CN107849543A - 治疗性肽 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了用于治疗和/或预防糖尿病性视网膜病的肽。本发明的肽包含甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶(GAPDH)结合序列和/或E3泛素连接酶七失神同源物1(Siah1)结合序列以及内化序列。

Description

治疗性肽
发明领域
本发明涉及与甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)和/或E3泛素连接酶、七失神同源物1(seven in absentia homolog 1，Siah1)结合的肽，以及其在糖尿病性视网膜病的治疗或预防中的用途。
背景技术
糖尿病性视网膜病(DR)是世界范围内失明的主要原因，并且其患病率正在增长。目前DR的疗法只涉及疾病的后期，其是侵入性的并且具有有限的有效性。视网膜周细胞死亡是DR的早期病理特征。尽管在糖尿病患者和DR的动物模型中已经观察到周细胞死亡，但是周细胞死亡的原因仍然是未知的。最近在眼组织中鉴定了由甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)与E3泛素连接酶七失神同源物1(Siah1)之间的相互作用引起的新促凋亡途径。
本发明要解决的问题是提供用于治疗或预防糖尿病性视网膜病的新治疗性肽。
概述
本发明提供了包含甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)结合序列和/或E3泛素连接酶七失神同源物1(Siah1)结合序列以及内化序列的肽。
在特定的实施方案中，本发明的肽从N-末端起顺序包含内化肽以及GAPDH结合序列和/或Siah1结合序列。
在本发明的特定实施方案中，内化序列是阳离子内化序列，优选包含Seq.Id.No.3的序列。
在特定的实施方案中，本发明的肽包含GAPDH结合序列和内化序列。
在特定的实施方案中，本发明的肽包含Siah1结合序列和内化序列。
在本发明的特定实施方案中，GAPDH结合序列包含Seq.Id.No.1。
在本发明的特定实施方案中，Siah1结合序列包含Seq.Id.No.2。
在本发明的特定实施方案中，肽的N-末端是乙酰化的。
在本发明的特定实施方案中，肽的C-末端是酰胺化的。
本发明还涉及用作治疗活性物质的如上所述的肽，特别是在治疗糖尿病性视网膜病中使用的如上所述的肽。
本发明还涉及包含如上所述的肽和治疗惰性的载体的药物组合物。
本发明提供包含编码如上所述的肽的核酸序列的载体。
本发明提供包含如上所述的载体的宿主细胞。
附图简述
图1：高葡萄糖引起Siah1总蛋白的上调。当与用正常葡萄糖(5mM)或L-葡萄糖(25mM)(渗透对照)(A)处理的细胞相比时，用高葡萄糖(25mMD-葡萄糖)处理48小时的hRP具有增加的Siah1总蛋白水平(图1A)。三个独立实验的定量在图1B中显示。
图2：高葡萄糖导致GAPDH与Siah1之间的缔合的增加。细胞用正常葡萄糖(5mM)、L-葡萄糖(25mM)或高葡萄糖(25mM)处理48小时。当与用正常葡萄糖或L-葡萄糖处理的细胞相比时，用高葡萄糖处理的hRP具有更高水平的与Siah1缔合的GAPDH(图2A)。用10μMSiah1siRNA(C)或1μM阻断GAPDH/Siah1的TAT-FLAG肽(图2E)抑制GAPDH/Siah1途径抑制了高的葡萄糖诱导的GAPDH/Siah1缔合。三个独立实验的定量在图2B、2D和2F中显示。
图3：高葡萄糖引起GAPDH核转位。当与用正常葡萄糖(5mM)或L-葡萄糖(25mM)处理的细胞相比时，GAPDH的核水平在用高葡萄糖(25mM)处理48小时的hRP中显著增加(图3A)。用Siah1siRNA进行处理抑制了高葡萄糖诱导的GAPDH核转位(图3C)。还能够通过使用TAT-FLAG肽抑制GAPDH/Siah1结合位点来阻止GAPDH的转位(图3E)。三个独立实验的定量在图3B、3D和3F中显示。
图4：GAPDH核转位的免疫细胞化学分析。HRP用4A)无一抗对照、(4B)正常葡萄糖(5mM)、(4C)L-葡萄糖(25mM)和(4D)高葡萄糖(25mM)(在存在或不存在(4E)对照肽或(4F)GAPDH肽的情况下)进行处理。GAPDH显示为红色，而DAPI-染色的细胞核显示为蓝色。
图5：GAPDH/Siah1信号传导途径的抑制阻断了高葡萄糖诱导的hRP凋亡。细胞用正常葡萄糖(5mM)、L-葡萄糖(25mM)或高葡萄糖(25mM)处理48小时。测量胱天蛋白酶-3(Caspase-3)酶活性水平和膜联蛋白V(Annexin V)水平作为凋亡的标志物。当与正常葡萄糖或L-葡萄糖相比时，高葡萄糖显著上调了胱天蛋白酶-3酶活性水平(图5A)和膜联蛋白V水平(图B)二者。指向Siah1的siRNA(图5C)和GAPDH/Siah1阻断肽(图5D)显著抑制高葡萄糖诱导的胱天蛋白酶-3酶活性诱导。
图6：高葡萄糖诱导的人视网膜周细胞凋亡中促凋亡途径GAPDH/Siah1的建议模型。细胞应激，诸如高葡萄糖，引起一氧化氮合成(NOS)活性的增加。NOS活性的这种增加导致细胞质一氧化氮(NO)升高，其引起GAPDH的S-亚硝基化。亚硝基化的GAPDH与Siah1缔合，这使得复合物稳定并促进其向细胞核的转位。一旦在细胞核中，Siah1降解靶蛋白和/或GAPDH承担其它非糖酵解功能，导致细胞不稳定性并最终导致细胞死亡。
图7：在GAPDH肽(肽1)处理的rmc-1细胞(24小时)中GAPDH的核积聚。用GAPDH肽(肽1)处理后，高葡萄糖诱导的GAPDH的核积聚降低。在用正常葡萄糖(5mM)或高葡萄糖(25mM)处理和在具有5μg/mL或10μg/mL的GAPDH肽的情况下用正常葡萄糖(5mM)或高葡萄糖(25mM)处理24小时的rmc-1细胞上进行台盼蓝染色，并且将对GAPDH的核积聚呈阳性或阴性的细胞进行计数以计算对GAPDH的核积聚呈阳性的细胞的百分比。
图8：在GAPDH肽(肽1)处理的rmc-1细胞(24小时)中GAPDH的核积聚。用肽1处理后，高葡萄糖诱导的GAPDH的核积聚降低。在用正常葡萄糖(5mM)或高葡萄糖(25mM)处理和在具有5μg/mL的肽1或混乱的(Scrambled)肽1的情况下用正常葡萄糖(5mM)或高葡萄糖(25mM)处理24小时以及用GAPDH一抗免疫染色的Müller细胞上进行免疫荧光染色。进行荧光显微镜检查，并且将对GAPDH的核积聚呈阳性或阴性的细胞进行计数以计算对GAPDH的核积聚呈阳性或阴性的细胞的百分比±SDEV。(n＝3；ns＝不显著)。
图9：GAPDH肽(肽1)处理的rmc-1细胞(96小时)中的细胞死亡。用GAPDH肽处理后，高葡萄糖诱导的细胞死亡降低。在用正常葡萄糖(5mM)或高葡萄糖(25mM)处理和在具有2.5或5μg/mL的GAPDH肽(肽1)的情况下用正常葡萄糖(5mM)或高葡萄糖(25mM)处理96小时的rmc-1细胞上进行台盼蓝染色，并且将活细胞和死细胞二者进行计数以计算细胞死亡的百分比。
图10：肽1处理的Müller细胞(96小时)中的细胞死亡。用肽1处理后，高葡萄糖诱导的细胞死亡降低。在用正常葡萄糖(5mM)或高葡萄糖(25mM)处理和在具有5μg/mL的肽1或混乱的肽1的情况下用正常葡萄糖(5mM)或高葡萄糖(25mM)处理96小时的Müller细胞上进行台盼蓝染色，并且将活细胞和死细胞二者进行计数以计算细胞死亡的平均百分比±SDEV。(n＝3；*＝p<0.5)。
图11：Siah-1与GAPDH肽结合。进行GAPDH肽(肽1)的FLAG序列的免疫沉淀以分析在用正常葡萄糖(5mM)或高葡萄糖(25mM)处理和在具有1μg/mL的GAPDH肽(肽1)的情况下用正常葡萄糖(5mM)或高葡萄糖(25mM)处理24小时的rmc-1细胞中GAPDH肽(肽1)是否确实结合Siah-1。GAPDH肽(肽1)的降低(pull down)和针对Siah-1的探测以证明在高血糖处理后的rMC中肽1与Siah-1的结合。
图12：TAT-FLAG肽鉴定。图12A：人类视网膜周细胞(Hrp)中的抗-FLAG(红色)染色的免疫细胞化学分析。左上板显示了在不具有肽处理的对照培养基中培养的hRP。这种情况用作背景FLAG荧光的度量。所有四个板都用DAPI染成蓝色。图12B：抗-FLAG的免疫沉淀蛋白质印迹。使用FLAG-BAP融合蛋白作为阳性对照以证实抗-FLAG单克隆抗体的功能完整性。图12C：用相应的肽处理的hRP的细胞活力测定。细胞用70％甲醇处理30分钟作为阳性对照。
图13：Siah1敲低(KD)效率。10μM的指向Siah1的siRNA寡聚物显著降低了Siah1表达(图13A)和蛋白质水平(图13B)。通过RT-PCR测量表达水平，并且通过蛋白质印迹分析测量蛋白质水平。
图14：高葡萄糖引起一氧化氮合酶(NOS)活性(图14A)和S-亚硝基化(图14B)的增加。HRP用低葡萄糖(5mM、25mM L-葡萄糖或D-葡萄糖处理48小时。图14A：使用CalbiochemNOS比色试剂盒测量NOS活性。图表示总亚硝酸盐(NO2-)和硝酸盐(NO3-)水平。图14B：S-亚硝基化蛋白质的蛋白质印迹分析。使用Pierce S-亚硝基化蛋白质印迹试剂盒，用抗坏血酸盐选择性还原S-亚硝基半胱氨酸以用iodoTMTzero试剂进行标记。抗-TMT抗体用于TMT标记的蛋白质的蛋白质印迹检测。不用抗坏血酸盐处理的样品作为阴性对照。
图15：在人视网膜周细胞(HRP)、人视网膜微血管内皮细胞(hRMEC)和人皮肤成纤维细胞(Hdf)中的GAPDH/Siah1复合物。在hRP(上)、hRMEC(中)和hDF(下)中的NG2染色(红色)的免疫细胞化学。图15A：用DAPI染成蓝色的细胞核。图15B：Siah1蛋白质印迹分析。图15C：GAPDH核级分和图15D：用高葡萄糖处理48小时的hDF的胱天蛋白酶-3酶活性活性测定。高葡萄糖(48小时)不会导致hDF或hRMEC中的GAPDH核转位或细胞死亡。
发明实施方案的具体描述
如本文所用，术语“GAPDH”是指来自任何动物(例如哺乳动物类，包括人)的天然的甘油醛-3-磷酸脱氢酶多肽，以及GAPDH变体。人GAPDH多肽的氨基酸序列在Seq.Id.No 4中给出。
如本文所用，术语“Siah1”是指来自任何动物(例如哺乳动物类，包括人)的天然的E3泛素连接酶七失神同源物1多肽，以及Siah1变体。人Siah1多肽的氨基酸序列在Seq.Id.No 5中给出。
如本文所用，术语“GAPDH结合序列”是指与GAPDH多肽结合并因此干扰和/或阻断GAPDH多肽与Siah1多肽的相互作用的肽序列。
如本文所用，术语“Siah1结合序列”是指与Siah1多肽结合并因此干扰和/或阻断Siah1多肽与GAPDH多肽的相互作用的肽序列。
如本文所用，术语“内化序列”是指这样的肽序列，其导致包含所述内化序列的肽的细胞摄取。
如本文所用，术语“肽序列”是指长度多达50个氨基酸的氨基酸序列。
如本文所用，术语“氨基酸”表示拥有位于羧基的a-位置的氨基部分的有机分子。氨基酸的实例包括：精氨酸，甘氨酸，鸟氨酸，赖氨酸，组氨酸，谷氨酸，天冬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，丙氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸，甲硫氨酸，丝氨酸，脯氨酸。使用的氨基酸在各个情况下任选地是L-形式。
如本文所用，术语“载体”是指能够传播与其连接的另一种核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及整合入宿主细胞(已经向所述宿主细胞中引入该载体)的基因组中的载体。某些载体能够指导与它们可操作连接的核酸的表达。这种载体在本文中称作“表达载体”。
术语“表达盒”是指重组地或合成地产生的多核苷酸，包括允许靶细胞中特定核酸序列的转录的一系列特定核酸元件。重组表达盒可以并入质粒、染色体、线粒体DNA、质体DNA、病毒或核酸片段中。通常，表达载体的重组表达盒部分包括(除其它序列外)待转录的核酸序列和启动子。
如本文所用，“表达”是指核酸转录成mRNA的过程和/或转录的mRNA(也称为转录物)随后翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。转录物和编码的多肽各自称为或共同称为基因产物。如果核酸来源于基因组DNA，则真核细胞中的表达可以包括相应mRNA的剪接。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”互换地使用并且是指已经向其中引入外源核酸的细胞，包括这类细胞的子代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，其包括原代转化的细胞和从中衍生的子代，而无论传代次数是多少。子代可以在核酸内容物方面不完全与亲本细胞相同，而是可以含有突变。本文中包括突变子代，所述突变子代具有与针对最初转化的细胞所筛选或选择的功能或生物活性相同的功能或生物活性。
“重组肽”是由重组工程改造的宿主细胞产生的肽。其任选地是分离的或纯化的。
本发明的肽可以通过本领域公知的方法重组地或合成地生产。
药物组合物和施用
另一个实施方案提供了含有本发明的肽和治疗惰性的载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物或药物，以及使用本发明的肽制备该组合物和药物的方法。在一个实例中，本发明的肽可以通过在环境温度下、在合适的pH下以及以所需的纯度与生理上可接受的载体(即，在用于盖仑制剂施用形式的剂量和浓度下对接受者无毒的载体)混合进行配制。制剂的pH主要取决于具体的用途和化合物的浓度，但是无论何处，优选范围是约3至约8。在一个实例中，将本发明的肽在pH 5下在乙酸盐缓冲液中配制。在另一个实施方案中，本发明的肽是无菌的。本发明的肽可以例如作为固体或无定形组合物、作为冻干制剂或作为水溶液储存。
组合物以与良好医学实践相一致的方式来配制、给药和施用。在这种情况下考虑的因素包括所治疗的具体病症、所治疗的具体哺乳动物、个体患者的临床状况、病症的病因、药剂的递送位点、施用方法、施用时间表以及医学从业者已知的其它因素。待施用的本发明的肽的“有效量”将由这样的考虑决定，并且是显示治疗效果所需的最小量。例如，这样的量可以低于对正常细胞或整个哺乳动物具有毒性的量。
实施例
实施例1：高葡萄糖增加人视网膜周细胞(hRP)中的Siah1蛋白质水平
HRP用正常葡萄糖(5mM D-葡萄糖)、渗透对照(25mM L-葡萄糖)或高葡萄糖(25mMD-葡萄糖)处理48小时。与用渗透对照处理的培养物相比，在用高葡萄糖处理的培养物中，Siah1总蛋白质增加了2倍(p＝0.0136)。渗透对照和正常葡萄糖处理的细胞之间不存在显著差异(图1A)。三个独立的蛋白质印迹的定量在图1B中显示。
实施例2：高葡萄糖增加hRP中GAPDH与Siah1之间的缔合
细胞用正常葡萄糖(5mM)、高葡萄糖(25mM)或L-葡萄糖(25mM)处理48小时。进行降低测定并描述如下：用抗-Siah1进行免疫沉淀(IP)，随后用抗-GAPDH进行免疫复合物的蛋白质印迹(WB)分析，揭示了与用渗透对照处理的细胞相比，高葡萄糖处理的细胞中GAPDH/Siah1缔合增加1.5倍(p＝0.0292)(图2A)。三个独立的蛋白质印迹的定量在图2B中显示。
实施例3：Siah1敲低和位点特异性阻断肽减少了高葡萄糖诱导的GAPDH/Siah1缔合
HRP用正常葡萄糖，渗透对照或高葡萄糖加10μM阴性对照siRNA、10μM指向Siah1的siRNA、1μM TAT-FLAG对照、1μM TAT-FLAG GAPDH肽、1μM TAT-FLAG Siah1肽或1μM GAPDH肽+1μM Siah1肽进行处理。如上所述进行降低测定。我们的GAPDH肽经设计以阻断Siah1上的GAPDH结合位点，并且Siah1肽经设计以阻断GAPDH上的Siah1结合位点(补充表1)。高葡萄糖显著增加GAPDH/Siah1缔合(p＝0.0390)并且Siah1siRNA显著降低该缔合(p＝0.0461)(图2C、D)。同样地，GAPDH肽(p＝0.0194)或Siah1肽(p＝0.0066)或二者的组合(p＝0.0146)显著抑制高葡萄糖诱导的GAPDH/Siah1缔合(图2E、F)。高葡萄糖诱导的GAPDH/Siah1缔合在hRP核级分中也是增加的，并且可以通过用指向Siah1的siRNA处理细胞来阻断核积聚(图2G)。
实施例4：高葡萄糖增加hRP中的GAPDH核转位。Siah1siRNA或GAPDH/Siah1特异性肽阻断高葡萄糖诱导的GAPDH核转位
在用正常葡萄糖、渗透对照或高葡萄糖处理48小时后，制备细胞裂解物并分离成细胞质级分和核级分。然后将每个级分进行GAPDH、MEK和组蛋白H3蛋白质印迹分析。将MEK和组蛋白H3用作对照抗原以分别评价细胞质级分和核级分的纯度。当与正常葡萄糖或渗透对照相比时，高葡萄糖处理引起核GAPDH的显著积聚(p＝0.0005)(图3A、B)。Siah1siRNA(10μM)抑制高葡萄糖诱导的GAPDH的核积聚(p＝0.0469)(图3C、D)。GAPDH肽(p＝0.0142)或Siah1肽(p＝0.0221)或这两个肽的组合(p＝0.0100)显著抑制高葡萄糖诱导的GAPDH核转位(图3E、F)。还通过免疫细胞化学分析测定了GAPDH核转位，其证明了转位由高葡萄糖诱导(图4D)并且该诱导被1μM GAPDH肽抑制(图4F)。
实施例5：高葡萄糖通过GAPDH/Siah1依赖性途径引起人视网膜周细胞凋亡
HRP用正常葡萄糖、L-葡萄糖或高葡萄糖处理48小时-72小时。高葡萄糖处理48小时后细胞死亡明显，并且72小时后显著增加。用25mM D-葡萄糖处理72小时导致胱天蛋白酶-3-酶活性(凋亡的常见标志物)增加3倍(p<0.0001)(图5A)。高葡萄糖暴露也引起膜联蛋白V水平(凋亡特异性细胞死亡的另一种量度)的显著增加(p<0.0001)(图5B；)。Siah1siRNA显著阻断了这种高葡萄糖诱导的凋亡(p＝0.0009)(图5C)。此外，GAPDH和Siah1阻断肽抑制高葡萄糖诱导的hRP凋亡(图5D，对照肽p＝0.0019，GAPDH肽p＝0.0090，Siah1肽p＝0.0053)。
最近在眼组织中鉴定了由甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)与E3泛素连接酶七失神同源物1(Siah1)之间的相互作用引起的新促凋亡途径。
本发明的发明人检查了GAPDH/Siah1相互作用在人视网膜周细胞(hRP)凋亡中的参与。将HRP在5mM正常葡萄糖、25mM L-葡萄糖或D-葡萄糖中培养48小时(分别为渗透对照和高葡萄糖处理)。Siah1siRNA用于下调Siah1的表达。TAT-FLAG GAPDH和/或Siah1肽用于阻断GAPDH和Siah1相互作用。进行免疫共沉淀分析以分析高葡萄糖对GAPDH和Siah1的缔合的影响。通过膜联蛋白V染色和胱天蛋白酶-3酶活性测定来测量凋亡。高葡萄糖增加了Siah1总蛋白质水平，诱导GAPDH与Siah1的缔合，并且导致GAPDH核转位。本发明人的发现表明，GAPDH/Siah1促凋亡复合物的解离可以阻断高葡萄糖诱导的周细胞凋亡(广泛认为是DR的标志性特征)。
方法
HRP处理：将人视网膜周细胞(hRP)(Cell Systems；Kirkland,WA)的原代培养物接种到包被有附着因子(Cell Signaling；Danvers,MA)的组织培养瓶。使HRP在补充有10％FBS和包括抗生素的细胞生长补充物(Lonza；Basel)的Dulbecco’s改良Eagle’s培养基正常葡萄糖(5.5mM DMEM 1X,LifeTechnologies；Carlsbad,CA)中生长和培养。所有培养物在37℃、5％CO2和95％相对湿度(20.9％氧气)下温育。将通道5至7用于所有的实验。通过神经元神经胶质2(NG2)(EMD Millipore；Temecula,CA)的免疫反应性证实HRP同一性。在80％会合时，将hRP用含有正常D-葡萄糖(5.5mM)、高D-葡萄糖(25mM Sigma；St.Louis,MO)或作为渗透对照的L-葡萄糖(25mM Acros Organics；Geel,Belgium)的10％FBS培养基处理。对于TAT-FLAG肽处理，将1μM的对照肽、1μM GAPDH肽和/或1μM Siah1肽添加到Hanks平衡盐溶液(Life Technologies；Carlsbad,CA)中。GAPDH肽竞争性地阻断Siah1上的GAPDH结合位点，并且Siah1肽竞争性地阻断GAPDH上的Siah1肽。在添加到每个孔之前，将肽溶液在37℃温育30分钟。在添加实验处理之前，将细胞与每种肽溶液温育2小时。在组合使用所述肽的情况下，对于每种肽使用各自的初始浓度。每个TAT-肽的N-末端是乙酰化的并且C-末端是酰胺化的；这些修饰确保正确的细胞进入并且防止一旦在细胞内的降解。FLAG标签肽序列使得能够检测和定量这些肽(图12)。
HRP转染：对于siRNA转染，将hRP在6孔平皿中培养，并在处理前30分钟将1ml的新鲜培养基添加到每个孔中。对于每个孔，将10μMsiRNA寡聚物(阴性对照siRNA或指向Siah1的siRNA)(siRNA序列识别号sc-37495A、B和C，Santa Cruz；Dallas,TX)、9μl Targefect溶液A(Targetingsystems；El Cajon,CA)和18μl Virofect(Targetingsystems)添加到单独管中的250μl Optimem(Life Technologies)中，并在添加每种试剂之间倒置。在添加到培养的hRP之前，将混合的试剂在37℃温育25分钟。在用新鲜培养基洗涤并处理之前，将细胞与转染试剂温育12小时。转染后24小时开始实验性处理。我们的siRNA实验的敲低效率和其它质量控制方面在图13中显示。
核分级和蛋白质印迹分析：根据需要对HRP进行处理。使用TrypLEExpress(LifeTechnologies)收获细胞，并使用放射免疫沉淀测定(RIPA)缓冲液(Qiagen；Limburg,Netherlands)进行裂解。NE-PER核和细胞质提取试剂(Thermo Scientific；Nashville,TN)用于将裂解物分离成细胞质级分和核级分。使样品平衡总蛋白质浓度，进行10％SDS/PAGE，并使用iBlot系统(LifeTechnologies)将凝胶转移到硝酸纤维素膜。将膜在使用合适的一抗(抗-β-肌动蛋白1:3000，抗-GAPDH 1:1000，抗-Siah1 1:250，抗-组蛋白H3和抗-MEK 1:750)探测的5％牛奶(对于β-肌动蛋白(Thermo Scientific)和GAPDH(Abcam；Cambridge,UK)免疫印迹)或5％BSA(对于Siah1(SantaCruz)、H3(Cell Signaling)、MEK(CellSignaling)免疫印迹)中封闭。然后用1:2000稀释的辣根过氧化物酶缀合的二抗(GAPDH、MEK和组蛋白H3；抗-兔，Siah1；抗-山羊和β-肌动蛋白；抗-小鼠)对印迹进行标记。MEK和组蛋白H3用作细胞质和核级分对照。β-肌动蛋白用于确定总蛋白质浓度。将膜在Pierce ECL蛋白质印迹底物中温育，并使用ChemiDoc MP(Bio-Rad；Hercules,CA)显色。至少三个独立的实验用于生成蛋白质印迹定量图。使用ImageJ 1.47v软件对印迹进行定量。
免疫共沉淀测定：根据需要对HRP进行处理，并使用Pierce IP裂解缓冲液进行裂解。将等量的来自每个样品的蛋白质(1000μg)与10μg的抗-Siah1抗体在4℃过夜混合。将Pierce蛋白质A/G磁珠预先清除并在室温下添加到抗原样品/抗体混合物1小时。用磁力架收集珠子并用50μl 4XSDS-PAGE还原样品缓冲液在100℃洗脱10分钟。然后将免疫复合物进行蛋白质印迹分析。将Siah1耗尽的样品用作从每个裂解物中Siah1的总降低的对照。进行独立的质量控制实验以证实Siah1免疫沉淀的效率(数据未显示)。
免疫细胞化学分析。将HRP在多孔载玻片上培养，并且将细胞用PBS中的0.1％Triton-X100透化30分钟并用PBST中的1.5％BSA在4℃封闭过夜。将细胞与抗GAPDH一抗(Abcam)在4℃温育过夜。与一抗(1:100)温育后，洗涤细胞并在室温与二抗温育1小时。然后在PBST中洗涤细胞，并应用40,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染料(Sigma)。最后，将细胞洗涤并使用具有Tris缓冲液的Fluorogel(Electron Microscopy Science,Hatfield,PA,USA)进行包埋，并通过荧光显微镜(Olympus AX70；Tokyo,日本)进行检查。
凋亡测量：所有凋亡测量均在适当处理72小时后进行。膜联蛋白V-FITC染色是用于测定凋亡的方法之一。简言之，将细胞沉淀重新悬浮于膜联蛋白V结合缓冲液(Biolegend；San Diego,CA)中。膜联蛋白V(LifeTechonologies)和7-AAD存活染料(Biolegend)在室温下添加到每个样品15分钟。使用在Vanderbilt的流式细胞术共享资源核心实验室进行的流式细胞术分析对样品进行定量。还通过测量胱天蛋白酶-3酶活性来测定凋亡。使用EnzChek胱天蛋白酶-3测定试剂盒(Life Technologies)对活性进行定量。将样品与来源于7-氨基-4-甲基香豆素的底物Z-DEVD-AMC温育1小时。在2小时后测量440nm处的荧光发射。
统计：使用具有Fisher’s LSD事后分析的ANOVA，用商业软件(GraphPad Prism 6；La Jolla,CA)分析数据。p<0.05的值被认为是统计学显著的。

Claims (15)

1.肽，其包含甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)结合序列和/或E3泛素连接酶七失神同源物1(Siah1)结合序列以及内化序列。
2.根据权利要求1所述的肽，其从N-末端起顺序包含内化肽以及GAPDH结合序列和/或Siah1结合序列。
3.根据权利要求1或2所述的肽，其中所述内化序列是阳离子内化序列，优选包含Seq.Id.No.3的序列。
4.根据权利要求1至3所述的肽，其包含GAPDH结合序列和内化序列。
5.根据权利要求1至3所述的肽，其包含Siah1结合序列和内化序列。
6.根据权利要求1至4所述的肽，其中GAPDH结合序列包含Seq.Id.No.1。
7.根据权利要求1至3或5所述的肽，其中Siah1结合序列包含Seq.Id.No.2。
8.根据权利要求1至7所述的肽，其中所述肽的N-末端是乙酰化的。
9.根据权利要求1至8所述的肽，其中所述肽的C-末端是酰胺化的。
10.根据权利要求1至9所述的肽，其用于治疗或预防糖尿病性视网膜病。
11.根据权利要求1至10所述的肽用于制备药物的用途，所述药物用于治疗或预防糖尿病性视网膜病。
12.包含权利要求1至9所述的肽的药物制剂。
13.用于治疗或预防糖尿病性视网膜病的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的根据权利要求1-9所述的肽。
14.载体，其包含编码根据权利要求1至9所述的肽的核酸序列。
15.包含权利要求14所述的载体的宿主细胞。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014035707A1 (en) * 2012-08-25 2014-03-06 The Johns Hopkins University Gapdh cascade inhibitor compounds and methods of use and treatment of stress induced disorders including mental illness

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MAKOTO R HARA等: "S-nitrosylated GAPDH initiates apoptotic cell death by nuclear translocation following Siah1 binding", 《NATURE CELL BIOLOGY》 *
NP_001276674.1: "glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase isoform 1[Homo sapiens]", 《GENBANK》 *
SANDRA SUAREZ等: "High Glucose-induced Retinal Pericyte Apoptosis Depends on Association of GAPDH and Siah1", 《THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》 *

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