CN108026505A - 通过适应性进化开发减少天冬酰胺的酵母的开发及所述酵母降低丙烯酰胺形成的用途 - Google Patents

Abstract

本公开内容涉及分离能够在非诱导条件下降解L‑天冬酰胺的酵母菌株的方法，其包括以下的重复循环：适应性进化和诱变，之后进行菌株选择。还包括通过所述方法获得的酵母菌株以及其用于在食品制备和加工期间减少天冬酰胺和由此减少丙烯酰胺的方法和用途。

Description

通过适应性进化开发减少天冬酰胺的酵母的开发及所述酵母 降低丙烯酰胺形成的用途

相关申请的交叉引用

本申请要求于2015年7月7日提交的美国临时申请No.62/189,547的优先权权益，其内容通过引用整体并入本文。

技术领域

本公开内容涉及用于降低食品中丙烯酰胺浓度的产品和方法，并且涉及丙烯酰胺含量降低的食品产品。特别地，本公开内容涉及具有增强的减少天冬酰胺和由此丙烯酰胺能力的进化酵母菌株。

背景技术

丙烯酰胺(acrylamide，AA)是用于制备废水处理、造纸、矿石加工、采油、科学研究和染料/织物处理中使用的聚丙烯酰胺聚合物的工业化学品。尽管其广泛使用，AA对生物系统具有高毒性，如大量体外、体内和动物模型(大鼠和小鼠)研究所证明的(1-6)。总而言之，这些数据坚定地确定AA及其活性代谢物环氧丙酰胺为具有潜在致诱变性、细胞毒性和神经毒性潜力的毒性化学物质。

由于其在非人系统中的已证明毒性，AA在1994年被世界卫生组织国际癌症研究机构(World Health Organization’s International Agency for Research on Cancer，WHO-IARC)分类为2A致癌原组，该组中的化合物基于‘在实验动物中的足够致癌力证据和致癌由也在人中起作用的机制介导的有力证据’被列为“可能对人具有致癌性’。

2002年，由于在烹制期间发生的Maillard褐变反应，显示AA存在于多种常见的人食物中(7-9)。更特别地，当含淀粉食品或食品产品一旦暴露于等于或大于120℃的温度(例如，煎炸、烘烤、焙烤等)氨基酸天冬酰胺与其中还原糖反应时，AA快速形成。因此，AA以显著量见于多种多样的食品产品中，包括面包(来自所有谷物粉)、马铃薯、马铃薯产品(法式薯条(French fries)、马铃薯条、马铃薯片和马铃薯粉)、咖啡、谷类食品、蔬菜等(10-19)。

由于AA在食品中普遍存在，人饮食遭受AA风险是普遍的。然而，目前还没有关于饮食AA在引起人癌症中的直接作用的科学共识。尽管迄今已经完成超过30项流行病学研究(20)，但是这些研究中很多得到不一致或不清楚的结果，因此仅支持高的饮食遭受AA风险与多种癌症，尤其是肾癌、子宫内膜癌和卵巢癌之间的相关关系(20)。

尽管缺乏饮食AA在引起癌症中的作用的科学共识，但是世界政府和监管机构已经将饮食AA的风险评估和减少作为重要的优先事项。事实上，欧洲食品安全局(EuropeanFood Safety Authority，EFSA)、WHO、美国食品和药品管理局(Food and DrugAdministration，FDA)、加利福尼亚环境健康危害评估办公室(California Office ofEnvironmental Health Hazard Assessment，OEHHA)和加拿大卫生部(Health Canada)全部都认为食品中AA的存在是一个主要问题并且建议将食品和饮料中AA的水平降低至可合理实现的低(As Low As Reasonably Achievable，ALARA)。此外，EFSA(丙烯酰胺工具箱—http://www.fooddrinkeurope.eu/publications/category/toolkits/)和美国FDA(http://www.fda.gov/Food/FoodborneIllnessContaminants/ChemicalContamin ants/ucm2006782.htm)发布了减少食品和饮料中AA的工业重点指南文件。

用于AA减少的目前可用方法基于两个基本原理：1)通过食品加工实践降低AA形成(限制烹制时间和温度)；和2)消除作为AA前体的天冬酰胺。重要的是，仅第二种策略降低食品的AA潜力，因为AA可以在终端使用者烹制实践期间形成。在商业生产和家庭准备的食品中同样地，AA含量随烹制时间和温度而显著提高(21)。因此，基于天冬酰胺去除的AA减少方法被认为是优越的，因为其消除下游AA形成的可能性。

目前多种方法可用于降低食品的AA含量。这些包括酶天冬酰胺酶的制剂(Novozymes,Denmark and PreventASe,DSM,Netherlands)(http://www.acrylaway.com/en/Pages/default.aspx；http://www.dsm.com/markets/foodandbeverages/en_US/products/enzymes/baking/preventase.html)、大范围酵母发酵(22)、在发酵之前向面团施加甘氨酸(23,24)、在煎炸之前将马铃薯浸入氯化钙中(25)、用蔗糖替代还原糖(26)、加工条件(例如温度、pH和含水量)的一般性优化(25,27,28)、关于不同原料选择的研究(27)和乳酸菌发酵(Zerabac和Zeracid,Zeracryl,Norway；http://www.zeracryl.com/)。此外，最近描述了低天冬酰胺马铃薯品种(29-31)，然而这是通过重组DNA技术产生的并且因此被认为是一种经遗传修饰生物(genetically modifiedorganism，GMO)(http://www.simplotplantsciences.com/)。所有这些列举的方法在某种程度上都是不够的，或者具有固有的问题使得其在食品产品制造期间是不切实际的，包括成本、对食品的感官特性的影响和/或在工业规模食品加工条件下的不能有效的减少丙烯酰胺。

面包酵母(Baker’s yeast)(酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))天然地能够消耗/降解AA前体，天冬酰胺和还原糖。然而，在食品加工常见的大多数条件下，降解天冬酰胺所需的细胞机器被关闭。因此，除非在非常特定的条件和时间下使用，否则常规酵母菌株在减少AA方面是无效的。为了规避这个问题，本发明人之前开发了一种新的基于经遗传修饰(GMO)面包酵母的技术来降低食品中的丙烯酰胺水平(US 2012/0321744A1)。该技术由用于降解天冬酰胺和由此丙烯酰胺的通过重组DNA技术改造的特定酿酒酵母(S.cerevisiae)菌株组成。尽管美国专利公开号2012/0321744A1中所述的酵母菌株在减少多种食品中的丙烯酰胺方面是有效的，但是其开发中重组DNA技术的使用将该菌株分类为自克隆的经遗传修饰生物(GMO)。这一指定固有地限制了其在其中GMO产品被认为不利地和/或违背法律的工业和国家中的应用。

在酿酒酵母中，负责天冬酰胺降解的基因是分别编码细胞内天冬酰胺酶I和细胞外细胞壁相关天冬酰胺酶II的ASP1和ASP3(32-34)。ASP1作为单拷贝基因存在(35)，而ASP3作为四重串联重复基因座存在(36)。令人感兴趣的是，ASP3基因座不是酿酒酵母天然的，而是通过进化从非酵母属酵母物种(Wickerhamomyces)通过水平基因转移获得的(34)。

众所周知，ASP1是组成型表达的，但是主要负责天冬酰胺的细胞内利用，而不负责天冬酰胺的氮的细胞外清除(32,33)。因此，单独ASP1活性不足以使酵母降解显著量的天冬酰胺以用于减少食品中AA的目的。为了降解细胞外天冬酰胺，酵母必须表达天冬酰胺酶II，然而ASP3经受选择性控制酵母中氮利用的机制，通常称为氮分解代谢物阻遏(nitrogencatabolite repression，NCR)(37-41)。一般来说，NCR是指由传感系统和转录调控回路组成的分子机制，其允许降解氮源所需的渗透酶和分解代谢酶的差异基因表达。更特别地，在生长于多种氮源上的培养物中，基于其相对生物化学利用层次，NCR允许酵母依次分解代谢不同的氮源(32,42)。在ASP3的情况下，已知类似于其他NCR调节的基因，该酶可在贫氮或氮缺乏条件下生长期间被诱导-无论氮源类型如何-只要细胞内氨基酸库被消耗至亚阈值水平即可(36,37,39,40)。

随机诱变和适应性进化是指生物体对新生长条件和/或环境的连续或迭代适应。为了实现这一点，在生物体中引入随机突变，然后对大变体库进行表征，并选择具有期望性状的个体。以此方式，人工选择被用于鉴定通过诱变加速的期望遗传变异性(43)。该技术通常在微生物学中使用以赋予或增强工业相关微生物的期望性状，并且更特别地在食品工业中具有悠久的应用史(43-56)。重要的是，适应性进化不涉及使用重组DNA技术；因此，通过适应性进化产生的生物是非GMO(http://ec.europa.eu/food/plant/gmo/new/index_en.htm)，并且因此不经受约束性GMO食品立法和消费者接受问题。

由于适应性进化的性质，其总是选择完成任务的最佳方式(52)。在大群体中和在众多代中，随机突变允许进化“尝试”每个可能的问题解决方案。只有提高适合度或至少没有明显不利的那些解决方案才将留存到下一代(52)。当考虑到当在生态位环境之外时对小生境的适应一般以适合度为代价得到时，这一概念变得尤为重要(52)。因此，适应性进化允许生物体达到与环境的适合度平衡。这种平衡是由目的适应的致因突变，以及尽可能抵消整体适合度损失的补偿性突变构成。以此方式，适应性进化机制往往可优于例如重组DNA工程的靶向特异性方法。

类似于其他微生物，面包酵母非常适合随机诱变和适应性进化。事实上，该技术已被广泛用于调节与工业过程(例如酿酒和生物乙醇生产)相关的性状(56)。适应性进化也被用于研究针对氮限制环境的适应性响应(57,58)，并且更特别地调节酵母使用氮的能力(NCR的去调节)以用于处理废水(59)。另外，为了研究NCR介导的ASP3调节的机制，已使用随机诱变和单轮选择来分离ASP3去阻遏的实验室酵母突变体(60)。

发明内容

本发明人已经证明，通过使用迭代适应性进化的特定方法，可以分离在非诱导条件下具有减少天冬酰胺的活性的新型酵母菌株。

因此，本公开内容提供了分离在非诱导条件下降解L-天冬酰胺的酵母菌株的方法，其包括：

a)在存在包含D-天冬酰胺作为唯一氮源的培养基下对表达或能够表达细胞壁相关天冬酰胺酶的野生型酵母菌株进行传代培养，

b)连续传代培养，追踪生长速率并每周进行诱变；

c)当所述生长速率达到基线时，选择b)的培养物；

d)在包含甲胺的选择性培养基中连续对选择的细胞进行传代培养，追踪生长速率，并每周诱变，直至在甲胺存在下的生长速率达到在不具有甲胺的选择性培养基中的生长速率；

e)通过在包含甲胺的选择性培养基上平板接种来分离d)的个体菌落，培养所述菌落，并选择大且生长快速的菌落；

f)测定e)中所选菌落在非诱导条件下降解L-天冬酰胺的能力，并选择至少一个与d)开始时的细胞相比具有高L-天冬酰胺降解活性的菌落；

g)用f)中所选细胞重复步骤d)至f)，每次提高甲胺浓度直至L-天冬酰胺降解活性达到稳定水平；

h)从g)中分离其中L-天冬酰胺降解活性已达到稳定水平的菌株。

在一个实施方案中，细胞壁相关天冬酰胺酶由ASP3基因座编码。

在一个实施方案中，野生型酵母菌株是工业酵母菌株。在一个实施方案中，酵母菌株是工业面包酵母菌株。

酵母菌株可以包括但不限于来自真菌界的属和物种。在一个实施方案中，属和物种可以选自食品生产中使用的那些。在另一个实施方案中，所述物种是但不限于Aspergillus acidus、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、酱油曲霉(Aspergillus sojae)、埃切假丝酵母(Candida etchellsii)、梅林假丝酵母(Candidamilleri)、橄榄假丝酵母菌(Candida oleophila)、褶皱假丝酵母(Candida rugosa)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、皱状假丝酵母(Candida versatilis)、Candidazemplinina、涎沫假丝酵母(Candida zeylanoides)、杰丁嗜杀酵母(Cyberlindnerajadinii)、拟威尔嗜杀酵母(Cyberlindnera mrakii)、Cystofilobasidiuminfirmominiatum、汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)、布鲁塞尔德克酵母(Dekkera bruxellensis)、Fusarium domesticum、镰孢霉(Fusarium venenatum)、白地霉(Galactomyces candidum)、念珠地丝菌(Geotrichum candidum)、普鲁兰久浩酵母(Guehomyces pullulans)、季也蒙有孢汉逊酵母(Hanseniaspora guilliermondii)、嗜高压有孢汉逊酵母(Hanseniaspora osmophila)、葡萄有孢汉逊酵母(Hanseniasporauvarum)、Kazachstania exigua、单孢酿酒酵母(Kazachstania unispora)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、马克思克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、Lachanceafermentati、耐热克鲁维酵母(Lachancea thermotolerans)、蜡蚧轮枝菌(Lecanicilliumlecanii)、美极梅奇酵母(Metschnikowia pulcherrima)、冻土毛霉(Mucor hiemalis)、霉白霉菌(Mucor mucedo)、密丛毛霉(Mucor plumbeus)、总状毛霉(Mucor racemosus)、好食链孢霉(Neurospora sitophila)、沙门柏干酪青霉(Penicillium camemberti)、Penicillium caseifulvum、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)、普通青霉(Penicillium commune)、纳地青霉(Penicillium nalgiovense)、娄地青霉(Penicilliumroqueforti)、离生青霉(Penicillium solitum)、发酵毕赤酵母(Pichia fermentans)、克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyveri)、库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)、膜醭毕赤酵母(Pichia membranifaciens)、西方毕赤酵母(Pichia occidentalis)、皮杰普氏毕赤酵母(Pichia pijperi)、小孢根霉(Rhizopus microspores)、少孢根霉(Rhizopusoligosporus)、米根霉(Rhizopus oryzae)、匍茎根霉(Rhizopus stolonifer)、贝酵母(Saccharomyces bayanus)、酿酒酵母、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、Schwanniomyces vanrijiae、黄帚霉(Scopulariopsis flava)、球拟假丝酵母(Starmerella bombicola)、戴尔凯氏有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)、白球拟酵母(Torulopsis candida)、霍尔姆球拟酵母(Torulopsis holmii)、Trigonopsiscantarellii、异威克汉逊酵母(Wickerhamomyces anomalus)、解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)、鲁氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)、佛罗伦接合有孢圆酵母(Zygotorulaspora florentina)。存在酵母菌株的多种商业来源，例如Lallemand Inc.(加拿大)、AB Mauri(澳大利亚)和Lesaffre(法国)。

在一个实施方案中，诱变是物理诱变，例如UV诱变。在另一个实施方案中，诱变是化学诱变。

在一个实施方案中，a)至c)在2至4周内发生。在一个实施方案中，d)至g)在6至48周内发生。

在一个实施例方案中，g)中重复的次数为5至20。

在另一个实施方案中，在e)中在选择大且生长快速的菌落之前将菌落培养2至10天。

在一个实施方案中，在g)中，逐渐增加甲胺的量，例如每次重复增加25％至50％。在一个实施方案中，e)中甲胺的量是足以比相对于没有甲胺的选择性培养基中的生长速率使生长速率抑制25％至75％的量。在另一个实施方案中，在L-天冬酰胺降解活性达到稳定水平之前，甲胺可以从0.05g/L增加至12g/L。

本文还提供了通过本文公开的方法产生的酵母。甚至进一步提供了在非诱导条件下表达细胞壁天冬酰胺酶并且具有减少天冬酰胺的活性的分离的未经遗传修饰酵母。在一个实施方案中，当在非诱导条件下生长时，分离的未经遗传修饰酵母使天冬酰胺减少至少20％、至少30％、至少40％、至少50％或更多。在一个实施方案中，细胞壁天冬酰胺酶是组成型表达的。在一个实施方案中，细胞壁天冬酰胺酶由ASP3基因座编码。在一个实施方案中，酵母菌株是工业酵母菌株。在一个实施方案中，酵母菌株是工业面包酵母菌株。

还提供了以保藏号140515-01(“RBAR-01”)、140515-02(“RBAR-02”)和/或140515-03(“RBAR-03”)保藏于加拿大国际保藏中心(International Depositary Authority ofCanada，IDAC)的分离的酵母菌株。

本发明人还表明，本文公开的酵母菌株特别地可用于减少天冬酰胺，这因此降低食品制备和加工期间的丙烯酰胺形成。因此，本文还提供了用于在食品制备或加工期间减少天冬酰胺并由此降低丙烯酰胺形成的方法，其包括在食品制备或加工条件下向食品中添加本文公开的酵母菌株；其中所述酵母在食品制备或加工期间减少天冬酰胺并由此降低丙烯酰胺形成。

在一个实施方案中，酵母菌株是无活性的。在另一个实施方案中，酵母是新鲜的。在另一个实施方案中，酵母是活性干酵母。

食品产品可以是通常包含天冬酰胺的任何食品产品，并且不受限地包括基于植物的食品产品、饮料、烘焙产品、谷物产品、水果、豆类、乳品或肉类产品。在一个实施方案中，食品产品是烘焙产品，例如面包、饼干或椒盐脆饼。在一个实施方案中，食品产品是马铃薯或马铃薯基产品。在另一个实施方案中，食品产品是咖啡。

在一个实施方案中，食品产品是马铃薯或马铃薯基产品，并且在食品制备或加工条件下向食品中添加酵母包括在烹制之前将马铃薯或马铃薯基产品预浸泡在水和酵母菌株的混合物中。

在另一个实施方案中，食品产品是基于马铃薯的零食食品产品，并且在食品制备或加工条件下向食品中添加酵母包括在形成、挤出或其他方式产生待通过烘焙、煎炸或烘烤烹制的压缩产品之前向马铃薯基面团样体系添加酵母。

在另一个实施方案中，食品产品是咖啡，并且向食品制备或加工条件中添加酵母菌株包括：在烘烤之前，将新鲜的绿咖啡豆浸泡在已经用酵母菌株预处理以减少天冬酰胺的绿咖啡豆提取物中使得经预处理的提取物从咖啡豆中消耗天冬酰胺。

在另一个实施方案中，食品产品是咖啡，并且向食品制备或加工条件中添加酵母菌株包括在焙烤之前用酵母菌株发酵经研磨的绿咖啡豆。

本文还提供了使用本文公开的酵母菌株或本文公开的方法产生的天冬酰胺减少的食品产品。

根据以下详细描述，本公开内容的其他特征和优点将变得显而易见。然而，应理解，详细描述和具体实例尽管指示本公开内容的一些实施方案但是仅通过举例说明的方式给出，因为根据该详细描述在本公开内容的精神和范围内的各种改变方案和修改方案对于本领域技术人员将变得显而易见。

附图说明

现在将结合附图对本公开内容进行描述，在附图中：

图1是用于产生本文公开的AR(减少丙烯酰胺)酵母菌株的适应性进化策略的示意图。

图2显示AR酵母菌株甚至在富培养基中生长时也降解L-天冬酰胺。将野生型菌株、AR菌株(RBAR-01、RBAR-02和RBAR-03)和经改造以过表达ASP3的GMO对照菌株在YEG中培养过夜(在30℃下18小时)，之后将2x 10⁷个细胞接种到补充有0.6g/L L-天冬酰胺的5mL新鲜YEG中。将细胞在YEG+L-天冬酰胺中孵育不同的时间点，之后在80℃下热灭活。通过比色酶促测定试剂盒测量每个样品中的残余L-天冬酰胺浓度。数据代表重复实验。

图3显示需要迭代适应性进化来产生AR酵母菌株。将野生型菌株以及AR菌株(RBAR-01、RBAR-02和RBAR-03)平板接种在非选择性培养基(YEG+D-天冬酰胺)、Kamerud和Roon使用的适度选择性培养基(YEG+D-天冬酰胺+3.1g/L甲胺)和本研究中使用的高度选择性培养基(YEG+D-天冬酰胺+12g/L甲胺)上。将每种菌株的相等数目的细胞以10倍系列稀释液点样。将平板在30℃下孵育4天。数据代表一式三份实验。

图4显示，AR酵母菌株由其野生型亲本进化衍生而来。使用Inter-delta PCR指纹图谱绘制来比较AR酵母菌株与其野生型亲本菌株的遗传。如先前所述(61)，从每种菌株的过夜培养物中提取基因组DNA，并用作inter-delta PCR的模板。通过琼脂糖凝胶电泳使扩增子可视化。数据代表重复实验。

图5显示AR酵母菌株组成型降解L-天冬酰胺并且组成型表达细胞壁相关天冬酰胺酶II(ASP3)。在YEG中生长期间每六小时对AR酵母菌株(RBAR-01、RBAR-02和RBAR-03)以及其野生型亲本进行采样。数据代表重复实验。A)通过OD₆₀₀测量追踪每种菌株的生长速率。B)通过标准化L-天冬酰胺降解测定(1小时测定孵育时间)测量每种菌株的L-天冬酰胺降解活性。C)通过由分离的总RNA逆转录的cDNA的qPCR以技术性一式三份测量每种菌株中ASP3的相对表达。使用ΔΔCt方法计算ASP3倍数变化值，并针对ACT1和野生型ASP3进行归一化。D)通过由分离的总RNA逆转录的cDNA的qPCR以技术性一式三份测量每种菌株中ASP1的相对表达。使用ΔΔCt方法计算ASP1倍数变化值，并针对ACT1和野生型ASP1进行归一化。

图6显示，L-天冬酰胺降解的动力学在AR酵母菌株之间不同。将野生型菌株以及AR菌株(RBAR-01、RBAR-02和RBAR-03)在YEG中培养过夜(在30℃下18小时)，之后将2x 10⁷个细胞接种到补充有0.6g/L L-天冬酰胺的5mL新鲜YEG中。将细胞在YEG+L-天冬酰胺中孵育不同的时间点，之后在80℃下热灭活。通过比色酶测定试剂盒测量每个样品中的残余L-天冬酰胺浓度。数据代表重复实验。

图7显示，最少数目的基因在AR酵母菌株中全局差异表达。在从YEG中指数生长期间野生型和AR酵母菌株(RBAR-01、RBAR-02和RBAR-03)收获总RNA。在Illumina HiSeq2500高输出模式平台上以2x100bp末端配对配置对由总RNA制备的RNA测序文库(TruSeq v3)进行测序。根据质量过滤原始读序，并映射到S288C参考基因组。对于6,604个酵母ORF(经验证的、未经表征的和可疑的)中的每一个示出Log₂倍数变化值(相对于野生型)。虚线在+1.5、0和-1.5绘出用于参考。每行内的追踪线是每种基因的实际倍数变化值。使用分层聚类来分组基因簇和菌株二者。

图8显示，许多差异表达基因对于每种AR酵母菌株是共同的。从在YEG中指数生长期间的野生型和AR酵母菌株(RBAR-01、RBAR-02和RBAR-03)收获总RNA。在IlluminaHiSeq2500高输出模式平台上以2x100bp末端配对配置对由总RNA制备的RNA测序文库(TruSeq v3)进行测序。根据质量过滤原始读序，并映射到S288C参考基因组。对于差异表达基因(≥|1.5|log2倍数变化&野生型酵母中≥100计数)中的每一种示出Log₂倍数变化值(相对于野生型)。虚线在+1.5、0和-1.5绘出用于参考。每行内的追踪线是每种基因的实际倍数变化值。使用分层聚类来分组基因簇和菌株二者。B)每种AR酵母菌株中差异表达基因之间的重叠的维恩图。

图9显示，很多NCR基因和氨基酸转运蛋白在每种AR酵母菌株中差异表达。从在YEG中指数生长期间的野生型和AR酵母菌株(RBAR-01、RBAR-02和RBAR-03)收获总RNA。在Illumina HiSeq2500高输出模式平台上以2x100bp末端配对配置对由总RNA制备的RNA测序文库(TruSeq v3)进行测序。根据质量过滤原始读序，并映射到S288C参考基因组。A)对于每种注释的NCR基因(71)示出了Log2倍数变化值(相对于野生型)。B)对于每种注释的氨基酸转运蛋白基因(71)示出了Log₂倍数变化值(相对于野生型)。A和B)虚线在+1.5、0和-1.5绘出用于参考。每行内的追踪线是每种基因的实际倍数变化值。使用分层聚类来分组基因簇和菌株二者。

图10显示，在AR酵母菌株中鉴定的大多数突变对于所有是共同的。从野生型和AR酵母菌株(RBAR-01、RBAR-02和RBAR-03))收获基因组DNA。在Illumina HiSeq平台上以2x300bp末端配对配置对由基因组DNA制备的DNA测序文库(Nextera XT)进行测序。根据质量过滤原始读序，并映射到S288C参考基因组。读序堆积用于调用相对于S288C共有序列在每个核苷酸的变体。将AR酵母菌株中的变体针对野生型变体进行过滤以去除多余的突变。每种AR酵母菌株中过滤突变之间的重叠的维恩图。

图11显示AR酵母菌株减少面包和吐司中的丙烯酰胺。用野生型酵母或AR菌株RBAR-01/RBAR-02和RBAR-03制作白面包和全麦面包(添加0或7％蔗糖)。如在材料和方法中限定的，在未经烘烤的面包，以及在低、中和高的烘烤水平下分析AA水平。A)具有0％蔗糖的白面包。B)具有7％蔗糖的白面包。C)具有0％蔗糖的全麦面包。D)具有7％蔗糖的全麦面包。数据代表重复实验。

图12显示，AR酵母菌株减少法式薯条中的丙烯酰胺。来自新鲜Russet马铃薯的法式薯条通过将经切割的未烹制马铃薯浸泡在不具有酵母、具有野生型酵母或具有AR菌株RBAR-01、RBAR-02和RBAR-03的水中来制备。在最终的煎炸产品中分析AA水平。数据代表重复实验。

图13显示，AR酵母菌株RBAR-03在短孵育时间和高温下以剂量依赖性方式减少法式薯条中的丙烯酰胺。将切好的马铃薯如方法部分中所述进行预处理，然后在单独水中或者在具有100g/L、200g/L、250g/L或300g/L AR酵母膏状菌株(23％固体)的水中在68℃下孵育50秒。在煎炸后，通过UPLC/MS测量法式薯条中的丙烯酰胺水平。数据代表一式三份实验。

图14显示，AR酵母菌株在基于马铃薯的煎炸零食中减少丙烯酰胺。在不具有酵母、具有野生型酵母或具有AR菌株RBAR-01、RBAR-02和RBAR-03下制作挤出的煎炸马铃薯基零食产品。在产生过程期间的不同点分析天冬酰胺水平(A)，并在最终的煎炸产品中分析AA水平(B)。数据代表重复实验。

图15显示，AR酵母菌株减少甜味饼干中的丙烯酰胺。在不具有酵母、具有野生型酵母、或具有AR菌株RBAR-01、RBAR-02和RBAR-03下制作甜味饼干。在最终产品中分析AA水平。数据代表重复实验。

图16显示，AR酵母菌株在椒盐脆饼中减少丙烯酰胺。用野生型酵母或AR菌株RBAR-01、RBAR-02和RBAR-03制作椒盐脆饼。在最终产品中分析AA水平。数据代表重复实验。

图17显示：通过直接对绿咖啡豆进行发酵，AR酵母菌株减少咖啡中的丙烯酰胺。将经研磨的绿咖啡豆在单独水、野生型酵母或AR菌株RBAR-03中孵育。在孵育后，将经研磨豆干燥并烘烤，在此之后分析AA水平。

图18显示，AR酵母菌株减少绿咖啡提取物中的天冬酰胺。将绿咖啡提取物(18％可溶性固体)与不同浓度的AR酵母一起孵育。在孵育后，通过离心使提取物澄清并分析L-天冬酰胺水平。数据代表重复实验。

具体实施方式

本发明人已经证明，与选择压力组合的迭代随机诱变过程提供了对非诱导条件下具有减少天冬酰胺的活性的工业酵母菌株的开发。

因此，本公开内容提供了分离在非诱导条件下降解L-天冬酰胺的酵母菌株的方法，其包括：

a)在存在包含D-天冬酰胺作为唯一氮源的培养基下对表达或能够表达细胞壁相关天冬酰胺酶的野生型酵母菌株进行传代培养；

b)连续传代培养，追踪生长速率并每周进行诱变；

c)当生长速率达到基线时，选择b)的培养物；

d)在包含甲胺的选择性培养基中连续传代培养选择的细胞进行，追踪生长速率，并每周诱变，直至在甲胺存在下的生长速率达到在不具有甲胺的选择性培养基中的生长速率；

e)通过在包含甲胺的选择性培养基上平板接种来分离d)的个体菌落，培养所述菌落，并选择大且生长快速的菌落；

f)测定e)中所选菌落在非诱导条件下降解L-天冬酰胺的能力，并选择至少一个与d)开始时的细胞相比具有高L-天冬酰胺降解活性的菌落；

g)用来自f)的所选细胞重复步骤d)至f)，每次提高甲胺浓度直至L-天冬酰胺降解活性达到稳定水平；

h)从g)中分离其中L-天冬酰胺降解活性已达到稳定水平的菌株。

在一个实施方案中，细胞壁天冬酰胺酶由ASP3基因座(GenBank登录号NM_001182042.1)编码。

在一个实施方案中，野生型酵母菌株是工业酵母菌株。在一个实施方案中，酵母菌株是面包酵母(酿酒酵母)。

本文使用的术语“工业酵母”是指用于工业过程的菌株，与通常用于实验室研究的实验室酵母形成对比。通常，工业酵母往往主要是二倍体，其中一些是三倍体、四倍体或非整倍体。类似地，实验室酵母往往是单倍体。

酵母菌株可以包括但不限于来自真菌界的属和物种。在一个实施方案中，属和物种选自食品生产中使用的那些。在另一个实施方案中，所述物种是但不限于Aspergillusacidus、黑曲霉、米曲霉、酱油曲霉、埃切假丝酵母、梅林假丝酵母、橄榄假丝酵母菌、褶皱假丝酵母、热带假丝酵母、皱状假丝酵母、Candida zemplinina、涎沫假丝酵母、杰丁嗜杀酵母、拟威尔嗜杀酵母、Cystofilobasidium infirmominiatum、汉逊德巴利酵母、布鲁塞尔德克酵母、Fusarium domesticum、镰孢霉(Fusarium venenatum)、白地霉、念珠地丝菌、普鲁兰久浩酵母、季也蒙有孢汉逊酵母、嗜高压有孢汉逊酵母、葡萄有孢汉逊酵母、Kazachstania exigua、单孢酿酒酵母、乳酸克鲁维酵母、马克思克鲁维酵母、Lachanceafermentati、耐热克鲁维酵母、蜡蚧轮枝菌、美极梅奇酵母、冻土毛霉、霉白霉菌、密丛毛霉、总状毛霉、好食链孢霉、沙门柏干酪青霉、Penicillium caseifulvum、产黄青霉、普通青霉、纳地青霉、娄地青霉、离生青霉、发酵毕赤酵母、克鲁维毕赤酵母、库德里阿兹威毕赤酵母、膜醭毕赤酵母、西方毕赤酵母、皮杰普氏毕赤酵母、小孢根霉、少孢根霉、米根霉、匍茎根霉、贝酵母、酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、Schwanniomyces vanrijiae、黄帚霉、球拟假丝酵母、戴尔凯氏有孢圆酵母、白球拟酵母、霍尔姆球拟酵母、Trigonopsis cantarellii、异威克汉逊酵母、解脂耶氏酵母、鲁氏接合酵母、佛罗伦接合有孢圆酵母。存在酵母菌株的多种商业来源，例如Lallemand Inc.(加拿大)、AB Mauri(澳大利亚)和Lesaffre(法国)。

在一个实施方案中，诱变通过物理诱变发生，包括但不限于UV和基于辐射的诱变形式，例如X射线和γ射线诱变。在一个实施方案中，物理诱变是UV诱变。本领域技术人员将容易获知用于UV诱变的条件。对于UV诱变，可以使细胞暴露于UV光源(标准恒定强度)不同的时间量。剂量可以基于杀伤率-平均地，在每次处理期间，可以使培养物暴露于足够的UV光以杀伤25％至90％的细胞。

在另一个实施方案中，诱变通过化学诱变(例如EMS-甲磺酸乙酯)发生。

本领域技术人员将知晓，诱变用于提高突变率，并因此提高在合适选择性条件下发现目的突变的可能性。

本文使用的术语“非诱导条件”是指在野生型酵母中正常阻遏细胞外L-天冬酰胺降解的任何培养条件。相比之下，“选择性条件”是指其中D-天冬酰胺是唯一氮源并且为了提高选择压力，可能存在生长抑制剂如甲胺的培养条件。

本领域技术人员将容易获知培养酵母细胞的条件。例如，对于(a)，可以在30℃下在液体选择性培养基中培养酵母细胞，所述液体选择性培养基例如补充有碳源(例如2％(w/v)蔗糖)和D-天冬酰胺(例如，10g/L，但是基于菌株，浓度可以为0.5g/L至15g/L而不等)的由不具有氨基酸或硫酸铵的酵母氮基质(YNB-AA/AS)构成的培养基。可以将过夜培养物每日以一致的浓度在新鲜培养基中传代培养，例如至0.01的光密度(OD₆₀₀)。

对于(d)甲胺选择，可以将细胞在30℃下在液体选择性培养基中进行培养，所述液体选择性培养基例如补充有碳源(例如2％(w/v)蔗糖)和D-天冬酰胺(例如，10g/L，但是基于菌株，浓度可以为0.5g/L至15g/L而不等)并且进一步补充有不同量甲胺的、由不具有氨基酸或硫酸铵的酵母氮基质(YNB-AA/AS)构成的培养基。

对于(e)分离用甲胺选择的个体菌落，可以将细胞平板接种在固体选择性培养基上并在30℃下进行培养，所述固体选择性培养基例如补充有碳源(例如2％(w/v)蔗糖)、D-天冬酰胺(例如，10g/L，但是基于菌株，浓度可以为0.5g/L至15g/L而不等)和使培养基固化的足够琼脂并且进一步补充有不同量甲胺的、由不具有氨基酸或硫酸铵的酵母氮基质(YNB-AA/AS)构成的培养基。

对于酵母的一般性维持，可以将细胞在30℃下在固体非选择性培养基(例如YEG琼脂培养基(2％酵母提取物+1％葡萄糖+2％琼脂))上进行培养。

确定生长速率的方法是本领域已知的，并且这些测量的实例描述在本文中的实施例中。在一个实施方案中，通过测量光密度来确定生长速率。光密度是最快速且最广泛使用的方法，并且依赖于水性悬浮液中的酵母散射光的事实。散射的光的量与每单位体积的细胞数(即细胞浓度)成比例。在一个替代实施方案中，通过计数细胞的数目来确定生长速率。可以使用显微镜和血细胞计数器来精确计数一定培养物体积中细胞的数目。在另一个实施方案中，在固体培养基上的生长速率可以通过目视比较以等同方式(即相同时间、温度和培养基)培养的细胞之间的菌落大小来确定。例如，较大的菌落将比较小的菌落生长更快。

本文使用的短语“大且生长快速的菌落”是指具有最快可视外观和相对于平板上菌落的大致平均尺寸的最大菌落尺寸的那些菌落。这样的鉴定在性质上可以是定性的，并且本领域技术人员将能够容易地确定那些符合这些标准的菌落。

本文关于生长速率使用的术语“基线”是指菌株在非诱导性和非选择性培养基(包含良好氮源的培养基，即富营养物培养基，即不是单独的D-天冬酰胺和/或包含甲胺)上的生长速率。

在一个实施方案中，在g)中，逐渐增加甲胺的量，例如每次重复增加25％至50％，使得初始增加较小并且随后增加较大。在一个实施方案中，e)中甲胺的量是足以相对于没有甲胺的选择性培养基中的生长速率使生长速率抑制25％至75％的量。在另一个实施方案中，在L-天冬酰胺降解活性达到稳定水平之前，可以将甲胺从0.05g/L增加至12g/L。

传代培养的时间框架和进化迭代的总次数变化并且取决于多个变量，包括野生型菌株的遗传复杂性、所使用的诱变类型(即化学、UV、X射线)、诱变剂量和选择强度。在一个实施方案中，a)至c)的时间段为2至4周。在一个实施方案中，d)至g)的时间段为6至48周。在一个实施方案中，g)中重复的次数为5至20。

如例如实施例部分中所述，可以测定菌落在非诱导条件下降解L-天冬酰胺的能力。

本文还提供了通过本文公开的方法产生的酵母。甚至还提供了在非诱导条件下表达细胞壁天冬酰胺酶并且具有减少天冬酰胺的活性的分离的未经遗传修饰酵母。在一个实施方案中，当在非诱导条件下生长时，分离的未经遗传修饰的酵母使天冬酰胺减少至少20％、至少30％、至少40％、至少50％或更多。本领域技术人员可以容易地使用实施例中公开的方法来测试酵母菌株减少天冬酰胺的能力。在一个实施方案中，细胞壁天冬酰胺酶由ASP3基因座编码。

在一个实施方案中，分离的未经遗传修饰酵母组成型表达细胞壁天冬酰胺酶。本文使用的组成型表达是指在整个微生物生长期间的持续基因表达，而不是取决于生长条件的选择性表达。在一个实施方案中，酵母菌株是工业酵母菌株。在一个实施方案中，酵母菌株是工业面包酵母菌株。

还提供了分离的酵母菌株，其以保藏号140515-01(在本文称为“RBAR-01”)、140515-02(在本文称为“RBAR-02”)和/或140515-03(在本文称为“RBAR-03”)于2015年5月14日保藏于位于加拿大马尼托巴省温尼伯市阿灵顿大街1015号，R3E 3R2的加拿大公共卫生署，国家微生物实验室的加拿大国际保藏中心(IDAC)。这些菌株的保藏和存活证明见于附录A。

本发明人还表明，这些进化酵母菌株特别地可用于在食品制备和加工期间减少天冬酰胺且进而减少丙烯酰胺，并且因此本文公开的酵母菌株被称为减少丙烯酰胺的酵母(Acrylamide reducing yeast)或AR酵母。术语“减少丙烯酰胺的酵母”和“减少天冬酰胺的酵母”在本文中可互换使用。因此，本文还提供了用于在食品制备或加工期间减少天冬酰胺并且进而减少丙烯酰胺的方法，其包括在食品制备或加工条件下向食物中添加本文公开的酵母菌株；其中该酵母在食品制备或加工期间减少天冬酰胺并且由此降低丙烯酰胺形成。

在一个实施方案中，酵母菌株是无活性的。本文使用的术语“无活性的”是指仍然保留其营养成分和其他特性的无活性的、不存活的和/或死的酵母生物体的组合物。例如，可以在允许过表达一种或更多种期望蛋白质的条件下培养酵母。然后，可以使用酵母来产生无活性的酵母，例如通过多种巴氏杀菌方法，包括但不限于高温和短时巴氏杀菌；多种灭菌方法，包括但不限于湿热和辐射；多种灭活方法，包括但不限于高压、光催化和脉冲光、光敏化，电场包括RF和脉冲细胞破碎、超声处理，均化、自溶和基于化学品的灭活，包括但不限于甲醛、硫柳汞、氯胺、二氧化氯、碘、银、铜、抗生素和臭氧。

在另一个实施方案中，酵母菌株是新鲜的。在另一个实施方案中，酵母菌株是活性干酵母。新鲜酵母是指已经在非选择性酵母培养基(例如如上限定)中培养并离心以去除大部分液体的酵母。新鲜酵母具有活性和代谢活性。新鲜酵母不可稳定贮存，并且在冷藏下通常仅维持1至5周。典型的新鲜酵母为约25％固体。活性干酵母(active dry yeast，ADY)是其中将酵母干燥至最终含湿量为3％(97％固体)的经加工产品。该产品中的酵母细胞是活的但是在代谢上在再水化前是惰性的。当真空密封时，ADY通常稳定贮存2至4年。用于制备ADY的标准化操作在基于酵母的工业(例如酿酒、酿造和烘焙)中是公知的。

本文使用的短语“减少天冬酰胺”是指与对照酵母菌株(例如酵母菌株由其进化而来的亲本菌株)相比，在例如食品产品中使天冬酰胺的水平降低或使天冬酰胺降解至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或更多。

天冬酰胺是在食品制备或加工期间产生丙烯酰胺的反应中的限制性前体。因此，在另一个实施方案中，提供了用于减少食品产品中的丙烯酰胺的方法，其包括在制备或加工条件下向食品中添加本文所述的酵母菌株；其中该酵母减少食品产品中的天冬酰胺，从而减少丙烯酰胺。本文还提供了本文公开的酵母菌株用于在食品制备或加工条件下降低丙烯酰胺浓度的用途。

本文使用的短语“减少丙烯酰胺”是指与不存在酵母菌株下相比，使食品产品中丙烯酰胺的水平降低至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或更多。

在一个实施方案中，食品制备或加工条件包括发酵。例如，本文的方法和用途可用于在面包制作、马铃薯加工、饼干生产、咖啡生产或零食食品制造期间发酵食物产品，包括但不限于碳水化合物。本文使用的术语“发酵”是指糖和其他营养物的酵母消耗。

因此，食品产品可以是通常包含天冬酰胺的任何食品产品，并且不受限地包括基于植物的食品产品、饮料、烘焙产品、谷物产品、水果、豆类、乳品或肉类产品。在一个实施方案中，食品产品是马铃薯或马铃薯基产品。在另一个实施方案中，食品产品是咖啡。

在一个实施方案中，食品产品是马铃薯或马铃薯基产品，并且在食品制备或加工条件下向食品中添加酵母包括在烹制之前将马铃薯或马铃薯基产品预浸泡在水和酵母菌株的混合物中。在一个实施方案中，在烹制之前，将马铃薯在室温下预浸泡并风干。术语“烹制”包括但不限于煎炸、烘烤和烘焙。在一个实施方案中，本文公开的酵母菌株在水/酵母菌株混合物中的浓度为至少1g/L、至少10g/L、至少50g/L、至少100g/L(干细胞重量/体积)或更高。在一个实施方案中，预浸泡的时间为至少0.25分钟、至少0.5分钟、至少1分钟、至少5分钟、至少10分钟、至少20分钟或更久。

在另一个实施方案中，食品产品是基于马铃薯的零食食品产品，并且在食品制备或加工条件下向食品中添加酵母包括在形成、挤出或其他方式产生待通过烘焙、煎炸或烘烤烹制的压缩产品之前向马铃薯基面团样体系添加酵母。

在另一个实施方案中，食品产品是咖啡并且向食品制备或加工条件中添加酵母菌株包括：在烘烤之前，将新鲜绿咖啡豆浸泡在已经用本文所公开酵母菌株预处理以减少天冬酰胺的绿咖啡豆提取物中使得经预处理的提取物从咖啡豆消耗天冬酰胺。在一个实施方案中，在60℃至80℃的温度下、任选地在70℃下对提取物进行预处理。在一个实施方案中，提取物预处理的时间为至少1小时、至少5小时、至少10小时、至少15小时或更久。

在另一个实施方案中，食品产品是咖啡，并且向食品制备或加工条件中添加酵母菌株包括在烘烤之前用酵母菌株发酵经研磨的绿咖啡豆。

本文还提供了使用本文公开的酵母菌株或本文公开的方法产生的天冬酰胺减少并且进而丙烯酰胺减少的食品产品。

食品产品可以是在导致天冬酰胺转化为丙烯酰胺的制备或加工条件下生产的任何食品产品。导致丙烯酰胺形成的典型制备和加工条件包括涉及高烹制温度(大于120℃)的制备，并且包括但不限于煎炸和烘焙、烤制、烘烤、烧烤、炖和烧制。丙烯酰胺通常以高浓度见于马铃薯产品、烘焙产品和任何谷类或谷物产品中。因此，在一个实施方案中，食品产品是植物类，例如马铃薯、芋头或橄榄产品、烘焙产品或者谷类或谷物产品。马铃薯产品包括但不限于法式薯条、马铃薯片、煎炸/烘焙马铃薯零食和成形马铃薯产品。烘焙产品包括但不限于饼干、甜饼、薄脆饼干、面包、非发酵面包产品、糊状产品(battered product)、玉米饼和面饼、糕点、饼皮、蛋糕和松饼混合物、以及糕点面团。例如，面包可以包括但不限于新鲜和冷冻面包和面团、酸面团、披萨面团、圆面包和面包卷以及各种面包，以及相关面包产品，例如煎炸或烘焙零食或面包屑；并且糕点可以包括但不限于甜面包、甜甜圈和蛋糕。谷类或谷物产品包括但不限于典型的早餐用谷类食品、啤酒麦芽和乳清产品、玉米片和椒盐饼干；在高温下加工的其他产品包括但不限于咖啡、烘烤坚果、烘烤芦笋、啤酒、麦芽和乳清饮品、巧克力粉、鱼类产品、肉类和家禽类产品、洋葱汤和蘸酱混合物、坚果奶油、包衣花生、烘烤大豆、烘烤向日葵籽、煎炸或烘焙食品如法拉费和kobbeh，以及巧克力棒。

以上公开内容总体上描述了本申请。通过参照以下具体实施例可以获得更完整的理解。这些实施例仅处于说明的目的而描述，并非旨在限制本公开内容的范围。当情况可能暗示或提供便利时，考虑形式的变化和等同方案的替换。尽管在此使用特定的术语，但是这些术语意在描述性的意思，而不是为了限制的目的。

以下非限制性实施例是对本公开内容进行举例说明：

实施例

材料和方法

酵母菌株和培养基

将酵母菌株维持在YEG琼脂平板上(2％w/v葡萄糖、1％w/v酵母提取物、2％w/v琼脂)。由接种到液体YEG培养基中的个体菌落培养过夜培养物，并在30℃下(250RPM)孵育18小时。

天冬酰胺分解测定

通过血细胞计数器测量过夜培养物的细胞密度。然后，将1x10⁷个细胞接种到补充有0.6g/L L-天冬酰胺的5mL YEG培养基中并在30℃下孵育。在每个实验中描述的时间点，移出500μL培养基，以13,000x g离心1分钟(室温)，并将上清液转移到新管中。通过将上清液在80℃下孵育30分钟来使天冬酰胺酶活性失活。通过酶测定根据制造商的说明(Megazyme,K-ASNAM)来测量上清液中的残余L-天冬酰胺。

intra-delta指纹图谱绘制

如(61)所述进行Intra-delt指纹图谱绘制。简言之，如先前所述使用酚-氯仿方法从过夜培养物中提取基因组DNA(62)。如下组装Taq聚合酶PCR反应：100ng基因组DNA、1μM引物1(delta12:5′-TCAACAATGGAATCCCAAC-3)(SEQ ID NO:1)、1μM引物2(delta21:5′-CATCTTAACACCGTATATGA)(SEQ ID NO:2)、200nM dNTP混合物、2.5mM MgCl₂、1x Taq缓冲液+KCl和1U Taq聚合酶(Thermo Fisher,EP0402)。根据以下方案在BioRad C1000热循环仪上进行扩增：95℃下4:00(初始变性)；95℃下0:30，46℃下0:30，72℃下1:30(35个循环)，72℃下10:00(最后延伸)。在具有标准TBE缓冲液的2％w/v HRB琼脂糖凝胶(Amresco,E776)上以8V/cm运行PCR产物，并用GelGreen核酸染色剂(Biotium)成像。

RNA提取

通过离心(13,000x g,1分钟,RT)分离5个OD₆₀₀单位的细胞，并随后在干冰/甲醇中快速冷冻。如先前所述(63)使用热酸性酚提取总RNA。简言之，用DEPC水洗涤细胞一次，然后在TES缓冲液和酸性酚-氯仿中在65℃下裂解1小时。用以下纯化液相：锁相凝胶管(5Prime)和酸性酚-氯仿，然后是另一锁相凝胶管和氯仿：异戊醇。将RNA在-80℃下乙醇沉淀过夜，用70％乙醇洗涤，并重悬于DEPC水中。

定量PCR(qPCR)

根据制造商的说明使用EZNA总RNA离心柱(Omega Biotek)纯化100μg原始总RNA。然后，量化纯化的RNA并通过RNA筛选带分析(Agilent Technologies)检查其质量。

根据制造商的说明(BioRad,iScript逆转录试剂盒)通过逆转录将800ng的干净总RNA转化为cDNA。以一式三份进行ASP1和ASP3表达的相对量化。如下组装iTaq UniversalSYBR Green qPCR反应：8ng cDNA、500nM正向引物、500nM反向引物和1x iTaq UniversalSYBR Green Supermix(BioRad)。根据以下方案在StepOnePlus定量PCR热循环仪(AppliedBiosystems)上进行扩增：95℃下0:30(起始变性)，95℃下0:15，60℃下1:00(40个循环)，以0.5℃增量65℃至95℃(解链曲线)。通过ΔΔCt方法进行相对量化数据分析，相对于管家基因ACT1归一化。

用于qPCR的引物如下：

ASP3_qPCR_Fwd 5′-GAGCGGATGAACAGGGATATT-3′(SEQ ID NO：3)

ASP3_qPCR_Rev 5′-GGGTCTGTGAGGTTGGAAAT-3′(SEQ ID NO：4)

ASP1_qPCR_Fwd 5′-CAAACTGAGAGTGGACGGTAAG-3′(SEQ ID NO：5)

ASP1_qPCR_Rev 5′-GTTGACTATAGCTGGCGGAAA-3′(SEQ ID NO：6)

ACT1_qPCR_Fwd 5′-CGTCTGGATTGGTGGTTCTATC-3′(SEQ ID NO：7)

ACT1_qPCR_Rev 5′-GGACCACTTTCGTCGTATTCTT-3′(SEQ ID NO：8)

DNA测序

如先前所述(62)，使用酚-氯仿方法从过夜培养物中提取基因组DNA。根据制造商的说明(Illumina)进行Nextera XT文库制备。在Illumina MiSeq平台上以2x300bp末端配对配置(GeneWiz)进行测序。

RNA测序

如上所述提取总RNA，清洗并质量控制。根据制造商的说明(Illumina)进行TruSeqv3文库制备。在Illumina HiSeq2500高输出模式平台上以2x100bp末端配对配置(GeneWiz)进行测序。

面包产生

通过将一环来自YEG平板的培养物接种到75mL液体YEG培养基中来制备用于面包生产的酵母。将培养物培养18小时(30℃)，然后扩大规模到3×450mL YEG培养基中并如前所述培养24小时。通过离心(10分钟,4,000x g,RT)收获酵母培养物。将膏状酵母通过重悬于无菌水中并离心(10分钟,4,000x g,RT)来洗涤两次。

通过在29℃下预发酵45分钟来活化酵母(表1)，在此之后将剩余的成分添加到预发酵酵母中并使用安装有面团钩的立式混合器(KitchenAid)混合21分钟(表2)。将面团在22℃下孵育15分钟(“落地时间”)，并形成为两个相同的面包，然后在35℃下孵育1.5小时(或直至面包的尺寸加倍)。然后，将发酵面包在204℃下烘焙15分钟。

表1|用于面包制作的预发酵混合物

表2|用于面包制作的最终成分混合物

*量作为％面粉(w/w)列出

在烘烤后，将面包块冷却至RT并切成1.4cm片。使用安装有数字温度计(VWRTraceable)的标准厨房烤箱烘烤面包样品。烘烤水平由烤箱温度如下限定：低温-167℃；中温-217℃；高温-235℃。然后，研磨面包和吐司样品(IKA分析用研磨机型号A11BS1)并均化。

法式薯条产生

如前文针对面包所述制备用于法式薯条产生的酵母。

将Russet马铃薯剥皮，漂洗，切碎并在90℃水中漂白10分钟，以使褐变酶失活。将漂白的马铃薯沥干，冷却至RT，并添加至单独的水或AR酵母和水的混合物中(表3)。将马铃薯在RT下在水/酵母混合物中孵育，并在10、20、40和60分钟取样，在此之后将样品立即在80℃下风干10分钟。然后，将经干燥的马铃薯样品在175℃下在玉米油中烹制(表3)。

对于测试AR酵母在短处理时间和高温下的效力，将50g马铃薯在单独100mL水中或者在具有100g/L、200g/L、250g/L或300g/L AR酵母膏状酵母(23％固体)的100mL水中在68℃下孵育50秒。在添加马铃薯之前，将酵母/水混合物平衡至68℃10分钟。在处理后，立即将样品在80℃风干10分钟。然后，将经干燥的马铃薯样品在批量煎炸锅中在175℃下在玉米油中烹制5分钟。以一式三份进行法式薯条和AR酵母处理。相对于0g/L AR酵母对照通过Student T检验确定统计学显著性。

表3|用于马铃薯处理的酵母混合物和烹制参数

零食颗粒产生

如上文针对面包所述制备用于零食颗粒产生的酵母。

根据(表4)将零食碎屑成分添加到安装有平桨附件的立式混合器(KitchenAid)中并混合5分钟。使用直径4mm的模具将碎屑挤出成颗粒(约2cm长)。所得颗粒在60℃下以单层干燥3至3.5小时至目标含湿量为11％。将颗粒在不透气的塑料袋中储存1周，然后在185℃下深度煎炸10秒。

表4|用于零食颗粒产生的最终成分混合物

甜饼干产生

如前文针对面包所述制备用于饼干产生的酵母。

通过使用平桨附件(KitchenAid经典立式混合器)以高速将油、糖浆和糖共混1分钟来处理甜饼干成分(表5)。将发酵剂和/或酵母溶解在成分水中并添加至混合碗中。添加干成分并再混合6分钟。将所得面团静置20分钟。将13g饼干面团压缩到直径为65mm的圆形模具中，并在180℃下烘焙6分钟(目标湿度：2.5％至3.5％)。

表5|用于甜饼干产生的最终成分混合物

椒盐脆饼产生

如前文针对面包所述制备用于椒盐脆饼试验的酵母。

通过首先使用安装有平桨附件的立式混合器(Kitchen Aid经典立式混合器)将干成分(表6)、水和酵母混合1分钟来制备椒盐脆饼。添加酥油并将面团再混合5分钟，然后在35℃下发酵30分钟。将发酵的面团通过9mm模具挤出约40mm长，然后静置10分钟。然后，将颗粒在碱浴(1％NaOH)中在94℃下烹制20秒。然后，将椒盐脆饼在204℃下烘焙25分钟(目标湿度15％)。将烘焙的产品在119℃下干燥25分钟(目标湿度3.5％)。

表6|用于椒盐脆饼产生的最终成分混合物

咖啡产生

如前文针对面包所述制备用于咖啡试验的酵母。

直接咖啡豆发酵

将绿咖啡豆(green coffee bean，GCB)(Brazil Serra Negra)研磨成粉末(IKA分析用研磨机型号A11BS1)。以每40g GCB粉末75mL的比例添加反渗透水。向GCB糊料中添加4g膏状酵母(25％固体)或3g RO水(用于无酵母对照)，并在摇动培养箱(250rpm，30℃)中发酵20小时。将10g发酵糊料在IR湿度计(Ohaus MB45-2A0)中在200℃下烘烤13分钟。

绿咖啡提取物制备和AR酵母处理

通过迭代地将GCB批料浸泡在水中来制备绿咖啡提取物(green coffee extract，GCE)。更具体地，将500g GCB在70℃下在水中浸泡16小时，然后弃掉。然后，将新鲜的GCB在70℃下在水中预浸泡1小时，之后在70℃下在GCE中孵育16小时。重复在GCE中浸泡新鲜GCB的这一过程，直到可溶性固体含量达到18％。

通过在室温下将不同浓度的AR酵母与GCE一起孵育不同时间来用AR酵母处理GCE。在处理后，通过离心澄清经AR酵母处理的GCE并用于天冬酰胺测量。

通过UPLC-QDA的丙烯酰胺量化

在取样之前，将食用量份的固体食品在食品加工机中粉碎。液体和粉状食品产品直接取样。称量1.00g样品到50mL离心管中，添加1mL的200μg/kg ¹³C₃标记丙烯酰胺内部标准品和9mL水。然后，给每个管加盖并用手摇动或短暂涡旋以混合管的内容物。将管夹在旋转摇床中以混合管内容物20分钟。用Eppendorf 5810R离心机以9000rpm将管离心15分钟。通过移液管立即移出澄清水层的5mL等分试样用于旋转过滤。在移出部分水相时，将移液管插入顶部油层，用移液管尖端避免底部固体层。将5mL等分试样置于旋转过滤管中并以9000rpm离心2至4分钟。如果过滤器堵塞，插入新的过滤器管，将未过滤的液体倒入新的过滤器中，并继续离心直到大部分液体已经通过过滤器。用3.5mL甲醇，之后是3.5mL水调节Oasis HLB SPE柱；弃掉甲醇和水部分。向每个柱装载1.5mL过滤的提取物。使提取物通过吸附剂材料，之后通过0.5mL水。然后，用1.5mL水洗脱柱，收集洗脱液用于Accucat SPE净化。在吸附床上方1mL液体的高度处标记Accucat SPE柱的外部，然后将A柱用2.5mL甲醇，之后是2.5mL水调节。弃掉甲醇和水部分。将从Oasis SPE收集的所有洗脱液装载并洗脱至1mL标记，然后收集剩余的洗脱部分。将这些部分转移到2mL琥珀色玻璃自动进样器小瓶中用于使用以下设置在与Waters ACQUITY Qda质量检测器偶联的Waters ACQUITY UPLC H-Class上进行液相色谱/质谱(LC-MS)分析：

流动相组成：0.1％甲酸水溶液，2％甲醇

色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3 2.1x50mm 1.8μm

柱流量：500μL/分钟

柱温：20℃

注射体积：5μl

洗脱时间：1分钟

电离模式：阳离子电喷雾

毛细管电压：600V

锥孔电压：5V

MS模式：SIR监测m/z 72.04

通过UPLC-PDA进行咖啡豆提取物中的L-天冬酰胺量化

将咖啡豆提取物在室温下以13,000rpm离心5分钟。用Milli-Q水稀释所得上清液以通过装备有光电二极管阵列(PDA)检测器(Acquity UPLC H-Class,Waters,Milford,MA,USA)和Acquity UPLC BEH C18柱(1.7μm,2.1mm X 100mm,Waters,Milford,MA,USA)的Waters超高效液相色谱(UPLC)系统测量L-天冬酰胺。获得99.6％纯度的L-天冬酰胺(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)以制备浓度范围为15至500皮摩尔/μL的标准溶液用于校准和计算。通过AccQ·Tag Ultra^TM衍生化试剂盒(WATERS,Milford,MA,USA)衍生化样品和标准溶液二者中的L-天冬酰胺以添加用于检测其在260nm处的吸光度的生色团。在注射体积为1μL和柱温为43℃下进行分析。AccQ·Tag Ultra^TM洗脱剂A和洗脱剂B浓缩溶液购买自Waters(Milford,MA,USA)用于L-天冬酰胺衍生物的梯度洗脱。详细的洗脱程序如下示于表7：

表7：洗脱程序：

溶剂A：洗脱剂A浓缩物

溶剂B：水中10％洗脱剂B

溶剂C：水

溶剂D：洗脱剂B浓缩物

结果

对ASP3去阻遏突变体的现有单轮筛选方法的评价

为了规避正常使ASP3保持阻遏的NCR，使用选择能够在D-天冬酰胺作为唯一氮源上生长的酵母细胞的随机诱变筛选方法(60)。类似于所有其他已知生命，酿酒酵母不利用D-氨基酸。然而，细胞壁相关天冬酰胺酶II(ASP3)酶的独特之处在于其可以降解D-天冬酰胺，虽然效率不高(64)。重要的是，胞质天冬酰胺酶I(ASP1)不能降解D-天冬酰胺。

虽然在D-天冬酰胺上生长表明正在产生ASP3，但其必须在强NCR条件下也表达以完全去阻遏。因此，选择方法也在培养基中引入甲胺。酿酒酵母不能利用甲胺作为氮源。然而，甲胺与铵离子竞争氨转运蛋白。一旦在细胞中，甲胺不参与代谢反应，但确实会引起强NCR-等同于在酵母的优选氮源-氨(硫酸铵)上生长。因此，甲胺是生长抑制剂(65,66)。

在包含D-天冬酰胺作为唯一氮源和甲胺的培养基中培养细胞建立以下条件，其中细胞可以生长的唯一方式是表达ASP3，降解外部D-天冬酰胺，然后输入释放的铵离子。同时，释放的铵离子必须与甲胺竞争以用于细胞生长。因此，由于生长培养基的阻遏条件，ASP3表达水平最大的细胞获得选择性优势。重要的是，酵母不能利用释放的D-天冬氨酸来生长。

这种选择方法(D-天冬酰胺和甲胺)先前用于在实验室酵母菌株(DJ2-23C)中鉴定去阻遏的ASP3突变体(60)。作者通过将EMS诱变细胞直接平板接种在选择性平板(具有100mM(3.1g/L)甲胺和5mM(0.66g/L)D-天冬酰胺)上来选择ASP3突变体。这使得作者发现多种去阻遏的ASP3变体。然而，在反复努力之后，在相关工业面包酵母菌株中不能重复这些结果。

重要的是要指出，原始研究的作者(Kamerud和Roon 1986)由于他们使用单倍体实验室酵母菌株而可能能够容易地发现去阻遏的ASP3突变体。使用具有显著更复杂基因组(三倍体、四倍体、非整倍体)的工业菌株使发现去阻遏的突变体变得显著更加困难。这是因为任何具有隐性表型的突变不会如其在单倍体菌株中那样显现。发生上位性或多效性突变的机会也显著更大。基本上，任何单个有益突变将被遗传冗余缓冲。这在实验室菌株中，尤其是具有单倍体背景的那些中是罕见的。

获得减少丙烯酰胺的酵母的随机诱变和适应性进化策略的开发

鉴于工业面包酵母不适合Kamerud和Roon的单轮选择策略，筛选方法被重新设计以将迭代适应性进化策略与多轮诱变组合合并(图1)。这种新策略的目的是结合重复诱变随时间缓慢提高选择压力以实现在原本阻遏的条件下完全ASP3表达和因此天冬酰胺分解。重要的是，确保ASP3完全去阻遏所必需的选择性条件必须缓慢增加，因为用于选择的D-天冬酰胺和甲胺的最终浓度完全阻止未适应酵母的生长。因此，只有采用的随机诱变和适应性进化的特定组合才能够产生AR表型。

筛选可商购获得工业酵母菌株的培养物集合在D-天冬酰胺作为唯一氮源上的生长。只有一种工业菌株-日本面包酵母菌株-在D-天冬酰胺上具有任何明显生长，表明其包含天然ASP3基因。使用实验室菌株S288C作为阳性对照，因为已知其包含ASP3。

在时间0时，首先将野生型菌株在包含D-天冬酰胺(10g/L)作为唯一氮源(蔗糖作为碳源)的基本培养基中传代培养。在该培养基中，野生型表现出非常缓慢的生长速率，并且在这些条件下，具有允许略高ASP3表达的天然突变的细胞具有选择性优势。为了引入遗传变异性，以不同的UV剂量(10％至99％致死剂量)每周对细胞进行UV诱变。连续对菌株进行传代培养(每天)，并采用OD₆₀₀读数来追踪相对生长。在每次传代培养之后，将细胞以0.01的相同起始OD₆₀₀接种到新鲜培养基中。在四周的时间内，观察诱变酵母在选择性培养基上的生长速率的提高，使得其与在非选择性培养基上的生长速率相当。这表明发明人已选择在非诱导条件下ASP3表达提高的细胞，因此给予良好遗传背景来开始选择具有最大表达潜力的去阻遏突变体(在强NCR条件或非诱导条件下)。

在一个月后，向培养基中引入甲胺以驱动强NCR，即ASP3的完全阻遏条件。使用诱变谱系作为起点，将最少量甲胺添加到生长培养基(0.05g/L)中。这使细胞的生长速率显著降低至与在首次开始在选择性培养基上的进行传代培养时相同的速率。

在接下来的四个月内，在存在甲胺和每周UV诱变(如上所述)下对生长最快的谱系进行连续传代培养。当在甲胺存在下的生长速率与不存在甲胺下的生长速率相当时，通过在包含甲胺的固体选择性培养基上平板接种来获得个体菌落。挑选显示快速生长的菌落(即最快可视外观和相对于平板上菌落的大致平均尺寸最大菌落尺寸)，并测定L-天冬酰胺降解活性。然后，对显示出高活性的菌落进行进一步传代培养并用逐渐更多的甲胺(0.05g/L到12g/L甲胺)诱变以提高选择压力，并且由此提高L-天冬酰胺降解活性。值得注意的是，在传代培养时间轴的不同阶段进行诱变不断产生新的谱系。只有相对于直接前身培养物显示出提高L-天冬酰胺降解活性的那些谱系才进一步进化。

作为对照，保存从未诱变的野生型酵母谱系。该谱系允许确定单独的适应性进化(没有诱变)是否足以产生期望的表型(完全去阻遏的ASP3)，或者获得的表型是否是进化工程方法的结果(即提供通过UV诱变选择的遗传变异性)。

AR酵母在NCR条件下降解天冬酰胺

面包酵母的ASP3的表达以及由此降解天冬酰胺的能力在大多数生长条件下被阻遏。为了使AR菌株的功能最大化，破坏控制ASP3表达的正常NCR机制是至关重要的。因此，甚至在富营养物培养基中生长时，AR菌株也应降解天冬酰胺。为了测试适应酵母的功能，比较其相对于未适应野生型亲本菌株的降解天冬酰胺的能力。

从适应性进化方案中，鉴定到三种具有期望表型(在存在甲胺下在D-天冬酰胺上生长)的主要变体-RBAR-01、RBAR-02和RBAR-03。当测试这些菌株的天冬酰胺降解活性时，甚至在富营养物(阻遏)条件下生长，每种菌株也都表现出高天冬酰胺分解水平(图2)。与野生型(其直至3小时时未显示出明显活性，并且之后显示极小活性(大于60％的残余L-天冬酰胺))相比，在每种AR菌株中都观察到高L-天冬酰胺降解活性水平，即使用少至1小时的测定时间也是如此(RBAR-01：在1小时时剩余82％L-天冬酰胺；RBAR-02：在1小时时剩余59％L-天冬酰胺；RBAR-03：在1小时时剩余54％L-天冬酰胺)。重要的是，当与被改造以组成型表达ASP3的GMO对照菌株相比时，RBAR-02和RBAR-03在1小时和2小时标记时表现得显著更好。这支持适应性进化通常可以产生优于人指导反向工程的功能性解决方案的观点。此外，这些数据表明，适应性进化AR酵母菌株在其中通常期望提供经济和食品安全益处的短孵育时间的工业中具有增强的实用性。总之，图1和图2表明，使用的适应性进化方案成功地改变正常NCR条件，使得AR酵母甚至在富培养基(YEG)中生长时也降解天冬酰胺。重要的是，所有三种AR变体都来源于分开的诱变谱系，因此其表型和相关作用机制可能独立地进化。

迭代适应性进化对于AR菌株的产生是关键的

如前所述，Kamerud和Roon的单轮选择策略不适用于工业面包酵母菌株。因此，开发了一种新颖的迭代适应性进化策略来获得具有降解L-天冬酰胺的能力的AR菌株。该新策略的目的是结合重复诱变随时间缓慢提高选择压力以获得足够遗传多样性从而实现在原本阻遏的条件下完全ASP3表达-和因此天冬酰胺分解。

为了确定该迭代过程对于开发AR菌株的必要性，在不同程度的选择压力下测试最终AR菌株及其野生型亲本的生长。将菌株平板接种在基本选择性培养基(YEG+D-天冬酰胺)、Kamerud和Roon使用的中等选择性培养基(YEG+D-天冬酰胺+3.1g/L甲胺)和本研究中使用的高选择性培养基(YEG+D-天冬酰胺+12g/L甲胺)上。如所预期的，所有菌株在非选择性条件下等同地生长良好(图3，左图)，但是只有AR菌株能够在最高选择性的条件下生长(图3，右图)。与先前的结果一致，亲本菌株能够在中度选择性条件下生长，但是比适应性进化AR菌株更缓慢(图3，中间平板)。这种生长差异表明AR菌株的进化变化使其能够在更高选择性环境下成功生长。总之，这些数据突出随时间迭代提高选择压力以选择连续遗传多样性(进化)的必要性。事实上，只有这种迭代方法才能够产生能够在高选择性条件下生长并因此赋予独特AR表型的工业面包酵母菌株。AR酵母菌株是野生型菌株的功能不同的进化适应后代

定向适应性进化允许新表型(例如组成型天冬酰胺降解)的高度特异性开发。由于已经证明AR菌株的进化表型(图2和3)，确保这些菌株确实是野生型菌株的后代，而不是在培养期间获得的任何污染菌株就变得重要。为了确定AR菌株(RBAR-01、RBAR-02和RBAR-03)的谱系，使用inter-delta指纹图谱PCR来针对野生型亲本对每种AR菌株进行分型。在TY1和TY2反转录转座子侧翼的delta序列分散在整个酵母基因组中。由于这些反转录转座子中的高突变率，intra-delta序列的扩增产生可用于鉴定特定酵母菌株的混合数量和尺寸的条带(61)。与野生型菌株相比，RBAR-01、RBAR-02和RBAR-03的intra-delta指纹图谱绘制扩增相同数量、尺寸分布和相对强度的条带(图4，比较泳道3、4、5和6)。这表明所有适应AR菌株都来源于相同的亲本菌株，因此其可能共有列斯的特性，例如生长动力学、生活力和用于工业烘焙用途的适用性。重要的是，野生型和AR菌株与非相关S288C和GMO天冬酰胺降解酵母对照菌株不同地型(图4，泳道1和7)。

AR菌株组成型表达天冬酰胺酶II以及降解L-天冬酰胺

酵母的NCR系统允许细胞以可能最有效的方式利用复杂氮源。也就是说，当不同质量的多种来源可利用时，NCR调节分解代谢基因表达，使得细胞优先利用可利用的最高质量来源，之后在转移到下一个来源。事实上，例如YEG的富生长培养基包含多种氮源(包括铵、游离氨基酸、肽和蛋白质)的复杂混合物。因此，在YEG中酵母生长期间，可利用氮的量和质量以及NCR活性处于恒定通量。因此，虽然AR菌株在YEG中过夜生长时表现出降解L-天冬酰胺的高度增强能力(图2)，但仍然有可能在这个时间点天冬酰胺分解局限于特定的氮环境。

为了测试ASP3基因表达和随之L-天冬酰胺降解活性是否对特定时间点具有特异性或者是组成型的，进行时间过程实验，其中在整个24小时期间对酵母进行取样。在最初过夜培养之后，将每种菌株的相同数量的细胞接种到新鲜的YEG培养物中并培养24小时。以六小时的间隔取每种菌株的样品以测量L-天冬酰胺分解(标准1小时测定)以及通过qPCR的ASP3基因表达。

如图5A所示，所有菌株均以相当的速率生长，从而允许在每个时间点收获相同数目的细胞。

就L-天冬酰胺分解而言，RBAR-02和RBAR-03二者在整个时间过程期间能够完全降解L-天冬酰胺(少于10％残余L-天冬酰胺)，而RBAR-01在相同时间期间具有分解代谢L-天冬酰胺的中等能力(平均60％残余L-天冬酰胺)。重要的是，野生型菌株在实验期间的任何点均未表现出任何明显的L-天冬酰胺分解(图5B)。值得注意的是，这些数据与先前在图2中观察到的L-天冬酰胺降解一致。

当测定ASP3表达时，所有AR菌株都表现出ASP3的组成型表达(图5C)。在所有时间点之间求平均，与野生型相比，RBAR-01、RBAR-02和RBAR-03分别表达4.7倍、9.6倍和10.5倍多ASP3(图5C)。有趣的是，组成型表达的相对幅度反映了每种菌株在整个时间过程中降解L-天冬酰胺的能力(比较图5B和5C)。最后，与野生型相比，所有AR菌株中的ASP1表达没有变化(图5D)，表明观察到的L-天冬酰胺降解是细胞壁相关天冬酰胺酶II(ASP3)的结果，而不是胞质天冬酰胺酶I(ASP1)的结果。总之，这些数据还表明AR菌株由于其适应性进化而组成型表达ASP3并且组成型降解L-天冬酰胺。

AR菌株表现出增强且独特的天冬酰胺酶II动力学

天冬酰胺分解代谢产生天冬氨酸和氨，二者在高温烹制期间可转化为异味化合物例如吡嗪。因此，在某些食品生产应用中，利用具有次最大天冬酰胺酶II活性水平的AR酵母以避免异味产生可能是有益的。为了测试每种AR酵母菌株中的天冬酰胺酶II动力学，将过夜培养物接种到包含L-天冬酰胺的YEG培养基中至固定细胞数目。然后，以30分钟的间隔取样并测定剩余的L-天冬酰胺。尽管与野生型对照相比所有三种AR菌株都表现出L-天冬酰胺分解，但在AR菌株中L-天冬酰胺分解动力学并不相同(图6)。更具体地，与RBAR-02和RBAR-03二者相比，RBAR-01具有较低的L-天冬酰胺分解速率(RBAR-01：在90分钟时剩余82％L-天冬酰胺)，而RBAR-02和RBAR-03是相似的(RBAR-02：在90分钟时剩余54％L-天冬酰胺；RBAR-03：在90分钟时剩余66％L-天冬酰胺)。这些数据与图2中观察到的L-天冬酰胺分解一致，并且结合其余数据而支持适应性进化AR酵母中的表型。

AR菌株表现出NCR调控基因的差异基因表达

由于固有的非特异性性质，随机诱变和适应性进化具有除目的基因之外还改变很多不同基因的表达的能力。由于已经确定AR酵母菌株在原本活性NCR条件下在质量氮源的存在下确实组成型表达ASP3并降解L-天冬酰胺(图2、图5和图6)，发明人试图评价AR酵母的整体基因表达谱。

为此，将来自过夜培养物的固定数目的细胞接种到新鲜的YEG培养基中，并将培养物孵育6小时。然后，从样品中提取总RNA，并由反转录cDNA(poly dT引发)构建RNA测序文库。在Illumina HiSeq2500高输出模式平台上以2x100bp末端配对配置进行测序。

平均地，每种菌株获得6750万个读序，其等于6,818兆碱基和约560倍覆盖度(假设12Mb单倍体基因组)。测序数据通常质量很高，94％的Q评分大于或等于30，平均Q评分为37。

在映射到S288C参考基因组之前，对每种菌株的原始读序进行整理并过滤质量(Q评分大于或等于30)。平均地，97.6％的读序成功比对。使用比对的读序构建每个基因读序计数，其然后形成差异基因表达(DEG)分析的基础。对于每种AR菌株，计算每种基因相对于野生型的log2倍数变化(图7)。倍数变化幅度值大于1.5和野生型读序计数为至少100的基因被认为差异表达(DE)。图8A和表8比较了每种AR菌株中DEG的表达水平。按照这些DEG标准，在RBAR-01、RBAR-02和RBAR-03各自中分别观察到81(1.6％)、73(1.4％)和84(1.6％)个DEG(在5,121个验证S288C ORF中)。此外，113个(44.2％)DEG中的50个是所有三种菌株共同的，而75个(66.4％)DEG是至少两种AR菌株共同的(图8B)。通过RNAseq分析，ASP3在每种AR菌株中都在靠前的上调基因中(表8)。实际上，ASP3在RBAR-01、RBAR-02和RBAR-03中分别上调4.9、7.8和8.9倍，这与图5B和5C中获得的L-天冬酰胺降解数据和qPCR数据一致。

除ASP3之外，DEG分析揭示很多NCR基因的显著差异调节(图9A)。总共，79个已知NCR控制基因中有15(19.0％)、15(19.0％)和17(21.2％)个分别在RBAR-01、RBAR-02和RBAR-03中差异表达。所有这些富集通过Fisher精确检验而具有高统计学显著性(p≤0.0001)。

最后，为了从全局角度分析AR酵母中受影响的遗传途径和网络，还在每种AR菌株中进行DEG的基因本体学分析(表9)。尽管许多生物过程、细胞区室和分子功能受到显著影响，但是最明显的是AR菌株中营养物转运，尤其是氨基酸转运的大规模去调节(图9A、表8和9)。事实上，许多靠前DEG(上调和下调两种)都是通透酶，包括UGA4、GAP1、MEP2、DAL4、DAL5、PUT4、OPT2、HXT5、HXT4、HXT10、HXT11、HXT14、HXT9、MUP1、TAT1、MUP3和GNP1(图9A和表8)。

总之，这些数据表明适应性进化的AR酵母相对于其非进化亲本表现出显著不同的基因表达谱。此外，AR酵母中受影响的主要途径包括NCR控制和氨基酸转运。

在YEG中指数生长期间从野生型和AR酵母菌株(RBAR-01、RBAR-02和RBAR-03)收获总RNA。在Illumina HiSeq2500高输出模式平台上以2x100bp末端配对配置对由总RNA制备的RNA测序文库(TruSeq v3)进行测序。根据质量过滤原始读序，并映射到S288C参考基因组。计算6,604个酵母ORF(验证、未表征的和可疑的)中每一个的Log₂倍数变化值(相对于野生型)。根据以下标准调用差异表达基因：≥|1.5|log2倍数变化&野生型酵母中≥100计数。参见表8。

表8：AR酵母菌株中的差异表达基因

^a倍数变化

通过GO富集分析分析表8中鉴定的差异表达基因(表9)。通过Holm-Bonferroni方法针对多重检验校正富集p值。

表9：AR酵母菌株中的基因本体学(GO)富集分析

^a差异表达基因

AR菌株与其非适应性进化亲本在遗传上不同

控制适应性进化的基本原理是突变的积累，这些突变一起赋予生物体在特定环境中具有适合度优势。已基于组成型降解L-天冬酰胺的能力选择AR菌株(图1、2、5和6)并且已在AR菌株中鉴定相关DEG的子集(图7、8和9)，发明人接下来期望检测AR菌株用于区分全基因组的突变。为此，分离来自每种AR菌株以及亲本的基因组DNA，并制备DNA测序文库。在Illumina MiSeq平台上以2x300bp末端配对配置进行测序。

平均地，每种菌株获得405万个读序，其等于2,430兆碱基和约203倍覆盖度(假设12Mb单倍体基因组)。测序数据通常质量非常高，其中84％的Q评分的大于或等于30，平均Q评分为35。

在映射到S288C参照基因组之前，对每种菌株的原始读序进行修剪并根据质量过滤(Q评分大于或等于30)。平均地，96.12％的读序成功比对。使用映射的读序来产生基因组中每个碱基的堆积统计学和共有序列。然后，将该信息与参考基因组进行比较，并基于S288C参考序列对突变进行注释。最后，将AR菌株中鉴定的突变针对在野生型菌株中也鉴定的那些突变进行过滤，以去除多余突变。为了提高鉴定突变的统计能力，最初针对DEG产生的RNA测序数据也被用于调用突变。由于酵母基因组为约72％编码，因此RNAseq数据集为大部分酵母基因组提供良好的覆盖度。

在表10和11中给出了突变分析的统计学汇总。AR菌株之间的突变重叠比较示于图10中。令人感兴趣的是，21,047个突变中的15,918个(75.6％)是所有三种菌株共同的，而17,571个(83.5％)对于至少两种AR菌株是共同的(图10)。

从野生型和AR酵母菌株(RBAR-01、RBAR-02和RBAR-03)收获基因组DNA。在Illumina MiSeq平台上以2x300bp末端配对配置对由基因组DNA制备的DNA测序文库(Nextera XT)进行测序。根据质量过滤原始读序，并映射到S288C参考基因组。使用读序堆积来调用相对于S288C共有序列的每个核苷酸的变体。将AR酵母菌株中的变体针对野生型变体进行过滤以去除多余的突变。参见表10。

表10：在DNA测序和RNA测序数据集中鉴定的总突变的汇总

表11|AR菌株中突变类型的分解。表10中鉴定的突变根据其类型分类

^a相对于转录起始位点由第-1000至-1位限定的启动子

^b转录因子结合位点(Transcription factor binding site)

^c单核苷酸变体(Single nucleotide variant)

鉴于随机诱变和适应性进化是非靶向方法，AR菌株中鉴定的绝大多数突变可能对AR表型，即ASP3的组成型表达和L-天冬酰胺降解是冗余的。因此，发生关键突变的最合乎逻辑位置在相关基因的编码区内或者所述基因的启动子内。重要的是，对于影响蛋白质功能的编码区突变，其必须影响蛋白质结构，即序列。同样，对于影响基因表达的启动子区突变，其可能应发生在转录因子结合位点(TFBS)内。因此，可以滤出同义外显子单核苷酸变体(SNV)以及基因间和非TFBS启动子突变。总之，这些过滤标准在RBAR-01、RBAR-02和RBAR-03中分别留下8,469个(4,894个TFBS和3,575个外显子的)、8,324个(4,792个TFBS和3,532个外显子的)和8,350个(4,862个TFBS和3,488个外显子的)候选突变。因此，明显地，AR菌株的适应性进化导致菌株DNA序列的变化，从而使其克服ASP3的NCR阻遏并组成型降解L-天冬酰胺。

AR菌株降低面包和吐司中的丙烯酰胺形成

当游离天冬酰胺与还原糖在高于120℃的温度下反应时，在面包中形成丙烯酰胺。重要的是，相对于天冬酰胺，面包中的还原糖过量存在。因此，面包中AA的水平与天冬酰胺含量高度相关(26、67-69)。此外，已充分确定，在烘烤(此时面包内部的未反应天冬酰胺暴露于高温)后，面包中的AA水平显著提高(21)。因此，在烘烤前在整个面包中去除天冬酰胺是降低面包的整体AA潜力的关键。

在已确定AR酵母菌株组成型表达ASP3并降解L-天冬酰胺(图2、5和6)之后，接下来期望确定菌株是否可用于减少面包中的AA。为此，用野生型酵母或AR菌株RBAR-01、RBAR-02和RBAR-03制备白面包和全麦面包，并在烘焙的面包和吐司面中分析AA水平(图11)。在用野生型酵母产生的所有面包中，AA水平为30至67ppb。相比之下，用AR酵母菌株产生的所有面包的AA水平都几乎不可检测(<10ppb)，这等同于AA大致平均减少80％。与加热对AA水平的影响一致，在所有菌株产生的所有面包中，观察到烘烤与AA水平之间明显正相关。平均地，低温、中温和高温烘烤使AA分别增加3、5和7倍(图11)。然而，在用AR菌株产生的吐司中，AA水平显著更低，其中AA平均减少75％至85％。在大多数情况下，由AR菌株产生的烘烤面包中的AA水平低于通过野生型菌株产生的未烘烤面包(图10)。值得注意的是，这些结果和条件代表超过10个独立实验。总之，这些结果验证了AR酵母菌株作为降低面包和吐司中AA水平的稳健的无缝方法。

AR菌株降低法式薯条中的丙烯酰胺形成

由于基于马铃薯的食品富含天冬酰胺和还原糖，因此其倾向于包含一定最高水平的AA(12)。因此，由于已确定AR酵母菌株组成型表达ASP3并降解L-天冬酰胺(图2、5和6)以及其显著降低面包和吐司中AA水平的能力(图11)，接下来确定这种菌株是否可以用于减少法式薯条中的AA。虽然酵母不是法式薯条中的成分，但是水性浸泡步骤在其生产中是常见的。因此，假设在煎炸之前将马铃薯浸泡在水/酵母混合物中可以减少法式薯条中的AA，在此期间，酵母会降解马铃薯表面上的天冬酰胺，由此减少AA。

为了测试这一想法，在由在仅水中或者在野生型酵母或AR菌株RBAR-01、RBAR-02和RBAR-03的水/酵母溶液中浸泡的新鲜Russet马铃薯制成的法式薯条中分析AA水平(图12)。与其高糖和天冬酰胺含量一致，无酵母的对照法式薯条具有高水平的AA-440ppb。相比之下，所有AR酵母菌株都能够显著降低法式薯条的AA含量(平均降低71％-127ppb)，其中RBAR-03降低77％(100ppb)。令人感兴趣的是，相对于无酵母对照，野生型酵母菌株能够将法式薯条中的AA减少55％(200ppb)。这可能是由于酵母发酵糖的天然能力。事实上，在大部分受AA影响的食品，即非马铃薯基食品中，天冬酰胺是AA形成的限制性试剂。然而，在马铃薯中，天冬酰胺和还原糖以大致等摩尔量存在(70)，因此限制还原糖是对马铃薯有效的AA减少措施。然而，已知还原糖和天冬酰胺水平根据马铃薯的品种、季节和贮藏条件而不同(70)。因此，只能消耗糖并且仅在有利加工条件下(例如，足够的接触时间以减少马铃薯产品中的丙烯酰胺)进行的野生型酵母的有效性将是可变的。因此，具有降解天冬酰胺的能力的AR酵母菌株能够显著且一致地降低AA水平，而不是简单地发酵糖。

为了在相对较短的接触时间和高温条件下进一步测试AR酵母，我们如上所述制备切割的马铃薯，并在68℃下将其在单独水或水/AR酵母(仅RBAR-03)混合物中浸泡50秒。如图13所示，我们观察到AR酵母的使用量与所观察到的丙烯酰胺减少之间的剂量依赖性关系。在所测试的条件下，最低的AR酵母浓度(100g/L)能够使丙烯酰胺减少19％(1002ppb，与1240ppb相比)。然而，在250g/L的AR酵母下，我们观察到丙烯酰胺显著减少49％(632ppb，与1240ppb相比)。令人感兴趣的是，我们对使用300g/L AR酵母没有观察到任何显著益处，这表明在测试条件下，50％可能是丙烯酰胺减少的最大值。然而，在其他更优化的条件下，通过AR酵母的丙烯酰胺减少可显著更高。值得注意的是，这些结果和条件代表多个独立实验。总之，这些数据表明，AR酵母有效地减少法式薯条并且更广泛地说由新鲜马铃薯制成的煎炸食品中的AA。

AR菌株降低零食颗粒中的丙烯酰胺形成

在已确定AR菌株用于减少新鲜马铃薯产品中AA的效用(图14)之后，接下来在基于马铃薯粉的零食食品中测试其效力。为此，用野生型酵母或AR菌株RBAR-01、RBAR-02和RBAR-03制备挤出的煎炸马铃薯基零食产品，并分析加工期间的天冬酰胺水平-还在最终煎炸产品中测量AA水平(图14)。关于天冬酰胺，相对于无酵母对照或野生型酵母，所有AR菌株都能够降解天冬酰胺(图14A)。更具体地，RBAR-01和RBAR-03在少至30分钟处理时间内消耗零食颗粒中的所有天冬酰胺。相比之下，RBAR-02中的天冬酰胺降解活性在该食品模型中较不稳健-在60分钟时减少45％。然而，相对于无酵母对照或野生型酵母，该活性显而易见。

就AA减少而言，所有的AR菌株都是有效的。平均地，AR菌株使AA减少75％(平均100ppb相对于400ppb-图14B)。与其在该食品模型中显示的优异降解天冬酰胺的能力一致，RBAR-01和RBAR-03获得最低水平的AA-分别减少82％和85％(70ppb和60ppb)(图14B)。令人感兴趣的是并且与法式薯条的情况形成对比，野生型酵母不能够降低零食颗粒中的AA水平。这可能是由于零食颗粒混合物中含非天冬酰胺成分(马铃薯淀粉和麦芽糊精)的存在。这些成分显著提高混合物的还原糖含量，从而使天冬酰胺成为零食颗粒中用于形成AA的限制性试剂。因此，酵母的糖发酵活性在降低AA方面是无效的。值得注意的是，这些结果和条件代表多个独立实验。总的来说，这些数据证实AR酵母可以成功地用于减少挤出的煎炸马铃薯粉基食品中的AA。

AR菌株降低甜饼干中的丙烯酰胺形成

在已确定AR菌株用于减少面包和吐司、新鲜马铃薯产品和经加工马铃薯产品中AA的效用(图11、12、13和14)之后，接下来在甜饼干中测试其效力。

为此，用野生型酵母或AR菌株RBAR-01、RBAR-02和RBAR-03制备甜饼干产品，并分析最终煎炸产品中的AA水平(图15)。与无酵母对照相比，所有的AR菌株都能够降低最终产品中的AA水平(平均降低69％-平均103ppb相对于330ppb)，其中RBAR-03是最有效的(79％降低-70ppb相对于330ppb)。类似于法式薯条的情况(图12)，注意到野生型酵母能够在一定程度上减少AA(30％减少-230ppb相对于330ppb)，这可能是由于发酵活性。然而，AR菌株由于其降解天冬酰胺的能力而大大增强减少AA的能力。值得注意的是，这些结果和条件代表多个独立实验。总的来说，这些数据表明AR酵母有效地减少甜饼干中的AA。

AR菌株降低椒盐脆饼中的丙烯酰胺形成

在已确定AR菌株用于减少面包和吐司、新鲜马铃薯产品、经加工马铃薯产品和甜饼干中AA的的效用(图11、12、13、14和15)之后，测试其在椒盐脆饼中的效力。椒盐脆饼由于所使用的氢氧化钠洗涤过程以在制造期间提高褐变而通常包含高水平的AA-事实上，在高pH下AA形成加速。

用野生型酵母或AR菌株RBAR-01、RBAR-02和RBAR-03制备椒盐脆饼，并在最终产品中分析AA水平(图16)。与野生型酵母相比，所有的AR菌株都极其能够降低最终产品中的AA水平(平均降低98％-平均<5ppb相对于200ppb)。值得注意的是，这些结果和条件代表多个独立实验。总的来说，这些数据表明AR酵母在椒盐脆饼中高度有效地减少AA。

AR酵母降低咖啡中的天冬酰胺和丙烯酰胺形成

在已确定AR菌株用于减少面包和吐司、新鲜马铃薯产品、经加工马铃薯产品、甜饼干和椒盐脆饼中AA的效用(图11、12、13、14、15和16)之后，在咖啡中测试其效力。作为第一个概念验证，在经研磨绿咖啡豆的发酵中测试野生型和AR酵母菌株RBAR-03(图17)。与无酵母对照相比，野生型菌株使AA减少52％(191ppb相对于394ppb)，这可能是由于豆中还原糖的发酵。然而，能够消耗糖和天冬酰胺二者的AR菌株RBAR-03使AA减少92％(32ppb相对于394ppb)。

鉴于AR酵母在直接施加于经研磨绿咖啡豆时能够减少AA(图17)，接下来在水性绿咖啡提取物中测试AR酵母减少天冬酰胺的能力。然后，这样的提取物在耗尽目的化合物(例如天冬酰胺或咖啡因)时可用于在烘烤之前从绿咖啡豆中选择性地除去该化合物。如果以这种方式去除天冬酰胺，则在所得烘烤咖啡中AA会降低。

如图18所示，AR酵母(RBAR-03)能够以时间和浓度依赖性方式减少GCE中的L-天冬酰胺(18％固体)。在最高AR酵母浓度(10⁹个细胞/mL)中，在30分钟内消耗大于95％的L-天冬酰胺(340g/100g L-天冬酰胺，时间＝0相对于13.1g/100g L-天冬酰胺，时间＝30分钟)，而在中等浓度(10⁸个细胞/mL)下，这在90分钟内实现(340g/100g L-天冬酰胺，时间＝0相对于10.5g/100g L-天冬酰胺，时间＝30分钟)。在最低AR酵母浓度(10⁷个细胞/mL)下，L-天冬酰胺消耗不完全，其中在150分钟时仅减少43％(340g/100g L-天冬酰胺，时间＝0相对于195g/100g L-天冬酰胺，时间＝150分钟)。值得注意的是，这些结果和条件代表多个独立实验。总之，这些数据证实具有降解L-天冬酰胺能力的AR菌株能够有效地降低咖啡中的L-天冬酰胺和AA。

结论

尽管明显需要更好的AA减少工具，但是目前可用的方法不能提供足够高的效力，或者在技术上、逻辑上和经济上难以实施。为了解决这些问题，开发了基于面包酵母的新型AA减少技术。使用酵母来驱动食品中AA减少是一个理想的解决方案，因为1)其已经是人长期接触的天然食品成分；2)酵母符合美国FDA“一般视为安全的”(GRAS)状态或全球大多数司法结构的国际等同状态；3)酵母已经是很多AA是显著问题的食品(例如面包)中的主要成分；4)AR酵母可以作为瞬时处理并入AA是问题的其他食品(例如马铃薯产品、谷物、零食食品和咖啡)中；5)酵母培养便宜且易于操作；以及6)大多数商业食品生产者具有处理酵母的先验经历。此外，由面包酵母菌株适应性地进化而来，AR酵母菌株可以在所有现有烘焙过程中无缝且容易地代替面包酵母，因为使用AR酵母不需要改变工业烘焙过程，其用于生产面包或任何酵母发酵烘焙产品。

如本报告中所述，组成型表达细胞壁相关天冬酰胺酶II ASP3(图2、5和6)的未经遗传修饰的适应性进化AR面包酵母菌株是食品中AA问题的稳健且高度有效的解决方案。AR酵母菌株能够在最小暴露时间和加工变化下在多种食品中将天冬酰胺水平显著降低多至95％(图11、12、13、14、15、16、17和18)-在酵母已经是成分的食品中，不需要加工改变。

通过在烹制之前显著降解食品产品中的天冬酰胺，该技术防止AA的形成，而不管下游食品处理实践，即AR菌株降低食品的AA潜力。这规避了实施起来在逻辑上和技术上具有挑战性，极其昂贵且难以调控(例如家庭和餐厅食品准备)的涉及大量参数且代表大规模干预的多管齐下的AA控制和减少策略的需要。

总之，使用适应性进化开发了新型的非GMO面包酵母菌株，其组成型表达细胞壁相关天冬酰胺酶II(ASP3)并且降解L-天冬酰胺以降低广泛多种常见食品产品中的AA水平。AR菌株能够将面包和其他酵母发酵食品、马铃薯基食品、挤出零食食品、甜饼干、椒盐脆饼和咖啡中的AA水平降低多达95％。

虽然已经参照目前被认为是实例的内容描述了本公开内容，但是应该理解，本公开内容不限于所公开的实例。相反，本公开内容旨在覆盖包括在所附权利要求书的精神和范围内的多种修改方案和等同布置。

所有的出版物、专利和专利申请都通过引用整体并入本文，程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请被特别地且单独地指出通过引用整体并入。

参考文献

1.Besaratinia A,Pfeifer GP.2007.A review of mechanisms of acrylamidecarcinogenicity(丙烯酰胺致癌机制研究综述).Carcinogenesis 28:519–528.

2.Exon JH.2006.A Review of the Toxicology of Acrylamide(丙烯酰胺毒理学研究综述).Journal of Toxicology and Environmental Health,Part B 9:397–412.

3.Capuano E,Fogliano V.2011.Acrylamide and 5-hydroxymethylfurfural(HMF):A review on metabolism,toxicity,occurrence in food and mitigationstrategies(食物中代谢、毒性的发生和缓解策略的综述).LWT-Food Science andTechnology 44:793–810.

4.Shipp A,Lawrence G,Gentry R,McDonald T,Bartow H,Bounds J,MacdonaldN,Clewell H,Allen B,Van Landingham C.2006.Acrylamide:review of toxicity dataand dose-response analyses for cancer and noncancer effects(丙烯酰胺：审查毒性数据和癌症和非癌症效应的剂量反应分析).Crit.Rev.Toxicol.36:481–608.

5.Besaratinia A,Pfeifer GP.2004.Genotoxicity of acrylamide andglycidamide(丙烯酰胺和缩水甘油酰胺的基因毒性).J.Natl.Cancer Inst 96:1023–1029.

6.Rice JM.2005.The carcinogenicity of acrylamide(丙烯酰胺的致癌性).Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis 580:3–20.

7.Mottram DS,Wedzicha BL,Dodson AT.2002.Acrylamide is formed in theMaillard reaction (丙烯酰胺在美拉德反应中形成).Nature 419:448–449.

8.Stadler RH,Blank I,Varga N,Robert F,Hau J,Guy PA.2002.Foodchemistry:acrylamide from Maillard reaction products(食品化学：来自美拉德反应产物中的丙烯酰胺).Nature 419:449–450.

9.Tareke E,Rydberg P,Karlsson P,Eriksson S, M.2002.Analysisof Acrylamide,a Carcinogen Formed in Heated Foodstuffs(加热食品中致癌物丙烯酰胺的分析).Journal of Agricultural and Food Chemistry 50:4998–5006.

10.Normandin L,Bouchard M,Ayotte P,Blanchet C,Becalski A,Bonvalot Y,Phaneuf D,Lapointe C,GagnéM,Courteau M.2013.Dietary exposure to acrylamide inadolescents from a Canadian urban center(加拿大城市中心的青少年的膳食暴露于丙烯酰胺).Food and Chemical Toxicology 57:75–83.

11.Chen Y-H,Xia E-Q,Xu X-R,Ling W-H,Li S,Wu S,Deng G-F,Zou Z-F,ZhouJ,Li H-B.2012.Evaluation of Acrylamide in Food from China by a LC/MS/MSMethod(LC/MS/MS法评价中国食品中丙烯酰胺).IJERPH 9:4150–4158.

12.Wenzl T,Anklam E.2007.European Union database of acrylamide levelsin food:Update and critical review of data collection(欧盟食品中丙烯酰胺含量数据库：对数据收集进行更新和严格审查).Food Additives and Contaminants 24:5–12.

13.Mojska H,Gielecińska I,Szponar L, M.2010.Estimation ofthe dietary acrylamide exposure of the Polish population(估计波兰人口膳食丙烯酰胺暴露量).Food and Chemical Toxicology 48:2090–2096.

14.Tran NL,Barraj LM,Murphy MM,Bi X.2010.Dietary Acrylamide Exposureand Hemoglobin Adducts“National Health and Nutrition Examination Survey(“04)(膳食丙烯酰胺暴露和血红蛋白加合物-国家健康和营养检查调查).Food andChemical Toxicology 48:3098–3108.

15.Sirot VR,Hommet F,Tard A,Leblanc J-C.2012.Dietary acrylamideexposure of the French population:Results of the second French Total DietStudy(法国人口膳食丙烯酰胺暴露：第二次法国总膳食研究的结果).Food and ChemicalToxicology 50:889–894.

16.Zhou PP,Zhao YF,Liu HL,Ma YJ,Li XW,Yang X,Wu YN.2013.Dietaryexposure of the Chinese population to acrylamide(中国人对丙烯酰胺的膳食暴露).Biomed.Environ.Sci.26:421–429.

17.Mojska H,Gielecińska I, K.2012.Determination of acrylamidelevel in commercial baby foods and an assessment of infant dietary exposure(商品婴儿食品中丙烯酰胺水平的测定和婴儿饮食暴露的评估).Food and ChemicalToxicology 50:2722–2728.

18.Cengiz MF,Gündüz CPB.2013.Acrylamide exposure among Turkishtoddlers from selected cereal-based baby food samples(来自选定的谷物婴儿食品样品的土耳其幼儿的丙烯酰胺暴露).Food and Chemical Toxicology 60:514–519.

19.Bent G-A,Maragh P,Dasgupta T.2012.Acrylamide in Caribbean foods“Residual levels and their relation to reducing sugar and asparagine content(加勒比食品中的丙烯酰胺-残留水平及其与还原糖和天冬酰胺含量的关系).FoodChemistry 133:451–457.

20.Pelucchi C,Bosetti C,Galeone C,La Vecchia C.2014.Dietaryacrylamide and cancer risk:An updated meta-analysis(膳食丙烯酰胺和癌症风险：最新的荟萃分析).Int.J.Cancer 136:2912–2922.

21.Jackson LS,Al-Taher F.2005.Effects of consumer food preparation onacrylamide formation(消费者食物制备对丙烯酰胺形成的影响).Advances inExperimental Medicine and Biology 561:447–465.

22.Fredriksson H,Tallving J,Rosén J, P.2004.Fermentation reducesfree asparagine in dough and acrylamide content in bread(发酵会减少面团中的游离天冬酰胺和面包中丙烯酰胺的含量).Cereal Chemistry 81:650–653.

23. E,Kita A,Knutsen SH,Wicklund T.2005.Addition of GlycineReduces the Content of Acrylamide in Cereal and Potato Products(添加甘氨酸降低谷物和马铃薯产品中丙烯酰胺的含量).Journal of Agricultural and FoodChemistry 53:3259–3264.

24.Fink M,Andersson R,Rosén J, P.2006.Effect of Added Asparagineand Glycine on Acrylamide Content in Yeast-Leavened Bread(添加天冬酰胺和甘氨酸对酵母发酵面包中丙烯酰胺含量的影响).Cereal Chemistry 83:218–222.

25. V, TK.2007.Acrylamide Formation in Foods duringThermal Processing with a Focus on Frying(主要煎炸的食品加工过程中食品中丙烯酰胺的形成).Food Bioprocess Technol 1:35–42.

26.Amrein TM, B,Escher F,AmadòR.2004.Acrylamide inGingerbread:Critical Factors for Formation and Possible Ways for Reduction(丙烯酰胺在姜饼：形成的关键因素和可能的减少方法).Journal of Agricultural and FoodChemistry 52:4282–4288.

27.Claus A,Schreiter P,Weber A,Graeff S,Herrmann W,Claupein W,Schieber A,Carle R.2006.Influence of Agronomic Factors and Extraction Rate onthe Acrylamide Contents in Yeast-Leavened Breads(农艺因素和提取率对酵母发酵面包中丙烯酰胺含量的影响).Journal of Agricultural and Food Chemistry 54:8968–8976.

28.Claus A,Mongili M,Weisz G,Schieber A,Carle R.2008.Impact offormulation and technological factors on the acrylamide content of wheatbread and bread rolls(配方和工艺因素对小麦面包和面包卷丙烯酰胺含量的影响).Journal of Cereal Science 47:546–554.

29.Chawla R,Shakya R,Rommens CM.2012.Tuber-specific silencing ofasparagine synthetase-1 reduces the acrylamide-forming potential of potatoesgrown in the field without affecting tuber shape and yield(块茎特异性沉默天冬酰胺合成酶-1降低了田间生长的马铃薯的丙烯酰胺形成潜力，而不影响块茎的形状和产量).Plant Biotechnology Journal 10:913–924.

30.Ye J,Shakya R,Shrestha P,Rommens CM.2010.Tuber-Specific Silencingof the Acid Invertase Gene Substantially Lowers the Acrylamide-FormingPotential of Potato(酸转化酶基因的块茎特异沉默显著降低了马铃薯的丙烯酰胺形成潜力).Journal of Agricultural and Food Chemistry 58:12162–12167.

31.Rommens CM,Yan H,Swords K,Richael C,Ye J.2008.Low-acrylamideFrench fries and potato chips(低丙烯酰胺法式炸薯条和薯片).Plant BiotechnologyJournal 6:843–853.

32.Cooper TG.1982.Nitrogen metabolism in S.cerevisiae,pp.39–99.InJ.N.Strathern,EWJ(ed.),The molecular biology of the yeast:metabolism and geneexpression(酿酒酵母中的氮代谢，第39-99页，J.N.Strathern，EWJ(编辑)，酵母的分子生物学：代谢和基因表达).Cold Spring Harbor Press,New York.

33.Jones GE.1977.Genetic and physiological relationships between L-asparaginase I and asparaginase II in Saccharomyces cerevisiae(酿酒酵母中L-天冬酰胺酶I和天冬酰胺酶II的遗传和生理关系).Journal of Bacteriology 130:128–130.

34.League GP,Slot JC,Rokas A.2012.The ASP3locus in Saccharomycescerevisiae originated by horizontal gene transfer from Wickerhamomyces(酿酒酵母中的ASP3基因座起源于Wickerhamomyces的水平基因转移).FEMS Yeast Research 12:859–863.

35.Sinclair K,Warner JP,Bonthron DT.1994.The ASP1gene ofSaccharomyces cerevisiae,encoding the intracellular isozyme of L-asparaginase(酿酒酵母的ASP1基因编码L-天冬酰胺酶的细胞内同功酶).Gene 144:37–43.

36.Kim KW,Kamerud JQ,Livingston DM,Roon RJ.1988.Asparaginase II ofSaccharomyces cerevisiae.Characterization of the ASP3gene(酿酒酵母的天冬酰胺酶II：ASP3基因的表征).Journal of Biological Chemistry 263:11948–11953.

37.Dunlop PC,Meyer GM,Roon RJ.1980.Nitrogen catabolite repression ofasparaginase II in Saccharomyces cerevisiae(酿酒酵母中天冬酰胺酶II的氮分解代谢抑制).Journal ofBacteriology 143:422–426.

38.Huang Y-C,Chen H-T,Teng S-C.2010.Intragenic transcription of anoncoding RNA modulatesexpression of ASP3in budding yeast(非编码RNA的基因内转录调节出芽酵母中ASP3的表达).RNA(New York,N.Y.)16:2085–2093.

39.Pauling KD,Jones GE.1980.Asparaginase II of Saccharomycescerevisiae:Dynamics of Accumulation and Loss in Rapidly Growing Cells(酿酒酵母天冬酰胺酶II：快速生长细胞积累和损失的动力学).J.Gen.Microbiol.117:423–430.

40.Roon RJ,Murdoch M,Kunze B,Dunlop PC.1982.Derepression ofasparaginase II during exponential growth of Saccharomyces cerevisiae onammonium ion.Arch(酿酒酵母指数生长期间天冬酰胺酶II的去阻遏对铵离子的影响).Biochem.Biophys.219:101–109.

41.Ferrara MA,Mattoso JMV,Bon EPS,Pereira N.2004.Kinetics ofasparaginase IIfermentation in Saccharomyces cerevisiae ure2dal80mutant:effect of nitrogen nutrition and pH(酿酒酵母ure2dal80突变体中天冬酰胺酶II发酵动力学：氮营养和pH的影响).Applied Biochemistry and Biotechnology 113-116:299–305.

42.Hofman-Bang J.1999.Nitrogen catabolite repression in Saccharomycescerevisiae(在酿酒酵母中氮分解代谢物的抑制).Molecular biotechnology 12:35–73.

43.Derkx PM,Janzen T, KI,Christensen JE,Stuer-Lauridsen B,Johansen E.2014.The art of strain improvement of industrial lactic acidbacteria without the use of recombinant DNA technology(不使用重组DNA技术的工业乳酸菌菌株改良技术).Microb.Cell Fact.13:S5.

44.Pedersen MB,Iversen SL, KI,Johansen E.2005.The long andwinding road from the research laboratory to industrial applications oflactic acid bacteria(乳酸菌的从研究实验室到工业应用的漫长而曲折的道路).FEMSmicrobiology reviews 29:611–624.

45.Margolles A,Sanchez B.2012.Selection of a Bifidobacterium animalissubsp.lactis Strain with a Decreased Ability To Produce Acetic Acid(选择产生乙酸的能力下降的动物双歧杆菌亚种乳酸菌菌株).Applied and EnvironmentalMicrobiology 78:3338–3342.

46.Saarela M,Alakomi HL, J,Ahonen AM,Puhakka A,TynkkynenS.2011.Improving the storage stability of Bifidobacterium breve in low pHfruit juice(提高低pH果汁中短双歧杆菌的贮存稳定性).International Journal ofFood Microbiology 149:106–110.

47.Smith J,van Rensburg E, JF.2014.Simultaneously improvingxylose fermentation and tolerance to lignocellulosic inhibitors throughevolutionary engineering of recombinant Saccharomyces cerevisiae harbouringxylose isomerase(通过进化工程改造携带木糖异构酶的酿酒酵母同时提高木糖发酵和对木质纤维素抑制剂的耐受性).BMC Biotechnol.14:41.

48.Bachmann H,Starrenburg MJC,Molenaar D,Kleerebezem M,van HylckamaVlieg JET.2012.Microbial domestication signatures of Lactococcus lactis canbe reproduced by experimental evolution(乳酸乳球菌的微生物驯化特征可以通过实验进化来再现).Genome research22:115–124.

49.guez JOV-R,Shi S,Siewers V,Nielsen J.2014.Metabolic engineering ofSaccharomyces cerevisiae for production of fatty acid ethyl esters,anadvanced biofuel,by eliminating non-essential fatty acid utilization pathways(通过消除非必需脂肪酸利用途径对酿酒酵母代谢工程改造以生产脂肪酸乙酯(先进生物燃料)).APPLIED ENERGY 115:226–232.

50.Callanan MJ,Beresford TP,Ross RP.2005.Genetic Diversity in theLactose Operons of Lactobacillus helveticus Strains and Its Relationship tothe Role of These Strains as Commercial Starter Cultures(瑞士乳杆菌乳糖操纵子的遗传多样性及其与这些菌株作为商业起子培养物作用的关系).Applied andEnvironmental Microbiology 71:1655–1658.

51. ZP,Turanli-Yildiz B,Alkim C,Yilmaz 2011.Evolutionaryengineering of Saccharomyces cerevisiae for improved industrially importantproperties(酿酒酵母进化工程改进工业重要特性).FEMS Yeast Res 12:171–182.

52.Winkler JD,Kao KC.2014.Recent advances in the evolutionaryengineering of industrial biocatalysts(工业生物催化剂进化工程的最新进展).Genomics 104:406–411.

53.Stanley D,Fraser S,Chambers PJ,Rogers P,Stanley GA.2009.Generationand characterisation of stable ethanol-tolerant mutants of Saccharomycescerevisiae(酿酒酵母的稳定乙醇耐受突变体的产生和表征).Journal of IndustrialMicrobiology and Biotechnology 37:139–149.

54.Liu E,Hu Y.2010.Construction of a xylose-fermenting Saccharomycescerevisiae strain by combined approaches of genetic engineering,chemicalmutagenesis and evolutionary adaptation(通过基因工程，化学诱变和进化适应的组合方法构建木糖发酵酿酒酵母菌株).Biochemical Engineering Journal 48:204–210.

55.Stroman P,Muller CC,Sorensen KI.2003.Heat Shock TreatmentIncreases the Frequency of Loss of an Erythromycin Resistance-EncodingTransposable Element from the Chromosome of Lactobacillus crispatus CHCC3692(治疗增加了卷曲乳杆菌CHCC3692染色体丢失红霉素抗性编码转座因子的频率).Appliedand Environmental Microbiology 69:7173–7180.

56.Dragosits M,Mattanovich D.2013.Adaptive laboratory evolutionprinciples and applications for biotechnology(自适应实验室进化原理和生物技术的应用).Microb.Cell Fact.12:1–1.

57.Gresham D,Usaite R,Germann SM,Lisby M,Botstein D,RegenbergB.2010.Adaptation to diverse nitrogen-limited environments by deletion orextrachromosomal element formation of the GAP1 locus(通过缺失或GAP1基因座的染色体外元件形成适应不同的氮限制环境).Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America 107:18551–18556.

58.Hong J,Gresham D.2014.Molecular Specificity,Convergence andConstraint Shape Adaptive Evolution in Nutrient-Poor Environments(在营养不良环境中分子特异性、收敛性和约束形状的适应性进化).PLoS genetics 10:e1004041–16.

59.WATANABE T,IEFUJI H,KITAMOTO HK.2013.Genome-wide screening tostudy breeding methods to improve the nitrogen accumulation ability of yeastwithout gene recombinant techniques(无基因重组技术的全基因组筛选研究育种方法以提高酵母的氮积累能力).Bioscience,biotechnology,and biochemistry 77:917–922.

60.Kamerud JQ,Roon RJ.1986.Asparaginase II of Saccharomycescerevisiae:selection of four mutations that cause derepressed enzymesynthesis(酿酒酵母的天冬酰胺酶II：选择引起去阻遏酶合成的四种突变).Journal ofBacteriology 165:293–296.

61.Tristezza M,Gerardi C,Logrieco A,Grieco F.2009.An optimizedprotocol for the production of interdelta markers in Saccharomyces cerevisiaeby using capillary electrophoresis(利用毛细管电泳产生在酿酒酵母interdelta标记的优化方案).Journal of Microbiological Methods 78:286–291.

62.Hoffman CS,Winston F.1987.A ten-minute DNA preparation from yeastefficiently releases autonomous plasmids for transformation of Escherichiacoli(酵母的DNA十分钟制备有效释放用于转化大肠杆菌的自体质粒).Gene 57:267–272.

63. K,Domdey H.1991.Preparation of high molecular weight RNA(高分子量RNA的制备).Methods in enzymology 194:398–405.

64.Dunlop PC,Roon RJ,Even HL.1976.Utilization of D-asparagine bySaccharomyces cerevisiae(酿酒酵母利用D-天冬酰胺).Journal of Bacteriology 125:999–1004.

65.Roon RJ,Even HL,Dunlop P,Larimore FL.1975.Methylamine and ammoniatransport in Saccharomyces cerevisiae(甲醇和氨气在酿酒酵母中的转运).Journalof Bacteriology 122:502–509.

66.Roon RJ,Levy JS,Larimore F.1977.Negative interactions betweenamino acid and methylamine/ammonia transport systems of Saccharomycescerevisiae(氨基酸与酿酒酵母甲胺/氨转运系统之间的负相互作用).Journal ofBiological Chemistry 252:3599–3604.

67.Keramat J,LeBail A,Prost C,Jafari M.2010.Acrylamide in BakingProducts:A Review Article(烘焙产品中的丙烯酰胺：综述文章).Food BioprocessTechnol 4:530–543.

68.Capuano E,Ferrigno A,Acampa I,Serpen A, V,FoglianoV.2009.Effect of flour type on Maillard reaction and acrylamide formationduring toasting of bread crisp model systems and mitigation strategies(面粉类型对面包酥脆模型系统烘烤过程中美拉德反应和丙烯酰胺形成的影响及缓解策略).FRIN42:1295–1302.

69.Surdyk N,Rosén J,Andersson R, P.2004.Effects of Asparagine,Fructose,and Baking Conditions on Acrylamide Content in Yeast-Leavened WheatBread(天冬酰胺、果糖和烘焙条件对酵母发酵麦面包中丙烯酰胺含量的影响).Journal ofAgricultural and Food Chemistry 52:2047–2051.

70.Halford NG,Curtis TY,Muttucumaru N,Postles J,Elmore JS,MottramDS.2012.The acrylamide problem:a plant and agronomic science issue(丙烯酰胺问题：植物和农艺学问题).Journal of Experimental Botany 63:2841–2851.

71.Ljungdahl PO,Daignan-Fornier B.2012.Regulation of amino acid,nucleotide,and phosphate metabolism in Saccharomyces cerevisiae(酿酒酵母中氨基酸，核苷酸和磷酸盐代谢的调节).Genetics 190:885–929

序列表

<110> 复兴生物科技公司

<120> 通过适应性进化开发减少天冬酰胺的酵母的开发及所述酵母降低丙烯酰胺形成的用途

<130> 23756-P48552PC00

<150> US 62/189,547

<151> 2015-07-07

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 1

tcaacaatgg aatcccaac 19

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 2

catcttaaca ccgtatatga 20

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 3

gagcggatga acagggatat t 21

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 4

gggtctgtga ggttggaaat 20

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 5

caaactgaga gtggacggta ag 22

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 6

gttgactata gctggcggaa a 21

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 7

cgtctggatt ggtggttcta tc 22

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 8

ggaccacttt cgtcgtattc tt 22

PCT/RO/134表

Claims (34)

1.一种分离的未经遗传修饰酵母，其在非诱导条件下表达细胞壁天冬酰胺酶并且具有减少天冬酰胺的活性。

2.根据权利要求1所述的分离的未经遗传修饰酵母，其中所述细胞壁天冬酰胺酶组成型表达。

3.根据权利要求1或2所述的分离的未经遗传修饰酵母，其中所述酵母当在非诱导条件下生长时使天冬酰胺减少至少20％、至少30％、至少40％、至少50％或更多。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的分离的未经遗传修饰酵母，其中细胞壁相关天冬酰胺酶由ASP3基因座编码。

5.一种分离在非诱导条件下降解L-天冬酰胺的酵母菌株的方法，其包括：

a)在存在包含D-天冬酰胺作为唯一氮源的培养基下对表达或能够表达细胞壁相关天冬酰胺酶的野生型酵母菌株进行传代培养，

b)连续传代培养，追踪生长速率并每周进行诱变；

c)当所述生长速率达到基线时，选择b)的培养物；

d)在包含甲胺的选择性培养基中连续对细胞进行传代培养，追踪生长速率，并每周诱变，直至在甲胺存在下的生长速率达到在不具有甲胺的选择性培养基中的生长速率；

e)通过在包含甲胺的选择性培养基上进行平板接种来分离d)的个体菌落，培养所述菌落，并选择大且生长快速的菌落；

f)测定e)中所选菌落在非诱导条件下降解L-天冬酰胺的能力，并选择至少一个与d)开始时的细胞相比具有高L-天冬酰胺降解活性的菌落；

g)重复步骤d)至f)，每次提高甲胺浓度直至L-天冬酰胺降解活性达到稳定水平；

h)从g)中分离其中L-天冬酰胺降解活性已达到稳定水平的菌株。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述细胞壁相关天冬酰胺酶由ASP3基因座编码。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其中所述野生型酵母菌株是面包酵母。

8.根据权利要求5至7中任一项所述的方法，其中诱变是物理诱变或化学诱变。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述物理诱变是UV诱变。

10.根据权利要求5至9中任一项所述的方法，其中a)至c)的时间段为2至4周。

11.根据权利要求5至10中任一项所述的方法，其中d)至g)的时间段为6至48周。

12.根据权利要求5至11中任一项所述的方法，其中在e)中在选择所述大且生长快速的菌落之前将所述菌落生长2至10天。

13.根据权利要求5至12中任一项所述的方法，其中在g)中，每周缓慢增加甲胺。

14.根据权利要求5至13中任一项所述的方法，其中在g)中，将甲胺从0.05g/L增加至12g/L。

15.根据权利要求5至14中任一项所述的方法，其中相对于在不具有甲胺的选择性培养基中的生长速率，e)中甲胺的量足以使生长速率抑制25％至75％。

16.根据权利要求5至15中任一项所述的方法，其中追踪生长速率包括测量细胞的光密度或测量在选择性培养基上生长的细胞的菌落尺寸。

17.根据权利要求5至16中任一项所述的方法，其中g)中重复的次数为5至20。

18.一种分离的酵母，其通过权利要求5至17中任一项所述的方法产生。

19.一种分离的酵母菌株，其以保藏号140515-01(RBAR-01)保藏于加拿大国际保藏中心(IDAC)。

20.一种分离的酵母菌株，其以保藏号140515-02(RBAR-02)保藏于加拿大国际保藏中心(IDAC)。

21.一种分离的酵母菌株，其以保藏号140515-03(RBAR-03)保藏于加拿大国际保藏中心(IDAC)。

22.一种用于在食物制备或加工期间减少天冬酰胺的方法，其包括在食物制备或加工条件下向食物中添加权利要求1至4或18至21中任一项所述的酵母菌株；其中所述酵母在所述食物制备或加工期间减少天冬酰胺。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述酵母菌株是无活性的。

24.根据权利要求22所述的方法，其中所述酵母菌株是新鲜的。

25.根据权利要求22所述的方法，其中所述酵母菌株是活性干酵母。

26.根据权利要求22至25中任一项所述的方法，其中食物产品是基于植物的食物产品、饮料、烘培产品、谷物产品、水果、豆类、乳品或肉类产品。

27.根据权利要求26所述的方法，其中在食物制备或加工条件下向食物中添加所述酵母菌株包括用所述酵母菌株替代酵母成分。

28.根据权利要求26所述的方法，其中在食物制备或加工条件下向食物中添加所述酵母菌株包括发酵。

29.根据权利要求26所述的方法，其中所述食物产品是马铃薯产品或马铃薯基产品。

30.根据权利要求29所述的方法，其中在食品制备或加工下向食物中添加所述酵母菌株包括在烹制之前将所述马铃薯产品或马铃薯基产品预浸泡在水和所述酵母菌株的混合物中。

31.根据权利要求26所述的方法，其中所述饮料是咖啡。

32.根据权利要求31所述的方法，其中向食物制备或加工中添加所述酵母菌株包括：在烘烤之前，将咖啡豆浸泡在已经用所述酵母菌株预处理以减少天冬酰胺的咖啡豆提取物中，使得经预处理的提取物消耗咖啡豆中的天冬酰胺。

33.一种含有减少的天冬酰胺或丙烯酰胺浓度的食物产品，其使用权利要求1至4或18至21中任一项所述的酵母菌株产生。

34.一种含有减少的天冬酰胺或丙烯酰胺浓度的食物产品，其使用权利要求22至32中任一项所述的方法产生。