JP2018533952A - 肺腺癌を検出するためのバイオマーカー及びその使用 - Google Patents

肺腺癌を検出するためのバイオマーカー及びその使用 Download PDF

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Abstract

肺腺癌の検出に関連するバイオマーカー及びその使用が提供される。また、肺腺癌をインビトロで検出する方法であって、被験体の第１の部位における、少なくとも１つの以下の遺伝子：ＴＰ５３、ＥＧＦＲ、ＬＲＰ１Ｂ、ＫＲＡＳ、ＰＴＰＲＤ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ２、ＰＩＫ３ＣＡ、ＢＲＡＦ、ＦＬＴ１、ＲＨＰＮ２、ＧＬＩ３、及びＭＲＣ２を含む１以上のバイオマーカーの突然変異レベルから第１の突然変異レベルを取得することと；前記第１の突然変異レベルを第１のレファレンスレベルと比較することと；前記第１の突然変異レベルと前記第１のレファレンスレベルとの間に明白な差があるとき、前記被験体が肺腺癌を有していると判定することとを含み、前記第１のレファレンスレベルが、正常個体の第１の部位における前記バイオマーカーの突然変異レベルである方法も提供される。【選択図】なし

Description

本開示は、生体医学の分野、具体的には肺腺癌を検出するためのバイオマーカー及びその使用、より具体的には被験体が肺腺癌に罹患しているかどうかをインビトロで判定する方法、それを判定する装置及びキット、並びに肺腺癌が患者において転移しているかどうかをインビトロで判定する方法、それを判定する装置及びキットに関する。
ヒトゲノムプロジェクトの完了と共に、次世代シーケンシングは、腫瘍の形成、発達、及び転移における分子機構を研究するための新規ツールを提供し、これは、癌患者のゲノムパターンによる遺伝子の突然変異と発癌との間の関係の研究に基づいて疾患を予測、妨害、診断、及び治療するために臨床腫瘍学の分野において重要な研究ストラテジとなっている。肺癌は、罹患率及び死亡率が最も急速に増大する、ヒトの健康及び生命を脅かす最も悪性度の高い腫瘍のうちの１つである。近年、肺癌の罹患率は、世界中で、特に中国で経時的に増加している。肺癌は、主に非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）（８５％）及び小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）を含み、肺腺癌は、最も一般的な組織学的タイプのＮＳＣＬＣであり、世界中で毎年５００，０００人超が死亡している。
外科的療法が大きく進歩したにもかかわらず、臨床における肺腺癌の遺伝子突然変異に基づく分子サブタイピング、標的療法、及び診断検査による補助的役割は依然として限定されており、その理由は、（１）早期診断に有効な検査が存在せず、一旦診断された大部分の患者において転移が既に生じている、（２）大部分の患者に対する有効で標的可能なドライバー遺伝子が知られていない、（３）腫瘍の異質性及び複雑さ、（４）悪性転移機序が不明であることにある。
肺腺癌のゲノムランドスケープに焦点を当てることによって、最近様々な潜在的癌ドライバー遺伝子が研究者によって同定され、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、及びＢＲＡＦ等の幾つかの活性化癌遺伝子、並びにＡＬＫ、ＲＯＳ１、及びＲＥＴが関与する転位及び融合については標的療法が開発されている。しかし、これら研究の大部分は、主に欧州又は北米の患者から得られた腫瘍サンプルに注目しており、試料の大部分は早期疾患段階で採取されたものであるので、民族集団が異なることから東アジア人集団に対する特異性が低い。更に、系統的調査が不十分であることから、既に転移が生じている進行肺腺癌の診断及び治療には困難な課題が存在する。
本開示の実施形態は、関連技術における既存の問題のうちの少なくとも１つを解決するか又は少なくとも商業的選択肢を提供することを目的とする。
東アジア人において肺腺癌の罹患率が高く、また、様々な民族集団間に遺伝的異質性が存在する可能性があるという発見に基づいて、本発明者らは、進行肺腺癌患者、特に転移性肺腺癌と診断された患者の遺伝子プロファイルを含む東アジア人の網羅的遺伝子解析を行った。次世代シーケンシングを用いた遺伝子突然変異の広範囲に亘る研究により、本発明者らは、肺腺癌の早期検出において有用なバイオマーカーを同定して、肺腺癌ドライバー遺伝子プロファイルを充実させ、肺腺癌の補助療法及び診断検査を容易にし、例えば、肺腺癌の形成及び発達の有効な検出のための病因の調査、予後評価、及び転移の進行において有用なバイオマーカーを提供し、転移の進行についての理解を深め、転移性肺腺癌の将来の診断及び治療に対する補助的指針を提供した。
３３５個の原発性肺腺癌サンプル、３５個のリンパ節転移サンプル、及び肺腺癌を有しない組織サンプルについての網羅的解析により、本発明者らは、突然変異遺伝子の突然変異率、遺伝子配列長、生物学的機能等を総合的に解析した。これら解析によって、肺腺癌サンプルにおける１３個の統計学的に有意な突然変異遺伝子が明らかになった。前記突然変異遺伝子は、ＴＰ５３、ＥＧＦＲ、ＬＲＰ１Ｂ、ＫＲＡＳ、ＰＴＰＲＤ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ２、ＰＩＫ３ＣＡ、ＢＲＡＦ、ＦＬＴ１、ＲＨＰＮ２、ＧＬＩ３、及びＭＲＣ２であり、これらは本明細書では病原遺伝子とも称される。
本発明者らは、これら突然変異遺伝子が肺腺癌集団、特に東アジア人集団において顕著な突然変異率を有することを見出した。これは、これら遺伝子が肺腺癌の発病と相関しているので、肺腺癌の発症についての直接又は補助的診断検査において使用できる可能性があることを示唆している。したがって、これら遺伝子は、肺腺癌のバイオマーカー、即ち、肺腺癌の発病の可能性を予測する、例えば、肺腺癌の判定を支援するか又は肺腺癌の早期診断検査を支援するバイオマーカーとして使用することができる。
本開示の第１の態様では、被験体が肺腺癌に罹患しているかどうかをインビトロで判定する方法であって、前記被験体の第１の部位における、ＴＰ５３、ＥＧＦＲ、ＬＲＰ１Ｂ、ＫＲＡＳ、ＰＴＰＲＤ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ２、ＰＩＫ３ＣＡ、ＢＲＡＦ、ＦＬＴ１、ＲＨＰＮ２、ＧＬＩ３、及びＭＲＣ２遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つであるバイオマーカーの第１の突然変異レベルを検出することと、前記第１の突然変異レベルを第１のレファレンスレベルと比較し、前記第１の突然変異レベルが前記第１のレファレンスレベルと有意に異なるとき、前記被験体が前記肺腺癌に罹患していると判定することとを含み、前記第１のレファレンスレベルが、肺腺癌を有しない個体の前記第１の部位に対応する部位における前記バイオマーカーの突然変異レベルである方法が実施形態に提供される。
本開示の第２の態様では、被験体が肺腺癌に罹患しているかどうかを判定する装置が実施形態に提供される。前記装置は、第１の態様に記載された方法の一部又は全ての工程を実施するのに好適であり、前記装置は、前記被験体の第１の部位における、ＴＰ５３、ＥＧＦＲ、ＬＲＰ１Ｂ、ＫＲＡＳ、ＰＴＰＲＤ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ２、ＰＩＫ３ＣＡ、ＢＲＡＦ、ＦＬＴ１、ＲＨＰＮ２、ＧＬＩ３、及びＭＲＣ２遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つであるバイオマーカーの第１の突然変異レベルを検出するようになっている第１の突然変異検出ユニットと；前記第１の突然変異検出ユニットに接続されており、且つ前記第１の突然変異レベルを第１のレファレンスレベルと比較し、前記第１の突然変異レベルが前記第１のレファレンスレベルと有意に異なるとき、前記被験体が前記肺腺癌に罹患していると判定するようになっている第１の判定ユニットとを含み、前記第１のレファレンスレベルは、肺腺癌を有しない個体の前記第１の部位に対応する部位における前記バイオマーカーの突然変異レベルである。
本開示の第３の態様では、生物学的サンプルが肺腺癌に冒されているかどうかを判定するキットであって、前記生物学的サンプルにおける、ＴＰ５３、ＥＧＦＲ、ＬＲＰ１Ｂ、ＫＲＡＳ、ＰＴＰＲＤ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ２、ＰＩＫ３ＣＡ、ＢＲＡＦ、ＦＬＴ１、ＲＨＰＮ２、ＧＬＩ３、及びＭＲＣ２遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つであるバイオマーカーの突然変異レベルを検出するようになっている試薬と、前記バイオマーカーの前記突然変異レベルと前記肺腺癌との間の関係を示すようになっている第１の説明書とを含み、任意で、前記第１の説明書が第１のレファレンスレベルを含み、前記第１のレファレンスレベルが、肺腺癌を有しない個体の前記生物学的サンプルが由来する部位に対応する部位における前記バイオマーカーの突然変異レベルであるキットが実施形態に提供される。
本開示の第４の態様では、被験体が肺腺癌に罹患しているかどうかをインビトロで判定する方法であって、前記被験体の第１の部位におけるバイオマーカーの第１の突然変異レベルを検出することと、前記被験体の第２の部位における前記バイオマーカーの第２の突然変異レベルを検出することと、前記第１の突然変異レベルを前記第２の突然変異レベルと比較し、前記第１の突然変異レベルが前記第２の突然変異レベルと有意に異なるとき、前記被験体が前記肺腺癌に罹患していると判定することとを含み、前記バイオマーカーが、ＴＰ５３、ＥＧＦＲ、ＬＲＰ１Ｂ、ＫＲＡＳ、ＰＴＰＲＤ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ２、ＰＩＫ３ＣＡ、ＢＲＡＦ、ＦＬＴ１、ＲＨＰＮ２、ＧＬＩ３、及びＭＲＣ２遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つであり、前記第２の部位が、肺腺癌を有しない方法が実施形態に提供される。
本開示の第５の態様では、被験体が肺腺癌に罹患しているかどうかを判定する装置が実施形態に提供される。前記装置は、第４の態様に記載された被験体が肺腺癌に罹患しているかどうかをインビトロで判定する方法の一部又は全ての工程を実施するのに好適であり、前記装置は、前記被験体の第１の部位におけるバイオマーカーの第１の突然変異レベルを検出し、前記被験体の第２の部位における前記バイオマーカーの第２の突然変異レベルを検出するようになっている第２の突然変異検出ユニットと、前記第２の突然変異検出ユニットに接続されており、且つ前記第１の突然変異レベルを前記第２の突然変異レベルと比較し、前記第１の突然変異レベルが前記第２の突然変異レベルと有意に異なるとき、前記被験体が前記肺腺癌に罹患していると判定するようになっている第２の判定ユニットとを含み、前記バイオマーカーは、ＴＰ５３、ＥＧＦＲ、ＬＲＰ１Ｂ、ＫＲＡＳ、ＰＴＰＲＤ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ２、ＰＩＫ３ＣＡ、ＢＲＡＦ、ＦＬＴ１、ＲＨＰＮ２、ＧＬＩ３、及びＭＲＣ２遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つであり、前記第２の部位は、肺腺癌を有しない。
かかる３つの遺伝子ＲＨＰＮ２、ＧＬＩ３、及びＭＲＣ２が、肺腺癌と高度に相関し、特に肺腺癌の形成及び発達と密接に相関している肺腺癌ドライバー遺伝子であることを本発明者らが初めて見出した。かかる３つの肺腺癌ドライバー遺伝子は、肺腺癌の直接又は補助的診断検査において有用であるが、このことはこれまで報告されていない。
本開示の第６の態様では、ＲＨＰＮ２、ＧＬＩ３、及びＭＲＣ２遺伝子を含む肺腺癌ドライバー遺伝子のセットが実施形態に提供される。
本開示の第７の態様では、肺腺癌の治療及び／又は肺腺癌を治療するための医薬の調製における第６の態様に記載された肺腺癌ドライバー遺伝子のセットの使用が実施形態に提供される。
本開示の第８の態様では、被験体が肺腺癌に罹患しているかどうかをインビトロで判定する方法であって、ＲＨＰＮ２、ＧＬＩ３、及びＭＲＣ２遺伝子を含む肺腺癌ドライバー遺伝子のセットが、それぞれ突然変異を有しているかどうかを検出することと、前記肺腺癌ドライバー遺伝子のセットがそれぞれ突然変異を有しているとき、前記被験体が前記肺腺癌に罹患していると判定することとを含み、前記肺腺癌ドライバー遺伝子のセットが、前記被験体の肺の細胞又は組織に由来する方法が実施形態に提供される。
本開示の第９の態様では、被験体が肺腺癌に罹患しているかどうかを判定する装置が実施形態に提供される。前記装置は、第８の態様に記載された被験体が肺腺癌に罹患しているかどうかをインビトロで判定する方法の一部又は全ての工程を実施するのに好適であり、前記装置は、ＲＨＰＮ２、ＧＬＩ３、及びＭＲＣ２遺伝子を含む肺腺癌ドライバー遺伝子のセットがそれぞれ突然変異を有しているかどうかを検出するようになっている第３の突然変異検出ユニットと、前記第３の突然変異検出ユニットに接続されており、且つ前記肺腺癌ドライバー遺伝子のセットがそれぞれ突然変異を有しているとき、前記被験体が前記肺腺癌に罹患していると判定するようになっている第３の判定ユニットとを含み、前記肺腺癌ドライバー遺伝子のセットは、前記被験体の肺の細胞又は組織に由来する。
本開示の第１０の態様では、生物学的サンプルが肺腺癌に冒されているかどうかを判定するキットであって、前記生物学的サンプルにおいて、ＲＨＰＮ２、ＧＬＩ３、及びＭＲＣ２遺伝子を含む肺腺癌ドライバー遺伝子のセットがそれぞれ突然変異を有しているかどうかを検出するようになっている試薬と、前記肺腺癌ドライバー遺伝子のセットにおける前記突然変異と前記肺腺癌との間の関係を示すようになっている第２の説明書とを含むキットが実施形態に提供される。
転移は、肺腺癌の発達に最も重要な事象であるが、転移性原発性肺腺癌患者と非転移性原発性肺腺癌患者との間の突然変異パターンの違いに関する系統的調査は未だ行われていない。リンパ節又は遠位転移性肺腺癌と診断された患者に由来するサンプルと非転移性肺腺癌であると診断された患者に由来するサンプルとを比較することによって、本発明者らは、フィッシャー直接検定を通して、転移性肺腺癌サンプルにおいてＴＰ５３遺伝子の突然変異体の発現のみが有意に多い（Ｐ＜０．０５）ことを見出した。これは、ＴＰ５３遺伝子が肺腺癌の形成に実質的に関連する癌抑制遺伝子であるだけではなく、肺腺癌の転移も駆動することを示す。したがって、ＴＰ５３遺伝子は、肺腺癌が転移しているかどうかを検出するため、及び治療後の予後を予測するためのバイオマーカーとして使用することができる。
本開示の第１１の態様では、肺腺癌が患者において転移しているかどうかをインビトロで判定する方法であって、前記肺腺癌を有する前記患者の肺の細胞又は組織に由来するＴＰ５３遺伝子の突然変異レベルを検出することと、前記ＴＰ５３遺伝子の前記突然変異レベルを第２のレファレンスレベルと比較し、前記ＴＰ５３遺伝子の前記突然変異レベルが前記第２のレファレンスレベルと有意に異なるとき、前記肺腺癌が前記患者において転移していると判定することとを含み、前記第２のレファレンスレベルが、非転移性肺腺癌であると診断された患者の肺の細胞又は組織に由来する前記ＴＰ５３遺伝子の突然変異レベルである方法が実施形態に提供される。
本開示の第１２の態様では、肺腺癌が患者において転移しているかどうかを判定する装置が実施形態に提供される。前記装置は、第１１の態様に記載された肺腺癌が患者において転移しているかどうかを判定する方法の一部又は全ての工程を実施するのに好適であり、前記装置は、前記肺腺癌を有する前記患者の肺の細胞又は組織に由来するＴＰ５３遺伝子の突然変異レベルを検出するようになっているＴＰ５３遺伝子検出ユニットと、前記ＴＰ５３遺伝子検出ユニットに接続されており、且つ前記ＴＰ５３遺伝子の前記突然変異レベルを第２のレファレンスレベルと比較し、前記ＴＰ５３遺伝子の前記突然変異レベルが前記第２のレファレンスレベルと有意に異なるとき、前記肺腺癌が前記患者において転移していると判定するようになっている第４の判定ユニットとを含み、前記第２のレファレンスレベルは、非転移性肺腺癌であると診断された患者の肺の細胞又は組織に由来する前記ＴＰ５３遺伝子の突然変異レベルである。
本開示の第１３の態様では、生物学的サンプルが転移性肺腺癌に冒されているかどうかを判定するキットであって、前記生物学的サンプルにおけるＴＰ５３遺伝子の突然変異レベルを検出するようになっている試薬と、前記ＴＰ５３遺伝子の前記突然変異レベルと前記転移性肺腺癌との間の関係を示すようになっている第３の説明書とを含み、前記第３の説明書が、非転移性肺腺癌であると診断された患者の肺の細胞又は組織に由来する前記ＴＰ５３遺伝子の突然変異レベルである第２のレファレンスレベルを含むキットが実施形態に提供される。
肺腺癌であると診断された中国人患者３３５人から得られた肺腺癌サンプルデータを比較することによって、本発明者らは、カプラン・マイヤー生存分析を通して、ＴＰ５３、ＬＲＰ１Ｂ、ＳＴＫ１１、ＫＥＡＰ１、ＢＲＡＦ、ＭＥＴ、及びＭＲＣ２遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つである遺伝子における突然変異が、野生型患者よりも有意に短い生存時間を示すことを見出した。本明細書において前記「野生型患者」とは、上記７つの遺伝子のいずれにも突然変異が存在しない肺腺癌患者を指す。突然変異を有する上記７つの遺伝子のうちのいずれか１つを、診療において生存予測を補助するためのバイオマーカーとして使用することができる。
本開示の第１４の態様では、肺腺癌の治療を受けている患者の予後を予測する方法であって、前記患者の肺の細胞又は組織に由来するＴＰ５３、ＬＲＰ１Ｂ、ＳＴＫ１１、ＫＥＡＰ１、ＢＲＡＦ、ＭＥＴ、及びＭＲＣ２遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つである遺伝子に突然変異が存在するかどうかを検出することと、前記突然変異が前記遺伝子に存在するとき、前記患者が予後不良であると判定することとを含む方法が実施形態に提供される。前記「予後不良」とは、肺腺癌の治療後の生存時間が野生型患者よりも短い患者を意味する。本明細書において前記「野生型患者」とは、上記７つの遺伝子のいずれにも突然変異が存在しない肺腺癌患者を指す。
本開示の第１５の態様では、肺腺癌の治療を受けている患者の予後を予測する装置が実施形態に提供される。前記装置は、第１４の態様に記載された肺腺癌の治療を受けている患者の予後を予測する方法の一部又は全ての工程を実施するのに好適であり、前記装置は、前記患者の肺の細胞又は組織に由来するＴＰ５３、ＬＲＰ１Ｂ、ＳＴＫ１１、ＫＥＡＰ１、ＢＲＡＦ、ＭＥＴ、及びＭＲＣ２遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つである遺伝子の突然変異レベルを検出するようになっている第４の突然変異検出ユニットと、前記第４の突然変異検出ユニットに接続されており、且つ前記突然変異が前記遺伝子に存在するとき、前記患者が予後不良であると判定するようになっている第５の判定ユニットとを含む。前記「予後不良」とは、肺腺癌の治療後の生存時間が野生型患者よりも短い患者を意味する。本明細書において前記「野生型患者」とは、上記７つの遺伝子のいずれにも突然変異が存在しない肺腺癌患者を指す。
本開示の第１６の態様では、肺腺癌の治療を受けている患者の予後を予測するキットであって、前記患者の肺の細胞又は組織に由来するＴＰ５３、ＬＲＰ１Ｂ、ＳＴＫ１１、ＫＥＡＰ１、ＢＲＡＦ、ＭＥＴ、及びＭＲＣ２遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つである遺伝子に突然変異が存在するかどうかを検出するようになっている試薬と、前記突然変異が前記遺伝子に存在するとき、前記患者が予後不良であることを示すようになっている第４の説明書とを含むキットが実施形態に提供される。前記「予後不良」とは、肺腺癌の治療後の生存時間が野生型患者よりも短い患者を意味する。本明細書において前記「野生型患者」とは、上記７つの遺伝子のいずれにも突然変異が存在しない肺腺癌患者を指す。
また、本発明者らは、新規肺腺癌ドライバー遺伝子であるＩＱＧＡＰ３遺伝子が肺腺癌サンプルにおいて高いレベルで発現することを見出した。本発明者らは、更に、ＩＱＧＡＰ３遺伝子の高い発現レベルが、より短い全生存期間及び無病生存期間と有意に相関していることを見出した。これは、その高い発現レベルが予後不良と顕著に相関していることを示唆する。したがって、ＩＱＧＡＰ３遺伝子は、肺腺癌を正確に検出し、予後を評価するためのバイオマーカーとして使用することができる。
本開示の第１７の態様では、肺腺癌の治療を受けている患者の予後を予測する方法であって、前記患者の肺の細胞又は組織に由来するＩＱＧＡＰ３遺伝子の発現レベルを検出することと、前記ＩＱＧＡＰ３遺伝子の前記発現レベルを第３のレファレンスレベルと比較し、前記ＩＱＧＡＰ３遺伝子の前記発現レベルが前記第３のレファレンスレベルと有意に異なるとき、前記患者が予後不良であると判定することとを含み、前記第３のレファレンスレベルが、予後良好の患者の肺の細胞又は組織に由来するＩＱＧＡＰ３遺伝子の発現レベルである方法が実施形態に提供される。本明細書では、患者の予後が良好であるか不良であるかは、生存期間がより長い又はより短いことに依存することに留意すべきである。前記「予後不良」とは、肺腺癌の治療後の生存時間が野生型患者よりも短い患者を意味する。本明細書において前記「野生型患者」とは、ＩＱＧＡＰ３遺伝子が有意に高いレベルでは発現していない肺腺癌患者を指す。
本開示の第１８の態様では、肺腺癌の治療を受けている患者の予後を予測する装置が実施形態に提供される。前記装置は、第１７の態様における肺腺癌の治療を受けている患者の予後を予測する方法の一部又は全ての工程を実施するのに好適であり、前記装置は、前記患者の肺の細胞又は組織に由来するＩＱＧＡＰ３遺伝子の発現レベルを検出するようになっているＩＱＧＡＰ３遺伝子検出ユニットと、前記ＩＱＧＡＰ３遺伝子検出ユニットに接続されており、且つ前記ＩＱＧＡＰ３遺伝子の前記発現レベルを第３のレファレンスレベルと比較し、前記ＩＱＧＡＰ３遺伝子の前記発現レベルが前記第３のレファレンスレベルと有意に異なるとき、前記患者が予後不良であると判定するようになっている第６の判定ユニットとを含み、前記第３のレファレンスレベルは、予後良好の患者の肺の細胞又は組織に由来する前記ＩＱＧＡＰ３遺伝子の発現レベルである。本明細書では、患者の予後が良好であるか不良であるかは、生存期間がより長い又はより短いことに依存することに留意すべきである。前記「予後不良」とは、肺腺癌の治療後の生存時間が野生型患者よりも短い患者を意味する。本明細書において前記「野生型患者」とは、ＩＱＧＡＰ３遺伝子が有意に高いレベルでは発現していない肺腺癌患者を指す。
本開示の第１９の態様では、肺腺癌の治療を受けている患者の予後を予測するキットであって、前記患者の肺の細胞又は組織に由来するＩＱＧＡＰ３遺伝子の発現レベルを検出するようになっている試薬と、前記ＩＱＧＡＰ３遺伝子の前記発現レベルと前記予後との間の関係を示すようになっている第５の説明書とを含み、前記第５の説明書が第３のレファレンスレベルを含み、前記第３のレファレンスレベルが、予後良好の患者の肺の細胞又は組織に由来する前記ＩＱＧＡＰ３遺伝子の発現レベルであるキットが実施形態に提供される。前記「予後不良」とは、肺腺癌の治療後の生存時間が野生型患者よりも短い患者を意味する。本明細書において前記「野生型患者」とは、ＩＱＧＡＰ３遺伝子が有意に高いレベルでは発現していない肺腺癌患者を指す。
本開示の上記及び／又は更なる態様及び利点は、添付図面と組み合わせた実施形態の説明から明らかになり、容易に理解されるであろう。
本開示の実施形態における様々な肺腺癌患者又は様々なサンプル由来の肺腺癌に関連する遺伝子における突然変異率を示す。 本開示の実施形態における肺腺癌に関連するＴＰ５３、ＥＧＦＲ、及びＬＲＰ１Ｂ遺伝子のそれぞれについて、突然変異の種類及び突然変異部位を示す。 本開示の実施形態における肺腺癌に関連するＫＲＡＳ、ＰＴＰＲＤ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＲＨＰＮ２、及びＳＴＫ１１遺伝子のそれぞれについて、突然変異の種類及び突然変異部位を示す。 本開示の実施形態における肺腺癌に関連するＢＲＡＦ、ＧＬＩ３、ＦＬＴ１、ＭＲＣ２、及びＳＭＡＤ２遺伝子のそれぞれについて、突然変異の種類及び突然変異部位を示す。 本開示の実施形態における肺腺癌に関連するＡＰＣ、ＫＥＡＰ１、ＡＴＦ７ＩＰ、ＩＴＩＨ５、ＩＱＧＡＰ３、及びＭＥＴ遺伝子のそれぞれについて、突然変異の種類及び突然変異部位を示す。 本開示の実施形態における肺腺癌に関連するＥＲＢＢ２及びＴＥＲＴ遺伝子のそれぞれについて、突然変異の種類及び突然変異部位を示す。 本開示の実施形態における肺腺癌及び臨床的特徴に関連する個々の遺伝子の突然変異間の関係を示す。 本開示の実施形態における生存割合及び全生存期間に対する、肺腺癌に関連する個々の７つの遺伝子の突然変異の影響を示す。 本開示の実施形態における肺腺癌を有しない組織、原発性肺腺癌サンプル、及び転移性肺腺癌サンプルにおけるＩＱＧＡＰ３遺伝子のそれぞれの発現レベルを示す。 本開示の実施形態における肺腺癌患者に由来する異なる発現レベルのＩＱＧＡＰ３遺伝子のカプラン・マイヤー生存曲線を示す。 本開示の実施形態における肺腺癌に関連するバイオマーカーを決定するフローチャートを示す。
本開示は、図面及び具体的な実施形態を参照して詳細に説明される。
同一又は類似の要素及び同一又は類似の機能を有する要素は、本明細書全体を通して類似の参照番号によって示される。本開示の実施形態は詳細に参照される。図面を参照して本明細書に記載される実施形態は、例示的、例証的であり、本開示を一般的に理解するために使用される。実施形態は、本開示を限定すると解釈してはならない。
「第１」及び「第２」等の用語は、本明細書では説明目的のために使用され、相対的な重要性又は重大さを示したり意味したりすることを意図するものでも、言及される技術的特徴の量を暗に示すことを意図するものでも、要素又は技術的特徴の順序の関係を示すことを意図するものでもない。したがって、「第１の」及び「第２の」を使用して規定される特徴は、１以上のこの特徴を含み得る。本開示の説明において、特に指定しない限り、「複数の」は２以上のこの特徴を意味する。
用語「逐次接続される」、「接続される」、「連結される」等は、本明細書では、具体的に定義又は限定しない限り、広く解釈されるべきであり、例えば、かかる用語は、２つの要素の固定接続、取り外し可能な接続、若しくは一体接続；又は機械的接続若しくは電気的接続；又は直接接続、中間媒体を介した間接接続、若しくは内部連通を指すと理解され得る。当業者は具体的な文脈に従って上記用語の具体的な意味を理解できると認識される。
用語「突然変異」とは、本明細書では、体細胞突然変異、即ち、生殖細胞を除く細胞が突然変異していることを意味する。
本開示の実施形態では、被験体が肺腺癌に罹患しているかどうかをインビトロで判定する方法が提供される。前記方法は、前記被験体の第１の部位における、ＴＰ５３、ＥＧＦＲ、ＬＲＰ１Ｂ、ＫＲＡＳ、ＰＴＰＲＤ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ２、ＰＩＫ３ＣＡ、ＢＲＡＦ、ＦＬＴ１、ＲＨＰＮ２、ＧＬＩ３、及びＭＲＣ２遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つであるバイオマーカーの第１の突然変異レベルを検出することと、前記第１の突然変異レベルを第１のレファレンスレベルと比較し、前記第１の突然変異レベルが前記第１のレファレンスレベルと有意に異なるとき、前記被験体が前記肺腺癌に罹患していると判定することとを含み、前記第１のレファレンスレベルが、肺腺癌を有しない個体の前記第１の部位に対応する部位における前記バイオマーカーの突然変異レベルである。
この実施形態では、第１の部位は、肺細胞、肺組織、及び血漿中の遊離核酸のうちの少なくとも１つであり得、前記突然変異レベルは、前記遺伝子における突然変異の有無、量、及び種類を含む。本開示の実施形態では、突然変異レベルは、次世代シーケンシングによって同定される。具体的には、肺の細胞又は組織から抽出した後、シーケンシングプラットフォームにおけるシーケンシングのためのライブラリ構築に核酸を付し、シーケンシングデータを得る。その後、レファレンス配列にアラインメントし、アラインメント結果に基づいて標的遺伝子における突然変異レベルを同定する、例えば、標的遺伝子における突然変異の有無、並びに存在する場合は前記突然変異の量及び種類を同定することによって、シーケンシングデータを解析する。既存のシーケンシングプラットフォームにおいてライブラリをシーケンスしてもよく、さもなければ、選択されたシーケンシングプラットフォームに従ってライブラリを構築してもよい。利用可能なシーケンシングプラットフォームとしては、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（ＣＧ）ＣＧＡ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ／Ｓｏｌｅｘａ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ、及びＲｏｃｈｅ４５４が挙げられるが、これらに限定されず、どれを選択するかに応じて、シングルエンドリード又はペアードエンドリードからなるライブラリを構築する。アラインメントは、Ｓｈｏｒｔ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ（ＳＯＡＰ）、ＢＷＡ等のソフトウェアを用いて実施することができるが、本明細書では限定されない。アラインメントのプロセスでは、アラインメントパラメータの設定に応じて、例えば、シーケンシングデータにおける各リードについての許容可能な最大ミスマッチとしてｈ（好ましくは１又は２）が設定され、含有するミスマッチ塩基がｈよりも多いリードは、レファレンス配列に対してマッピングされないリードであると解釈される。アラインメント結果は、リードがレファレンス配列に対してマッピングされ得るかどうか、リードがマッピングされた位置、特定の部位におけるマッピングされたリードの数、マッピングされたリードの特定の部位における塩基の種類等を含む。前記レファレンス配列は公知の配列であり、同じ生物種のゲノムの公開されているアセンブル配列等、標的個体が属する生物種の任意のレファレンス配列であり得る。核酸サンプルがヒト由来である場合、そのゲノムレファレンス配列（レファレンスゲノムとも称される）は、ＮＣＢＩデータベースによって提供されるＨＧ１９であり得る。ＳＮＰ、ＣＮＶ、及びＩｎＤｅｌのうちの少なくとも１つを含む突然変異の種類は、得られたアラインメント結果に基づいて対応する公知のソフトウェア又はプログラムを用いて同定され得る。例えば、ＳＮＰは、デフォルトパラメータ設定に従ってＳＯＡＰｓｎｐ及びＧＡＴＫ等のソフトウェアを用いて同定することができる。
前記第１のレファレンスレベルは、被験体が肺腺癌に罹患しているかどうかの判定中に検出することができる。例えば、第１の部位におけるバイオマーカーの突然変異レベルを検出すると同時に、肺腺癌を有しない個体の第１の部位に対応する部位における前記バイオマーカーの突然変異レベルも検出する。第１の部位は、被験体の肺の組織又は細胞由来であってよい。第１のレファレンスレベルは、前もって検出し、将来的に使用するために記録しておいてもよい。本開示の実施形態では、第１のレファレンスレベルは、前もって検出し、将来的に使用するために記録しておいた、肺腺癌を有しない個体の肺の細胞又は組織に由来する前記バイオマーカーの平均突然変異レベルである。
前記「有意な差」又は「有意に異なる」は、差が明白且つ大きいことを示し得る。例えば、第１のレファレンスレベルは、突然変異の不在を表し、第１の突然変異レベルは、突然変異の存在を表す。別の例では、第１のレファレンスレベルは、ミスセンス突然変異の不在を表し、第１の突然変異レベルは、ミスセンス突然変異の存在を表す。更なる例では、第１のレファレンスレベルは、Ｎ突然変異の不在を表し、第１の突然変異レベルは、１．５Ｎ、２Ｎ、又はそれ以上の突然変異の存在を表す。前記「有意な差」又は「有意に異なる」は、差が統計的に有意であることを示し得る。
上記実施形態における方法は、東アジア人において肺腺癌の罹患率が高く、様々な民族的背景間において潜在的に遺伝的異質性が存在するという知見に基づいて開発され、本発明者らは、進行肺腺癌患者、特に転移性肺腺癌と診断された患者の遺伝子プロファイルを含む、東アジア人のゲノムパターンに対する網羅的解析を行った。次世代シーケンシングを用いた遺伝子突然変異の広範囲に亘る研究により、本発明者らは、肺腺癌の早期検出において有用なバイオマーカーを同定して、肺腺癌ドライバー遺伝子プロファイルを充実させ、肺腺癌の補助療法及び診断検査を容易にし、例えば、肺腺癌の形成及び発達の有効な検出のための病因の調査、予後評価、及び転移の進行において有用なバイオマーカーを提供し、転移の進行についての理解を深め、転移性肺腺癌の将来の診断及び治療に対する補助的指針を提供した。
３３５個の原発性肺腺癌サンプル、３５個のリンパ節転移サンプル、及び肺腺癌を有しない組織サンプルについての網羅的解析により、本発明者らは、突然変異遺伝子の突然変異率、遺伝子配列長、生物学的機能等を総合的に解析した。これら解析によって、肺腺癌サンプルにおける１３個の統計学的に有意な突然変異遺伝子が明らかになった。前記突然変異遺伝子は、ＴＰ５３、ＥＧＦＲ、ＬＲＰ１Ｂ、ＫＲＡＳ、ＰＴＰＲＤ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ２、ＰＩＫ３ＣＡ、ＢＲＡＦ、ＦＬＴ１、ＲＨＰＮ２、ＧＬＩ３、及びＭＲＣ２であり、これらは本明細書では病原遺伝子とも称される。
本発明者らは、これら突然変異遺伝子が肺腺癌集団、特に東アジア人集団において顕著な突然変異率を有することを見出した（図１及び２を参照）。これは、これら遺伝子が肺腺癌の発病と相関しているので、肺腺癌の発症についての直接又は補助的診断検査において使用できる可能性があることを示唆している。例えば、本発明者らは、肺腺癌の中国人集団の４４％についてＴＰ５３遺伝子に統計学的に有意な突然変異が存在することを見出した。これは、肺腺癌を検出するためのバイオマーカーとしてかかる遺伝子を使用できることを示唆する。また、本発明者らは、肺腺癌の中国人集団の３９％についてＥＧＦＲ遺伝子に統計学的に有意な突然変異が存在することを実証した。これは、非喫煙者及び女性により一般的である。更に、白人由来のデータと比較すると、ＥＧＦＲ遺伝子における突然変異はＫＲＡＳ遺伝子よりも高頻度で生じている。更に、ＥＧＦＲ遺伝子における突然変異は、チロシンキナーゼ阻害剤についての治療感受性部位であるＬｅｕ８５８Ａｒｇ部位及びｅｘｏｎ１９ｄｅｌ部位で主に生じることが示された。これは、肺腺癌の検出又は標的療法においてバイオマーカーとしてかかる遺伝子を使用できることを示唆する。更に、本発明者らは、肺腺癌の中国人集団の１９％についてＬＲＰ１Ｂ遺伝子に統計学的に有意な突然変異が存在することを明らかにした。これは、肺腺癌を検出するためのバイオマーカーとしてかかる遺伝子を使用できることを示唆する。更に、本発明者らは、肺腺癌の中国人集団の１１％についてＫＲＡＳ遺伝子に統計学的に有意な突然変異が存在することを示した。これは、肺腺癌を検出するためのバイオマーカーとしてかかる遺伝子を使用できることを示唆する。更に、本発明者らは、肺腺癌の中国人集団の７％についてＰＴＰＲＤ遺伝子に統計学的に有意な突然変異が存在することを見出した。これは、肺腺癌を検出するためのバイオマーカーとしてかかる遺伝子を使用できることを示唆する。更に、本発明者らは、肺腺癌の中国人集団の４％についてＳＴＫ１１遺伝子に統計学的に有意な突然変異が存在することを示した。これは、肺腺癌を検出するためのバイオマーカーとしてかかる遺伝子を使用できることを示唆する。更に、本発明者らは、肺腺癌の中国人集団の５％についてＰＩＫ３ＣＡ遺伝子に統計学的に有意な突然変異が存在することを示した。これは、肺腺癌を検出するためのバイオマーカーとしてかかる遺伝子を使用できることを示唆する。更に、本発明者らは、肺腺癌の中国人集団の５％についてＲＨＰＮ２遺伝子に統計学的に有意な突然変異が存在することを証明した。これは、肺腺癌を検出するためのバイオマーカーとしてかかる遺伝子を使用できることを示唆する。更に、本発明者らは、肺腺癌の中国人集団の２％についてＳＭＡＤ２遺伝子に統計学的に有意な突然変異が存在することを見出した。これは、肺腺癌を検出するためのバイオマーカーとしてかかる遺伝子を使用できることを示唆する。更に、本発明者らは、肺腺癌の中国人集団の４％についてＢＲＡＦ遺伝子に統計学的に有意な突然変異が存在することを証明した。これは、肺腺癌を検出するためのバイオマーカーとしてかかる遺伝子を使用できることを示唆する。更に、本発明者らは、肺腺癌の中国人集団の４％についてＧＬＩ３遺伝子に統計学的に有意な突然変異が存在することを明らかにした。これは、肺腺癌を検出するためのバイオマーカーとしてかかる遺伝子を使用できることを示唆する。更に、本発明者らは、肺腺癌の中国人集団の３％についてＦＬＴ１遺伝子に統計学的に有意な突然変異が存在することを示した。これは、肺腺癌を検出するためのバイオマーカーとしてかかる遺伝子を使用できることを示唆する。更に、本発明者らは、肺腺癌の中国人集団の２％についてＭＲＣ２遺伝子（ｕＰＡＲＡＰ、Ｅｎｄｏ１８０、又はＣＤ２８０とも称される）に統計学的に有意な突然変異が存在することを見出した。これは、肺腺癌を検出するためのバイオマーカーとしてかかる遺伝子を使用できることを示唆する。したがって、これら各遺伝子又はこれらの組合せを、肺腺癌のバイオマーカーとして、即ち、肺腺癌の発病の可能性を予測する、例えば、肺腺癌の判定を支援するか又は早期における肺腺癌の診断検査を支援するバイオマーカーとして使用することができる。
本開示の幾つかの実施形態では、前記バイオマーカーは、ＴＰ５３、ＥＧＦＲ、ＬＲＰ１Ｂ、ＫＲＡＳ、ＰＴＰＲＤ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ２、ＰＩＫ３ＣＡ、ＢＲＡＦ、ＦＬＴ１、ＲＨＰＮ２、ＧＬＩ３、及びＭＲＣ２遺伝子からなる群から選択される任意の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、及び１３個全ての遺伝子を含む。前記第１の突然変異レベル及び前記第１のレファレンスレベルは、対応して、複数の遺伝子のそれぞれの突然変異レベルを含み得る。
本開示の実施形態では、被験体が肺腺癌に罹患しているかどうかを判定する装置が提供される。前記装置は、本開示の上記実施形態又は任意の例に記載の方法の一部又は全ての工程を実施するのに好適であり、前記装置は、前記被験体の第１の部位における、ＴＰ５３、ＥＧＦＲ、ＬＲＰ１Ｂ、ＫＲＡＳ、ＰＴＰＲＤ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ２、ＰＩＫ３ＣＡ、ＢＲＡＦ、ＦＬＴ１、ＲＨＰＮ２、ＧＬＩ３、及びＭＲＣ２遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つであるバイオマーカーの第１の突然変異レベルを検出するようになっている第１の突然変異検出ユニットと；前記第１の突然変異検出ユニットに接続されており、且つ前記第１の突然変異レベルを第１のレファレンスレベルと比較し、前記第１の突然変異レベルが前記第１のレファレンスレベルと有意に異なるとき、前記被験体が前記肺腺癌に罹患していると判定するようになっている第１の判定ユニットとを含み、前記第１のレファレンスレベルは、肺腺癌を有しない個体の前記第１の部位に対応する部位における前記バイオマーカーの突然変異レベルである。この実施形態では、第１の部位は、肺細胞、肺組織、及び血漿中の遊離核酸のうちの少なくとも１つであり得る。本開示の上記実施形態又は任意の例に記載の被験体が肺腺癌に罹患しているかどうかをインビトロで判定する方法の技術的特徴又は利点は、この実施形態における被験体が肺腺癌に罹患しているかどうかを判定する装置にも適用可能であり、このことは本明細書において詳述されない。本開示の上記実施形態又は任意の例における方法の工程は、互いに接続されているサブユニットを用いて実施できることが当業者に理解されるであろう。例えば、前記第１の突然変異検出ユニットは、シーケンシングデータを得るためのシーケンシングサブユニットと、前記シーケンシングデータをレファレンス配列に対してアラインメントしてアラインメント結果を得るためのアラインメントサブユニットとを含む。
本開示の実施形態では、生物学的サンプルが肺腺癌に冒されているかどうかを判定するキットであって、前記生物学的サンプルにおける、ＴＰ５３、ＥＧＦＲ、ＬＲＰ１Ｂ、ＫＲＡＳ、ＰＴＰＲＤ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ２、ＰＩＫ３ＣＡ、ＢＲＡＦ、ＦＬＴ１、ＲＨＰＮ２、ＧＬＩ３、及びＭＲＣ２遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つであるバイオマーカーの突然変異レベルを検出するようになっている試薬と、前記バイオマーカーの前記突然変異レベルと前記肺腺癌との間の関係を示すようになっている第１の説明書とを含み、前記第１の説明書が第１のレファレンスレベルを含み、前記第１のレファレンスレベルが、肺腺癌を有しない個体の前記生物学的サンプルが由来する部位に対応する部位における前記バイオマーカーの突然変異レベルであるキットが提供される。この実施形態では、第１の部位は、肺細胞、肺組織、及び血漿中の遊離核酸のうちの少なくとも１つであり得る。本開示の上記実施形態又は任意の例に記載の被験体が肺腺癌に罹患しているかどうかをインビトロで判定する方法の技術的特徴又は利点は、この実施形態における生物学的サンプルが肺腺癌に冒されているかどうかを判定するキットにも適用可能であり、このことは本明細書において詳述されない。前記第１の説明書は、第１の突然変異レベルを第１のレファレンスレベルと比較すること、及び第１の突然変異レベルが第１のレファレンスレベルと有意に異なるとき、被験体が肺腺癌に罹患していると判定することに関する指示を含む。
本開示の実施形態では、被験体が肺腺癌に罹患しているかどうかをインビトロで判定する方法であって、前記被験体の第１の部位におけるバイオマーカーの第１の突然変異レベルを検出することと、前記被験体の第２の部位における前記バイオマーカーの第２の突然変異レベルを検出することと、前記第１の突然変異レベルを前記第２の突然変異レベルと比較し、前記第１の突然変異レベルが前記第２の突然変異レベルと有意に異なるとき、前記被験体が前記肺腺癌に罹患していると判定することとを含み、前記バイオマーカーが、ＴＰ５３、ＥＧＦＲ、ＬＲＰ１Ｂ、ＫＲＡＳ、ＰＴＰＲＤ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ２、ＰＩＫ３ＣＡ、ＢＲＡＦ、ＦＬＴ１、ＲＨＰＮ２、ＧＬＩ３、及びＭＲＣ２遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つであり、前記第２の部位が、肺腺癌を有しない、即ち、無肺腺癌部位である方法が提供される。被験体の前記正常無肺腺癌部位は、血液サンプル等、肺腺癌を有しない被験体における細胞、組織、又は体液のサンプルを含む。この実施形態では、前記第１の部位は、肺細胞、肺組織、及び血漿中の遊離核酸のうちの少なくとも１つであり得、前記第２の部位は、健常部位又は肺腺癌を有しないことが公知である部位であり得る。本開示の上記実施形態又は任意の例に記載の被験体が肺腺癌に罹患しているかどうかをインビトロで判定する方法の技術的特徴又は利点は、この実施形態における被験体が肺腺癌に罹患しているかどうかをインビトロで判定する方法にも適用可能であり、このことは本明細書において詳述されない。
本開示の実施形態では、被験体が肺腺癌に罹患しているかどうかを判定する装置が提供される。前記装置は、上記実施形態に記載の被験体が肺腺癌に罹患しているかどうかをインビトロで判定する方法の一部又は全ての工程を実施するのに好適であり、前記装置は、前記被験体の第１の部位におけるバイオマーカーの第１の突然変異レベルを検出し、前記被験体の第２の部位における前記バイオマーカーの第２の突然変異レベルを検出するようになっている第２の突然変異検出ユニットと、前記第２の突然変異検出ユニットに接続されており、且つ前記第１の突然変異レベルを前記第２の突然変異レベルと比較し、前記第１の突然変異レベルが前記第２の突然変異レベルと有意に異なるとき、前記被験体が前記肺腺癌に罹患していると判定するようになっている第２の判定ユニットとを含み、前記バイオマーカーが、ＴＰ５３、ＥＧＦＲ、ＬＲＰ１Ｂ、ＫＲＡＳ、ＰＴＰＲＤ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ２、ＰＩＫ３ＣＡ、ＢＲＡＦ、ＦＬＴ１、ＲＨＰＮ２、ＧＬＩ３、及びＭＲＣ２遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つである。この実施形態では、前記第１の部位は、肺細胞、肺組織、及び血漿中の遊離核酸のうちの少なくとも１つであり得、前記第２の部位は、健常部位又は肺腺癌を有しないことが公知である部位であり得る。本開示の上記実施形態又は任意の例に記載の被験体が肺腺癌に罹患しているかどうかをインビトロで判定する方法の技術的特徴又は利点は、この実施形態における被験体が肺腺癌に罹患しているかどうかをインビトロで判定する装置にも適用可能であり、このことは本明細書において詳述されない。上記実施形態のいずれかにおける方法の工程は、互いに接続されているサブユニットを用いて実施できることが当業者に理解されるであろう。例えば、前記第２の突然変異検出ユニットは、シーケンシングデータを得るためのシーケンシングサブユニットと、前記シーケンシングデータをレファレンス配列に対してアラインメントしてアラインメント結果を得るためのアラインメントサブユニットとを含む。
本開示の別の実施形態では、ＲＨＰＮ２、ＧＬＩ３、及びＭＲＣ２を含む肺腺癌ドライバー遺伝子のセットが提供される。かかる３つの遺伝子ＲＨＰＮ２、ＧＬＩ３、及びＭＲＣ２が、肺腺癌と高度に相関し、特に肺腺癌の形成及び発達と密接に相関している肺腺癌ドライバー遺伝子であることを本発明者らが初めて見出した。かかる３つの肺腺癌ドライバー遺伝子は、肺腺癌の直接又は補助的診断検査において有用であるが、このことはこれまで報告されていない。
本開示の別の実施形態では、肺腺癌の治療及び／又は肺腺癌を治療するための医薬の調製における上記実施形態に記載された肺腺癌ドライバー遺伝子の使用が提供される。かかる３つの遺伝子ＲＨＰＮ２、ＧＬＩ３、及びＭＲＣ２が、肺腺癌と相関し、特に肺腺癌の形成及び発達と密接に相関している肺腺癌ドライバー遺伝子であることを本発明者らが初めて見出した。かかる３つの肺腺癌ドライバー遺伝子は、肺腺癌の直接又は補助的診断検査において有用であるが、このことはこれまで報告されていない。
本開示の別の実施形態では、被験体が肺腺癌に罹患しているかどうかをインビトロで判定する方法であって、ＲＨＰＮ２、ＧＬＩ３、及びＭＲＣ２遺伝子を含む肺腺癌ドライバー遺伝子のセットが、それぞれ突然変異を有しているかどうかを検出することと、前記肺腺癌ドライバー遺伝子のセットがそれぞれ突然変異を有しているとき、前記被験体が前記肺腺癌に罹患していると判定することとを含み、前記肺腺癌ドライバー遺伝子のセットが、前記被験体の肺の細胞又は組織に由来する方法が実施形態に提供される。
本開示の例では、肺腺癌ドライバー遺伝子のセットがそれぞれ突然変異を有しているかどうかを検出することは、前記ＲＨＰＮ２遺伝子がＶ７３Ｍ突然変異を有しているかどうかを検出することを更に含み、肺腺癌ドライバー遺伝子のセットは、被験体の肺の細胞又は組織に由来する。ＲＨＰＮ２遺伝子におけるＶ７３Ｍ突然変異は、肺腺癌集団においてのみ高発生頻度でみられることが本発明者らによって見出された。これまで報告されていないＲＨＰＮ２遺伝子におけるＶ７３Ｍ突然変異を、肺腺癌に関連する突然変異に焦点を当てた潜在的バイオマーカーとして、特に、東アジア人集団の肺腺癌の診断及び治療における新規バイオマーカーとして使用できることに留意すべきである。
本開示の別の実施形態では、被験体が肺腺癌に罹患しているかどうかを判定する装置が提供される。前記装置は、本開示の上記実施形態又は任意の例に記載の被験体が肺腺癌に罹患しているかどうかをインビトロで判定する方法の一部又は全ての工程を実施するのに好適であり、前記装置は、ＲＨＰＮ２、ＧＬＩ３、及びＭＲＣ２遺伝子を含む肺腺癌ドライバー遺伝子のセットがそれぞれ突然変異を有しているかどうかを検出するようになっている第３の突然変異検出ユニットと、前記第３の突然変異検出ユニットに接続されており、且つ前記肺腺癌ドライバー遺伝子のセットがそれぞれ突然変異を有しているとき、前記被験体が前記肺腺癌に罹患していると判定するようになっている第３の判定ユニットとを含み、前記肺腺癌ドライバー遺伝子のセットは、前記被験体の肺の細胞又は組織に由来する。かかる３つの遺伝子ＲＨＰＮ２、ＧＬＩ３、及びＭＲＣ２が、肺腺癌と相関し、特に肺腺癌の形成及び発達と密接に相関している肺腺癌ドライバー遺伝子であることを本発明者らが初めて見出した。かかる３つの肺腺癌ドライバー遺伝子は、肺腺癌の直接又は補助的診断検査において有用であるが、このことはこれまで報告されていない。
本開示の例では、肺腺癌ドライバー遺伝子のセットがそれぞれ突然変異を有しているかどうかを検出することは、前記ＲＨＰＮ２遺伝子がＶ７３Ｍ突然変異を有しているかどうかを検出することを更に含み、肺腺癌ドライバー遺伝子のセットは、被験体の肺の細胞又は組織に由来する。ＲＨＰＮ２遺伝子におけるＶ７３Ｍ突然変異は、肺腺癌集団においてのみ高発生頻度でみられることが本発明者らによって見出された。これまで報告されていないＲＨＰＮ２遺伝子におけるＶ７３Ｍ突然変異を、肺腺癌に関連する突然変異に焦点を当てた潜在的バイオマーカーとして、特に、東アジア人集団の肺腺癌の診断及び治療における新規バイオマーカーとして使用できることに留意すべきである。
本開示の別の実施形態では、生物学的サンプルが肺腺癌に冒されているかどうかを判定するキットであって、前記生物学的サンプルにおいて、ＲＨＰＮ２、ＧＬＩ３、及びＭＲＣ２遺伝子を含む肺腺癌ドライバー遺伝子のセットがそれぞれ突然変異を有しているかどうかを検出するようになっている試薬と、前記肺腺癌ドライバー遺伝子のセットにおける前記突然変異と前記肺腺癌との間の関係を示すようになっている第２の説明書とを含むキットが提供される。前記第２の説明書は、肺腺癌ドライバー遺伝子のセットがそれぞれ突然変異を有しているとき、被験体が肺腺癌に罹患していると判定することに関する情報を含む。
転移は、肺腺癌の発達に最も重要な事象であるが、転移性原発性肺腺癌患者と非転移性原発性肺腺癌患者との間の突然変異パターンの違いに関する系統的調査は未だ行われていない。リンパ節又は遠位転移性肺腺癌と診断された患者に由来するサンプルと非転移性肺腺癌であると診断された患者に由来するサンプルとを比較することによって、本発明者らは、フィッシャー直接検定を通して、転移性肺腺癌サンプルにおいてＴＰ５３遺伝子の突然変異体の発現のみが有意に多い（Ｐ＜０．０５）ことを見出した（図３を参照）。これは、ＴＰ５３遺伝子が肺腺癌の形成に実質的に関連する癌抑制遺伝子であるだけではなく、肺腺癌の転移も駆動することを示す。したがって、ＴＰ５３遺伝子は、肺腺癌が転移しているかどうかを検出するため、及び治療後の予後を予測するためのバイオマーカーとして使用することができる。
本開示の別の実施形態では、肺腺癌が患者において転移しているかどうかをインビトロで判定する方法であって、前記肺腺癌を有する前記患者の肺の細胞又は組織に由来するＴＰ５３遺伝子の突然変異レベルを検出することと、前記ＴＰ５３遺伝子の前記突然変異レベルを第２のレファレンスレベルと比較し、前記ＴＰ５３遺伝子の前記突然変異レベルが前記第２のレファレンスレベルと有意に異なるとき、前記肺腺癌が前記患者において転移していると判定することとを含み、前記第２のレファレンスレベルが、非転移性肺腺癌であると診断された患者の肺の細胞又は組織に由来する前記ＴＰ５３遺伝子の突然変異レベルである方法が提供される。
この実施形態では、前記突然変異レベルは、ＴＰ５３遺伝子における突然変異の有無、量、及び種類を含む。本開示の実施形態では、ＴＰ５３遺伝子の突然変異レベルは、次世代シーケンシングによって同定される。具体的には、１以上のサンプルの肺の細胞又は組織から抽出した後、シーケンシングプラットフォームにおけるシーケンシングのためのライブラリ構築に核酸を付し、シーケンシングデータを得る。その後、レファレンス配列にアラインメントし、アラインメント結果に基づいて標的遺伝子における突然変異レベルを同定する、例えば、標的遺伝子における突然変異の有無、並びに存在する場合は前記突然変異の量及び種類を同定することによって、シーケンシングデータを解析する。既存のシーケンシングプラットフォームにおいてライブラリをシーケンスしてもよく、さもなければ、選択されたシーケンシングプラットフォームに従ってライブラリを構築してもよい。利用可能なシーケンシングプラットフォームとしては、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（ＣＧ）ＣＧＡ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ／Ｓｏｌｅｘａ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ、及びＲｏｃｈｅ４５４が挙げられるが、これらに限定されず、どれを選択するかに応じて、シングルエンドリード又はペアードエンドリードからなるライブラリを構築する。アラインメントは、Ｓｈｏｒｔ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ（ＳＯＡＰ）、ＢＷＡ等のソフトウェアを用いて実施することができるが、本明細書では限定されない。アラインメントのプロセスでは、アラインメントパラメータの設定に応じて、例えば、シーケンシングデータにおける各リードについての許容可能な最大ミスマッチとしてｈ（好ましくは１又は２）が設定され、含有するミスマッチ塩基がｈよりも多いリードは、レファレンス配列に対してマッピングされないリードであると解釈される。アラインメント結果は、リードがレファレンス配列に対してマッピングされ得るかどうか、リードがマッピングされた位置、特定の部位におけるマッピングされたリードの数、マッピングされたリードの特定の部位における塩基の種類等を含む。前記レファレンス配列は公知の配列であり、同じ生物種のゲノムの公開されているアセンブル配列等、標的個体が属する生物種の任意のレファレンス配列であり得る。核酸サンプルがヒト由来である場合、そのゲノムレファレンス配列（レファレンスゲノムとも称される）は、ＮＣＢＩデータベースによって提供されるＨＧ１９であり得る。ＳＮＰ、ＣＮＶ、及びＩｎＤｅｌのうちの少なくとも１つを含む突然変異の種類は、得られたアラインメント結果に基づいて対応する公知のソフトウェア又はプログラムを用いて同定され得る。例えば、ＳＮＰは、デフォルトパラメータ設定に従ってＳＯＡＰｓｎｐ及びＧＡＴＫ等のソフトウェアを用いて同定することができる。
前記第２のレファレンスレベルは、被験体が肺腺癌に罹患しているかどうかの判定中に検出することができる。例えば、肺腺癌患者に由来する肺の組織又は細胞におけるバイオマーカーの突然変異レベルを検出すると同時に、非転移性肺腺癌であると診断された患者に由来する肺の組織又は細胞における前記バイオマーカーの突然変異レベルも検出する。第２の突然変異レベルは、前もって検出し、将来的に使用するために記録しておいてもよい。本開示の実施形態によれば、第２の突然変異レベルは、前もって検出し、将来的に使用するために記録しておいた非転移性肺腺癌患者に由来する肺の組織又は細胞における前記バイオマーカーの平均突然変異レベルである。
前記「有意な差」又は「有意に異なる」は、差が明白且つ相当であることを示し得る。例えば、第２の突然変異レベルは、突然変異の不在を表し、ＴＰ５３遺伝子の突然変異レベルは、突然変異の存在を表す。別の例では、第２のレファレンスレベルは、ミスセンス突然変異の不在を表し、ＴＰ５３遺伝子の突然変異レベルは、ミスセンス突然変異の存在を表す。更なる例では、第２のレファレンスレベルは、Ｎ突然変異の不在を表し、ＴＰ５３遺伝子の突然変異レベルは、１．５Ｎ、２Ｎ、又はそれ以上の突然変異の存在を表す。前記「有意な差」又は「有意に異なる」は、差が統計的に有意であることを示し得る。
本開示の別の実施形態では、肺腺癌が患者において転移しているかどうかを判定する装置が提供される。前記装置は、本開示の上記実施形態又は任意の例に記載の肺腺癌が患者において転移しているかどうかを判定する方法の一部又は全ての工程を実施するのに好適であり、前記装置は、前記肺腺癌を有する前記患者の肺の細胞又は組織に由来するＴＰ５３遺伝子の突然変異レベルを検出するようになっているＴＰ５３遺伝子検出ユニットと、前記ＴＰ５３遺伝子検出ユニットに接続されており、且つ前記ＴＰ５３遺伝子の前記突然変異レベルを第２のレファレンスレベルと比較し、前記ＴＰ５３遺伝子の前記突然変異レベルが前記第２のレファレンスレベルと有意に異なるとき、前記肺腺癌が前記患者において転移していると判定するようになっている第４の判定ユニットとを含み、前記第２のレファレンスレベルは、非転移性肺腺癌であると診断された患者の肺の細胞又は組織に由来する前記ＴＰ５３遺伝子の突然変異レベルである。本開示の上記実施形態又は任意の例に記載の肺腺癌が患者において転移しているかどうかを判定する方法の技術的特徴又は利点は、この実施形態における肺腺癌が患者において転移しているかどうかを判定する装置にも適用可能であり、このことは本明細書において詳述されない。上記実施形態における肺腺癌が患者において転移しているかどうかを判定する方法の工程は、それぞれがこの実施形態における接続されているサブユニットを含む対応する機能ユニットを用いて実施できることが当業者に理解されるであろう。例えば、前記ＴＰ５３遺伝子検出ユニットは、シーケンシングデータを得るためのシーケンシングサブユニットを含む。
本開示の別の実施形態では、生物学的サンプルが転移性肺腺癌に冒されているかどうかを判定するキットであって、前記生物学的サンプルにおけるＴＰ５３遺伝子の突然変異レベルを検出するようになっている試薬と、前記ＴＰ５３遺伝子の前記突然変異レベルと前記転移性肺腺癌との間の関係を示すようになっている第３の説明書とを含み、前記第３の説明書が、非転移性肺腺癌であると診断された患者の肺の細胞又は組織に由来する前記ＴＰ５３遺伝子の突然変異レベルである第２のレファレンスレベルを含むキットが提供される。前記第３の説明書は、ＴＰ５３遺伝子の突然変異レベルと第２のレファレンスレベルとを比較すること、及び前記ＴＰ５３遺伝子の突然変異が前記第２のレファレンスレベルと有意に異なるとき、肺腺癌が患者において転移していると判定することに関する情報又は操作指示を含む。本開示の上記実施形態又は任意の例に記載の肺腺癌が患者において転移しているかどうかを判定する方法の技術的特徴又は利点は、生物学的サンプルが転移性肺腺癌に冒されているかどうかを判定するキットにも適用可能であり、このことは本明細書において詳述されない。
本開示の別の実施形態では、肺腺癌の治療を受けている患者の予後を予測する方法であって、前記患者の肺の細胞又は組織に由来するＴＰ５３、ＬＲＰ１Ｂ、ＳＴＫ１１、ＫＥＡＰ１、ＢＲＡＦ、ＭＥＴ、及びＭＲＣ２遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つである遺伝子に突然変異が存在するかどうかを検出することと、前記突然変異が前記遺伝子に存在するとき、前記患者が予後不良であると判定することとを含む方法が提供される。前記「予後不良」とは、肺腺癌の治療後の生存時間が野生型患者よりも短い患者を意味する。本明細書において前記「野生型患者」とは、上記７つの遺伝子のいずれにも突然変異が存在しない肺腺癌患者を指す。
肺腺癌であると診断された中国人患者３３５人から得られた肺腺癌サンプルデータを比較することによって、本発明者らは、カプラン・マイヤー生存分析を通して、ＴＰ５３、ＬＲＰ１Ｂ、ＳＴＫ１１、ＫＥＡＰ１、ＢＲＡＦ、ＭＥＴ、及びＭＲＣ２遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つである遺伝子における突然変異が、野生型患者よりも有意に短い生存時間を示すことを見出した（図４を参照）。本明細書において前記「野生型患者」とは、上記７つの遺伝子のいずれにも突然変異が存在しない肺腺癌患者を指す。突然変異を有する上記７つの遺伝子のうちのいずれか１つを、診療において生存予測を補助するためのバイオマーカーとして使用することができる。
この実施形態では、突然変異レベルは、次世代シーケンシングによって同定することができる。具体的には、肺腺癌の治療を受けている１人以上の患者の肺の細胞又は組織から抽出した後、シーケンシングプラットフォームにおけるシーケンシングのためのライブラリ構築に核酸を付し、シーケンシングデータを得る。その後、レファレンス配列にアラインメントし、アラインメント結果に基づいて標的遺伝子における突然変異レベルを同定することによって、シーケンシングデータを解析する。既存のシーケンシングプラットフォームにおいてライブラリをシーケンスしてもよく、さもなければ、選択されたシーケンシングプラットフォームに従ってライブラリを構築してもよい。利用可能なシーケンシングプラットフォームとしては、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（ＣＧ）ＣＧＡ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ／Ｓｏｌｅｘａ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ、及びＲｏｃｈｅ４５４が挙げられるが、これらに限定されず、どれを選択するかに応じて、シングルエンドリード又はペアードエンドリードからなるライブラリを構築する。アラインメントは、Ｓｈｏｒｔ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ（ＳＯＡＰ）、ＢＷＡ等のソフトウェアを用いて実施することができるが、本明細書では限定されない。アラインメントのプロセスでは、アラインメントパラメータの設定に応じて、例えば、シーケンシングデータにおける各リードについての許容可能な最大ミスマッチとしてｈ（好ましくは１又は２）が設定され、含有するミスマッチ塩基がｈよりも多いリードは、レファレンス配列に対してマッピングされないリードであると解釈される。アラインメント結果は、リードがレファレンス配列に対してマッピングされ得るかどうか、リードがマッピングされた位置、特定の部位におけるマッピングされたリードの数、マッピングされたリードの特定の部位における塩基の種類等を含む。前記レファレンス配列は公知の配列であり、同じ生物種のゲノムの公開されているアセンブル配列等、標的個体が属する生物種の任意のレファレンス配列であり得る。核酸サンプルがヒト由来である場合、そのゲノムレファレンス配列（レファレンスゲノムとも称される）は、ＮＣＢＩデータベースによって提供されるＨＧ１９であり得る。ＳＮＰ、ＣＮＶ、及びＩｎＤｅｌのうちの少なくとも１つを含む突然変異の種類は、得られたアラインメント結果に基づいて対応する公知のソフトウェア又はプログラムを用いて同定され得る。例えば、ＳＮＰは、デフォルトパラメータ設定に従ってＳＯＡＰｓｎｐ及びＧＡＴＫ等のソフトウェアを用いて同定することができる。
本開示の幾つかの実施形態では、前記突然変異が前記遺伝子に存在するときに前記患者が予後不良であると判定するという場合、前記突然変異はミスセンス突然変異である。
本開示の別の実施形態では、肺腺癌の治療を受けている患者の予後を予測する装置が提供される。前記装置は、本開示の上記実施形態又は任意の例に記載の肺腺癌の治療を受けている患者の予後を予測する方法の一部又は全ての工程を実施するのに好適であり、前記装置は、前記患者の肺の細胞又は組織に由来するＴＰ５３、ＬＲＰ１Ｂ、ＳＴＫ１１、ＫＥＡＰ１、ＢＲＡＦ、ＭＥＴ、及びＭＲＣ２遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つである遺伝子の突然変異レベルを検出するようになっている第４の突然変異検出ユニットと、前記第４の突然変異検出ユニットに接続されており、且つ前記突然変異が前記遺伝子に存在するとき、前記患者が予後不良であると判定するようになっている第５の判定ユニットとを含む。前記「予後不良」とは、肺腺癌の治療後の生存時間が野生型患者よりも短い患者を意味する。本明細書において前記「野生型患者」とは、上記７つの遺伝子のいずれにも突然変異が存在しない肺腺癌患者を指す。本開示の上記実施形態又は任意の例に記載の肺腺癌の治療を受けている患者の予後を予測する方法の技術的特徴又は利点は、この実施形態における肺腺癌の治療を受けている患者の予後を予測する装置にも適用可能であり、このことは本明細書において詳述されない。上記実施形態における肺腺癌の治療を受けている患者の予後を予測する方法の工程は、それぞれがこの実施形態における接続されているサブユニットを含む対応する機能ユニットを用いて実施できることが当業者に理解されるであろう。
本開示の別の実施形態では、肺腺癌の治療を受けている患者の予後を予測するキットであって、前記患者の肺の細胞又は組織に由来するＴＰ５３、ＬＲＰ１Ｂ、ＳＴＫ１１、ＫＥＡＰ１、ＢＲＡＦ、ＭＥＴ、及びＭＲＣ２遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つである遺伝子に突然変異が存在するかどうかを検出するようになっている試薬と、前記突然変異が前記遺伝子に存在するとき、前記患者が予後不良であることを示すようになっている第４の説明書とを含むキットが提供される。前記「予後不良」とは、肺腺癌の治療後の生存時間が野生型患者よりも短い患者を意味する。本明細書において前記「野生型患者」とは、上記７つの遺伝子のいずれにも突然変異が存在しない肺腺癌患者を指す。本開示の上記実施形態又は任意の例に記載の肺腺癌の治療を受けている患者の予後を予測する方法の技術的特徴又は利点は、この実施形態における肺腺癌の治療を受けている患者の予後を予測するキットにも適用可能であり、このことは本明細書において詳述されない。
本開示の実施形態では、肺腺癌の治療を受けている患者の予後を予測する方法であって、前記患者の肺の細胞又は組織に由来するＩＱＧＡＰ３遺伝子の発現レベルを検出することと、前記ＩＱＧＡＰ３遺伝子の前記発現レベルを第３のレファレンスレベルと比較し、前記ＩＱＧＡＰ３遺伝子の前記発現レベルが前記第３のレファレンスレベルと有意に異なるとき、前記患者が予後不良であると判定することとを含み、前記第３のレファレンスレベルが、予後良好の患者の肺の細胞又は組織に由来するＩＱＧＡＰ３遺伝子の発現レベルである方法が提供される。本明細書では、患者の予後が良好であるか不良であるかは、生存期間がより長い又はより短いことに依存することに留意すべきである。前記「予後不良」とは、肺腺癌の治療後の生存時間が野生型患者よりも短い患者を意味する。本明細書において前記「野生型患者」とは、ＩＱＧＡＰ３遺伝子が有意に高いレベルでは発現していない肺腺癌患者を指す。
ＩＱＧＡＰ３遺伝子は、肺腺癌サンプルにおいて高いレベルで発現する、本発明者らによって見出された新規肺腺癌ドライバー遺伝子である。本発明者らは、更に、ＩＱＧＡＰ３遺伝子の高い発現レベルが、より短い全生存期間及び無病生存期間と有意に相関していることを見出した（図５及び６を参照）。これは、その高い発現レベルが予後不良と顕著に相関していることを示唆する。したがって、ＩＱＧＡＰ３遺伝子は、肺腺癌を正確に検出し、予後を評価するためのバイオマーカーとして使用することができる。
この実施形態では、ＩＱＧＡＰ３遺伝子の発現レベルは、次世代シーケンシングによって同定することができる。具体的には、１以上のサンプルの肺の細胞又は組織から抽出した後、シーケンシングプラットフォームにおけるシーケンシングのためのライブラリ構築に核酸を付し、シーケンシングデータを得る。その後、レファレンス配列にアラインメントし、アラインメント結果に基づいて標的遺伝子における突然変異レベルを同定することによって、シーケンシングデータを解析する。既存のシーケンシングプラットフォームにおいてライブラリをシーケンスしてもよく、さもなければ、選択されたシーケンシングプラットフォームに従ってライブラリを構築してもよい。利用可能なシーケンシングプラットフォームとしては、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（ＣＧ）ＣＧＡ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ／Ｓｏｌｅｘａ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ、及びＲｏｃｈｅ４５４が挙げられるが、これらに限定されず、どれを選択するかに応じて、シングルエンドリード又はペアードエンドリードからなるライブラリを構築する。アラインメントは、Ｓｈｏｒｔ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ（ＳＯＡＰ）、ＢＷＡ等のソフトウェアを用いて実施することができるが、本明細書では限定されない。アラインメントのプロセスでは、アラインメントパラメータの設定に応じて、例えば、シーケンシングデータにおける各リードについての許容可能な最大ミスマッチとしてｈ（好ましくは１又は２）が設定され、含有するミスマッチ塩基がｈよりも多いリードは、レファレンス配列に対してマッピングされないリードであると解釈される。アラインメント結果は、リードがレファレンス配列に対してマッピングされ得るかどうか、リードがマッピングされた位置、特定の部位におけるマッピングされたリードの数、マッピングされたリードの特定の部位における塩基の種類等を含む。前記レファレンス配列は公知の配列であり、同じ生物種のゲノムの公開されているアセンブル配列等、標的個体が属する生物種の任意のレファレンス配列であり得る。核酸サンプルがヒト由来である場合、そのゲノムレファレンス配列（レファレンスゲノムとも称される）は、ＮＣＢＩデータベースによって提供されるＨＧ１９であり得る。
本開示の例では、発現レベルは、以下の式によって表されるＲＰＫＭ法によって計算される：
（式中、Ｃは、標的遺伝子にマッピングされたリードの数を表し、Ｎは、ゲノムにマッピングされたリードの総数を表し、Ｌは、標的遺伝子のエクソン長を表す）。
前記第３のレファレンスレベルは、肺腺癌の治療を受けている患者の予後の判定中に検出することができる。例えば、肺腺癌の治療を受けている患者の肺の細胞又は組織に由来するＩＱＧＡＰ３遺伝子の発現レベルを検出すると同時に、予後良好な肺腺癌の治療を受けた患者の肺の細胞又は組織に由来するＩＱＧＡＰ３遺伝子の発現レベルも検出する。第３のレファレンスレベルは、前もって検出し、将来的に使用するために記録しておいてもよい。本開示の実施形態では、第３のレファレンスレベルは、前もって検出し、将来的に使用するために記録しておいた、予後良好な肺腺癌の治療を受けた患者の肺の細胞又は組織に由来するＩＱＧＡＰ３遺伝子の平均突然変異レベルである。
前記「有意な差」又は「有意に異なる」は、差が明白且つ相当であることを示し得る。例えば、第３のレファレンスレベルは、ＩＱＧＡＰ３遺伝子の発現レベルがＫであることを表し、ＩＱＧＡＰ３遺伝子の検出された発現レベルは、１．５Ｋ、２Ｋ、又はそれ以上であることを表す。前記「有意な差」又は「有意に異なる」は、差が統計的に有意であることを示し得る。
本開示の実施形態では、肺腺癌の治療を受けている患者の予後を予測する装置が提供される。前記装置は、本開示の上記実施形態又は任意の例に記載の肺腺癌の治療を受けている患者の予後を予測する方法の一部又は全ての工程を実施するのに好適であり、前記装置は、前記患者の肺の細胞又は組織に由来するＩＱＧＡＰ３遺伝子の発現レベルを検出するようになっているＩＱＧＡＰ３遺伝子検出ユニットと、前記ＩＱＧＡＰ３遺伝子検出ユニットに接続されており、且つ前記ＩＱＧＡＰ３遺伝子の前記発現レベルを第３のレファレンスレベルと比較し、前記ＩＱＧＡＰ３遺伝子の前記発現レベルが前記第３のレファレンスレベルと有意に異なるとき、前記患者が予後不良であると判定するようになっている第６の判定ユニットとを含み、前記第３のレファレンスレベルは、予後良好の患者の肺の細胞又は組織に由来する前記ＩＱＧＡＰ３遺伝子の発現レベルである。本明細書では、患者の予後が良好であるか不良であるかは、生存期間がより長い又はより短いことに依存することに留意すべきである。前記「予後不良」とは、肺腺癌の治療後の生存時間が野生型患者よりも短い患者を意味する。本明細書において前記「野生型患者」とは、ＩＱＧＡＰ３遺伝子が有意に高いレベルでは発現していない肺腺癌患者を指す。本開示の上記実施形態又は任意の例に記載の肺腺癌の治療を受けている患者の予後を予測する方法の技術的特徴又は利点は、この実施形態における肺腺癌の治療を受けている患者の予後を予測する装置にも適用可能であり、このことは本明細書において詳述されない。上記実施形態における肺腺癌の治療を受けている患者の予後を予測する方法の工程は、それぞれがこの実施形態における接続されているサブユニットを含む対応する機能ユニットを用いて実施できることが当業者に理解されるであろう。
本開示の実施形態では、肺腺癌の治療を受けている患者の予後を予測するキットであって、前記患者の肺の細胞又は組織に由来するＩＱＧＡＰ３遺伝子の発現レベルを検出するようになっている試薬と、前記ＩＱＧＡＰ３遺伝子の前記発現レベルと前記予後との間の関係を示すようになっている第５の説明書とを含み、前記第５の説明書が第３のレファレンスレベルを含み、前記第３のレファレンスレベルが、予後良好の患者の肺の細胞又は組織に由来する前記ＩＱＧＡＰ３遺伝子の発現レベルであるキットが提供される。前記「予後不良」とは、肺腺癌の治療後の生存時間が野生型患者よりも短い患者を意味する。本明細書において前記「野生型患者」とは、ＩＱＧＡＰ３遺伝子が有意に高いレベルでは発現していない肺腺癌患者を指す。前記第５の説明書は、ＩＱＧＡＰ３遺伝子の発現レベルと第３のレファレンスレベルとを比較すること、及び前記肺腺癌の治療を受けている患者が予後不良であると判定することに関する情報又は操作指示を含む。本開示の上記実施形態又は任意の例に記載の肺腺癌の治療を受けている患者の予後を予測する方法の技術的特徴又は利点は、この実施形態における肺腺癌の治療を受けている患者の予後を予測するキットにも適用可能であり、このことは本明細書において詳述されない。
本開示の以下の実施例を詳細に参照する。本明細書に記載される実施例は、例示的、例証的であり、本開示を一般的に理解するために使用される。実施例は、本開示を限定すると解釈してはならない。
特に指定しない限り、以下の実施例に含まれる試薬、機器、又はソフトウェアは、全て市販されており、例えば、シーケンシングライブラリを調製するためのキットは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから購入され、ライブラリは、キットの指示書に従って構築される。
図７は、現代の分子生物学の技術を用いて肺腺癌に関連する様々なバイオマーカーを本発明者らが同定したフローチャートを要約する。具体的には、早期肺腺癌又は転移性肺腺癌を有する中国人集団に由来するサンプルから抽出した後、フラグメンテーション、末端修復、アダプターライゲーション、全ゲノム増幅、及び更なる増幅後に構築されるトランスクリプトームライブラリを用いるエクソンキャプチャを含む、核酸ライブラリ構築のために核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を使用した。その後、ハイスループットシーケンシングプラットフォームを用いて得られたシーケンシングデータを、早期肺腺癌又は転移性肺腺癌と診断された患者についての全ゲノムシーケンシングデータ、トランスクリプトームシーケンシングデータ、エクソンシーケンシングデータのアラインメントを含む、生物学的情報ソフトウェアを用いて処理し、そこから、肺腺癌の発症、発達、及び予後に高度に関連する遺伝子を、中国人集団に対して肺腺癌を標的とする有効なバイオマーカーとして使用できることが証明された。
１． サンプルの収集及び核酸の抽出
患者のインフォームドコンセントの下、病院から臨床サンプルを収集した。具体的には、肺腺癌サンプル、転移が生じている場合は転移性肺腺癌に冒されているリンパ節サンプル、及び肺腺癌に隣接する肺腺癌を有しないサンプル（側癌性組織）を、肺腺癌（原発性肺腺癌又はリンパ節転移性肺腺癌）の存在を判定するための病理学的解析、例えば、病理学的分類；腫瘍、リンパ節、及び転移（ＴＮＭ）分類；並びに腫瘍細胞構造のために収集した。収集した後、将来科学的に使用するために、臨床サンプルを一度に液体窒素中に保存した。
ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ Ｃｏ Ｌｔｄ）を用いて、臨床サンプルから全ゲノムＤＮＡを抽出した。ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏ Ｌｔｄ）を用いて、臨床サンプルから全ＲＮＡを抽出した。アガロースゲル電気泳動及びＡｇｉｌｅｎｔ ２１００によって、得られたＤＮＡ／ＲＮＡサンプルを測定し、定量した。ＤＮＡ／ＲＮＡサンプルが１人の同じ患者に由来していることを保証するために、２１対の一塩基多型（ＳＮＰ）部位をＭｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙによって確認した。
２． 全ゲノム、トランスクリプトーム、及びエクソームライブラリの構築及びそのシーケンシング
２．１ 全ゲノムライブラリ
全ゲノムＤＮＡサンプル２μｇ〜３μｇを、Ｃｏｖａｒｉａｓ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃａｔｏｒによって約５００ｂｐのＤＮＡ断片に無作為に断片化し、これを用いて、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｋｌｅｎｏｗ断片、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ、及びヌクレオチドリン酸塩の存在下における末端修復；Ｋｌｅｎｏｗ酵素（３’−５’エクソ）を用いる、修復されたＤＮＡ断片の３’末端のリン酸化；及びシトシンの代わりに５’−メチルシトシンを用いて合成されたＰＥインデックスアダプターへのＴ４ ＤＮＡリガーゼによるライゲーションを含む標準的なＩｌｌｕｍｉｎａ Ｐａｉｒｅｄ−Ｅｎｄプロトコールに従ってライブラリを構築した。上記各工程後に、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ Ｃｏ Ｌｔｄ）を用いて精製を行った。
２．２ 全エクソームライブラリ
先ず、全ゲノムＤＮＡサンプル３μｇを、２．１に記載の通り断片化した。得られたＤＮＡ断片にＰＥインデックスアダプターをライゲートした後、ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ｔａｒｇｅｔ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ＳｙｓｔｅｍのＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ｈｕｍａｎ Ｗｈｏｌｅ ｅｘｏｎ ５０Ｍｂ Ｋｉｔによって、これら断片を含有するエクソン領域をキャプチャし、濃縮し、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングのための２００ｂｐのペアードエンドリードからなる全エクソームライブラリを構築した。
２．３ トランスクリプトームライブラリ
３７℃で３０分間ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ Ｉ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を用いて残存ＤＮＡを除去した後、オリゴ（ｄＴ）（ポリ（Ａ）テールを用いてｍＲＮＡを捕捉するため）、ランダムプライマー、及びトランスクリプターゼの存在下で、ＲＮＡサンプル２０μｇをｃＤＮＡの第１の鎖に逆転写し、続いて、ＲＮａｓｅ Ｈ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｉ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を添加して、ｃＤＮＡの第２の鎖を合成した。製造業者の指示書に従ってｃＤＮＡライブラリの構築を完了した。
２．４ シーケンシングプラットフォームにおけるシーケンシング
構築後、被覆度が原発性肺腺癌サンプルについては５０×、側癌性組織については３０×であるような高深度で、上記３つのシーケンシングライブラリをＨｉｓｅｑ２０００シーケンシングプラットフォームにおいて別々にシーケンスした。
３． データ解析
３．１ データフィルタリング
上記シーケンスの完了後、まず、アダプター配列を含有するシーケンスリード、並びに例えば未知塩基を１０％超含有するリード及びｑ値＞５である塩基を５０％超含有するリード等の低品質リードを除去することを含む、Ｃｕｔａｄａｐｔソフトウェア（ｖ１．８）（ｈｔｔｐ：／／ｃｕｔａｄａｐｔ．ｒｅａｄｔｈｅｄｏｃｓ．ｏｒｇ／ｅｎ／ｌａｔｅｓｔ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）によるシーケンス生データのフィルタリングを行った。以下のデータ解析は全て、フィルタリング後のデータに基づいている。
３．２ 全ゲノム及び全エクソームのデータ解析
３．２．１ 高品質のＰＥリードを、ＢＷＡソフトウェア（ｖ０．５．９）（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏ−ｂｗａ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ／）を使用してＵＣＳＣデータベース（ｆｔｐ：／／ｈｇｄｏｗｎｌｏａｄ．ｃｓｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／ｇｏｌｄｅｎＰａｔｈ／ｈｇ１９／ｂｉｇＺｉｐｓ／ｃｈｒｏｍＦａ．ｔａｒ．ｇｚ）由来のｈｇ１９レファレンス配列にアラインメントして、ＳＡＭフォーマット（ｈｔｔｐ：／／ｓａｍｔｏｏｌｓ．ｇｉｔｈｕｂ．ｉｏ／ｈｔｓ−ｓｐｅｃｓ／ＳＡＭｖ１．ｐｄｆ）のアラインメント結果を得た。
３．２．２ ＳＡＭフォーマットのアラインメント結果を、Ｓａｍｔｏｏｌｓソフトウェア（ｖ０．１．１８）（ｈｔｔｐ：／／ｓａｍｔｏｏｌｓ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ／）を使用してＢＡＭフォーマットに転換し、続いて、座標系に従ってランキングした。
３．２．３ ＰＣＲ増幅中に得られた繰り返し配列を、Ｐｉｃａｒｄソフトウェア（ｖ１．５４）（ｈｔｔｐ：／／ｐｉｃａｒｄ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ／）を使用して除去した。
３．２．４． Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｏｏｌｋｉｔソフトウェア（ＧＡＴＫ）（ｖ１．０．６０７６）（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｇａｔｋ／）を使用して、Ｉｎｄｅｌに隣接する配列を局所的に再配置した。
上記基礎解析後、（１）ＭｕｔＴｅｃｔソフトウェア（ｖ１．１．４）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｃａｎｃｅｒ／ｃｇａ／ｍｕｔｅｃｔ）を使用して点突然変異を決定し；（２）次いで、体細胞において決定されているインサート及びデリーション（Ｉｎｄｅｌ）を用い、Ｐｌａｔｙｐｕｓソフトウェア（ｖ０．７．９．１）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｅｌｌ．ｏｘ．ａｃ．ｕｋ／ｐｌａｔｙｐｕｓ）を使用して、早期肺腺癌と肺腺癌を有しない組織との間及び転移性肺腺癌組織と腺癌を有しない組織との間で点突然変異をペアワイズに解析し；（３）体細胞において決定されたコピー数の変動を用い、ＳｅｇＳｅｑアルゴリズム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｃａｎｃｅｒ／ｃｇａ／ｓｅｇｓｅｑ）を使用して、早期肺腺癌と肺腺癌を有しない組織との間及び転移性肺腺癌組織と腺癌を有しない組織との間で点突然変異をペアワイズに解析し；（４）次いで、体細胞において決定された構造変動を用い、ＣＲＥＳＴソフトウェア（ｖ１．０）（ｗｗｗ．ｓｔｊｕｄｅｒｅｓｅａｒｃｈ．ｏｒｇ／ｓｉｔｅ／ｌａｂ／ｚｈａｎｇ）を使用して、早期肺腺癌と肺腺癌を有しない組織との間及び転移性肺腺癌組織と腺癌を有しない組織との間で点突然変異をペアワイズに解析した。ＡＮＮＯＶＡＲソフトウェア（２０１１Ｏｃｔ０２）（ｈｔｔｐ：／／ａｎｎｏｖａｒ．ｏｐｅｎｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｏｒｇ／ｅｎ／ｌａｔｅｓｔ／）を使用して、上記変動確定の全てにアノテーションを付けた。
統計プログラムによる解析、肺腺癌ドライバー遺伝子を予測するモデルの構築、各突然変異の統計的有意性の計算、及び突然変異と肺腺癌との間の相関の評価によって、肺腺癌に関連する重要な突然変異を有する遺伝子の同定を行った。突然変異スコアのバックグラウンド分布及びサンプルに亘って観察された突然変異スコアの検定統計量と共に、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ法を用いて偽発見率（ＦＤＲ）を決定した。次の解析のためにＦＤＲ（ｑ値）＜０．１の遺伝子のみを選択した。次に、ＭｕｔＳｉｇＣＶソフトウェア（ｖ１．４）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｃａｎｃｅｒ／ｃｇａ／ｍｕｔｓｉｇ）を使用して有意に突然変異している遺伝子の予測を実施した。
３．３ トランスクリプトームのデータ解析
データのアラインメント
フィルタリング後のデータを、ＳＯＡＰ２ソフトウェア（ｖ２．２１）（ｈｔｔｐ：／／ｓｏａｐ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎ／ｓｏａｐａｌｉｇｎｅｒ．ｈｔｍｌ）を使用して、ｈｇ１９レファレンス配列（ＵＣＳＣデータベースからダウンロード、ｆｔｐ：／／ｈｇｄｏｗｎｌｏａｄ．ｃｓｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／ｇｏｌｄｅｎＰａｔｈ／ｈｇ１９／ｂｉｇＺｉｐｓ／ｃｈｒｏｍＦａ．ｔａｒ．ｇｚ）及びそのトランスクリプトーム配列（ＵＣＳＣデータベースからダウンロード、ｆｔｐ：／／ｈｇｄｏｗｎｌｏａｄ．ｃｓｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／ｇｏｌｄｅｎＰａｔｈ／ｈｇ１９／ｄａｔａｂａｓｅ／ｒｅｆＧｅｎｅ．ｔｘｔ．ｇｚ）にアラインメントし、各リードにつき最大５個の不一致は許容可能であった。各遺伝子の発現レベルは、以下の式に従ってＲＰＫＭ法によって計算される：
（式中、Ｃは、標的遺伝子にマッピングされたリードの数を表し、Ｎは、ゲノムにマッピングされたリードの総数を表し、Ｌは、標的遺伝子のエクソン長を表す）。
４． 結果
３３５個の原発性肺腺癌サンプル、３５個の転移性肺腺癌に冒されているリンパ節サンプル、及び肺腺癌を有しない組織サンプルについての網羅的解析により、本発明者らは、突然変異遺伝子の発生頻度、長さ、生物学的機能等を総合的に解析して、肺腺癌に関連する以下のバイオマーカーを同定した。これらバイオマーカーと肺腺癌との間の前記相関は、本方法による検出と臨床診断との間で９０％結果が一致していたことから更に確認された。結果として、これらバイオマーカーは、肺腺癌が存在するかどうか及び／又は肺腺癌が転移しているかどうかの判定において有用であり得る。
４．１ 病原性肺腺癌ドライバー遺伝子
上記実験及びデータ解析（図１及び図２Ａ〜２Ｃを参照）を通して、本発明者らは、全ての肺腺癌サンプルの中から、ＴＰ５３、ＥＧＦＲ、ＬＲＰ１Ｂ、ＫＲＡＳ、ＰＴＰＲＤ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ２、ＰＩＫ３ＣＡ、ＢＲＡＦ、ＦＬＴ１、ＲＨＰＮ２、ＧＬＩ３、及びＭＲＣ２を含む１３個の遺伝子のいずれかに統計的に有意な突然変異が存在することを明らかにした。これらは本明細書では病原遺伝子とも称される。各病原遺伝子の突然変異の種類を図２に示す。
本発明者らは、肺腺癌の中国人集団において、突然変異が任意のこれら遺伝子に顕著な発生頻度で存在することを見出した。これは、これら遺伝子が肺腺癌の発病と相関しているので、肺腺癌の発症についての診断検査において使用できる可能性があることを示唆する。これら１３個の遺伝子のいずれか１つ又は任意の組合せは、肺腺癌の発病の可能性の検出、例えば、早期肺腺癌の診断検査に有用である。
本発明者らは、肺腺癌の中国人集団の４４％についてＴＰ５３遺伝子に統計学的に有意な突然変異が存在することを見出した（図１及び２Ａを参照）。これは、肺腺癌を検出するためのバイオマーカーとしてかかる遺伝子を使用できることを示唆する。
また、肺腺癌の中国人集団の３９％についてＥＧＦＲ遺伝子に統計学的に有意な突然変異が存在することが本発明者らによって実証された（図１及び２Ａを参照）。これは、非喫煙者及び女性により一般的である。更に、白人由来のデータと比較すると、ＥＧＦＲ遺伝子における突然変異はＫＲＡＳ遺伝子よりも高頻度で生じている。更に、ＥＧＦＲ遺伝子における突然変異は、チロシンキナーゼ阻害剤についての治療感受性部位であるＬｅｕ８５８Ａｒｇ部位及びｅｘｏｎ１９ｄｅｌ部位で主に生じることが示された。これは、肺腺癌の検出又は標的療法においてバイオマーカーとしてかかる遺伝子を使用できることを示唆する。
更に、肺腺癌の中国人集団の１９％についてＬＲＰ１Ｂ遺伝子に統計学的に有意な突然変異が存在することが本発明者らによって明らかになった（図１及び２Ａを参照）。これは、肺腺癌を検出するためのバイオマーカーとしてかかる遺伝子を使用できることを示唆する。
更に、肺腺癌の中国人集団の１１％についてＫＲＡＳ遺伝子に統計学的に有意な突然変異が存在することが本発明者らによって示された（図１及び２Ｂを参照）。これは、肺腺癌を検出するためのバイオマーカーとしてかかる遺伝子を使用できることを示唆する。
更に、肺腺癌の中国人集団の７％についてＰＴＰＲＤ遺伝子に統計学的に有意な突然変異が存在することが本発明者らによって見出された（図１及び２Ｂを参照）。これは、肺腺癌を検出するためのバイオマーカーとしてかかる遺伝子を使用できることを示唆する。
更に、肺腺癌の中国人集団の５％についてＰＩＫ３ＣＡ遺伝子に統計学的に有意な突然変異が存在することが本発明者らによって示された（図１及び２Ｂを参照）。これは、肺腺癌を検出するためのバイオマーカーとしてかかる遺伝子を使用できることを示唆する。
更に、肺腺癌の中国人集団の５％についてＲＨＰＮ２遺伝子に統計学的に有意な突然変異が存在することが本発明者らによって証明された（図１及び２Ｂを参照）。これは、肺腺癌を検出するためのバイオマーカーとしてかかる遺伝子を使用できることを示唆する。
更に、肺腺癌の中国人集団の４％についてＳＴＫ１１遺伝子に統計学的に有意な突然変異が存在することが本発明者らによって見出された（図１及び２Ｂを参照）。これは、肺腺癌を検出するためのバイオマーカーとしてかかる遺伝子を使用できることを示唆する。
更に、肺腺癌の中国人集団の４％についてＢＲＡＦ遺伝子に統計学的に有意な突然変異が存在することが本発明者らによって証明された（図１及び２Ｃを参照）。これは、肺腺癌を検出するためのバイオマーカーとしてかかる遺伝子を使用できることを示唆する。
更に、肺腺癌の中国人集団の４％についてＧＬＩ３遺伝子に統計学的に有意な突然変異が存在することが本発明者らによって明らかになった（図１及び２Ｃを参照）。これは、肺腺癌を検出するためのバイオマーカーとしてかかる遺伝子を使用できることを示唆する。
更に、肺腺癌の中国人集団の３％についてＦＬＴ１遺伝子に統計学的に有意な突然変異が存在することが本発明者らによって示された（図１及び２Ｃを参照）。これは、肺腺癌を検出するためのバイオマーカーとしてかかる遺伝子を使用できることを示唆する。
更に、肺腺癌の中国人集団の２％についてＭＲＣ２遺伝子（ｕＰＡＲＡＰ、Ｅｎｄｏ１８０、又はＣＤ２８０とも称される）に統計学的に有意な突然変異が存在することが本発明者らによって示された（図１及び２Ｃを参照）。これは、肺腺癌を検出するためのバイオマーカーとしてかかる遺伝子を使用できることを示唆する。
更に、肺腺癌の中国人集団の２％についてＳＭＡＤ２遺伝子に統計学的に有意な突然変異が存在することが本発明者らによって証明された（図１及び２Ｃを参照）。これは、肺腺癌を検出するためのバイオマーカーとしてかかる遺伝子を使用できることを示唆する。
肺腺癌に関係する重要な突然変異を有する上記遺伝子に加えて、本発明者らは、更に、ＡＰＣ、ＫＥＡＰ１、ＡＴＦ７ＩＰ、ＩＴＩＨ５、ＩＱＧＡＰ３、ＭＥＴ、ＥＲＢＢ２、及びＴＥＲＴを含む重要ではない突然変異を有する他の遺伝子も機能において発癌遺伝子であり得ることを見出した（図１、２Ｄ、及び２Ｅを参照）。
４．２ 新規肺腺癌ドライバー遺伝子
ＲＨＰＮ２、ＧＬＩ３、及びＭＲＣ２遺伝子が、肺腺癌と高度に相関する３つの肺腺癌ドライバー遺伝子であることを本発明者らが初めて見出した。特に、これまで報告されていなかったＲＨＰＮ２遺伝子におけるＶ７３Ｍ突然変異を、肺腺癌に関連する突然変異に焦点を当てた潜在的バイオマーカーとして、特に、東アジア人集団の肺腺癌の診断及び治療における新規バイオマーカーとして使用できる。
４．３ 肺腺癌が転移しているかどうかを検出するためのバイオマーカーとしてのＴＰ５３遺伝子
転移は、肺腺癌の発達に最も重要な事象であるが、転移性原発性肺腺癌患者と非転移性原発性肺腺癌患者との間の突然変異パターンの違いに関する系統的調査は未だ行われていない。リンパ節又は遠位転移性肺腺癌と診断された患者に由来するサンプルと非転移性肺腺癌であると診断された患者に由来するサンプルとを比較することによって、本発明者らは、フィッシャー直接検定を通して、転移性肺腺癌サンプルにおいてＴＰ５３遺伝子の突然変異体の発現のみが有意に多い（Ｐ＜０．０５）ことを見出した（図３を参照）。これは、ＴＰ５３遺伝子が肺腺癌の形成に実質的に関連する癌抑制遺伝子であるだけではなく、肺腺癌の転移も駆動することを示す。したがって、ＴＰ５３遺伝子は、肺腺癌が転移しているかどうかを検出するため及び治療後の予後を予測するためのバイオマーカーであることが本発明者によって提唱される。
４．４ 遺伝子における突然変異と臨床的特徴との間の相関
本発明者らは、フィッシャー直接検定を通して、ＥＧＦＲ遺伝子における突然変異は非喫煙患者と有意に相関しているが、ＬＲＰ１Ｂ、ＫＲＡＳ、ＰＴＰＲＤ、ＧＬＩ３、及びＫＥＡＰ１遺伝子のいずれかにおける突然変異は喫煙患者と有意に相関していることを見出した。同様に、フィッシャー直接検定を通して、ＥＧＦＲ遺伝子における突然変異は女性患者と有意に相関しているが、ＬＲＰ１Ｂ、ＡＰＣ、ＫＲＡＳ、ＰＴＰＲＤ、ＫＥＡＰ１、ＩＴＩＨ５、ＦＬＴ１、及びＳＴＫ１１遺伝子のいずれかにおける突然変異は男性患者と有意に相関していることを見出した。同様に、本発明者らは、フィッシャー直接検定を通して、ＴＰ５３、ＧＬＩ３、及びＩＴＩＨ５遺伝子における突然変異が、６０歳を超える年齢の患者と有意に相関していることを示した（図３を参照）。
４．５ 診療における肺腺癌の予後を予測するためのバイオマーカー
肺腺癌と診断された中国人患者３３５人のコホート集団から得られた肺腺癌サンプルのデータを比較することによって、本発明者らは、カプラン・マイヤー生存評価を通して、ＴＰ５３、ＬＲＰ１Ｂ、ＳＴＫ１１、ＫＥＡＰ１、ＢＲＡＦ、ＭＥＴ、及びＭＲＣ２遺伝子のいずれか１つから選択される遺伝子における突然変異が、野生型患者よりも有意に短い生存期間を示すことを見出した。本開示では、上記７つの遺伝子のいずれか１つを診療において生存を予測するためのバイオマーカーとして使用できることを提案する（図４を参照）。
４．６ 肺腺癌の予後を予測するための新規バイオマーカー
シーケンシングデータに基づく体細胞突然変異、コピー数の変動、構造変動、遺伝子融合等に関する解析を組み合わせて、本発明者らは、新規肺腺癌ドライバー遺伝子、即ち、肺腺癌サンプルにおいて高レベルで発現しているＩＱＧＡＰ３遺伝子を見出した（図５を参照）。本発明者らは、更に、ＩＱＧＡＰ３遺伝子の高発現レベルがより短い全生存期間及び無病生存期間と有意に相関していることを見出した（図６を参照）。これは、その高い発現レベルが予後不良と顕著に相関していることを示唆する。したがって、ＩＱＧＡＰ３遺伝子は、肺腺癌を正確に検出し、予後を評価するためのバイオマーカーとして使用することができる。
本開示の明細書では、用語「実施形態」、「幾つかの実施形態」、「実施例」、「具体例」、「幾つかの実施例」、又は「特定の実施形態」等は、本開示の少なくとも１つの実施形態又は実施例に含まれる例又は実施形態によって記載されている特定の機構、構造、材料、又は特徴を指すことを意図する。本明細書では、上記用語の概略図は、必ずしも、同じ実施形態又は実施例を指すものではない。更に、記載される特定の機構、構造、材料、又は特徴は、１以上の実施形態又は実施例において任意の好適な方法で組み合わせることができる。
本開示の実施形態について記載してきたが、本開示の原理及び趣旨から逸脱することなしに、これら実施形態において様々な変更、修正、置換、及び改変を行うことができ、本開示の範囲は特許請求の範囲及びその等価物によって規定されることを当業者であれば理解するであろう。

Claims (21)

  1. ＲＨＰＮ２、ＧＬＩ３、及びＭＲＣ２遺伝子を含むことを特徴とする肺腺癌ドライバー遺伝子のセット。
  2. 肺腺癌の治療及び／又は肺腺癌を治療するための医薬の調製における請求項１に記載の肺腺癌ドライバー遺伝子のセットの使用。
  3. 被験体が肺腺癌に罹患しているかどうかをインビトロで判定する方法であって、
    ＲＨＰＮ２、ＧＬＩ３、及びＭＲＣ２遺伝子を含む肺腺癌ドライバー遺伝子のセットが、それぞれ突然変異を有しているかどうかを検出することと、
    前記肺腺癌ドライバー遺伝子のセットがそれぞれ突然変異を有しているとき、前記被験体が前記肺腺癌に罹患していると判定することと
    を含み、
    前記肺腺癌ドライバー遺伝子のセットが、前記被験体の肺の細胞又は組織に由来することを特徴とする方法。
  4. 肺腺癌ドライバー遺伝子のセットがそれぞれ突然変異を有しているかどうかを検出することが、
    前記ＲＨＰＮ２遺伝子がＶ７３Ｍ突然変異を有しているかどうかを検出すること
    を含む請求項３に記載の方法。
  5. 被験体が肺腺癌に罹患しているかどうかを判定する装置であって、
    ＲＨＰＮ２、ＧＬＩ３、及びＭＲＣ２遺伝子を含む肺腺癌ドライバー遺伝子のセットがそれぞれ突然変異を有しているかどうかを検出するようになっている第３の突然変異検出ユニットと、
    前記第３の突然変異検出ユニットに接続されており、且つ前記肺腺癌ドライバー遺伝子のセットがそれぞれ突然変異を有しているとき、前記被験体が前記肺腺癌に罹患していると判定するようになっている第３の判定ユニットと
    を含み、
    前記肺腺癌ドライバー遺伝子のセットが、前記被験体の肺の細胞又は組織に由来することを特徴とする装置。
  6. 肺腺癌ドライバー遺伝子のセットがそれぞれ突然変異を有しているかどうかを検出することが、
    前記ＲＨＰＮ２遺伝子がＶ７３Ｍ突然変異を有しているかどうかを検出すること
    を含む請求項５に記載の装置。
  7. 生物学的サンプルが肺腺癌に冒されているかどうかを判定するキットであって、
    前記生物学的サンプルにおいて、ＲＨＰＮ２、ＧＬＩ３、及びＭＲＣ２遺伝子を含む肺腺癌ドライバー遺伝子のセットがそれぞれ突然変異を有しているかどうかを検出するようになっている試薬と、
    前記肺腺癌ドライバー遺伝子のセットにおける前記突然変異と前記肺腺癌との間の関係を示すようになっている第２の説明書と
    を含むことを特徴とするキット。
  8. 被験体が肺腺癌に罹患しているかどうかをインビトロで判定する方法であって、
    前記被験体の第１の部位における、ＴＰ５３、ＥＧＦＲ、ＬＲＰ１Ｂ、ＫＲＡＳ、ＰＴＰＲＤ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ２、ＰＩＫ３ＣＡ、ＢＲＡＦ、ＦＬＴ１、ＲＨＰＮ２、ＧＬＩ３、及びＭＲＣ２遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つであるバイオマーカーの第１の突然変異レベルを検出することと、
    前記第１の突然変異レベルを第１のレファレンスレベルと比較し、前記第１の突然変異レベルが前記第１のレファレンスレベルと有意に異なるとき、前記被験体が前記肺腺癌に罹患していると判定することと
    を含み、
    前記第１のレファレンスレベルが、肺腺癌を有しない個体の前記第１の部位に対応する部位における前記バイオマーカーの突然変異レベルであることを特徴とする方法。
  9. 被験体が肺腺癌に罹患しているかどうかを判定する装置であって、
    前記被験体の第１の部位における、ＴＰ５３、ＥＧＦＲ、ＬＲＰ１Ｂ、ＫＲＡＳ、ＰＴＰＲＤ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ２、ＰＩＫ３ＣＡ、ＢＲＡＦ、ＦＬＴ１、ＲＨＰＮ２、ＧＬＩ３、及びＭＲＣ２遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つであるバイオマーカーの第１の突然変異レベルを検出するようになっている第１の突然変異検出ユニットと、
    前記第１の突然変異検出ユニットに接続されており、且つ前記第１の突然変異レベルを第１のレファレンスレベルと比較し、前記第１の突然変異レベルが前記第１のレファレンスレベルと有意に異なるとき、前記被験体が前記肺腺癌に罹患していると判定するようになっている第１の判定ユニットと
    を含み、
    前記第１のレファレンスレベルが、肺腺癌を有しない個体の前記第１の部位に対応する部位における前記バイオマーカーの突然変異レベルであることを特徴とする装置。
  10. 生物学的サンプルが肺腺癌に冒されているかどうかを判定するキットであって、
    前記生物学的サンプルにおける、ＴＰ５３、ＥＧＦＲ、ＬＲＰ１Ｂ、ＫＲＡＳ、ＰＴＰＲＤ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ２、ＰＩＫ３ＣＡ、ＢＲＡＦ、ＦＬＴ１、ＲＨＰＮ２、ＧＬＩ３、及びＭＲＣ２遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つであるバイオマーカーの突然変異レベルを検出するようになっている試薬と、
    前記バイオマーカーの前記突然変異レベルと前記肺腺癌との間の関係を示すようになっている第１の説明書と
    を含み、
    任意で、前記第１の説明書が第１のレファレンスレベルを含み、
    前記第１のレファレンスレベルが、肺腺癌を有しない個体の前記生物学的サンプルが由来する部位に対応する部位における前記バイオマーカーの突然変異レベルであることを特徴とするキット。
  11. 被験体が肺腺癌に罹患しているかどうかをインビトロで判定する方法であって、
    前記被験体の第１の部位におけるバイオマーカーの第１の突然変異レベルを検出することと、
    前記被験体の第２の部位における前記バイオマーカーの第２の突然変異レベルを検出することと、
    前記第１の突然変異レベルを前記第２の突然変異レベルと比較し、前記第１の突然変異レベルが前記第２の突然変異レベルと有意に異なるとき、前記被験体が前記肺腺癌に罹患していると判定することと
    を含み、
    前記バイオマーカーが、ＴＰ５３、ＥＧＦＲ、ＬＲＰ１Ｂ、ＫＲＡＳ、ＰＴＰＲＤ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ２、ＰＩＫ３ＣＡ、ＢＲＡＦ、ＦＬＴ１、ＲＨＰＮ２、ＧＬＩ３、及びＭＲＣ２遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つであり、前記第２の部位が、肺腺癌を有しないことを特徴とする方法。
  12. 被験体が肺腺癌に罹患しているかどうかを判定する装置であって、
    前記被験体の第１の部位におけるバイオマーカーの第１の突然変異レベルを検出し、
    前記被験体の第２の部位における前記バイオマーカーの第２の突然変異レベルを検出するようになっている第２の突然変異検出ユニットと、
    前記第２の突然変異検出ユニットに接続されており、且つ前記第１の突然変異レベルを前記第２の突然変異レベルと比較し、前記第１の突然変異レベルが前記第２の突然変異レベルと有意に異なるとき、前記被験体が前記肺腺癌に罹患していると判定するようになっている第２の判定ユニットと
    を含み、
    前記バイオマーカーが、ＴＰ５３、ＥＧＦＲ、ＬＲＰ１Ｂ、ＫＲＡＳ、ＰＴＰＲＤ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＤ２、ＰＩＫ３ＣＡ、ＢＲＡＦ、ＦＬＴ１、ＲＨＰＮ２、ＧＬＩ３、及びＭＲＣ２遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つであり、前記第２の部位が、肺腺癌を有しないことを特徴とする装置。
  13. 肺腺癌が患者において転移しているかどうかをインビトロで判定する方法であって、
    前記肺腺癌を有する前記患者の肺の細胞又は組織に由来するＴＰ５３遺伝子の突然変異レベルを検出することと、
    前記ＴＰ５３遺伝子の前記突然変異レベルを第２のレファレンスレベルと比較し、前記ＴＰ５３遺伝子の前記突然変異レベルが前記第２のレファレンスレベルと有意に異なるとき、前記肺腺癌が前記患者において転移していると判定することと
    を含み、
    前記第２のレファレンスレベルが、非転移性肺腺癌であると診断された患者の肺の細胞又は組織に由来する前記ＴＰ５３遺伝子の突然変異レベルであることを特徴とする方法。
  14. 肺腺癌が患者において転移しているかどうかを判定する装置であって、
    前記肺腺癌を有する前記患者の肺の細胞又は組織に由来するＴＰ５３遺伝子の突然変異レベルを検出するようになっているＴＰ５３遺伝子検出ユニットと、
    前記ＴＰ５３遺伝子検出ユニットに接続されており、且つ前記ＴＰ５３遺伝子の前記突然変異レベルを第２のレファレンスレベルと比較し、前記ＴＰ５３遺伝子の前記突然変異レベルが前記第２のレファレンスレベルと有意に異なるとき、前記肺腺癌が前記患者において転移していると判定するようになっている第４の判定ユニットと
    を含み、
    前記第２のレファレンスレベルが、非転移性肺腺癌であると診断された患者の肺の細胞又は組織に由来する前記ＴＰ５３遺伝子の突然変異レベルであることを特徴とする装置。
  15. 生物学的サンプルが転移性肺腺癌に冒されているかどうかを判定するキットであって、
    前記生物学的サンプルにおけるＴＰ５３遺伝子の突然変異レベルを検出するようになっている試薬と、
    前記ＴＰ５３遺伝子の前記突然変異レベルと前記転移性肺腺癌との間の関係を示すようになっている第３の説明書と
    を含み、
    前記第３の説明書が、非転移性肺腺癌であると診断された患者の肺の細胞又は組織に由来する前記ＴＰ５３遺伝子の突然変異レベルである第２のレファレンスレベルを含むことを特徴とするキット。
  16. 肺腺癌の治療を受けている患者の予後を予測する方法であって、
    前記患者の肺の細胞又は組織に由来するＴＰ５３、ＬＲＰ１Ｂ、ＳＴＫ１１、ＫＥＡＰ１、ＢＲＡＦ、ＭＥＴ、及びＭＲＣ２遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つである遺伝子に突然変異が存在するかどうかを検出することと、
    前記突然変異が前記遺伝子に存在するとき、前記患者が予後不良であると判定することと
    を含むことを特徴とする方法。
  17. 肺腺癌の治療を受けている患者の予後を予測する装置であって、
    前記患者の肺の細胞又は組織に由来するＴＰ５３、ＬＲＰ１Ｂ、ＳＴＫ１１、ＫＥＡＰ１、ＢＲＡＦ、ＭＥＴ、及びＭＲＣ２遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つである遺伝子の突然変異レベルを検出するようになっている第４の突然変異検出ユニットと、
    前記第４の突然変異検出ユニットに接続されており、且つ前記突然変異が前記遺伝子に存在するとき、前記患者が予後不良であると判定するようになっている第５の判定ユニットと
    を含むことを特徴とする装置。
  18. 肺腺癌の治療を受けている患者の予後を予測するキットであって、
    前記患者の肺の細胞又は組織に由来するＴＰ５３、ＬＲＰ１Ｂ、ＳＴＫ１１、ＫＥＡＰ１、ＢＲＡＦ、ＭＥＴ、及びＭＲＣ２遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つである遺伝子に突然変異が存在するかどうかを検出するようになっている試薬と、
    前記突然変異が前記遺伝子に存在するとき、前記患者が予後不良であることを示すようになっている第４の説明書と
    を含むことを特徴とするキット。
  19. 肺腺癌の治療を受けている患者の予後を予測する方法であって、
    前記患者の肺の細胞又は組織に由来するＩＱＧＡＰ３遺伝子の発現レベルを検出することと、
    前記ＩＱＧＡＰ３遺伝子の前記発現レベルを第３のレファレンスレベルと比較し、前記ＩＱＧＡＰ３遺伝子の前記発現レベルが前記第３のレファレンスレベルと有意に異なるとき、前記患者が予後不良であると判定することと
    を含み、
    前記第３のレファレンスレベルが、予後良好の患者の肺の細胞又は組織に由来するＩＱＧＡＰ３遺伝子の発現レベルであることを特徴とする方法。
  20. 肺腺癌の治療を受けている患者の予後を予測する装置であって、
    前記患者の肺の細胞又は組織に由来するＩＱＧＡＰ３遺伝子の発現レベルを検出するようになっているＩＱＧＡＰ３遺伝子検出ユニットと、
    前記ＩＱＧＡＰ３遺伝子検出ユニットに接続されており、且つ前記ＩＱＧＡＰ３遺伝子の前記発現レベルを第３のレファレンスレベルと比較し、前記ＩＱＧＡＰ３遺伝子の前記発現レベルが前記第３のレファレンスレベルと有意に異なるとき、前記患者が予後不良であると判定するようになっている第６の判定ユニットと
    を含み、
    前記第３のレファレンスレベルが、予後良好の患者の肺の細胞又は組織に由来する前記ＩＱＧＡＰ３遺伝子の発現レベルであることを特徴とする装置。
  21. 肺腺癌の治療を受けている患者の予後を予測するキットであって、
    前記患者の肺の細胞又は組織に由来するＩＱＧＡＰ３遺伝子の発現レベルを検出するようになっている試薬と、
    前記ＩＱＧＡＰ３遺伝子の前記発現レベルと前記予後との間の関係を示すようになっている第５の説明書と
    を含み、
    前記第５の説明書が第３のレファレンスレベルを含み、前記第３のレファレンスレベルが、予後良好の患者の肺の細胞又は組織に由来する前記ＩＱＧＡＰ３遺伝子の発現レベルであることを特徴とするキット。
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