JP2018530322A - 治療用ペプチド - Google Patents
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Abstract
本発明は、糖尿病網膜症の治療及び/又は予防のためのペプチドを開示する。本発明のペプチドは、グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)結合配列及び/又はE3ユビキチンリガーゼseven in absentia homolog 1(Siah1)結合配列並びにインターナリゼーション配列を含む。
Description
発明の分野
本発明は、グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)及び/又はE3ユビキチンリガーゼseven in absentia homolog 1(Siah1)に結合するペプチド並びに糖尿病網膜症の治療又は予防におけるその使用に関する。
本発明は、グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)及び/又はE3ユビキチンリガーゼseven in absentia homolog 1(Siah1)に結合するペプチド並びに糖尿病網膜症の治療又は予防におけるその使用に関する。
背景
糖尿病網膜症(DR)は、世界中における失明の主原因であり、その有病率は増加している。DRのための現行の治療法は、疾患の後期だけに対処しており、侵襲性であり、有効性が限られている。網膜周皮細胞の死滅は、DRの初期の病理学的特徴である。これは、糖尿病患者及びDRの動物モデルにおいて観察されているが、周皮細胞の死滅の原因は未知のままである。最近、眼組織からグリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)とE3ユビキチンリガーゼseven in absentia homolog 1(Siah1)との間の相互作用によって開始される新規なアポトーシス促進経路が特定された。
糖尿病網膜症(DR)は、世界中における失明の主原因であり、その有病率は増加している。DRのための現行の治療法は、疾患の後期だけに対処しており、侵襲性であり、有効性が限られている。網膜周皮細胞の死滅は、DRの初期の病理学的特徴である。これは、糖尿病患者及びDRの動物モデルにおいて観察されているが、周皮細胞の死滅の原因は未知のままである。最近、眼組織からグリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)とE3ユビキチンリガーゼseven in absentia homolog 1(Siah1)との間の相互作用によって開始される新規なアポトーシス促進経路が特定された。
本発明によって解決されるべき問題は、糖尿病網膜症の治療又は予防のための新しい治療用ペプチドを提供することであった。
概要
本発明は、グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)結合配列及び/又はE3ユビキチンリガーゼseven in absentia homolog 1(Siah1)結合配列並びにインターナリゼーション配列を含むペプチドを提供する。
本発明は、グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)結合配列及び/又はE3ユビキチンリガーゼseven in absentia homolog 1(Siah1)結合配列並びにインターナリゼーション配列を含むペプチドを提供する。
特定の実施態様では、本発明のペプチドは、N末端から順にインターナリゼーションペプチド並びにGAPDH結合配列及び/又はSiah1結合配列を含む。
本発明の特定の実施態様では、インターナリゼーション配列は、陽イオン性インターナリゼーション配列、好ましくは配列番号3を含む配列である。
特定の実施態様では、本発明のペプチドは、GAPDH結合配列及びインターナリゼーション配列を含む。
特定の実施態様では、本発明のペプチドは、Siah1結合配列及びインターナリゼーション配列を含む。
本発明の特定の実施態様では、GAPDH結合配列は配列番号1を含む。
本発明の特定の実施態様では、Siah1結合配列は配列番号2を含む。
本発明の特定の実施態様では、ペプチドのN末端はアセチル化されている。
本発明の特定の実施態様では、ペプチドのC末端はアミド化されている。
本発明は、また、治療活性物質としての使用のための、特に糖尿病網膜症の処置における使用のための、上記ペプチドに関する。
本発明は、また、上記ペプチド及び治療上不活性な担体を含む医薬組成物に関する。
本発明は、上記ペプチドをコードする核酸配列を含むベクターを提供する。
本発明は、上記ベクターを含む宿主細胞を提供する。
発明の実施態様の詳細な説明
用語「GAPDH」は、本明細書において、任意の動物、例えばヒトを含む哺乳動物種由来の未変性グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼポリペプチド及びGAPDH異種を表すために使用される。ヒトGAPDHポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号4に示す。
用語「GAPDH」は、本明細書において、任意の動物、例えばヒトを含む哺乳動物種由来の未変性グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼポリペプチド及びGAPDH異種を表すために使用される。ヒトGAPDHポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号4に示す。
用語「Siah1」は、本明細書において、任意の動物、例えばヒトを含む哺乳動物種由来の未変性E3ユビキチンリガーゼseven in absentia homolog 1ポリペプチド及びSiah1異種を表すために使用される。ヒトSiah1ポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号5に示す。
用語「GAPDH結合配列」は、本明細書において、GAPDHポリペプチドに結合し、そのことによって、GAPDHポリペプチドとSiah1ポリペプチドとの相互作用を妨害及び/又はブロッキングするペプチド配列を表すために使用される。
用語「Siah1結合配列」は、本明細書において、Siah1ポリペプチドに結合し、そのことによって、Siah1ポリペプチドとGAPDHポリペプチドとの相互作用を妨害及び/又はブロッキングするペプチド配列を表すために使用される。
用語「インターナリゼーション配列」は、本明細書において、そのようなインターナリゼーション配列を含むペプチドの細胞取り込みをもたらすペプチド配列を表すために使用される。
本明細書に使用される用語「ペプチド配列」は、最大50アミノ酸長のアミノ酸配列を表す。
本明細書に使用される用語「アミノ酸」は、カルボキシル基に対してa位に位置するアミノ部分を有する有機分子を意味する。アミノ酸の例には、アルギニン、グリシン、オルニチン、リシン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、イソロイシン、ロイシン、アラニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、セリン、プロリンが含まれる。採用されるアミノ酸は、それぞれの場合に任意でL−型である。
本明細書に使用される用語「ベクター」は、それが連結される別の核酸を増やすことができる核酸分子を表す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター及び導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。ある特定のベクターは、作動的に連結された核酸の発現を指令することができる。そのようなベクターは、本明細書において「発現ベクター」と呼ばれる。
用語「発現カセット」は、標的細胞における特有の核酸配列の転写を許す一連の特定の核酸エレメントを含む、組換え又は合成的に生成されたポリヌクレオチドを表す。組換え発現カセットを、プラスミド、染色体、ミトコンドリアDNA、色素体DNA、ウイルス、又は核酸フラグメントに組み入れることができる。典型的には、発現ベクターの組換え発現カセット部分は、数ある配列の中で、転写されるべき核酸配列及びプロモーターを含む。
本明細書に使用される「発現」は、核酸がmRNAに転写される過程及び/又は転写されたmRNA(転写物とも呼ばれる)が続いてペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質に翻訳される過程を表す。転写物及びコードされるポリペプチドは、個別に又はまとめて遺伝子産物と呼ばれる。核酸がゲノムDNAから得られる場合、真核細胞における発現は、対応するmRNAのスプライシングを含み得る。
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」、及び「宿主細胞培養物」は、互換的に使用され、そして外因性核酸が導入された細胞を、そのような細胞の子孫を含めて表す。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換細胞」を含み、形質転換細胞は、初代形質転換細胞及び継代回数に関係なくそれから得られた子孫を含む。子孫は、親細胞と核酸内容物が完全に同一でない場合があり、変異を含む場合がある。本来形質転換された細胞においてスクリーニング又は選択されたのと同じ機能又は生物学的活性を有する変異型子孫が、本明細書に含まれる。
「組換えペプチド」は、組換え操作された宿主細胞によって産生されるペプチドである。それは、任意で単離又は精製されている。
本発明のペプチドは、当技術分野において周知の方法によって組換え又は合成的に製造することができる。
医薬組成物及び投与
別の実施態様は、本発明のペプチド及び治療上不活性な担体、希釈剤又は賦形剤を含有する医薬組成物又は医薬、並びにそのような組成物及び医薬を調製するために本発明のペプチドを使用する方法を提供する。一例では、本発明のペプチドは、外界温度及び適切なpH及び所望の純度で、生理学的に許容される担体、すなわち採用される投薬量及び濃度でレシピエントに無毒の担体と共に混合してガレノス投与形態にすることによって製剤化され得る。製剤のpHは、主に特定の使用及び化合物の濃度に依存するが、好ましくは約3〜約8のどこかの範囲である。一例では、本発明のペプチドは、pH5の酢酸塩緩衝液中に製剤化される。別の実施態様では、本発明のペプチドは無菌である。本発明のペプチドは、例えば、固形又は無定形組成物として、凍結乾燥製剤として、又は水溶液として保存され得る。
別の実施態様は、本発明のペプチド及び治療上不活性な担体、希釈剤又は賦形剤を含有する医薬組成物又は医薬、並びにそのような組成物及び医薬を調製するために本発明のペプチドを使用する方法を提供する。一例では、本発明のペプチドは、外界温度及び適切なpH及び所望の純度で、生理学的に許容される担体、すなわち採用される投薬量及び濃度でレシピエントに無毒の担体と共に混合してガレノス投与形態にすることによって製剤化され得る。製剤のpHは、主に特定の使用及び化合物の濃度に依存するが、好ましくは約3〜約8のどこかの範囲である。一例では、本発明のペプチドは、pH5の酢酸塩緩衝液中に製剤化される。別の実施態様では、本発明のペプチドは無菌である。本発明のペプチドは、例えば、固形又は無定形組成物として、凍結乾燥製剤として、又は水溶液として保存され得る。
組成物は、優良製造規則に一致する方法で製剤化、調剤、及び投与される。これに関連する考慮要因には、処置される特定の障害、処置される特定の哺乳類、個別の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与計画、及び医師に公知の他の要因が含まれる。投与されるべき本発明のペプチドの「有効量」は、そのような考慮事項によって左右され、治療効果を示すために必要な最小量である。例えば、そのような量は、正常細胞又は全体としての哺乳動物に有毒な量未満であり得る。
実施例
実施例1:高グルコースはヒト網膜周皮細胞(hRP)におけるSiah1タンパク質レベルを増加させる
HRPを正常グルコース(5mM D−グルコース)、浸透圧対照(25mM L−グルコース)又は高グルコース(25mM D−グルコース)で48時間処理した。Siah1総タンパク質は、浸透圧対照で処理された培養物と比較して、高グルコースで処理された培養物では2倍に増加した(p=0.0136)。浸透圧対照処理細胞と正常グルコース処理細胞との間に有意差はなかった(図1A)。3つの独立したウエスタンブロットの定量を図1Bに示す。
実施例1:高グルコースはヒト網膜周皮細胞(hRP)におけるSiah1タンパク質レベルを増加させる
HRPを正常グルコース(5mM D−グルコース)、浸透圧対照(25mM L−グルコース)又は高グルコース(25mM D−グルコース)で48時間処理した。Siah1総タンパク質は、浸透圧対照で処理された培養物と比較して、高グルコースで処理された培養物では2倍に増加した(p=0.0136)。浸透圧対照処理細胞と正常グルコース処理細胞との間に有意差はなかった(図1A)。3つの独立したウエスタンブロットの定量を図1Bに示す。
実施例2:高グルコースはhRPにおけるGAPDHとSiah1との間の結合を増加させる
HRPを正常グルコース(5mM)、高グルコース(25mM)又はL−グルコース(25mM)で48時間処理した。プルダウンアッセイ法を行ったが、それは、以下のように説明される:抗Siah1を用いた免疫沈降(IP)に続く、抗GAPDHを用いた免疫複合体のウエスタンブロット(WB)解析により、浸透圧対照を用いて処理された細胞と比較して、高グルコースで処理された細胞におけるGAPDH/Siah1結合の1.5倍の増加が明らかとなった(p=0.0292)(図2A)。3つの独立したウエスタンブロットの定量を図2Bに示す。
HRPを正常グルコース(5mM)、高グルコース(25mM)又はL−グルコース(25mM)で48時間処理した。プルダウンアッセイ法を行ったが、それは、以下のように説明される:抗Siah1を用いた免疫沈降(IP)に続く、抗GAPDHを用いた免疫複合体のウエスタンブロット(WB)解析により、浸透圧対照を用いて処理された細胞と比較して、高グルコースで処理された細胞におけるGAPDH/Siah1結合の1.5倍の増加が明らかとなった(p=0.0292)(図2A)。3つの独立したウエスタンブロットの定量を図2Bに示す。
実施例3:Siah1ノックダウン及び部位特異的ブロッキングペプチドは高グルコースが誘導するGAPDH/Siah1結合を軽減する
HRPを、正常グルコース、浸透圧対照又は高グルコースに加えて10μM 陰性対照siRNA、Siah1に対する10μM siRNA、1μM TAT−FLAG対照、1μM TAT−FLAG GAPDHペプチド、1μM TAT−FLAG Siah1ペプチド又は1μM GAPDH+1μM Siah1ペプチドで処理した。上記のようにプルダウンアッセイ法を行った。本発明者らのGAPDHペプチドを設計して、Siah1上のGAPDH結合部位をブロッキングし、Siah1ペプチドを設計して、GAPDH上のSiah1結合部位をブロッキングした(補足の表1)。高グルコースは、GAPDH/Siah1の結合を有意に増加させ(p=0.0390)、この結合は、Siah1 siRNAによって有意に減少した(p=0.0461)(図2C、D)。GAPDH(p=0.0194)若しくはSiah1ペプチド(p=0.0066)、又は両方の組合せ(p=0.0146)は、高グルコースが誘導するGAPDH/Siah1の結合を同様に有意に阻害した(図2E、F)。hRP核画分においても、高グルコースが誘導するGAPDH/Siah1の結合が増加し、Siah1に対するsiRNAを用いて細胞を処理することによって核蓄積をブロッキングすることができる(図2G)。
HRPを、正常グルコース、浸透圧対照又は高グルコースに加えて10μM 陰性対照siRNA、Siah1に対する10μM siRNA、1μM TAT−FLAG対照、1μM TAT−FLAG GAPDHペプチド、1μM TAT−FLAG Siah1ペプチド又は1μM GAPDH+1μM Siah1ペプチドで処理した。上記のようにプルダウンアッセイ法を行った。本発明者らのGAPDHペプチドを設計して、Siah1上のGAPDH結合部位をブロッキングし、Siah1ペプチドを設計して、GAPDH上のSiah1結合部位をブロッキングした(補足の表1)。高グルコースは、GAPDH/Siah1の結合を有意に増加させ(p=0.0390)、この結合は、Siah1 siRNAによって有意に減少した(p=0.0461)(図2C、D)。GAPDH(p=0.0194)若しくはSiah1ペプチド(p=0.0066)、又は両方の組合せ(p=0.0146)は、高グルコースが誘導するGAPDH/Siah1の結合を同様に有意に阻害した(図2E、F)。hRP核画分においても、高グルコースが誘導するGAPDH/Siah1の結合が増加し、Siah1に対するsiRNAを用いて細胞を処理することによって核蓄積をブロッキングすることができる(図2G)。
実施例4:高グルコースはhRPにおけるGAPDHの核移行を増加させる。Siah1 siRNA、又はGAPDH/Siah1特異的ペプチドは高グルコースが誘導するGAPDHの核移行をブロッキングする
正常グルコース、浸透圧対照又は高グルコースで48時間処理後、細胞溶解物を調製し、細胞質画分及び核画分に分離した。次に、各画分を、GAPDH、MEK及びヒストンH3のウエスタンブロット解析に供した。MEK及びヒストンH3を対照抗原として使用して、それぞれ細胞質画分及び核画分の純度を判定した。高グルコース処理は、正常グルコース又は浸透圧対照のどちらと比較しても核GAPDHの有意な蓄積を引き起こした(p=0.0005)(図3A、B)。Siah1 siRNA(10μM)は、高グルコースが誘導するGAPDHの核蓄積を阻害した(p=0.0469)(図3C、D)。GAPDHペプチド(p=0.0142)若しくはSiah1ペプチド(p=0.0221)又は両方のペプチドの組合せ(p=0.0100)は、高グルコースが誘導するGAPDHの核移行を有意に阻害した(図3E、F)。GAPDHの核移行を、免疫細胞化学分析によってもアッセイし、それは、移行が高グルコースによって誘導され(図4D)、この誘導が1μM GAPDHペプチドによって阻害されたことを実証した(図4F)。
正常グルコース、浸透圧対照又は高グルコースで48時間処理後、細胞溶解物を調製し、細胞質画分及び核画分に分離した。次に、各画分を、GAPDH、MEK及びヒストンH3のウエスタンブロット解析に供した。MEK及びヒストンH3を対照抗原として使用して、それぞれ細胞質画分及び核画分の純度を判定した。高グルコース処理は、正常グルコース又は浸透圧対照のどちらと比較しても核GAPDHの有意な蓄積を引き起こした(p=0.0005)(図3A、B)。Siah1 siRNA(10μM)は、高グルコースが誘導するGAPDHの核蓄積を阻害した(p=0.0469)(図3C、D)。GAPDHペプチド(p=0.0142)若しくはSiah1ペプチド(p=0.0221)又は両方のペプチドの組合せ(p=0.0100)は、高グルコースが誘導するGAPDHの核移行を有意に阻害した(図3E、F)。GAPDHの核移行を、免疫細胞化学分析によってもアッセイし、それは、移行が高グルコースによって誘導され(図4D)、この誘導が1μM GAPDHペプチドによって阻害されたことを実証した(図4F)。
実施例5:高グルコースはGAPDH/Siah1依存性経路によりヒト網膜周皮細胞のアポトーシスを引き起こす
HRPを正常グルコース、L−グルコース又は高グルコースで48時間〜72時間処理した。細胞死は、48時間の高グルコース処理後に明白であり、細胞死は72時間後に有意に増加する。25mM D−グルコースを用いた72時間の処理の結果、アポトーシスの一般的マーカーであるカスパーゼ−3−酵素活性に3倍の増加が生じた(p<0.0001)(図5A)。高グルコース曝露は、アポトーシス特異的細胞死の別の尺度であるアネキシンVレベルにも有意な増加を引き起こした(p<0.0001)(図5B;)。Siah1 siRNAは、この高グルコースが誘導するアポトーシスを有意にブロッキングした(p=0.0009)(図5C)。さらに、GAPDHブロッキングペプチド及びSiah1ブロッキングペプチドは、高グルコースが誘導するhRPのアポトーシスを阻害した(図5D、対照ペプチド p=0.0019、GAPDHペプチド p=0.0090、Siah1ペプチド p=0.0053)。
HRPを正常グルコース、L−グルコース又は高グルコースで48時間〜72時間処理した。細胞死は、48時間の高グルコース処理後に明白であり、細胞死は72時間後に有意に増加する。25mM D−グルコースを用いた72時間の処理の結果、アポトーシスの一般的マーカーであるカスパーゼ−3−酵素活性に3倍の増加が生じた(p<0.0001)(図5A)。高グルコース曝露は、アポトーシス特異的細胞死の別の尺度であるアネキシンVレベルにも有意な増加を引き起こした(p<0.0001)(図5B;)。Siah1 siRNAは、この高グルコースが誘導するアポトーシスを有意にブロッキングした(p=0.0009)(図5C)。さらに、GAPDHブロッキングペプチド及びSiah1ブロッキングペプチドは、高グルコースが誘導するhRPのアポトーシスを阻害した(図5D、対照ペプチド p=0.0019、GAPDHペプチド p=0.0090、Siah1ペプチド p=0.0053)。
グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)とE3ユビキチンリガーゼseven in absentia homolog 1(Siah1)との間の相互作用によって開始される新規なアポトーシス促進経路が、最近、眼組織において特定された。
本発明の発明者らは、ヒト網膜周皮細胞(hRP)のアポトーシスにおけるGAPDH/Siah1相互作用の関与について調査した。HRPを5mM 正常グルコース、25mM L−又はD−グルコース中で48時間培養した(それぞれ浸透圧対照処理及び高グルコース処理)。Siah1の発現をダウンレギュレーションするためにSiah1 siRNAを使用した。TAT−FLAG GAPDH及び/又はSiah1ペプチドを使用してGAPDHとSiah1との相互作用をブロッキングした。免疫共沈アッセイ法を行って、GAPDH及びSiah1の結合に及ぼす高グルコースの影響を分析した。アネキシンV染色及びカスパーゼ−3酵素活性アッセイ法によってアポトーシスを測定した。高グルコースは、Siah1総タンパク質レベルを増加させ、GAPDHとSiah1との結合を誘導し、GAPDHの核移行をもたらした。本発明者らの知見により、GAPDH/Siah1アポトーシス促進複合体の解離は、DRの顕著な特徴と広く見なされる、高グルコースが誘導する周皮細胞のアポトーシスをブロッキングできることが実証される。
方法
HRP処理:ヒト網膜周皮細胞(hRP)の初代培養物(Cell Systems; Kirk-land, WA)を、接着因子(Cell Signaling; Danvers, MA)をコーティングした組織培養フラスコ中に蒔いた。10% FBS及び細胞成長補助栄養を補充した、抗生物質(Lonza; Basel)を含む正常グルコースのダルベッコ変法イーグル培地(5.5mM DMEM 1×, Life Technologies; Carlsbad, CA)中でHRPを成長させ培養した。全ての培養物を37℃、5% CO2及び相対湿度95%(酸素20.9%)でインキュベートした。全ての実験に継代5〜7回を使用した。HRPの同一性をニューロングリア2(NG2)(EMD Millipore; Temecula, CA)の免疫反応によって確認した。正常D−グルコース(5.5mM)、高D−グルコース(25mM Sigma; St. Louis,MO)又は浸透圧対照として役立ったL−グルコース(25mM Acros Organics; Geel, Belgium)を含有する10% FBS培地で集密度80%のhRPを処理した。TAT−FLAGペプチド処理について、1μM 対照ペプチド、1μM GAPDHペプチド及び/又は1μM Siah1ペプチドをハンクス平衡塩溶液(Life Technologies; Carlsbad, CA)に添加した。GAPDHペプチドは、Siah1上のGAPDH結合部位を競合的にブロッキングし、Siah1ペプチドは、GAPDH上のSiah1ペプチドを競合的にブロッキングする。ペプチド溶液を37℃で30分間インキュベートしてから各ウェルに添加した。細胞を各ペプチド溶液と共に2時間インキュベートしてから実験処理を加えた。ペプチドを組み合わせて使用した場合、各ペプチドについてそれぞれの元の濃度を使用した。各TAT−ペプチドのN−末端をアセチル化し、C−末端をアミド化する。これらの改変は、適正な細胞進入を確実にし、細胞内に入った後の分解を阻止する。FLAGタグペプチド配列は、これらのペプチドの検出及び定量を可能にする(図12)。
HRP処理:ヒト網膜周皮細胞(hRP)の初代培養物(Cell Systems; Kirk-land, WA)を、接着因子(Cell Signaling; Danvers, MA)をコーティングした組織培養フラスコ中に蒔いた。10% FBS及び細胞成長補助栄養を補充した、抗生物質(Lonza; Basel)を含む正常グルコースのダルベッコ変法イーグル培地(5.5mM DMEM 1×, Life Technologies; Carlsbad, CA)中でHRPを成長させ培養した。全ての培養物を37℃、5% CO2及び相対湿度95%(酸素20.9%)でインキュベートした。全ての実験に継代5〜7回を使用した。HRPの同一性をニューロングリア2(NG2)(EMD Millipore; Temecula, CA)の免疫反応によって確認した。正常D−グルコース(5.5mM)、高D−グルコース(25mM Sigma; St. Louis,MO)又は浸透圧対照として役立ったL−グルコース(25mM Acros Organics; Geel, Belgium)を含有する10% FBS培地で集密度80%のhRPを処理した。TAT−FLAGペプチド処理について、1μM 対照ペプチド、1μM GAPDHペプチド及び/又は1μM Siah1ペプチドをハンクス平衡塩溶液(Life Technologies; Carlsbad, CA)に添加した。GAPDHペプチドは、Siah1上のGAPDH結合部位を競合的にブロッキングし、Siah1ペプチドは、GAPDH上のSiah1ペプチドを競合的にブロッキングする。ペプチド溶液を37℃で30分間インキュベートしてから各ウェルに添加した。細胞を各ペプチド溶液と共に2時間インキュベートしてから実験処理を加えた。ペプチドを組み合わせて使用した場合、各ペプチドについてそれぞれの元の濃度を使用した。各TAT−ペプチドのN−末端をアセチル化し、C−末端をアミド化する。これらの改変は、適正な細胞進入を確実にし、細胞内に入った後の分解を阻止する。FLAGタグペプチド配列は、これらのペプチドの検出及び定量を可能にする(図12)。
HRPのトランスフェクション:siRNAのトランスフェクションのために、hRPを6ウェル皿内で培養し、処理の30分前に各ウェルに新鮮培地1mlを添加した。各ウェルについて、10μM siRNAオリゴマー(陰性対照siRNA又はSiah1に対するsiRNA)(siRNA配列の識別表示sc−37495A、B及びC、Santa Cruz; Dallas,TX)、Targefect Solution A(Targetingsystems; El Cajon, CA)9μl、及びVirofect(Targetingsystems)18μlを別々のチューブ内のOptimem(Life Technologies)250μlに添加し、各試薬の添加の合間に転倒混和した。混合した試薬を37℃で25分間インキュベートしてから培養hRPに添加した。細胞をトランスフェクション試薬と共に12時間インキュベートしてから洗浄し、新鮮培地で処理した。実験処理は、トランスフェクションの24時間後に開始した。本発明者らのsiRNA実験のノックダウン効率及び他の品質管理局面を図13に示す。
核分画及びウエスタンブロット解析:必要に応じてHRPを処理した。TrypLE Express(Life Technologies)を使用して細胞を回収し、放射免疫沈降アッセイ用(RIPA)緩衝液(Qiagen; Limburg, Netherlands)を使用して細胞を溶解させた。NE−PER核及び細胞質抽出試薬(Thermo Scientific; Nashville, TN)を使用して溶解物をサイトゾル画分と核画分に分離した。総タンパク質濃度のために試料を平衡化し、10% SDS/PAGEに供し、iBlotシステム(Life Technologies)を使用してゲルをニトロセルロース膜に移動させた。5% ミルク(β-アクチン(Thermo Scientific)及びGAPDH(Abcam; Cambridge,UK)のイムノブロット用)又は5% BSA(Siah1(Santa Cruz)、H3(Cell Signaling)、MEK(Cell Signaling)のイムノブロット用)中で膜をブロッキングし、適切な一次抗体(抗β−アクチン 1:3000、抗GAPDH 1:1000、抗Siah1 1:250、抗ヒストンH3及び抗MEK 1:750)で探索した。次にブロットを、1:2000に希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲート型二次抗体(GAPDH、MEK及びヒストンH3;抗ウサギ、Siah1;抗ヤギ、及びβ−アクチン;抗マウス)で標識した。MEK及びヒストンH3は、細胞質分画対照及び核分画対照として役立った。β−アクチンを使用して総タンパク質濃度を決定した。Pierce ECLウエスタンブロット基質中で膜をインキュベートし、ChemiDoc MP(Bio-Rad; Hercules, CA)を使用して現像した。少なくとも3回の独立した実験を使用してウエスタンブロット定量グラフを作った。ImageJ 1.47vソフトウェアを使用してブロットを定量した。
免疫共沈アッセイ法:必要に応じてHRPを処理し、Pierce IP Lysis Bufferを使用して溶解させた。各試料から等しい量のタンパク質(1000μg)を抗Siah1抗体 10μgと共に4℃で一晩混合した。Pierce Protein A/G Magnetic Beadを予備洗浄し、抗原試料/抗体混合物に室温で1時間添加した。磁気スタンドを用いてビーズを収集し、4×SDS−PAGE還元試料緩衝液50μlを使用して100℃で10分間溶離させた。次に免疫複合体をウエスタンブロット解析に供した。各溶解物からSiah1を完全にプルダウンするための対照としてSiah1枯渇試料を役立てた。Siah1免疫沈降の効率を検証するために独立した品質管理実験を行った(データは示さず)。
免疫細胞化学分析。HRPをマルチウェルガラススライド上で培養し、細胞をPBS中0.1% トリトン−X100で30分間透過処理し、PBST中1.5% BSAで4℃で一晩ブロッキングした。細胞を抗GAPDH一次抗体(Abcam)と共に4℃で一晩インキュベートした。一次抗体(1:100)と共にインキュベートした後、細胞を洗浄し、二次抗体と共に室温で1時間インキュベートした。次に細胞をPBST中で洗浄し、40,6−ジアミジノ−2−フェニルインドール(DAPI)染色(Sigma)を適用した。最後に、細胞を洗浄し、トリス緩衝液と共にFluorogel(Electron Microscopy Science, Hatfield, PA, USA)を使用して包埋し、蛍光顕微鏡(Olympus AX70; Tokyo, Japan)により観察した。
アポトーシスの測定:全てのアポトーシス測定を、72時間の適切な処理後に行った。アネキシンV−FITC染色は、アポトーシスをアッセイするために使用した方法の1つであった。簡潔には、細胞ペレットをアネキシンV結合緩衝液(Biolegend; San Diego, CA)中に再懸濁した。アネキシンV(Life Techonologies)及び7−AAD生存染色液(Biolegend)を各試料に室温で15分間添加した。Vanderbilt's Flow Cytometry Shared Resource中核研究室で行われたフローサイトメトリー分析を用いて試料を定量した。カスパーゼ−3酵素活性を測定することによってもアポトーシスをアッセイした。EnzChekカスパーゼ−3アッセイキット(Life Technologies)を使用して活性を定量した。7−アミノ−4−メチルクマリン由来基質であるZ−DEVD−AMCと共に試料を1時間インキュベートした。440nmでの蛍光の発光を2時間後に測定した。
統計:市販のソフトウェア(GraphPad Prism 6; La Jolla, CA)を用いて、フィッシャーのLSD事後解析を行うANOVAを使用してデータを解析した。p<0.05の値を統計的に有意と見なした。
Claims (15)
- グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)結合配列及び/又はE3ユビキチンリガーゼseven in absentia homolog 1(Siah1)結合配列並びにインターナリゼーション配列を含むペプチド。
- N末端から順にインターナリゼーションペプチド並びにGAPDH結合配列及び/又はSiah1結合配列を含む、請求項1記載のペプチド。
- インターナリゼーション配列が、陽イオン性インターナリゼーション配列、好ましくは配列番号3を含む配列である、請求項1又は2記載のペプチド。
- GAPDH結合配列及びインターナリゼーション配列を含む、請求項1〜3記載のペプチド。
- Siah1結合配列及びインターナリゼーション配列を含む、請求項1〜3記載のペプチド。
- GAPDH結合配列が、配列番号1を含む、請求項1〜4記載のペプチド。
- Siah1結合配列が、配列番号2を含む、請求項1〜3又は5記載のペプチド。
- ペプチドのN末端がアセチル化されている、請求項1〜7記載のペプチド。
- ペプチドのC末端がアミド化されている、請求項1〜8記載のペプチド。
- 糖尿病網膜症の治療又は予防における使用のための、請求項1〜9記載のペプチド。
- 糖尿病網膜症の治療又は予防のための医薬の調製のための、請求項1〜10記載のペプチドの使用。
- 請求項1〜9記載のペプチドを含む医薬製剤。
- 請求項1〜9記載のペプチドの有効量を対象に投与することを含む、糖尿病網膜症の治療又は予防のための方法。
- 請求項1〜9記載のペプチドをコードする核酸配列を含むベクター。
- 請求項14記載のベクターを含む宿主細胞。
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