JP2018534950A - 遺伝子編集によるヒトジストロフィン遺伝子の修正用の治療標的および使用方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる、2015年11月30日に出願された米国仮特許出願第62/260,712号明細書および2016年5月2日に出願された米国仮特許出願第62/330,336号明細書に対する優先権を主張する。
本発明は、National Science Foundation Graduate Research Fellowship Programによる賞の下で政府の支援を受けて行なわれた。米国政府は本発明に対して一定の権利を有する。
本開示は、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat)(CRISPR)/CRISPR関連(Cas)9に基づくシステムおよびウイルス送達システムを使用する遺伝子発現の改変、遺伝子のゲノム操作およびゲノム改変の分野に関する。本開示はまた、筋肉(例えば骨格筋および心筋)での遺伝子のゲノム操作およびゲノム改変の分野にも関する。
別途定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。矛盾する場合には、定義を含む本文書が支配する。好ましい方法および材料が以下に説明されているが、本明細書で説明されたものと類似のまたは等価の方法および材料を本発明の実施または試験で使用することができる。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。本明細書で開示された材料、方法および例は一例にすぎず、限定することを意図するものではない。
本発明は、ジストロフィン遺伝子(例えばヒトジストロフィン遺伝子)のゲノム編集、ゲノム改変またはゲノム発現の変更のための遺伝子コンストラクトを対象とする。この遺伝子コンストラクトは、ヒトおよびアカゲザルの両方のジストロフィン遺伝子配列(例えば、SaCas9に適合する標的)を標的とする少なくとも1種のgRNAを含む。本開示のgRNAは、ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン51の周囲のイントロン領域を標的とするために、CRISPR/Cas9に基づく遺伝子編集システム(例えば、SaCas9を使用するシステム)に含まれ得、この領域のゲノム欠失を引き起こして、DMD患者由来の細胞中で機能するジストロフィンの発現を回復させる。
ジストロフィンは、細胞膜を介して筋繊維の細胞骨格と周囲の細胞外マトリックスとをつなぐタンパク質複合体の一部である棒状の細胞質タンパク質である。ジストロフィンは、細胞膜のジストログリカン複合体に構造安定性をもたらす。ジストロフィン遺伝子は、遺伝子座Xp21で2.2ベガ塩基である。一次転写は約2,400kbを測定し、成熟mRNAは約14kbである。79種のエクソンは、3500個を超えるアミノ酸であるタンパク質をコードする。正常な骨格筋組織には、わずかな量のジストロフィンしか含まれないが、このジストロフィンの異常な発現の欠如により、重度且つ不治の症状が発症する。ジストロフィン遺伝子中のいくつかの変異により、罹患した患者では不完全なジストロフィンおよび重度のジストロフィー表現型が産生される。ジストロフィン遺伝子中のいくつかの変異により、罹患した患者では、部分的に機能するジストロフィンタンパク質および非常に軽度のジストロフィー表現型がもたらされる。
本開示の遺伝子コンストラクト(例えばベクター)は、ジストロフィン遺伝子(例えばヒトジストロフィン遺伝子)に特異的であるCRISPR/Cas9に基づく遺伝子編集システムをコードする。「クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート」および「CRISPR」は、本明細書で互換的に使用される場合、配列決定された細菌の約40%および配列決定された古細菌の90%のゲノムで見られる複数の短いダイレクトリピートを含む遺伝子座を指す。CRISPR系は、ある形態の獲得免疫を提供する、侵入するファージおよびプラスミドに対する防御に関与する、微生物ヌクレアーゼ系である。微生物宿主におけるCRISPR遺伝子座は、CRISPR介在性の核酸切断の特異性をプログラミングすることが可能な、CRISPR関連(Cas)遺伝子と、ノンコーディングRNAエレメントとの組み合わせを含有する。スペーサーと呼ばれる、外来DNAの短い部分が、ゲノムのCRISPRリピート間に組み込まれ、過去の曝露の「メモリー」として働く。Cas9は、sgRNA(本明細書で互換的に「gRNA」とも称される)の3’末端との複合体を形成し、このタンパク質−RNA対は、sgRNA配列の5’末端と、プロトスペーサーとして公知であるあらかじめ定義された20bp DNA配列との間の相補的塩基対合によって、そのゲノム上の標的を認識する。この複合体は、crRNA内のコードされた領域を介して、病原体DNAの相同遺伝子座、すなわち、病原体ゲノム内のプロトスペーサー、およびプロトスペーサー隣接モチーフ(protospacer−adjacent motif)(PAM)に誘導される。ノンコーディングCRISPRアレイは、ダイレクトリピート内で転写および切断されて、個々のスペーサー配列を含有する短いcrRNAとなり、これが、Casヌクレアーゼを標的部位(プロトスペーサー)に誘導する。発現されるsgRNAの20bp認識配列を単に交換することによって、Cas9ヌクレアーゼを、ゲノム上の新しい標的に誘導することができるようになる。CRISPRスペーサーは、真核生物におけるRNAiと同様の方式で外来性遺伝因子を認識および発現停止させるために使用される。
化膿レンサ球菌(Streptococcus pyogenes)の遺伝子改変された形態のII型エフェクター系は、ゲノム工学のために、ヒト細胞において機能することが示された。この系では、Cas9タンパク質は、合成によって再構成された「ガイドRNA」(「gRNA」、また、本明細書ではキメラ一本鎖ガイドRNA(「sgRNA」)と互換的に使用され、一般に、RNase III およびcrRNAプロセシングの必要性を不要にするcrRNA−tracrRNA融合体である)によって、ゲノム上の標的部位に誘導された。本明細書で提供するのは、ゲノム編集、および遺伝性疾患の治療における使用のためのCRISPR/Cas9に基づく編集システムである。CRISPR/Cas9に基づく編集システムは、遺伝性疾患、老化、組織再生、または創傷治癒に関与する遺伝子を含めた、あらゆる遺伝子を標的にするように設計することができる。CRISPR/Cas9に基づく遺伝子編集システムは、Cas9タンパク質またはCas9融合タンパク質と、少なくとも1つのgRNAとを含むことができる。特定の実施態様では、システムは2種のgRNA分子を含む。Cas9融合タンパク質は、例えば、トランス活性化ドメインなどの、Cas9にとって内在性であるものとは異なる活性を有するドメインを含むことができる。
CRISPR/Cas9に基づく遺伝子編集システムは、Cas9タンパク質またはCas9融合タンパク質を含むことができる。Cas9タンパク質は核酸を開裂するエンドヌクレアーゼであり、CRISPR遺伝子座によりコードされ、且つII型CRISPRシステムに関与する。Cas9タンパク質は、以下が挙げられるがこれらに限定されないあらゆる細菌または古細菌の種に由来し得る:化膿レンサ球菌(Streptococcus pyogenes)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)(S.aureus)、アシドボラックス・アヴェナエ(Acidovorax avenae)、アクチノバチルス・プルロニューモニア(Actinobacillus pleuropneumoniae)、アクチノバチルス・サクシノゲネス(Actinobacillus succinogenes)、アクチノバチルス・スイス(Actinobacillus suis)、アクチノマイセス種(Actinomyces sp.)、シクリフィルス・デニトリフィカンス(cycliphilus denitrificans)、アミノモナス・パウシボランス(Aminomonas paucivorans)、バチルス・セレウス(Bacillus cereus)、バチルス・スミシイ(Bacillus smithii)、バチルス・チューリンギエンシス(Bacillus thuringiensis)、バクテロイデス種(Bacteroides sp.)、ブラストピレルラ・マリナ(Blastopirellula marina)、ブラディリゾビウム種(Bradyrhizobium sp.)、ブレビバチルス・ラテロスポラス(Brevibacillus laterosporus)、カンピロバクター・コリ(Campylobacter coli)、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)、カンピロバクター・ラリ(Campylobacter lari)、カンジダツス・プニセイスピリルム(Candidatus Puniceispirillum)、クロストリジウム・セルロリチカム(Clostridium cellulolyticum)、クロストリジウム・パーフリンゲン(Clostridium perfringens)、コリネバクテリウム・アクコレン(Corynebacterium accolens)、コリネバクテリウム・ジフテリア(Corynebacterium diphtheria)、コリネバクテリウム・マトルコチイ(Corynebacterium matruchotii)、ディノロセオバクター・シバエ(Dinoroseobacter shibae)、ユウバクテリウム・ドリクム(Eubacterium dolichum)、ガンマプロテオバクテリア(gamma proteobacterium)、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクス(Gluconacetobacter diazotrophicus)、ヘモフィルス・パラインフルエンザエ(Haemophilus parainfluenzae)、ヘモフィルス・スプトラム(Haemophilus sputorum)、ヘリコバクター・カナデンシス(Helicobacter canadensis)、ヘリコバクター・シナエディ(Helicobacter cinaedi)、ヘリコバクター・ムステラエ(Helicobacter mustelae)、イリオバクター・ポリトロパス(Ilyobacter polytropus)、キンゲラ・キンガエ(Kingella kingae)、ラクトバチルス・クリスパータス(Lactobacillus crispatus)、リステリア・イバノビイ(Listeria ivanovii)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、リステリアセアエ・バクテリア(Listeriaceae bacterium)、メチロシスチス種(Methylocystis sp.)、メチロシナス・トリコスポリウム(Methylosinus trichosporium)、モビルンカス・ムリエリス(Mobiluncus mulieris)、ナイセリア・バシリフォルミス(Neisseria bacilliformis)、ナイセリア・シネレア(Neisseria cinerea)、ナイセリア・フラベッセンス(Neisseria flavescens)、ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)、ナイセリア種(Neisseria sp.)、ナイセリア・ワズワーシイ(Neisseria wadsworthii)、ニトロソモナス種(Nitrosomonas sp.)、パルビバクラム・ラバメンティボランス(Parvibaculum lavamentivorans)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、ファスコラークトバクテリウム・スクシナテュテンス(Phascolarctobacterium succinatutens)、ラルストニア・シジジイ(Ralstonia syzygii)、ロドシュードモナス・パルストリス(Rhodopseudomonas palustris)、ロドブラム種(Rhodovulum sp.)、シモンシエラ・ムエレ(Simonsiella muelleri)、スフィンゴモナス種(Sphingomonas sp.)、スポロラクトバチルス・ビネア(Sporolactobacillus vineae)、スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス(Staphylococcus lugdunensis)、ストレプトコッカス種(Streptococcus sp.)、サブドリグラヌルム種(Subdoligranulum sp.)、チストレラ・モビリス(Tistrella mobilis)、トレポネーマ種(Treponema sp.)またはベルミネフロバクター・エイセニア(Verminephrobacter eiseniae)。特定の実施態様では、Cas9分子は化膿レンサ球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9分子(本明細書では「SpCas9」とも称される)である。特定の実施態様では、Cas9分子は黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)Cas9分子(本明細書では「SaCas9」とも称される)である。
第2のポリペプチドドメインは転写活性化活性(即ちトランス活性化ドメイン)を有することができる。例えば、gRNAの組み合わせを介してiCas9とトランス活性化ドメインとの融合タンパク質の標的を哺乳類のプロモーターに定めることにより、内因性の哺乳類遺伝子(例えばヒト遺伝子)の遺伝子発現を活性化することができる。このトランス活性化ドメインは、1つのVP16タンパク質、複数のVP16タンパク質(例えばVP48ドメインもしくはVP64ドメイン)、またはNFカッパB転写活性化因子活性のp65ドメインを含むことができる。例えば、融合タンパク質はiCas9−VP64であることができる。
第2のポリペプチドドメインは転写抑制活性を有することができる。この第2のポリペプチドドメインは、Kruppel関連ボックス活性(例えばKRABドメイン)、ERF抑制因子ドメイン活性、Mxil抑制因子ドメイン活性、SID4X抑制因子ドメイン活性、Mad−SID抑制因子ドメイン活性またはTATAボックス結合タンパク質活性を有することができる。例えば、融合タンパク質はdCas9−KRABであることができる。
第2のポリペプチドドメインは転写終結因子活性を有することができる。この第2のポリペプチドは、真核性終結因子1(ERF1)活性または真核性終結因子3(EFR3)活性を有することができる。
第2のポリペプチドドメインはヒストン修飾活性を有することができる。この第2のポリペプチドドメインは、ヒストンデアセチラーゼ活性、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性、ヒストンデメチラーゼ活性またはヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を有することができる。ヒストンアセチルトランスフェラーゼは、p300もしくはCREB結合タンパク質(CBP)タンパク質またはその断片であることができる。例えば、融合タンパク質はdCas9−p300であることができる。
この第2のポリペプチドドメインは、Cas9タンパク質のヌクレアーゼ活性とは異なるヌクレアーゼ活性を有することができる。ヌクレアーゼ、またはヌクレアーゼ活性を有するタンパク質は、核酸のヌクレオチドサブユニット間のホスホジエステル結合を切断することが可能な酵素である。ヌクレアーゼは通常、エンドヌクレアーゼとエキソヌクレアーゼにさらに分類されるが、いくつかの酵素は、どちらのカテゴリーにも属することができる。よく知られているヌクレアーゼは、デオキシリボヌクレアーゼおよびリボヌクレアーゼである。
第2のポリペプチドドメインは核酸会合活性を有し得る、または核酸結合タンパク質−DNA結合ドメイン(DBD)は、二本鎖DNAもしくは一本鎖DNAを認識する少なくとも1つのモチーフを含む独立に折り畳まれたタンパク質ドメインである。DBDは、特定のDNA配列(認識配列)を認識し得る、またはDNAに対して一般的な親和性を有し得る。以下からなる群から選択される核酸会合領域:ヘリックス−ターン−ヘリックス領域、ロイシンジッパー領域、翼状ヘリックス領域、翼状ヘリックス−ターン−ヘリックス領域、ヘリックス−ループ−ヘリックス領域、免疫グロブリンフォールド、B3ドメイン、ジンクフィンガー、HMG−ボックス、Wor3ドメイン、TALエフェクターDNA結合ドメイン。
第2のポリペプチドドメインはメチラーゼ活性を有し得、このメチラーゼ活性は、メチル基のDNA、RNA、タンパク質、小分子、シトシンまたはアデニンへの転移に関与する。この第2のポリペプチドドメインはDNAメチルトランスフェラーゼを含むことができる。
第2のポリペプチドドメインはデメチラーゼ活性を有することができる。この第2のポリペプチドドメインは、核酸、タンパク質(特にヒストン)および他の分子からメチル(CH3−)基を除去する酵素を含むことができる。あるいは、この第2のポリペプチドは、DNAを脱メチル化するための機序において、メチル基をヒドロキシメチルシトシンに変換することができる。この第2のポリペプチドはこの反応を触媒することができる。例えば、この反応を触媒する第2のポリペプチドはTet1であることができる。
CRISPR/Cas9に基づく遺伝子編集システムは、少なくとも1種のgRNA分子(例えば2種のgRNA分子)を含む。このgRNAにより、CRISPR/Cas9に基づく遺伝子編集システムが標的とされる。このgRNAは、以下の2つの非コードRNA:crRNAおよびtracrRNAの融合である。このsgRNAは、任意の所望のDNA標的との相補的塩基対形成により標的化特異性を付与する20bpのプロトスペーサーをコードする配列を交換することにより、この所望のDNA配列を標的とすることができる。gRNAは、II型エフェクターシステムに関与する、天然に存在するcrRNA:tracrRNA二本鎖を模倣する。この二本鎖(例えば、42個のヌクレオチドのcrRNAおよび75個のヌクレオチドのtracrRNAを含み得る)は、Cas9が標的核酸を切断するためのガイドとして作用する。「標的領域」、「標的配列」または「プロトスペーサー」は、本明細書で互換的に使用される場合、CRISPR/Cas9に基づく遺伝子編集システムが標的とする標的遺伝子(例えばジストロフィン遺伝子)の領域を指す。CRISPR/Cas9に基づく遺伝子編集システムは少なくとも1種のgRNAを含み得、これらのgRNAは異なるDNA配列を標的とする。これらの標的DNA配列は重複することができる。この標的配列またはプロトスペーサーに続いて、このプロトスペーサーの3’末端でPAM配列が存在する。II型システムが異なると、必要とされるPAMも異なる。例えば、化膿レンサ球菌(Streptococcus pyogenes)II型システムは「NGG」配列を使用し、「N」はあらゆるヌクレオチドであることができる。いくつかの実施態様では、PAM配列は「NGG」であり得、「N」はあらゆるヌクレオチドであり得る。いくつかの実施態様では、PAM配列はNNGRRT(配列番号24)であってもよいしNNGRRV(配列番号25)であってもよい。
本発明はまた、そのような遺伝子コンストラクトを含むDNAターゲティング組成物も対象とする。このDNAターゲティング組成物は、上記で説明したようにジストロフィン遺伝子(例えばヒトジストロフィン遺伝子)を標的とする少なくとも1種のgRNA分子(例えば2種のgRNA分子)を含む。この少なくとも1種のgRNA分子は、標的領域に結合して認識することができる。この標的領域を、可能なアウトオブフレーム終止コドンのすぐ上流で選択し得、その結果、修復プロセス中の挿入または欠失がフレーム変換によってジストロフィン読み枠を回復させる。標的領域はまた、スプライス受容部位またはスプライス供与部位であることもでき、その結果、修復プロセス中の挿入または欠失が、スプライス部位の破壊およびエクソンの排除によりスプライシングを破壊しジストロフィン読み枠を回復させる。標的領域はまた、異所性終止コドンであることもでき、その結果、修復プロセス中の挿入または欠失が、この終止コドンを除去することによりまたは破壊することによりジストロフィン読み枠を回復させる。
(xi)配列番号11に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第1のgRNA分子、および配列番号18に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第2のgRNA分子;ならびに(xii)配列番号41に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第1のgRNA分子、および配列番号42に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第2のgRNA分子からなる群から選択される。いくつかの実施態様では、DNAターゲティング組成物は、配列番号37に記載のヌクレオチド配列および/または配列番号38に記載のヌクレオチド配列を含む。
本発明は、対象の骨格筋中でのまたは心筋中での標的遺伝子のゲノム編集用の遺伝子コンストラクト(例えばベクター)またはその組成物を対象とする。この組成物は、改変AAVベクターと、CRISPR/Cas9に基づく遺伝子編集システム(例えばgRNA分子およびCas9分子)をコードするヌクレオチド配列とを含む。この組成物は、活性型のCRISPR/Cas9に基づく遺伝子編集システムを骨格筋または心筋に送達する。本開示の遺伝子コンストラクト(例えばベクター)を、遺伝性疾患および/または他の骨格筋もしくは心筋の状態(例えばDMD)に関与するジストロフィン遺伝子中での変異の影響の修正または低減で使用することができる。この組成物は、ドナーDNAまたは導入遺伝子をさらに含むことができる。この組成物を、ゲノム編集、ゲノム操作、ならびに遺伝性疾患および/または他の骨格筋もしくは心筋の状態に関与する遺伝子中での変異の影響の修正また低減で使用することができる。
本明細書では、ジストロフィン遺伝子に特異的なCRISPR/Cas9に基づく遺伝子編集システムが開示されている。このCRISPR/Cas9に基づく遺伝子編集システムは、Cas9と、ジストロフィン遺伝子を標的とするための少なくとも1種のgRNAとを含むことができる。このCRISPR/Cas9に基づく遺伝子編集システムは、標的領域に結合して認識することができる。この標的領域を、可能なアウトオブフレーム終止コドンのすぐ上流で選択し得、その結果、修復プロセス中の挿入または欠失がフレーム変換によってジストロフィン読み枠を回復させる。標的領域または、スプライス受容部位またはスプライス供与部位であることもでき、その結果、修復プロセス中の挿入または欠失が、スプライス部位の破壊およびエクソンの排除により、スプライシングを破壊しジストロフィン読み枠を回復させる。標的領域はまた、異所性終止コドンであることもでき、その結果、修復プロセス中の挿入または欠失が、この終止コドンを除去することによりまたは破壊することによりジストロフィン読み枠を回復させる。
この組成物はウイルス送達システムも含むことができる。特定の実施態様では、このベクターはアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターである。このAAVベクターは、ヒトおよびいくつかの他の霊長類種に感染するパルボウイルス(Parvoviridae)科のディペンドウイルス(Dependovirus)属に属する小型ウイルスである。AAVベクターを使用して、様々なコンストラクト構造を使用するCRISPR/Cas9に基づく遺伝子編集システムを送達することができる。例えば、AAVベクターは、別々ベクター上のまたは同一のベクター上のCas9およびgRNA発現カセットを送達することができる。あるいは、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)または髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)等の種に由来する小さいCas9タンパク質を使用する場合、Cas9と最大2つのgRNA発現カセットとの両方を、4.7kbのパッケージング限度内で単一のAAVベクター中で組み合わせることができる。
本開示は、対象の骨格筋中でのまたは心筋中での遺伝子編集の方法を対象とする。この方法は、上記で説明した骨格筋中でのまたは心筋中での遺伝子編集用組成物を対象の骨格筋または心筋に投与することを含む。このゲノム編集は、変異遺伝子を修正することまたは導入遺伝子を挿入することを含むことができる。変異遺伝子を修正することは、この変異遺伝子を欠失させること、再編集することまたは置き換えることを含むことができる。変異異遺伝子を修正することは、ヌクレアーゼ介在性のNHEJまたはHDRを含むことができる。
本開示の主題は、細胞中で変異遺伝子(例えば変異ジストロフィン遺伝子、例えば変異ヒトジストロフィン遺伝子)を修正し、遺伝性疾患(例えばDMD)に罹患している対象を処置する方法を提供する。この方法は、上記で説明した本開示の遺伝子コンストラクト(例えばベクター)またはこの遺伝子コンストラクトを含む組成物を細胞または対象に投与すること含むことができる。この方法は、上記で説明した骨格筋中でのまたは心筋中での遺伝子編集用の本開示の遺伝子コンストラクト(例えばベクター)またはこの遺伝子コンストラクトを含む組成物を対象の骨格筋または心筋に投与することを含むことができる。CRISPR/Cas9に基づく遺伝子編集システムを骨格筋または心筋に送達するための本開示の遺伝子コンストラクト(例えばベクター)またはこの遺伝子コンストラクトを含む組成物の使用により、修復鋳型またはドナーDNA(これらは、遺伝子全体またはこの変異を含む領域を置き換えることができる)と共に、完全に機能するまたは部分的に機能するタンパク質の発現を回復させることができる。CRISPR/Cas9に基づく遺伝子編集システムを使用して、標的とされるゲノム遺伝子座で部位特異的な二本鎖切断を導入することができる。部位特異的二本鎖切断は、CRISPR/Cas9に基づく遺伝子編集システムが標的DNA配列に結合し、それにより標的DNAの開裂が可能になる場合に生じる。このDNA開裂は天然のDNA修復機構を刺激し得、以下の2つの可能な修復経路のうちの1つをもたらす:相同組換え修復(HDR)経路または非相同末端結合(NHEJ)経路。
内因性の変異遺伝子からのタンパク質発現の回復は、鋳型なしのNHEJ介在性のDNA修復によるものであることができる。標的遺伝子RNAを標的とする一過性の方法とは対照的に、過渡的に発現されたCRISPR/Cas9に基づく遺伝子編集システムによるゲノム中の標的遺伝子読み枠の修正により、それぞれ改変された細胞およびその後代の全てによって、永久に回復された標的遺伝子発現をもたらすことができる。特定の実施態様では、NHEJはヌクレアーゼ介在性のNHEJであり、このヌクレアーゼ介在性のNHEJは、特定の実施態様では、Cas9分子により開始されて二本鎖DNAを切断するNHEJを指す。この方法は、骨格筋中でのまたは心筋中での遺伝子編集のために、本開示の遺伝子コンストラクト(例えばベクター)またはこの遺伝子コンストラクトを含む組成物を対象の骨格筋または心筋に投与することを含む。
内在性の変異した遺伝子からのタンパク質発現の修復は、相同組換え修復を含むことができる。上に記載した通りの方法は、細胞にドナー鋳型を投与することをさらに含む。ドナー鋳型は、完全に機能性または部分的に機能性のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むことができる。例えば、ドナー鋳型は、小型化されたジストロフィンコンストラクト(ミニジストロフィン(「minidys」)と呼ばれる)、変異ジストロフィン遺伝子を修復するための完全に機能性のジストロフィンコンストラクト、または相同組換え修復後に変異ジストロフィン遺伝子の修復をもたらすジストロフィン遺伝子の断片を含むことができる。
本開示はまた、修復鋳型またはドナーDNA(これらは、遺伝子全体、または変異を含有する領域を置き換えることができる)を用いる、完全に機能性または部分的に機能性のタンパク質の発現を修復するための、CRISPR/Cas9に基づく遺伝子編集システムを用いるゲノム編集を対象とする。CRISPR/Cas9に基づく遺伝子編集システムは、標的とされるゲノム遺伝子座に部位特異的二本鎖切断を導入するために使用することができる。部位特異的二本鎖切断は、CRISPR/Cas9に基づく遺伝子編集システムが、gRNAを使用して標的DNA配列に結合し、それによって標的DNAの切断が可能になる場合にもたらされる。CRISPR/Cas9に基づく遺伝子編集システムは、その高速の成功裡かつ効率的な遺伝子改変のおかげで、ゲノム編集の進歩という利点を有する。このDNA切断は、天然のDNA修復機構を刺激し、可能性のある2つの修復経路:相同組換え修復(HDR)または非相同末端結合(NHEJ)経路のうちの1つをもたらすことができる。例えば、ジストロフィン遺伝子に誘導されるCRISPR/Cas9に基づく遺伝子編集システムは、配列番号1〜19、41、42のいずれか1つの核酸配列またはその相補体を有するgRNAを含むことができる。
本開示は、必要とする対象を処置する方法を対象とする。この方法は、上記で説明した本開示の遺伝子コンストラクト(例えばベクター)またはこの遺伝子コンストラクトを含む組成物を対象の組織に投与することを含む。特定の実施態様では、この方法は、上記で説明した本開示の遺伝子コンストラクト(例えばベクター)またはこの遺伝子コンストラクトを含む組成物を対象の骨格筋または心筋に投与することを含むことができる。特定の実施態様では、この方法は、上記で説明した本開示の遺伝子コンストラクト(例えばベクター)またはこの遺伝子コンストラクトを含む組成物を対象の静脈に投与することを含むことができる。特定の実施態様では、この対象は、変性または衰弱または遺伝性疾患を引き起こす骨格筋または心筋の状態に罹患している。例えば、この対象は、上記で説明したデュシェンヌ型筋ジストロフィーに罹患している。
上記で説明した方法を使用して、ジストロフィン遺伝子を修正して前記変異ジストロフィン遺伝子の完全に機能するまたは部分的に機能するタンパク質発現を回復させることができる。いくつかの態様および実施態様では、本開示は、患者におけるDMDの影響(例えば臨床症状/適応症)を低減する方法を提供する。いくつかの態様および実施態様では、本開示は、患者においてDMDを処置する方法を提供する。いくつかの態様および実施態様では、本開示は、患者においてDMDを予防する方法を提供する。いくつかの態様および実施態様では、本開示は、患者においてDMDのさらなる悪化を予防する方法を提供する。
本開示は、エクソン52が欠失しているヒトジストロフィン遺伝子を有する遺伝子導入齧歯動物胚を作成する方法を対象とする。この方法は、本gRNAを齧歯動物胚に投与し、それによりヒトジストロフィン遺伝子のエクソン52を欠失させること、およびヒトジストロフィン遺伝子のエクソン52が欠失している遺伝子導入齧歯動物胚を選択することであって、この齧歯動物胚は正常なヒトジストロフィン遺伝子を含む、選択することを含む。いくつかの実施態様では、この齧歯動物胚はマウス胚である。いくつかの実施態様では、この遺伝子導入齧歯動物胚は、ヘテロ接合性hDMDまたはヘテロ接合性hDMD−Δ52である。いくつかの実施態様では、配列番号41に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第1のgRNA分子と、配列番号42に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第2のgRNA分子とをこの齧歯動物胚に投与して、ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン52を欠失させる。いくつかの実施態様では、この方法は、配列番号27に記載のアミノ酸配列を含むCasタンパク質をこの齧歯動物胚に投与することをさらに含む。本開示は、この方法により作成された遺伝子導入齧歯動物胚を対象とする。本開示はまた、この遺伝子導入齧歯動物胚から作成された遺伝子導入齧歯動物も対象とする。
上記で説明した組成物は、本明細書で開示したCRISPR/Cas9に基づく遺伝子編集システムをコードする遺伝子コンストラクトを含むことができる。この遺伝子コンストラクト(例えばプラスミド)は、CRISPR/Cas9に基づく遺伝子編集システム(例えばCas9タンパク質およびCas9融合タンパク質および/またはgRNAのうちの少なくとも1つ)をコードする核酸を含むことができる。上記で説明した組成物は、改変AAVベクターをコードする遺伝子コンストラクトと、本明細書で開示したCRISPR/Cas9に基づく遺伝子編集システムをコードする核酸配列とを含むことができる。この遺伝子コンストラクト(例えばプラスミド)は、このCRISPR/Cas9に基づく遺伝子編集システムをコードする核酸を含むことができる。上記で説明した組成物は、本明細書で開示した改変レンチウイルスベクターをコードする遺伝子コンストラクトを含むことができる。
本開示の主題は、上記で説明した遺伝子コンストラクトを含む組成物を提供する。本発明に係る医薬組成物は、使用される投与様式に従って製剤化され得る。医薬組成物が注射用医薬組成物である場合、この医薬組成物は無菌であり、パイロジェンフリーであり且つ粒子状物質フリーである。等張性製剤が好ましくは使用される。一般に、等張性のための添加剤として、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトールおよびラクトースを挙げることができる。場合によって、等張性溶液(例えばリン酸緩衝生理食塩水)が好ましい。安定剤としてゼラチンおよびアルブミンが挙げられる。いくつかの実施態様では、この製剤に血管収縮剤が添加される。
本明細書で提供されるのは、本開示の遺伝子コンストラクト(例えばベクター)またはその組成物を細胞に送達する方法である。この組成物の送達は、この細胞中で発現され且つこの細胞の表面に送達される核酸分子としてのこの組成物の遺伝子導入または電気穿孔であることができる。この核酸分子を、BioRad Gene Pulser XcellデバイスまたはAmaxa Nucleofector IIbデバイスを使用して電気穿孔することができる。BioRad電気穿孔溶液、Sigmaリン酸緩衝生理食塩水 製品番号D8537(PBS)、Invitrogen OptiMEM I(OM)またはAmaxa Nucleofector溶液V(N.V.)等のいくつかの異なる緩衝液を使用することができる。遺伝子導入は、Lipofectamine 2000等の遺伝子導入試薬を含むことができる。
本開示の遺伝子コンストラクト(例えばベクター)またはこの遺伝子コンストラクトを含む組成物を、様々な経路(例えば、経口、非経口、舌下、経皮、直腸内、経粘膜、局所、吸入を介して、頬側投与を介して、胸膜内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、鼻腔内、くも膜下腔内、および関節内、またはこれらの組み合わせ)により対象に投与することができる。特定の実施態様では、本開示の遺伝子コンストラクト(例えばベクター)または組成物を、対象(例えばDMDを罹患している対象)に筋肉内投与する、静脈内投与する、またはこれらの組み合わせで投与する。獣医学的使用の場合、本開示の遺伝子コンストラクト(例えばベクター)または組成物を、通常の獣医学診療に従って、適切に許容される製剤として投与することができる。獣医師は、ある特定の動物にとって最も適している投薬レジメンおよび投与経路を容易に決定することができる。この組成物を、従来のシリンジ、無針注射装置、「微粒子銃(microprojectile bombardment gone gun)」、または他の物理的方法(例えば電気穿孔(「EP」)、「水力学的方法」または超音波)により投与することができる。
これらの送達方法および/または送達の経路のいずれかを無数の細胞型(例えば、DMDの細胞に基づく治療用に現在研究中の細胞型)と共に利用することができ、この細胞型として以下が挙げられるがこれらに限定されない:不死化筋芽細胞、例えば野生型およびDMD患者由来の株、例えばΔ48−50 DMD、DMD6594(del48−50)、DMD8036(del48−50)、C25C14およびDMD−7796細胞株、原発性DMD皮膚線維芽細胞、誘導された多能性幹細胞、骨髄由来前駆細胞、骨格筋前駆細胞、DMD患者由来のヒト骨格筋芽細胞、CD133+細胞、中胚葉性血管芽細胞、心筋細胞、肝細胞、軟骨細胞、間葉系前駆細胞、造血性幹細胞、平滑筋細胞、およびMyoD形質導入細胞もしくはPax7形質導入細胞、または他の筋原性前駆細胞。ヒト筋原性細胞の不死化を使用して、遺伝的に修正された筋原性細胞のクローンを誘導することができる。細胞をエクスビボで改変して、遺伝的に修正されたジストロフィン遺伝子を含み且つゲノムのタンパク質コード領域中に他のヌクレアーゼ導入変異がない不死化DMD筋芽細胞のクローン集団を単離して増殖させることができる。あるいは、非ウイルスまたは非組込みウイルスの遺伝子導入によるまたは精製タンパク質および細胞浸透モチーフを含むgRNAの直接送達によるCRISPR/Cas9に基づくシステムのインビボでの一時的な送達により、外因性DNA組込みのリスクが最低限なまたはないインサイチュでの高度に特異的な修正が可能になり得る。
本明細書で提供されるのは、変異ジストロフィン遺伝子を修正するのに使用され得るキットである。このキットは、変異ジストロフィン遺伝子の修正用のgRNAと、CRISPR/Cas9に基づく遺伝子編集システムを使用するための説明書とを少なくとも含む。また、本明細書で提供されるのは、骨格筋中でのまたは心筋中でのジストロフィン遺伝子のゲノム編集に使用され得るキットでもある。このキットは、上記で説明した骨格筋中でのまたは心筋中でのゲノム編集用の遺伝子コンストラクト(例えばベクター)またはこの遺伝子コンストラクトを含む組成物と、前記組成物を使用するための説明書とを含む。
本明細書で説明された本開示の方法の他の適切な改変および適応が容易に適用可能であり且つ認識可能であり、ならびに本開示または本明細書で開示された態様および実施態様の範囲から逸脱することなく適切な等価物を使用して行なわれ得ることが当業者に容易に明らかであるだろう。これまで本開示を詳細に説明したが、以下の実施例を参照することにより本開示がより明確に理解されるだろう。この実施例は、本開示のいくつかの態様および実施態様を説明することのみを単に意図しており、本開示の範囲を限定するとみなすべきではない。本明細書で言及される全ての学術誌参考文献、米国特許および刊行物の開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ヒトジストロフィン遺伝子のターゲティング
CRISPR/Cas9に基づく遺伝子編集システムを使用して、ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン51を標的としてこのエクソン51を欠失させた。黄色ブドウ球菌(S.aureus)Cas9(SaCas9)(化膿レンサ球菌(S.pyogenes)Cas9と比べて約1kb小さい)をアデノ随伴ウイルス(AAV)と共に使用して、CRISPR/Cas9に基づく遺伝子編集システムを送達した。黄色ブドウ球菌(S.aureus)Cas9分子をコードするコドン最適化核酸配列を、配列番号43または配列番号44に記載する。図3は、2種のウイルスベクターによるSaCas9および2種のgRNAの筋肉組織へのAAVに基づくインビボ同時送達の概略を示す。各ベクターは、それぞれCMVプロモーターおよびhU6プロモーターにより駆動されるSaCas9および1種のgRNAのコピーを有した(PT366−179(配列番号39)およびPT366−183(配列番号40))。
Δ52/mdxマウスの作成
図17はΔ52/mdxマウスの設計を示す。hDMD/mdxマウスをLeiden Universityから得て、DMDの関連モデル(エクソン52が除去されており、この欠失により読み枠外シフトおよびDMD遺伝子型が生じている)を作成するために操作した。hDMD/mdxマウスはmdxバックグランウド中の5番染色体上に完全長の野生型ヒトジストロフィン遺伝子を含み、その結果、マウスジストロフィンは発現されない。
エクソン51の除去によるジストロフィンの回復
エクソン51の除去により、Δ52/mdxマウスにおいてベッカー型筋ジストロフィー(BMD)様の遺伝子型を作成することができ、理論的にはジストロフィン発現を回復させることができる。Δ52/mdxマウスを使用して、本開示のCRISPR/Cas9に基づく遺伝子編集システムを使用したエクソン51の除去によるジストロフィン発現の回復を実証した。図32は、イントロン領域中でエクソン51の上流および下流をgRNAが標的とすることによりエクソン51をスキップさせる、SaCas9およびgRNAを使用した修正戦略を示す。
第1項.配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号41、配列番号42に記載のヌクレオチド配列またはその相補体を含むターゲティングドメインを含むガイドRNA(gRNA)。
AAAAGGCCGGCGGCCACGAAAAAGGCCGGCCAGGCAAAAAAGAAAAAG
Claims (77)
- 配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号41、配列番号42に記載のヌクレオチド配列またはその相補体を含むターゲティングドメインを含むガイドRNA(gRNA)。
- 第1のgRNAおよび第2のgRNAを含むDNAターゲティング組成物であって、前記第1のgRNA分子および前記第2のgRNA分子は、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号41、配列番号42に記載のヌクレオチド配列またはその相補体を含むターゲティングドメインを含み、前記第1のgRNA分子および前記第2のgRNA分子は異なるターゲティングドメインを含む、DNAターゲティング組成物。
- 前記第1のgRNA分子は配列番号1、配列番号3、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15または配列番号41であり、前記第2のgRNA分子は配列番号2、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19または配列番号42である、請求項2に記載のDNAターゲティング組成物。
- 前記第1のgRNA分子は、配列番号1、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14および配列番号15からなる群から選択され、前記第2のgRNA分子は、配列番号2、配列番号4、配列番号16、配列番号17、配列番号18および配列番号19からなる群から選択される、請求項2に記載のDNAターゲティング組成物。
- 前記第1のgRNA分子および前記第2のgRNA分子は、
(i)配列番号1に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第1のgRNA分子、および配列番号2に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第2のgRNA分子;
(ii)配列番号11に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第1のgRNA分子、および配列番号4に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第2のgRNA分子;
(iii)配列番号15に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第1のgRNA分子、および配列番号19に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第2のgRNA分子;
(iv)配列番号15に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第1のgRNA分子、および配列番号18に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第2のgRNA分子;
(v)配列番号15に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第1のgRNA分子、および配列番号4に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第2のgRNA分子;
(vi)配列番号14に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第1のgRNA分子、および配列番号19に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第2のgRNA分子;
(vii)配列番号14に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第1のgRNA分子、および配列番号18に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第2のgRNA分子;
(viii)配列番号14に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第1のgRNA分子、および配列番号4に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第2のgRNA分子;
(ix)配列番号11に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第1のgRNA分子、および配列番号19に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第2のgRNA分子;
(x)配列番号14に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第1のgRNA分子、および配列番号15に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第2のgRNA分子;
(xi)配列番号11に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第1のgRNA分子、および配列番号18に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第2のgRNA分子;ならびに
(xii)配列番号41に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第1のgRNA分子、および配列番号42に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第2のgRNA分子
からなる群から選択される、請求項2に記載のDNAターゲティング組成物。 - クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート関連(Cas)タンパク質をさらに含む、請求項2に記載のDNAターゲティング組成物。
- 前記Casタンパク質は、NNGRRT(配列番号24)またはNNGRRV(配列番号25)のいずれかのプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)を認識するCas9分子を含む、請求項6に記載のDNAターゲティング組成物。
- 前記Casタンパク質は、配列番号45のアミノ酸配列を有する黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)Cas9分子を含む、請求項6に記載のDNAターゲティング組成物。
- 前記DNAターゲティング組成物は、配列番号83のヌクレオチド配列、配列番号84のヌクレオチド配列、配列番号37のヌクレオチド配列および/または配列番号38のヌクレオチド配列を含む、請求項2に記載のDNAターゲティング組成物。
- 請求項1に記載のgRNA分子を含む単離ポリヌクレオチド。
- 請求項1に記載のgRNAを含むベクター。
- 請求項6に記載のDNAターゲティング組成物を含むベクター。
- (a)第1のガイドRNA(gRNA)分子、
(b)第2のgRNA分子、および
(c)NNGRRT(配列番号24)またはNNGRRV(配列番号25)のいずれかのプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)を認識する少なくとも1種のCas9分子
をコードするベクターであって、
前記第1のgRNA分子および前記第2のgRNA分子は、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号41、配列番号42に記載のヌクレオチド配列またはその相補体を含むターゲティングドメインを含み、前記第1のgRNA分子および前記第2のgRNA分子は異なるターゲティングドメインを含む、ベクター。 - 前記ベクターは、ヒトDMD遺伝子のエクソン51に隣接する第1および第2のイントロン中で第1および第2の二本鎖切断を形成するように構成されている、請求項13に記載のベクター。
- 前記第1のgRNA分子は、配列番号1、配列番号3、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15または配列番号41であり、前記第2のgRNA分子は、配列番号2、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19または配列番号42である、請求項13に記載のベクター。
- 前記第1のgRNA分子は、配列番号1、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14および配列番号15からなる群から選択され、前記第2のgRNA分子は、配列番号2、配列番号4、配列番号16、配列番号17、配列番号18および配列番号19からなる群から選択される、請求項13に記載のベクター。
- 前記第1のgRNA分子および前記第2のgRNA分子は、
(i)配列番号1に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第1のgRNA分子、および配列番号2に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第2のgRNA分子;
(ii)配列番号11に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第1のgRNA分子、および配列番号4に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第2のgRNA分子;
(iii)配列番号15に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第1のgRNA分子、および配列番号19に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第2のgRNA分子;
(iv)配列番号15に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第1のgRNA分子、および配列番号18に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第2のgRNA分子;
(v)配列番号15に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第1のgRNA分子、および配列番号4に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第2のgRNA分子;
(vi)配列番号14に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第1のgRNA分子、および配列番号19に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第2のgRNA分子;
(vii)配列番号14に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第1のgRNA分子、および配列番号18に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第2のgRNA分子;
(viii)配列番号14に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第1のgRNA分子、および配列番号4に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第2のgRNA分子;
(ix)配列番号11に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第1のgRNA分子、および配列番号19に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第2のgRNA分子;
(x)配列番号14に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第1のgRNA分子、および配列番号15に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第2のgRNA分子;ならびに
(xi)配列番号11に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第1のgRNA分子、および配列番号18に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第2のgRNA分子
からなる群から選択される、請求項13に記載のベクター。 - 前記ベクターはウイルスベクターである、請求項11に記載のベクター。
- 前記ベクターはアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターである、請求項18に記載のベクター。
- 前記AAVベクターはAAV8ベクターまたはAAV9ベクターである、請求項19に記載のベクター。
- 前記ベクターは、前記第1のgRNA分子、前記第2のgRNA分子および/または前記Cas9分子をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された組織特異的プロモーターを含む、請求項11に記載のベクター。
- 前記組織特異的プロモーターは筋肉特異的プロモーターである、請求項21に記載のベクター。
- 請求項1に記載のgRNAを含む細胞。
- 請求項1に記載のgRNAを含むキット。
- 細胞中で変異ジストロフィン遺伝子を修正する方法であって、請求項1に記載のgRNAを細胞に投与することを含む方法。
- 対象中で変異ジストロフィン遺伝子をゲノム編集する方法であって、請求項1に記載のgRNAを含むゲノム編集用組成物を前記対象に投与することを含む方法。
- 前記ゲノム編集用組成物を前記対象に筋肉内投与する、静脈内投与する、またはこれらの組み合わせで投与する、請求項26に記載の方法。
- 前記変異ジストロフィン遺伝子を修正することは、ヌクレアーゼ介在性の非相同末端結合を含む、請求項25または26に記載の方法。
- 変異ジストロフィン遺伝子を有する、必要とする対象を処置する方法であって、請求項1に記載のgRNAを前記対象に投与することを含む方法。
- 対象中での変異ジストロフィン遺伝子のゲノム編集用の改変アデノ随伴ウイルスベクターであって、請求項1に記載のgRNAをコードする第1のポリヌクレオチド配列と、NNGRRT(配列番号24)またはNNGRRV(配列番号25)のいずれかのプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)を認識するCas9分子をコードする第2のポリヌクレオチド配列とを含む改変アデノ随伴ウイルスベクター。
- 前記改変アデノ随伴ウイルスベクターは配列番号39または配列番号40に記載のヌクレオチド配列を含む、請求項30に記載の改変アデノ随伴ウイルスベクター。
- ジストロフィン遺伝子におけるエクソン51を含むセグメントの欠失用の組成物であって、
(a)第1のガイドRNA(gRNA)分子をコードするポリヌクレオチド配列と、NNGRRT(配列番号24)またはNNGRRV(配列番号25)のいずれかのプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)を認識する第1のCas9分子をコードするポリヌクレオチド配列とを含む第1のベクター、および
(b)第2のgRNA分子をコードするポリヌクレオチド配列と、NNGRRT(配列番号24)またはNNGRRV(配列番号25)のいずれかのプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)を認識する第2のCas9分子をコードするポリヌクレオチド配列とを含む第2のベクター
を含み、
前記第1および第2のgRNA分子のそれぞれは、19〜24個のヌクレオチドの長さのターゲティングドメインを有し、前記第1のベクターおよび第2のベクターは、それぞれがヒトDMD遺伝子のエクソン51に隣接する第1のイントロン中でおよび第2のイオントロン中で第1および第2の二本鎖切断を形成するように構成され、それにより、前記ジストロフィン遺伝子におけるエクソン51を含むセグメントが欠失される、組成物。 - 前記セグメントは約50個の塩基対〜約2,000個の塩基対の長さを有する、請求項32に記載の組成物。
- 前記セグメントは、約118個の塩基対、約233個の塩基対、約326個の塩基対、約766個の塩基対、約805個の塩基対または約1611個の塩基対の長さを有する、請求項33に記載の組成物。
- 前記第1のCas9分子および前記第2のCas9分子は同一である、請求項32に記載の組成物。
- 前記第1のCas9分子および前記第2のCas9分子は黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)Cas9分子である、請求項35に記載の組成物。
- 前記第1のCas9分子および前記第2のCas9分子は変異黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)Cas9分子である、請求項36に記載の組成物。
- 前記第1のCas9分子および前記第2のCas9分子は異なる、請求項32に記載の組成物。
- 前記第1のCas9分子または前記第2のCas9分子は黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)Cas9分子である、請求項38に記載の組成物。
- 前記第1のCas9分子および/または前記第2のCas9分子は、配列番号45のアミノ酸配列を有するSaCas9分子を含む、請求項32に記載の組成物。
- 前記第1のベクターおよび/または前記第2のベクターはウイルスベクターである、請求項32に記載の組成物。
- 前記第1のベクターおよび/または前記第2のベクターはアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターである、請求項41に記載の組成物。
- 前記AAVベクターはAAV8ベクターまたはAAV9ベクターである、請求項42に記載の組成物。
- 前記ジストロフィン遺伝子はヒトジストロフィン遺伝子である、請求項32に記載の組成物。
- 前記第1のgRNA分子および前記第2のgRNA分子は、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19に記載のヌクレオチド配列またはその相補体を含むターゲティングドメインを含み、前記第1のgRNA分子および前記第2のgRNA分子は異なるターゲティングドメインを含む、請求項32に記載の組成物。
- 前記第1のgRNA分子は配列番号1、配列番号3、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14または配列番号15であり、前記第2のgRNA分子は配列番号2、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号16、配列番号17、配列番号18または配列番号19である、請求項32に記載の組成物。
- 前記第1のgRNA分子は、配列番号1、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14および配列番号15からなる群から選択され、前記第2のgRNA分子は、配列番号2、配列番号4、配列番号16、配列番号17、配列番号18および配列番号19からなる群から選択される、請求項32に記載の組成物。
- 前記第1のgRNA分子および前記第2のgRNA分子は、
(i)配列番号1に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第1のgRNA分子、および配列番号2に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第2のgRNA分子;
(ii)配列番号11に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第1のgRNA分子、および配列番号4に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第2のgRNA分子;
(iii)配列番号15に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第1のgRNA分子、および配列番号19に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第2のgRNA分子;
(iv)配列番号15に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第1のgRNA分子、および配列番号18に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第2のgRNA分子;
(v)配列番号15に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第1のgRNA分子、および配列番号4に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第2のgRNA分子;
(vi)配列番号14に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第1のgRNA分子、および配列番号19に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第2のgRNA分子;
(vii)配列番号14に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第1のgRNA分子、および配列番号18に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第2のgRNA分子;
(viii)配列番号14に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第1のgRNA分子、および配列番号4に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第2のgRNA分子;
(ix)配列番号11に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第1のgRNA分子、および配列番号19に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第2のgRNA分子;
(x)配列番号14に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第1のgRNA分子、および配列番号15に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第2のgRNA分子;ならびに
(xi)配列番号11に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第1のgRNA分子、および配列番号18に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第2のgRNA分子
からなる群から選択される、請求項32に記載の組成物。 - 前記第1のベクターは配列番号39に記載のヌクレオチド配列を含み、前記第2のベクターは配列番号40に記載のヌクレオチド配列を含む、請求項32に記載の組成物。
- 薬物での使用のための請求項32に記載の組成物。
- デュシェンヌ型筋ジストロフィーの処置での使用のための請求項32に記載の組成物。
- 請求項32に記載の組成物を含む細胞。
- 細胞中で変異ジストロフィン遺伝子を修正する方法であって、前記細胞に、
(a)第1のガイドRNA(gRNA)分子をコードするポリヌクレオチド配列と、NNGRRT(配列番号24)またはNNGRRV(配列番号25)のいずれかのプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)を認識する第1のCas9分子をコードするポリヌクレオチド配列とを含む第1のベクター、および
(b)第2のgRNA分子をコードするポリヌクレオチド配列と、NNGRRT(配列番号24)またはNNGRRV(配列番号25)のいずれかのプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)を認識する第2のCas9分子をコードするポリヌクレオチド配列とを含む第2のベクターを投与することを含み、
前記第1のgRNA分子および第2のgRNA分子のそれぞれは、19〜24個のヌクレオチドの長さのターゲティングドメインを有し、前記ベクターは、それぞれがヒトジストロフィン遺伝子のエクソン51に隣接する第1および第2のイントロン中に第1および第2の二本鎖切断を形成するように構成され、それにより、前記ジストロフィン遺伝子においてエクソン51を含むセグメントが欠失される、方法。 - 前記第1のgRNA分子および前記第2のgRNA分子は、
(i)配列番号1に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第1のgRNA分子、および配列番号2に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第2のgRNA分子;
(ii)配列番号11に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第1のgRNA分子、および配列番号4に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第2のgRNA分子;
(iii)配列番号15に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第1のgRNA分子、および配列番号19に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第2のgRNA分子;
(iv)配列番号15に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第1のgRNA分子、および配列番号18に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第2のgRNA分子;
(v)配列番号15に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第1のgRNA分子、および配列番号4に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第2のgRNA分子;
(vi)配列番号14に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第1のgRNA分子、および配列番号19に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第2のgRNA分子;
(vii)配列番号14に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第1のgRNA分子、および配列番号18に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第2のgRNA分子;
(viii)配列番号14に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第1のgRNA分子、および配列番号4に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第2のgRNA分子;
(ix)配列番号11に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第1のgRNA分子、および配列番号19に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第2のgRNA分子;
(x)配列番号14に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第1のgRNA分子、および配列番号15に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第2のgRNA分子;ならびに
(xi)配列番号11に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第1のgRNA分子、および配列番号18に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第2のgRNA分子
からなる群から選択される、請求項53に記載の方法。 - 前記変異ジストロフィン遺伝子は、未成熟終止コドン、破壊された読み枠、異所性スプライス受容部位または異所性スプライス供与部位を含む、請求項53に記載の方法。
- 前記変異ジストロフィン遺伝子は、未成熟終止コドンおよび切り詰め型遺伝子産物をもたらすフレームシフト変異を含む、請求項53に記載の方法。
- 前記変異ジストロフィン遺伝子は、前記読み枠を破壊する1つまたは複数のエクソンの欠失を含む、請求項53に記載の方法。
- 前記変異ジストロフィン遺伝子の修正は、未成熟終止コドンの欠失、破壊された読み枠の修正、またはスプライス受容部位の破壊もしくはスプライス供与配列の破壊によるスプライシングの改変を含む、請求項53に記載の方法。
- 前記変異ジストロフィン遺伝子の修正はエクソン51の欠失を含む、請求項53に記載の方法。
- 前記変異ジストロフィン遺伝子の修正は相同組換え修復を含む、請求項53に記載の方法。
- 前記細胞にドナーDNAを投与することをさらに含む、請求項60に記載の方法。
- 前記変異ジストロフィン遺伝子の修正はヌクレアーゼ介在性の非相同末端結合を含む、請求項53に記載の方法。
- 前記細胞は筋芽細胞である、請求項53に記載の方法。
- 前記細胞はデュシェンヌ型筋ジストロフィーに罹患している対象に由来する、請求項53に記載の方法。
- 前記細胞は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーに罹患しているヒト対象由来の筋芽細胞である、請求項53に記載の方法。
- 前記第1のgRNA分子および前記第2のgRNA分子は、
(i)配列番号1に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第1のgRNA分子、および配列番号2に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第2のgRNA分子;
(ii)配列番号11に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第1のgRNA分子、および配列番号4に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第2のgRNA分子;
(iii)配列番号15に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第1のgRNA分子、および配列番号19に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第2のgRNA分子
からなる群から選択される、請求項53に記載の方法。 - 変異ジストロフィン遺伝子を有する、必要とする対象を処置する方法であって、前記対象に、
(a)第1のガイドRNA(gRNA)分子をコードするポリヌクレオチド配列と、NNGRRT(配列番号24)またはNNGRRV(配列番号25)のいずれかのプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)を認識する第1のCas9分子をコードするポリヌクレオチド配列とを含む第1のベクター、および
(b)第2のgRNA分子をコードするポリヌクレオチド配列と、NNGRRT(配列番号24)またはNNGRRV(配列番号25)のいずれかのプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)を認識する第2のCas9分子をコードするポリヌクレオチド配列とを含む第2のベクター
を投与することを含み、
前記第1のgRNA分子および第2のgRNA分子のそれぞれは、19〜24個のヌクレオチドの長さのターゲティングドメインを有し、前記ベクターは、それぞれがヒトジストロフィン遺伝子のエクソン51に隣接する第1および第2のイントロン中で第1および第2の二本鎖切断を形成するように構成され、それにより、ジストロフィン遺伝子においてエクソン51を含むセグメントが欠失される、方法。 - 前記第1のgRNA分子および前記第2のgRNA分子は、
(i)配列番号1に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第1のgRNA分子、および配列番号2に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第2のgRNA分子;
(ii)配列番号11に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第1のgRNA分子、および配列番号4に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第2のgRNA分子;
(iii)配列番号15に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第1のgRNA分子、および配列番号19に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第2のgRNA分子;
(iv)配列番号15に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第1のgRNA分子、および配列番号18に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第2のgRNA分子;
(v)配列番号15に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第1のgRNA分子、および配列番号4に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第2のgRNA分子;
(vi)配列番号14に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第1のgRNA分子、および配列番号19に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第2のgRNA分子;
(vii)配列番号14に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第1のgRNA分子、および配列番号18に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第2のgRNA分子;
(viii)配列番号14に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第1のgRNA分子、および配列番号4に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第2のgRNA分子;
(ix)配列番号11に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第1のgRNA分子、および配列番号19に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第2のgRNA分子;
(x)配列番号14に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第1のgRNA分子、および配列番号15に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第2のgRNA分子;ならびに
(xi)配列番号11に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第1のgRNA分子、および配列番号18に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第2のgRNA分子
からなる群から選択される、請求項67に記載の方法。 - 前記対象はデュシェンヌ型筋ジストロフィーに罹患している、請求項68に記載の方法。
- 前記第1のベクターおよび第2のベクターを前記対象に筋肉内投与する、静脈内投与する、またはこれらの組み合わせで投与する、請求項67に記載の方法。
- エクソン52が欠失した(Δ52)ヒトジストロフィン遺伝子(hDMD)を有する遺伝子導入齧歯動物胚を作成する方法であって、請求項1に記載のgRNAを齧歯動物胚に投与することを含む方法。
- 前記齧歯動物胚はマウス胚である、請求項71に記載の方法。
- 前記遺伝子導入齧歯動物胚はヘテロ接合性hDMDまたはヘテロ接合性hDMD−Δ52である、請求項71に記載の方法。
- 配列番号41に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第1のgRNA分子と配列番号42に記載のヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインを含む第2のgRNA分子とを前記齧歯動物胚に投与して、ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン52を欠失させる、請求項71に記載の方法。
- 配列番号27に記載のアミノ酸配列を含むCasタンパク質を前記齧歯動物胚に投与することをさらに含む、請求項71に記載の方法。
- 請求項71に記載の方法により作成された遺伝子導入齧歯動物胚。
- 請求項71に記載の遺伝子導入齧歯動物胚から作成された遺伝子導入齧歯動物。
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