KR20230156270A - vIRF3 유래 펩타이드 및 이의 암 예방 또는 치료 용도 - Google Patents

vIRF3 유래 펩타이드 및 이의 암 예방 또는 치료 용도 Download PDF

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KR20230156270A
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Abstract

본 발명은 KSHV(Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus) vIRF3 유래 펩타이드 및 이의 용도에 대한 것으로, 본 발명에 따르면, KSHV vIRF3 유래 펩타이드는 PKM2의 활성을 억제하고 종양의 크기 및 부피를 감소시키며, 암 세포의 이동 및 침입을 유의미하게 억제하는 효과가 있는 바, 이를 암 예방, 개선 또는 치료 용도 또는, 암 세포의 전이 억제를 위하여 유용하게 활용할 수 있다.

Description

vIRF3 유래 펩타이드 및 이의 암 예방 또는 치료 용도{viral interferon regulatory factor 3-derived peptide and its use for preventing or treating cancer}
본 발명은 vIRF3 유래 펩타이드 및 이의 암 예방 또는 치료 용도에 대한 것이다.
항암화학요법은 항암제를 이용한 임의의 전신적인 치료 방법으로서, 수술, 방사선요법과 함께 암 치료의 3대 방법 중 하나이다. 몸으로 유입된 화학요법 항암제는 혈관을 타고 전신을 순환하며 암세포의 성장을 막거나 죽이는 역할을 한다. 전통적인 항암제는 세포독성 항암제로 빠르게 분열하며 증식하는 세포를 공격하여 분열을 차단함으로써 암세포 사멸을 유도한다.
하지만 항암화학요법의 치료 기간과 횟수는 암의 종류, 항암제의 종류, 치료에 대한 반응, 부작용의 정도에 따라 다르다. 더욱이 대체적으로 항암제는 세포 독성 약물이므로 세포 내에 일반적으로 존재하는 DNA나 미세소관에 작용하기 때문에 암세포에 대해서 어느 정도 치료 효과를 나타내지만 정상세포에도 악영향을 끼치기 때문에 평균 2 내지 3주의 휴식 기간을 두어 정상 세포가 회복될 때를 기다려야 할 만큼 부작용이 심한 것이 일반적이다.
따라서 효과적인 항암 효과를 보이면서도 부작용이 적은 항암제의 개발이 요구되고 있다. 이에 있어, 펩타이드 의약품은 아미드 결합에 의해 연결된 40개 이하 아미노산으로 구성된 의약품으로 높은 생물학적 활성, 특이성, 안전성과 더불어 합성이 용이하여 생산성도 높다는 장점이 있어 바이오의약품 시장 내에서 높은 성장이 예상되고 있는 분야이다.
한편, 피루브산 키나아제(pyruvate kinase, PK)는 해당작용 동안 포스포에놀피루브산(phosphoenolpyruvate)을 피루브산으로 전환시키는 대사효소이다. 네 개의 PK 아형들이 포유동물에 존재한다: L 및 R 아형이 간 및 적혈구(red blood cells)에 발현되고, M1 아형(PKM1)은 성인 조직 거의 모두에서 발현되며, M2 아형(PKM2)은 배아 발달 동안 발현되는 M1의 다양한 이어맞춤(splice)이다. 모든 종양 세포들은 오직 배아 M2 아형을 발현한다. PK의 아형인 M1 및 M2 사이의 잘 알려진 차이는 PKM2는 과당- 1,6-이인산(fructose- 1,6-bisphosphate, FBP)과 같은 상부(upstream) 해당작용 중간체에 의한 다른자리입체성활성화(allosteric activation)를 필요로 하는 낮은-활성 효소인 것이며, 반면 PKM1은 지속 활성 효소(constitutively active enzyme)이다.
모든 종양 세포들은 오직 암 치료를 위한 잠재적인 표적으로서 제안되는 피루브산 키나아제의 PKM2를 발현한다. 하지만 현재까지 개발된 PKM2의 저해제는 선택적이지 않아서 PKM2 기능에 관련된 질병의 치료가 어려운 현실이다.
본 발명자들은 KSHV(Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus) vIRF3의 PKM2에 대한 결합을 확인하고, 이로부터 분리한 신규한 펩타이드가 PKM2 활성을 억제하여 종양의 성장을 억제하며, 이동 및 침입을 억제하는 효과를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 vIRF3(viral interferon regulatory factor 3) 유래 펩타이드 또는 이의 단편을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 인간을 제외한 개체의 암 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 암의 이동 또는 전이 억제용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 암 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 암의 예방 또는 개선용 의약외품을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 암의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 vIRF3(viral interferon regulatory factor 3) 유래 펩타이드 또는 이의 단편을 제공한다.
또한 상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 vIRF3 유래 펩타이드, 이의 단편 또는 이를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 약학적 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 인간을 제외한 개체의 암 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 vIRF3 유래 펩타이드, 이의 단편 또는 이를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 암의 이동 또는 전이 억제용 약학적 조성물을 제공한다.
또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 PKM2를 포함하는 시료에 후보물질을 접촉시키는 단계; (b) 상기 PKM2 도메인에 대한 후보물질의 물리적 상호작용을 제 1항에 따른 vIRF3 유래 펩타이드 또는 이의 단편의 물리적 상호작용과 비교하는 단계; 및 (c) 상기 후보물질의 물리적 상호작용이 상기 vIRF3 유래 펩타이드 또는 이의 단편의 물리적 상호작용과 유사하거나, 더 큰 상호작용을 나타내는 경우, 상기 후보물질을 암 치료제로 선정하는 단계;를 포함하는, 암 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 vIRF3 유래 펩타이드, 이의 단편 또는 이를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 암의 예방 또는 개선용 의약외품을 제공한다.
또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 vIRF3 유래 펩타이드, 이의 단편 또는 이를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 암의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 vIRF3 유래 펩타이드, 이의 단편 또는 이를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 KSHV(Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus) vIRF3 유래 펩타이드 및 이의 용도에 대한 것으로, 본 발명에 따르면, KSHV vIRF3 유래 펩타이드는 PKM2의 활성을 억제하고 종양의 크기 및 부피를 감소시키며, 암 세포의 이동 및 침입을 유의미하게 억제하는 효과가 있는 바, 이를 암 예방, 개선 또는 치료 용도 또는, 암 세포의 전이 억제를 위하여 유용하게 활용할 수 있다.
도 1a는 KSHV vIRF3와 내인성(endogenous) PKM2의 상호 작용 여부를 확인한 결과로, 도 1a에 있어서, 밑줄쳐진 서열은 vIRF3을 발현하는 LEC(lympathic endothelial cells)의 질량 분석(mass-spectrometry analysis)에서 확인된 PKM2를 나타낸다.
도 1b는 KSHV vIRF3와 내인성 PKM2의 상호 작용 여부를 확인한 결과로, 293T 세포를 각각의 플라스미드 조합으로 형질감염시키고 샘플을 GST-풀다운 분석(GST-pull down analysis)에 이어 항-HA 항체로 면역블롯팅하여 분석한 결과이다.
도 1c는 KSHV vIRF3와 내인성 PKM2의 상호 작용 여부를 확인한 결과로, 293T 세포를 PKM2 및 vIRF3 돌연변이로 공동감염시킨 후, 이의 세포 용해물을 항-HA 항체로 면역침강시킨(immunoprecipitated) 후 항-GST에 대한 면역블롯팅을 수행한 결과이다.
도 1d는 KSHV vIRF3와 내인성 PKM2의 상호 작용 여부를 확인한 결과로, 293T 세포를 PKM2 및 vIRF3 또는 이의 단편 TM1, TM2, TM3로 형질감염시키고 항-HA 항체로 면역침전을 수행한 다음 항-GST 항체로 면역블롯팅을 수행한 결과이다.
도 1e는 KSHV vIRF3와 내인성 PKM2의 상호 작용 여부를 확인한 결과로, 각각 LEC 발현 pCDH 벡터, vIRF3 및 vIRF3 유래 aa240-250, aa250-260, aa260-270, aa270-280이 결손된 돌연변이체로 감염시킨 세포 용해물을 항-PKM2 항체로 면역침강시키고 항-V5 항체로 면역블롯팅한 결과이다.
도 2a는 KSHV vIRF3-PKM2 상호작용이 PK 활성에 미치는 영향을 확인한 결과로, 다량체(multimeric) PKM2의 가교결합을 위해 pCDH, vIRF3 및 vIRF3(△250-280) 돌연변이체를 발현하는 LEC 세포 용해물에 0.15% 글루타르알데히드(glutaraldehyde)를 처리한 후, 표시된 항체로 면역블롯팅을 수행한 결과이다. 이에 있어, β-액틴(β-actin)을 내부 로딩 컨트롤(internal loading control)로 표시하였다.
도 2b는 KSHV vIRF3-PKM2 상호작용이 PK 활성에 미치는 영향을 확인한 결과로, LEC-pCDH 및 vIRF3 및 vIRF3(△250-280) 돌연변이체를 세포질 및 핵 분획으로 분획화한 후 면역블롯팅을 수행한 결과이다. PKM2 밴드의 강도는 내부 컨트롤 밴드의 강도(세포질의 경우 α-튜불린(α-tubulin), 핵 분획의 경우 라민 A/C(lamin A/C))로 정규화하였고, LEC-pCDH 샘플과 비교하여 나타내었다. 도 2b에 있어서, **는 p<0.005이고, ***는 p<0.0005이며, ****는 p<0.0001이다.
도 2c는 KSHV vIRF3-PKM2 상호작용이 PK 활성에 미치는 영향을 확인한 결과로, pCDH, vIRF3 및 vIRF3(△250-280) 돌연변이체를 안정적으로 발현하는 LEC에 있어, 표시된 대사체 분석을 위해 세포를 용해시킨 후 V5 항체에 대해 면역블로팅하였다. 이에 있어, β-액틴을 내부 로딩 컨트롤로 표시하였다.
도 3a는 vIRF3에 따른 TCA 주기 대사산물(TCA cycle metabolites) 증가 여부를 확인한 결과로, pCDH, vIRF3 및 vIRF3(△250-280) 돌연변이를 포함하는 LEC를 수확하고 대사산물 추출을 위해 용해한 후, 용해물을 LC/MS로 분석한 결과이다. 도 3a에 있어서, V는 pCDH를 포함하는 실험군을 의미하고, W는 vIRF3(야생형)를 포함하는 실험군을 의미하며, M은 vIRF3(△250-280) 돌연변이를 포함하는 실험군을 의미한다. 도 3a에 있어서, NS는 p>0.05이고, **는 p<0.005이며, ***는 p<0.0005이고, ****는 p<0.0001이다.
도 3b는 vIRF3에 따른 TCA 주기 대사산물(TCA cycle metabolites) 증가 여부를 확인한 결과로, 13C 동위원소 표지화는 13C6-글루코스(13C6-glucose)를 pCDH, vIRF3 및 vIRF3(△250-280) 돌연변이체를 발현하는 LEC에 처리하여 수행하였다. 다른 탄소 공급원이 없는 조정 배지에서 세포에 13C6-글루코스으로 24시간 동안 처리하고 대사산물 추출을 위해 수확한 후 LC/MS 분석을 수행하여 다양한 대사체에 포함된 13C의 수준을 측정한 결과이다. 상기 도 3b에 있어서, M+(1 내지 6)은 1부터 6까지 축적된 C13 원자를 라벨링(labeling)한 것이다.
도 4a는 vIRF3-PKM2가 총 세포 아세틸-CoA를 증가시키고, 이에 따라 SMAD2/3의 아세틸화를 향상시킴을 확인한 결과로, pCDH, vIRF3 및 vIRF3(△250-280) 돌연변이체를 발현하는 LEC를 ACLY 억제제인 BMS303141과 함께(오른쪽 결과) 또는 상기 억제제를 제외하고(왼쪽 결과) 배양한 후 항-아세틸 라이신(anti-acetyl lysine) 및 항-V5 항체(anti-V5 antibody)를 이용해 면역블롯팅을 수행한 결과이다. 이에 있어, β-액틴을 내부 로딩 컨트롤로 표시하였다.
도 4b는 vIRF3-PKM2가 총 세포 아세틸-CoA를 증가시키고, 이에 따라 SMAD2/3의 아세틸화를 향상시킴을 확인한 결과로, 각각의 SMAD를 표적으로 하는 항체를 사용한 면역침강에 이어 아세틸-라이신에 대한 면역블롯팅을 통해 SMAD의 아세틸화 수준을 분석한 결과이다. 이에 있어, β-액틴을 내부 로딩 컨트롤로 표시하였다.
도 5a는 vIRF3 또는 vIRF3(△250-280) 돌연변이체 처리에 따른 SMAD2 및 SMAD3의 vIRF3 매개 아세틸화 및 이에 따른 LEC의 EndMT를 확인한 결과로, CDH, vIRF3 및 vIRF3(△250-280) 돌연변이체를 안정적으로 발현하는 LEC를 표시된 내피(endothelial) 또는 중간엽(mesenchymal) 특이적 마커 단백질을 표적으로 하는 항체로 염색한 결과이다.
도 5b는 vIRF3 또는 vIRF3(△250-280) 돌연변이체 처리에 따른 SMAD2 및 SMAD3의 vIRF3 매개 아세틸화 및 이에 따른 LEC의 EndMT를 확인한 결과로, Boyden의 챔버 세포 이동 분석(Boyden’s chamber cell migration assay)을 수행한 결과이다. 도 5b에 있어, ****는 p<0.0001이다.
도 5c는 vIRF3 또는 vIRF3(△250-280) 돌연변이체 처리에 따른, 3D 스페로이드 침습(3D spheroid invasion) 분석을 수행하고 이를 공초점 현미경으로 분석한 결과이다.
도 6a는 이종이식(Xenograft) 모델에서 KS 유사 종양 진행에 KSHV vIRF3-PKM2 상호작용이 미치는 영향을 확인한 결과로, 지시된 3가지 상이한 rKSHV-BAC16의 접종 후 30일째 마우스의 이미지이다. 도 6a에 있어서, WT는 야생형, MT는 vIRF3(△250-280), Rev.; Rev는 복귀돌연변이체(Revertant)-vIRF3(△250-280)를 의미한다.
도 6b는 이종이식 모델에서 KS 유사 종양 진행에 KSHV vIRF3-PKM2 상호작용이 미치는 영향을 확인한 결과로, 각 실험군의 평균 종양 부피, 체중 종양의 크기 및 종양 무게를 나타낸 결과이다. 도 6b에 있어서, *는 p<0.05이고, ***는 p<0.0005이다.
도 7은 KSHV vIRF3 유래 펩타이드 단편(vIRF3(250-260), vIRF3(260-270) 및 vIRF3(270-280))의 PKM2와의 상호 결합 유무를 확인한 결과이다.
도 8a는 본 발명에 따른 KSHV vIRF3 유래 펩타이드가 PKM2 활성을 억제하여 KS 유사 종양 진행을 억제함을 확인한 결과로, vIRF3을 발현하는 LEC를 비히클(vehicle), 세포투과성 펩타이드(TAT) 또는 본 발명의 펩타이드와 세포투과성 펩타이드를 결합시킨 펩타이드(TAT-VDP)와 함께 인큐베이션하고 용해시킨 후 안티-V5 및 안티-PKM2 항체로 면역블롯팅한 결과이다. 이에 있어, β-액틴을 내부 로딩 컨트롤로 표시하였다.
도 8b는 본 발명에 따른 KSHV vIRF3 유래 펩타이드가 PKM2 활성을 억제하여 KS 유사 종양 진행을 억제함을 확인한 결과로, pCDH 또는 vIRF3을 발현하는 LEC를 비히클, TAT 또는 TAT-VDP로 처리한 후 용해하고, 이를 4-12% 구배(gradient) SDS-PAGE 겔로 면역블롯팅한 결과이다. 이에 있어, β-액틴을 내부 로딩 컨트롤로 표시하였다.
도 8c는 본 발명에 따른 KSHV vIRF3 유래 펩타이드가 PKM2 활성을 억제하여 KS 유사 종양 진행을 억제함을 확인한 결과로, pCDH 또는 vIRF3을 발현하는 LEC를 비히클, TAT 또는 TAT-VDP로 처리한 후 이의 세포 아세틸-CoA 및 ATP 수준을 측정한 결과이다. 도 8c에 있어서, NS는 p>0.05이고, *는 p<0.05이며, ****는 p<0.0001이다.
도 8d는 본 발명에 따른 KSHV vIRF3 유래 펩타이드가 PKM2 활성을 억제하여 KS 유사 종양 진행을 억제함을 확인한 결과로, pCDH 벡터 또는 vIRF3을 발현하는 LEC를 CAM(chick embryo chorioallantoic membrane)에 접종하고 비히클, TAT 또는 TAT-VDP로 처리한 후, CAM 샘플을 수확하고 면역조직화학 분석을 수행한 결과이다. 각 조직 샘플에 대한 H&E 염색은 대조군 염색으로 표시하였다. 도 8d에 있어, EC는 외배엽(ectoderm)이고, M는 중배엽(mesoderm)이며, ED는 내배엽(endoderm)이다.
도 8e는 본 발명에 따른 KSHV vIRF3 유래 펩타이드가 PKM2 활성을 억제하여 KS 유사 종양 진행을 억제함을 확인한 결과로, 각 실험군의 평균 종양 부피 및 체중을 30일 내지 60일동안 모니터링한 결과(위, (a)는 TAT 처리 30일 후 TAT-VDP를 처리한 실험군을 나타내고, (b)는 TAT-VDP를 처리한 실험군을 나타내며, (c)는 TAT만 처리한 양성 대조군을 나타낸다)와 각 실험군의 종양의 대표 사진 및 종양 무게를 나타낸 결과(아래)이다. 도 8e에 있어서, **는 p<0.005이고, N.D.는 확인되지 않음을 의미한다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 vIRF3(viral interferon regulatory factor 3) 유래 펩타이드 또는 이의 단편을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 vIRF3는 KSHV(Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus) vIRF3인 것을 특징으로 하며, Genebank: MZ923827.1일 수 있고, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
상기 KSHV는 발암바이러스(oncovirus)라 일컫는 인간 암 바이러스의 7종류 중 하나로, 인간 헤르페스바이러스의 8번째 종류이기도 하다. HHV-8이란 이름은 공용되어 사용된다. 상기 바이러스는 AIDS(acquired immune deficiency syndrome) 환자에게서 흔히 발생하는 카포시육종(Kaposi’s Sarcoma, KS)을 일으킬 뿐만 아니라 원발성삼출성림프종(Primary effusion lymphoma, PEL)과 다심성 캐슬맨 질병(multicentric Castleman’s disease)의 원인이 된다.
상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 vIRF3 유래 펩타이드는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 vIRF3의 aa 250-280내에 포함되는 아미노산 서열로, 본 발명의 일실시예에 따르면, vIRF3250-280은 PKM2210-402에 특이적으로 결합함을 확인하였다. 더 나아가, vIRF3 250번부터 280번 아미노산까지 각 11개의 단편 펩타이드를 발현하는 돌연변이(vIRF3(250-260), vIRF3(260-270), vIRF3(270-280))은 모두 PKM2와 상호 결합함을 확인하였다.
그러므로 본 발명에 있어서, 상기 단편은 상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 vIRF3 유래 펩타이드의 아미노산 서열 내에서 vIRF3 aa 250-260, vIRF3 aa 260-270 및 vIRF3 aa 270-280으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 한다. 바람직하게는 상기 vIRF3 aa 250-260는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어졌고, 상기 vIRF3 aa 260-270는 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어졌으며, 상기 vIRF3 270-280는 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드는 적절한 숙주세포에서 본 발명의 폴리펩타이드 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 발현함으로써 제조할 수 있다. 이것은 당업자에게 알려진 재조합 DNA 기술의 방법으로 수행할 수 있다.
또한 본 발명에 따른 펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성에 의해 제조될 수 있다. 대표적인 방법으로는 액체 또는 고체상 합성, 단편 응축, F-MOC(9-fluorenylmethoxycarbonyl) 또는 T-BOC(tert-butyloxycarbonyl) 화학법이 포함되나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다. 또한 본 발명의 펩타이드는 유전공학적 방법에 의해 제조될 수 있다. 우선, 통상적인 방법에 따라 상기 펩타이드를 코딩하는 DNA 서열을 작제한다. DNA 서열은 적절한 프라이머를 사용하여 PCR 증폭함으로써 작제할 수 있다. 다른 방법으로 당업계에 공지된 표준 방법에 의해, 예컨대, 자동 DNA 합성기(예: Biosearch 또는 Applied Biosystems사에서 판매하는 것)를 사용하여 DNA 서열을 합성할 수도 있다. 제작된 DNA 서열은 이 DNA 서열에 작동가능하게 연결되어(operatively linked) 그 DNA 서열의 발현을 조절하는 하나 또는 그 이상의 발현 조절 서열(expression control sequence)(예: 프로모터, 인핸서 등)을 포함하는 벡터에 삽입시키고, 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨다. 생성된 형질전환체를 상기 DNA 서열이 발현되도록 적절한 배지 및 조건 하에서 배양하여, 배양물로부터 상기 DNA 서열에 의해 코딩된 실질적으로 순수한 펩타이드를 회수한다. 상기 회수는 이 기술분야에서 공지된 방법(예컨대, 크로마토그래피)을 이용하여 수행할 수 있다. 상기에서 '실질적으로 순수한 펩타이드'라 함은 본 발명에 따른 펩타이드가 숙주로부터 유래된 어떠한 다른 단백질도 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다. 더불어 본 발명에 따른 펩타이드는 생체 내의 단백질 절단 효소들로부터 보호하고 안정성을 증가시키기 위해서 N 말단 또는 C 말단을 변형하거나 여러 유기단으로 보호한 형태일 수 있다. 즉, 상기 펩타이드의 C 말단은 안정성을 증가시키기 위해서 변형될 수 있는 형태라면, 특별한 제한은 없으나 바람직하게는 히드록시기(-OH) 또는 아미노기(-NH2)로 변형되는 것일 수 있다. 또한 상기 펩타이드의 N 말단은 안정성을 증가시키기 위해서 변형될 수 있는 형태라면, 특별한 제한은 없으나 바람직하게는 아세틸(Acetyl)기, 플루오레닐 메톡시카르보닐(Fmoc)기, 포르밀(Formyl)기, 팔미토일(Palmitoyl)기, 미리스틸(Myristyl)기, 스테아릴(Stearyl)기 및 폴리에틸렌글리콜(PEG)로 이루어진 군에서 선택되는 기로 변형되는 것일 수 있다.
또한 본 발명에 따른 펩타이드는 D형, L형, 펩토이드 모노머를 포함한 펩타이드 모방체 또는 비천연 아미노산 중의 어느 하나의 아미노산을 갖는 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명에 따른 펩타이드는 이중체(dimer), 삼중체(trimer) 또는 다중체(multimer)인 것을 특징으로 하며, N 말단 혹은 C 말단에 다양한 기능기를 포함할 수 있다.
상기 다양한 기능기의 예시로서, N 말단의 기능기는 자유아민(free amine), 아세틸화(acetylation), 바이오틴(biotin) 및 형광단(fluorophore)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있고, C 말단의 기능기는 유리산(free acid), 아미드화(amidation), 비오틴(biotin) 및 형광단(fluorophore)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 vIRF3 유래 펩타이드 또는 이의 단편 범위에 포함될 수 있는 생물학적 기능 균등물은 본 발명의 펩타이드와 균등한 생물학적 활성을 발휘하는 아미노산 서열의 변이를 포함하는데에 한정될 것이라는 것은 당업자에게 명확하다.
이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 가지며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.
변이를 도입하는 데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스(hydropathic index)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 아이소루이신 (+4.5); 발린 (+4.2); 루이신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스타인 (+2.5); 메티오닌 (+1.9); 알라닌 (+1.8); 글라이신 (-0.4); 트레오닌 (-0.7); 세린 (-0.8); 트립토판 (-0.9); 타이로신 (-1.3); 프롤린 (-1.6); 히스티딘 (-3.2); 글루타메이트 (-3.5); 글루타민 (-3.5); 아스파르테이트 (-3.5); 아스파라긴 (-3.5); 라이신 (-3.9); 및 아르기닌 (-4.5).
펩타이드의 상호적인 생물학적 기능(interactive biological function)을 부여하는 데 있어서 소수성 아미노산 인덱스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ±2 이내, 보다 바람직하게는 ±1 이내, 보다 더 바람직하게는 ±0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.
한편, 유사한 친수성 값(hydrophilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 펩타이드를 초래한다는 것도 잘 알려져 있다. 미국 특허 제4,554,101호에 개시된 바와 같이, 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌 (+3.0); 라이신 (+3.0); 아스팔테이트(+3.0±1); 글루타메이트 (+3.0±1); 세린 (+0.3); 아스파라긴 (+0.2); 글루타민 (+0.2); 글라이신 (0); 쓰레오닌 (-0.4); 프롤린 (-0.5±1); 알라닌 (-0.5); 히스티딘 (-0.5); 시스테인 (-1.0); 메티오닌 (-1.3); 발린 (-1.5); 루이신 (-1.8); 아이소루이신 (-1.8); 타이로신 (-2.3); 페닐알라닌 (-2.5); 트립토판 (-3.4).
친수성 값을 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ±2 이내, 보다 바람직하게는 ±1 이내, 보다 더 바람직하게는 ±0.5 이내의 친수성 값 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 펩타이드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.
상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 vIRF3 유래 펩타이드 또는 이의 단편은 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 본 발명의 펩타이드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80% 이상의 상동성, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열 비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있는 어떤 방법이라도 제한없이 사용할 수 있다.
더불어 본 발명에 따른 vIRF3 유래 펩타이드는 세포 투과성 도메인을 추가로 포함하여 세포 투과성을 증대시킬 수 있다. 상기 세포 투과성 도메인은 다양한 분자화물(작은 화학 분자 내지 나노사이즈 입자 및 DNA의 큰 단편)의 세포흡수를 촉진하는 짧은 펩타이드를 의미하는 것일 수 있다. 단백질과 같은 "화물"(cargo)“은 공유결합을 거친 화학결합을 통하여 또는 비공유 상호작용을 통하여 펩타이드와 연결되어 있다. 세포 투과성 도메인의 기능은 세포내에 화물을 전달하는 것이며, 일반적으로 살아있는 포유동물 세포의 엔도솜(endosome)에 전달된 화물과 엔도사이토시스(endocytosis)를 통해 발생하는 과정이다. 세포 투과성 도메인은 전형적으로 높은 상대적 존재량의 양전하성 아미노산 예를 들어 라이신 또는 아르기닌을 함유하는 아미노산 조성을 가지거나 또는 대체 패턴의 극성/전하성 아미노산 및 비극성, 소수성 아미노산을 함유하는 서열을 갖는다. 본 발명에 있어서, 상기 세포 투과성 도메인은 이에 제한되는 것은 아니나, HIV TAT 펩타이드일 수 있다.
일례로 상기 세포 투과성 도메인으로 HIV TAT 펩타이드가 추가로 포함된 vIRF3 유래 펩타이드는 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다. 상기 HIV TAT 펩타이드가 추가로 포함된 vIRF3 유래 펩타이드는 앞서와 동일한 이유로, 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열과 실질적인 동일성을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석될 수 있다.
본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 vIRF3 유래 펩타이드를 vIRF3를 발현하는 LEC 세포주에 처리한 결과, PKM2 활성이 크게 억제됨을 확인하였다. 또한 본 발명의 또 다른 일실시예에 따르면, KSHV에 감염된 LEC를 이식한 동물모델에 본 발명에 따른 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 vIRF3 유래 펩타이드를 피하 주사한 결과, 종양의 크기 및 부피가 현저히 감소되었음을 확인하였다.
따라서 본 발명은 본 발명에 따른 vIRF3 유래 펩타이드, 이의 단편 또는 이를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "치료"는 유익하거나 바람직한 임상 결과를 얻기 위한 접근법으로서, 본 발명의 목적을 위해 유익하거나 바람직한 임상적 결과를 감지 가능하거나 가능하지 않거나를 불문하고, 또한 부분적이든 전체적이든 상관없이 증상의 완화, 질환 정도의 감소, 질환의 안정화된(즉, 더 나빠지지 않는) 상태, 질환 진행의 지연 또는 속도감소, 질환 상태의 개선 또는 일시적 완화 및 경감을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 따라서, 치료는 치료법적 치료 및 예방적인 차원의 것들 모두를 가리키며, 치료할 필요가 있는 것들은 이미 질환을 가지고 있는 상태뿐만 아니라 질환이 예방되어야 할 상태를 포함한다. 또한 본 발명의 약학적 조성물을 개체에 투여하여 암의 증세가 호전되도록 하거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "예방"은 본원에 따른 조성물의 투여 또는 도포로 본 조성물이 효과가 있는 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 암의 예방 또는 치료 효과가 있는 본 발명의 조성물은 암의 초기 증상, 또는 나타나기 전에 복용 또는 투여할 경우 이러한 질환을 예방할 수 있다는 것은 당업자에게 자명할 것이다.
본 발명의 약학적 조성물은 암이 발병되거나, 발병할 가능성이 있는 “개체”에 투여될 수 있으며, 상기 "개체"는 인간을 포함한 모든 동물을 의미할 수 있다.
더불어 본 발명의 또 다른 실시예에 따르면 PKM2 고활성을 보이는 LEC 세포주를 접종한 닭 배아 융모요막(chorioallantoic membrane, CAM)에 본 발명에 따른 vIRF3 유래 펩타이드를 투여한 결과, 암 세포의 이동 및 침입성이 현저히 억제되었음을 확인하였다.
따라서 본 발명은 본 발명에 따른 vIRF3 유래 펩타이드, 이의 단편 또는 이를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 암의 이동 또는 전이 억제용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 vIRF3 유래 펩타이드, 이의 단편 또는 이를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드와 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 치료받을 대상의 연령, 성별, 체중과, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 일반적으로 투여량은 0.01㎎/㎏/일 내지 대략 2000㎎/㎏/일의 범위이다. 더 바람직한 투여량은 0.1㎎/㎏/일 내지 1000㎎/㎏/일이다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있으며, 비경구, 경구 모두 사용할 수 있으나, 바람직하게는 비경구로 투여될 수 있다.
비경구 투여를 위한 형태로는 치약, 구강세정제, 국소 투여제(크림, 연고, 드레싱 용액, 분무제, 기타 도포제등) 등을 들 수 있다. 상기 국소 투여제의 제형의 일 예로는, 본 발명에 따른 암을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물을 수용성 고분자를 포함하는 필름 또는 패치에 고정하여 암 발병 주변부위에 부착할 수 있도록 제형화한 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 암을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물 또는 암의 이동 또는 전이를 억제하기 위한 약학적 조성물은 유효성분인 본 발명에 따른 vIRF3 유래 펩타이드, 이의 단편 또는 이를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 외에, 암의 예방, 치료, 이동, 침습 억제 효과 상승을 위하여 이미 안전성이 검증되고 암 예방, 치료, 또는 이동 및 침습 억제 효과를 갖는 것으로 공지된 임의의 화합물이나 천연 추출물을 추가로 포함할 수 있다.
또한 본 발명의 암을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물 또는 암의 이동 또는 전이를 억제하기 위한 약학적 조성물은 암의 외과적 치료와 더불어 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 암은 PKM2를 과발현하는 암인 것을 특징으로 한다. 상기 PKM2를 과발현하는 암은 KSHV에 감염된 암이거나, 감염되지 않은 암일 수 있다. 더불어 상기 PKM2를 과발현하는 암의 예로서, 폐암, 전립선암, 대장암, 유방암, 림프종, 신장암, 췌장암, 간암, 난소암, 담낭암 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 약학적 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 인간을 제외한 개체의 암 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
상기 개체는 암의 발병이 의심되거나, 발병 가능성이 있는 개체를 의미하는 것으로서, 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 모르모트, 랫트, 마우스, 소, 양, 돼지, 염소 등과 같은 비인간 동물, 조류 및 어류 등이 있다.
더불어 본 발명은 (a) 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 PMK2를 포함하는 시료에 후보물질을 접촉시키는 단계; (b) 상기 PKM2 도메인에 대한 후보물질의 물리적 상호작용을 제 1항에 따른 vIRF3 유래 펩타이드 또는 이의 단편의 물리적 상호작용과 비교하는 단계; 및 (c) 상기 후보물질의 물리적 상호작용이 상기 vIRF3 유래 펩타이드 또는 이의 단편의 물리적 상호작용과 유사하거나, 더 큰 상호작용을 나타내는 경우, 상기 후보물질을 암 치료제로 선정하는 단계;를 포함하는, 암 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 후보물질은 상기 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 PMK2의 활성에 영향을 미치는지의 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 후보물질은 화학물질, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 안티센스-RNA, siRNA, shRNA, miRNA, 특이적인 항체 또는 천연물 추출물을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서 상기 "시료"는 가장 광범위한 의미로 사용된다. 한편으로 이는 검체 또는 배양물(예를 들어 미생물 배양물)을 포함하는 의미이다. 다른 한편으로는 생물학적 및 환경적 시료 양자 모두를 포함하는 의미이다. 더불어 시료는 합성 기원의 검체를 포함할 수 있다. 상기 생물학적 시료는 전혈(whole blood), 혈장(plasma), 혈청(serum), 객담(sputum), 눈물(tears), 점액(mucus), 세비액(nasal washes), 비강 흡인물(nasal aspirate), 호흡(breath), 소변(urine), 정액(semen), 침(saliva), 복강 세척액(peritoneal washings), 복수(ascites), 낭종액(cystic fluid), 뇌척수막 액(meningeal fluid), 양수(amniotic fluid), 백혈구(leukocytes), 말초혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cells), 백혈구 연층(buffy coat), 선액(glandular fluid), 췌장액(pancreatic fluid), 림프액(lymph fluid), 흉수(pleural fluid), 유두 흡인물(nipple aspirate), 기관지 흡인물(bronchial aspirate), 활액(synovial fluid), 관절 흡인물(joint aspirate), 기관 분비물(organ secretions), 세포(cell), 세포 추출물(cell extract) 및 뇌척수액(cerebrospinal fluid)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 vIRF3 유래 펩타이드, 이의 단편 또는 이를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 암의 예방 또는 개선용 의약외품을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 "의약외품"은 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 개선, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 물품들 중 의약품보다 작용이 경미한 물품들을 의미하는 것으로, 예를 들어 약사법에 따르면 의약외품이란 의약품의 용도로 사용되는 물품을 제외한 것으로, 사람 및/또는 동물의 질병 치료나 예방에 쓰이는 제품, 인체에 대한 작용이 경미하거나 직접 작용하지 않는 제품 등이 포함된다.
본 발명에 따른 vIRF3 유래 펩타이드, 이의 단편 또는 이를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 의약외품 첨가물로 사용하는 경우, 이를 그대로 첨가하거나 다른 의약외품 또는 의약외품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 함께 사용되는 다른 성분들과의 혼합비율은 사용 목적(예를 들어, 예방, 개선 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 의약외품 조성물은 연고제, 크림제, 겔제, 로션제, 액제, 드레싱제, 패취제, 수포제, 테이프제, 연무제, 외용산제 및 스프레이제 등으로 제형화될 수 있다.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 vIRF3 유래 펩타이드, 이의 단편 또는 이를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 암의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
더불어 본 발명은 본 발명에 따른 vIRF3 유래 펩타이드, 이의 단편 또는 이를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 식품 조성물은 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food), 식품 첨가제(food additives) 등의 모든 형태를 포함한다.
본 발명에 있어서 용어, "건강기능식품"이란 건강보조의 목적으로 특정성분을 원료로 하거나 식품 원료에 들어있는 특정성분을 추출, 농축, 정제, 혼합 등의 방법으로 제조, 가공한 식품을 말하며, 상기 성분에 의해 생체 방어, 생체리듬의 조절, 질병의 방지와 회복 등 생체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발휘할 수 있도록 설계되고 가공된 식품을 말하는 것으로서, 질병의 예방 또는 건강의 회복 등과 관련된 기능을 수행할 수 있는 것을 말한다.
본 발명에 따른 식품 조성물 또는 건강기능식품 조성물은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다.
예를 들면, 건강식품으로는 본 발명에 따른 vIRF3 유래 펩타이드, 이의 단편 또는 이를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취하거나 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 할 수 있다. 또한, 본 발명의를 암의 예방, 개선 또는 치료 효과가 있다고 알려진 공지의 물질 또는 활성 성분과 함께 혼합하여 조성물의 형태로 제조할 수 있다.
또한, 기능성 식품으로는 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마멀레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지콘비이프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치이즈 등), 식용식물유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등에 본 발명의 메트포민이 포함된 배지에서 배양한 치주인대줄기세포 배양액을 첨가하여 제조할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물 중 상기 본 발명의 본 발명에 따른 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 vIRF3 유래 펩타이드, 이의 단편 또는 이를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 바람직한 함유량으로는 이에 한정되지 않지만 예를 들어 최종적으로 제조된 식품 중 0.01 내지 80 중량%일 수 있으며, 바람직하게는 최종적으로 제조된 식품 중 0.01 내지 50 중량%일 수 있다.
또한, 본 발명의 식품 조성물을 식품 첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다.
상술한 본 발명의 내용은 상호 모순되지 않는 한, 서로 동일하게 적용되며, 당해 기술분야의 통상의 기술자가 적절한 변경을 가해 실시하는 것 또한 본 발명의 범주에 포함된다.
이하 본 발명을 실시예를 통해 상세하게 설명하나 본 발명의 범위가 하기 실시예로만 한정되는 것은 아니다.
실험예 1. 화학 물질 및 항체(항-아세틸(anti-acetyl) H3) 구입
독시사이클린(Doxycycline, DOX), 소듐 부티레이트(sodium butyrate, NaB) 및 D-글루코스 용액(D-glucose solution)은 시그마에서 구입하였다. PKM2 억제제 화합물인 3k는 셀렉켐(Selleckchem)에서, FCCP(Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone), 로테논(Rotenone), 안티마이신(Antimycin) A1, 2-DG(2-deoxy-D-glucose), 및 BMS-303141는 케이만 케미컬(Cayman Chemical)에서 구입하였다. 올리고마이신 복합체(Oligomycin complex)는 바이오비전(Biovision)에서 구입하였고, 1차 항체(Primary antibody)는 다음 제조업체에서 구입하였다: 항 아세틸화-라이신(anti-acetylated-lysine (6952S))은 셀시그널링 테크놀로지(Cell signaling technology)에서 구입하였고, 항-KSHV LANA(anti-KSHV LANA (LNA-1; 4013)) 및 항 기니피그((anti-Guinea pig) IgG-Alexa Fluor® 568 (ab-175714))는 Abcam에서 구입하였다. 항-MCL-1(anti-MCL-1 (sc-12756)), 항-GST(anti-GST) (sc-138)), 항-라민((anti-Lamin) A/C (sc-625)), 항-ORF45(anti-ORF45 (sc-53883)), 항-K8.1(anti-K8.1 (sc-65446)), 항-SMAD2(anti-SMAD2 (sc-101153)), 항-SMAD3(anti-SMAD3 (sc-101154)), 항-비멘틴((anti-Vimentin) (sc-6260)), 항-피브로닉텐((anti-Fibronectin) (sc-8422)), 항-N-카데린((anti-N-cadherin) (sc-59987)), 항 α-SMA(anti-α-SMA (sc-53142)) 및 항 아세틸 H3(anti-acetyl H3 (sc-32268))는 산타 크루즈(Santa Cruz)에서 구입하였다. 항 β-액틴(anti-β-actin (A-5441)), 항-FLAG(anti-FLAG (F1804)), 및 항-튜뷸린((anti-tubulin) (GTU-88))은 시그마에서 구입하였다. 항-V5(anti-V5 (MA5-15253))는 인비트로젠(Invitrogen)에서 구입하였고, 항-VE-카데린(( anti-VE-cadherin (555661))는 BD 파밍겐(BD Pharmingen)에서 구입하였으며, 항 HA(anti-HA (M180-3))는 MBL에서 구입하였다. 항-PKM1(anti-PKM1 (15821-1-AP)) 및 항-PKM2(anti-PKM2 (15822-1-AP))는 프로테인테크(Proteintech)에서 구입하였고, 항 SMAD7(anti-SMAD7 (NBP2-24710)) 및 항-LAN2(anti-LANA2 (NB200-167))는 노버스 바이오로지컬스(Novus biologicals)에서 구입하였으며, 항-알파 평활근 액틴((anti-alpha smooth muscle actin) (449004))은 시냅틱 시스템(Synaptic systems)에서 구입하였다.
실험예 2. KSHV vIRF3 유래 펩타이드 합성 및 이와 세포투과성 펩타이드의 결합
KSHV vRIF3 유래 250-280 펩타이드, KSHV vRIF3 유래 250-260 펩타이드, KSHV vRIF3 유래 260-270 펩타이드 및 KSHV vRIF3 유래 270-280 펩타이드는 (주)바이오닉스에 의뢰하여 합성하였다.
실험예 3. 분석 방법
3-1. 세포 배양 및 세포주 구축
293T, SLK 및 iSLK 세포는 10% FBS(Fetal bovine serum)과 1% P(penicillin)/S(streptomycin)(Corning)이 포함된 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)으로 배양하였다. LEC-E6/E7 세포는 200 μg/ml G418와 함께 VascuLife® VEGF 혈관내피세포 배지 완전 키트(endothelial medium complete kit (Lifeline cell technology))에서 유지하였다. vIRF3(viral interferon regulatory factor 3) 발현 LEC(lymphatic endothelial cells)를 확립하기 위해, E6/E7 불멸화 LEC를 다음과 같이 준비하였다. 먼저 HPV16 E6/E7을 발현하는 레트로바이러스(retrovirus) 생산 세포주 PA317-Lxsn에서 수득한 바이러스성 상층액(viral supernatant)을 미리 배양한 LEC에 폴리에틸렌(polybrene)과 함께 접종한 후, 2주간 선별 마커(selective marker)인 G418을 처리하여 레트로바이러스에 감염된 LEC만 선택적 배양하여 제작하였다. 이를 통해 E6/E7을 발현하여 불멸화된 LEC를 수득하였다. 이를 V5/vIRF3 발현 렌티바이러스에 당 분야에 공지된 방법으로 감염시켰다. 감염 48시간 후, 푸로마이신(puromycin (0.5 μg/ml))과 G418(200 μg/ml)을 사용하여 세포를 선별하였다. 일시적 감염(Transient transfection)은 PEI(Polyethylenimine hydrochloride (Sigma)) 또는 FuGENE HD(Promega)를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 수행하였다.
3-2. 플라스미드(Plasmid) 구축(construct)
pCMV-HA-hPKM2 플라스미드는 일본 나토리 미야기 암센터 연구소로부터 제공받았다. 더불어 vIRF3(Δ250-280) 돌연변이는 QuikChange XL 부위 지정 돌연변이 유발 키트(Agilent)를 사용하여 알라닌(alanine) 250에서 10개의 아미노산을 순차적으로 삭제하여 생성하였다. vRIF3 결실 돌연변이에 사용되는 프라이머 쌍은 다음과 같다. vIRF3(△250-260) 정방향 5'-GCTTGATAAAGAATCTATGGACATGCTAATGA-3'(서열번호 8), vIRF3(△250-260) 역방향 5'-TCATTAGCATGTCCATAGATTCTTTATCAAGC-3'(서열번호 9), vIRF3(△260-270) 정방향 5'-GCTTGATAAAGAATCTGAAGACCTCTTTGATC-3'(서열번호 10), vIRF3(△260-270) 역방향 5'-GATCAAAGGTCTTCAGATTCTTTATCAAGC-3'(서열번호 11), vIRF3(△270-280) 정방향 5'-GCTTGATAAAGAATCTGAGGATGTTATCGCAA-3'(서열번호 12), vIRF3(△270-280) 역방향 5'-TTGCGATAACATCCTCAGATTCTTTATCAAGC-3'(서열번호 13). GST-태깅된 vIRF3 250-260, 260-270, 270-280은 다음 프라이머를 사용하여 BamHI 및 NotI 제한 부위가 있는 pEBB-GST 벡터에 서브클로닝하였다. vIRF3(250-260) 정방향 5'- GATCCGCCACCATGGCATGTGCATTGATGTACCACGTGGGACAGGAGTAGGC-3'(서열번호 14), vIRF3(250-260) 역방향 5'- GGCCGCCTACTCCTGTCCCACGTGGTACATCAATGCACATGCCATGGTGGCG-3'(서열번호 15), vIRF3(260-270) 정방향 5'- GATCCGCCACCAT GGAGATGGACATGCTAATGAGGGCGATGTGCGATTAGGC-3'(서열번호 16), vIRF3(260 -270) 역방향 5'-GGCCGCCTAATCGCACATCGCCCTCATTAGCATGTCCATCTCCATGGTGCG-3'(서열번호 17), vIRF3(270-280) 정방향 5'-GATCCGCCACCATGGATGAAGACCTCTTTGATCTG CTTGGCATCCCATAGGC-3'(서열번호 18), vIRF3 270-280 역방향 5'-GGCCGCCTATGGGATGCCAAGCAGATCAAAGAGGTCTTCATCCATGGGTGGCG-3'(서열번호 19).
더불어 다음 프라이머를 사용하여 EcoRI 및 NotI 제한 부위가 있는 pCMV3 벡터에서 PKM2 절단 돌연변이를 생성하였다. PKM2 정방향 5'-GCGAATTCCAGCCACCATGTCGAAGCCCATAGTG-3', PKM2 225 역방향 5'-GCAACT AAGCGGCCGCTTAGTCCTTCTCCCGACACAGC-3', PKM2 402 역방향 5'- GAATCTTAGCGGCCGCCTTACGCCAGGCGGCGGAGTTC-3', PKM2 210 정방향 5'-GAGAATTCGCGCCACCATGAACCTTCCTGGGGCTGCT-3', PKM2 107 정방향 5'-GAGAATTCGCGCCACCATGCCCGTGCTGTGGCTCTA- 3', PKM2 역방향 5'-GATTCTATGCGGCCGCTCACGGCACAGG AACAAC-3'.
3-3. 재조합 KSHV 클론(iSLK-BAC16 세포주) 확립 및 특성 분석
iSLK-BAC16-Flag/vIRF3, vIRF3(△250-280) 및 복귀돌연변이체(revertant (Rev.))는 다음과 같이 준비하였다. 먼저, iSLK 세포에 FuGENE HD(Promega)를 사용하여 각 BAC16 DNA를 감염시켰다. 감염 2일 후, 1mg/ml 하이그로마이신 B(hygromycin B)를 사용하여 BAC16을 보유한 세포를 선별하였고, 3주간 하이그로마이신 B 선별을 수행한 후, 하이그로마이신 B 내성 iSLK-BAC16 세포주를 확립하였다. 재조합 바이러스의 재활성화를 위해 각 세포주에 1μg/ml DOX 및 1mM NaB를 처리하였다. 72시간의 재활성화 후, 플래그 항체(plag antibody)를 사용한 면역블롯 분석(immunoblot analysis)을 통해 세포를 수득하였다. 세포의 배양 생청액을 수집하고 0.45μm SFCA 주사기 필터를 이용해 여과하였다. 바이러스 관련 DNA(virion-associated DNA) 정제를 위하여, 상청액을 프로테아제 K(protease K)로 처리한 후, 페놀-클로로포름(penol-chloroform)으로 DNA를 추출하고 KSHV ORF11 특이적 실시간 정량 PCR(real-time quantitative PCR)을 수행하였다. BAC16 DNA의 연속 희석(serial dilution)을 사용한 표준 곡선을 기반으로 iSLK-BAC16 세포주에서 생성된 바이러스의 양을 계산하였다.
3-4. 세포 하위 분획(Subcellular Fractionation) 분석
세포를 분획(fractionation) 완충액(20 mM HEPES [pH 7.4], 10 mM KCl, 2 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM PMSF)에 용해한 다음 27G 바늘(30x)를 통과시켰다. 720g에서 15분간 원심분리한 후 핵(nuclear) 펠렛을 수득하였다. 더불어 12000g에서 15분간 원심분리하여 상층액을 제거하였다(세포질 분획(Cytoplasmic fraction)). 핵 펠렛은 NP-40 용해 완충액(150mM NaCl, 0.5% NP40, 50mM Tris[pH 8.0])에서 용해시켰다. 핵 및 세포질 분획을 모두 SDS(Sodium Dodecyl Sulfate) 로딩 염료와 혼합하고 면역 블롯팅으로 분석하였다.
3-5. 면역침전(Immunoprecipitation) 및 GST-풀 다운(Pull down)
표시된 세포를 플라스미드 조합의 유무에 관계없이 감염시켰다. 세포를 채취하여 프로테아제 억제제 혼합 정제(protease inhibitor cocktail tablet (Thermofisher))가 첨가된 용해 완충액(150 mM NaCl, 0.5% NP40, 50 mM Tris [pH 8.0])에서 용해시켰다. 세포 용해물을 표시된 단백질에 대하여 면역 침전시키고 당분야에 알려진 방법에 따라 면역 블롯팅으로 분석하였다.
3-6. PKM2 교차 결합(cross-linking) 및 그라디언트 PAGE 겔 러닝(gradient PAGE gel running)
293T 세포를 표시된 플라스미드 조합으로 감염시키고 감염 48시간 후에 수확하였다. 세포를 프로테아제 억제제(150 mM NaCl, 0.5% NP40, 50 mM pH 8.0 Tris-HCl)가 첨가된 NP-40 용해 완충액으로 용해하고 실온에서 4분동안 0.1% 글루타르알데히드(glutaraldehyde)를 처리했다. 그 후 NuPAGE 4-12% Bis-Tris gel (Invitrogen)로 그라디언트 SDS-PAGE를 수행하고 면역블롯팅으로 분석하였다.
3-7. 피루베이트 키나아제(Pyruvate kinase) 활성 분석
피루베이트 키나아제 활성 분석은 피루베이트 키나아제 분석 키트(Sigma Aldrich)를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 수행하였다. 간략하게, 각각 pCDH 벡터, vIRF3 및 vIRF3(△250-280)를 발현하는 LEC를 수확하고 1X PBS로 2번 세척하였다. 세포를 50 μl의 피루베이트 키나아제 분석 버퍼에 현탁하고 15분동안 배양하였다. 세포 잔해(debris)는 13,000 rpm으로 15분간 원심분리하여 제거하였다. 상층액을 96웰 플레이트에 옮기고 키나아제 분석 혼합물을 첨가하였다. 흡광도는 570nm 파장에서 마이크로판독기(Varioskan Lux microplate reader (Thermo scientific))를 이용하여 측정하였다.
3-8. 아세틸-CoA(Acetyl-CoA) 분석
아세틸-CoA 분석은 아세틸-CoA 분석 키트(Sigma Aldrich)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 수행하였다. 간략하게, LEC 세포주를 수확하고 50μl의 아세틸-CoA 분석 버퍼에 용해시켰다. 용해물을 과염소산(perchloric acid)으로 탈단백화시키고(deproteinized) KOH로 중화시켰다. 상층액을 96웰 플레이트에 옮기고 반응 혼합물과 혼합한 후 형광 강도를 λex=535 nm 및 λem=587 nm에서 측정하였다.
3-9. 젖산염 및 ATP(adenosine triphosphate) 분석
젖산염 및 ATP 분석은 Lactate-Glo and CellTiter-Glo (Promega)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 수행하였다. 간략하게 세포를 96웰 플레이트에 시딩(seeding)하고 24시간동안 배양하였다. 배양후 배양액과 세포를 각각 수득하였다. 배양 배지를 젖산염 검출 혼합물과 혼합하고 96웰 플레이트에서 1시간동안 배양하였다. 세포를 세척하고 1X DPBS로 현탁시킨 후, 같은 양의 CellTiter-Glo 시약을 첨가하였다. 세포 용해물을 10분간 배양한 후 96웰 플레이트에 옮겼다. 젖산염과 ATP 분석 혼합물의 RLU(relative luminescence unit)를 마이크로플레이트 판독기(Varioskan Lux microplate reader)로 측정하였다.
3-10. 대사산물(Metabolite) 추출 및 LC/MS 기반 대사체학 분석
pCDH, V5/vIRF3, 또는 V5/vIRF3(△250-280)를 각각 보유한 LEC-E6/E7 세포주를 100mm 세포 배양 플레이트에 시딩하였다. 48시간 후, 세포를 80% 저온의 메탄올에 수확하였다. 이를 BeadRuptor Elite (Omni)를 이용하여 0.1 mm 지르코니아(zirconia)/ 실리카(silica) 비드로 균질화하였다(homogenized). 비드와 세포 잔해는 13,000 rpm으로 10분간 원심분리하여 제거하였다. 상층액은 크라이오튜브(cryotube)로 옮기고 액체 N2로 동결건조하였다. 샘플은 LC/MS로 분석하기 전에 -80℃에서 보관했다. 당 분야에 공지된 방법에 따라 이로부터 대사산물을 추출하였고, 추출된 대사산물은 Cogent Diamond Hybride C형 컬럼(구배 3)에서 분리되었고 다음으로 구성된 이동상을 사용하여 대사산물의 LC/MS 분석을 수행하였다(0.2% 포름산 사용). 사용된 구배 및 시간 조건은 다음과 같다: 0 - 2분, 85% sol B; 3 - 5분, 80% sol B; 6 - 7분, 75% sol B; 8 - 9분, 70% sol B; 10 - 11.1분 50% sol B; 11.1 - 14분 20% sol B; 14.1 - 24분 5% solB에 이어 0.4 mL/분의 유속으로 85% solB에서 10분 재평형 기간. 이때 Agilent 1290 액체 크로마토그래피(LC) 시스템과 결합된 Agilent Accurate Mass 6230 비행시간형 질량분석기(time of flight mass spectrometer)를 사용하였다. 검출된 이온은 수반되는 동위원소의 예상 분포를 나타내는 질량에 대한 고유한 정확한 질량 보유 시간 식별자를 기반으로 대사산물로 간주하였다. 0.005 Da 미만의 질량 허용 오차를 사용하여 대사산물 식별을 검색했으며,. Profinder B.08.00 및 Agilent Qulitative Analysis B.07.00(Agilent Technologies)을 사용하여 풍부한 추출 대사체 이온 강도를 추출했다.
3-11. 면역 형광(Immunofluorescence) 분석
유리 디스크에 시드된 세포를 4% 파라포름알데히드(Sigma)로 고정하고 0.1% 트리톤 X-100(Triton X-100 (Sigma))으로 투과화했다(permabilized). 표시된 단백질을 표적으로 하는 1차 항체를 제조사에서 권장하는 농도로 희석하여 세포에 첨가하였다. FITC, 로다민(Rhodamine) 또는 알렉사 플루오르® 568(Alexa Fluor® 568)과 접합된 2차 항체를 희석하여 세포에 첨가하였다. 염색 후, DAPI(Vector Laboratories)가 포함된 마운팅(mounting) 용액을 슬라이드 유리 위에 떨어뜨리고 세포가 놓인 디스크를 마운팅 용액위에 놓았다. 준비된 슬라이드를 공초점 레이저 주사 현미경(Confocal laser scanning microscope LSM-700 (Carl Zeiss))으로 분석하였다.
3-12. 트랜스웰 세포 이동(Transwell cell migration) 분석
8μm 기공 크기의 24웰 트랜스웰 인서트(transwell insert (Corning))를 사용하여 트랜스웰 세포 이동 분석을 수행하였다. 10% FBS를 함유한 세포 배양액을 24웰 플레이트의 각 웰에 첨가하고 트랜스웰 인서트를 각 웰에 배치하였다. LEC 세포주를 채취하고 이를 무혈청 배양액에 다시 현탁하였다. 세포 현탁액을 트랜스웰 인서트에 첨가하고 16시간동안 배양하였다. 배양 후, 세포를 고정하고 1% 포름알데히드(formaldehyde) 및 25% 메탄올(methanol)을 함유한 0.05% 크리스탈 바이올렛(crystal violet) 용액으로 염색하였다. 트랜스웰 상단의 이동하지 않은 세포는 면봉으로 제거하고 트랜스웰을 1X PBS로 세척하였다. 트랜스웰 바닥면의 이동된 세포를 EVOS-M500 imaging system (Thermo scientific)으로 계수하고 이미지화하였다.
3-13. 3D 스페로이드 침입(3D spheroid invasion) 분석
LFC 세포주를 96웰 ULA(ultra-low attachment) 플레이트(Corning)에 시딩하고 48시간동안 배양하였다. 스페로이드는 96웰 플레이트의 3mg/ml 매트리젤(matrigel (Corning)) 층으로 옮겨 37℃에서 2시간동안 배양하였다. 배양 후 상층(upper layer)을 만들기 위해 매트리젤을 웰에 추가하였다. 배양 배지극 상층에 추가하고 3일간 배양하였다. 스페로이드가 포함된 메트리젤 매트릭스(matrix)를 아세톤(acetone)/메탄올(methanol)(1:1)로 고정하고 차단(blocking) 완충액(15% 열-비활성화된(heat-inactivated) PBS, 0.3% 트리톤 X-100(1X PBS))을 처리하여 차단하였다. 그런 다음, 표시된 1차 및 2차 항체로 스페로이드를 염색한 후, 공초점 레이저 주사 현미경(LSM-700)으로 z-스택(z-stack) 분석을 수행하였다.
3-14. CAM(Chorioallantoic membrane) 침입 분석
닭의 수정란을 Rcom D-50 인큐베이터(Autoelex)에서 37.5℃, 70% 가습분위기에서 배양하였다. 배아 발생일(embryonic day, ED) 5일 후, 달걀 껍질에 1.5cm의 정사각형 구멍을 뚫고 멸균 파라필름 테이프로 밀봉하였다. 배아는 매일 촛불하에서 모니터링하였다. 10일째 되는 날, 멸균 실리콘 링(silicone ring)을 배아의 CAM에 배치하고 표시된 세포를 링에 추가한 후, 세포를 파종하였다. 파중 24시간 및 48시간에 0.2mg의 TAT(HIV-1의 TAT 서열만 가지는 대조군 펩타이드(바이오닉스에서 합성)) 또는 본 발명에 따른 TAT-VDP(TAT 서열과 vRIF3 유래 aa250-260 펩타이드 결합(바이오닉스에서 합성))를 처리하였다. 실리콘 링 주위의 약 1cm2의 CAM을 채취하여 4℃에서 24시간동안 4% 파라포름알데히드로 고정하였다. 그런 후 샘플을 면역조직화학(immunohistochemistry) 및 H&E(Hematoxyling and Eosin) 염색을 위해 처리하였다.
3-15. 이종이식(Xenograft) 모델
vIRF3를 발현하며 E6/E7의 발현을 통해 불멸화된 LEC(LEC-E6/E7/V5/vIRF3)를 PBS로 세척한 후 7주량 암컷 무혈성 NCr-nu/nu 마우스(Koatech)에 피하주사하였다. 각 실험군마다 15마리의 마우스를 사용하였다. TAT 또는 TAT-VDP 펩타이드를 1X DPBS에 용해하여 세포 접종 3일 후 주 2회, 1회당 0.2 mg의 용량으로 세포 주입 부위에 피하 투여하였다. 30일 동안 매일 TAT와 TAT-VDP 처리 마우스간의 체중과 종양 부피를 비교하여 종양 성장 억제를 모니터링하였다. 종양의 부피는 하기 수학식 1을 통해 계산하였다.
[수학식 1]
종양 부피=1/2(길이×너비2)
30일간의 모니터링 후, 종양 퇴행을 평가하기 위해 TAT-VDP를 TAT를 처리한 실험군에 투여하였다. 모든 데이터는 GraphPad Prism software 및 two-tailed unpaired t-test를 통해 분석하였다.
3-16. 면역조직화학(Immunohistochemistry)
마우스를 안락사시킨 후, 장기 및 종양을 해부하고 즉시 4% 파라포름알데히드로 고정시켰다. 24시간 고정 후, 조직 샘플을 이용하여 Genoss(수원, 한국)를 통해 면역조직화학을 수행하였다.
3-17. 통계
통계 분석은 GraphPad 프리즘 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. P-값은 스튜던트 t-test(Student’s t-tes) 또는 일원 분산분석(One-way ANOVA) 테스트를 통해 계산하였다. P<0.05는 통계적 유의성을 나타내며, 데이터는 평균 ± SD(mean ± SD)로 표시하였다.
실시예 1. LEC에서 KSHV vIRF3와 PKM2의 상호작용 확인
LEC(lymphatic endothelial cells)에서 KSHV vIRF3 상호작용 네트워크를 확인하기 위해, V5-태그 vIRF3를 발현하는 LEC를 사용하여 질량분석법(mass spectrometry analysis)을 수행하였다. 그 결과, 분자 질량이 ~60kDa인 폴리펩타이드(polypeptide)가 PKM(pyruvate kinas M)인 것으로 확인되었다(도 1a). PKM 유전자는 대체 스플라이싱(alternative splicing)에 의해 생성되는 PKM1과 PKM2를 암호화한다. 두 PKM은 모두 해당 과정(glycolysis)의 마지막 단계에서 촉매 작용을 통해 PEP(phosphoenolpyruvate)를 피루베이트(pyruvate)로 전환하고 ATP를 생성한다. PKM1은 근육이나 뇌와 같은 말단 분화 조직(terminally differentiated tissues)에서 발현되는 반면, PKM2는 줄기세포, 배아세포, 종양 세포와 같이 고도로 증식된 세포에서 주로 발현된다. 또한 PKM2는 LECs에서만 발현되는 반면, PKM1은 LECs에서 전사 수준에서 검출되지 않았다(도 1b). 이에 면역 침전법(immunoprecipitation)을 통해 vIRF3가 PKM2와 상호작용함을 확인하였다(도 1c). vIRF3 N-터미널 도메인(N-terminal domain(1~150; TM1)), 센트럴 도메인(central domain(151~430; TM2)), C-터미널 도메인(C-terminal domain(430~566; TM3)) 및 야생형 vIRF3와의 결합을 침전법을 통해 확인해본 결과 vIRF3 야생형 및 TM2 (151~430) domain이 결합하는 것을 확인하였다 (도 1d). 더 나아가 vIRF3와 PKM2 간의 상세한 결합 분석 결과, vIRF3250-280이 PKM2210-402에 특이적으로 관여하는 것으로 나타났다(도 1d 및 도 1E). 더불어, V5-태그가 부착된 vIRF3 또는 vIRF3(△250-280)를 외배엽적으로 발현하는 LEC 라인을 생성하였다. 이를 면역 침전법으로 분석한 결과, vIRF3는 내인성 PKM2와 상호작용했지만, vIRF3 유래의 단편(250-260, 260-270, 270-280)이 결손된 돌연변이체는 PKM2와 결합하지 않는 것을 확인하였다(도 1E). 상기와 같은 결과를 통해, vIRF3의 250 내지 280aa 부위가 PKM2 결합에 필요한 부위임을 다시 한번 확인하였다.
실시예 2. KSHV vIRF3-PKM2 상호작용에 의한 PK(pyruvate kinase) 활성 향상 확인
이합체(dimeric)와 사량체(tetrameric) 형태 사이의 PKM2의 생물학적 특성은 상당히 다른 것으로 알려져 있다. 사량체 형태는 주로 PK로 작용하는 해당 과정뿐만 아니라 산화적 인산화(oxidative phosphorylation)를 촉진하는 반면, 이합체 PKM2는 핵에서 전사 보조인자(transcriptional co-factor)로서의 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 이에 vIRF3-PKM2 상호작용이 PKM2 알로스테릭 상태(allosteric state)에 영향을 미치는지 조사한 결과, LEC에서 vIRF3를 발현했을 때, vIRF3는 PKM2의 사량체화를 크게 향상시킨 반면, vIRF3(△250-280)는 영향을 미치지 않음을 확인하였다(도 2a). 또한, vIRF3는 세포질에서 PKM2의 축적을 유도했으며, 핵에서도 PKM2 발현을 하향 조절시켰다(도 2b). vIRF3 매개 PKM2 사량체화의 역할을 더 확인하기 위하여 PK 효소 활성을 측정하였다. 그 결과, KSHV vIRF3의 존재는 PK 활성과 관련된 아세틸-CoA 농도를 증가시킨 반면, 같은 조건에서 젖산염 농도는 감소되었다(도 2c). 한편 vIRF3(△250-280)는 vIRF3와 달리 PK 효소 활성 및 이와 관련된 상태에 변화를 유도하지 않음을 확인하였다.
실시예 3. TCA 주기 대사산물에서 KSHV vIRF3-PKM2 상호작용 확인
전체 길이 vIRF3 발현이 LEC 세포 대사에 미치는 영향을 연구하기 위해 LEC-벡터, LEC-V5/vIRF3 및 LEC-V5/vIRF3(△250-280)을 2D 단층 조건에서 배양했다. vIRF3로 유도된 LEC 대사체를 추출하고 그 변화를 Metaboanalyst v5.0을 이용하여 분석하였다. 이때 TCA 사이클 중간체에 초점을 맞추어 분석하였다. 첫째, LEC-vIRF3에서 벡터 단독 또는 vIRF3(△250-280) 돌연변이와 비교하여 LEC-vIRF3에서 풍부한 피루베이트 및 아세틸-CoA가 유의하게 증가한다는 것을 발견했다. 상기 아세틸-CoA는 젖산염은 아니었다. 향상된 수준의 아세틸-CoA는 시트레이트, 알파 KG, 숙시네이트, 푸마레이트 및 숙시네이트를 포함하는 모든 TCA 주기 중간체의 증가된 생합성에 의해 확인된 TCA 주기 중간체의 기질로서 우선적으로 사용되었다. 흥미롭게도 축적된 글루타메이트와 글루타민도 관찰했다. 당분해 플럭스와 글루타민 분해 사이의 TCA 주기 중간체의 기원을 명확히 하기 위해, 단일 탄소원으로 완전히 13C 표지된([U-13C]) 포도당을 사용하여 13C 동위원소 추적 실험을 수행했다. 예상대로, 강화된 피루브산은 삼탄당인산염이성화효소(Triose-phosphate isomerase)의 촉매 활성에 의해 vIRF(△250-280)가 아니라 전체 길이 vIRF3를 과발현하는 LEC에서 주로 M+3으로 구성된다. 그런 다음 피루브산은 PKM2의 기질 역할을 하여 주로 M+1 또는 M+2 동위원소인 아세틸-CoA를 생성한다. 아세틸-CoA는 TCA 주기 중간체의 기질로 직접 사용되기 때문에 M+2는 모든 TCA 주기 중간체의 주요 동위원소 구성요소이며, 이는 vIRF3 매개 아세틸-CoA의 향상된 생합성이 증가된 PKM2 촉매 활성에 의해 매개된다는 가설을 뒷받침하고 아세틸-CoA는 TCA 주기 중간체 생합성의 기질 역할을 한다. 또한 글루타메이트의 강화된 생합성이 주로 알파 KG를 사용하여 매개됨을 확인했다. 우리는 또한 LEC-vIRF3(△250-280)이 아닌 LEC-vIRF3에서 아세틸화된 프롤린, 라이신 및 세린의 수준이 증가하는 것을 관찰했다. 13C 동위원소 추적 실험은 또한 vIRF3-PKM2에 의해 축적된 아세틸-CoA가 아미노산을 아세틸화하기 위한 기질 역할도 한다는 것을 확인했다.
실시예 4. KSHV vIRF3-PKM2가 피루브산 이화 작용(pyruvate catabolism)에서 유래한 세포내 아세틸-CoA에 미치는 영향 확인
아세틸-CoA는 히스톤(histone)뿐만 아니라 단백질의 아세틸화 반응을 위한 아세틸기를 제공하는 역할을 하는 중요한 대사산물이다. vIRF3에 의한 LEC의 아세틸-CoA 상향 조절의 중요성을 더 확인하기 위하여, 먼저 vIRF3가 LEC의 총 아세틸화 수준을 증가시킬 수 있는지 여부를 확인하였다. 이를 위해 세포 용해물을 안티-아세틸-라이신 항체(anti-acetyl-lysine antibody)를 이용해 IB(immunoblotting ) 분석하였다. 대사체학 분석과 일치하게, 구성적(constitutive) vIRF3 발현은 LEC에서 전체 아세틸화 수준을 극적으로 증가시켰다(도 4a). 특히, 수많은 세포 단백질의 활성, 안정성 또는 국소화를 조절하는 단백질의 라이신 아세틸화(lysine acetylation)에 관여하는 세포질 아세틸-CoA는 주로 미트콘드리아에서 세포질로 시트레이트가 ACLY(ATP-citrate lyase)를 통해 전위(translocation)되어 생성된다. 따라서 pCDH, V5-vIRF3 및 V5-vIRF3(△250-280)의 발현 벡터를 코딩하는 세 개의 LEC 안정 세포주를 ACLY 억제제 BMS303141로 처리한 다음 안티-아세틸-라이신 항체를 이용해 IB 분석하였다. 그 결과 총 아세틸화 수준의 증가를 확인할 수 없었으므로, 이는 아세틸화 증가가 TCA 사이클 유래 시트레이트(citrate)에서 기인한 것임을 확인하였다(도 4b).
한편, 증가된 TGF-β 신호전달은 EndMT 관련 질병의 주요 기본 메커니즘으로 인식되고 있다. 더불어 BEC(blood endothelial cells)에서 세포내 아세틸-CoA 수준과 SMAD7 신호의 변화가 EndMT에 중요하다고 보고된 바 있다. 따라서 vIRF3-PKM2 상호작용을 매개로 한 높은 수준의 아세틸-CoA가 TGF-β 신호에 영향을 미치는지 조사하기 위하여, TGF-β 하류 인자(downstream effector)인 SMAD에 대한 지시 항체를 사용한 풀다운 분석(pull down assay)과 아세틸-라이신 항체를 사용한 IB를 수행하였다. 그 결과 vIRF3 발현은 SMAD2와 SMAD3의 아세틸화를 증가시켰지만 억제성 SMAD인 SMAD7은 증가시키지 않음을 확인하였다(도 4b). 그러므로 이를 통해 vIRF3-PKM2와 관련된 높은 수준의 아세틸-CoA가 내인성(endogenous) TGF-β 신호를 증가시킴을 알 수 있었다.
실시예 5. vIRF3-매개 SMAD2 및 SMAD3 아세틸에 의한 영향 확인
EndMT를 유도하기 위해서는 SMAD2와 SMAD3를 매개로 한 TGF-β 신호의 활성화가 모두 필요하다는 점을 기반으로, 다음으로 LEC-vIRF3가 전형적인 내피 세포 마커(endothelial cell maker)를 억제하면서 전형적인 중간엽 마커(mesenchymal maker)를 발현할 수 있는지 여부를 확인하였다. 그 결과, 내피 세포 마커 중 LYVE-1 및 VE-카데린이 vIRF3에 의해 현저히 감소되는 것을 확인하였다. 반면, 상향 조절된 중간엽 마커(비멘틴, 파이브로넥틴, N-카데린 및 α-평활근 액틴(α-SMA))는 감소했다. 그러나 LEC-vIRF3(△250-280)는 PKM2와 상호작용하지 않고 내피세포 마커를 하향조절하지 않았으며, 중간엽 마커를 상향조절하지도 않았다(도 5a).
중간엽 세포의 주요 특성은 이동 능력이 증가함에 따라 침습성이 높아지는 것이기 때문에, 먼저 보이든 챔버 분석(boyden chamber assay)을 사용하여 vIRF3에 이한 이동의 잠재적인 기능적 기여를 조사하였다. pCDH, V5-vIRF3 및 V5-vIRF3(△250-280)을 발현하는 3개의 LEC 안정 세포주를 8㎛-기공 크기 트랜스웰의 상부 챔버에 도말하고 16시간 후 이동을 측정했다. 그 결과, vIRF3 발현 LEC는 증가된 이동 행동(2배)을 보인 반면, vIRF3 발현(△250-280)은 벡터 세포주와 차이가 없었다(도 5b).
LEC-vIRF3의 침습 능력을 추가로 조사하기 위해, 3개의 LEC 안정 세포주를 사용하여 3D 매트리젤 내에 다세포 종양 유발 스페로이드(multicellular tumorigenic spheroids)를 삽입하는 3D 스페로이드 침습 분석을 수행하였다. 침습성을 분석하기 위해 세포로 덮인 영역을 코어(core), 중간, 가장자리의 세 가지 고유한 하위 영역으로 나누었다. 코어는 세포가 촘촘하게 모여있는 중심부, 중간 영역은 세포가 다소 느슨하게 모여 이는 영역, 가장자리는 세포가 주변 영역으로 침입하는 영역을 나타낸다. 이동 분석 데이터와 동일하게, 코어 영역은 20%만 검출되었고, 중간 영역과 가장자리 영역 모두 vIRF3 발현시 현저하게 증가하였다. 이와 대조적으로 벡터와 V5-vIRF3(△250-280) 발현은 매개체의 과장자리 부분이 관찰되었다. 더불어 공초점 현미경 분석 결과, 벡터 및 V5-vIRF3(△250-280)와는 대조적으로 vIRF3 자극 스페로이드의 침습은 중간엽 마커(αSM, 피브로넥틴)을 발현했지만 EC 마커인 VE-카데린은 극히 희미한 신호를 보였다(도 5c).
이를 통해 vIRF3-PKM2 상호작용에 의해 유도된 LEC의 중간엽 리프로그래밍이 KSHV 관련 종양 형성에 결정적인 역할을 할 수 있는 이동 및 침입을 유도한다는 것을 확인하였으며, vIRF3(△250-280)는 이를 유도하지 않으므로, 이를 이용하여 KSHV 관련 종양 형성을 억제할 수 있음을 확인하였다.
실시예 6. 이종이식모델에서 KSHV vIRF3 및 PKM2 상호작용이 미치는 영향 확인
KSHV 관련 병인에서 vIRF3-PKM2 상호 작용을 통한 EndMT의 역할을 조사하기 위해 먼저 WT-, MT- 또는 Rev-BAC16 KSHV가 감염된 LEC로 피하 이종 이식 실험을 수행한 다음 종양 발달, 부피, 무게, 그리고 체중을 확인하였다. 그 결과 WT- 및 Rev-BAC16 KSHV에 감염된 LEC는 모두 MT-BAC16 KSHV에 감염된 LEC와 비교하여 효과적으로 종양 개시 및 촉진을 야기하였다(도 6a 및 도 6b). 이에 vIRF3-PKM2 관련 EndMT가 다른 내부 장기에서 암세포를 관찰하는 이차 종양을 유도할 수 있는지 여부를 조사하기 위하여, 세 가지 다른 KSHV 감염 세포를 이식한 후 30일 후에 마우스를 희생시켰다. 흥미롭게도, 도 6a 및 6b에 표시된 종양 촉진 결과와 일치하여 WT- 및 Rev-BAC16 KSHV 모두에서 형태학적으로 비정상적인 기관을 발견했으며 위, 비장, 간 등을 포함한 여러 다른 기관에서 KSHV 게놈의 존재를 나타내는 GFP 발현을 감지했다.
실시예 7. KSHV vIRF3 유래 펩타이드의 vIRF3 매개 PKM2 기능 억제 효과 확인
상기 결과를 기반으로, vIRF3의 아미노산 250~280 영역이 PKM2와의 상호작용에 중요한 역할을 한다는 것을 확인한 바, 이의 단편인 vIRF3(250-260), vIRF3(260-270) 및 vIRF3(270-280) 또한 PKM2에 결합하는지 확인한 결과, vIRF3(250-260), vIRF3(260-270) 및 vIRF3(270-280)도 PKM2와 상호 결합함을 확인하였다(도 7).
더불어 vIRF3 유래 aa250-260 펩타이드(이하 'VDP'로 명명)가 피루브산 대사 사이클에 미치는 영향을 확인하였다. 이에 있어, 세포 내 전달을 위해 VDP를 HIV-1 TAT 단백질 전달 도메인과 융합했다. 그런 다음 LEC-V5-vIRF3 또는 LEC-벡터 세포를 TAT 또는 TAT-VDP로 처리한 다음 PK 활성 및 이의 하류 대사산물 축적을 측정하는 여러 검정을 수행했다. 비교 동역학 분석 결과, VDP가 LEC에서 vIRF3 발현에 의해 상향 조절되는 PK 활성, 아세틸-CoA 농도 및 ATP 농도를 효과적으로 억제하는 반면, LEC 벡터 세포에서는 영향을 미치지 않는다는 것을 확인하였다(도 8c). 그런 다음 VDP가 vIRF3 결합 경쟁을 통해 vIRF3 매개 높은 수준의 PK 활동을 감소시킬 수 있는지 여부를 조사했다. 이를 위해 LEC-V5-vIRF3를 TAT 또는 TAT-VDP로 처리한 후 항-PKM2 항체로 면역침전을 수행하였다. TAT 처리와 달리 VDP는 vIRF3-PKM2 상호 작용을 효율적으로 차단했다(도 8a). 더욱이, 예상한 바와 같이, TAT-VDP는 PKM2와의 상호작용을 위해 vIRF3과 경쟁함으로써 PKM2의 vIRF3-매개 사량체 형태를 충분히 방지하였다 (도 8b).
또한 VDP의 항침습 활성을 평가하기 위해 LEC-V5-vIRF3를 병아리 융모요요막(CAM)에 주입했다. Ovo에서 침입 확립 후 TAT 또는 TAT-VDP를 처리한 다음 면역조직화학(IHC)을 위해 CAM을 수확했다. CAM의 조직학적 구조는 외배엽, 중배엽 및 내배엽의 세 가지 주요 배엽층을 포함한다. 그 결과, LEC-V5-vIRF3는 CAM의 중배엽층으로 침입하도록 유도하지만, LEC-벡터는 CAM의 외배엽층만을 검출하였다(도 8d). 특히, VDP 처리된 LEC-V5-vIRF3는 외배엽 군단으로 미미하게 침범한 반면, TAT 처리는 vIRF3 매개 침습 능력에 영향을 미치지 않았으며, 이는 VDP가 침습 활동을 효과적으로 억제했음을 시사한다(도 8d). VDP의 항종양 활성을 추가로 확인하기 위해 재조합 KSHV 감염 LEC를 피하 주사한 NOD/SCID 이종이식 마우스를 활용했다. KSHV에 감염된 LEC를 주사한 후, 우리는 30일 동안 매주 2회 각 펩티드에 0.2mg(~uM에 해당)을 마우스에 챌린지했다. TAT-VDP로 처리한 결과, TAT 처리한 실험군과 달리 종양 형성이 현저하게 억제됨을 확인하였다(도 8e). 따라서 본 발명에 따른 vRIF3 유래 펩타이드는 우수한 항종양 활성을 가짐을 확인하였다.
종합적으로 본 발명에 따른 KSHV(Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus) vIRF3 유래 펩타이드는 PKM2의 활성을 억제하고 종양의 크기 및 부피를 감소시키며, 암 세포의 이동 및 침입을 억제하는 효과가 있는 바, 이를 암 예방, 개선 또는 치료 용도 또는, 암 세포의 전이 억제를 위하여 유용하게 활용할 수 있다.

Claims (17)

  1. 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 vIRF3(viral interferon regulatory factor 3) 유래 펩타이드 또는 이의 단편.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 vIRF3 유래 펩타이드는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 vIRF3의 aa 250-280인 것을 특징으로 하는, vIRF3 유래 펩타이드 또는 이의 단편.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 단편은 서열번호 3 내지 5 로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 1종의 아미노산 서열로 이루어진 vIRF3 유래 펩타이드의 단편인, vIRF3 유래 펩타이드 또는 이의 단편.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 vIRF3는 KSHV(Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus) vIRF3인 것을 특징으로 하는, vIRF3 유래 펩타이드 또는 이의 단편.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 vIRF3 유래 펩타이드에 세포 투과성 도메인이 더 결합된 것을 특징으로 하는, vIRF3 유래 펩타이드 또는 이의 단편.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 세포 투과성 도메인은 HIV TAT 펩타이드인 것을 특징으로 하는, vIRF3 유래 펩타이드 또는 이의 단편.
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 세포 투과성 도메인이 더 결합된 vIRF3 유래 펩타이드는 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, vIRF3 유래 펩타이드 또는 이의 단편.
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 vIRF3 유래 펩타이드 또는 이의 단편은 PKM2(pyruvate kinase M2)의 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는, vIRF3 유래 펩타이드 또는 이의 단편.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 vIRF3 유래 펩타이드, 이의 단편 또는 이를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  10. 제 9항에 있어서,
    상기 암은 PKM2(pyruvate kinase M2)를 과발현하는 암인 것을 특징으로 하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  11. 제 10항에 있어서,
    상기 암은 폐암, 전립선암, 대장암, 유방암, 림프종, 신장암, 췌장암, 간암, 난소암 및 담낭암으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  12. 제 9항에 따른 약학적 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 인간을 제외한 개체의 암 예방 또는 치료 방법.
  13. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 vIRF3 유래 펩타이드, 이의 단편 또는 이를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 암의 이동 또는 전이 억제용 약학적 조성물.
  14. (a) 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 PMK2를 포함하는 시료에 후보물질을 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 PKM2 도메인에 대한 후보물질의 물리적 상호작용을 제 1항에 따른 vIRF3 유래 펩타이드 또는 이의 단편의 물리적 상호작용과 비교하는 단계; 및
    (c) 상기 후보물질의 물리적 상호작용이 상기 vIRF3 유래 펩타이드 또는 이의 단편의 물리적 상호작용과 유사하거나, 더 큰 상호작용을 나타내는 경우, 상기 후보물질을 암 치료제로 선정하는 단계;를 포함하는, 암 치료제의 스크리닝 방법.
  15. 제1항 내지 제 8항 중 어느 한 항의 vIRF3 유래 펩타이드, 이의 단편 또는 이를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 암의 예방 또는 개선용 의약외품.
  16. 제1항 내지 제 8항 중 어느 한 항의 vIRF3 유래 펩타이드, 이의 단편 또는 이를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 암의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  17. 제1항 내지 제 8항 중 어느 한 항의 vIRF3 유래 펩타이드, 이의 단편 또는 이를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
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