JP2018516599A - ポックスウイルス由来のプロモーターおよびそれを含むベクター - Google Patents
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Abstract
Description
技術的課題
本発明の目的は、高い発現レベルで標的遺伝子を発現できるポックスウイルスのための遺伝子発現調節核酸分子を提供することである。
本発明は、ポックスウイルスについてのプロモーター、プロモーターを含むウイルスベクター、疾患の治療および予防におけるウイルスベクターの使用に関する。治療薬剤の効能は、高いレベルの遺伝子発現により増強され得る。
以下、本発明を実施例によってより詳細に説明する。以下の実施例は、その範囲を限定することなく本発明をさらに説明することを意図する。
1−1:プロモーター遺伝子の取得およびプラスミドの構築
各プロモーターを遺伝子合成を通して得た。ヌクレオチド配列は、下記であった。遺伝子合成はMacrogenに依頼し、かつBioautomation, Inc.のMM192Eをシンセサイザーとして使用した。プロモーター遺伝子は、WRゲノムDNA配列(GenBank:AY243312.1)に基づき、かつ各プロモーターの配列は下記表2で示される。
実施例1−1で生成された8種のプラスミドそれぞれにおいて発現されるルシフェラーゼタンパク質の量は、プロモーター活性を評価するために測定した。pI1L、pE3L、pC11R、pF11L、およびpB19Rプロモーターを含むプラスミド、ならびにコントロール群として既知のp7.5、pE/Lおよびp11プロモーターを含有するプラスミドを使用した。
プロモーターの活性を高めるために、組み換えプロモーターは、実施例1−2におけるシングルプロモーターとして最も高い活性を示したI1Lプロモーターと比較的高い活性を示したE3LまたはB19Rプロモーターとを組み合わせることにより生成した。各プロモーターは、実施例1−1と同様にして合成し、かつそのヌクレオチド配列は、下記のようにした。
実施例1−3において生成された3種のプラスミドにおいて発現されるルシフェラーゼタンパク質の量は、プロモーター活性を評価するために測定した。
3−1:ウイルスベクターのためのシャトルベクター構築
組み換えプロモーターが導入されたプラスミドを使用して測定されたプロモーターの活性評価の結果が、同様にウイルスに適用され得るかどうかを試験するために、本発明に係るウイルスプロモーターおよびレポーター遺伝子ルシフェラーゼは、TK遺伝子が除去されたウイルスシャトルベクターpSP72−TK(−)に共に導入した。
野生型ワクチニアウイルスと共に、実施例3−1において調製された組み換えシャトルベクターを細胞に導入して組み換えウイルスを調製した。組み換えワクチニアウイルスは、相同組み換えによりワクチニアウイルスのTK遺伝子位置に挿入することにより調製した。
感染性ウイルスの濃度は、培養宿主細胞の50%に感染するウイルスの希釈濃度、すなわち50%組織培養感染量(TCID50)により示される。ウイルスのポテンシー(potency)はTCID50法を使用して測定し、組み換えウイルスの特性を解析した。
ゲノムDNA PCRを行うためにウイルスのゲノムDNAを抽出し、TK遺伝子の代わりに挿入された導入遺伝子のサイズをPCRにより確認した。組み換えは、野生型ウイルスIHD−Wとの比較により確認した。
実施例3−2で構築された組み換えワクチニアウイルスTK(−)−p7.5−Luc、TK(−)−pI1L−E3L−Luc、TK(−)−pI1L−B19R−Lucをヒト子宮頸がん細胞系列HeLaまたはヒト結腸がん細胞系列SW620に感染させ、それぞれのプロモーターにより調節されるルシフェラーゼの発現レベルを解析した。
Claims (16)
- 配列番号1、配列番号2および配列番号3のポリヌクレオチドからなる群から選択される2以上のポリヌクレオチドを含む、核酸分子。
- 配列番号1のポリヌクレオチド;および
配列番号2および配列番号3のポリヌクレオチドからなる群から選択される1以上のポリヌクレオチドを含む、請求項1に記載の核酸分子。 - 5’から3’方向で、配列番号1のポリヌクレオチドの3’末端に結合している配列番号2および配列番号3のポリヌクレオチドからなる群から選択される1以上のポリヌクレオチドを含む、請求項2に記載の核酸分子。
- 少なくとも1つの末端で制限酵素認識部位をさらに含む、請求項2に記載の核酸分子。
- 配列番号9または配列番号10のポリヌクレオチドを含む、請求項1に記載の核酸分子。
- 哺乳動物細胞において標的遺伝子の転写を誘導できるプロモーターである、請求項1に記載の核酸分子。
- 哺乳動物細胞の細胞質において発現される標的遺伝子のプロモーターである、請求項6に記載の核酸分子。
- 請求項1−7のいずれか一項に記載の核酸分子を含むベクター。
- ウイルスである、請求項8に記載のベクター。
- ポックスウイルス科のウイルスに由来する、請求項9に記載のベクター。
- ポックスウイルス科のウイルスが、オルソポックスウイルス、アビポックスウイルス、パラポックスウイルス、カプリポックスウイルス、およびスイポックスウイルス属のウイルスからなる群から選択される、請求項10に記載のベクター。
- ポックスウイルスが、ワクチニアウイルスである、請求項10に記載のベクター。
- 核酸分子に結合している標的遺伝子をさらに含む、請求項8に記載のベクター。
- 標的遺伝子が、腫瘍抗原、免疫応答誘導因子、腫瘍増殖抑制因子、アポトーシス誘導因子、または腫瘍組織におけるウイルスの活性の増強を助けることができる因子をコードするポリヌクレオチドである、請求項13に記載のベクター。
- 請求項1−7のいずれか一項に記載の核酸分子を含むベクターで形質転換された、宿主。
- 微生物、哺乳動物、哺乳動物細胞、または哺乳動物由来の細胞系列である、請求項15に記載の宿主。
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