JP2018524002A

JP2018524002A - 適応進化によるアスパラギン低減酵母の開発及びアクリルアミド生成を低減するためのその使用

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Publication number: JP2018524002A
Application number: JP2018500428A
Authority: JP
Inventors: ザカリ・ジェイ・タージョン; ジェシカ・マリエ・スワンソン; マシュー・エス・ダハビー; ジョン・アイ・フスニク
Original assignee: ルネサンスバイオサイエンスコーポレーション
Priority date: 2015-07-07
Filing date: 2016-07-06
Publication date: 2018-08-30
Anticipated expiration: 2036-07-06
Also published as: AU2016289705B2; UA126369C2; RU2018104263A; US20180192676A1; EP3320084A4; RU2764014C2; AU2016289705A1; CL2018000041A1; EP3320084B9; EP3320084B1; CA2991325A1; CO2018001247A2; CN108026505B; US11051535B2; HK1255069A1; JP6997073B2; ZA201800650B; CN108026505A; WO2017004715A1; AR105287A1

Abstract

本開示は、L-アスパラギンを非誘導的条件下で分解することができる酵母株を単離する方法に関する。また、前記方法により得られる酵母株、並びに食品の調製及び加工中にアスパラギン、そしてひいてはアクリルアミドを低減するための、その方法及び使用も含まれる。

Description

本出願は、2015年7月7日に出願された米国仮出願第62/189,547号に基づく優先権の利益を主張し、この仮出願の内容は参照によりその全体が本願明細書に援用される。

分野
本開示は、食品中のアクリルアミド濃度を低減するための製品及び方法、並びに低減されたアクリルアミド濃度を有する食品に関する。特に、本開示は、アスパラギン、ひいてはアクリルアミドを低減する能力が強化された、進化した酵母株に関する。

アクリルアミド（AA）は、廃水処理、製紙、選鉱、石油回収、科学研究、及び染色/織物に用いられる加工ポリアクリルアミドポリマーを調製するために用いられる工業化学物質である。その広範な用途に反して、多数のインビトロ、インビボ、及び動物モデル（ラット及びマウス）により証明されている（1〜6）ように、AAは生物系に対して非常に毒性がある。総合すると、これらのデータにより、AA―及びその活性代謝物であるグリシドアミド―が、強力な変異原性、細胞毒性、及び神経毒性の可能性を有する毒性化合物として確固たるものとなった。

非ヒト系において実証された毒性の結果、AAは、世界保健機関の国際がん研究機関（World Health Organization’s International Agency for Research on Cancer）（WHO-IARC）により、1994に、グループ2Aの発がん性物質として分類された―このグループの化合物は、「実験動物における発がん性の十分なエビデンス及びその発がん性がヒトにおいても作動する機構により仲介されるという強力なエビデンス」に基づいて、「ヒトに対しておそらく発がん性がある」として登録されている。

2002年には、AAは、調理中に起こるメイラード褐変反応の結果として、様々な一般的なヒトの食品に生じることが示された（7〜9）。より具体的には、アスパラギンというアミノ酸と、デンプン質の食材又は食品中の還元糖とが、120℃以上の温度に曝露されると（例えば、油で揚げる、焼成する、及び焙煎する等）、反応して、AAが急速に生成する。したがって、AAは、パン（全ての穀物粉原料のもの）、ジャガイモ、ジャガイモ製品（フライドポテト（フレンチフライ）、ポテトチップス、ポテトフレーク及びフラワー（粉））、コーヒー、シリアル（穀類）、野菜等を含む多種多様な食品中に、著しい量で見出される（10〜19）。

AAの食品における普遍性の結果、ヒトのAAへの食物曝露は広範囲に及んでいる。しかしながら、現在、ヒトにがんを引き起こすことにおけるAAの役割に関して、科学的なコンセンサスは無い。現在までに30を超える疫学的研究が行われたが（20）、これらの研究の多くは、一貫性のない又は不明確な結論に至っており、したがって高食物AA曝露と、様々ながん、特に腎臓がん、子宮内膜がん、及び卵巣がんとの間の相関関係を支持しているのみである（20）。

ヒトにがんを引き起こすことにおけるAAの役割に関する科学的コンセンサスの欠如にも関わらず、世界の政府及び規制機関の多くは、食物AAのリスク評価及び軽減を、重要な優先事項としている。実際、欧州食品安全機関（the European Food Safety Authority）（EFSA）、WHO、アメリカ食品医薬品局（U.S. Food and Drug Administration）（FDA）、カリフォルニア州環境保健有害性評価局（California Office of Environmental Health Hazard Assessment）（OEHHA）、及びカナダ保健省（Health Canada）は、皆、食品中のAAの存在を大きな懸念事項であると考えており、食品及び飲料中のAAのレベルを、合理的に達成可能な限り低く（As Low As Reasonably Achievable）（ALARA）することを推奨している。さらに、EFSA（Acrylamide Toolbox―http://www.fooddrinkeurope.eu/publications/category/toolkits/）及びUS FDA（http://www.fda.gov/Food/FoodborneIllnessContaminants/ChemicalContaminants/ucm2006782.htm）の両者は、食品及び飲料中のAAを低減するための、業界別に的を絞った指針書を発行している。

現在利用可能なAA低減のための方法は、2つの基本原理に基づいている：1) 食品加工の実践によるAA生成の軽減（調理時間及び温度の制限）、及び2) AA前駆体としてのアスパラギンの除去。重要なことに、AAは末端消費者による調理の実行中に生成し得るため、2番目のストラテジーのみが、食品中のAAポテンシャルを低減する。商業的に生産される食品及び家庭で調製される食品の両方において同様に、AA含有量は、調理時間及び温度と共に著しく増加する（21）。したがって、アスパラギン除去に基づくAA低減の方法は、下流のAA生成のポテンシャルを取り除くので、優れていると考えられる。

食品のAA含有量を低下させるための多数の方法が現在利用可能である。これらには、酵素のアスパラギナーゼ（Acrylaway（登録商標）、Novozymes、デンマーク、及びPreventASe、DSM、オランダ）（http://www.acrylaway.com/en/Pages/default.aspx; http://www.dsm.com/markets/foodandbeverages/en_US/products/enzymes/baking/preventase.html）の調製、大規模な酵母発酵（22）、発酵前のグリシンの生地への適用（23、24）、揚げ（フライ）前のジャガイモの塩化カルシウムへの浸漬（25）、還元糖のスクロースへの置換（26）、加工条件の全体的最適化、例えば温度、pH、及び水分含量（25、27、28）、原材料の異なる選択に関する研究（27）、並びに乳酸菌を用いた発酵（Zerabac and Zeracid、Zeracryl、ノルウェー; http://www.zeracryl.com/）が含まれる。さらに、低アスパラギンのジャガイモの品種が、近年記述されている（29〜31）が、これは組換えDNA技術により作出されており、したがって遺伝子組換え生物（GMO）とみなされる（http://www.simplotplantsciences.com/）。これらの列挙したアプローチは全て、ある程度不十分であるか、又は、費用、食品の官能的特性に対する作用、及び/若しくは工業スケールでの食品加工条件下における非効果的なアクリルアミド低減を含む、食品の製造中に非現実的となるような固有の問題を有している。

パン酵母（サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae））は、生来、AA前駆体であるアスパラギンを消費/分解することができ、糖を低減することができる。しかしながら、食品加工に一般的な大抵の条件下では、アスパラギンを分解するために必要な細胞機構は停止している。したがって、非常に特定の条件及び時間で使用しない限り、従来の酵母株は、AAを低減するのに無効である。この問題を回避するために、本発明者らは、以前、新規の遺伝子組換え（GMO）のパン酵母に基づく、食品中のアクリルアミドレベルを低減する技術を開発した（US 2012/0321744 A1）。この技術は、アスパラギン、ひいてはアクリルアミドを分解するための、Ｓ．セレビシエの特定の株―組換えDNA技術により操作された―から成っていた。米国特許出願第2012/0321744 A1号に記述された酵母株は、多種多様な食品においてアクリルアミドを低減するのに有効であるものの、その開発において組換えDNA技術を使用したことにより、この株はセルフクローニングされた、遺伝子組換え生物（GMO）として分類される。この指定により、GMOが否定的な見方をされる及び/又は法律で禁止されている産業及び国における採択が本質的に制限される。

Ｓ．セレビシエにおいて、アスパラギン分解を担う遺伝子は、ASP1及びASP3であり、これらはそれぞれ細胞内アスパラギナーゼI及び細胞外細胞壁関連アスパラギナーゼIIをコードしている（32〜34）。ASP1は、シングルコピー遺伝子として存在し（35）、一方ASP3は4重のタンデムリピート座位（ローカス）として存在する（36）。興味深いことに、ASP3座位は、Ｓ．セレビシエに元々あったものではなく、進化を通じて、非サッカロマイセスの酵母の種（ウィッカーハモマイセス（Wickerhamomyces））から、遺伝子の水平伝播によって獲得された（34）。

ASP1は、恒常的に発現しているが、窒素を求めて細胞外のアスパラギンを捕捉するというより、むしろ大部分はアスパラギンの細胞内での利用を担っているということはよく知られている（32、33）。そのようなものとして、ASP1活性は、単独では、食品中のAAを低減することを目的として、酵母が有意な量のアスパラギンを分解するためには十分でない。細胞外のアスパラギンを分解するために、酵母はアスパラギナーゼIIを発現しなければならないが、しかしながらASP3は、より一般的には窒素カタボライト抑制（NCR）として知られる、酵母の窒素利用を選択的に調節する機構の支配下にある（37〜41）。一般的に、NCRは、窒素源を分解するために必要なパーミアーゼ及び異化酵素の差次的遺伝子発現を可能にする分子機構―検知システム及び転写制御回路から成る―を指す。より具体的には、複数の窒素源で生育させた培養では、NCRは、その相対生化学的利用優先度（ヒエラルキー）に基づき、酵母に種々の窒素源を連続して異化させる（32、42）。ASP3との関連では、NCRに制御される他の遺伝子と同様に、この酵素は、貧窒素又は窒素欠乏条件下―窒素源の種類に関わらず―での生育中に、細胞内アミノ酸プールが閾値未満のレベルまで枯渇すると、誘導され得ることが知られている。（36、37、39、40）。

ランダム突然変異誘発及び適応進化は、生物の新たな生育条件及び/又は環境への連続的又は反復的な適応を指す。これを成し遂げるために、ランダム突然変異を生物に導入し、続いてバリアントの巨大なプールを特性解析（キャラクタライゼーション）し、所望の形質を有する個体を選抜する。このようにして、人為淘汰（人工的選択）を用いて、突然変異誘発によって加速された遺伝的変動性（genetic variability）を同定する（43）。この手法は、微生物関連の産業において所望の形質を付与又は強化するために、微生物で一般的に用いられ、より具体的には、食品産業において長い使用の歴史を有する（43〜56）。重要なことに、適応進化には組換えDNA技術の使用が関与しない；したがって、適応進化により創出された生物は、非GMOであり（http://ec.europa.eu/food/plant/gmo/new/index_en.htm）、そのようなものとして、制限的なGMO食品法案及び顧客の受容の問題の影響を受けない。

その本質のおかげで、適応進化は、常に課題を遂行する最適な方法を選択する（52）。大きな集団にわたって、及び多くの世代にわたって、ランダム突然変異は、進化が問題に対するあらゆる可能な解法を「試み」ることを可能にする。適応度を高める-又は少なくともあからさまに有害でない-解法のみが、次の世代まで生き残る（52）。ニッチな環境への適応が、一般的にはその環境の外での適応度を犠牲にして得られるものであると考えると、この概念は特に重要になる（52）。そのようなものとして、適応進化により、生物はその環境の適応度平衡（fitness equilibrium）に達することができる。この平衡は、目的の適応の原因となる変異、及び全般的な適応度の損失を可能な限り打ち消す代償的変異で構成されている。このようにして、適応的に進化させた機構は、組換えDNAエンジニアリング等の標的化された特定の方法よりも優れている場合が多い。

他の微生物と同様に、パン酵母は、ランダム突然変異誘発及び適応進化に非常に適している。実際、この手法は、ワイン作り及びバイオエタノール生産等の産業的プロセスに関係する形質を改変するために広く用いられている（56）。また、適応進化は、窒素制限環境への適応応答を研究するため（57、58）、及びより具体的には、廃水の処理のために、酵母の窒素を使用する能力を改変する（NCRの脱制御）ためにも用いられている（59）。加えて、ランダム突然変異誘発及びシングルラウンド選抜は、NCR-媒介ASP3制御の機構を研究するために、ASP3が脱抑制された実験室酵母の変異体を単離するために用いられている（60）。

US 2012/0321744 A1

Besaratinia A, Pfeifer GP. 2007. A review of mechanisms of acrylamide carcinogenicity. Carcinogenesis 28:519-528. Exon JH. 2006. A Review of the Toxicology of Acrylamide. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part B 9:397-412. Capuano E, Fogliano V. 2011. Acrylamide and 5-hydroxymethylfurfural (HMF): A review on metabolism, toxicity, occurrence in food and mitigation strategies. LWT - Food Science and Technology 44:793-810.

本発明者らは、反復適応進化の特定の方法を用いることにより、非誘導的条件下でアスパラギン低減活性を有する新規酵母株を単離できることを実証した。

したがって、本開示は、L-アスパラギンを非誘導的条件下で分解する酵母株を単離する方法であって：
a) 細胞壁関連アスパラギナーゼを発現しているか又は発現する能力を有する野生型酵母株を、D-アスパラギンを唯一の窒素源として含有する培地の存在下で継代培養する工程；
b) 連続的に継代培養し、生育速度を追跡し、毎週突然変異誘発に供する工程；
c) 生育速度がベースラインに達したときのb)の培養を選択する工程；
d) メチルアミンを含有する選択培地中で選択された細胞を連続的に継代培養し、生育速度を追跡し、メチルアミンの存在下での生育速度がメチルアミンを含まない選択培地でのそれに達するまで、毎週突然変異誘発する工程；
e) メチルアミンを含有する選択培地上にプレーティングすることによりd)の個々のコロニーを単離し、前記コロニーを生育させて大きく速く生育するコロニーを選択する工程；
f) 選択したe)のコロニーを、L-アスパラギンを非誘導的条件下で分解する能力に関して試験し、d)の開始時の細胞と比較して高いL-アスパラギン分解活性を有する少なくとも1個のコロニーを選択する工程；
g) 選択したf)の細胞を用いて、工程d)〜f)を、毎回メチルアミン濃度を増加させながら、L-アスパラギン分解活性がプラトーに達するまで繰り返す工程；
h) L-アスパラギン分解活性がプラトーに達したg)からの株を単離する工程
を含む、方法を提供する。

一実施形態において、細胞壁関連アスパラギナーゼは、ASP3座位によりコードされる。

一実施形態において、野生型酵母株は、産業用酵母株である。一実施形態において、酵母株は、産業用パン酵母株である。

酵母株は、菌界の属及び種を含んでもよいが、これに限定されない。一実施形態において、属及び種は、食品製造において用いられるものから選択されてもよい。別の実施形態において、種は、アスペルギルス・アシダス（Aspergillus acidus）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus sojae）、カンジダ・エチェルシー（Candida etchellsii）、カンジダ・ミレリ（Candida milleri）、カンジダ・オレオフィラ（Candida oleophila）、カンジダ・ルゴサ（Candida rugosa）、カンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis）、カンジダ・バーサティリス（Candida versatilis）、カンジダ・ゼムプリニナ（Candida zemplinina）、カンジダ・ゼイラノイデス（Candida zeylanoides）、シベルリンドネラ・ジャディニイ（トルラ酵母）（Cyberlindnera jadinii）、シベルリンドネラ・ムラキ（Cyberlindnera mrakii）、シストフィロバシディウム・インファモミニアタム（Cystofilobasidium infirmominiatum）、デバリオマイセス・ハンゼニイ（Debaryomyces hansenii）、デッケラ・ブルクセレンシス（Dekkera bruxellensis）、フザリウム・ドメスティカム（Fusarium domesticum）、フザリウム・ベネナツム（Fusarium venenatum）、ガラクトマイセス・カンジダム（Galactomyces candidum）、ゲオトリクム・カンジダム（Geotrichum candidum）、グエホマイセス・プルランス（Guehomyces pullulans）、ハンゼニアスポラ・グイリエルモンディ（Hanseniaspora guilliermondii）、ハンゼニアスポラ・オスモフィラ（Hanseniaspora osmophila）、ハンゼニアスポラ・ウバルム（Hanseniaspora uvarum）、カザケスタニア・エイグア（Kazachstania exigua）、カザケスタニア・ユニスポラ（Kazachstania unispora）、クルイベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）、クルイベロマイセス・マルシアヌス（Kluyveromyces marxianus）、ラカンセア・ファーメンタティ（Lachancea fermentati）、ラカンセア・サーモトレランス（Lachancea thermotolerans）、レカニシリウム・レカニイ（Lecanicillium lecanii）、メチニコウィア・プルチェリマ（Metschnikowia pulcherrima）、ムコール・ヒエマリス（Mucor hiemalis）、ムコール・ムセド（Mucor mucedo）、ムコール・プルムベウス（Mucor plumbeus）、ムコール・ラセモサス（Mucor racemosus）、ニューロスポラ・シトフィラ（Neurospora sitophila）、ペニシリウム・カメンベルティ（Penicillium camemberti）、ペニシリウム・カゼイフィルバム（Penicillium caseifulvum）、ペニシリウム・クリソゲナム（Penicillium chrysogenum）、ペニシリウム・コミュネ（Penicillium commune）、ペニシリウム・クリソゲナム（Penicillium nalgiovense）、ペニシリウム・ロックフォルティ（Penicillium roqueforti）、ペニシリウム・ソリタム（Penicillium solitum）、ピキア・ファーメンタンス（Pichia fermentans）、ピキア・クルイベリ（Pichia kluyveri）、ピキア・クドリアブゼビイ（Pichia kudriavzevii）、ピキア・メンブラニファシエンス（Pichia membranifaciens）、ピキア・オキシデンタリス（Pichia occidentalis）、ピキア・ピジペリ（Pichia pijperi）、リゾプス・ミクロスポラス（Rhizopus microspores）、リゾプス・オリゴスポラス（Rhizopus oligosporus）、リゾプス・オリゼー（Rhizopus oryzae）、リゾプス・ストロニファー（Rhizopus stolonifer）、サッカロマイセス・バヤヌス（Saccharomyces bayanus）、サッカロマイセス・セレビシエ、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、シュワニオマイセス・ヴァンリジエ（Schwanniomyces vanrijiae）、スコプラリオプシス・フラバ（Scopulariopsis flava）、スタルメレラ・ボンビコラ（Starmerella bombicola）、トルラスポラ・デルブレッキイ（Torulaspora delbrueckii）、トルロプシス・カンジダ（Torulopsis candida）、トルロプシス・ホルミイ（Torulopsis holmii）、トリゴノプシス・カンタレリ（Trigonopsis cantarellii）、ウィッカーハモマイセス・アノマルス（Wickerhamomyces anomalus）、ヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）、ジゴサッカロマイセス・ルーキシー（Zygosaccharomyces rouxii）、ジゴトルラスポラ・フロレンティナ（Zygotorulaspora florentina）であるが、これらに限定されない。様々な酵母株の商業的供給元があり、例えばLallemand Inc.（カナダ）、AB Mauri（オーストラリア）、及びLesaffre（フランス）である。

一実施形態において、突然変異誘発は、物理的突然変異誘発、例えばUV突然変異誘発である。別の実施形態において、突然変異誘発は化学的突然変異誘発である。

一実施形態において、a)〜c)は、2〜4週間かけて生じる。一実施形態において、d)〜g)は、6〜48週間かけて生じる。

一実施形態において、g)における繰り返しの数は、5〜20である。

別の実施形態において、e)において、大きくかつ速く生育するコロニーを選択する前に、コロニーを2〜10日間生育させる。

一実施形態において、g)においてメチルアミンの量を徐々に、例えば各繰り返し毎に25〜50%ずつ増加させる。一実施形態において、e)におけるメチルアミンの量は、メチルアミンを含まない選択培地での生育速度と比較して生育速度を25〜75%阻害するのに十分な量である。別の実施形態において、メチルアミンは、L-アスパラギン分解活性がプラトーに達する前に、0.05 g/Lから12 g/Lまで増加させてもよい。

また、本願明細書には、本願明細書に開示される方法により作製される酵母も開示される。またさらに、非誘導的条件下で細胞壁アスパラギナーゼを発現しアスパラギン低減活性を有する、単離された非遺伝子改変酵母が開示される。一実施形態において、単離された非遺伝子改変酵母は、非誘導的条件下で生育させる場合、アスパラギンを少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、又はそれより多く低減する。一実施形態において、細胞壁アスパラギナーゼは、恒常的に発現される。一実施形態において、細胞壁アスパラギナーゼは、ASP3座位によりコードされる。一実施形態において、酵母株は、産業用酵母株である。一実施形態において、酵母株は、産業用パン酵母株である。

カナダ国際寄託当局（International Depositary Authority of Canada）（IDAC）に、140515-01（「RBAR-01」）、140515-02（「RBAR-02」）、及び/又は140515-03（「RBAR-03」）というアクセッション番号で寄託された、単離された酵母株がさらに開示される。

本発明者らは、本願明細書に開示される酵母株が、アスパラギンを低減するのに特に有用であることをさらに示しており、これにより食品の調製及び加工中のアクリルアミドの生成が低減される。したがって、本願明細書に開示される酵母株を、食品の調製又は加工条件下の食品に加える工程を含む、アスパラギン、ひいては食品の調製又は加工中に生成するアクリルアミド形成を低減するための方法もまた本願明細書に開示され、本方法において、酵母がアスパラギン、ひいては食品の調製又は加工中に生成するアクリルアミド形成を低減する。

一実施形態において、酵母株は不活性である。別の実施形態において、酵母は生である。別の実施形態において、酵母は活性乾燥酵母である。

食品は、典型的にアスパラギンを含有する任意の食品であってよく、野菜を原料とする食品、飲料、ベーカリー製品、穀物製品、果実、豆類、乳、又は肉製品を含むが、これに限定されない。一実施形態において、食品は、ベーカリー製品、例えばパン、ビスケット、又はプレッツェルである。一実施形態において、食品は、ジャガイモ又はジャガイモを原料とする製品である。別の実施形態において、食品はコーヒーである。

一実施形態において、食品は、ジャガイモ又はジャガイモを原料とする製品であり、食品の調製又は加工条件下において酵母を食品に加える工程には、調理前にジャガイモ又はジャガイモを原料とする製品を水と酵母株との混合物中に予備浸漬する工程を含む。

別の実施形態において、食品は、ジャガイモを原料とするスナック食品であり、食品の調製又は加工条件下において酵母を食品に加える工程には、油で揚げる、焼成する、又は焙煎することにより調理される圧縮製品を、成形する工程、押し出す工程、又はその他作り出す工程の前に、酵母をジャガイモを原料とする生地様の系に加える工程を含む。

別の実施形態において、食品はコーヒーであり、食品の調製又は加工に酵母株を加える工程には、焙煎の前に、前処理された抽出物がコーヒー豆由来のアスパラギンを枯渇するように、酵母株で前処理してアスパラギンを低減させたコーヒー生豆抽出物中に、新しいコーヒー生豆を浸漬する工程を含む。

さらに別の実施形態において、食品はコーヒーであり、食品の調製又は加工条件に酵母株を加える工程には、焙煎の前に挽いたコーヒー生豆を酵母株で発酵させる工程を含む。

本願明細書に開示される酵母株又は本願明細書に開示される方法を用いて製造した、低減されたアスパラギンを有する食品が、本願明細書においてさらに提供される。

本開示の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、本開示の主旨及び範囲内の様々な変更及び改変がこの詳細な説明から当業者に明らかとなるため、詳細な説明及び具体的な実施例は、本開示の実施形態を示しているが、例示の目的でのみ与えられることが理解されるべきである。

本開示は、以下の図面に関連して、ここに記述される。

図１は、本願明細書に開示されるAR（アクリルアミド低減）酵母株を作り出すために用いられる適応進化ストラテジーの概略図である。図２は、AR酵母株が、富栄養培地中で生育される場合でも、L-アスパラギンを分解することを示す。野生型株、AR株（RBAR-01、RBAR-02、及びRBAR-03）、並びにASP3を過剰発現するように遺伝子操作されたGMO対照株を、YEG中で一晩生育させ（30℃で18時間）、その後2 x 10⁷個の細胞を、0.6 g/LのL-アスパラギンを補った5 mLの新しいYEGに接種した。細胞をYEG + L-アスパラギン中で様々な時点までインキュベートし、その後80℃で熱不活性化した。各サンプル中の残存L-アスパラギン濃度を、比色酵素アッセイキットにより測定した。データは2連の実験の代表である。図３は、AR酵母株を作製するために反復適応進化が必要であることを示す。野生型株並びにAR株（RBAR-01、RBAR-02、及びRBAR-03）を非選択的な培地（YEG + D-アスパラギン）、Kamerud and Roonにより用いられた、中程度に選択的な培地（YEG + D-アスパラギン+ 3.1 g/L メチルアミン）、及び本研究において用いられた、高度に選択的な培地（YEG + D-アスパラギン+ 12 g/L メチルアミン）上にプレーティングした。各株について等しい数の細胞を10倍の連続希釈でスポットした。プレートを30℃で4日間インキュベートした。データは3連の実験の代表である。図４は、AR酵母株が、野生型の親株に進化的に由来することを示す。インターデルタPCRフィンガープリント法を用いて、AR酵母株のヘリテージ（祖先から受け継いだ遺伝子）を野生型の親株と比較した。各々の株のゲノムDNAを終夜培養から抽出し、以前に記述したようにインターデルタPCRの鋳型として使用した（61）。アンプリコンをアガロースゲル電気泳動により可視化した。データは2連の実験の代表である。図5は、L-アスパラギンを恒常的に分解し、細胞壁関連アスパラギナーゼII（ASP3）を恒常的に発現するAR酵母株を示す。AR酵母株（RBAR-01、RBAR-02、及びRBAR-03）、並びに野生型の親株を、YEGでの生育中、6時間毎にサンプリングした。データは2連の実験の代表である。A) 各株の生育速度を、OD₆₀₀測定により追跡した。B) 各株のL-アスパラギン分解活性を、標準化されたL-アスパラギン分解アッセイ（1時間のアッセイインキュベーション時間）により測定した。C) 各株におけるASP3の相対発現を、単離した全RNAから逆転写したcDNAのqPCRにより、技術的3連（technical triplicate）で測定した。ASP3の倍数変化値を、ΔΔCt法を用いて計算し、ACT1及び野生型ASP3に対して正規化した。D) 各株におけるASP1の相対発現を、単離した全RNAから逆転写したcDNAのqPCRにより、技術的3連で測定した。ASP1の倍数変化値を、ΔΔCt法を用いて計算し、ACT1及び野生型ASP1に対して正規化した。図６は、L-アスパラギン分解の動態がAR酵母株間で異なることを示す。野生型株及びAR株（RBAR-01、RBAR-02、及びRBAR-03）をYEG中で一晩生育させ（30℃で18時間）、その後2 x 10⁷個の細胞を、0.6 g/L L-アスパラギンを補った5 mLの新しいYEGに接種した。細胞をYEG + L-アスパラギン中で様々な時点までインキュベートし、その後80℃で熱不活性化した。各サンプル中の残存L-アスパラギン濃度を、比色酵素アッセイキットにより測定した。データは2連の実験の代表である。図７は、最小限の数の遺伝子が、AR酵母株において包括的に差次的に発現していることを示す。全RNAを、野生型及びAR酵母株（RBAR-01、RBAR-02、及びRBAR-03）から、YEGでの対数増殖中に回収した。RNAシーケンシングライブラリ（TruSeq v3）―全RNAより調製―を、Illumina HiSeq2500 High Outputモードプラットフォームで、2x100 bpペアエンド設定でシーケンシングした。生リードを品質でフィルタリングし、S288C参照ゲノムにマッピングした。Log₂の倍数変化値（野生型に対して）を、6,604の酵母ORF（検証済、未特性解析、及び疑わしい）の各々について示す。参照のため、+1.5、0、及び-1.5に点線をひいている。各列内の描線（トレース線）は、各遺伝子についての実際の倍数変化値である。階層的クラスタリングを用いて遺伝子クラスター及び株の両方をグループ化した。図８は、多数の差次的に発現している遺伝子が、AR酵母株の各々に共通していることを示す。全RNAを、野生型及びAR酵母株（RBAR-01、RBAR-02、及びRBAR-03）から、YEGでの対数増殖中に回収した。RNAシーケンシングライブラリ（TruSeq v3）―全RNAより調製―を、Illumina HiSeq2500 High Outputモードプラットフォームで、2x100 bpペアエンド設定でシーケンシングした。生リードを品質でフィルタリングし、S288C参照ゲノムにマッピングした。図８Ａは、A) Log₂の倍数変化値（野生型に対して）を、差次的に発現している遺伝子（≧ | 1.5 | log2倍数変化 & 野生型酵母において≧100カウント）の各々について示す。参照のため、+1.5、0、及び-1.5に点線をひいている。各列内の描線は、各遺伝子についての実際の倍数変化値である。階層的クラスタリングを用いて遺伝子クラスター及び株の両方をグループ化した。図８Ｂは、B) AR酵母株の各々において差次的に発現している遺伝子間の重複のベン図である。図９は、AR酵母株の各々において、NCR遺伝子及びアミノ酸トランスポーターが差次的に発現していることを示す。全RNAを、野生型及びAR酵母株（RBAR-01、RBAR-02、及びRBAR-03）から、YEGでの対数増殖中に回収した。RNAシーケンシングライブラリ（TruSeq v3）―全RNAより調製―を、Illumina HiSeq2500 High Outputモードプラットフォームで、2x100 bpペアエンド設定でシーケンシングした。生リードを品質でフィルタリングし、S288C参照ゲノムにマッピングした。図９Ａは、A) Log₂の倍数変化値（野生型に対して）を、アノテーションされたNCR遺伝子（71）の各々について示す。図９Ｂは、B) Log₂の倍数変化値（野生型に対して）を、アノテーションされたアミノ酸トランスポーター遺伝子（71）の各々について示す。A及びB) 参照のため、+1.5、0、及び-1.5に点線をひいている。各列内の描線は、各遺伝子についての実際の倍数変化値である。階層的クラスタリングを用いて遺伝子クラスター及び株の両方をグループ化した。図１０は、AR酵母株において同定された変異の大部分が、全てに共通していることを示す。ゲノムDNAを、野生型及びAR酵母株（RBAR-01、RBAR-02、及びRBAR-03）から回収した。DNAシーケンシングライブラリ（Nextera XT）―ゲノムDNAから調製―を、Illumina MiSeqプラットフォームで、2x300 bpペアエンド設定でシーケンシングした。生リードを品質でフィルタリングし、S288C参照ゲノムにマッピングした。リードのパイルアップを用いて、S288Cコンセンサス配列に対し、各ヌクレオチドにおけるバリアントを分類した。過分な変異を除くために、AR酵母株におけるバリアントを、野生型バリアントに対してフィルタリングした。AR酵母株の各々においてフィルタリングした変異間の重複のベン図。図１１は、AR酵母株がパン及びトースト中のアクリルアミドを低減することを示す。白パン及び全粒小麦パン（0又は7%のいずれかのスクロースが加えられている）を、野生型酵母又はAR株のRBAR-01、RBAR-02、及びRBAR-03のいずれかを用いて作製した。AAレベルを、トーストしていないパン、並びに、材料及び方法において定義した、低、中、及び高のトーストレベルにおいて分析した。A) 0%スクロースを含む白パン。B) 7%スクロースを含む白パン。C) 0%スクロースを含む全粒小麦パン。D) 7%スクロースを含む全粒小麦パン。データは2連の実験の代表である。図１２は、AR酵母株がフライドポテト中のアクリルアミドを低減することを示す。生のラセット（Russet）ポテトを原料とするフライドポテトを、切った未調理のジャガイモを、酵母を含まない、野生酵母を含む、又はAR株のRBAR-01、RBAR-02、及びRBAR-03を含む、のいずれかの水に浸漬することにより作製した。AAレベルを最終フライ製品中で分析した。データは2連の実験の代表である。図１３は、AR酵母株RBAR-03が、短いインキュベーション時間及び高い温度下において、用量依存的にフライドポテト中のアクリルアミドを低減することを示す。切ったジャガイモを、方法の項に記述したように予備加工し、その後、水単独、又は100、200、250、若しくは300 g/LのAR酵母のクリーム状酵母（23%固形分）のいずれかを含む水の中で、68℃で50秒間インキュベートした。揚げ工程の後、フライドポテト中のアクリルアミドレベルをUPLC/MSにより測定した。データは3連の実験の代表である。図１４は、AR酵母株がジャガイモを原料とするフライドスナック中のアクリルアミドを低減することを示す。押し出して揚げたジャガイモを原料とするスナック製品を、酵母を用いないで、野生型酵母を用いて、又はAR株のRBAR-01、RBAR-02、及びRBAR-03を用いてのいずれかで作製した。製造プロセス中の様々な時点においてアスパラギンレベルを分析し（A）、最終フライド製品においてAAレベルを分析した（B）。データは2連の実験の代表である。図１５は、AR酵母株が甘いビスケット中のアクリルアミドを低減することを示す。甘いビスケットを、酵母を用いないで、野生型酵母を用いて、又はAR株のRBAR-01、RBAR-02、及びRBAR-03を用いてのいずれかで作製した。AAレベルを最終製品において分析した。データは2連の実験の代表である。図１６は、AR酵母株がプレッツェル中のアクリルアミドを低減することを示す。プレッツェルを、野生型酵母を用いて、又はAR株のRBAR-01、RBAR-02、及びRBAR-03を用いてのいずれかで作製した。AAレベルを最終製品において分析した。データは2連の実験の代表である。図１７は、AR酵母株が、コーヒー生豆の直接発酵によりコーヒーのアクリルアミドを低減することを示す。挽いたコーヒー生豆を、水単独、野生型酵母、又はAR株のRBAR-03のいずれかの中でインキュベートした。インキュベーション後、挽いた豆を乾燥及び焙煎し、その後AAレベルを分析した。図１８は、AR酵母株が、生コーヒー抽出物のアスパラギンを低減することを示す。生コーヒー抽出物（18%可溶性固形分）を、様々な濃度のAR酵母を用いてインキュベートした。インキュベーション後、抽出物を遠心分離により清澄化し、L-アスパラギンレベルを分析した。データは2連の実験の代表である。

本発明者らは、選択圧と組み合わせたランダム突然変異誘発の反復プロセスにより、非誘導的条件下でアスパラギン低減活性を有する産業用酵母株の開発がもたらされたことを実証した。

一実施形態において、細胞壁アスパラギナーゼは、ASP3座位（GenBank受託番号NM_001182042.1）によりコードされる。

一実施形態において、野生型酵母株は産業用酵母株である。一実施形態において、酵母株はパン酵母（Ｓ．セレビシエ）である。

本願明細書で用いられる用語「産業用酵母」は、産業的プロセスにおいて用いられる株を指し、研究室での研究のために典型的に用いられる実験室酵母と対比される。典型的には、産業用酵母は、大部分が二倍体であり、一部が三倍体、四倍体、又は異数体である場合が多い。同様に、実験室酵母は一倍体である場合が多い。

酵母株は、菌界の属及び種を含んでもよいが、これに限定されない。一実施形態において、属及び種は、食品製造において用いられるものから選択されてもよい。別の実施形態において、種は、アスペルギルス・アシダス、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・オリゼー、アスペルギルス・ソーヤ、カンジダ・エチェルシー、カンジダ・ミレリ、カンジダ・オレオフィラ、カンジダ・ルゴサ、カンジダ・トロピカリス、カンジダ・バーサティリス、カンジダ・ゼムプリニナ、カンジダ・ゼイラノイデス、シベルリンドネラ・ジャディニイ、シベルリンドネラ・ムラキ、シストフィロバシディウム・インファモミニアタム、デバリオマイセス・ハンゼニイ、デッケラ・ブルクセレンシス、フザリウム・ドメスティカム、フザリウム・ベネナツム、ガラクトマイセス・カンジダム、ゲオトリクム・カンジダム、グエホマイセス・プルランス、ハンゼニアスポラ・グイリエルモンディ、ハンゼニアスポラ・オスモフィラ、ハンゼニアスポラ・ウバルム、カザケスタニア・エイグア、カザケスタニア・ユニスポラ、クルイベロマイセス・ラクティス、クルイベロマイセス・マルシアヌス、ラカンセア・ファーメンタティ、ラカンセア・サーモトレランス、レカニシリウム・レカニイ、メチニコウィア・プルチェリマ、ムコール・ヒエマリス、ムコール・ムセド、ムコール・プルムベウス、ムコール・ラセモサス、ニューロスポラ・シトフィラ、ペニシリウム・カメンベルティ、ペニシリウム・カゼイフィルバム、ペニシリウム・クリソゲナム、ペニシリウム・コミュネ、ペニシリウム・クリソゲナム、ペニシリウム・ロックフォルティ、ペニシリウム・ソリタム、ピキア・ファーメンタンス、ピキア・クルイベリ、ピキア・クドリアブゼビイ、ピキア・メンブラニファシエンス、ピキア・オキシデンタリス、ピキア・ピジペリ、リゾプス・ミクロスポラス、リゾプス・オリゴスポラス、リゾプス・オリゼー、リゾプス・ストロニファー、サッカロマイセス・バヤヌス、サッカロマイセス・セレビシエ、シゾサッカロマイセス・ポンベ、シュワニオマイセス・ヴァンリジエ、スコプラリオプシス・フラバ、スタルメレラ・ボンビコラ、トルラスポラ・デルブレッキイ、トルロプシス・カンジダ、トルロプシス・ホルミイ、トリゴノプシス・カンタレリ、ウィッカーハモマイセス・アノマルス、ヤロウィア・リポリティカ、ジゴサッカロマイセス・ルーキシー、ジゴトルラスポラ・フロレンティナであるが、これらに限定されない。様々な酵母株の商業的供給元があり、例えばLallemand Inc.（カナダ）、AB Mauri（オーストラリア）、及びLesaffre（フランス）である。

一実施形態において、突然変異誘発は、物理的突然変異誘発により生じ、これには、UV、並びに放射線に基づく突然変異誘発の形態、例えばX線及びガンマ線の突然変異誘発を含むが、これに限定されない。一実施形態において、物理的突然変異誘発は、UV突然変異誘発である。当業者であれば、UVを用いて突然変異を起こさせるための条件が容易にわかる。UV突然変異誘発に関して、細胞を、UV光源（標準的な一定の強度）に、様々な時間、曝露させることができる。線量は、殺傷率に基づいてもよい―平均して、各処理中、培養を、25〜90%の細胞を殺すために十分なUV光に曝露してもよい。

別の実施形態において、突然変異誘発は、化学的突然変異誘発（例えば、EMS−メタンスルホン酸エチル）により生じる。

当業者であれば、変異率、ひいては目的の変異を見つける見込みを高めるために、適切な選択的条件下で突然変異誘発が用いられることを理解する。

本願明細書で用いられる用語「非誘導的条件」は、野生型酵母において細胞外L-アスパラギン分解が通常抑制される任意の培養条件を指す。これに対して、「選択的条件」は、D-アスパラギンが唯一の窒素源である培養条件を指し、増加する選択圧に関して、メチルアミンなどの生育阻害剤の存在があってもよい。

当業者であれば、酵母細胞を培養する条件が容易にわかる。例えば、(a)に関して、酵母細胞を、30℃で、液体選択培地、例えば、炭素源、例えば2% (w/v)スクロース、及びD-アスパラギン（例えば10 g/Lであるが、濃度は株に応じて0.5〜15 g/Lまで変動してもよい）を補った、アミノ酸・硫酸アンモニウム不含酵母ニトロゲンベース（YNB-AA/AS）から成る培地中で培養してもよい。終夜培養（オーバーナイトカルチャー）は、1日1回、新しい培地に、一定の濃度で、例えば0.01の光学密度（OD₆₀₀）で、継代培養してもよい。

(d)のメチルアミンを用いた選抜に関して、細胞を、30℃で、液体選択培地、例えば、炭素源、例えば2% (w/v)スクロース、及びD-アスパラギン（例えば10 g/Lであるが、濃度は株に応じて0.5〜15 g/Lまで変動してもよい）を補い、さらに変動する量のメチルアミンを補った、アミノ酸・硫酸アンモニウム不含酵母ニトロゲンベース（YNB-AA/AS）から成る培地中で培養してもよい。

(e)の、メチルアミンを用いて選抜した個々のコロニーの単離に関して、細胞を、固体選択培地、例えば、炭素源、例えば2% (w/v)スクロース、D-アスパラギン（例えば10 g/Lであるが、濃度は株に応じて0.5〜15 g/Lまで変動してもよい）、及び培地を固めるために十分な寒天を補い、さらに変動する量のメチルアミンを補った、アミノ酸・硫酸アンモニウム不含酵母ニトロゲンベース（YNB-AA/AS）から成る培地上にプレーティングして30℃で生育させてもよい。

酵母の一般的な維持のためには、細胞を30℃で、固体非選択培地、例えばYEG 寒天培地（2%酵母エキス+ 1% グルコース + 2% 寒天）上で生育させてもよい。

生育速度を決定するための方法は、当該技術分野では公知であり、そのような想定の例が、実施例において本願明細書に記述される。一実施形態において、生育速度は、光学密度を測定することにより決定される。光学密度は、最も速くかつ最も広く用いられる方法であり、水性分散体中の酵母は光を散乱させるという事実に依存している。散乱される光の量は、単位体積当たりの細胞数、すなわち細胞濃度に比例する。代替的な実施形態において、生育速度は、細胞数を数えることにより決定される。ある体積の培養液中の細胞数は、顕微鏡及び血球計算盤を用いて正確に数えることができる。さらなる実施形態において、固体培地上での生育速度は、同等の方法（すなわち、同じ時間、温度、及び培地）で生育させた細胞間でコロニーサイズを視覚的に比較することにより決定することができる。例えば、より大きいコロニーの方がより小さいコロニーよりも速く生育している。

本願明細書で用いられる語句「大きくかつ速く生育するコロニー」は、最も早く目視で出現し、プレート上のおよそ平均的な大きさのコロニーに対して最も大きいコロニーサイズを有するコロニーを指す。そのような同定は、本質的に定性的であってよく、当業者であれば、そのような基準に当てはまるコロニーを容易に決定することができる。

本願明細書で用いられる、生育速度に関する「ベースライン」という用語は、非誘導的かつ非選択的な培地（良好な窒素源を含有する培地、すなわち栄養素に富んだ（リッチな）培地、すなわちD-アスパラギンだけでない、及び/又はメチルアミンを含まない）での株の生育速度を指す。

一実施形態において、g)において、メチルアミンの量は、徐々に、例えば、各繰り返しで25〜50%ずつ、初期の増加は小さく、後の増加はより大きくなるように、増加される。一実施形態において、e)におけるメチルアミンの量は、メチルアミンを含まない選択培地における生育速度に対して、生育速度を25〜75%阻害するのに十分な量である。別の実施形態において、メチルアミンは、L-アスパラギン分解活性がプラトーに達する前に、0.05 g/Lから12 g/Lまで増加させてもよい。

継代培養のための時間枠（タイムフレーム）及び進化的反復の総数は、変動し、また、野生型株の遺伝子的複雑さ、使用する突然変異誘発の種類（すなわち、化学物質、UV、X線）、突然変異誘発の用量、及び選択の強度を含む、多数の変数に依存する。一実施形態において、a)〜c)の期間は、2〜4週間である。一実施形態において、d)〜g)の期間は、6〜48週間である。一実施形態において、g)における繰り返しの数は、5〜20回である。

コロニーは、非誘導的条件下でL-アスパラギンを分解する能力について、例えば実施例の項で説明するように、試験することができる。

また、本願明細書に開示される方法により作製される酵母も、本願明細書において提供される。またさらに、非誘導的条件下で細胞壁アスパラギナーゼを発現しアスパラギン低減活性を有する、単離された非遺伝子改変酵母が提供される。一実施形態において、単離された非遺伝子改変酵母は、非誘導的条件下で生育させる場合、アスパラギンを少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、又はそれより多く低減する。当業者であれば、実施例に開示された方法を用いて、酵母株がアスパラギンを低減する能力を容易に試験することができる。一実施形態において、細胞壁アスパラギナーゼは、ASP3座位にコードされる。

一実施形態において、単離された非遺伝子改変酵母は、恒常的に細胞壁アスパラギナーゼを発現する。本願明細書で用いられる、恒常発現は、生育条件に依存する選択的発現ではなく、微生物の生育全体を通しての連続的な遺伝子発現を指す。一実施形態において、酵母株は産業用酵母株である。一実施形態において、酵母株は産業用パン酵母株である。

2015年5月14日にカナダ国際寄託当局（IDAC）国立微生物学研究所（National Microbiology Laboratory）、カナダ公衆衛生庁（Public Health Agency of Canada）1015 Arlington Street, Winnipeg, Manitoba, Canada R3E 3R2に、140515-01（本願明細書では「RBAR-01」と称する）、140515-02 （本願明細書では「RBAR-02」と称する）、及び/又は140515-03 （本願明細書では「RBAR-03」と称する）というアクセッション番号で寄託された、単離された酵母株がさらに開示される。これらの株の受託及び生存能力の受領書は、付属書A（Appendix A）にある。

本願発明者らは、これらの進化させた酵母株が、食品の調製及び加工中に、アスパラギン、そしてひいてはアクリルアミドを低減するのに特に有用であることをさらに示し、したがって、本願明細書に開示される酵母株は、アクリルアミド低減酵母又はAR酵母と称される。用語「アクリルアミド低減酵母」及び「アスパラギン低減酵母」は、本願明細書において互換的に用いられる。したがって、食品の調製又は加工条件下において本願明細書に開示される酵母株を食品に加える工程を含む、アスパラギン、そしてひいては食品の調製又は加工中にアクリルアミドを低減するための方法もまた本願明細書に開示される；該方法において、酵母がアスパラギン、そしてひいては食品の調製又は加工中のアクリルアミド形成を低減する。

一実施形態において、酵母株は不活性である。本願明細書で用いられる用語「不活性」は、まだ栄養素含有量及び他の特性を保っている、不活性、生存不能、及び/又は死んだ酵母生物の組成物を指す。例えば、所望の1種又は複数のタンパク質を過剰発現させる条件下で、酵母を生育させてもよい。その後、酵母を使用して、例えば、高温短時間パスチャライゼーションを含むがこれに限定されない様々なパスチャライゼーション方法、湿熱及び放射線を含むがこれに限定されない様々な滅菌方法、高圧、光触媒及びパルス光、光感作（増感）、RF及びパルスを含む電場、細胞破砕、超音波処理（ソニケーション）、ホモジナイゼーション、自己消化、並びにホルムアルデヒド、チメロサール、クロラミン、二酸化塩素、ヨウ素、銀、銅、抗生物質、及びオゾンを含むがこれに限定されない化学物質に基づく不活性化、を含むがこれに限定されない様々な不活性化方法により、不活性酵母を製造することができる。

別の実施形態において、酵母株は生である。さらに別の実施形態において、酵母株は活性乾燥酵母である。生酵母（生イースト）は、非選択的酵母培地（例えば上で規定しているもの）中で生育させ、遠心分離して大部分の液体を取り除いた酵母を指す。生酵母は生きており、代謝的に活性である。生酵母は、常温保存可能でなく、典型的には冷蔵で1〜5週間しかもたない。典型的な生酵母は、およそ25%固形分である。活性乾燥酵母（ADY）は、最終水分含量3%（97%固形分）まで酵母を乾燥させた加工品である。この製品中の酵母細胞は、生きてはいるが、補水するまで代謝的に不活性である。真空包装されると、ADYは典型的には2〜4年間常温保存可能である。ADYを製造するための標準化された手順は、酵母に基づく産業、例えばワイン製造、（ビール）醸造、及び製パンにおいて公知である。

本願明細書で用いられる語句「アスパラギンを低減する」は、例えば食品中で、対照酵母株、例えばその酵母株が進化した元の親株と比較して、少なくとも20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、又はそれ以上、アスパラギンのレベルを低減するか又はアスパラギンを分解することを指す。

アスパラギンは、食品の調製又は加工中にアクリルアミドを生成する反応において、限定的（律速的）な前駆体である。したがって、別の実施形態において、食品中のアクリルアミドを低減するための方法であって、本願明細書に開示される酵母株を、調製又は加工条件下の食品に加える工程を含む、方法が提供される；ここで、酵母は、食品中のアスパラギンを低減し、それによりアクリルアミドを低減する。また、食品の調製又は加工条件中にアクリルアミド濃度を低減するための、本願明細書に開示される酵母株の使用も提供される。

本願明細書で用いられる語句「アクリルアミドを低減する」は、食品中のアクリルアミドのレベルを、酵母株の不存在時と比較して、少なくとも20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、又はそれより多く低減することを指す。

一実施形態において、食品の調製又は加工条件には、発酵を含む。例えば、本願明細書における方法及び使用は、製パン中の炭水化物、ジャガイモ加工、ビスケット製造、コーヒー製造、又はスナック食品製造を含むが、これに限定されない、食品の発酵に有用である。本願明細書で用いられる用語「発酵」は、酵母による糖及び他の栄養素の消費を指す。

したがって、食品は、典型的にアスパラギンを含有する、任意の食品であってよく、野菜を原料とする食品、飲料、ベーカリー製品、穀物製品、果物、豆類、乳製品又は肉製品を含むが、これに限定されない。一実施形態において、食品は、ジャガイモ又はジャガイモを原料とする製品である。別の実施形態において、食品はコーヒーである。

一実施形態において、食品は、ジャガイモ又はジャガイモを原料とする製品であり、食品の調製又は加工条件下において酵母を食品に加える工程には、ジャガイモ又はジャガイモを原料とする製品を水と酵母株との混合物中に調理前に予備浸漬する工程を含む。一実施形態において、ジャガイモは、調理前に、室温で予備浸漬され、空気乾燥される。用語「調理する」には、油で揚げる（焼く）、焼成する（ベーキング）、及び焙煎（ロースト）することを含むが、これに限定されない。水/酵母株の混合物中の、本願明細書に開示される酵母株の濃度は、一実施形態において、少なくとも1、少なくとも10、少なくとも50、少なくとも100 g/L（乾燥細胞質量/体積）、またはそれより多い。予備浸漬の時間は、一実施形態において、少なくとも0.25分間、少なくとも0.5分間、少なくとも1分間、少なくとも5分間、少なくとも10分間、少なくとも20分間、又はそれより長い。

別の実施形態において、食品はコーヒーであり、食品の調製又は加工条件に酵母株を加える工程には、焙煎の前に、前処理された抽出物がコーヒー豆由来のアスパラギンを枯渇するように、本願明細書に開示される酵母株で前処理してアスパラギンを低減させたコーヒー生豆抽出物中に、新しいコーヒー生豆を浸漬する工程を含む。一実施形態において、抽出物は、60℃〜80℃、場合により70℃の温度で前処理される。抽出物前処理の時間は、一実施形態において、少なくとも1時間、少なくとも5時間、少なくとも10時間、少なくとも15時間、又はそれより長い。

さらに別の実施形態において、食品はコーヒーであり、酵母株を食品の調製又は加工条件に加える工程は、焙煎の前に挽いたコーヒー生豆を酵母株を用いて発酵させる工程を含む。

本願明細書に開示される酵母株又は本願明細書に開示される方法を用いて製造された、低減されたアスパラギン、そしてひいては低減されたアクリルアミドを有する食品が、本願明細書にさらに提供される。

食品は、アスパラギンからアクリルアミドへの変換をもたらす調製又は加工条件で製造される任意の食品であってよい。アクリルアミド生成をもたらす典型的な調製及び加工条件には、高い調理温度（120℃より高い）が関与する調製が含まれ、油で焼く（揚げる）及び焼成する（ベーキング）、トーストする、焙煎（ロースト）する、グリルする、蒸し煮（ブレゼ）する、及び直火焼き（ブロイル）することを含むが、これに限定されない。アクリルアミドは、典型的には、ジャガイモ製品、ベーカリー製品、及びあらゆる穀物又は穀類製品（シリアル又は穀粒製品）において、高濃度で見出される。したがって、一実施形態において、食品は、野菜、例えばジャガイモ、タロイモ、若しくはオリーブ製品、ベーカリー製品、又は穀物又は穀類製品である。ジャガイモ製品には、フライドポテト、ポテトチップス、揚げた/焼いたポテトスナック、及び成形ジャガイモ製品が含まれるが、これに限定されない。ベーカリー製品には、ビスケット、クッキー、クラッカー、パン、無発酵パン製品、バッター（衣）をつけた製品、コーン及びフラワートルティーヤ、ペイストリー、パイクラスト（皮）、ケーキ及びマフィンミックス、並びにペイストリー生地が含まれるがこれに限定されない。例えば、パンには、生の及び冷凍のパン及び生地、サワー種（サワードウ）、ピザ生地、丸パン（bun）及びロールパン（roll）、及び多様なパン、並びに関連するパン製品、例えば油で焼いた（揚げた）若しくは焼成（ベーク）したスナック（軽食）又はパン粉を含めることができるが、これに限定されない；及びペイストリーには、菓子パン、ドーナツ、及びケーキを含むことができるが、これに限定されない。穀物又は穀類製品には、典型的な朝食用シリアル、ビール麦芽、及びホエー製品、コーンチップス、及びプレッツェルが含まれるが、これに限定されない。高温で加工される他の食品には、コーヒー、ローストナッツ、ローストアスパラガス、ビール、麦芽、及びホエー飲料、チョコレート粉末、魚製品、肉及び家禽製品、オニオンスープ及びディップミックス、ナッツバター、コーティングしたピーナッツ、ロースト大豆、ローストヒマワリ種子、揚げたか又は焼いた食物、例えばファラフェル（falafel）及びキッビ（kobbeh）、並びにチョコレートバーが含まれるが、これに限定されない。

上記の開示は、本発明を一般的に説明する。以下の具体的な実施例を参照することにより、より完全な理解が得られる。これらの実施例は、例示の目的でのみ記述され、本開示の範囲を限定することを意図していない。状況によって示唆される又は適切化され得るように、形式の変更及び等価物の置換が検討される。本願明細書では特定の用語が用いられるが、そのような用語は、記述的な意味で意図され、限定の目的で意図されない。

以下の非限定的な実施例は、本開示の具体例である：

材料及び方法
酵母株及び培地
酵母株は、YEG寒天プレート（2% w/vグルコース、1% w/v酵母エキス、2% w/v寒天）上で維持した。終夜培養は、液体YEG培地に接種した個々のコロニーから培養し、30℃で18時間インキュベートした（250 RPM）。

アスパラギン分解アッセイ
終夜培養の細胞密度を、血球計算盤により測定した。その後、1x10⁷個の細胞を、0.6 g/LのL-アスパラギンを補った5 mLのYEG培地に接種し、30℃でインキュベートした。各実験で記述される時点において、500 μLの培地を取り出し、13,000 x gで1分間遠心分子し（室温）、上清を新しいチューブに移した。上清を80℃で30分間インキュベートすることにより、アスパラギナーゼ活性を不活化した。上清中の残存L-アスパラギンを、酵素アッセイにより、メーカーの取り扱い説明書（Megazyme, K-ASNAM）に従って測定した。。

イントラデルタ（Intra-delta）フィンガープリント法
イントラデルタフィンガープリント法を、既報のとおり行った（61）。簡潔に説明すると、ゲノムDNAを、終夜培養からフェノール-クロロホルム法を用いて既報のとおり抽出した（62）。TaqポリメラーゼPCR反応を、以下のとおり組み立てた：100 ng ゲノムDNA、1 μMのプライマー1 （デルタ12：5′-TCAACAATGGAATCCCAAC-3′）（配列番号1）、1 μM プライマー2 （デルタ21：5′-CATCTTAACACCGTATATGA）（配列番号2）、200 nM dNTPミックス、2.5 mM MgCl₂、1x Taqバッファー + KCl、及び1 U Taqポリメラーゼ（Thermo Fisher, EP0402）。増幅を、BioRad C1000サーモサイクラーで、以下のプロトコルに従って行った：95℃で4:00（初期変性）、95℃で0:30、46℃で0:30、72℃で1:30（35サイクル）、72℃で10:00（最終伸長）。PCR産物を、2% w/v HRBアガロースゲル（Amresco, E776）で、標準TBEバッファーを用いて8 V/cmで泳動し、GelGreen核酸染色（Biotium）を用いてイメージングした。

RNA抽出
5 OD₆₀₀単位の細胞を遠心分離（13,000 x g、1分間、RT）により単離し、その後ドライアイス/メタノール中で瞬間凍結（スナップフリーズ）した。全RNAを、熱酸性フェノールを用いて既報のとおり抽出した（63）。簡潔に説明すると、細胞を、DEPC水で一度洗浄し、その後TESバッファー及び酸性フェノール-クロロホルムで中で、65℃で1時間、溶解した。液相を、phase lock gelチューブ（5Prime）及び酸性フェノール-クロロホルム、続いて別のphase lock gelチューブ及びクロロホルム：イソアミルアルコールを用いて精製した。RNAを-80℃で一晩エタノール沈殿し、70%エタノールで洗浄し、DEPC水に再懸濁した。

定量的PCR （qPCR）
100 μgの未加工全RNAを、EZNA全RNAスピンカラム（Omega Biotek）を用いて、メーカーの取り扱い説明書に従って精製した。精製したRNAを、その後RNA screen tape分析（Agilent Technologies）により定量及び品質確認した。

800 ngのクリーンな全RNAを、逆転写により、メーカーの取り扱い説明書（BioRad, iScript Reverse Transcriptionキット）に従ってcDNAに変換した。ASP1及びASP3の発現の相対定量を、3連で行った。iTaq Universal SYBR Green qPCR反応を、以下のとおり組み立てた：8 ng cDNA、500 nMのフォワードプライマー、500 nMのリバースプライマー、及び1x iTaq Universal SYBR Green Supermix（BioRad）。増幅を、StepOnePlus定量的PCRサーモサイクラー（Applied Biosystems）で、以下のプロトコルに従って行った：95℃で0:30（初期変性）、95℃で0:15、60℃で1:00（40サイクル）、0.5℃の増分（インクリメント）で65〜95℃（融解曲線）。相対定量データ解析を、ΔΔCt法により行い、ハウスキーピング遺伝子ACT1に正規化した。

qPCR用のプライマーは以下のとおりであった：
ASP3_qPCR_Fwd 5′-GAGCGGATGAACAGGGATATT-3′（配列番号3）
ASP3_qPCR_Rev 5′-GGGTCTGTGAGGTTGGAAAT-3′（配列番号4）
ASP1_qPCR_Fwd 5′-CAAACTGAGAGTGGACGGTAAG-3′（配列番号5）
ASP1_qPCR_Rev 5′-GTTGACTATAGCTGGCGGAAA-3′（配列番号6）
ACT1_qPCR_Fwd 5′-CGTCTGGATTGGTGGTTCTATC-3′（配列番号7）
ACT1_qPCR_Rev 5′-GGACCACTTTCGTCGTATTCTT-3′（配列番号8）

DNAシーケンシング
ゲノムDNAを、終夜培養からフェノール-クロロホルム法を用いて既報のとおり抽出した（62）。Nextera XTライブラリ調製は、メーカーの取り扱い説明書（Illumina）に従って行った。シーケンシングを、Illumina MiSeqプラットフォームで、2x300 bpペアエンド設定（GeneWiz）で行った。

RNAシーケンシング
上述のとおり、全RNAを抽出し、クリーンアップし、品質確認した。TruSeq v3ライブラリ調製は、メーカーの取り扱い説明書（Illumina）に従って行った。シーケンシングを、Illumina HiSeq2500 High Outputモードプラットフォームで、2x100 bpペアエンド設定（GeneWiz）で行った。

パン製造
パン製造用の酵母を、1ループ分のYEGプレートを75 mL液体YEG培地に接種することにより調製した。培養液を、18時間（30℃）生育させ、その後量って（はがして）3 x 450 mL YEG培地に入れ、前と同様に24時間生育させた。酵母培養液を遠心分離（10分間、4,000 x g、RT）により回収した。クリーム状酵母を滅菌水中に再懸濁させ遠心分離（10分間、4,000 x g、RT）することにより2回洗浄した。

酵母を29℃で45分間予備発酵させることにより活性化させ（表1）、その後、残りの材料を予備発酵酵母に加え、ドウフックを取り付けたスタンドミキサー（KitchenAid）を用いて21分間混合した（表2）。生地を22℃で15分間インキュベートし（「フロアタイム」）、2個の等しいローフ（塊）に成形し、その後35℃で1.5時間（又はローフが2倍の大きさになるまで）インキュベートした。発酵させたローフをその後204℃で15分間焼成した。

焼成後、パンのローフを室温（RT）に冷却し、1.4 cmのスライスに切った。パンの「サンプルを、デジタル温度計（VWR Traceable）を取り付けた標準的なキッチントースターを用いてトーストした。トーストの度合い（レベル）は、トースターの温度により以下のとおり規定した：ライト（軽）―167℃；ミディアム（中）―217℃；ハイ（高）―235℃。パン及びトーストのサンプルを、その後ミル（IKA分析用ミルModel A11BS1）にかけて、ホモジナイズした。

フライドポテト製造
フライドポテト製造用の酵母は、パンについて前に記述したように調製した。

ラセットポテトの皮を剥き、すすぎ、細かく刻み、褐変酵素を不活性化するために90℃の湯で10分間湯通しした。湯通ししたジャガイモを水切りし、室温に冷却し、水単独か、AR酵母と水との混合物のいずれかに加えた（表3）。ジャガイモを水/酵母混合物中で室温でインキュベートし、サンプルを10、20、40、及び60分で採取し、その後サンプルを直ちに80℃で10分間空気乾燥した。乾燥ジャガイモサンプルをその後175℃のコーン油中で調理した（表3）。

短い加工時間及び高温下でのAR酵母の有効性を試験するために、50 gのジャガイモを、100 mLの水単独か又は100、200、250、又は300 g/LのAR酵母のクリーム状酵母（23%固形分）のいずれかを含む100 mLの水中で、68℃で50秒間インキュベートした。ジャガイモを加える前に、酵母/水の混合物を68℃で10分間平衡化した。処理後、サンプルを直ちに80℃で10分間空気乾燥した。乾燥ジャガイモサンプルをその後バッチ式フライヤーに入ったコーン油中で、175℃、5分間調理した。フライドポテト及びAR酵母処理は3連で行った。統計的有意差は、0 g/LのAR酵母対照と比較したスチューデントのT検定により行った。

スナックペレット製造
スナックペレット製造用の酵母は、パンについて前に記述したように調製した。

スナッククラム（粉）材料を、フラット羽根のアタッチメントを取り付けたスタンドミキサー（KitchenAid）に加え、（表4）に従って5分間混合した。直径4 mmの金型を用いて、クラムを押し出し、ペレット（およそ2 cmの長さ）にした。得られたペレットを、60℃で3〜3.5時間、単層で乾燥させて、目標水分含量である11%にした。ペレットを密閉したプラスチック袋中で1週間保存し、その後185℃で10秒間揚げた。

甘いビスケット製造
甘いビスケット製造用の酵母は、パンについて前に記述したように調製した。

甘いビスケットの材料（表5）を、油、シロップ、及び糖を、フラット羽根のアタッチメント（KitchenAid Classic Stand Mixer）を用いて高速で1分間混合することにより加工した。膨張剤及び/又は酵母を材料の水に溶解させて、ミキシングボウルに加えた。粉類（乾燥材料）を加えて、さらに6分間混合した。得られた生地を20分間休ませた。13 gのビスケット生地を直径65 mmの円形の型に押し付けて、180℃で6分間焼成した（目標水分：2.5〜3.5%）。

プレッツェル製造
プレッツェル試験用の酵母は、パンについて前に記述したように調製した。

最初に粉類（乾燥材料）（表6）、水、及び酵母を、フラット羽根のアタッチメントを取り付けたスタンドミキサー（Kitchen Aidクラシックスタンドミキサー）を用いて1分間混合することにより、プレッツェルを調製した。ショートニングを加え、生地をさらに5分間混合し、その後35℃で30分間発酵させた。発酵させた生地を、およそ40 mmの長さの9 mmの金型を通して押し出し、10分間休ませた。ペレットを、アルカリ浴（1% NaOH）中で94℃、20秒間調理した。プレッツェルをその後204℃で25分間焼成した（目標水分15%）。焼成した製品を119℃で25分間乾燥させた（目標水分3.5%）。

コーヒー製造
コーヒー試験用の酵母は、パンについて前に記述したように調製した。

直接コーヒー豆発酵
コーヒー生豆（GCB）（Brazil Serra Negra）を挽いて粉にした（IKA分析用ミルModel A11BS1）。40 gのGCB粉末あたり75 mLの割合で逆浸透（reverse osmosis）水を加えた。4 gのクリーム状酵母（25%固形分）又は無酵母の対照用に3 gのRO水をGCBペーストに加え、振盪インキュベーター（250 rpm 30℃）中で20時間発酵させた。10 gの発酵させたペーストを、IR水分計（Ohaus MB45-2A0）中で、200℃で13分間IR焙煎した。

生コーヒー抽出物調製及びAR酵母処理
生コーヒー抽出物（GCE）を、GCBのバッチを繰り返し水に浸漬することにより調製した。より具体的には、500 gのGCBを、70℃で16時間、水に浸漬し、その後廃棄した。その後、新しいGCBを、70℃で1時間、水に予備浸漬し、その後GCEを70℃で16時間インキュベートした。この新しいGCBをGCEに浸漬するプロセスを、可溶性固形分含有量が18%に達するまで繰り返した。

GCEを、様々な濃度のAR酵母をGCEと室温で様々な時間インキュベートすることにより、AR酵母で処理した。処理後、AR酵母処理GCEを遠心分離により清澄化し、アスパラギン測定に使用した。

UPLC-QDAによるアクリルアミド定量
1人分（サービングサイズ）の量の固形食品を、サンプリング前にフードプロセッサーで粉砕した。液体及び粉末化された食品を直接サンプリングした。1.00 gのサンプルを50 mL遠沈管（チューブ）に量り取り、1 mLの200 μg/kg ¹³C₃-標識アクリルアミド内部標準及び9 mLの水を加えた。各チューブにその後キャップをして、手で振盪または短くボルテックスし、チューブ内の内容物を混合した。チューブを回転する振盪機内に固定し、チューブ内容物を20分間混合した。チューブを、Eppendorf 5810R遠心機で、9000 rpmで15分間、遠心分離した。スピン濾過（spin filtration）用に清澄化した水層の5 mLのアリコートをピペットにより速やかに取り出した。水性相の一部を取り出すときは、ピペットの先で底の固形物層を避けつつ、ピペットを上層の油層を通過して挿入した。5 mLのアリコートをスピン濾過チューブに入れ、9000 rpmで2〜4分間遠心分離した。フィルターが詰まった場合は、新しいフィルターを挿入し、未濾過の液体を新しいフィルターに注ぎ、大部分の液体がフィルターを通り抜けるまで遠心分離を続けた。Oasis HLB SPEカートリッジを3.5 mLのメタノール、続いて3.5 mLの水でコンディショニングした；メタノール及び水の部分は廃棄した。各カートリッジに1.5 mLの濾過抽出物をロードした。収着剤物質に抽出物を通過させ、その後0.5 mLの水が続いた。その後、カラムを1.5 mLの水で溶離させ、溶離液をAccucat SPEクリーンアップのために回収した。Accucat SPEカートリッジの外側、収着剤ベッドの上1 mLの液体の高さに印をつけ、それからカートリッジを2.5 mLのメタノール、続いて2.5 mLの水でコンディショニングした。メタノール及び水の部分は廃棄した。Oasis SPEから回収した溶離液を全てロードし、1 mLの印まで溶離し、その後溶出した部分の残りを回収した。これらの部分を、2 mLのアンバーのガラス製オートサンプラーバイアルに移し、Waters ACQUITY QDa質量検出器と結合させたWaters ACQUITY UPLC H-Classでの液体クロマトグラフィー/質量分析（Liquid Chromatography/Mass Spectrometry）（LC-MS）解析用とし、解析は以下の設定を用いる：
移動相組成：水性0.1%ギ酸、2%メタノール
カラム：Waters ACQUITY UPLC HSS T3 2.1x50mm 1.8μm
カラム流速：500 μL/min
カラム温度：20℃
注入量：5 μl
溶離時間：1分間
イオン化モード：ポジティブイオンエレクトロスプレー
キャピラリー電圧：600 V
コーン電圧：5 V
MSモード：m/z 72.04をモニタリングするSIR

UPLC-PDAによるコーヒー豆抽出物中のL-アスパラギン定量
コーヒー豆抽出物を13,000 rpmで5分間、室温で遠心分離した。Photodiode Array （PDA）検出器（Acquity UPLC H-Class, Waters、ミルフォード、MA、米国）及びAcquity UPLC BEH C18カラム（1.7 μm, 2.1 mm X 100 mm、Waters、ミルフォード、MA、米国）を備えたWaters Ultra Performance Liquid Chromatography （UPLC）システムによりL-アスパラギンを測定するために、得られた上清をMilli-Q水で希釈した。純度99.6%のL-アスパラギン（Sigma-Aldrich、セントルイス、MO、米国）を入手し、キャリブレーション及び計算用に15〜500 pmole/μLの範囲の濃度の標準溶液を調製した。サンプル及び標準溶液の両方のL-アスパラギンを、AccQ・Tag Ultra^TM Derivatization Kit （WATERS、ミルフォード、MA、米国）により誘導体化して、260 nmでの吸光度の検出のための発色団基を加えた。分析は、1 μLの注入量及び43℃のカラム温度で行った。L-アスパラギン誘導体の勾配溶離用に、AccQ・Tag Ultra^TM Eluent A及びEluent Bの濃縮溶液を、Waters（ミルフォード、MA、米国）より購入した。詳細な溶離プログラムは、表7に示した。

結果
現行のシングルラウンドのASP3脱抑制変異体スクリーニング方法の評価
通常ASP3を抑制状態にしているNCRを回避するために、D-アスパラギンを唯一の窒素源として生育することができる酵母細胞を選抜する、ランダム突然変異誘発-スクリーニング法を用いた（60）。他の全ての生物と同様に、サッカロマイセス・セレビシエは、D-アミノ酸を利用しない。しかしながら、細胞壁関連アスパラギナーゼII（ASP3）酵素は、非効率的ではあるものの、D-アスパラギンを分解することができるという点で特有である（64）。重要なことに、細胞質アスパラギナーゼI（ASP1）は、D-アスパラギンを分解することができない。

D-アスパラギンでの生育はASP3が生産されていることを示すものであるが、加えて、完全に脱抑制されるために、強力なNCR条件で発現されていなければならない。したがって、選抜方法には、培地中のメチルアミンも包含される。Ｓ．セレビシエは、メチルアミンを窒素源として利用できない。しかしながら、メチルアミンは、アンモニアトランスポーターに関してアンモニウムイオンと競合する。ひとたび細胞に入ってしまえば、メチルアミンは代謝反応に関与しないが強力なNCRを引き起こす―酵母の好む窒素源：アンモニア（硫酸アンモニウム）と同程度に。したがって、メチルアミンは、生育阻害剤である（65、66）。

唯一の窒素源としてのD-アスパラギンと、メチルアミンとを含有する培地中で細胞を培養することにより、細胞が生育できる唯一の方法が、ASP3を発現し、外部のD-アスパラギンを分解し、そして放出されたアンモニウムイオンを取り込むことである、という状況が整う。同時に、遊離したアンモニウムイオンは、細胞によって生育のために使用されるために、メチルアミンと競合するはずである。したがって、ASP3の発現レベルが最も高い細胞が、生育培地の抑制的条件に起因する選択的優位性を獲得する。重要なことに、酵母は放出されたD-アスパラギン酸を生育のために利用することができない。

この選抜方法（D-アスパラギン及びメチルアミン）は、酵母の実験室株（DJ2-23C）において、脱抑制ASP3変異体を同定するために以前に用いられている（60）。著者らは、EMS突然変異誘発細胞を選択プレート（100 mM （3.1 g/L）メチルアミン及び5 mM（0.66 g/L）D-アスパラギンを含む）上に直接プレーティングすることにより、ASP3変異体を選抜した。これにより、著者らは、様々な脱抑制ASP3バリアントを見出した。しかしながら、繰り返し試みたにもかかわらず、関連する産業用パン酵母株においてそれらの結果を再現することができなかった。

元の研究（Kamerud and Roon 1986）の著者らがおそらくは容易に脱抑制ASP3変異体を発見することができたのは、一倍体の実験室酵母株を使用していたからである、ということに注目することが重要である。産業用株―著しくより複雑なゲノム（三倍体、四倍体、異数体）を伴う―を使用することにより、脱抑制変異体を発見することが相当により困難になる。これは、潜性（劣性）の表現型を伴うあらゆる変異体が、一倍体株で表れていたようには表れてこないからである。また、エピスタシス又は多面的変異が起こる機会も、著しくより多い。原則的に、あらゆる有益な変異は、遺伝子冗長性により緩衝される。これは実験室株ではまれであり、一倍体のバックグラウンドをもつものでは特にそうである。

アクリルアミド低減酵母を得るためのランダム突然変異誘発及び適応進化ストラテジーの開発
産業用パン酵母がKamerud and Roonのシングルラウンド選抜ストラテジーに適していないということを考慮し、スクリーニング方法は、複数ラウンドの突然変異誘発と組み合わせた反復適応進化ストラテジーを組み込むように設計された（図１）。この新規ストラテジーの目標は、突然変異誘発を繰り返すと同時に、選択圧を時間をかけてゆっくりと高め、本来ならば抑制的である条件において、完全なASP3発現―そしてひいてはアスパラギン分解―を可能にさせるようにすることである。重要なことに、選抜に用いられるD-アスパラギン及びメチルアミンの最終濃度は非適応酵母の生育を完全に阻止するため、ASP3の完全な脱抑制を確実にするために必要な選択条件は、ゆっくりと増加させなければならない。したがって、採用されたランダム突然変異誘発と適応進化との特定の組合せのみが、AR表現型を生じさせることができる。

市販の産業用酵母株のカルチャーコレクションを、唯一の窒素源としてのD-アスパラギンでの生育に関してスクリーニングした。1種の産業用株―日本のパン酵母株―のみが、少しでも目に見えるD-アスパラギンでの生育を示し、このことはこの株が天然のASP3遺伝子を含んでいることを示している。実験室株S288CはASP3を含んでいることが知られているので、これを陽性対照として用いた。

ゼロ時点において、野生型株を、最初にD-アスパラギン（10 g/L）を唯一の窒素源として（スクロースを炭素源として）含有する最少培地中で継代培養した。この培地中では、野生型は非常に遅い生育速度を示し、これらの条件下において、わずかにより高いASP3の発現を可能にする自然変異には、選択的優位性がある。遺伝的変動性を導入するために、細胞を週1回の頻度で、様々な線量（致死線量の10〜99%）のUVでのUV突然変異誘発に供した。株は、継続的に継代培養され（1日1回の頻度で）、OD₆₀₀の測定値を記録して相対生育を追跡した。各継代培養の際に、細胞を新しい培地に、0.01という同一の開始OD₆₀₀で、接種した。4週間の期間にわたって、突然変異誘発させた酵母の選択培地での生育速度が、非選択培地での生育速度に匹敵するほどに向上するのが観察された。これは、本発明者らが、非誘導的条件下でのASP3の発現が向上し、それにより（強力なNCRの条件又は非誘導的条件において）脱抑制された変異体の選抜を開始するための良好な遺伝的バックグラウンドを与える細胞を選抜したことを示唆していた。

1カ月後、強力なNCR、すなわちASP3の完全に抑制的な条件を作動させるために、メチルアミンを培養培地に導入した。出発点として突然変異誘発させた系統を使用し、最少量のメチルアミンを増殖培地に加えた（0.05 g/L）。これにより、細胞の生育速度が、選択培地での継代培養を最初に開始したときと同じレベルまで、著しく低減した。

次の4ヶ月間にわたって、最も生育の速い系統を、メチルアミンの存在下での連続的継代培養及び週1解のUV突然変異誘発に供した（上述のとおり）。メチルアミンの存在下での生育速度が、メチルアミン非存在下での生育速度に匹敵したとき、個々のコロニーを、固体のメチルアミン含有選択培地上にプレーティングすることにより得た。速い生育を示すコロニー（すなわち、最も早く目視で出現し、プレート上のおよそ平均的な大きさのコロニーに対して最も大きいコロニーサイズ）を選び、L-アスパラギン分解活性について試験した。高い活性を示すコロニーを、続いてさらに継代培養し、選択圧を高めひいてはL-アスパラギン分解活性を向上させるために、漸進的により多いメチルアミン（0.05 g/L〜12 g/Lのメチルアミン）で突然変異誘発した。特筆すべきは、継代培養の時系列の異なる段階で突然変異誘発することにより、新しい系統が連続的に創り出された。直前の代の培養に対して向上したL-アスパラギン分解活性を示す系統のみを、さらに進化させた。

対照として、一度も突然変異誘発しない野生型酵母の系統を維持した。この系統により、適応進化が、単独で（突然変異誘発無しで）所望の表現型（完全に脱抑制されたASP3）を作製するのに十分であるか、あるいは獲得した表現型が、進化工学的アプローチ（すなわち、UV突然変異誘発により選択された遺伝的変動性）の結果であるかを判定することができる。

AR酵母はNCR条件下でアスパラギンを分解する
ASP3の発現、ひいてはパン酵母のアスパラギンを分解する能力は、大部分の生育条件下で抑制される。AR株の機能性を最大化するために、ASP3発現を調節するNCR機構を破壊することが不可欠であった。そのようなものとして、AR株は、富栄養培地中で生育するときであっても、アスパラギンを分解するはずである。適応酵母の機能性を試験するために、非適応の野生型の親株に対しての、適応酵母のアスパラギンを分解する能力を比較した。

適応進化プロトコルから、所望の表現型（メチルアミンの存在下でD-アスパラギンで生育）を有する3株の主要なバリアント―RBAR-01、RBAR-02、及びRBAR-03を同定した。これらの株をアスパラギン分解活性について試験すると、これらの株の各々は、富栄養（抑制的）条件下で生育させた場合でも、高いレベルのアスパラギン分解を示した（図２）。野生型―最大3時間まで感知できるほどの活性を示さず、その後最小限の活性のみを示した（60%より多い残存L-アスパラギン）―と比較して、高いレベルのL-アスパラギン分解活性が、1時間という少ないアッセイ時間でも、AR株の各々で観察された（RBAR-01：1時間で82%のL-アスパラギンが残存；RBAR-02：1時間で59%のL-アスパラギンが残存；RBAR-03：1時間で54%のL-アスパラギンが残存）。重要なことに、RBAR-02及びRBAR-03は、1時間及び2時間の記録において、ASP3を恒常的に発現するように遺伝子操作されたGMO対照株と比較して、相当に良い成績を示した。これは、適応進化が、人間が主導するリバースエンジニアリングよりも優れた機能的解法をもたらすことができる場合が多いという考えを支持する。さらに、これらのデータは、適応的に進化したAR酵母は、短時間のインキュベーション―経済的及び食品安全的な利益を提供する―が望まれる場合が多い産業において、強化された有用性を有するであろうことを示唆する。総合すると、図１及び２は、使用した適応進化プロトコルは正常なNCR条件をうまく改変して、AR酵母が富栄養培地（YEG）で生育させた場合でもアスパラギンを分解するようにすることができたことを示している。重要なことに、3株全てのARバリアントは分離した突然変異誘発系統から生じており、したがって、これらの表現型―及び関連する作用機序―は、独立して進化したようである。

反復適応進化はAR株の作製に決定的に重要である
前に述べたとおり、Kamerud and Roonのシングルラウンド選抜ストラテジーは産業用パン酵母株に適用できない。したがって、新規な反復適応進化的ストラテジーを開発して、L-アスパラギンを分解する能力を有するAR株を得た。この新規ストラテジーの目標は、突然変異誘発を繰り返すと同時に、選択圧を時間をかけてゆっくりと高め、本来ならば抑制的である条件において、完全なASP3発現―そしてしたがってアスパラギン分解―を可能にする十分な遺伝的多様性を達成することである。

AR株を開発するためのこの反復プロセスの必要性を確認するために、最終的なAR株、並びにその野生型の親株の生育を、異なる程度の選択圧下で試験した。株を、最小限に選択的な培地（YEG + D-アスパラギン）、Kamerud and Roonにより用いられた、中程度に選択的な培地（YEG + D-アスパラギン+ 3.1 g/L メチルアミン）、及び本研究において用いられた、高度に選択的な培地（YEG + D-アスパラギン+ 12 g/L メチルアミン）上にプレーティングした。予想通り、非選択的条件では全ての株が等しく良好に生育した（図３、左のプレート）が、最も選択的な条件ではAR株のみが生育することができた（図３、右のプレート）。以前の結果と整合して、親株は、適応進化させたAR株よりもゆっくりとではあるが、穏やかな選択的条件で生育することができた（図３、中央のプレート）。この生育の差異は、より高度に選択的な環境において自身をうまく生育させることができる、AR株の進化的変化を示している。総合すると、これらのデータは、経時的に連続的遺伝的多様性（進化）を選択するように選択圧を反復的に増加させることの必要性を強調する。実際、この反復的アプローチによってのみ、高度に選択的な条件下で生育することができる産業用パン酵母株を作製することができ、結果として、独自のAR表現型を付与することができた。

AR酵母株は、機能的に異なった、進化的に適応された、野生型株の子孫である
方向付けられた適応進化は、新規表現型（例えば、恒常的アスパラギン分解）の高度に特異的な発達を可能にする。進化させたAR株の表現型を実証した（図２及び３）が、これらの株が、培養中に獲得された混入（コンタミ）株ではなく、本当に野生型株の子孫であることを保証することが重要になった。AR株（RBAR-01、RBAR-02、及びRBAR-03）の系統を確認するために、インターデルタ（inter-delta）フィンガープリンティングPCRを用いて野生型の親株に対する各AR株のタイピング（型判定）を行った。TY1及びTY2レトロトランスポゾンに隣接するデルタ配列は、酵母ゲノム全体に分散している。これらのレトロトランスポゾンでの高い突然変異率に起因して、イントラデルタ配列の増幅により、入り混じった数及びサイズのバンドがもたらされ、これを特定の酵母株を同定するために用いることができる（61）。RBAR-01、RBAR-02、及びRBAR-03のインターデルタフィンガープリンティングは、野生型株と比較して、同一の数、サイズ分布、及び相対的強度のバンドを増幅した（図４、レーン３、４、５、及び６を比較）。これは、適応させた全てのAR株が、同じ親株に由来することを示唆しており、したがって、これらが類似の性質、例えば生育動態（速度論）、活性（バイタリティ）、及び産業的製パン用途への適性を共有する可能性が高い。重要なことに、野生型及びAR株は、非関連のS288C及びGMOアスパラギン分解酵母対照株とは異なってタイピングされた（図４、レーン１及び７）。

AR株はアスパラギナーゼIIを恒常的に発現し、かつL-アスパラギンを分解する
酵母のNCR系は、細胞が複雑な窒素源を可能な限り最も効率的な方法で利用することを可能にする。すなわち、質の異なる複数の供給源が利用可能な場合、NCRは、細胞が利用可能なものの中で最も品質の高い供給源を優先的（選択的）に利用してから次の供給源に移行するように、異化遺伝子発現を制御する。実際、YEG等の富栄養増殖培地は、アンモニウム、遊離アミノ酸、ペプチド、及びタンパク質を含む、様々な窒素源の複雑な混合物を含有する。結果的に、YEGでの酵母生育中、利用可能な窒素の量及び質―並びにNCR活性―は、常に流動的である。そのようなものとして、AR株は、YEG中で終夜生育させた場合にはL-アスパラギンを分解する非常に強化された能力を示した（図２）が、この時点では、アスパラギン分解が特定の窒素環境に制限されている可能性が残っていた。

ASP3遺伝子発現―そして結果的にはL-アスパラギン分解活性―が、特定の時点に特異的であるのか、そうではなくて恒常的であるのかを試験するために、24時間の期間にわたって酵母をサンプリングする経時的実験を行った。初期終夜培養の後、等しい細胞数の各株を新しいYEG培養液に接種し、24時間生育させた。L-アスパラギン分解（標準的な1時間のアッセイ）、及びqPCRによるASP3遺伝子発現の両方を測定するために、各株からのサンプルを6時間間隔で採取した。

図５Ａに示すように、全ての株は同等の速度で生育し、そのため各時点で等しい数の細胞を回収することができた。

L-アスパラギン分解に関しては、RBAR-02及びRBAR-03の両方が、経過時間全体を通してL-アスパラギンを完全に分解することができ（10%未満の残存L-アスパラギン）、一方でRBAR-01は、同じ期間中、L-アスパラギンを異化する中程度の能力を有していた（平均で60%の残存L-アスパラギン）。重要なことに、野生型株は実験中どの時点でも感知できるほどのL-アスパラギン分解を示さなかった（図５Ｂ）。注目すべきは、これらのデータは図2で以前観察されたL-アスパラギン分解と整合している。

ASP3発現について試験すると、全てのAR株はASP3の恒常発現を示した（図５Ｃ）。全時点にわたって平均すると、RBAR-01、RBAR-02、及びRBAR-03は、それぞれ、野生型より4.7、9.6、及び10.5倍多くASP3を発現した（図５Ｃ）。興味深いことに、恒常発現の相対的な大きさは、各株の経過時間全体を通してのL-アスパラギンを分解する能力を反映していた（図５Ｂと５Ｃとを比較）。最後に、全てのAR株におけるASP1発現は、野生型と比較して変化しておらず（図５Ｄ）、観察されたL-アスパラギン分解が細胞質アスパラギナーゼI（ASP1）ではなく細胞壁関連アスパラギナーゼII（ASP3）の結果であることを示している。総合すると、これらのデータもまた、AR株が、適応進化の結果、恒常的にASP3を発現し、恒常的にL-アスパラギンを分解していることを示している。

AR株は強化された特有のアスパラギナーゼII動態を示す
アスパラギン異化によりアスパラギン酸及びアンモニアが生産されるが、これらはどちらも高温の調理中にピラジン類等のオフフレーバー化合物に変換され得る。したがって、特定の食品製造利用においては、オフフレーバー生成を防ぐために最大値未満のレベルのアスパラギナーゼII活性を有するAR酵母を利用することが有益である可能性がある。各AR酵母株におけるアスパラギナーゼII動態を試験するために、終夜培養を、L-アスパラギンを含有するYEG培地に固定の細胞数接種した。サンプルを30分間隔で採取し、残存L-アスパラギンを試験した。3株全てのAR株は野生型対照と比較してL-アスパラギン分解を示したものの、L-アスパラギン分解動態はAR株間で同等ではなかった（図６）。より具体的には、RBAR-01は、RBAR-02、及びRBAR-03の両方と比較して、低いL-アスパラギン分解速度を有している（RBAR-01：90分で82%のL-アスパラギンが残存）が、一方RBAR-02及びRBAR-03は類似していた（RBAR-02：90分で54%のL-アスパラギンが残存；RBAR-03：90分で66%のL-アスパラギンが残存）。これらのデータは、図２で観察されたL-アスパラギン分解と整合しており、残りのデータと併せて考えると、適応的に進化させたAR酵母における表現型を支持している。

AR株はNCRに制御される遺伝子の差次的遺伝子発現を示す
その固有の非特異的性質のおかげで、ランダム突然変異誘発及び適応進化は、目的の遺伝子に加えて、多数の異なる発現を変化させる能力を有する。AR酵母株が実際にASP3を恒常的に発現し、本来ならば活性なNCRの条件において良質の窒素源の存在下でL-アスパラギンを分解することを決定し終えて（図２、５、及び６）、発明者らは、AR酵母の包括的な遺伝子発現プロファイルを評価しようとした。

これを行うために、終夜培養から固定の細胞数を新しいYEG培地に接種し、培養液を6時間インキュベートした。全RNAをその後サンプルから抽出し、逆転写cDNA（ポリdTプライミング）からRNAシーケンシングライブラリを構築した。シーケンシングをIllumina HiSeq2500 High Outputモードプラットフォームで、2x100 bpペアエンド設定で行った。

平均で、株当たり6750万リードが得られ、これは6,818メガベース及び（12 Mbの1倍体ゲノムと仮定して）およそ560倍のカバレッジに等しい。シーケンシングデータは、全体的に非常に高い品質であり、94%のQスコアが30以上であり、平均Qスコアは37であった。

各株についての生（raw）リードを、品質でトリミング及びフィルタリングした（Qスコアが30以上）、その後S288C参照ゲノムにマッピングした。平均して97.6%のリードがうまくアラインメントされた。アラインメントされたリードを用いて、遺伝子当たりのリードカウント（per gene read counts）を構築し、これが差次的遺伝子発現（DEG）解析の基礎を形成した。各AR株について、野生型に対する各遺伝子のlog2の倍数変化を計算した（図７）。1.5より大きい大きさの倍数変化の値を有する遺伝子及び少なくとも100の野生型リードカウントが、差次的に発現している（DE）とみなされた。図８Ａ及び表８は、各AR株におけるDEGの発現レベルを比較した。これらのDEGの基準により、81（1.6%）、73（1.4%）、及び84（1.6%）のDEG（S288Cの5,121の検証済（verified）ORF中）が、RBAR-01、RBAR-02、及びRBAR-03の各々で、それぞれ観察された。さらに、113中50（44.2%）のDEGが3株全ての株に共通しており、一方で75（66.4%）のDEGが少なくとも2株のAR株に共通していた（図８Ｂ）。RNAseq解析によると、AR株の各々において、ASP3は中でもアップレギュレートされた上位の遺伝子であった（表8）。実際、ASP3は、RBAR-01、RBAR-02、及びRBAR-03においてそれぞれ4.9、7.8、及び8.9-倍アップレギュレートされ、これは図５Ｂ及び５Ｃにおいて得られたL-アスパラギン分解データ及びqPCRデータと整合する。

ASP3に加えて、DEG解析により、多数のNCR遺伝子の実質的な差次的制御が明らかになった（図９Ａ）。合計で、79の既知のNCRにより調節される遺伝子中15（19.0%）、15（19.0%）、及び17（21.2%）が、それぞれRBAR-01、RBAR-02、及びRBAR-03において差次的に発現していた。これらの強化は全て、フィッシャーの正確確率検定により高度に統計的に有意であった（p ≦ 0.0001）。

最後に、包括的な観点からAR酵母において影響を受けている遺伝子経路及びネットワークを解析するために、AR株の各々においてDEGの遺伝子オントロジー解析も行った（表9）。多数の生物学的プロセス、細胞の構成要素、及び分子機能が著しく影響を受けているが、最も明らかなものは、AR株における栄養素輸送、特にアミノ酸輸送の大規模な脱制御である（図９Ａ、表８及び９）。実際、多数の上位DEG（アップレギュレートされたもの及びダウンレギュレートされたもののどちらも）が、UGA4、GAP1、MEP2、DAL4、DAL5、PUT4、OPT2、HXT5、HXT4、HXT10、HXT11、HXT14、HXT9、MUP1、TAT1、MUP3、及びGNP1を含むパーミアーゼ酵素である（図９Ａ及び表８）。

総合すると、これらのデータは、適応的に進化させたAR酵母は、進化させていない親株に対して、実質的な差次的遺伝子発現プロファイルを示すことを示す。さらに、AR酵母において影響を受けている主要な経路には、NCR調節及びアミノ酸輸送が含まれる。

全RNAを、野生型及びAR酵母株（RBAR-01、RBAR-02、及びRBAR-03）から、YEGでの対数増殖中に回収した。RNAシーケンシングライブラリ（TruSeq v3）―全RNAより調製―を、Illumina HiSeq2500 High Outputモードプラットフォームで、2x100 bpペアエンド設定でシーケンシングした。生リードを品質でフィルタリングし、S288C参照ゲノムにマッピングした。Log₂の倍数変化値（野生型に対して）を、6,604の酵母ORF（検証済、未特性解析（uncharacterized）、及び疑わしい（dubious））の各々について計算した。差次的に発現していた遺伝子を、以下の基準に従って分類した：≧ | 1.5 | log2倍数変化 & 野生型酵母において≧ 100 カウント。表8を参照。

AR株は、適応的に進化させていない親株と遺伝的に異なっている
適応進化を司る基本原理は、生物に特定の環境における適応度の優位性を集合的に付与する変異の蓄積である。L-アスパラギンを恒常的に分解する能力に基づいてAR株を選抜し（図１、２、５、及び６）、AR株における関連するDEGのサブセットを同定した（図７、８、及び９）ので、発明者らは、次にゲノムワイドで変異を識別するために、AR株を調べようとした。これを行うために、AR株の各々、及び親株由来のゲノムDNAを単離し、DNAシーケンシングライブラリを調製した。シーケンシングを、Illumina MiSeqプラットフォームで、2x300 bpペアエンド設定で行った。

平均して、2,430メガベース及び（12 Mbの1倍体ゲノムと仮定して）およそ203倍のカバレッジに等しい、株当たり405万リードが得られた。シーケンシングデータは、全体的に非常に高い品質であり、84%のQスコアが30以上であり、平均Qスコアは35であった。

各株についての生リードを、品質でトリミング及びフィルタリングした（Qスコアが30以上）、その後S288C参照ゲノムにマッピングした。平均して96.12%のリードがうまくアラインメントされた。マッピングされたリードを用いて、ゲノム中の各塩基についてパイルアップ（積み重ね）統計値及びコンセンサス配列を作製した。この情報を、その後参照ゲノムと比較し、変異をS288C参照配列に基づいてアノテーションした。最後に、AR株における同定した変異を、過分な（superfluous）変異を除くために、野生型株でも同定されたものに対してフィルタリングした。変異を同定する統計的検出力を高めるために、当初DEGについて作製したRNAシーケンシングデータを、変異を分類するためにも用いた。酵母ゲノムはおよそ72%がコーディングであることから、RNAseqデータセットは酵母ゲノムの大部分について良好なカバレッジを提供する。

変異解析についての統計の要約が表10及び11に与えられる。AR株間での変異重複比較を図１０に示す。興味深いことに、21,047中15,918（75.6%）の変異が、3株全ての株に共通しており、一方で17,571（83.5%）が少なくとも2株のAR株に共通していた（図１０）。

ゲノムDNAを、野生型及びAR酵母株（RBAR-01、RBAR-02、及びRBAR-03）から回収した。DNAシーケンシングライブラリ（Nextera XT）―ゲノムDNAから調製―を、Illumina MiSeqプラットフォームで、2x300 bpペアエンド設定でシーケンシングした。リードを品質でフィルタリングし、S288C参照ゲノムにマッピングした。リードのパイルアップを用いて、S288Cコンセンサス配列に対し、各ヌクレオチドにおけるバリアントを分類した。過分な変異を除くために、AR酵母株におけるバリアントを、野生型バリアントに対してフィルタリングした。表10を参照。

ランダム突然変異誘発及び適応進化が非標的化方法であることを考えると、AR株において同定された大部分の変異は、ARの表現型、すなわちASP3の恒常発現及びL-アスパラギンの分解には過分（不要）である可能性がある。したがって、決定的な変異が生じる最も論理的な場所は、関連する遺伝子のコード領域か又は該遺伝子のプロモーターの中である。重要なことに、コード領域変異がタンパク質の機能に影響を与えるためには、その変異がタンパク質の構造、すなわち配列に影響しなければならない。同様に、プロモーター領域の変異が遺伝子発現に影響を与えるためには、変異は転写因子結合部位（TFBS）の内部で起こらなければならないようである。そのようなものとして、同義的エキソン性一塩基バリアント（SNV）、並びに遺伝子間及び非TFBSプロモーターの変異は、どちらも除外することができる。総合すると、これらのフィルタリング基準により、RBAR-01、RBAR-02、及びRBAR-03において、それぞれ8,469（4,894 TFBS及び3,575 エキソン性）、8,324（4,792 TFBS及び3,532 エキソン性）、及び8,350（4,862 TFBS及び3,488 エキソン性）の候補変異が残る。したがって、AR株の適応進化によって、株のDNA配列に変化がもたらされ、それによりASP3のNCR抑制を克服し、L-アスパラギンを恒常的に分解することができたことは明らかである。

AR株はパン及びトースト中のアクリルアミド生成を低減する
120℃より高い温度で遊離アスパラギンが還元糖と反応すると、パン中でアクリルアミドが生成する。重要なことに、パン中の還元糖は、アスパラギンに対して過剰に生じる；したがって、パン中のAAのレベルは、アスパラギン含有量と高度に相関する（26、67〜69）。さらに、パン中のAAレベルは、トーストする際に、ローフの内部の未反応のアスパラギンが高温に曝露されると著しく増加するということは、十分に確立されている（21）。したがって、トーストする前にローフ全体からアスパラギンを除去することが、パンの総合的なAAポテンシャルを低減する鍵となる。

AR酵母株が恒常的にASP3を発現し、L-アスパラギンを分解することが確立された（図２、５、及び６）ので、次に、株をパンのAAを低減するために使用することができるかを決定することが望まれた。これを行うために、野生型酵母又はAR株のRBAR-01、RBAR-02、及びRBAR-03を用いて白パン及び全粒小麦パンを作り、焼成したパン及びトーストの両方において、AAレベルを分析した（図１１）。野生型酵母を用いて製造した全てのパンにおいて、AAレベルは30〜67 ppbの範囲であった。対照的に、AR酵母株を用いて製造した全てのパンは、ほとんど検出できないレベルのAA（< 10 ppb）を有しており、これは、80%のAAの概算平均減少に相当する。加熱工程のAAレベルに対する作用と整合するように、全ての株によって製造された全てのパンにおいて、トースト工程とAAレベルとの間に明らかな正の相関が観察された。平均して、低、中、及び高のトースト工程により、AAがそれぞれ3、5、及び7倍増加した（図１１）。しかしながら、AR株を用いて製造したトーストにおいては、AAレベルは相当により低く、AAの平均減少は75〜85%であった。ほとんどの場合において、AR酵母により製造された、トーストされたパンのAAレベルは、野生型株によって製造されたトーストされていないパンよりも低かった（図１０）。特筆すべきは、これらの結果及び条件が、10より多い独立した実験を代表するということである。総合すると、これらの結果により、AR酵母株が、パン及びトーストにおいてAAレベルを低減するための頑強（ロバスト）かつ滑らか（シームレス）な方法として認証される。

AR株はフライドポテト中のアクリルアミド生成を低減する
ジャガイモを原料とする食品はアスパラギン及び還元糖がどちらも豊富であり、最も高レベルのAAのいくつかを含む傾向がある（12）。したがって、ASP3を恒常的に発現してL-アスパラギンを低減し（図２、５、及び６）、パン及びトーストにおいてAAレベルを相当に低減する能力（図１１）を有するAR酵母株を確立したため、次に、フライドポテト中のAAの低減のためにこの株を用いることができるか判定した。酵母はフライドポテトの材料ではないが、水（水性）浸漬工程は生産において一般的である。したがって、揚げる前に水/酵母混合物にジャガイモを浸漬する工程により、フライドポテト中のAAを低減することができるという仮説を立てた―この時間の間に、酵母がジャガイモの表面のアスパラギンを分解し、それによりAAを低減するであろう。

この考えを試すために、水単独、又は野生型酵母若しくはAR株であるRBAR-01、RBAR-02、及びRBAR-03の水/酵母溶液に浸漬したラセットポテトから作ったフライドポテトにおいてAAレベルを分析した（図１２）。その高い糖及びアスパラギン含有量と整合して、無酵母の対照フライドポテトは、高濃度のAA―440 ppbを有していた。対照的に、全てのAR酵母株は、フライドポテト中のAA含有量を相当に低減することができ（71%の平均減少―127 ppb）、RBAR-03は77%の減少をもたらした（100 ppb）。興味深いことに、野生型酵母株は、無酵母の対照と比較して、フライドポテト中のAAを55%低減することができた（200 ppb）。これは、糖を発酵させる酵母の天然の能力に起因する可能性が高い。実際、AAの影響を受ける食品の大部分、すなわち非ジャガイモ原料の食品では、アスパラギンはAA生成の限定試薬（律速物質）である。しかしながら、ジャガイモにおいては、アスパラギン及び還元糖がおおよそ等モル量で存在している（70）―したがって、還元糖の還元は、ジャガイモに関して効果的なAA軽減手段である。しかしながら、還元糖及びアスパラギンのレベルは、ジャガイモの栽培品種、季節、及び貯蔵条件に非常に依存することが知られている（70）。したがって、野生型酵母―糖しか消費できず、かつ有利な加工条件、例えば十分な接触時間の下でしか消費することができない―のジャガイモ製品中のアクリルアミドを低減する有効性は、変動する。そのようなものとして、アスパラギンを分解する能力を有するAR酵母株は、単純な糖の発酵を超越して、著しくかつ一貫してAAレベルを低減することができる。

比較的短い接触時間及び高い温度条件下でAR酵母をさらに試験するために、発明者らは、上述のとおり切ったジャガイモを用意し、それを水単独、又は水/AR酵母（RBAR-03のみ）の混合物に68℃で50秒間浸漬した。図１３に示すとおり、発明者らは、使用したAR酵母の量と観察されたアクリルアミド低減との間に用量依存的関係を観察した。試験した条件下で、最も低い濃度のAR酵母（100 g/L）は、アクリルアミドを19%低減することができた（1240 ppbと比較して1002 ppb）。しかしながら、250 g/LのAR酵母では、発明者らは49%というアクリルアミドの著しい低減を観察した（1240 ppbと比較して632 ppb）。興味深いことに、300 g/LのAR酵母を用いることには、著しい利益が何も観察されず、これは、試験した条件下では50%がアクリルアミド低減の最大値である可能性があることを示唆している。しかしながら、他のより最適化した条件下では、AR酵母によるアクリルアミド低減は、相当に高い可能性がある。特筆すべきは、これらの結果及び条件が、複数の独立した実験を代表するということである。総合すると、これらのデータは、AR酵母が、フライドポテト、より大まかに言うと生のジャガイモから作られる油で揚げた（焼いた）食品中のAAを低減するのに有効であることを示す。

AR株はスナックペレット中のアクリルアミド生成を低減する
生のジャガイモ製品中のAAを低減するためのAR株の有用性が確立された（図１４）ので、次に、ポテトフラワーを原料とするスナック食品においてその有効性を試験した。これを行うために、押し出して揚げたジャガイモを原料とするスナック製品を、野生型酵母又はAR株のRBAR-01、RBAR-02、及びRBAR-03のいずれかを用いて作製し、加工中のアスパラギンレベルを分析した―AAレベルは、最終フライド製品中でも測定した（図１４）。アスパラギンに関して、無酵母対照又は野生型酵母のいずれかに対して、全てのAR株はアスパラギンを分解することができた（図１４Ａ）。より具体的には、RBAR-01及びRBAR-03は、スナックペレット中の全てのアスパラギンを、30分間という少ない処理時間で消費した。対照的に、RBAR-02中のアスパラギン分解活性は、この食品モデルではそれほどロバストでなかった―60分間で45%の低減。しかしながら、無酵母対照又は野生型酵母に対しては、この活性は容易に明らかであった。

AA低減に関して、全てのAR株は有効であった。平均して、AR株はAAを75%低減した（400 ppbに対して平均100 ppb − 図１４Ｂ）。この食品モデルにおいてアスパラギンを分解する実証された優れた能力と整合するように、RBAR-01及びRBAR-03は、最も低いレベルのAAをもたらした―それぞれ82及び85%低減（70及び60 ppb）（図１４Ｂ）。興味深いことに、そしてフライドポテトでの場合とは対照的に、野生型酵母はスナックペレット中のAAレベルを低減することができなかった。これは、スナックペレット混合物中の非アスパラギン含有原料（ポテトスターチ及びマルトデキストリン）の存在に起因するものである可能性がある。これらの原料は、混合物中の還元糖の含有量を著しく増加させ、それによってアスパラギンがスナックペレット中でのAA生成の限定試薬となる。そのようなものとして、酵母の糖発酵活性は、AAを低減するには効果的でない。特筆すべきは、これらの結果及び条件が、複数の独立した実験を代表するということである。総合すると、これらのデータは、AR酵母が、押し出して揚げたポテトフラワーベースの食品においてAAを低減するためにうまく使用することができることを確認する。

AR株は甘いビスケット中のアクリルアミド生成を低減する
パン及びトースト、生のジャガイモ製品、並びに加工ジャガイモ製品中のAAを低減するためのAR株の有用性が確立された（図１１、１２、１３、及び１４）ので、次に、甘いビスケットにおいてその有効性を試験した。

これを行うために、甘いビスケット製品を、野生型酵母又はAR株のRBAR-01、RBAR-02、及びRBAR-03のいずれかを用いて作製し、最終フライド製品中のAAレベルを分析した（図１５）。無酵母対照と比較すると、全てのAR株が、最終製品中でAAレベルを低減することができ（平均低減69% - 330 ppbに対して平均103 ppb）、RBAR-03が最も有効であった（79%低減 − 330 ppbに対して70 ppb）。フライドポテトでの状況と同様に（図１２）、野生型酵母はAAをある程度は低減することができたことが書き留められた（30%低減 - 330 ppbに対して230 ppb）が、これは発酵活動に起因する可能性がある。しかしながら、AR株は、アスパラギンの分解する能力に起因する、AAを低減する大いに強化された能力を有している。特筆すべきは、これらの結果及び条件が、複数の独立した実験を代表するということである。総合すると、これらのデータは、AR酵母が甘いビスケット中のAAを低減するのに有効であることを示す。

AR株はプレッツェル中のアクリルアミド生成を低減する
パン及びトースト、生のジャガイモ製品、加工ジャガイモ製品、並びに甘いビスケット中のAAを低減するためのAR株の有用性が確立された（図１１、１２、１３、１４、及び１５）ので、プレッツェルにおいてその有効性を試験した。プレッツェルは、製造中に褐色化（ブラウニング）を向上させるために用いられる水酸化ナトリウム洗浄工程に起因して、典型的に高いレベルのAAを含有している−実際、AA生成は高pHで加速する。

プレッツェルを、野生型酵母又はAR株のRBAR-01、RBAR-02、及びRBAR-03のいずれかを用いて作製し、最終製品中のAAレベルを分析した（図１６）。野生型酵母と比較すると、全てのAR株が最終製品中のAAレベルを極めて低減することができた（平均低減98% - 200 ppbに対して平均 < 5 ppb）。特筆すべきは、これらの結果及び条件が、複数の独立した実験を代表するということである。総合すると、これらのデータは、AR酵母がプレッツェル中のAAを低減するのに非常に有効であることを示す。

AR株はコーヒー中のアスパラギン及びアクリルアミドの生成を低減する
パン及びトースト、生のジャガイモ製品、加工ジャガイモ製品、甘いビスケット、並びにプレッツェル中のAAを低減するためのAR株の有用性が確立された（図１１、１２、１３、１４、１５、及び１６）ので、コーヒーにおいてその有用性を試験した。最初の概念実証（プルーフ・オブ・コンセプト）として、野生型及びAR酵母株のRBAR-03を用いて、挽いたコーヒー生豆の発酵に使用した（図１７）。無酵母対照と比較して、野生型株は、恐らく豆中の還元糖の発酵に起因して、AAを52%低減した（394 ppbに対して191 ppb）。しかしながらAR株のRBAR-03は、糖及びアスパラギンの両方を消費する能力により、AAを92%低減した（394 ppbに対して32 ppb）。

AR酵母が挽いたコーヒー生豆に直接適用された場合にAAを低減することができる（図１７）ことを考慮し、次に、AR酵母がアスパラギンを低減する能力を水性の生コーヒー抽出物において試験した。そのような抽出物は、目的の化合物、例えばアスパラギン又はカフェインを枯渇させると、焙煎の前にコーヒー生豆からその化合物を選択的に除去するために使用することができる。アスパラギンがこの方法で除去されれば、結果として生じる焙煎したコーヒーにおいてAAが低くなるであろう。

図１８に示すとおり、AR酵母（RBAR-03）は、GCE（18%固形分）中のL-アスパラギンを、時間及び濃度に依存的に、低減することができる。最も高い濃度のAR酵母（10⁹ 細胞/mL）において、95%より多いL-アスパラギンが30分間以内に消費され（13.1 g/100g L-アスパラギン、時間 = 30分に対して、340 g/100g L-アスパラギン、時間 = 0）、一方で中程度の濃度（10⁸ 細胞/mL）では、これは90分間以内に達成された（10.5 g/100g L-アスパラギン、時間 = 30分に対して、340 g/100g L-アスパラギン、時間 = 0）。最も低い濃度のAR酵母（10⁷ 細胞/mL）では、L-アスパラギン消費は不完全であり、150分間で43%しか低減しなかった（195 g/100g L-アスパラギン、時間 = 150分に対して、340 g/100g L-アスパラギン、時間 = 0）。特筆すべきは、これらの結果及び条件が、複数の独立した実験を代表するということである。総合すると、これらのデータは、AR株―L-アスパラギンを分解する能力を有している―が、コーヒー中のL-アスパラギン及びAAを効率的に低減することができることを確認した。

結論
より良いAA低減ツールの明らかな必要性があったにも関わらず、現在利用可能な方法は、十分に高い有効性を提供していないか、又は実行するのが技術的、物流的（logistically）、及び経済的に困難であるかのいずれかである。これらの問題に対処するために、パン酵母に基づく新規AA低減技術が開発された。酵母を用いて食品中のAA低減を行わせることは、理想的な解決手段である。なぜならば、1)酵母は、ヒトが長く接してきた歴史を持つ、既に天然の食品原料である；2)酵母は、US FDAの「一般に安全と認められる」（Generally Regarded As Safe）（GRAS）のステータス、又は世界中の大部分の法的権限の管轄における国際的に同等のものの対象である；3) 酵母は、例えばパン等の、AAが著しい問題である食品の多くにおいて、既に主要な原料である；4) AR酵母は、AAが問題である他の食品、例えばジャガイモ製品、シリアル、スナック食品、及びコーヒーへの一過性の処置として組み込むことができる；5) 酵母は、生育させるのに費用がかからず、作業が容易である、並びに6) 大部分の商業的食品生産業者は、酵母を扱った経験が既にあるためである。さらに、パン酵母株から適応的に進化させたため、それがパンであろうが任意の酵母発酵されたベイクド製品であろうが、AR酵母を使用するために工業的製パンプロセスに何も変更を必要としないので、AR酵母株は、全ての既存の製パンプロセスにおいて、滑らかにかつ容易にパン酵母と置き換えることができる。

本報告に記述したとおり、非遺伝子組換えの、適応的に進化させたARパン酵母株―細胞壁関連アスパラギナーゼII ASP3を恒常的に発現する（図２、５、及び６）―は、食品におけるAA問題の頑強かつ高度に効果的な解決手段である。

AR酵母株は、様々な食品において、アスパラギンレベルを、最小限の曝露時間及びプロセスの変更で、最大95%、相当に低減することができる（図１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、及び１８）―酵母が既に原料になっている食品では、何のプロセスの変更も必要としない。

調理前に食品中のアスパラギンを相当に低減することにより、この技術は、下流の食品取り扱いの実践に関わらず、AAの生成を防止する、すなわちAR株は食品のAAポテンシャルを低減する。これにより、実行が物流的及び技術的に困難であり、極めて高額で、制御が難しい（例えば、家庭及びレストランでの食品調製）、多面的なAA管理及び低減のストラテジー―広大な範囲のパラメーターが関与し、広いスケールの介入に相当する―の必要性が回避される。

要約すると、適応進化を用いて、多種多様な一般的な食料品において、細胞壁関連アスパラギナーゼII（ASP3）を恒常的に発現し、L-アスパラギンを分解してAAレベルを低減する、新規の非GMOパン酵母株を開発した。AR株は、パン及び他の酵母発酵食品、ジャガイモを原料とする食品、押し出しスナック食品、甘いビスケット、プレッツェル、並びにコーヒーにおいて、最大95%、AAレベルを低減することができる。

本開示を、現在のところ実施例であるとされているものを参照して説明したが、本開示は、開示された実施例に限定されないということが理解されるべきである。それとは反対に、本開示は、添付の特許請求の範囲の意図に含まれる、様々な改変及び同等の配置（アレンジメント）に及ぶことが意図される。

全ての刊行物、特許、及び特許出願は、各刊行物、特許、又は特許出願が、参照によりその全体が援用されることが具体的かつ個別に示されたのと同じ程度まで、参照によりその全体が援用される。

Claims

細胞壁アスパラギナーゼを発現し、非誘導的条件下でアスパラギン低減活性を有する、単離された非遺伝子改変酵母。
細胞壁アスパラギナーゼが恒常的に発現されている、請求項１に記載の単離された非遺伝子改変酵母。
非誘導的条件下で生育させた場合にアスパラギンを少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%又はそれ以上低減する、請求項１又は２に記載の単離された非遺伝子改変酵母。
細胞壁関連アスパラギナーゼが、ASP3座位によりコードされている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離された非遺伝子改変酵母。
a) 細胞壁関連アスパラギナーゼを発現しているか又は発現する能力を有する野生型酵母株を、D-アスパラギンを唯一の窒素源として含有する培地の存在下で継代培養する工程；
b) 連続的に継代培養し、生育速度を追跡し、毎週突然変異誘発に供する工程；
c) 生育速度がベースラインに達したときのb)の培養を選択する工程；
d) メチルアミンを含有する選択培地中で細胞を連続的に継代培養し、生育速度を追跡し、メチルアミンの存在下での生育速度がメチルアミンを含まない選択培地での生育速度に達するまで、毎週突然変異誘発する工程；
e) メチルアミンを含有する選択培地上にプレーティングすることによりd)の個々のコロニーを単離し、前記コロニーを生育させて大きく速く生育するコロニーを選択する工程；
f) 選択したe)のコロニーを、L-アスパラギンを非誘導的条件下で分解する能力に関して試験し、d)の開始時と比較して高いL-アスパラギン分解活性を有する少なくとも1個のコロニーを選択する工程；
g) 工程d)〜f)を、毎回メチルアミン濃度を増加させながら、L-アスパラギン分解活性がプラトーに達するまで繰り返す工程；
h) L-アスパラギン分解活性がプラトーに達したg)からの株を単離する工程
を含む、L-アスパラギンを非誘導的条件下で分解する酵母株を単離する方法。
細胞壁関連アスパラギナーゼが、ASP3座位によりコードされている、請求項５に記載の方法。
野生型酵母株がパン酵母である、請求項５又は６に記載の方法。
突然変異誘発が物理的突然変異誘発又は化学的突然変異誘発である、請求項５〜７のいずれか一項に記載の方法。
物理的突然変異誘発がUV突然変異誘発である、請求項８に記載の方法。
a)〜c)の期間が、2〜4週間である、請求項５〜９のいずれか一項に記載の方法。
d)〜g)の期間が、6〜48週間である、請求項５〜１０のいずれか一項に記載の方法。
e)において、大きく速く生育するコロニーを選択する前に、コロニーが2〜10日間培養される、請求項５〜１１のいずれか一項に記載の方法。
g)において、メチルアミンを週単位で徐々に増加させる、請求項５〜１２のいずれか一項に記載の方法。
g)において、メチルアミンを0.05 g/Lから12 g/Lまで増加させる、請求項５〜１３のいずれか一項に記載の方法。
e)におけるメチルアミンが、メチルアミンを含まない選択培地での生育速度と比較して生育速度を25〜75%阻害するのに十分な量である、請求項５〜１４のいずれか一項に記載の方法。
生育速度を追跡する工程が、細胞の光学密度を測定する工程、又は選択培地上で生育させた細胞のコロニーサイズを測定する工程を含む、請求項５〜１５のいずれか一項に記載の方法。
g)における繰り返しの数が5〜20である、請求項５〜１６のいずれか一項に記載の方法。
請求項５〜１７のいずれか一項に記載の方法により生産された、単離された酵母。
カナダ国際寄託当局（IDAC）に受託番号140515-01（RBAR-01）で寄託されている、単離された酵母株。
カナダ国際寄託当局（IDAC）に受託番号140515-02（RBAR-02）で寄託されている、単離された酵母株。
カナダ国際寄託当局（IDAC）に受託番号140515-03（RBAR-03）で寄託されている、単離された酵母株。
食物の調製又は加工中のアスパラギンを低減するための方法であって、請求項１〜４及び１８〜２１のいずれか一項に記載の酵母株を食物の調製又は加工条件下の食物に加える工程を含み；酵母が、食物の調製又は加工中のアスパラギンを低減する、方法。
酵母株が不活性である、請求項２２に記載の方法。
酵母株が生である、請求項２２に記載の方法。
酵母株が活性乾燥酵母である、請求項２２に記載の方法。
食品が、野菜を原料とする食品、飲料、ベーカリー製品、穀物製品、果実製品、豆類製品、乳製品、又は肉製品である、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の方法。
酵母株を食物の調製又は加工条件下の食物に加える工程が、酵母材料を酵母株に置換する工程を含む、請求項２６に記載の方法。
酵母株を食物の調製又は加工条件下の食物に加える工程が、発酵を含む、請求項２６に記載の方法。
食品がジャガイモ又はジャガイモを原料とする製品である、請求項２６に記載の方法。
酵母株を食物の調製又は加工条件下の食物に加える工程が、ジャガイモ又はジャガイモを原料とする製品を、水と酵母株との混合物中に調理前に予備浸漬させる工程を含む、請求項２９に記載の方法。
飲料がコーヒーである、請求項２６に記載の方法。
酵母株を食物の調製又は加工に加える工程が、コーヒー豆を酵母株で前処理したコーヒー豆抽出物中に浸漬し、前処理した抽出物によりロースト前にコーヒー豆からアスパラギンを枯渇させてアスパラギンを低減する工程を含む、請求項３１に記載の方法。
１〜４及び１８〜２１のいずれか一項に記載の酵母株を用いて製造された、低減されたアスパラギン又はアクリルアミド濃度を有する食品。
請求項２２〜３２のいずれか一項に記載の方法を用いて製造された、低減されたアスパラギン又はアクリルアミド濃度を有する食品。