1H,d),12.18(1H,s).m/z:ES⁺[M+H]⁺486。

实例16(a)和16(b)

(2S)-2-(3,5-二甲氧基苯基)-2-甲氧基-N-[5-[[(3R)-1-(1,2,4-三嗪-3-基)吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺和(2R)-2-(3,5-二甲氧基苯基)-2-甲氧基-N-[5-[[(3R)-1-(1,2,4-三嗪-3-基)吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺

将DIPEA(0.1mL，0.568mmol)添加到在DMF(3mL)中的2-(3,5-二甲氧基苯基)-2-甲氧基-乙酸(中间体28，0.13g，0.568mmol)和N2-[(3R)-1-(1,2,4-三嗪-3-基)吡咯烷-3-基]-1,3,4-噻二唑-2,5-二胺(中间体12，0.15g，0.568mmol)中。将HATU(0.22g，0.568mmol)添加到溶液中，并将反应混合物在室温下在氮气下搅拌24小时。在减压下除去溶剂，得到深橙色油状物，将其溶于DCM中，吸收到二氧化硅上并通过FCC(SiO₂，1％-10％MeOH的DCM溶液)纯化。合并纯的级分，减压除去溶剂，得到深橙色油状物，将其通过制备型HPLC(SunFireC18柱，5μm，50mm×19mm，流速25mL/min)进一步纯化。使用极性比率渐减的含有0.1％甲酸的水和MeCN作为流动相。合并纯级分，减压蒸发，通过2g SCX柱，用MeOH洗涤，然后用2N NH₃的MeOH溶液洗脱。将碱性级分蒸发至干，得到为灰白色泡沫(132mg)的非对映异构体的混合物。非对映异构体通过制备型HPLC(Lux C4柱，5μm，20mm×250mm，洗脱剂MeOH，含有二乙醇胺改性剂，21mL/min)分离。将单独的非对映异构体溶于DCM中，用水洗涤，蒸发有机层，得到：

第一洗脱异构体实例16(a)2-(3,5-二甲氧基苯基)-2-甲氧基-N-[5-[[(3R)-1-(1,2,4-三嗪-3-基)吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺(23.2mg，8.6％)。¹HNMR(400MHz,DMSO-d6,21℃)δ2.09(1H,d)2.30(1H,dd),3.30(3H,d),3.74(6H,s),3.55-3.91(4H,m),4.38(1H,s),4.89(1H,s),6.47(1H,t),6.64(2H,d),7.71(1H,d),8.32(1H,d),8.61(1H,d),12.17(1H,s).m/z:ES⁺[M+H]⁺472。

第二洗脱异构体实例16(b)2-(3,5-二甲氧基苯基)-2-甲氧基-N-[5-[[(3R)-1-(1,2,4-三嗪-3-基)吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺(28.3mg，10.5％)。¹HNMR(400MHz,DMSO-d6,21℃)δ2.12(1H,s),2.31(1H,d),3.33(3H,s),3.60-3.73(3H,m),3.77(6H,s),3.80-3.89(1H,m),4.40(1H,s),4.92(1H,s),6.50(1H,t),6.67(2H,d),7.73(1H,d),8.35(1H,d),8.64(1H,d),12.19(1H,s).m/z:ES⁺[M+H]⁺472。

实例17(a)和17(b)

(2S)-[3-(二氟甲氧基)苯基]-2-乙氧基-N-[5-[[(3R)-1-哒嗪-3-基吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺和(2R)-[3-(二氟甲氧基)苯基]-2-乙氧基-N-[5-[[(3R)-1-哒嗪-3-基吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺

将2-[3-(二氟甲氧基)苯基]-2-乙氧基-乙酸(中间体47，0.14g，0.57mmol)和N2-[(3R)-1-哒嗪-3-基吡咯烷-3-基]-1,3,4-噻二唑-2,5-二胺(中间体1，0.15g，0.57mmol)称重到圆底烧瓶中。添加DMF(3mL)和DIPEA(0.18g，1.424mmol)随后添加HATU(0.22g，0.57mmol)，并将所得溶液在室温下在N₂下搅拌3小时。减压除去溶剂。将残余的胶状物溶于DCM中，吸收到二氧化硅上并通过FCC(SiO₂，在DCM中的1％至8％MeOH)纯化。在减压下蒸发纯的级分，得到黄色胶状物，将其通过制备型手性SFC(Amy-C柱，5μm，20mm×250mm，含有40％NH₃作为改性剂的洗脱剂MeOH/CO₂)分离。在波长210nm处的流速为50mL/min，得到：

第一洗脱异构体实例17(a)[3-(二氟甲氧基)苯基]-2-乙氧基-N-[5-[[(3R)-1-哒嗪-3-基吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺(23mg，8.2％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d6,30℃)δ1.19(3H,t),2.02-2.10(1H,m),2.21-2.36(1H,m),3.37-3.63(5H,m),3.74(1H,dd),4.40-4.36(1H,m),5.12(1H,s),6.87(1H,dd),7.16(1H,dd),7.25(1H,t),7.28-7.29(1H,m),7.30-7.38(2H,m),7.45(1H,t),7.72(1H,d),8.48(1H,dd),12.27(1H,s).m/z:ES⁺[M+H]⁺492。

第二洗脱异构体实例17(b)[3-(二氟甲氧基)苯基]-2-乙氧基-N-[5-[[(3R)-1-哒嗪-3-基吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺(0.025g，8.9％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆,30℃)δ¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ1.19(3H,t),2.03-2.10(1H,m),2.24-2.32(1H,m),3.38-3.62(5H,m),3.74(1H,dd),4.36-4.40(1H,m),5.12(1H,s),6.86(1H,dd),7.16(1H,t),7.24(1H,t),7.26-7.38(3H,m),7.45(1H,t),7.72(1H,d),8.48(1H,dd),12.27(1H,s).m/z:ES⁺[M+H]⁺492。

实例18(a)和18(b)

(2S)-2-甲氧基-2-[3-(氧杂环丁烷-3-基)苯基]-N-[5-[[(3R)-1-哒嗪-3-基吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺和(2R)-2-甲氧基-2-[3-(氧杂环丁烷-3-基)苯基]-N-[5-[[(3R)-1-哒嗪-3-基吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺

在21℃下，在N₂下，将HATU(520mg，1.37mmol)添加到在DMF(8mL)中的N2-[(3R)-1-哒嗪-3-基吡咯烷-3-基]-1,3,4-噻二唑-2,5-二胺(中间体1，300mg，1.14mmol)、2-甲氧基-2-[3-(氧杂环丁烷-3-基)苯基]乙酸(中间体48，304mg，1.37mmol)和DIPEA(0.198mL，1.14mmol)中。将所得溶液在21℃下搅拌2小时。将粗产物通过离子交换色谱法使用SCX柱纯化。使用1M NH₃的MeOH溶液从柱上洗脱所需产物，蒸发纯级分。粗产物通过FCC(SiO₂，0至15％1M NH₃的MeOH的EtOAc溶液)纯化。将纯级分蒸发至干燥，得到固体。将粗产物通过制备型HPLC(Waters XBridge OBD C18柱，5μm，30mm×100mm)纯化。使用极性渐减的含有1％NH₄OH的水和MeCN的混合物作为流动相。将含有所需化合物的级分蒸发至干，得到为非对映异构体的混合物的产物。非对映异构体通过制备型HPLC(Phenomenex Lux C4柱，20μm，50mm×250mm，MeOH/IPA 50/50，120mL/min)分离，得到：

第一洗脱异构体实例18(a)2-甲氧基-2-[3-(氧杂环丁烷-3-基)苯基]-N-[5-[[(3R)-1-哒嗪-3-基吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺(45mg，8％)。¹H NMR(400MHz,DMSO,30℃)δ2.12(1H,td),2.23-2.40(1H,m),3.38(3H,s),3.46-3.69(3H,m),3.74-3.86(1H,m),4.26-4.35(1H,m),4.41-4.50(1H,m),4.65(2H,ddd),4.90-5.11(3H,m),6.91(1H,dd),7.27-7.49(4H,m),7.57(1H,s),7.70(1H,d),8.53(1H,dd),12.24(1H,s).m/z:ES⁺[M+H]⁺468。

第二洗脱异构体实例18(b)2-甲氧基-2-[3-(氧杂环丁烷-3-基)苯基]-N-[5-[[(3R)-1-哒嗪-3-基吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺(38mg，7％)。¹H NMR(400MHz,DMSO,30℃)δ2.12(1H,td),2.23-2.40(1H,m),3.38(3H,s),3.46-3.69(3H,m),3.74-3.86(1H,m),4.26-4.35(1H,m),4.41-4.50(1H,m),4.65(2H,ddd),4.90-5.11(3H,m),6.91(1H,dd),7.27-7.49(4H,m),7.57(1H,s),7.70(1H,d),8.53(1H,dd),12.24(1H,s).m/z:ES⁺[M+H]⁺468。

实例19(a)和19(b)

(2S)-2-乙氧基-N-[5-[[(3R)-1-哒嗪-3-基吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]-2-[3-(三氟甲氧基)苯基]乙酰胺和(2R)-2-乙氧基-N-[5-[[(3R)-1-哒嗪-3-基吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]-2-[3-(三氟甲氧基)苯基]乙酰胺

将DIPEA(0.15mL，0.85mmol)、HATU(260mg，0.68mmol)和2-乙氧基-2-[3-(三氟甲氧基)苯基]乙酸(中间体51，180mg，0.68mmol)添加到在DMF(4mL)中的N2-[(3R)-1-哒嗪-3-基吡咯烷-3-基]-1,3,4-噻二唑-2,5-二胺(中间体1，150mg，0.57mmol)溶液中。将混合物在室温下搅拌18小时。然后将其用水(5mL)稀释，然后萃取到DCM(10mL)中，蒸发并通过制备型HPLC(XBridge OBD C18柱，5μm，50mm×19mm，流速为25mL/min)纯化。使用极性比率渐减的含有0.3mL/LNH₄OH的水和MeCN作为流动相。蒸发纯级分，通过SCX柱，用MeOH洗涤，然后用2MNH₃的MeOH溶液洗脱。将碱性级分蒸发并真空干燥，得到非对映异构体混合物形式的产物。然后通过HPLC(Lux C4柱，5μm，20mm×250mm，包含NH₃改性剂的MeOH，21mL/min)分离非对映异构体，得到：

第一洗脱异构体实例19(a)2-乙氧基-N-[5-[[(3R)-1-哒嗪-3-基吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]-2-[3-(三氟甲氧基)苯基]乙酰胺，(46mg，16％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d6,21℃)δ1.19(3H,t),1.97-2.15(1H,m),2.18-2.36(1H,m),3.40-3.65(5H,m),3.65-3.81(1H,m),4.32-4.46(1H,m),5.17(1H,s),6.87(1H,dd),7.28-7.40(2H,m),7.40-7.59(3H,m),7.74(1H,d),8.48(1H,dd),12.32(1H,s).m/z:ES⁺[M+H]⁺510。

第二洗脱异构体实例19(b)2-乙氧基-N-[5-[[(3R)-1-哒嗪-3-基吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]-2-[3-(三氟甲氧基)苯基]乙酰胺(39mg，14％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d6,21℃)δ1.19(3H,t),2.06(1H,m),2.20-2.35(1H,m),3.39-3.63(5H,m),3.74(1H,m),4.34-4.44(1H,m),5.17(1H,s),6.88(1H,dd),7.28-7.41(2H,m),7.42-7.58(3H,m),7.73(1H,d),8.48(1H,d),12.32(1H,s).m/z:ES⁺[M+H]⁺510。

实例20(a)和20(b)

(2R)-2-[4-氟-3-(三氟甲氧基)苯基]-2-甲氧基-N-[5-[[(3R)-1-哒嗪-3-基吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺和(2S)-2-[4-氟-3-(三氟甲氧基)苯基]-2-甲氧基-N-[5-[[(3R)-1-哒嗪-3-基吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺

将DIPEA(0.12mL，0.71mmol)、HATU(216mg，0.568mmol)和2-[4-氟-3-(三氟甲氧基)苯基]-2-甲氧基-乙酸(中间体52，0.13g，0.474mmol)添加到在DMF(4mL)中的N2-[(3R)-1-哒嗪-3-基吡咯烷-3-基]-1,3,4-噻二唑-2,5-二胺(中间体1，0.12g，0.474mmol)溶液中。将混合物在室温下搅拌18小时。然后将其用水(5mL)稀释，萃取到DCM(10mL)中，蒸发并通过制备型HPLC(SunFire C18柱，5μm，50mm×19mm，25mL/min)纯化。使用极性比率渐减的含有0.1％甲酸的水和MeCN作为流动相。将纯级分通过SCX柱，用MeOH洗涤，然后用2M NH₃的MeOH溶液洗脱。蒸发碱性级分。仍然看到杂质，所以通过制备型HPLC(XBridge OBD C18柱，5μm，50mm×19mm，流速25mL/min)再次纯化材料。使用极性比率渐减的含有0.3mL/LNH₄OH的水和MeCN作为流动相。将纯级分蒸发至干，并通过制备型手性HPLC(Phenomenex Lux C2柱，20μm，50mm×250mm，洗脱剂MeOH，110mL/min)分离非对映异构体的混合物，得到：

第一洗脱异构体实例20(a)2-[4-氟-3-(三氟甲氧基)苯基]-2-甲氧基-N-[5-[[(3R)-1-哒嗪-3-基吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺(18.4mg，7.5％)。¹HNMR(400MHz,DMSO-d6,22℃)2.06(1H,dq),2.28(1H,dt),3.34(3H,s),3.45-3.60(3H,m),3.75(1H,dd),4.34-4.42(1H,m),5.03(1H,s),6.87(1H,dd),7.33(1H,dd),7.51-7.57(2H,m),7.60-7.69(2H,m),8.48(1H,dd),12.35(1H,s).m/z:ES+[M+H]+514。

第二洗脱异构体实例20(b)2-[4-氟-3-(三氟甲氧基)苯基]-2-甲氧基-N-[5-[[(3R)-1-哒嗪-3-基吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺(19.2mg，7.9％)。¹HNMR(400MHz,DMSO-d6,22℃)2.07(1H,dd),2.28(1H,dt),3.49(1H,d),3.53-3.60(2H,m),3.74(1H,dd),4.33-4.43(1H,m),5.04(1H,s),6.87(1H,d),7.33(1H,dd),7.52-7.57(2H,m),7.63(1H,d),7.68(1H,d),8.48(1H,d),12.35(1H,s).m/z:ES⁺[M+H]⁺514。

实例21(a)和21(b)

(2S)-2-(3,5-二甲氧基苯基)-2-甲氧基-N-[5-[[(3R)-1-哒嗪-3-基吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺和(2R)-2-(3,5-二甲氧基苯基)-2-甲氧基-N-[5-[[(3R)-1-哒嗪-3-基吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺

在21℃下，在氮气下，将HATU(433mg，1.14mmol)添加到在DMF(8mL)中的2-(3,5-二甲氧基苯基)-2-甲氧基-乙酸(中间体28，215mg，0.95mmol)、N2-[(3R)-1-哒嗪-3-基吡咯烷-3-基]-1,3,4-噻二唑-2,5-二胺(中间体1，250mg，0.95mmol)和DIPEA(0.332mL，1.90mmol)中。将所得溶液在21℃下搅拌2小时。将粗产物通过离子交换色谱法使用SCX柱纯化。使用1M NH₃/MeOH将所需产物从柱上洗脱，将纯级分蒸发至干，得到粗产物。将粗产物通过快速硅胶色谱(洗脱梯度0至12％1M NH₃/MeOH的DCM溶液)纯化。将纯级分蒸发至干，得到米色泡沫。LCMS显示9％的化学杂质。将粗产物通过快速硅胶色谱(洗脱梯度0至8％MeOH的DCM溶液)进一步纯化。将纯级分蒸发至干，得到非对映体混合物形式的产物。(180mg)

通过制备型HPLC(LucC4柱，20μm二氧化硅，50mm直径，250mm长度，100％MeOH，120ml/min)分离非对映异构体。将单独的非对映异构体溶于DCM中，用水洗涤，蒸发有机层，得到：

实施例21(a)，作为第一洗脱异构体(固体，74mg，16％)。¹H NMR(400MHz,DMSO,27℃)δ2.06(1H,m),2.21-2.38(1H,m),3.30(9H,d),3.41-3.62(3H,m),4.28-4.47(1H,m),4.87(1H,s),6.46(1H,t),6.63(2H,s),6.85(1H,d),7.31(1H,dd),7.65(1H,d),8.47(1H,dd),12.13(1H,s).m/z:ES⁺[M+H]⁺472。

实例21(b)，作为第二洗脱异构体(固体，75mg，17％)。¹H NMR(400MHz,DMSO,27℃)δ2.06(1H,m),2.21-2.38(1H,m),3.30(9H,d),3.41-3.62(3H,m),4.28-4.47(1H,m),4.87(1H,s),6.46(1H,t),6.63(2H,s),6.85(1H,d),7.31(1H,dd),7.65(1H,d),8.47(1H,dd),12.13(1H,s)。m/z:ES⁺[M+H]⁺472。

实例22(a)和22(b)

(2S)-2-乙氧基-2-[3-(3-甲氧基氮杂环丁烷-1-基)苯基]-N-[5-[[(3R)-1-哒嗪-3-基吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺和(2R)-2-乙氧基-2-[3-(3-甲氧基氮杂环丁烷-1-基)苯基]-N-[5-[[(3R)-1-哒嗪-3-基吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺

在室温下，在N₂下，将HATU(0.13g，0.332mmol)和N2-[(3R)-1-哒嗪-3-基吡咯烷-3-基]-1,3,4-噻二唑-2,5-二胺(中间体1，0.07g，0.276mmol)溶解到DMF(2mL)中。将混合物搅拌5分钟，然后加入DIPEA(0.07mL，0.414mmol)和2-乙氧基-2-[3-(3-甲氧基氮杂环丁烷-1-基)苯基]乙酸锂(中间体56，0.07g，0.276mmol)然后在室温下搅拌过夜。使粗混合物通过5g SCX柱，用MeOH洗涤，然后用2N NH₃的MeOH溶液洗脱。蒸发碱性级分，得到不纯的产物，为橙色胶状物，其通过制备型HPLC(SunFire C18柱，5μm，50mm×19mm，25mL/min)纯化。使用极性比率渐减的含有0.1％甲酸的水和MeCN作为流动相。合并含有所需物质的级分，蒸发并通过5g SCX柱，用MeOH洗涤，然后用2N NH₃的MeOH溶液洗脱。真空除去溶剂，得到非对映异构体的混合物，其通过制备型手性HPLC分离。(Phenomenex Lux C4柱，20μm二氧化硅，50mm直径，250mm长度)，EtOH/MeOH 50/50，120mL/min。将含有所需化合物的级分蒸发至干燥，得到：

实例22(a)，作为第一洗脱异构体(固体，21.4mg，15％)。

实例22(b)，作为第二洗脱异构体(固体，20.4mg，14％)。

其他实例

以与上述实例类似的方式制备以下实例的化合物。

实例45(a)和45(b)

(2S)-3-甲氧基-N-[5-[[(3R)-1-(6-甲基哒嗪-3-基)吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]-2-苯基-丙酰胺和(2R)-3-甲氧基-N-[5-[[(3R)-1-(6-甲基哒嗪-3-基)吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]-2-苯基-丙酰胺

在室温下，在N₂下，将N2-[(3R)-1-(6-甲基哒嗪-3-基)吡咯烷-3-基]-1,3,4-噻二唑-2,5-二胺(中间体6，0.11g，0.389mmol)和3-甲氧基-2-苯基-丙酸(0.08g，0.433mmol)溶解到DMF(2mL)中。将混合物搅拌5分钟，然后加入DIPEA(0.34mL，1.943mmol)和N-[(二甲基氨基)(3H-[1,2,3]三唑[4,5-b]吡啶-3-基氧基)亚甲基]-N-甲基甲基铵六氟磷酸盐、HATU(0.4mL，0.361mmol)，然后在室温下静置过夜。将粗混合物通过5g SCX-2柱，用MeOH洗涤，然后用2M NH₃的MeOH溶液洗脱。合并纯的级分，减压除去溶剂，且将残余物通过制备型HPLC(SunFire C18柱，5μm，50mm×19mm，流速25mL/min)进一步纯化。使用极性比率渐减的含有0.1％甲酸的水和MeCN作为流动相。合并纯级分，减压蒸发，通过SCX-2柱，用MeOH洗涤，然后用2M NH₃的MeOH溶液洗脱。将碱性级分蒸发至干，得到为浅黄色固体的非对映异构体的混合物。通过制备型HPLC(Phenomonex Lux C1柱，20μm二氧化硅，50mm直径，250mm长度)，使用MeCN/MeOH的95/5混合物作为洗脱液以12mL/min分离非对映异构体。将含有所需化合物的级分蒸发至干，得到：

第一洗脱异构体实例45(a)3-甲氧基-N-[5-[[(3R)-1-(6-甲基哒嗪-3-基)吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]-2-苯基-丙酰胺(31.7mg，20％)。¹H NMR(400MHz,DMSO,30℃)1.95-2.12(1H,m),2.21-2.35(1H,m),2.42(3H,s),3.26(3H,s),3.4-3.63(4H,m),3.74(1H,dd),3.98(1H,t),4.12(1H,dd),4.31-4.43(1H,m),6.82(1H,d),7.15-7.46(6H,m),7.62(1H,d),12.18(1H,s)。m/z:ES⁺[M+H]⁺440

第二洗脱异构体实例45(b)3-甲氧基-N-[5-[[(3R)-1-(6-甲基哒嗪-3-基)吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]-2-苯基-丙酰胺(28.3mg，18％)。

¹H NMR(400MHz,DMSO,30℃)1.99-2.12(1H,m),2.2-2.36(1H,m),2.41(3H,s),3.26(3H,s),3.39-3.62(4H,m),3.73(1H,dd),3.98(1H,t),4.12(1H,dd),4.31-4.42(1H,m),6.82(1H,d),7.17-7.46(5H,m),7.62(1H,d),12.19(1H,s).m/z:ES⁺[M+H]⁺440。

其他实例

以与上述实例类似的方式制备以下实例的化合物。

中间体1

N'-[(3R)-1-哒嗪-3-基吡咯烷-3-基]-1,3,4-噻二唑-2,5-二胺

向1L圆底烧瓶中放置(3R)-1-哒嗪-3-基吡咯烷-3-胺二盐酸盐(中间体2，10.5g，44.29mmol)在DMF(400mL)、5-溴-1,3,4-噻二唑-2-胺(7.94g，44.10mmol)和DIPEA(17.07g，132.08mmol)中的溶液。将溶液在80℃下搅拌4小时。将所得混合物在真空下浓缩。粗产物通过从乙醇/EtOAc重结晶纯化，得到为浅黄色固体的N’-[(3R)-1-哒嗪-3-基吡咯烷-3-基]-1,3,4-噻二唑-2,5-二胺(11g，94％)。1H NMR(500MHz,DMSO-d6,30℃)δ2.04(1H,td),2.22-2.31(1H,m),3.43-3.62(3H,m),3.72(1H,dd),4.28(1H,dq),6.27(2H,s),6.86(1H,dd),7.07(1H,d),7.33(1H,dd),8.48(1H,dd)。m/z:ES⁺[M+H]⁺264.28。

还根据以下替代程序大规模制备中间体1：

在45℃下，将(R)-1-(哒嗪-3-基)吡咯烷-3-胺(中间体3，游离碱形式，25.5g，150.63mmol)和5-溴-1,3,4-噻二唑-2-胺(29.8g，165.70mmol)与DIPEA(39.4mL，225.95mmol)的混合物作为在MeOH(200mL)中的浆料搅拌。将浆料冷却至20℃，通过真空过滤分离固体。使用50mlMeOH作为滤饼的置换洗涤液，然后将其在40℃的真空烘箱中干燥过夜。得到为自由流动的米色粉末的中间体1(32.9g，83％)。

中间体2

(3R)-1-哒嗪-3-基吡咯烷-3-胺二盐酸盐

向1L圆底烧瓶中加入叔丁基N-[(3R)-1-哒嗪-3-基吡咯烷-3-基]氨基甲酸酯(中间体4，20g，75.66mmol)在二噁烷(200mL)和浓HCl(100mL)中的溶液。将溶液在室温下搅拌30分钟。将所得混合物在真空下浓缩。将粗产物从MeOH/EtOAc以1:2的比例重结晶。这产生为灰白色固体(13.4g，75％)的(3R)-1-哒嗪-3-基吡咯烷-3-胺二盐酸盐。¹H NMR(300MHz,DMSO-d6,26℃)δ2.25-2.43(2H,m),3.66-3.74(1H,m),3.78-3.90(3H,m),4.02-4.10(1H,m),7.75(1H,d),7.94(1H,dd),8.66(1H,d),8.77-8.98(3H,brm)。m/z:ES⁺[M+H]⁺165。

根据以下程序制备中间体3(游离碱形式)：将在吡啶(400mL)中的叔丁基N-[(3R)-1-(6-氯哒嗪-3-基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸酯(中间体5，20g，107.38mmol)与氢氧化钯碳(皮尔曼催化剂(Pearlman’s Catalyst)，27.5g，25.84mmol)和在MeOH(1375mL)中的1-甲基-1,4-环己二烯(31.0ml，276.13mmol)混合。然后将反应混合物加热至65℃持续90分钟。观察到完全转化，将反应冷却回到环境温度，通过过滤除去催化剂。然后将3MHCl的MeOH溶液(184mL，552.27mmol)加入到反应混合物中，将溶液加热至65℃持续1小时。观察到完全转化后，将反应溶液冷却至环境温度，并通过已用MeOH预洗脱的10×50g SCX柱。使用1M NH₃的MeOH溶液从SCX释放化合物。将所得溶液用甲苯(1L)稀释，并通过旋转蒸发浓缩至干，得到自由流动的固体。(3R)-1-哒嗪-3-基吡咯烷-3-胺以97％w/w的强度作为游离碱分离。

中间体4

叔丁基N-[(3R)-1-哒嗪-3-基吡咯烷-3-基]氨基甲酸酯

向2L圆底烧瓶中加入在MeOH(800mL)中的叔丁基N-[(3R)-1-(6-氯哒嗪-3-基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸酯(中间体5，23g，76.98mmol)和钯碳(2g)。将系统吹扫并用氢气保持。将所得溶液在室温下搅拌4小时。滤出固体。将所得混合物真空浓缩，得到为黄色固体的叔丁基N-[(3R)-1-哒嗪-3-基吡咯烷-3-基]氨基甲酸酯(20g，84％)。¹H NMR(300MHz,CDCl₃,24℃)δ1.44(9H,s),2.25-2.35(2H,m),3.48-3.56(1H,m),3.70-4.10(3H,m),4.35-4.42(1H,m),7.26-7.32(1H,m),7.70-7.75(1H,m),8.53-8.55(1H,m)。m/z:ES⁺[M+H]⁺265。

中间体5

叔丁基N-[(3R)-1-(6-氯哒嗪-3-基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸酯

向1L圆底烧瓶中加入叔丁基N-[(3R)-吡咯烷-3-基]氨基甲酸酯(20g，107.38mmol)在吡啶(400mL)和3,6-二氯哒嗪(16g，107.40mmol)中的溶液。将所得溶液加热至回流过夜。将所得混合物在真空下浓缩。将粗产物通过从乙醇/Et₂O以1:3的比例重结晶而纯化，得到为黄色固体的叔丁基N-[(3R)-1-(6-氯哒嗪-3-基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸酯(23g，72％)。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃,30℃)δ1.45(9H,s),2.02(1H,dq),2.31(1H,td),3.41(1H,dd),3.54-3.70(2H,m),3.78(1H,dd),4.37(1H,s),4.76(1H,s),6.61(1H,d),7.17(1H,d).m/z:ES⁺[M+H]⁺299。

中间体6

N2-[(3R)-1-(6-甲基哒嗪-3-基)吡咯烷-3-基]-1,3,4-噻二唑-2,5-二胺

将5-溴-1,3,4-噻二唑-2-胺(912mg，5.07mmol)、(3R)-1-(6-甲基哒嗪-3-基)吡咯烷-3-胺(中间体7，860mg，4.83mmol)和DIPEA(0.924mL，5.31mmol)溶解到DMF(10mL)中。将反应加热至100℃持续1小时，然后在室温下放置过夜。将粗产物通过离子交换色谱法使用SCX柱纯化。使用1M NH₃的MeOH溶液将所需产物从柱上洗脱，将纯级分蒸发至干燥，得到粗产物。将其溶于DCM/MeOH中，吸附到二氧化硅上并通过FCC(SiO₂，0至20％MeOH的DCM溶液)纯化。将纯级分蒸发至干，得到为棕色胶状物的N2-[(3R)-1-(6-甲基哒嗪-3-基)吡咯烷-3-基]-1,3,4-噻二唑-2,5-二胺(350mg，26％)。m/z:ES⁺[M+H]⁺278。

中间体7

(3R)-1-(6-甲基哒嗪-3-基)吡咯烷-3-胺

在21℃下，在氮气下，将三氟乙酸(12mL)添加到在DCM(60mL)中的叔丁基N-[(3R)-1-(6-甲基哒嗪-3-基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸酯(中间体8，2.1g，7.54mmol)中。将所得溶液在21℃下搅拌2小时。将粗产物通过离子交换色谱法使用SCX柱纯化。使用7M NH₃的MeOH溶液从柱上洗脱所需产物，并将纯级分蒸发至干燥，得到为黄色油状物的(3R)-1-(6-甲基哒嗪-3-基)吡咯烷-3-胺(1.6g，119％)，将其静置固化。¹H NMR(400MHz,DMSO-d6,27℃)δ1.56-1.8(1H,m),2.04(1H,m),2.39(3H,s),3.07(1H,m),3.37-3.43(1H,m),3.47-3.66(3H,m),4.08(1H,s),6.73(1H,d),7.19(1H,d)。m/z:ES⁺[M+H]⁺179。

中间体8

叔丁基N-[(3R)-1-(6-甲基哒嗪-3-基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸酯

将DIPEA(8.49mL，48.62mmol)、叔丁基N-[(3R)-吡咯烷-3-基]氨基甲酸酯(3.62g，19.45mmol)、3-氯-6-甲基哒嗪(2.5g，19.45mmol)和正丁醇(30mL)的混合物在130℃下搅拌12小时，然后冷却过周末。蒸发反应混合物并且将粗产物通过FCC(SiO₂，0至10％1M NH₃的MeOH的EtOAc溶液)纯化。将纯级分蒸发至干，得到为黄色固体的叔丁基N-[(3R)-1-(6-甲基哒嗪-3-基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸酯(2.1g，38.8％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d6,27℃)δ1.39(9H,s),1.88(1H,m),2.14(1H,m),2.40(3H,s),3.23(1H,m),3.37-3.45(1H,m),3.47-3.58(1H,m),3.61(1H,m),3.99-4.2(1H,m),6.77(1H,d),7.20(2H,m)。m/z:ES⁺[M+H]⁺279。

中间体9

N2-[(3R)-1-(6-氟哒嗪-3-基)吡咯烷-3-基]-1,3,4-噻二唑-2,5-二胺

在室温下，将DIPEA(3.48mL，19.96mmol)添加到无水DMF(40mL)中的5-溴-1,3,4-噻二唑-2-胺(1.797g，9.98mmol)和(3R)-1-(6-氟哒嗪-3-基)吡咯烷-3-胺(中间体10，2g，10.98mmol)中。将所得溶液在80℃下搅拌4小时。将粗产物通过离子交换色谱法使用SCX柱纯化。使用1M NH₃的MeOH溶液从柱上洗脱所需产物，并且将纯级分蒸发至干，得到为棕色固体的N2-[(3R)-1-(6-氟哒嗪-3-基)吡咯烷-3-基]-1,3,4-噻二唑-2,5-二胺(2.9g，103％)。¹HNMR(400MHz,DMSO-d6,30℃)δ1.90-2.12(1H,m),2.23(1H,dtd),3.42(1H,dd),3.47-3.61(2H,m),3.69(1H,dd),4.25(1H,dq),6.25(2H,s),7.04(1H,d),7.14(1H,dd),7.33(1H,dd)。m/z:ES⁺[M+H]⁺282。

中间体10

(3R)-1-(6-氟哒嗪-3-基)吡咯烷-3-胺

在25℃下，将叔丁基N-[(3R)-1-(6-氟哒嗪-3-基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸酯(中间体11，6g，21.25mmol)添加到DCM(70mL)和TFA(14.00mL)中。将所得溶液在25℃下搅拌4小时。将粗产物通过离子交换色谱法使用SCX柱纯化。使用1M NH₃的MeOH溶液将所需产物从柱上洗脱，将纯级分蒸发至干燥，得到为浅黄色胶状固体的(3R)-1-(6-氟哒嗪-3-基)吡咯烷-3-胺(2.0g，52％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d6,30℃)δ1.55-1.83(1H,m),1.98-2.13(1H,m),2.89-3.14(1H,m),3.29-3.43(1H,m),3.54(3H,ddt),7.06(1H,dd),7.30(1H,dd)。m/z:ES⁺[M+H]⁺183。

中间体11

叔丁基N-[(3R)-1-(6-氟哒嗪-3-基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸酯

将3,6-二氟哒嗪(6.06g，52.21mmol)叔丁基N-[(3R)-吡咯烷-3-基]氨基甲酸酯(9.72g，52.21mmol)、DIPEA(22.80mL，130.53mmol)和正丁醇(140mL)的混合物在130℃下搅拌10小时。将反应混合物用EtOAc(750mL)稀释，并用水(150mL)洗涤两次。将有机层用Na₂SO₄干燥，过滤并蒸发，得到粗产物。然后将其溶于DCM中，粗产物通过FCC(SiO₂，30％-65％EtOAc的庚烷溶液)纯化。将纯级分蒸发至干，得到为奶油状固体的叔丁基N-[(3R)-1-(6-氟哒嗪-3-基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸酯(15g，102％)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃,30℃)δ1.46(9H,s),1.91-2.13(1H,m),2.32(1H,dq),3.40(1H,dd),3.56-3.72(2H,m),3.78(1H,dd),4.37(1H,s),4.70(1H,s),6.78(1H,dd),6.98(1H,dd)。m/z:ES⁺[M+H]⁺283。

中间体12

N2-[(3R)-1-(1,2,4-三嗪-3-基)吡咯烷-3-基]-1,3,4-噻二唑-2,5-二胺

在室温下，在N₂下，将5-溴-1,3,4-噻二唑-2-胺(1.31g，7.264mmol)和(3R)-1-(1,2,4-三嗪-3-基)吡咯烷-3-胺(中间体13，1.2g，7.264mmol)在DMF(15mL)中合并。将混合物在室温下搅拌过夜。然后蒸发至干，通过FCC(SiO₂，5％-10％2N NH₃的MeOH(在DCM中)溶液)纯化，得到为米色泡沫(1.7g，88％)的N2-[(3R)-1-(1,2,4-三嗪-3-基)吡咯烷-3-基]-1,3,4-噻二唑-2,5-二胺。¹H NMR(400MHz,DMSO,30℃)δ1.80-1.85(1H,m),1.98-2.05(1H,m),3.40(4H,brs),4.03(1H,brs),6.09(2H,s),6.88(1H,d),8.10(1H,d),8.38(1H,d)。

中间体13

(3R)-1-(1,2,4-三嗪-3-基)吡咯烷-3-胺

将叔丁基N-[(3R)-1-(1,2,4-三嗪-3-基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸酯(中间体14，2.39g，9.01mmol)溶于DCM(20mL)和三氟乙酸(5mL)的混合物中，并将溶液在室温下静置1小时，然后在减压下蒸发。将残余物溶于MeOH中，并通过用MeOH冲洗的20g SCX柱，然后用3NNH₃的MeOH溶液冲洗，以得到产物。在减压下蒸发溶剂，得到为黄色固体的(3R)-1-(1,2,4-三嗪-3-基)吡咯烷-3-胺(1.460g，98％)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃,27℃)δ1.80-1.92(1H,m),2.18-2.29(1H,m),3.45(1H,s),3.6-4.01(4H,m),8.13(1H,d),8.50(1H,d)。m/z:ES⁺[M+H]⁺166。

中间体14

叔丁基N-[(3R)-1-(1,2,4-三嗪-3-基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸酯

将3-甲基硫烷基-1,2,4-三嗪(中间体15，1.5g，11.80mmol)和叔丁基N-[(3R)-吡咯烷-3-基]氨基甲酸酯(2.64g，14.15mmol)溶解到乙醇(12mL)中，并且密封进入微波管。将反应在微波反应器中加热至100℃持续24小时，并冷却至室温。LC/MS显示61％产物和34％未反应的三嗪。进一步添加叔丁基N-[(3R)-吡咯烷-3-基]氨基甲酸酯(0.52g)，并且在微波中在100℃下继续加热15小时。LC/MS显示76％的产物和18％的未反应的三嗪。在减压下除去溶剂，并将残余物在EtOAc和碳酸氢钠水溶液之间分配。将水层用新鲜EtOAc再次萃取，将合并的有机物干燥(MgSO₄)，过滤并减压蒸发。将粗产物通过FCC(SiO₂，0至80％EtOAc的庚烷溶液)纯化。蒸发相关级分，得到为黄色固体的叔丁基N-[(3R)-1-(1,2,4-三嗪-3-基)吡咯烷-3-基]氨基甲酸酯(2.390g，76％)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃,27℃)δ1.46(9H,s),1.96-2.07(1H,m),2.26-2.37(1H,m),3.55(1H,s),3.75(2H,s),3.90(1H,s),4.39(1H,s),4.69(1H,s),8.14(1H,d),8.53(1H,d)。m/z:ES^-[M-H]^-264。

中间体15

3-甲基硫烷基-1,2,4-三嗪

将甲基肼碳亚胺硫代酯氢碘酸盐(中间体16，7.5g，32.18mmol)的冰/水(400mL)溶液加入到搅拌的40％乙二醛(14.70mL，128.71mmol)和碳酸氢钠(6.76g，80.45mmol)的冰/水(400mL)溶液中。将所得溶液在0℃下搅拌5小时，然后用DCM(2×150mL)萃取。将萃取物合并，用1M柠檬酸(50mL)洗涤，干燥(MgSO₄)，蒸发，得到为黄色固体的3-甲基硫烷基-1,2,4-三嗪(3.60g，88％)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃,27℃)δ2.68(3H,s),8.38(1H,d),8.94(1H,d)。

中间体16

肼碳亚胺硫代酯氢碘酸盐

将碘甲烷(0.623mL，10.00mmol)添加到肼硫代甲酰胺(0.911g，10mmol)的乙醇(10mL)溶液中。将所得混合物在70℃下搅拌30分钟。使反应冷却至室温。然后将反应混合物通过尼龙滤器过滤。然后将所得固体用Et₂O洗涤，并在真空下干燥过夜，得到作为白色固体的甲基肼碳亚胺硫代酯氢碘酸盐(1.810g，78％)，将其不经进一步纯化使用。

中间体17

[2-[3-(3-氟氮杂环丁烷-1-基)苯基]-2-甲氧基-乙酰基]氧锂

将甲基2-[3-(3-氟氮杂环丁烷-1-基)苯基]-2-甲氧基-乙酸酯(中间体18，

0.26g，1.034mmol)和氢氧化锂一水合物(0.07g，1.552mmol)溶于MeOH(5mL)和水(2mL)的混合物中。将反应物在室温下搅拌2小时。然后蒸发并真空干燥过周末，得到为白色固体(270mg，100％)的[2-[3-(3-氟氮杂环丁烷-1-基)苯基]-2-甲氧基-乙酰基]氧锂。¹HNMR(400MHz,DMSO-d6,27℃)δ3.35(3H,s),4.08-3.91(2H,m),4.29(2H,ddd),4.42(1H,s),5.78-5.56(1H,m),6.50(1H,ddd),6.68(1H,t),6.93(1H,dt),7.25(1H,t)。m/z:ES⁺[M+H]⁺240。

中间体18

甲基2-[3-(3-氟氮杂环丁烷-1-基)苯基]-2-甲氧基-乙酸酯

向甲基2-(3-溴苯基)-2-甲氧基乙酸酯(中间体19，500mg，1.93mmol)和3-氟氮杂环丁烷盐酸盐(215mg，1.93mmol)在甲苯(20mL)中的混合物中加入Ruphos钯(II)苯乙胺氯化物(58.3mg，0.07mmol)、二环己基(2',6'-二异丙氧基-[1,1’-联苯]-2-基膦(29.7mg，0.06mmol)和碳酸铯(2.20mg，6.75mmol)。将反应用氮气鼓泡约5分钟，然后加热至90℃，在氮气下搅拌过夜。将反应冷却至室温，然后用EtOAc和水稀释。将有机层干燥(MgSO₄)，过滤并在减压下蒸发溶剂。通过FCC(SiO₂，0-25％EtOAc的庚烷溶液)纯化。将含有级分的产物在减压下蒸发，得到为油状物的甲基2-[3-(3-氟氮杂环丁烷-1-基)苯基]-2-甲氧基-乙酸酯(330mg，67％)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃,30℃)δ3.40(3H,s),3.72(3H,s),3.90-4.02(2H,m),4.19(2H,ddd),4.71(1H,s),5.30-5.51(1H,m),6.44(1H,ddd),6.54-6.56(1H,m),6.83(1H,d),7.21(1H,t)。m/z:ES⁺[M+H]⁺254。

中间体19

甲基2-(3-溴苯基)-2-甲氧基乙酸酯

在N₂下将钠(0.345g，15.00mmol)溶于无水MeOH(50mL)中，向该溶液中加入甲基2-溴-2-(3-溴苯基)乙酸酯(中间体20，4.2g，13.64mmol)在无水MeOH(10mL)中的溶液。将反应混合物在40℃加热2小时，然后减压蒸发。将残余物用氯化铵水溶液处理，并将混合物用EtOAc(50mL×2)萃取。将合并的有机物干燥(MgSO₄)，过滤并在减压下蒸发，得到粗产物，将其通过FCC(SiO₂，0-12％EtOAc的庚烷溶液)纯化。将含有级分的产物蒸发至干，得到为油状物的甲基2-(3-溴苯基)-2-甲氧基乙酸酯(2.95g，83％)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃,30℃)δ3.42(3H,s),3.74(3H,s),4.73(1H,s),7.24(1H,t),7.36-7.39(1H,m),7.47(1H,ddd),7.61(1H,t)。m/z:TOF MS EI⁺257.9880。

中间体20

甲基2-溴-2-(3-溴苯基)乙酸酯

将甲基2-(3-溴苯基)乙酸酯(4g，17.46mmol)和NBS(3.26g，18.33mmol)和(E)-2,2’-(二氮烯-1,2-二基)双(2-甲基丙腈)(0.143g，0.87mmol)的四氯化碳(50mL)溶液加热回流4小时，然后冷却至室温。滤出固体，弃去，在减压下蒸发滤液。通过FCC纯化(SiO₂，0-5％EtOAc的庚烷溶液)。在减压下蒸发含有级分的产物，得到为油状物的甲基2-溴-2-(3-溴苯基)乙酸酯(4.2g，78％)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃,30℃)δ3.80(3H,s),5.28(1H,s),7.21-7.26(1H,m),7.45-7.48(1H,m),7.48-7.5(1H,m),7.70(1H,t)。m/z:TOF MS EI⁺305.8891。

中间体21

[2-[3-(3,3-二氟氮杂环丁烷-1-基)苯基]-2-甲氧基-乙酰基]氧锂

将甲基2-[3-(3,3-二氟氮杂环丁烷-1-基)苯基]-2-甲氧基-乙酸酯(中间体23，0.08g，0.295mmol)和氢氧化锂一水合物(0.01g，0.354mmol)溶解在甲醇(3mL)和水(2mL)的混合物中。将反应在室温下搅拌2小时。将反应混合物在减压下蒸发，并在真空烘箱中干燥过周末，以给出[2-[3-(3,3-二氟氮杂环丁烷-1-基)苯基]-2-甲氧基-乙酰基]氧锂。¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ3.19(3H,s),4.24-4.17(4H,m),6.42-6.35(1H,m),6.57(1H,s),6.82(1H,d),7.09(1H,t)。

中间体22

2-[3-(3,3-二氟氮杂环丁烷-1-基)苯基]-2-甲氧基-乙酸

将2-[3-(3,3-二氟氮杂环丁烷-1-基)苯基]-2-甲氧基-乙酸乙酯(中间体23，270mg，1.00mmol)在MeOH(4mL)中的溶液用氢氧化锂一水合物(84mg，1.99mmol)的水(2mL)溶液处理，并将混合物在室温下搅拌2小时。在减压下蒸发MeOH，水层用盐水(2ml)稀释，用乙酸中和，用2-甲基四氢呋喃(4×5mL)萃取。将合并的有机物干燥(MgSO₄)，过滤并减压蒸发，得到为胶状的2-[3-(3,3-二氟氮杂环丁烷-1-基)苯基]-2-甲氧基-乙酸(130mg，50.8％)。m/z:ES⁺[M+H]⁺258。

中间体23

甲基2-[3-(3,3-二氟氮杂环丁烷-1-基)苯基]-2-甲氧基-乙酸酯

向在甲苯(20mL)中的甲基2-(3-溴苯基)-2-甲氧基乙酸酯(中间体19，473mg，1.83mmol)和3,3-二氟氮杂环丁烷盐酸盐(236mg，1.83mmol)的混合物中加入Ruphos钯(II)苯乙胺氯化物(55.2mg，0.07mmol)、二环己基(2',6'-二异丙氧基-[1,1'-联苯]-2-基)膦(28.1mg，0.06mmol)和碳酸铯(2.08g，6.39mmol)。将反应用N₂鼓泡约5分钟，然后加热至90℃，在N₂下搅拌过夜。将反应冷却至室温，然后用EtOAc(20mL)和水(20mL)稀释。将有机层干燥(MgSO₄)，过滤并在减压下蒸发溶剂。通过FCC纯化(SiO₂，0-20％EtOAc的庚烷溶液)。将含有级分的产物在减压下蒸发，得到为油状物的甲基2-[3-(3,3-二氟氮杂环丁烷-1-基)苯基]-2-甲氧基-乙酸酯(280mg，57％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d6,30℃)δ3.62(3H,s),4.25(4H,t),4.82(1H,s),6.51-6.56(2H,m),6.79(1H,d),7.19-7.25(1H,m)。m/z:ES⁺[M+H]⁺272。

中间体24

[2-甲氧基-2-[3-(3-甲氧基氮杂环丁烷-1-基)苯基]乙酰基]氧锂

将甲基2-甲氧基-2-[3-(3-甲氧基氮杂环丁烷-1-基)苯基]乙酸酯(中间体26，0.24g，0.886mmol)和氢氧化锂一水合物(0.06g，1.329mmol)溶于甲醇(5mL)和水(2mL)的混合物中。将反应物在室温下搅拌2小时，然后减压蒸发并真空干燥过周末。¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ2.96(3H,s),3.03(3H,s),3.37-3.26(2H,m),3.80(2H,dd),4.01(1H,s),4.09(1H,tt),6.06(1H,dd),6.25(1H,t),6.49(1H,dt),6.83(1H,t)。

中间体25

2-甲氧基-2-[3-(3-甲氧基氮杂环丁烷-1-基)苯基]乙酸

将甲基2-甲氧基-2-[3-(3-甲氧基氮杂环丁烷-1-基)苯基]乙酸酯(中间体26，450mg，1.61mmol)在MeOH(7mL)中的溶液用氢氧化锂一水合物(135mg，3.22mmol)的水(3mL)溶液处理，并且将混合物在室温下搅拌过夜。在减压下蒸发MeOH，将含水残余物用乙醚萃取。将水层用乙酸酸化，用固体氯化钠处理，得到饱和溶液，用EtOAc(3×10mL)萃取。将有机层干燥(MgSO₄)，过滤并减压蒸发，得到胶状的2-甲氧基-2-[3-(3-甲氧基氮杂环丁烷-1-基)苯基]乙酸(236mg，58.3％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d6,30℃)δ3.23(3H,s),3.26(3H,s),3.51-3.59(2H,m),3.97-4.06(2H,m),4.26-4.34(1H,m),4.59(1H,s),6.38(1H,dd),6.43(1H,s),6.69(1H,d),7.13(1H,t).m/z:ES⁺[M+H]⁺252。

中间体26

甲基2-甲氧基-2-[3-(3-甲氧基氮杂环丁烷-1-基)苯基]乙酸酯

向甲基2-(3-溴苯基)-2-甲氧基乙酸酯(中间体19，524mg，2.02mmol)和3-甲氧基氮杂环丁烷盐酸盐(250mg，2.02mmol)在甲苯(20mL)中的混合物中加入Ruphos钯(II)苯乙胺氯化物(61.1mg，0.07mmol)、二环己基(2',6'-二异丙氧基-[1,1’-联苯]-2-基)膦(31.2mg，0.07mmol)和碳酸铯(2307mg，7.08mmol)。将反应用氮气鼓泡约5分钟，然后加热至90℃，在氮气下搅拌过夜。将反应冷却至室温，然后用EtOAc和水稀释。将有机层干燥(MgSO₄)，过滤并在减压下蒸发溶剂。通过FCC(SiO₂，0-25％EtOAc的庚烷溶液)纯化，得到为油状物的甲基2-甲氧基-2-[3-(3-甲氧基氮杂环丁烷-1-基)苯基]乙酸酯(450mg，84％)。¹HNMR(400MHz,CDCl₃,30℃)δ3.33(3H,s),3.39(3H,s),3.68-3.74(5H,m),4.07-4.13(2H,m),4.29-4.36(1H,m),4.70(1H,s),6.43(1H,ddd),6.51-6.54(1H,m),6.79(1H,d),7.19(1H,t).m/z:ES⁺[M+H]⁺266。

中间体27

2-乙氧基-2-(3-甲氧基苯基)乙酸

在0℃下，经1小时，向3-甲氧基苯甲醛(5.0g，36.72mmol)和溴仿(3.85mL，44.06mmol)在乙醇(40mL)中的搅拌混合物中滴加氢氧化钾(11.33g，201.98mmol)在乙醇(60mL)中的溶液。添加完成后，将混合物在室温下搅拌过夜。通过过滤除去形成的沉淀，蒸发滤液，得到糊状物，将其溶于水(100mL)中，用EtOAc(2×100mL)萃取。然后将水相用2MHCl酸化至pH＝2，并用EtOAc(2×100mL)萃取。将合并的有机物干燥(MgSO₄)，过滤并蒸发，得到浅棕色油状物。将其吸附到二氧化硅上，通过FCC(SiO₂，5％MeOH的DCM溶液)纯化，得到为浅棕色油状物的2-乙氧基-2-(3-甲氧基苯基)乙酸(3.1g，40％)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃,21℃)δ1.28(3H,t),2.09(1H,s),3.64-3.52(2H,m),3.81(3H,s)4.86(1H,s),6.89(1H,ddd),6.99(1H,m),7.03(1H,m),7.29(1H,t)。m/z:ES^-[M-H]^-209。

中间体28

2-(3,5-二甲氧基苯基)-2-甲氧基-乙酸

经2小时将氢氧化钾(9.79g，174.43mmol)的MeOH(80mL)溶液以小份加入到3,5-二甲氧基苯甲醛(5.27g，31.71mmol)和溴仿(3.33mL，38.06mmol)在MeOH(40mL)中的搅拌混合物中。然后将混合物温热至室温，并且搅拌过夜。在减压下过滤固体，并用MeOH(40mL)冲洗。将滤液蒸发为浓稠的白色糊状物，然后重新溶解于水(150mL)中。将其用Et₂O(200mL)洗涤，并将含水部分用2MHCl酸化至pH＝2。将水相用EtOAc(500mL)萃取。将合并的有机物干燥(MgSO₄)，过滤并减压蒸发，得到为黄色胶状物(5.00g，70％)的2-(3,5-二甲氧基苯基)-2-甲氧基-乙酸。¹H NMR(400MHz,DMSO-d6,27℃)δ3.72(9H,s),4.68(1H,s),6.45(1H,s),6.52(2H,s)。

中间体29

3-甲氧基-2-(3-甲氧基苯基)丙酸

将乙基3-甲氧基-2-(3-甲氧基苯基)丙酸酯(中间体30，0.3g，1.259mmol)悬浮于水(5mL)中，并用氢氧化锂(0.3g，12.59mmol)处理，然后在60℃下加热持续3小时。将反应混合物冷却至室温。用EtOAc(20mL)萃取水溶液，弃去有机物。将水层用1MHCl酸化至pH＝1，并用EtOAc(2×20mL)萃取。将有机物干燥(MgSO₄)，过滤并减压蒸发，得到无色胶状物，通过FCC(SiO₂，0-100％EtOAc的环己烷溶液)纯化。合并含有所需化合物的级分，并且蒸发，得到3-甲氧基-2-(3-甲氧基苯基)丙酸(88mg，33％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d6,30℃)δ3.25(s,3H),3.49(1H,dd),3.74(3H,s),3.88-3.76(2H,m),6.93-6.80(3H,m),7.32-7.17(1H,m),12.51(1H,s)。m/z:ES⁺[M+H]⁺211。

中间体30

乙基3-甲氧基-2-(3-甲氧基苯基)丙酸酯

向圆底烧瓶中的乙基3-羟基-2-(3-甲氧基苯基)丙酸酯(中间体31，0.38g，1.695mmol)在MeCN(2mL)中的溶液中加入氧化银(0.5g，2.14mmol)。将溶液冷却至0℃，并且用碘甲烷(0.17mL，2.676mmol)处理。将反应混合物在室温下在黑暗中搅拌2.5天。LCMS分析显示一些产物，但主要是起始原料。进一步加入0.53mL碘甲烷和0.15g氧化银，并继续搅拌24小时。反应进一步进行，将其再搅拌7天。LCMS分析显示完全转化。将混合物通过硅藻土过滤，并且在减压下除去溶剂。将残余物吸附到二氧化硅上并通过FCC(SiO₂，0-40％EtOAc的环己烷溶液)纯化。在减压下蒸发适当的级分，以分离为无色油状物(0.3g，74％)的乙基3-甲氧基-2-(3-甲氧基苯基)丙酸酯。¹H NMR(400MHz,CDCl₃,21℃)δ1.23(3H,t),3.37(3H,s),3.58(1H,dd),3.80(3H,s),3.84(1H,dd),3.97(1H,t),4.24-4.08(2H,m),6.82(1H,ddd),6.95-6.85(2H,m),7.23(1H,d)。m/z:ES⁺[M+H]⁺239。

中间体31

乙基3-羟基-2-(3-甲氧基苯基)丙酸酯

将乙基2-(3-甲氧基苯基)乙酸酯(1.0g，5.149mmol)称重添加至具有碳酸氢钠(0.02g，0.257mmol)的圆底烧瓶中。加入DMSO(8mL)，然后加入多聚甲醛(0.39mL，5.149mmol)。将所得悬浮液在室温下搅拌24小时，然后将反应在60℃下加热3小时，得到无色溶液。将反应混合物冷却，用水(100mL)稀释并用0.5MHCl中和。将水溶液用EtOAc(3×50mL)萃取，干燥(MgSO₄)并减压蒸发，得到无色油状物，将其通过FCC(SiO₂，0-50％EtOAc的环己烷溶液)纯化。在减压下除去溶剂，得到为无色油状(0.38g，33％)的乙基3-羟基-2-(3-甲氧基苯基)丙酸酯。¹H NMR(400MHz,CDCl₃,21℃)δ1.23(3H,t),2.26(1H,s),3.86-3.76(5H,m),4.28-4.06(3H,m),6.89-6.79(3H,m),7.30-7.22(1H,m).m/z:ES⁺[M+H]⁺225。

中间体32

2-甲氧基-2-[3-(三氟甲氧基)苯基]乙酸

经2小时在0℃将氢氧化钾(1.851g，33.00mmol)在MeOH(10mL)中的溶液以小份加入到3-(三氟甲氧基)苯甲醛(1.141g，6mmol)和溴仿(0.630mL，7.20mmol)在MeOH(5.00mL)中的搅拌溶液中。然后将混合物温热至室温，并搅拌过夜。在反应混合物中形成白色沉淀。在减压下滤出固体，用MeOH(15mL)冲洗滤饼。将滤液蒸发为浓稠的白色糊状物，然后重新溶于水(50mL)中。然后将其用Et₂O(50mL)洗涤。将水相酸化至pH＝2(约5mL2MHCl溶液)，然后萃取到EtOAc(3×50mL)中。将合并的有机物干燥(MgSO₄)，过滤并减压蒸发，得到澄清油状物。将粗产物通过FCC(SiO₂，10％-50％EtOAc的庚烷溶液)纯化。将纯级分蒸发至干，得到为无色油状物的2-甲氧基-2-[3-(三氟甲氧基)苯基]乙酸(0.832g，55％)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃,30℃)δ3.47(3H,s),4.81(1H,s),7.20-7.24(1H,m),7.33(1H,s),7.37-7.46(2H,m)。m/z:ES^-[M-H]^-249.4。

中间体33

2-(3,5-二甲氧基苯基)-2-乙氧基-乙酸

在0℃下，经30分钟，向3,5-二甲氧基苯甲醛(2.16mL，15.04mmol)和溴仿(1.58mL，18.054mmol)在乙醇(15mL)中的搅拌混合物中加入氢氧化钾(4.64g，82.747mmol)在乙醇(30mL)中的溶液。添加完成后，将混合物搅拌并温热至室温过夜。第二天早上，通过过滤除去沉淀。蒸发滤液，得到糊状物，将其溶于水(75mL)中，用EtOAc(2×75mL)萃取。然后将水相用2NHCl酸化至pH＝2。将其用EtOAc(2×100mL)萃取。将合并的有机物干燥(MgSO₄)并蒸发，得到粗产物。通过FCC(SiO₂，0-5％MeOH的DCM溶液)纯化。合并纯的级分，在减压下蒸发，得到为橙色胶状物(2.46g，68％)的2-(3,5-二甲氧基苯基)-2-乙氧基-乙酸。¹H NMR(400MHz,DMSO-d6,25℃)δ1.15(3H,t),3.37-3.42(1H,m),3.48-3.55(1H,m),3.73(6H,s),4.78(1H,s),6.29(1H,s),6.53(1H,s),6.54(1H,s),12.76(1H,s)。m/z:ES^-[M-H]^-239。

中间体34

2-[4-氟-3-(3-甲氧基氮杂环丁烷-1-基)苯基]-2-甲氧基-乙酸

甲基2-[4-氟-3-(3-甲氧基氮杂环丁烷-1-基)苯基]-2-甲氧基-乙酸酯(中间体35，250mg，0.88mmol)悬浮于水(1.5mL)中，用氢氧化锂(42mg，1.77mmol)处理，并且在40℃加热2小时。使反应混合物冷却至室温，并在减压下蒸发MeOH。将水相用盐水(5mL)稀释，通过加入饱和柠檬酸水溶液调节至pH＝5。用含有5％MeOH(3×10mL)的DCM萃取水溶液。将合并的有机萃取物干燥(MgSO₄)并过滤。通过加入甲酸将水溶液进一步酸化至pH＝3，然后用EtOAc(4×10mL)再萃取。合并EtOAc萃取物，干燥(MgSO₄)，过滤，与DCM/MeOH萃取物合并，然后在减压下蒸发。将胶状残余物从Et₂O浓缩两次，得到为淡黄色玻璃状固体的2-[4-氟-3-(3-甲氧基氮杂环丁烷-1-基)苯基]-2-甲氧基-乙酸(221mg，93％)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃,21℃)δ3.33(3H,s),3.41(3H,s),3.80-3.83(2H,m),4.19-4.23(2H,m),4.29-4.33(1H,m),4.68(1H,s),6.50(1H,dd),6.75(1H,ddd),6.94(1H,dd)。m/z:ES⁺[M+H]⁺270.1。

中间体35

甲基2-[4-氟-3-(3-甲氧基氮杂环丁烷-1-基)苯基]-2-甲氧基-乙酸酯

将甲基2-(3-溴-4-氟-苯基)-2-甲氧基-乙酸酯(中间体36，600mg，2.17mmol)称重添加到配有suba密封件，N₂入口和回流冷凝器的三颈圆底烧瓶中。将烧瓶用N₂冲洗5分钟，然后加入3-甲氧基氮杂环丁烷盐酸盐(0.27g，2.17mmol)和碳酸铯(2.47g，7.58mmol)。在单独的烧瓶中，将2-二环己基膦基-2,6-二异丙氧基联苯(Ruphos，0.04g，0.087mmol)和RuphosPd G2(0.06g，0.077mmol)溶于无水甲苯中。将溶液通过针头用N₂脱气5分钟，然后通过suba密封件加入到3颈圆底烧瓶中的其他试剂中。将反应混合物在90℃加热20小时。将反应混合物冷却至室温，并用EtOAc(20mL)和水(20mL)稀释。收集有机层，并且用另一份EtOAc(20mL)洗涤水相。有机物用盐水(50mL)洗涤，分离并且在减压下蒸发。将残余物通过FCC(SiO₂，0-70％EtOAc的石油醚溶液)纯化。合并纯的级分，并且在减压下蒸发，得到为无色油状物的甲基2-[4-氟-3-(3-甲氧基氮杂环丁烷-1-基)苯基]-2-甲氧基-乙酸酯(136mg，22％)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃,21℃)δ3.33(3H,s),3.38(3H,s),3.72(3H,s),3.78-3.83(2H,m),4.19-4.23(2H,m),4.29-4.33(1H,m),4.67(1H,s),6.55(1H,dd),6.75(1H,ddd),6.92(1H,dd)。m/z:ES⁺[M+H]⁺284.0。

中间体36

甲基2-(3-溴-4-氟-苯基)-2-甲氧基-乙酸酯

在N₂下将钠(93mg，4.05mmol)溶解在MeOH(12mL)中。添加甲基2-溴-2-(3-溴-4-氟-苯基)乙酸酯(中间体37，1.20g，3.68mmol)在MeOH(3mL)中的溶液，将反应混合物加热至40℃持续2小时。将反应混合物冷却至室温，并且在减压下蒸发。将残余物用饱和NH₄Cl(水溶液)(10mL)处理，用EtOAc(3×10mL)萃取。将合并的有机萃取物干燥(MgSO₄)，过滤，并且在减压下蒸发。将残余物通过FCC(SiO₂，0-10％EtOAc的石油醚溶液)纯化。合并纯的级分，并且在减压下蒸发，得到为无色油状物的甲基2-(3-溴-4-氟-苯基)-2-甲氧基-乙酸酯(616mg，60％)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃,21℃)δ3.42(3H,s),3.74(3H,s),4.73(1H,s),7.12(1H,t),7.37(1H,ddd),7.67(1H,dd)。

中间体37

甲基2-溴-2-(3-溴-4-氟-苯基)乙酸酯

制备甲基2-(3-溴-4-氟-苯基)乙酸酯(5.0g，20.24mmol)在四氯化碳(50mL)中的溶液，并且添加N-溴琥珀酰亚胺(3.78g，21.25mmol)，随后添加2,2’-偶氮双(2-甲基丙腈)(0.17g，1.01mmol)。将反应加热至回流4小时，并使其冷却至室温。滤出沉淀，在减压下蒸发溶液。将粗残余物通过FCC(SiO₂，0-10％EtOAc的石油醚溶液)纯化。合并纯的级分，并且在减压下蒸发，得到为无色油状物的甲基2-溴-2-(3-溴-4-氟-苯基)乙酸酯(5.30g，80％)。¹HNMR(400MHz,CDCl₃,21℃)δ3.81(3H,s),5.28(1H,s),7.12(1H,t),7.49(1H,ddd),7.78(1H,dd)。

中间体38

2-[4-氟-3-(3-氟氮杂环丁烷-1-基)苯基]-2-甲氧基-乙酸锂

将氢氧化锂(99.86mg，4.16mmol)悬浮在水(10mL)和甲醇(33mL)中，用甲基2-[4-氟-3-(3-氟氮杂环丁烷-1-基)苯基]-2-甲氧基-乙酸酯(中间体39，565mg，2.08mmol)处理，并且在45℃下，在氮气下加热2小时。将反应混合物冷却至室温，在减压下除去MeOH和水，然后在真空烘箱中干燥1天。这得到2-[4-氟-3-(3-氟氮杂环丁烷-1-基)苯基]-2-甲氧基-乙酸锂(0.60g，75％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ3.18(3H,s),3.95-3.50(3H,m),4.18-4.11(1H,m),4.21(1H,s),5.58-5.32(1H,m),6.60(1H,dd),6.77-6.70(1H,m),6.96-6.88(1H,m).m/z:ES⁺[M+H]⁺263.1。

中间体39

甲基2-[4-氟-3-(3-氟氮杂环丁烷-1-基)苯基]-2-甲氧基-乙酸酯

向配备有suba密封件、磁力搅拌棒氮气入口和回流冷凝器的2颈圆底烧瓶中加入Ruphos Pd G1甲基叔丁基醚加合物(0.16g，0.193mmol)、2-二环己基膦基-2,6-二异丙氧基联苯，(Ruphos，0.09g，0.193mmol)、3-氟氮杂环丁烷盐酸盐(0.5g，4.461mmol)和碳酸铯(4.24g，13.01mmol)，将烧瓶用氮气冲洗5分钟，然后在单独的圆底烧瓶中放置甲基2-(3-溴-4-氟-苯基)-2-甲氧基-乙酸酯(中间体36，1.03g，3.717mmol)。将烧瓶装上suba密封件，在氮气下加入甲苯(25mL)。通过向其中鼓入氮气5分钟使所得溶液脱气，然后在氮气下将其加入到含有其他试剂的2颈圆底烧瓶中。将反应混合物在90℃加热48小时，然后使其冷却至室温，并在减压下蒸发。将残余物在EtOAc(100mL)和水(100mL)之间分配。将水层用另一部分EtOAc(200mL)萃取。合并有机物，用MgSO4干燥，过滤并且在减压下蒸发，得到浅棕色油状物，将其溶于EtOAc中并吸附到二氧化硅上，然后通过快速柱色谱法纯化，用0-100％EtOAc的环己烷溶液洗脱。蒸发适当的馏分，提供为淡黄色液体(565mg，33％)的甲基2-[4-氟-3-(3-氟氮杂环丁烷-1-基)苯基]-2-甲氧基-乙酸酯。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ3.28(3H,s),3.63(3H,s),4.02-3.84(2H,m),4.31-4.17(2H,m),4.84(1H,s),5.57-5.31(1H,m),6.62-6.53(1H,m),6.79-6.71(1H,m),7.07(1H,dd)。m/z:ES⁺[M+H]⁺271.2。

中间体40

2-[3-(3-氟氮杂环丁烷-1-基)-5-甲氧基-苯基]-2-甲氧基-乙酸锂

将氢氧化锂(0.02g，0.932mmol)悬浮于水(1mL)和MeOH(3mL)中，并且用甲基2-[3-(3-氟氮杂环丁烷-1-基)-5-甲氧基-苯基]-2-甲氧基-乙酸酯(中间体41，0.13g，0.466mmol)处理。将混合物在N₂下加热至45℃持续2小时。然后将其冷却至室温，并且在减压下除去溶剂，然后真空干燥3天，得到2-[3-(3-氟氮杂环丁烷-1-基)-5-甲氧基-苯基]-2-甲氧基-乙酸锂(137mg，101％)。m/z:ES⁺[M+H]⁺269.3。

中间体41

甲基2-[3-(3-氟氮杂环丁烷-1-基)-5-甲氧基-苯基]-2-甲氧基-乙酸酯

在圆底烧瓶中放置甲基2-(3-溴-5-甲氧基-苯基)-2-甲氧基-乙酸酯(中间体42，0.3g，1.038mmol)。该烧瓶配备有suba密封件，并在N₂下加入甲苯(6.5mL)。将所得溶液通过N₂鼓泡脱气5分钟。向装有suba密封件、磁力搅拌棒、氮气入口和回流冷凝器的2颈圆底烧瓶中加入Ruphos Pd G1甲基叔丁基醚加合物(0.04g，0.054mmol)、2-二环己基膦基-2,6-二异丙氧基联苯，(Ruphos，0.03g，0.054mmol)、3-氟氮杂环丁烷盐酸盐(0.14g，1.245mmol)和碳酸铯(1.18g，3.632mmol)。将烧瓶用N₂冲洗5分钟，然后通过suba密封件加入甲基2-(3-溴-5-甲氧基-苯基)-2-甲氧基-乙酸酯(0.3g，1.038mmol)在甲苯中的脱气溶液。将反应混合物在90℃下加热48小时，然后使其冷却至室温，并在减压下蒸发。将残余物在EtOAc(100mL)和水(100mL)之间分配。将水层用另一部分EtOAc(200mL)萃取。将有机物合并，干燥(MgSO₄)，过滤并蒸发，得到浅棕色油，将其溶于EtOAc中并吸附到二氧化硅上。通过FCC(SiO₂，0-50％EtOAc的环己烷溶液)纯化。蒸发适当的级分，提供为浅黄色液体的甲基2-[3-(3-氟氮杂环丁烷-1-基)-5-甲氧基-苯基]-2-甲氧基-乙酸酯(132mg，42％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d6,30℃)δ3.27(3H,s),3.62(3H,s),3.71(3H,s),3.78-3.96(2H,m),4.05-4.21(2H,m),4.77(1H,s),5.35-5.57(1H,m),5.98(1H,s),6.05(1H,s),6.29(1H,s)。m/z:ES⁺[M+H]⁺283.3。

中间体42

甲基2-(3-溴-5-甲氧基-苯基)-2-甲氧基-乙酸酯

将2-(3-溴-5-甲氧基-苯基)-2-甲氧基-乙酸(中间体43，2.77g，10.06mmol)溶于MeOH(30mL)中，用浓硫酸(0.17mL，2.014mmol)处理，然后加热至65℃持续2小时。将混合物冷却至室温，蒸发，然后用水(5mL)稀释，随后用饱和碳酸氢钠水溶液(20mL)稀释。将水层萃取到DCM中，然后用EtOAc萃取。蒸发合并的有机物，通过FCC(SiO₂，0-40％EtOAc的环己烷溶液)纯化粗物质。蒸发含有级分的产物，得到甲基2-(3-溴-5-甲氧基-苯基)-2-甲氧基-乙酸酯(1.2g，41％)。(400MHz,DMSO-d6,30℃)δ3.31(s,3H),3.65(3H,s),3.78(3H,s),4.94(1H,s),6.90-6.95(1H,m),7.11-7.14(1H,m),7.15(1H,dd)。m/z:ES⁺[M+H]⁺290。

中间体43

2-(3-溴-5-甲氧基-苯基)-2-甲氧基-乙酸

在0℃下，经10分钟，向氢氧化钾(2.87g，51.15mmol)和溴仿(0.98mL，11.16mmol)在甲醇(15mL)中的搅拌混合物中加入3-溴-5-甲氧基-苯甲醛(0.75mL，9.301mmol)在甲醇(60mL)中的悬浮液。添加完成后，将混合物温热至室温过夜搅拌。然后将反应混合物用DCM(60mL)处理，并通过过滤除去沉淀。将滤液蒸发，得到糊状物，将其溶于水(200mL)中，用DCM(200mL)萃取。然后将水相用2MHCl酸化至pH2，并用DCM(2×100mL)和EtOAc(2×100mL)萃取。将合并的有机物在减压下蒸发并进行色谱分离(SiO₂，0-30％EtOAc-环己烷)。蒸发含有级分的产物，得到2-(3-溴-5-甲氧基-苯基)-2-甲氧基-乙酸(0.84g，33％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ3.30(s,3H)3.77(s,3H),4.78(s,1H),6.94-6.91(m,1H),7.14-7.10(m,2H),13.04(s,1H).m/z:ES⁺[M+H]⁺275.1。

中间体44

2-甲氧基-2-[3-甲氧基-5-(三氟甲氧基)苯基]乙酸

在0℃下，经30分钟，向3-甲氧基-5-(三氟甲氧基)苯甲醛(中间体45，

0.15g，0.681mmol)和溴仿(0.07mL，0.81mmol)在MeOH(1mL)中的搅拌混合物中逐滴加入氢氧化钾(0.207g，3.75mmol)在MeOH(2mL)中的溶液。将混合物搅拌并加热至室温过夜。通过过滤除去所得沉淀。蒸发滤液，得到糊状物，将其溶于水(100mL)中，用EtOAc(2×100mL)萃取以除去未反应的醛。然后将水相用2N盐酸酸化至pH＝2，并用EtOAc(2×100mL)萃取。将合并的有机物干燥(MgSO₄)，过滤并减压蒸发，得到粗产物，将其通过FCC(SiO₂，0-10％MeOH的DCM溶液)纯化，得到为黄色固体的2-甲氧基-2-[3-甲氧基-5-(三氟甲氧基)苯基]乙酸(191mg，34％)。m/z:ES⁺[M+H]⁺280。

中间体45

3-甲氧基-5-(三氟甲氧基)苯甲醛

向[3-甲氧基-5-(三氟甲氧基)苯基]甲醇(中间体46，330mg，1.49mmol)在DCM(18mL)中的搅拌溶液中加入活化的二氧化锰(646mg，7.43mmol)，并且将反应混合物在室温下搅拌3小时。将反应混合物用水(50mL)稀释，用DCM(3×50mL)萃取，用盐水(100mL)洗涤，干燥(MgSO₄)，过滤并减压蒸发，得到粗产物，将其通过FCC(SiO₂，0-50％EtOAc的环己烷溶液)，得到为无色油状物的3-甲氧基-5-(三氟甲氧基)苯甲醛(0.15g，45％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d6,21℃)δ3.83(3H,s),7.24-7.27(1H,m),7.39-7.42(1H,m),7.46-7.48(1H,m),9.94(1H,s)。m/z:ES⁺[M+H]⁺222。

中间体46

[3-甲氧基-5-(三氟甲氧基)苯基]甲醇

在0℃下，在氮气下，经10分钟，向3-甲氧基-5-(三氟甲氧基)苯甲酸(0.50g，2.12mmol)在THF(10mL)中的搅拌溶液中滴加氢化锂铝(1M在THF中，2.33mL，2.33mmol)。在氮气下将反应混合物搅拌3小时，并且温热至室温。将反应混合物用水(10mL)稀释，然后用2NNaOH(30mL)溶液稀释，通过过滤除去形成的盐。将滤液用DCM(3×100mL)萃取，干燥(MgSO₄)，过滤并减压蒸发，得到粗产物，将其通过FCC(SiO₂，0-50％EtOAc的环己烷溶液)纯化，得到为白色固体的[3-甲氧基-5-(三氟甲氧基)苯基]甲醇(0.33g，67％)。m/z:ES⁺[M+H]⁺222。

中间体47

2-[3-(二氟甲氧基)苯基]-2-乙氧基-乙酸

在0℃下，经1小时，向3-(二氟甲氧基)苯甲醛(2.0g，11.619mmol)和溴仿(1.22mL，13.94mmol)在乙醇(40mL)中的搅拌混合物中加入氢氧化钾(3.59g，63.90mmol)在乙醇(20mL)中的溶液。添加完成后，将混合物搅拌并温热至室温过夜。通过过滤除去沉淀物，滤液在减压下蒸发，得到糊状物，将其溶于水(100mL)中，用EtOAc(2×75mL)萃取。然后将水相用2MHCl酸化至pH＝1，并用EtOAc(2×75mL)萃取。将合并的有机物干燥(MgSO₄)，过滤并蒸发，得到浅棕色油状物，将其通过FCC(SiO₂，95:5环己烷:EtOAc+0.1％甲酸，增至8:2EtOAc:环己烷+0.1％甲酸)纯化。在减压下蒸发适当的级分，以提供为无色油状(1.8g，62％)的2-[3-(二氟甲氧基)苯基]-2-乙氧基-乙酸

¹H NMR(400MHz,CDCl₃,21℃)δ1.29(3H,t),3.49-3.70(2H,m),4.89(1H,s),6.52(1H,t),7.07-7.15(1H,m),7.21-7.26(1H,m),7.28-7.35(1H,m),7.34-7.41(1H,m)。m/z:ES^-[M-H]^-245。

中间体48

2-甲氧基-2-[3-(氧杂环丁烷-3-基)苯基]乙酸

经2小时将氢氧化钾(1.427g，25.43mmol)在MeOH(30mL)中的溶液以小部分加入到3-(氧杂环丁烷-3-基)苯甲醛(中间体49，750mg，4.62mmol)和溴仿(0.485mL，5.55mmol)在MeOH(15mL)中的搅拌溶液中，然后将混合物温热至室温，并且搅拌过夜。在减压下过滤固体，用MeOH(15mL)冲洗固体。将滤液蒸发为浓稠的白色糊状物，然后重新溶于水(150mL)中。将其用Et2O(200mL)洗涤，然后用2M酸化至pH＝2。将水相萃取到EtOAc(300mL)中，将合并的有机物干燥(MgSO₄)，过滤并减压蒸发，得到为无色油状物(1.0g，97％)的2-甲氧基-2-[3-(氧杂环丁烷-3-基)苯基]乙酸，其不经进一步纯化而使用。¹H NMR(400MHz,DMSO,30℃)δ3.31(3H,s),4.18-4.35(1H,m),4.58(2H,m),4.77(1H,s),4.94(1H,m),7.22-7.57(4H,m)。

中间体49

3-(氧杂环丁烷-3-基)苯甲醛

在氮气下在21℃下将氧化锰(IV)(14.30g，164.43mmol)加入到在DCM(70mL)中的(3-(氧杂环丁烷-3-基)苯基)甲醇(中间体50，1.5g，8.22mmol)中。将所得混合物在21℃下搅拌16小时。然后将反应通过硅藻土过滤，用DCM洗涤并蒸发成胶状物。将粗产物通过FCC(SiO₂，10％-60％EtOAc的庚烷溶液)纯化。将纯级分蒸发至干，得到为无色胶状物的3-(氧杂环丁烷-3-基)苯甲醛(800mg，60％)。¹H NMR(400MHz,DMSO,30℃)δ4.21-4.51(1H,m),4.64(2H,m),4.98(2H,m),7.60(1H,t),7.74(1H,d),7.79-7.85(1H,d),7.94(1H,s),10.03(1H,s)。

中间体50

(3-(氧杂环丁烷-3-基)苯基)甲醇

在0℃和氮气下，将氢化铝锂(1M的THF溶液，1.94mL，1.95mmol)滴加到3-(氧杂环丁烷-3-基)苯甲酸钠(300mg，1.50mmol)的THF(10mL)溶液中。将所得混合物在0℃下搅拌20分钟，然后在25℃下搅拌18小时。添加5％HCl水溶液，将混合物用EtOAc(100mL)萃取，用2M水性Na₂CO₃溶液洗涤，然后将有机层干燥(Na₂SO₄)，过滤并蒸发。将粗产物通过FCC(SiO₂，50％-100％EtOAc的庚烷溶液，然后10％1M NH₃的MeOH(在EtOAc中)溶液)纯化。将纯级分蒸发至干，得到为无色胶状物的(3-(氧杂环丁烷-3-基)苯基)甲醇(140mg，57％)。¹H NMR(400MHz,DMSO,30℃)δ4.20(1H,m),4.51(2H,d),4.62(2H,m),4.95(2H,m),5.16(1H,t),7.17-7.29(2H,m),7.31-7.41(2H,m)。

中间体51

2-乙氧基-2-[3-(三氟甲氧基)苯基]乙酸

在0℃下，经10分钟，向氢氧化钾(1.62g，28.93mmol)和溴仿(0.55mL，6.31mmol)在乙醇(15mL)中的搅拌混合物中加入3-(三氟甲氧基)苯甲醛(0.75mL，5.26mmol)的乙醇(30mL)溶液。添加后，将混合物搅拌并温热至室温过夜。通过过滤除去沉淀。将滤液蒸发，得到糊状物，将其溶于水(200mL)中，用DCM(100mL)萃取。这形成乳液，然后将水相用2M HCl(10mL)酸化并分离。然后进一步用EtOAc(100mL)萃取。将合并的有机物在减压下蒸发并通过FCC(SiO₂，0-50％EtOAc的环己烷溶液)纯化。合并纯的级分，并且在减压下蒸发，得到2-乙氧基-2-[3-(三氟甲氧基)苯基]乙酸(690mg，49％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d6,21℃)δ1.16(3H,t),3.38-3.50(1H,m),3.53-3.66(1H,m),4.99(1H,s),7.28-7.39(2H,m),7.45(1H,d),7.53(1H,t),13.04(1H,s)。m/z:ES⁺[M+H]⁺265。

中间体52

2-[4-氟-3-(三氟甲氧基)苯基]-2-甲氧基-乙酸

将氢氧化锂(0.02g，0.9mmol)悬浮于水(1mL)和甲醇(3mL)中并用乙基2-[4-氟-3-(三氟甲氧基)苯基]-2-甲氧基-乙酸酯(中间体53，0.13g，0.45mmol)处理，并在45℃下加热2小时。使反应混合物冷却至室温，并在减压下除去MeOH。将水相用盐水(20mL)稀释，通过加入甲酸调节至pH3，然后用EtOAc(3×20mL)萃取。将合并的EtOAc萃取物用盐水(30mL)洗涤，经MgSO₄干燥，过滤并在减压下除去溶剂，得到2-[4-氟-3-(三氟甲氧基)苯基]-2-甲氧基-乙酸(0.127g，105％)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃-d6,25℃)δ3.47(3H,s),4.78(1H,s),7.23(1H,dd),7.37-7.46(2H,m)。m/z:ES+[M+H]+268.98。

中间体53

乙基2-[4-氟-3-(三氟甲氧基)苯基]-2-甲氧基-乙酸酯

在N₂下，在圆底烧瓶中，将钠(0.04g，1.66mmol)加入到无水甲醇(12mL)中。在N₂下向该溶液中加入甲基2-溴-2-[4-氟-3-(三氟甲氧基)苯基]乙酸酯(中间体54，0.5g，1.51mmol)的甲醇(3mL)溶液。将反应混合物在40℃加热2小时。在减压下除去溶剂，将剩余的胶状物在饱和氯化铵溶液(50mL)和EtOAc(50mL)之间分配。将水层用另一部分EtOAc(50mL)萃取。将有机物合并，用MgSO₄干燥，过滤并在减压下除去溶剂。将残余的油通过快速柱色谱纯化(用100％环己烷至15％EtOAc的环己烷溶液洗脱)。蒸发适当的级分，以提供乙基2-[4-氟-3-(三氟甲氧基)苯基]-2-甲氧基-乙酸酯(0.127g，28％)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃-d6,25℃)δ1.23(3H,t),3.44(3H,s),4.12-4.28(2H,m),4.74(1H,d),7.20(1H,dd),7.39(1H,dddd),7.42-7.48(m,1H)。

中间体54

甲基2-溴-2-[4-氟-3-(三氟甲氧基)苯基]乙酸酯

将甲基2-[4-氟-3-(三氟甲氧基)苯基]乙酸酯(中间体55，0.65g，2.578mmol)和N-溴琥珀酰亚胺(4.08g，22.919mmol)称重至圆底烧瓶中，并且添加在四氯化碳(6mL)中的2,2-偶氮双(2-甲基丙腈)(AIBN，0.02g，0.129mmol)。将反应加热至回流4小时，并且使其冷却至室温。滤出沉淀，将溶液用二氧化硅处理，减压蒸发，并且通过快速柱色谱纯化(用100％环己烷逐渐增加至环己烷中的30％EtOAc进行洗脱)。在减压下蒸发适当的级分，得到为浅黄色油状物(1.1g，129％)的甲基2-溴-2-[4-氟-3-(三氟甲氧基)苯基]乙酸酯。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃-d6,25℃)δ3.81(3H,s),5.29(1H,s),7.17-7.24(1H,m,),7.46-7.52(1H,m),7.53-7.59(1H,m)。

中间体55

甲基2-[4-氟-3-(三氟甲氧基)苯基]乙酸酯

将4-氟-3-(三氟甲氧基)苯基乙酸(1.0g，4.199mmol)悬浮于甲醇(10mL)中，并且用硫酸(0.07mL，0.84mmol)处理，并且在45℃下加热2小时。使反应混合物冷却至室温，并在减压下除去甲醇。将残余物用盐水(20mL)稀释，然后用EtOAc(3×20mL)萃取。将合并的EtOAc萃取物用盐水(30mL)洗涤，用MgSO₄干燥，过滤并减压除去溶剂，得到甲基2-[4-氟-3-(三氟甲氧基)苯基]乙酸酯，(0.65g，61％)

¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ3.63(3H,s),3.78(2H,s),7.33-7.39(1H,m),7.42-7.53(2H,m)。m/z:ES⁺[M+H]⁺253。

生物测定

使用以下测定来测量在此描述的化合物的效果：a)GLS酶效力测定；b)GLS细胞效力测定；c)GLS细胞增殖测定。在测定的描述中，通常：

i.使用以下缩写：CO₂＝二氧化碳；DMEM＝杜氏改良伊格尔培养基；DMSO＝二甲亚砜；EDTA＝乙二胺四乙酸；EGTA＝乙二醇四乙酸；FCS＝胎牛血清；h＝小时；NBS＝非结合表面；SDS＝十二烷基硫酸钠；TRIS＝三(羟甲基)氨基甲烷。

ii.使用Genedata智能拟合模型计算IC₅₀值。IC₅₀值是抑制50％生物活性的测试化合物的浓度。

测定a)：GLS酶效力测定

使用谷氨酸氧化酶/AmplexRed偶联测定来测量化合物在体外结合并抑制GLS1活性的能力。纯化在大肠杆菌中表达的6His标记的GLS蛋白(氨基酸63-669)，并以等分试样保存在-80℃。将GLS1稀释至2x工作浓度，并在室温下孵育以允许四聚体/二聚体形式达到稳定状态。测定测量在包含50mM TRIS(pH7.8)、100mM NaPO₄(pH7.8)、0.001％v/vTween20的缓冲液中进行。将纯化的重组GLS1蛋白在测定缓冲液中稀释至12nM，并在室温下预孵育30分钟。通过在100％DMSO中稀释以制备用于12点浓度响应的正确剂量范围并且使用LabcyteEcho555声学分配器将适当体积(2.5-60nl)分配到384孔微量测定板(Greiner产品代码784900)中来制备测试化合物。通过用DMSO溶液回填来将DMSO浓度维持在2％。然后使用BioRaptr自动分配器(Beckman-Coulter)将3μL稀释的GLS1蛋白(12nM)分配到每个孔中，并在室温下孵育15分钟。然后添加3μL的在测定缓冲液中稀释的100mM谷氨酰胺，并将反应在室温孵育60分钟。然后通过添加在100mM TRIS(pH7.5)中的45μM6-(2-溴乙炔基)-2,3-二甲基-喹唑啉-4-酮、75μM Amplex Red、0.375单位/mL辣根过氧化物酶、0.12单位/mL谷氨酸氧化酶来终止反应。在黑暗中在室温下30分钟后，使用535/590nm光学滤器在Perkin ElmerEnVision上读取平板，并且使用Genedata分析原始数据以产生IC₅₀值。其中用测定缓冲液替换6His标记的GLS蛋白和谷氨酰胺的测定的人工制品版本也用于排除对测定组分的非特异性影响。

测定b)：GLS细胞效力测定

通过使用测量细胞谷氨酸盐耗竭的PC3偶联测定来评价化合物抑制细胞GLS活性的潜力。通过在100％DMSO中稀释以制备用于12点浓度响应的正确剂量范围并且使用Labcyte Echo 555声学分配器将适当体积(5-120nl)分配到384孔微量测定板(科宁(Corning)产品代码3712)中来制备测试化合物。通过用DMSO溶液回填来将DMSO浓度维持在0.3％。PC3细胞在不含苯酚的DMEM、10％透析的FCS、2mM谷氨酰胺中生长，并通过胰蛋白酶消化分散，以每孔5.6×10³细胞在40μl生长培养基中直接接种到含有分配的化合物的384孔测定板中。在37℃下孵育6小时后，吸出5％CO₂生长培养基，并且细胞在含有10mM TRISpH 7.4、100mM NaCl、1mM EDTA、1mM EGTA、1mM NaF、20mM Na₄P₂O₇、2mM Na₃VO₄、1％TritonX-100、10％甘油、0.1％SDS和0.5％脱氧胆酸盐的15μl缓冲液中裂解。然后将4μl细胞裂解物转移到384孔NBS板(科宁产品编号3575)中，并添加35μl 27.5μM Amplex Red、0.1375U/mL辣根过氧化物酶、0.044U/mL谷氨酸氧化酶、100mM TRIS pH 7.5。在黑暗中在室温下30分钟后，使用535/590nm光学滤器在Perkin Elmer EnVision上读取平板，并且使用专有软件分析原始数据以产生IC₅₀值。

测定c)：GLS细胞增殖测定

使用384孔板NCI-H1703细胞增殖测定法测量化合物抑制细胞生长的能力。将NCI-H1703细胞在不含酚红的RPMI1640、10％FCS和2mM谷氨酰胺中生长，并在40μl生长培养基中以每孔750个细胞的密度接种进入澄清底384孔测定板(科宁产品代码3712)中，并在37℃，5％CO₂下孵育24小时。通过在100％DMSO中稀释以制备用于12点浓度响应的正确剂量范围并将适当体积(5-120nl)直接分配到含有铺板细胞的测定板中来制备测试化合物。通过用DMSO溶液回填来将DMSO浓度维持在0.3％。将板在37℃、5％CO₂孵育5天，添加Sytox Green和皂苷至终浓度分别为2μM和0.25％，并孵育6小时，然后分析。在Acumen eX3(TTP Labtech公司)上使用488nm激发和FITC滤光片组(500-530nm)针对发射读取平板。通过使用GeneData软件分析将曲线拟合至第零天生长的最大抑制来计算IC₅₀值。

测定a)-c)的结果显示在表1中。

表1.测定数据

Claims

1.一种具有如下化学式的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中：

R²是氢或氟；

R³是氢或甲氧基；并且

R⁴是甲氧基、乙氧基、或甲氧基甲基；

2.如权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R¹是甲氧基并且R³是甲氧基。

3.如权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R¹是氧杂环丁烷-3-基，3-氟氮杂环丁烷-1-基；3-甲氧基氮杂环丁烷-1-基，或3,3-二氟氮杂环丁烷-1-基。

4.如权利要求1-3中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R²是H。

5.如权利要求1-3中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R³是甲氧基。

6.如权利要求1-3中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R⁴是甲氧基。

7.如权利要求1-3中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中Q是1,2,4-三嗪-3-基、或哒嗪-3-基。

8.化合物或其药学上可接受的盐，其中该化合物选自下组，该组由以下各项组成：

(2S)-2-[3-(3-氟氮杂环丁烷-1-基)苯基]-2-甲氧基-N-[5-[[(3R)-1-(1,2,4-三嗪-3-基)吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺；

(2S)-2-甲氧基-2-[3-(氧杂环丁烷-3-基)苯基]-N-[5-[[(3R)-1-哒嗪-3-基吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺；

(2R)-2-[4-氟-3-(三氟甲氧基)苯基]-2-甲氧基-N-[5-[[(3R)-1-哒嗪-3-基吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺；以及

(2S)-2-[4-氟-3-(三氟甲氧基)苯基]-2-甲氧基-N-[5-[[(3R)-1-哒嗪-3-基吡咯烷-3-基]氨基]-1,3,4-噻二唑-2-基]乙酰胺。

9.一种药物组合物，其包含如权利要求1-8中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐和至少一种药学上可接受的稀释剂或载体。

10.如权利要求1-8中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗至少部分由GLS1介导的疾病的药物中的用途。

11.如权利要求1-8中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗癌症的药物中的用途。

12.如权利要求11所述的用途，其中所述癌症是乳腺癌、肺癌、胰腺癌、肾癌或肝细胞癌。