JP2018515742A

JP2018515742A - 癌のｃｄ４＋ｔヘルパー１型応答の監視方法および免疫回復

Info

Publication number: JP2018515742A
Application number: JP2016558088A
Authority: JP
Inventors: ジェイツェルニキブライアン; ケイコスキガリー; ダッタジャショディープ
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2015-03-13
Filing date: 2016-03-04
Publication date: 2018-06-14
Also published as: CN107533065A; CA2979676A1; WO2016153761A1

Abstract

癌を発症した、またはおそれのある哺乳動物被験体を診断または治療するための方法であって：前記被験体の血液試料由来の抗原提示細胞（ＡＰＣ）またはその前駆体及びＣＤ４＋Ｔ細胞から、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）の分泌を引き起こす循環抗癌ＣＤ４＋Ｔｈ１応答を生成するステップ；及び前記抗癌ＣＤ４＋Ｔｈ１応答を検出して前記応答が抑制されたかを決定するステップ；を含む方法。ＨＥＲ２特異的ＣＤ４＋のＴｈ１免疫応答の回復を、その必要のあるＨＥＲ２陽性乳癌患者において行う方法であって：前記患者の抗ＨＥＲ２ＣＤ４＋Ｔｈ１応答を上昇させるために、免疫原性ＨＥＲ２ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドをパルスした自己ＤＣを含有する治療的有効量のＤＣワクチンを前記患者に投与（ＤＣワクチン接種）するステップ；及び前記応答の増加量を決定するために、前記患者のＤＣワクチン接種前後の前記抗ＨＥＲ２ＣＤ４＋Ｔｈ１応答を測定するステップ；を含む方法。

Description

優先権主張

この出願は２０１４年３月１４日に出願された米国仮特許出願シリアル番号６１／９５３７２６から優先権を主張し利益を得る。

承認
本発明は、国立衛生研究所により授与された助成金番号Ｒ０１ＣＡ０９６９９７の下で部分的に政府の支援で開発された。政府は本発明において一定の権利を有する。

本発明の実施形態は、癌における免疫応答の進行性の喪失、特に、ＨＥＲ２駆動乳癌における抗ＨＥＲ２／ｎｅｕＣＤ４^＋Ｔヘルパー１型（Ｔｈ１）応答の損失及びその回復、ならびにそれに基づく診断監視方法、治療方法及びツールを対象とする。

乳がん（ＢＣ）は、世界中の癌関連死亡率の主因である。Ｊｅｍａｌ，Ａ．，ｅｔａｌ，ＧｌｏｂａｌＣａｎｃｅｒＳｔａｔｉｓｔｉｃｓ．ＣＡ：ＡＣａｎｃｅｒＪｏｕｒｎａｌｆｏｒＣｌｉｎｉｃｉａｎｓ６１：６９−９０（２０１１）を参照。遺伝子発現符号の発達により、乳房腫瘍の少なくとも４つの広範な表現型：管腔Ａ及びＢ、基底様、及びヒト上皮成長因子受容体２／ｎｅｕ（ＨＥＲ２^ｐｏｓ）が、現在認められている。Ｐｅｒｏｕ，ＣＭ．，ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ４０６：７４７−５２（２０００）を参照。ＢＣの約２０〜２５％を含むいくつかの腫瘍タイプの分子オンコドライバーである、ＨＥＲ２の過剰発現（Ｍｅｒｉｃ，Ｆ．，ｅｔａｌ，Ｊ．ＡｍＣｏｌｌ．Ｓｕｒｇ．１９４：４８８−５０１（２００２））は、高悪性度の臨床経過、化学療法に対する耐性、及びＢＣにおける不十分な全体的な予後と関連している。Ｈｅｎｓｏｎ，Ｅ．Ｓ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎ．Ｒｅｓ．１２：８４５−５３（２００６）（Ｈｅｎｓｏｎ，ｅｔａｌ）及びＷａｎｇ，Ｇ．Ｓ．，Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．Ｒｅｐ．６：（４）：７７９−８２（２０１２）（Ｗａｎｇ，Ｇ．Ｓｅｔａｌ．）を参照。初期のＢＣでは、ＨＥＲ２過剰発現は強化された侵襲性（Ｒｏｓｅｓ，Ｒ．Ｅ．，ｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＥｐｉｄｅｍｉｏｌ．Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ＆Ｐｒｅｖ．１８（５）：１３８６−９（２００９））、腫瘍細胞の遊走（Ｗｏｌｆ−Ｙａｄｌｉｎ，Ａ．，ｅｔａｌ，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＳｙｓｔｅｍｓＢｉｏｌｏｇｙ２：５４（２００６））、及び血管新生因子（Ｗｅｎ，Ｘ．Ｆ．，ｅｔａｌ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ２５：６９８６−９６（２００６））の発現と関連しており、腫瘍原生環境を促進することにおけるＨＥＲ２の重要な役割を示唆している。化学療法との併用で、ＨＥＲ２標的療法（すなわち、ハーセプチン（登録商標）／トラスツズマブ）、は、ＨＥＲ２^ｐｏｓＢＣ患者において大幅に改善された生存率を有する（Ｐｉｃｃａｒｔ−Ｇｅｂｈａｒｔ．，Ｍ．Ｊ．，ｅｔａｌ，Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５３：（１６）：１６５９−７２（２００５））（Piccart-Gebhart et al.）けれども、患者のかなりの割合が、このような治療に耐性を持つようになる（Ｐｏｈｌｍａｎｎ，Ｐ．Ｒ．，ｅｔａｌ，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎ．Ｒｅｓ．１５：７４７９−９１（２００９）（Ｐｏｈｌｍａｎ，ｅｔａｌ．））。ＨＥＲ２標的療法に対する応答速度を向上させるための新たなアプローチと同様に、治療不全のリスクが高い患者のサブグループを同定する戦略が必要とされている。

多くの証拠は、腫瘍微小環境における頑強な細胞性免疫応答がＢＣ、特にＨＥＲ２^ｐｏｓサブタイプ、での改善された転帰に関連していることを示す。Ａｌｅｘｅ．，Ｇ．，ｅｔａｌ．，Ｃａｎ．Ｒｅｓ．６７：１０６６９−７６（２００７）を参照。そのために、これらの抗腫瘍効果の個々の免疫メディエーターを解明することに進歩が見られている。歴史的に、細胞傷害性ＣＤ８^＋Ｔリンパ球（ＣＴＬ）が、抗腫瘍免疫の主要なエフェクターであると考えられたが（Ｍａｈｍｏｕｄ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔａｌ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２９：１９４９−５５（２０１１））、ＨＥＲ２駆動ＢＣにおいてペプチドワクチンでＣＴＬ応答をブーストすると、最小限の臨床的影響をもたらした（Ａｍｉｎ．，Ａ．，ｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＩｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５７（１２）：１８１７−２５（２００８））、おそらく、Ｂｏｓ，Ｒ．，ｅｔａｌ，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．７０：８３６８−７７（２０１０）によって報告されたように、ＣＴＬは適切なＣＤ４^＋Ｔリンパ球の助けなしに準最適に機能するからである。ＣＴＬの発生及び持続のために重要であることに加えて、ＣＤ４^＋Ｔヘルパー（Ｔｈ）細胞は、直接細胞傷害性殺腫瘍活性、抗腫瘍サイトカイン応答の変調、および長期的な免疫記憶の増強を含む、他のメカニズムを通して抗腫瘍作用を媒介する（Ｃｉｎｔｏｌｏ，Ｊ．Ａ．，ｅｔａｌ，ＦｕｔｕｒｅＯｎｃｏｌ．８：１２７３−９９（２０１２））。免疫グロプリンのクラススイッチを促進することによって、Ｔｈ細胞はまた、体液性抗腫瘍免疫およびエフェクターＢ細胞応答に寄与する。Ｐａｒｋｅｒ，Ｄ．Ｃ．，ｅｔａｌ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：３３１−６０（１９９３）（Ｐａｒｋｅｒ，ｅｔａｌ．）を参照。実際、腫瘍微小環境中のインターフェロン（ＩＦＮ）−γ産生ＣＤ４^＋Ｔヘルパー１型（Ｔｈ１）細胞の浸潤は、ＢＣにおける予後の改善と関連している。Ｇｕ−Ｔｒａｎｔｉｅｎ，Ｃ，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖ．１２３：２８７３−９２（２０１３）を参照。

Ｈｅｎｓｏｎ，Ｅ．Ｓ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎ．Ｒｅｓ．１２：８４５−５３（２００６）（「Ｈｅｎｓｏｎ，ｅｔａｌ」）Ｗａｎｇ，Ｇ．Ｓ．，Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．Ｒｅｐ．６：７７９−８２（２０１２）Ｒｏｓｅｓ，Ｒ．Ｅ．，ｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＥｐｉｄｅｍｉｏｌ．Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ＆Ｐｒｅｖ．１８（５）：１３８６−９（２００９）Ｗｏｌｆ−Ｙａｄｌｉｎ，Ａ．，ｅｔａｌ，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＳｙｓｔｅｍｓＢｉｏｌｏｇｙ２：５４（２００６）Ｗｅｎ，Ｘ．Ｆ．，ｅｔａｌ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ２５：６９８６−９６（２００６）Ｐｉｃｃａｒｔ−Ｇｅｂｈａｒｔ．，Ｍ．Ｊ．，ｅｔａｌ，Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５３：１６５９−７２（２００５）Ｐｏｈｌｍａｎｎ，Ｐ．Ｒ．，ｅｔａｌ，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎ．Ｒｅｓ．１５：７４７９−９１（２００９）Ｇｕ−Ｔｒａｎｔｉｅｎ，Ｃ，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖ．１２３：２８７３−９２（２０１３）

ＨＥＲ２駆動の乳房腫瘍形成における全身抗ＨＥＲ２ＣＤ４^＋Ｔｈ１応答の役割は、しかし、不明なままである。トラスツズマブと化学療法によるＨＥＲ２標的治療に対する応答速度を改善するアプローチと同様に、治療不全のリスクが高い患者のサブグループを予測する戦略のための、満たされていない必要性が残っている。したがって、１つまたはそれ以上の本発明の実施形態は、本明細書で特定された問題の一つ以上に対処することを対象にする。

ある広範な態様において、癌を発症した、またはおそれのある哺乳動物被験体を診断または治療するための方法であって：前記被験体の血液試料由来の抗原提示細胞（ＡＰＣ）またはその前駆体及びＣＤ４^＋Ｔ細胞から、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）の分泌を引き起こす循環抗癌ＣＤ４^＋Ｔｈ１応答を生成するステップ；及び前記抗癌ＣＤ４^＋Ｔｈ１応答を検出して前記応答が抑制されたかを決定するステップ；を含む方法が提供される。

別の態様において、前記生成ステップがさらに：前記血液試料から非培養の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離するステップ；及び前記ＰＢＭＣおよびその中のＡＰＣ前駆体の単球を、前記被験体が罹患した癌の種類に基づく免疫原性ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドを含む組成物でパルスし、それによって前記ＰＢＭＣにおけるＣＤ４^＋Ｔｈ１細胞を活性化してＩＦＮ−γを分泌させるステップ；を含み、ならびに前記検出ステップが、前記分泌されたＩＦＮ−γを検出するステップ；を含む。

代替の態様において、前記生成ステップがさらに：前記被験体試料由来の精製したＣＤ４^＋Ｔ細胞を、前記被験体が罹患した癌の種類に基づく免疫原性ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドを含む組成物でパルスした前記被験体試料由来のＡＰＣ、未成熟または成熟樹状細胞（ＤＣ）とともに共培養し、それにより、前記ＣＤ４^＋Ｔ細胞を活性化してＩＦＮ−γを分泌するステップ；を含み、前記検出ステップが前記分泌されたＩＦＮ−γを検出するステップを含む。

ほかの態様において、前記癌が、乳癌、脳腫瘍、膀胱癌、食道癌、肺癌、膵臓癌、肝臓癌、前立腺癌、卵巣癌、結腸直腸癌、および胃癌から成る群から選択される、またはそれらの任意の組み合わせである。

ほかの態様において、前記癌がＨＥＲ２発現である。

さらなる態様において、前記癌がＨＥＲ２陽性乳癌であり、前記被験体がヒト女性であり、そして前記免疫原性ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドがＨＥＲ２分子に基づく。

好ましい実施形態において、前記組成物がさらに：ペプチド４２〜５６（配列番号：１）；ペプチド９８〜１１４（配列番号：２）；ペプチド３２８〜３４５（配列番号：３）；ペプチド７７６〜７９０（配列番号：４）；ペプチド９２７〜９４１（配列番号：５）；およびペプチド１１６６〜１１８０（配列番号：６）；を含むＨＥＲ２ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドを含む。

好ましい実施形態において、前記ＩＦＮ−γの産生が、ＩＦＮ−γ酵素結合免疫アッセイ（ＥＬＩＳＰＯＴ）によって測定される。

ほかの態様において、ＨＥＲ２特異的ＣＤ４^＋のＴｈ１免疫応答の回復を、その必要のあるＨＥＲ２陽性乳癌患者において行う方法であって：前記患者の抗ＨＥＲ２ＣＤ４^＋Ｔｈ１応答を上昇させるために、免疫原性ＨＥＲ２ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドをパルスした自己ＤＣを含有する治療的有効量のＤＣワクチンを前記患者に投与（ＤＣワクチン接種）するステップ；及び前記応答の増加量を決定するために上記態様の生成及び検出ステップに従って、前記患者のＤＣワクチン接種前後の前記抗ＨＥＲ２ＣＤ４^＋Ｔｈ１応答を測定するステップ；を含む方法であって、前記回復を行う方法はさらに：１または複数の追加の時間間隔で、上記態様の生成及び検出ステップを行うことにより前記患者のＤＣワクチン接種後の前記抗ＨＥＲ２ＣＤ４^＋Ｔｈ１応答の回復状態を測定して前記応答の回復を監視するステップを含む、方法がある。

ほかの態様において、乳癌または他の癌のために個体をスクリーニングする方法であって：上記態様の生成及び検出ステップに記載の方法に従って前記個体の抗ＨＥＲ２ＣＤ４^＋Ｔｈ１応答を検出して健常な個体と比較して前記応答が抑制されているかを判断するステップ；を含む方法がある。

ほかの態様において、乳癌またはその他の癌を発症するリスクのある個体をスクリーニングする方法であって：上記態様の生成及び検出ステップに記載の方法に従って前記個体の抗ＨＥＲ２ＣＤ４^＋Ｔｈ１応答を検出して健常な個体と比較して前記応答が抑制されているかを判断するステップ；を含む方法がある。

ほかの態様において、ＨＥＲ陽性乳癌患者が、化学療法及びトラスツズマブのような標準的な非免疫療法に十分に応答するかを予測する方法であって：上記態様の生成及び検出ステップに記載の方法に従って、前記患者の抗ＨＥＲ２ＣＤ４^＋Ｔｈ１応答を検出するステップ；を含む方法がある。

ほかの態様において、トラスツズマブ及び化学療法で治療されたＨＥＲ２陽性侵襲性乳癌（ＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣ）患者における新しい乳房イベントを予測する方法であって：上記態様の生成及び検出ステップに記載の方法に従って、前記患者の前記抗ＨＥＲ２ＣＤ４^＋Ｔｈ１応答を測定して前記応答が抑制されたかを判断するステップ；を含む方法がある。

ほかの態様において、ＨＥＲ２陽性乳癌患者において術前補助療法のトラスツズマブ及び化学療法（Ｔ／Ｃ）後のＨＥＲ２陽性乳癌の病理学的応答を予測する方法であって：上記態様の生成及び検出ステップに記載の方法に従って、前記Ｔ／Ｃ治療後の前記患者における抗ＨＥＲ２ＣＤ４^＋Ｔｈ１応答の程度を測定して、前記応答が、術前補助療法の病理学的完全奏効（術後の病理で残存浸潤性乳癌がない）と関連する有意に高い抗ＨＥＲ２ＣＤ４^＋Ｔｈ１応答であるか、又は非病理学的完全奏効に関連するより低い応答であるかを判断するステップ；を含み、さらに、前記患者における非病理学的完全奏効の場合には、前記患者の抗ＨＥＲ２ＣＤ４^＋Ｔｈ１応答が、ＤＣワクチン接種によって回復される、方法がある。

さらにほかの広範な態様において、癌を有するまたは発症するリスクがある哺乳動物被験体を診断または治療するための方法であって：前記被験体から血液を得るステップ；その後抗癌ＣＤ４^＋Ｔｈ１応答の抑制を測定する血液検査を行うステップ、及び、抑制の場合には；前記被験体にＤＣワクチン、トラスツズマブのような標的癌治療、化学療法のような従来の癌治療、外科手術及び放射線照射からなる群から選択される癌治療薬を有効量で投与するステップ；を含む、方法がある。

ほかの態様において標的乳がん治療に加えて化学療法を完了した後に前記癌の再発リスクを評価するためにＨＥＲ^ｐｏｓＩＢＣ患者を監視する方法であって、上記態様の生成及び検出ステップに記載の方法に従って、前記治療後の患者における抗ＨＥＲ２ＣＤ４^＋Ｔｈｌ応答度を測定して前記応答が前記癌の再発と相関する有意に抑制された抗ＨＥＲ２ＣＤ４^＋Ｔｈｌ応答か又は非再発と相関するより高い抗ＨＥＲ２ＣＤ４^＋Ｔｈｌ応答かを決定するステップを含む、方法がある。さらなる態様において、前記標的治療は、前記患者への薬剤トラスツズマブの投与を含む。

例示的な実施形態のより良い理解のために、それらの他の及びさらなる特徴および利点とともに、参照は、添付の図面と併せて、以下の記載に言及し、そして請求される実施形態の範囲は、添付の特許請求の範囲において指摘されるであろう。

添付の図面と併せて読むと、好ましい実施形態の以下の詳細な説明がより良く理解されるであろう。実施形態を説明するために、図面において示される現在好ましい実施例がある。しかしながら、好ましい実施形態は、図面に示された正確な配置および手段に限定されないことが理解されるべきである。

図１は、本明細書に記載の参考例研究に含まれる患者／ドナー群を示す階層図である。コホートをＡ〜Ｈでラベルする。採血時と同様に、コホートＧ及びＨの治療予定を、赤色のコールアウトボックスに示す。具体的には、Ｔ／Ｃ治療ＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣコホート（Ｇ）において、患者は術前補助Ｔ／Ｃ（続いて手術がある）及び術後補助トラスツズマブの完了のいずれの治療も受けた：患者を手術−最初のアプローチが完了した術後補助Ｔ／Ｃのために選択した。術後補助トラスツズマブ療法の完了から６ヶ月未満又は６ヶ月以上のどちらかで採血を行った。図２は、樹状細胞（ＤＣ）ワクチン接種戦略を示す。患者の単球を最初に白血球搬出法及び水簸により、他の白血球細胞から分離する。これらの単球をその後、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）及びインターロイキン（ＩＬ）−４と共に無血清培地（ＳＦＭ）で培養して未成熟樹状細胞（ＩＤＣ又はｉＤＣ）にする。これらの細胞をその後、６個のＨＥＲ２ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドでパルスし、患者に注射して戻す前に完全なＤＣ活性化を達成するためにインターフェロン（ＩＦＮ）−γ及びリポ多糖（ＬＰＳ）を加えて成熟及び活性化プロセスを完了した。Ｆｒａｃｏｌ，Ｍ．，ｅｔａｌ，Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．２０（１０）：３２３３（２０１３）を参照。ＨＬＡ−Ａ２ｐｏｓ患者の場合には、細胞の半分をＭＨＣクラス１結合ペプチドでパルスし、他の半分を異なるＭＨＣクラス１結合ペプチドでパルスした。図３Ａ及び図３Ｂは、ＥＬＩＳＰＯＴのアッセイ間の精度を示すグラフである。図３Ａの研究のために、３つの対応する同型培養を３日以上、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて、既知の様々な抗ＨＥＲ２反応性を有する（異なる記号で表される）５人のドナー由来の試料について実施した。生体外でＨＥＲ２細胞外ドメイン（ＥＣＤ）ペプチドミックス（（ペプチド４２〜５６（配列番号：１）、ペプチド９８〜１１４（配列番号：２）、及びペプチド３２８〜３４５（配列番号：３）））で刺激したドナーを対象とした累積抗ＨＥＲ２Ｔｈ１応答（平均ＳＦＣ（スポット形成細胞）／２ｘｌ０^５細胞）に対して、分散係数の平均（ＣＶ平均）をプロットした。エラーバーは、複製物の標準偏差（ＳＤ）を表す。図３Ｂは、アッセイ間の変動性の尺度として、各ドナー（異なる記号で表される）を対象とした累積Ｔｈ１応答（平均ＳＦＣ／２ｘｌ０^５細胞）に対してプロットした、別々の日の３個のアッセイの標準偏差（ＳＤ）を示す。実線は、平行点線で示される回帰の９５％信頼区間を伴う、生成されたＳＤの線形回帰を表す。図４は、ＥＬＩＳＰＯＴの直線性を示すグラフを示す。２人の高応答ＨＥＲ２反応性ドナー（ドナー＃１、（三角形）とドナー＃２、（円））由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の３通りの試料をシリアル既知の同種異系非ＨＥＲ２応答者（すべてのアッセイを対象として同じＰＢＭＣドナー）由来のＰＢＭＣに連続的に希釈し、そしてＨＥＲ２ＥＣＤペプチド混合物（ペプチド４２〜５６（配列番号：１）、ペプチド９８〜１１４（配列番号：２）、及びペプチド３２８〜３４５（配列番号：３））を用いて生体外で刺激した。未刺激の背景は、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおける各希釈ポイントについて差し引いた。図５Ａ〜５Ｄは、抗ＨＥＲ２ＣＤ４^＋Ｔｈ１応答およびＩｇＧ１／ＩｇＧ４の反応がＨＥＲ２^ｐｏｓ乳房腫瘍形成において進行的に失われていることを示す。図５Ａは、全身のＣＤ４^＋Ｔ細胞及び抗ＨＥＲ２ＣＤ４^＋Ｔｈ１応答のＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ分析のヒストグラム（左のパネル）を示す；患者群間での対応する対応する事後シェフェｐ値の比較をヒストグラム（右パネル）と並んで示す。研究患者群は、ＨＤ（健康なドナー）；ＢＤ（良性の乳房生検）；ＨＥＲ２^ｎｅｇＤＣＩＳ；ＨＥＲ２^ｎｅｇＩＢＣ（明確なＨＥＲ２^ｎｅｇ（ＨＥＲ２、０および１＋）浸潤性乳癌）；ＨＥＲ２^ｐｏｓＤＣＩＳ（インサイツＨＥＲ２^ｐｏｓの乳管癌）；およびＨＥＲ２^ｐｏｓＩＢＣ（ステージＩ／ＩＩＨＥＲ２^ｐｏｓ浸潤性乳癌）：であった。上のヒストグラムは全体の抗ＨＥＲ２応答（１００％）（１以上の反応性ペプチドに応答する患者の割合）を示す（抗ＨＥＲ２応答性とも呼ばれる）。中央のヒストグラムは、反応性ペプチドの平均数（ｎ）を示す（前記群の患者が全体として反応する、反応性ペプチドの平均数（ｎ））（応答レパートリーとも呼ばれる）；そして、下のヒストグラムは平均総ＳＦＣ／１０^６細胞（各被験者群由来のすべての６個のＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドからの反応性スポットの総和（ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ解析による１０^６個の細胞あたりのスポット形成細胞ＳＦＣ）を示す（累積応答とも呼ばれる）（すべての分散分析でｐ＜０．００１）。抗ＨＥＲ２応答性、応答レパートリー、および累積応答によって評価した場合、ＨＥＲ２^ｐｏｓ乳房腫瘍形成におけるＣＤ４^＋Ｔｈ１応答の進行性の喪失が示されている（すなわち、ＨＤ／ＢＤ→ＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＤＣＩＳ→ＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣ）。Ｔｈ１応答の差異はＨＥＲ２^ｎｅｇ−ＤＣＩＳ及びＨＥＲ２^ｎｅｇ−ＩＢＣ（ＩＨＣ０／１＋）ならびにＨＤ／ＢＤの被験者の間で見られなかった。図５Ｂは、Ｔ／Ｃ治療したＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣ患者群を加えた（Ｔ／Ｃは、トラスツズマブ及び化学療法を意味する）、図５Ａと同様のそれぞれの患者群におけるＥＬＩＳＰＯＴによるＩＦＮ−γ産生（累積応答（平均総ＳＦＣ／２ｘ１０^５細胞））を示す。結果を、箱ひげ図において２ｘ１０^５細胞あたりの中央値±四分位範囲（ＩＱＲ）ＩＦＮ−γＳＦＣとして提示する。図５Ｃは、ドナーの年齢によって層別化した（５０歳未満Ｖ．５０歳以上）ＨＤ／ＢＤにおける抗ＨＥＲ２Ｔｈ１累積応答の変動のヒストグラム（左上のパネル）、閉経状態（閉経前Ｖ．閉経後）（右上のパネル）、人種（白人Ｖ．他）（左下パネル）および妊娠回数（ゼロＶ．＞１妊娠）（右下パネル）それぞれのＴｈ１内で、結果は割合または平均値（±ＳＥＭ）として表現される。図５Ｄは、組換えＨＥＲ２ＥＣＤペプチドに対する血清反応性のＥＬＩＳＡの結果を示す。ＥＬＩＳＡ測定値を１：１００の血清希釈液で光学密度（ＯＤ）として示す（水平直線が平均ＯＤを示す、グループ化された散布図）。抗ＨＥＲ２のＩｇＧ１抗体レベル（上のパネル）及び抗ＨＥＲ２ＩｇＧ４の抗体レベル（下のパネル）を、ＨＤ（円／左）、ＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＤＣＩＳ（四角／中央）、およびＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣ（三角／右）患者で測定した（^＊＊＊適用可能な場合は事後シェフェテストを伴う独立ｔ検定または分散分析によりｐ＜０．００１）。有意に上昇した抗ＨＥＲ２ＩｇＧ１およびＩｇＧ４の抗体レベルは、ＨＤと比較してＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣ患者に存在し、ＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＤＣＩＳ患者では減衰した。図６はＨＥＲ２^ｐｏｓ乳房腫瘍形成における累積ＣＤ４^＋Ｔｈ１免疫に対する個々のＨＥＲ２ペプチドの寄与が、ＨＤ（健康なドナー）；ＢＤ（良性の乳房生検）；ＨＥＲ２^ｎｅｇＤＣＩＳ；ＨＥＲ２^ｎｅｇＩＢＣ（明確なＨＥＲ２ｎｅｇ（ＨＥＲ２、０および１＋）浸潤性乳癌）；ＨＥＲ２^ｐｏｓＤＣＩＳ（インサイツＨＥＲ２^ｐｏｓの乳管癌）；及び、ＨＥＲ２^ｐｏｓＩＢＣ（ステージＩ／ＩＩＨＥＲ２^ｐｏｓ浸潤性乳癌）の患者にとって、免疫彫刻（ｉｍｍｕｎｅｓｃｕｌｐｔｉｎｇ）を反映するものではない。ＨＥＲ２細胞外ドメイン（ＥＣＤ）−制限ペプチドおよび細胞内ドメイン（ＩＣＤ）−制限ペプチドを使用した。Ｔｈ１反応性プロファイルは、ＥＣＤペプチド４２〜５６（ＥＣＤｐ４２〜５６）（配列番号：１）（左上）、ＥＣＤペプチド９８〜１１４（ＥＣＤＰ９８〜１１４」）（配列番号：２）（中央左）及びＥＣＤペプチド３２８〜３４５（ＥＣＤｐ３２８〜３４５）（配列番号：３）（左下）に対して、ならびにＩＣＤペプチド７７６〜７９０（ＩＣＤｐ７７６〜７９０）（配列番号：４）（右上）、ＩＣＤペプチド９２７〜９４１（ＩＣＤｐ９２７〜９４１）（配列番号：５）（右中央）及びＩＣＤペプチド１１６６〜１１８０（ＩＣＤｐ１１６６〜１１８０）（配列番号：６）（右下）に対して示される。個々のペプチド特異的な応答は、ＥＬＩＳＰＯＴにより２×１０^５のＰＢＭＣあたりの平均ＩＦＮ−γＳＦＣとして示される。Ｔｈ１反応性プロファイルは、ＨＥＲ２^ｐｏｓ乳房腫瘍形成における（分散分析により、すべてｐ＜０．００５）連続体全体で（ＨＤ→ＢＤ→ＨＥＲ２^ｎｅｇ−ＤＣＩＳ→ＨＥＲ２^ｎｅｇ−ＩＢＣ→ＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＤＣＩＳ→ＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣ）抗ＨＥＲ２Ｔｈ１免疫における有意な段階的な減衰を示す。結果を平均値±ＳＥＭとして表す。図７は、ドナー抗ＨＥＲ２Ｔｈ１応答における最小限の時間的な変動を示す。少なくとも６ヶ月離れて得られた血液サンプルから生成したドナーをマッチさせた抗ＨＥＲ２Ｔｈ１累積応答（左パネル）および応答レパートリー（右パネル）を、対になったＨＤ（緑の三角形；ｎ＝４）及び未治療ＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣ被験者（青い四角、ｎ＝４）のためにプロットした。最小限のドナー内Ｔｈ１応答の変動が、ＨＤおよび未治療ＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣ被験者の両方で時間と共に観察された（全て、ｐ＝ＮＳ）。図８Ａ−８ＥはＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣにおける抗ＨＥＲ２Ｔｈ１の欠乏が免疫能の欠如または免疫抑制表現型の増加に起因せず、しかし、ＩＦＮ−γ：ＩＬ−１０−産生表現型における機能的なシフトに関連することを示す。図８Ａは、ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴで破傷風トキソイドまたはカンジダ・アルビカンスの刺激をリコールする累積Ｔｈ１応答を（平均総ＳＦＣ／１０^５細胞）を測定することによる、ＩＦＮ−γ産生を示す。結果を、箱髭図で２×１０^５個の細胞あたりＩＦＮ−γＳＦＣ中央値±四分位範囲（ＩＱＲ）として提示する。未治療およびＴ／Ｃ治療済みの両方の、ＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣ患者由来のＰＢＭＣは、ＨＤのものと有意差が認められなかった。図８Ｂの上のパネルは、免疫表現型を決定するために、ＨＤ、ＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣ（ステージＩ／ＩＩ）及びＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣｓ／ｐＴ／Ｃ（Ｔ／Ｃ治療した患者）由来のＰＢＭＣを用いた代表的なフローサイトメトリー染色を示す。ＣＤ４^＋（ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋）（上の染色）又はＣＤ８^＋（ＣＤ３^＋ＣＤ８^＋）Ｔ細胞（下の染色）の相対的な割合を下のヒストグラムに図示して表現し、その下のヒストグラムはそれぞれ、患者群：ＨＤ（暗いバー）、ステージＩ／ＩＩＨＥＲ^ｐｏｓ−ＩＢＣ（中間のバー）およびＨＥＲ２ｐｏｓ−ＩＢＣのｓ／ｐＴ／Ｃ（明るいバー）を対象としたＣＤ４^＋（ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋）Ｔ細胞（左）およびＣＤ８^＋（ＣＤ３^＋ＣＤ８^＋）Ｔ細胞（右）の相対的な割合を示す。未治療およびＴ／Ｃ治療後の両方の、ＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣ患者由来のＰＢＭＣは、ＨＤのものと有意差は認められなかった。図８Ｃの上のパネルは、それらの免疫表現型を決定するために、ＨＤ、ＨＥＲ^ｐｏｓ−ＩＢＣ（ステージＩ／ＩＩ）及びＨＥＲ２^ｐｏｓＩＢＣｓ／ｐＴ／Ｃ由来のＰＢＭＣを使用する代表的なフローサイトメトリー染色を示す。制御性Ｔ細胞（Ｔ_ｒｅｇ：ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＦｏｘＰ３^＋）（上の染色）及び骨髄由来のサプレッサー細胞（「ＭＤＳＣ」；ＣＤ１１ｂ^＋ＣＤ３３^＋ＨＬＡ＿ＤＲ−ＣＤ８３⁻）（下の染色）の相対的な割合を下のヒストグラムに図示して表現し、その下のヒストグラムはそれぞれ、患者群：ＨＤ（暗いバー）、ステージＩ／ＩＩＨＥＲ^ｐｏｓ−ＩＢＣ（中間のバー）およびＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣのｓ／ｐＴ／Ｃ（明るいバー）を対象とした制御性Ｔ細胞（Ｔ_ｒｅｇ：ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＦｏｘＰ３^＋）（左）及び骨髄由来のサプレッサー細胞（「ＭＤＳＣ」；ＣＤ１１ｂ^＋ＣＤ３３^＋ＨＬＡ＿ＤＲ−ＣＤ８３⁻）（右）の相対的な割合を示す。未治療およびＴ／Ｃ治療の両方の、ＨＥＲ２ｐｏｓ−ＩＢＣ患者由来のＰＢＭＣは、ＨＤのものと有意差は認められなかった。図８Ｄは、循環ＨＥＲ２特異的ＩＬ−１０産生が患者群の間で差がないことを示す。未治療（ＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣ）およびＴ／Ｃ治療を受けた（ＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣｓ／ｐＴ／Ｃ）の両方の、ＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣ患者由来のＰＢＭＣは、全体的な抗ＨＥＲ２応答性（上）、レパートリー（中央）、および累積応答（下）によって評価された、ＥＬＩＳＰＯＴを介した抗ＨＥＲ２ＩＬ−１０産生においてＨＤと有意差はなかった。結果を割合又は平均値±ＳＥＭとして表現する。図８ＥはＨＥＲ２^ｐｏｓ乳房腫瘍形成における相対的なＨＥＲ２特異的ＩＦＮ−γおよびＩＬ−１０産生を示す。ＨＤ、ＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣ（未治療）、およびＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣｓ／ｐＴ／Ｃ（Ｔ／Ｃ治療）患者における６個のＨＥＲ２ＨＥＲ２クラスＩＩペプチド全体でドナーをマッチさせた累積ＩＦＮ−γ産生およびＩＬ−１０産生（ＳＦＣ／１０^６細胞）を比較した。棒グラフは、ＨＥＲ２抗原特異的反応（上のパネル）およびポジティブコントロール（ＣＤ３またはＣＤ８／２８）（下のパネル）のための患者群；（ＩＦＮ−γ産生（緑）；ＩＬ−１０産生（赤））全体で、ＳＦＣの寄与の割合を介してＩＬ−１０に対するＨＥＲ２特異的ＩＦＮ−γの相対的な割合を示す（グラフに％で示されている）。ＩＬ−１０に対する相対的なＨＥＲ２特異的ＩＦＮ−γの割合は、ＨＤからＴ／Ｃ治療の有無にかかわらずＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣ患者へ有意に減少した。ＩＦＮ−γ：ＩＬ−１０産生比率の絶対値は６．６：１（ＨＤ）から０．９７：１（Ｔ／Ｃ治療）及び０．７４：１（ＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣ）へ、それぞれ変化した（上のパネル）。ＩＦＮ−γ：ＩＬ−１０産生の有意な相対的なシフトはポジティブコントロール（抗ＣＤ３／抗ＣＤ３／ＣＤ２８）（下のパネル）に対して認められなかった。図９Ａ−９Ｂは、抗ＨＥＲ２ＣＤ４^＋ＴＨ１サブセットにおける全身性の損失がＨＥＲ２^ｐｏｓ乳房病変における不均衡な腫瘍周囲のＴリンパ球輸送とは関係ないことを示す。図９Ａは、ＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＤＣＩＳ病変（上）及びＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣ腫瘍（下）由来の組織サンプルの代表的なヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色の２つの写真を示す（倍率バー２５μｍ）。矢印は、免疫組織化学染色によるＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＤＣＩＳ病変（上）と比較して、ＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣ腫瘍の腫瘍周囲の間質（下）で観察されたリンパ球浸潤の相対的な不足を指す。評価可能なＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＤＣＩＳ（ｎ＝１４）及びＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣ（ｎ＝８）における間質性リンパ球浸潤は、隣接するテーブル内の低い（１５％未満の関与）、中等度（１５〜２４％）及び高い（２５％以上）として定量化される。図９Ｂは、代表的なＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＤＣＩＳ（左）及びＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣ（右）病変における多重標識免疫蛍光の結果の４つの写真を示す。ＣＤ４^＋Ｔ細胞（緑色シグナル）の著しい不足が５／５（１００％）のＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣ腫瘍において観察され、そこで優勢な浸潤性および間質性リンパ球浸潤は、ＣＤ８^＋（黄信号）である。比較すると、ＣＤ４^＋Ｔ細胞の浸潤は、主にＤＣＩＳを含有するダクト（４／４腫瘍）で見られた。代表的なＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＤＣＩＳ及びＩＢＣ病変が示され；多重標識された画像は、上記対応するＨ＆Ｅ切片（倍率バー２５μｍ）に示される。図１０Ａ〜１０Ｄは、ＨＥＲ２^ｌｏｗではなく、ＨＥＲ２^ｈｉｇｈのヒトおよびマウス乳癌細胞のＣＤ４^＋Ｔｈ１誘導アポトーシスを示す。図１０Ａは、切断されたカスパーゼ−３の検出のためのウエスタンブロット分析の写真の結果（上のパネル）を示す。ＳＫ−ＢＲ−３細胞を：レーン１）−完全な培地単独（完全培地）；レーン２）−１０^６ＣＤ４^＋Ｔ細胞のみ（ＣＤ４^＋のみ）；レーン３および４）−１０^６ＣＤ４^＋Ｔ細胞に加えて１０^５ＨＥＲ２ＣｌａｓｓＩＩペプチド（ｉＤＣＨ）−または無関係なクラスＩＩＢＲＡＦペプチド（ｉＤＣＢ）−、それぞれをパルスした未成熟ＤＣ（ｉＤＣ）；レーン５および６）−１０^６ＣＤ４^＋Ｔ細胞に加えて１０^５のＨＥＲ２（ＤＣｌＨ）−又はＢＲＡＦ（ＤＣｌＢ）−、それぞれをパルスしたＤＣＩＳ；レーン７）−ＣＤ４^＋１０^６のＤＣｌＨ１０^５＋ＩＦＮ−γ＆ＴＮＦ−α 中性抗体及びレーン８）−ＣＤ４^＋１０^６のＤＣｌＨ１０^５＋ＩｇＧアイソタイプコントロール抗体：と共培養した。ＤＣｌＢ、ｉＤＣＨ、またはｉＤＣＢ群ではなく、ＤＣｌＨ：ＣＤ４^＋Ｔ細胞と共培養したとき、増加したカスパーゼ３の切断は、ＳＫ−ＢＲ−３細胞の用量依存性のアポトーシスを示した。ビンキュリンを、ローディングコントロールとして使用した。表示されたウエスタンブロットは、３回の実験の代表である。中央のパネルのバーグラフ（赤いバー）は、上のパネルのウエスタンブロットレーン１〜６に対応する、アポトーシスの誘導倍率を示す平均カスパーゼ−３／ビンキュリン比±ＳＥＭとして表現した結果を示す（ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて定量化した）。右の棒グラフで（黒いバー）（上のパネルのウエスタンブロットレーン７−８に対応）、バーは、３つの実験に亘るアポトーシス／平均カスパーゼ３／ビンキュリン比±ＳＥＭ（３１．４±５．３％ＩＦＮ−γ／ＴＮＦ−α中和対コントロール）の救出％を表す。ＩｇＧアイソタイプコントロールと比較して、ＣＤ４^＋：ＤＣ１Ｈ−誘導ＳＫ−ＢＲ−３アポトーシスをＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αを中和することによって大幅に救出した。下のパネルは、ＥＬＩＳＡによる、それぞれの共培養におけるＩＦＮ−γ（左ｙ軸）（無地のバー）およびＴＮＦ−α（右ｙ軸）（裏地のバー）の対応する産生を示す。結果は、３回の実験を代表するものであり、ｐｇ／ｍｌで表現される。図１０Ｂは、「ＣＤ４^＋のみ」、「ＣＤ４^＋＋ＤＣ１Ｂ」、および「ＣＤ４^＋＋ＤＣ１Ｈ」細胞群の細胞の写真を示す。アポトーシス細胞をＤＡＰＩ染色により明らかにした。ＣＤ４^＋＋ＤＣ１Ｈ群では、ＣＤ４^＋＋ＤＣ１ＢまたはＣＤ４^＋のみの群と比較したとき、より多くのアポトーシス細胞（アスタリスク）を観察した。棒グラフ（右）は、視覚的な結果と相関するＣＤ４^＋＋ＤＣＨ群を対象としたアポトーシスの２５倍の増加と共に、描写された３つの細胞群のためのアポトーシス細胞のアポトーシス細胞％（誘導倍率）を示す。結果は３回の実験を代表するものであり、平均値アポトーシス細胞％±ＳＥＭとして表した。図１０Ｃは、ＨＥＲ２^ｈｉｇｈＳＫ−ＢＲ−３、ＨＥＲ２^{ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ} ＭＣＦ−７、およびＨＥＲ２^ｌｏｗＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒトＢＣ細胞が一律にＩＦＮ−γ−ＲａおよびＴＮＦ−α−Ｒ１受容体の発現を維持したウエスタンブロット分析の結果である写真を示す。ビンキュリンを、ローディングコントロールとして使用した。図１０ＤはトランスジェニックマウスＨＥＲ２^ｈｉｇｈ乳癌ＴＵＢＯ（上のグラフ）及びＭＭＣ１５（ＨＥＲ２^ｈｉｇｈ）細胞（中央のグラフ）において、組換えマウス（ｒｍ）Ｔｈ１サイトカインｒｍＩＦＮ−γ及びｒｍＴＮＦーαとの併用治療が、未治療の対照（ｎｏＲｘ）又はいずれかのサイトカインを単独で用いた治療と比較して、有意に高いアポトーシスをもたらしたことを示した。この効果は、マウスＨＥＲ２^{ｌｏｗ／ｎｅｇ}細胞４Ｔ１（下のグラフ）における二重のｒｍＩＦＮ−γ＋ｒｍＴＮＦーα治療で再現されなかった。結果は３回の実験を代表するものであり、フローサイトメトリーによるＰＩ^ｐｏｓ／ＡｎｎｅｘｉｎＶ^ｐｏｓ細胞の割合によって検出された、平均アポトーシス細胞％±ＳＥＭとして表した（^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１）。図１１Ａ〜１１ＣはＨＥＲ２^ｌｏｗでなく、ＨＥＲ２^ｈｉｇｈヒトＢＣ細胞がＴｈ１産生サイトカインＩＦＮ−γおよびＴＮＦーαによってＣＤ４^＋Ｔｈ１媒介アポトーシスに感受性が高いことを示す。図１１Ａ（上パネル）は、切断されたカスパーゼ−３の検出のためのウエスタンブロット分析の写真の結果を示す。トランスウェルシステムを使用して、５０ｘ１０^３ＭＣＦ−７（ＨＥＲ２^{ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ}）及び５０ｘ１０^３ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＨＥＲ２^ｌｏｗ）細胞を、培地単独（完全培地）、１０^６ＣＤ４^＋Ｔ細胞単独（ＣＤ４^＋のみ）、及び１０^６ＣＤ４^＋Ｔ細胞に、１０^５のＨＥＲ２（ＤＣ１Ｈ）−またはＢＲＡＦコントロール（ＤＣ１Ｂ）の各々をパルスしたＤＣ１と共培養した。ウエスタンブロットにおいて示された以下の対応する棒グラフ（下のパネル）で表されたカスパーゼ３の切断は、ＤＣ１Ｈ：ＣＤ４^＋Ｔ細胞と共培養したとき、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（右のパネル）でなく、ＭＣＦ−７（左のパネル）の増加したアポトーシスを示した。ビンキュリンを、ローディングコントロールとして使用した。表示されたウエスタンブロットは、３回の実験を代表するものであり、結果は平均カスパーゼ３／ビンキュリン比±ＳＥＭとして表現した（アポトーシスの誘導倍率を示す）。図１１Ｂは、図１０Ａの次の処理条件（［完全培地単独；１０^６ＣＤ４^＋Ｔ細胞単独（ＣＤ４^＋のみ）；ＣＤ４^＋Ｔ細胞に加えて、ＨＥＲ２−パルスｉＤＣ（ｉＤＣＨ）；ＣＤ４^＋Ｔ細胞に加えてＢＲＡＦ−パルスｉＤＣ（ｉＤＣＢ）；ＣＤ４^＋Ｔ細胞に加えて１０^５ＨＥＲ２−パルスＤＣｌ（ＤＣｌＨ）；およびＣＤ４^＋Ｔ細胞に加えて１０^５ＢＲＡＦ−パルスＤＣ１（ＤＣ１Ｂ）］を５０ｘ１０^３ＳＫ−ＢＲ−３細胞と共培養した。）由来の上清とＳＫ−ＢＲ−３細胞を共培養したウエスタンブロットの結果を示す。ＤＣｌＢ，ｉＤＣＨ，ｉＤＣＢ，またはＣＤ４^＋のみの群と比較して、ＤＣｌＨ：ＣＤ４^＋群は比較的高い切断されたカスパーゼ３レベルが検出された。結果は３回の実験を代表するものである。図１１Ｃは、培養ＳＫ−ＢＲ−３（左）、ＭＣＦ−７（中央）、及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（右）を示された量のＴＮＦ−αおよびＩＦＮーαと培養した、切断されたカスパーゼ−３の検出のためのウエスタンブロットの結果の写真（上パネル）を示す。下のパネルのバーグラフのバーが上のパネルに表示されたウエスタンブロットのレーンに対応する。Ｔｈ１サイトカインＩＦＮ−γ及びＴＮＦーαとの併用治療は、未処理の対照と比較して、ＳＫ−ＢＲ−３（ＨＥＲ２^ｈｉｇｈ；１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ−α＋１００Ｕ／ｍＬのＩＦＮ−γ）及びＭＣＦ−７（ＨＥＲ２^{ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ}；１００ｎｇ／ｍＬＴＮＦ−α＋１０００Ｕ／ｍＬＩＦＮ−γ）細胞により大きなアポトーシスをもたらした。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（ＨＥＲ２^ｌ０Ｗ；２００ｎｇ／ｍＬＴＮＦ−α＋２０００Ｕ／ｍＬＩＦＮ−γ）は、二重のＩＦＮ−γ＋ＴＮＦ−α処理により大部分は影響を受けないままだった。結果は、３回の実験を代表するものである。（^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．００１）。図１２Ａ−１２Ｅは、抗ＨＥＲ２ＣＤ４^＋Ｔｈ１免疫がＨＥＲ２標的療法後ではなく、ＨＥＲ２パルスＤＣ１ワクチン接種後に差動的に回復することを示す。図１２Ａは、全体的な抗ＨＥＲ２応答性（上）、応答レパートリー（中央）、及び累積応答（下）によって評価した、未治療ＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣ患者（ｎｏＴｘＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣ）（黒）及びトラスツズマブ及び化学療法を受けているＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣ患者（ｔ／Ｃ治療ＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣ）におけるＣＤ４^＋Ｔｈ１応答のグラフである（赤）。未治療ステージＩ／ＩＩＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣ患者（ｎｏｔｘ）と比較して、抗ＨＥＲ２応答性（上）、レパートリー（中央）、または累積応答（下）によって示される抗ＨＥＲ２Ｔｈ１応答は、ステージＩ−ＩＩＩＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣ患者（Ｔ／Ｃ治療）においてＴ／Ｃ治療後に全体的に増強されなかった。ＨＥＲ２特異的および破傷風（ポジティブコントロール）の刺激後のＩＦＮ−γ：ＩＬ−１０反応性細胞の相対比率（下のパネルのヒストグラムに示される％；ＩＦＮ−γ：無地；ＩＬ−１０：斜線）は、ｔｘなし（ｎ＝５）と比較してＴ／Ｃ治療（ｎ＝５）で改善しなかった。図１２Ｂは、全体的な抗ＨＥＲ２応答性（上）、応答レパートリー（中央）、および累積応答（下）によって評価した、ＨＥＲ２パルスＤＣ１ワクチン接種の直前及び直後（ＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣＰＲＥｖａｘ）（黒）及び（ＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣＰＯＳＴｖａｘ）（緑）それぞれのＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣ患者におけるＣＤ４^＋Ｔｈ１応答のグラフである。１１人のステージＩＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣ（ＰＲＥｖａｘ）患者においてＨＥＲ２パルスＤＣ１ワクチン接種直後に（ＰＯＳＴｖａｘ）、すべての抗ＨＥＲ２Ｔｈ１免疫指標における大幅な改善が観察された。破傷風刺激後のＩＬ：１０反応性細胞に対するＩＦＮ−γの相対的な割合（下のパネルのヒストグラムに示される％；ＩＦＮ−γ：裏地；ＩＬ−１０：斜線）は、認め得るほどに変化しなかった一方、ＰＲＥｖａｘ（ｎ＝５）患者と比較してＰＯＳＴｖａｘ（ｎ＝５）患者において、ＨＥＲ２−パルスワクチン接種はＩＦＮ−γのＩＬ：１０反応性細胞に対する相対的な割合を大幅に増加させた。図１２Ｃは、抗ＨＥＲ２Ｔｈ１免疫へのＤＣワクチン接種およびトラスツズマブ／化学療法のステージを一致させた効果を示す。ＡＪＣＣステージＩ未治療（Ｎｏｔｘ）、Ｔ／Ｃ治療（Ｔ／Ｃ治療）、およびＨＥＲ２−パルスＤＣ１ワクチン接種（ＰＯＳＴ−ｖａｘ）ＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣ患者間での一致させた比較を全体的な抗ＨＥＲ２応答（上）、応答レパートリー（中央）、および累積応答（下）によって評価した。Ｔ／Ｃ治療でなく、ＨＥＲ２パルスＤＣ１予防接種後の差動的なＴｈ１回復は、ステージＩＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣ患者におけるステージを一致させた比較に持続した。結果は割合または平均値±ＳＥＭとして表現した。（^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１）。図１２Ｄ及び１２ＥはＤＣワクチン接種後のＣＤ４^＋Ｔｈ１免疫応答の耐久性を示す。免疫応答を、ステージＩ／ＩＩＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣ患者ＤＣワクチン接種前（ＰＲＥＶＡＣＣＩＮＥ）、ＤＣワクチン接種直後（ＩＭＭＥＤＩＡＴＥＰＯＳＴＶＡＣＣＩＮＥ）及びワクチン接種後６ヶ月以上（≧６ＭＯＰＯＳＴＶＡＣＣＩＮＥ）で比較した。ワクチン接種直後の期間を超えて、この時点（破線の矢印）で、すべての患者における全身性の化学療法の開始／終了にかかわらず、１１人中９人の評価可能なワクチン接種後６ヶ月以上の患者において抗ＨＥＲ２ＣＤ４^＋Ｔｈ１免疫は永続的に増強されたままだった。散布図は、個々のワクチン接種を受けた被験者のための応答レパートリー（図１２Ｄ）及び累積応答（図１２Ｅ）によりＣＤ４^＋Ｔｈ１反応性プロファイルを示す。図１３Ａ−１３Ｅは、Ｔ／Ｃ治療後の抑制された抗ＨＥＲ２Ｔｈ１応答が有害な臨床的および病理学的結果と相関することを示す。図１３Ａ−１３Ｄのグラフは、図１３Ａ−化学療法の配列（術前補助対術後補助）、図１３Ｂ−トラスツズマブの完了から研究への登録までの時間（６ヶ月未満対６ヶ月以上）、図１３Ｃ−エストロゲン受容体の状態（ＥＲ^ｐｏｓ対ＥＲ^ｎｅｇ）及び図１３Ｄ−病理学的状態（Ｉ対ＩＩ対ＩＩＩ）によって層別化するとき、Ｔ／Ｃ治療ＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣ患者のサブグループ解析が認め得るほどの抗ＨＥＲ２応答性（上のグラフ）、レパートリー（中央のグラフ）、または累積応答（下のグラフ）の違いを実証しなかったことを示す。図１３Ｅは、Ｔ／Ｃの完了後乳房イベントが発生しなかった（ＮｏＢＥ）ＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣ患者と比較して、ＢＥが発生した患者（＋ＢＥ）の抗ＨＥＲ２応答（左上のグラフ）及び累積Ｔｈ１応答（左下のグラフ）が大幅に落ち込んだことを示す。術前補助Ｔ／Ｃ後に病理学的完全奏功（ｐＣＲ）を達成したＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣ患者において、抗ＨＥＲ２Ｔｈ１応答レパートリー（右中央のグラフ）及び累積応答（右下のグラフ）は、非−ｐＣＲの患者と比較して有意に大きかった。図１４は、９５人のＨＥＲ２^ｐｏｓ乳癌患者が登録された実験例２のための研究集団のフロー図である。すべての腫瘍は組織学的にＨＥＲ２過剰発現（３＋または２＋／ＦＩＳＨ陽性）の浸潤性乳癌であると確認された。採血時点を赤の吹き出しボックスに示す。トラスツズマブと化学療法（Ｔ＋Ｃ）とで治療したコホートにおける経過観察の中央値は、４４（ＩＱＲ３１）ヶ月だった。図１５Ａ−１５ＤはＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣ非再発および再発患者コホートの抗ＨＥＲ２ＣＤ４^＋Ｔｈ１応答における変化を示す。図１５Ａは、ＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣ乳癌患者コホート（未治療［ｎ＝２２］、再発［ｎ＝２５］、および非再発［ｎ＝４８］）間の抗ＨＥＲ２応答（上のパネル）、応答のレパートリー（中央のパネル）、および累積応答（下のパネル）によって層別化した、ＩＦＮ−γ^＋抗ＨＥＲ２ＣＤ４^＋Ｔ細胞応答の変化を示す。結果を、割合（％）または平均±ＳＥＭとして表現する。＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１事後ボンフェローニテストで、一元配置分散分析のｐ値を並べて表示する。図１５Ｂは、ＥＬＩＳＰＯＴを用いて―抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８刺激（上のパネル）又は破傷風トキソイド（左下パネル）およびカンジダ・アルビカンス（右下のパネル）のリコール刺激に対するＩＦＮ−γ産生を測定することによって−非再発および再発コホート由来のＰＢＭＣの間には、免疫能における有意差が認められなかったことを示す。結果を、中央値±四分位範囲（ＩＱＲ）ＩＦＮ−γＳＦＣ／２×１０^５細胞として提示する。図１５Ｃは、非再発および再発コホートのＰＢＭＣにおけるＨＥＲ２ペプチド特異的ＩＦＮ−γ^＋細胞に対するＴｈ１（Ｔ−ｂｅｔ^＋ＩＦＮ−γ^＋）「Ｔ−ｂｅｔ」対Ｔｈ２（ＧＡＴＡ−３^＋ＩＦＮ−γ^＋）「ＧＡＴＡ−３」表現型の相対的な寄与を示す。ＣＤ４^＋細胞上でゲーティングした後のこれらのグループ内の代表的な染色を示す（上のパネル）；隣接するヒストグラムにおける結果を、示されたとおり平均比率（％）±ＳＥＭとして表す（中央パネル）。下のパネルは、抗ＨＥＲ２のＴｈ１応答性（左）、レパートリー（中央）、および累積応答（右）によって評価した場合、循環ＨＥＲ２特異的ＩＬ−４産生が非再発と再発コホートとの間で変化しないことを示す。結果を比率または平均±ＳＥＭとして表す。図１５Ｄは、フローサイトメトリーによるＴ_ｒｅｇ（ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋のＦｏｘＰ３^＋）の相対的な割合を示す。グループ内の代表的な染色を示す（上のパネル）；隣接ヒストグラムにおける結果を、平均比率（％）±ＳＥＭとして表す（中央パネル）。下のパネルは、ＨＥＲ２特異的なＩＬ−１０産生が、非再発及び再発コホート間で、すべての３個のＴｈ１特定基準全体で類似することを示す。結果を割合または平均±ＳＥＭとして表現する。図１６は、完全に治療されたＨＥＲ２^ｐｏｓ乳癌患者における、抗ＨＥＲ２Ｔｈ１応答性によって層別化された無病生存期間（ＤＦＳ）のＣｏｘ比例ハザードモデルを示すグラフである。Ｔｈ１応答性でない患者は、Ｔｈ１応答性の患者と比較して顕著に亢進したリスク調整後のＤＦＳを示す。

なお、本実施形態の図面、画像および説明が本発明の実施例に見出すことができる多くの他の要素を、明確にする目的で、排除する一方、明確な理解に関連する要素を説明するために簡略化されていることを理解すべきである。関連技術の当業者は、本発明の実施形態を実現するために他の要素が望ましい及び／又は必要であることを認識するであろう。しかしながら、そのような要素は当技術分野でよく知られており、そのような要素は、本発明の実施形態の理解を容易にしないので、そのような要素の議論は、本明細書において提供されない。

「一実施形態」または「実施形態」または実施形態に関連して記載される特定の特徴、構造、または特性を意味する同類のものなどの本明細書全体を通しての参照は少なくとも１つの実施形態に含まれる。したがって、「実施形態において」または「一実施形態では」または本明細書全体を通して様々な場所での同様の語句の出現は必ずしも全てが同じ実施形態に言及されない。

さらに、本開示の原理の理解を促進する目的で、参照は、現在本明細書において示されて記載された実施形態になされ、特定の言語が同じものを説明するために使用されるであろう。それにもかかわらず、本開示の範囲の限定がそれによって意図されないことが理解されるであろう；任意の変更、説明または図示された実施形態のさらなる改変および本明細書に示された本開示の原理のさらなる応用は、本開示が関係する当業者に通常起こるであろうと考慮される。すべての範囲の制限は、一つ以上の発行された特許の最終的な特許請求の範囲に従って、及び最終的な特許請求の範囲で表されるように決定されるべきである。

定義別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、一般的に、本開示の発明の主題が属する技術分野の当業者によって理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または同等の任意の方法および材料を本発明の実施形態の実施または試験に用いることができるが、好ましい方法および材料が記載される。

一般に、本明細書中で使用される用語と、細胞培養、分子遺伝学、有機化学、および核酸化学およびハイブリダイゼーションにおける実験手順は、それらの技術分野でよく知られており、一般的に用いられるものである。

標準的な技術は、核酸及びペプチド合成のために使用される。技術および手順は、一般に、当該技術分野における従来の方法および種々の一般的参考文献（ＳａｍｂｒｏｏｋａｎｄＲｕｓｓｅｌｌ，２０１２，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＡｐｐｒｏａｃｈ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ，ａｎｄＡｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．，２０１２，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ）に従って行われ、これは、本明細書を通じて提供される。

本明細書中で使用される命名法及び以下に記載される分析化学および有機合成で使用される実験手順は、当該技術分野でよく知られており、一般的に使用されるものである。標準技術またはその改良は、化学合成および化学分析に使用される。

本明細書で使用される場合、以下の用語の各々は、この節でそれと関連する意味を有する。

冠詞「ａ」および「ａｎ」は、１つまたは複数（すなわち、少なくとも１つ）という冠詞の文法上の目的を指すために本明細書において使用される。一例として、「ａｎｅｌｅｍｅｎｔ」は一つの要素または複数の要素を意味する。

量、一時的な持続時間などのような測定可能な値に言及する場合、本明細書において使用される「約」は、規定値から±２０％または±１０％、または±５％、または±１％、または±０．１％の変動を、そのような変動が開示された方法を実行するのに適切であるように、包含することを意味する。

本明細書において使用される乳癌の「術後補助療法」は、一次療法（すなわち、外科手術）後に行われる任意の治療を指して長期生存の可能性を増加させる。「術前補助療法」は、一次治療の前に行われる治療である。

本明細書において使用される用語「抗原」または「ａｇ」は、免疫応答を誘発する分子として定義される。この免疫応答は、抗体産生、または特定の免疫学的にコンピテントな細胞の活性化のいずれか、またはその両方を含むことができる。当業者は、実質的に全てのタンパク質またはペプチドを含む任意の高分子が、抗原として働くことができることを理解するであろう。さらに、抗原は、組換えまたはゲノムＤＮＡに由来してもよい。当業者は任意のＤＮＡであって、当該ＤＮＡが免疫応答を誘発するたんぱく質をコードするヌクレオチド配列または部分的なヌクレオチド配列を含み、従って本明細書においてその用語が使用されるように「抗原」をエンコードすることを理解するであろう。さらに、当業者は、抗原が遺伝子の全長ヌクレオチド配列のみでエンコードされる必要がないことを理解するだろう。本発明の実施形態は、限定されないが、１つ以上の遺伝子の部分的ヌクレオチド配列の使用を含み、これらのヌクレオチド配列は、所望の免疫応答を誘発するために様々な組み合わせで配置されることが容易に分かるだろう。さらに、当業者は、抗原が「遺伝子」によってコードされる必要は全くないことを理解するであろう。抗原を生成または合成することができ、または生物学的試料に由来してもよいことが容易に分かる。そのような生物学的サンプは、限定されるものではないが、組織試料、腫瘍試料、細胞または生物学的液体を含むことができる。

「抗原提示細胞」または「ＡＰＣ」は、Ｔ細胞を活性化することができ、限定されるものではないが、単球／マクロファージ、Ｂ細胞及び樹状細胞（ＤＣ）を含みうる、細胞である。

「抗原パルスＡＰＣ」または「抗原負荷ＡＰＣ」は、抗原に曝露して抗原により活性化されているＡＰＣが含まれる。例えば、ＡＰＣは、生体外で、例えば抗原の存在下での培養中、抗原負荷になることができる。ＡＰＣはまた、抗原への曝露により生体内でロードすることもできる。「抗原負荷ＡＰＣ」は、伝統的に、２つの方法のいずれかで調整する：（１）抗原ペプチドとして知られる小ペプチドフラグメントを、ＡＰＣの外側に直接「パルス」する：または（２）ＡＰＣを、その後ＡＰＣによって摂取される全タンパク質またはタンパク質粒子と共にインキュベートする。これらのタンパク質は、ＡＰＣにより小ペプチドフラグメントに消化され、最終的に搬送され、ＡＰＣの表面に提示される。加えて、抗原負荷ＡＰＣはまた、細胞へ抗原をコードするポリヌクレオチドを導入することによって生成することもできる。

「抗ＨＥＲ２応答」は、具体的には、ＨＥＲ２タンパク質に対する免疫応答である。

本明細書において使用される用語「抗腫瘍効果」は、腫瘍体積の減少、腫瘍細胞数の減少、転移の数の減少、平均余命の増加、または癌状態に関連する様々な生理的症状の改善によって明らかにすることができる生物学的効果を指す。「抗腫瘍効果」はまた、そもそも腫瘍の発生の予防における結合ペプチド、ポリヌクレオチド、細胞および抗体の能力によって明らかにすることもできる。

「アポトーシス」は、プログラム細胞死のプロセスである。カスパーゼ３は、頻繁に活性化される細胞死プロテアーゼである。

本明細書において使用する場合、用語「自己」は、そこに後で導入されるのと同じ個体に由来する任意の材料を指す。

本明細書において使用される用語「Ｂ細胞」は、骨髄および／または脾臓に由来する細胞として定義される。Ｂ細胞は抗体を産生する形質細胞に発達することができる。

結合ペプチド」に関しては「ＨＥＲ２結合ペプチド」を参照。

本明細書において使用される用語「癌」は、正常なコントロールの損失というその独特の特色が、無秩序な増殖、分化の欠如、局所組織浸潤、および／または転移をもたらす細胞の過剰増殖として定義される。例としては、限定するものではないが、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、皮膚癌、膀胱癌、食道癌、膵臓癌、結腸直腸癌、胃癌、腎臓癌、肝臓癌、脳腫瘍、リンパ腫、白血病、肺癌、胚細胞腫瘍、等を含む。

「ＣＤ４^＋Ｔｈ１細胞」、「Ｔｈ１細胞」、「ＣＤ４^＋Ｔヘルパー１型細胞」、「ＣＤ４^＋Ｔ細胞」などは、表面タンパク質ＣＤ４を発現し、高レベルのサイトカインＩＦＮ−γを産生するヘルパーＴ細胞のサブタイプとして定義される。「ヘルパーＴ細胞」も参照。

「累積応答」は、与えられた患者群由来の全ての６個のＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドからの反応スポットの総和（ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ分析での１０^６個の細胞当たりのスポット形成細胞「ＳＦＣ」）として表現される、患者群の複合免疫応答を意味する。

「ＤＣワクチン接種（ＤＣｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ）」、「ＤＣ免疫化（ＤＣｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）」、「ＤＣ１免疫化（ＤＣ１ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）」などは、自己樹状細胞を用いて特定の分子を認識してそれらに対して特異的応答を開始する免疫システムを利用する戦略を指す。

用語「樹状細胞」または「ＤＣ」は、生体内、試験管内、生体外、又は宿主ならびに対象内に存在する、または造血幹細胞または単球に由来することができる抗原提示細胞である。樹状細胞およびそれらの前駆体は、骨髄や末梢血からと同様に、種々のリンパ器官、例えば、脾臓、リンパ節から単離することができる。ＤＣは、樹状細胞本体から離れた複数の方向に延びる薄いシート（葉状仮足）を有する特徴的な形態を持つ。一般には、樹状細胞は、高いレベルのＭＨＣおよび共刺激（例えば、Ｂ７−１およびＢ７−２）分子を発現する。樹状細胞は、試験管内でのＴ細胞の抗原特異的な分化を誘導し、試験管内および生体内での一次Ｔ細胞応答を開始することができる。ワクチン生産との関連において、「活性化されたＤＣ」は、リポ多糖（ＬＰＳ）などのＴｏｌｌ様受容体アゴニストに暴露されたＤＣである。活性化されたＤＣは、抗原が付加されてもよくされなくてもよい。「成熟ＤＣ」も参照。

「ＤＣ−１極性化樹状細胞」、「ＤＣ１」及び「１型極性化ＤＣ」は、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、およびＩＬ−２３などのＴｈｌ−駆動サイトカインを分泌する成熟ＤＣを指す。ＤＣ１は、細胞性免疫を完全に促進することができる。本明細書中の好ましい実施形態で、ＤＣ１はＨＥＲ２ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドでパルスされる。

「エストロゲン受容体（ＥＲ）陽性」または「ＥＲ^ｐｏｓ」癌はエストロゲンの発現について陽性を感知する癌である。「ＥＲ陰性」癌はそのような発現について陰性を感知する。ＥＲ状態の分析は、当技術分野で公知の任意の方法によって行うことができる。

「ＨＥＲ２」は、ヒト上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）ファミリーの一員である。ＨＥＲ２は、ヒト乳癌の約２０％〜２５％で過剰発現されており、多くの他の癌において発現される。

本明細書中で使用される「ＨＥＲ２結合ペプチド」、「ＨＥＲ２ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチド」、「結合ペプチド」、「ＨＥＲ２ペプチド」、「免疫原性ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチド」、「抗原結合ペプチド」、「ＨＥＲ２エピトープ」、「反応性ペプチド」、及び同様のものは、約２０〜２５パーセントの全ヒト乳癌およびその等価物で見られる標的である、ＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質の配列に由来するか又は基づくＭＨＣクラスＩＩペプチドを指す。ＨＥＲ２細胞外ドメイン「ＥＣＤ」は、細胞膜に固定、または循環中のいずれかである細胞の外側にあるＨＥＲ２のドメインを指し、それらの断片を含む。ＨＥＲ２細胞内ドメイン「ＩＣＤ」は、細胞の細胞質内のＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質のドメインを指す。好ましい実施形態によれば、ＨＥＲ２エピトープまたは他の結合ペプチドは、３個のＨＥＲ２ＥＣＤペプチド及び３個のＨＥＲ２のＩＣＤペプチドを含む６個のＨＥＲ２結合ペプチドから構成される。
好ましいＨＥＲ２ＥＣＤペプチドは：
ペプチド４２〜５６：ＨＬＤＭＬＲＨＬＹＱＧＣＱＶＶ（配列番号：１）；
ペプチド９８〜１１４：ＲＬＲＩＶＲＧＴＱＬＦＥＤＮＹＡＬ（配列番号：２）；及び
ペプチド３２８〜３４５：ＴＱＲＣＥＫＣＳＫＰＣＡＲＶＣＹＧＬ（配列番号：３）を含み；
好ましいＨＥＲ２ＩＣＤペプチドは：
ペプチド７７６〜７９０：ＧＶＧＳＰＹＶＳＲＬＬＧＩＣＬ（配列番号：４）；
ペプチド９２７〜９４１：ＰＡＲＥＩＰＤＬＬＥＫＧＥＲＬ（配列番号：５）；及び
ペプチド１１６６〜１１８０：ＴＬＥＲＰＫＴＬＳＰＧＫＮＧＶ（配列番号：６）を含む。
ドナーがＨＬＡＡ２．１血液型（ＨＬＡ−Ａ２^ｐｏｓ）を有する実施態様においては、ＨＥＲ２ＭＨＣクラスＩペプチド又はエピトープは：
ペプチド３６９−３７７：ＫＩＦＧＳＬＡＦＬ（配列番号：７）及び
ペプチド６８９−６９７：ＲＬＬＱＥＴＥＬＶ（配列番号：８）を含む。

「ＨＥＲ２^ｐｏｓ」は、多数の他のタイプの癌と同様に、乳癌の分類又は分子サブタイプである。ＨＥＲ２陽性は、現在ＦＩＳＨ（蛍光インサイツハイブリダイゼーション）アッセイによる遺伝子増幅によって定義され、病理学的染色の強度で２＋または３＋である。

「ＨＥＲ２^ｎｅｇ」はＦＩＳＨによる遺伝子増幅の欠如によって定義され、ほとんどの場合０から２＋の病理学的染色の範囲を包含することができる。

「単離された」とは、天然の状態から変更されたまたは除去されたことを意味する。例えば、生きている動物中に天然に存在する核酸またはペプチドは「単離された」ではないが、その自然の状態の共存している材料から部分的に又は完全に分離された同じ核酸またはペプチドは、「単離された」である。単離された核酸またはタンパク質は、実質的に精製された形態で存在することができ、または、例えば、宿主細胞のような非天然環境で存在することができる。

本明細書中で使用される用語「主要組織適合遺伝子複合体」または「ＭＨＣ」は、遺伝子の特定のクラスターとして定義され、その多くは組織適合性の最も重要な決定要因の一つである抗原提示に関与する進化的に関連する表面タンパク質をコードする。クラスＩＭＨＣ、またはＭＨＣクラスＩは、主にＣＤ８Ｔリンパ球への抗原提示に機能する。クラスＩＩＭＨＣ、またはＭＨＣクラスＩＩは、主にＣＤ４^＋Ｔリンパ球（Ｔヘルパー細胞）への抗原提示に機能する。

本明細書中で使用される「成熟ＤＣ」は、高いレベルのＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ８０（Ｂ７．１）およびＣＤ８６（Ｂ７．２）分子を含む、分子を発現する樹状細胞を意味する。これとは対照的に、未成熟ＤＣ（「ｉＤＣ」または「ＩＤＣ」）は、低レベルのＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ８０（Ｂ７．１）およびＣＤ８６（Ｂ７．２）分子を発現し、まだ依然として抗原を取り入れることができる。「成熟ＤＣ」はまた、生体内、試験管内、生体外、又は宿主ならびに対象内に存在する抗原提示細胞を指し、ＤＣ１極性化であってもよい。（すなわち、細胞性免疫を完全に促進することができる。）

ＣＤ４^＋Ｔｈ１応答（またはＴｈ１応答）の「測定基準」は、抗ＨＥＲ２ＣＤ４^＋Ｔｈ１免疫応答を分析した各被験者グループを対象に定義される：各被験者グループ由来の６個のＭＨＣクラスＩＩから結合ペプチドで（ａ）全体的な抗ＨＥＲ２応答（１以上の反応性ペプチドに応答する被験者のパーセントとして表される）；（ｂ）応答レパートリー（各被験者グループによって認識された反応性ペプチド（ｎ）の平均数として表される）；及び（ｃ）累積応答（反応性スポットの総和（ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ解析での１０^６個の細胞当たりのスポット形成細「ＳＦＣ」）として表される）

「明確なＨＥＲ２^ｎｅｇ」は遺伝子増幅されず、病理学的染色で０または１＋であるとして定義される。「曖昧なＨＥＲ２^ｎｅｇ」は遺伝子増幅されないが、病理学的染色で２＋であるとして定義される。

「応答性」または「抗ＨＥＲ２応答」は本明細書中で交換可能に使用され、６個の結合ペプチドの少なくとも１つに応答する被験者の割合を意味する。

「応答レパートリー」は各被験者グループによって認識される反応性ペプチドの平均数（ｎ）として定義される。

本明細書中で使用される「サンプル」または「生物学的試料」は、限定されるものではないが、血液、臓器、組織、エキソソーム、血漿、唾液、尿および他の体液を含む、被験者由来の生物学的材料を意味する。試料は、対象から得られた材料の任意の供給源となりうる。

用語「被験者」、「患者」、「個体」及び同様のものは、本明細書中で交換可能に使用され、本明細書に記載の方法に適した、それらの任意の動物、または、試験管内であろうとインサイツであろうとその細胞を指す。特定の非限定的な実施形態では患者、被験者又は個体は、ヒトである。

本明細書で使用される用語「標的療法」は、薬物または他の物質を使用する癌治療を指し、それは抗腫瘍効果を達成するために通常正常細胞にはほとんどダメージを与えない一方、癌細胞の増殖に関与する特定の標的分子に干渉する。伝統的な細胞傷害性化学療法薬は、対照的に、すべての活発に分裂する細胞に対して作用する。乳癌治療モノクローナル抗体では、具体的にはトラスツズマブ／ハーセプチン（登録商標）がＨＥＲ２／ｎｅｕ膜受容体を標的とする。

「Ｔ／Ｃ」は、トラスツズマブ及び化学療法と定義される。これは、乳癌手術前／後にトラスツズマブ及び化学療法の両方を受けた患者を指す。

本明細書で使用される用語「Ｔ―細胞」または「Ｔ細胞」は、種々の細胞性免疫反応に関与する胸腺由来の細胞として定義される。

用語「Ｔヘルパー細胞」、「ヘルパーＴ細胞」、「Ｔｈ細胞」等は、本明細書中で細胞に関して使用され、当業者によって同定可能な異なる細胞型を含む、リンパ球のサブグループ（白血球細胞または白血球のタイプ）を示す。具体的には、Ｔヘルパー細胞は、その主な機能が他のＢおよびＴリンパ球および／またはマクロファージの活性化および機能を促進することであるエフェクターＴ細胞である。ヘルパーＴ細胞は、「Ｔｈ１」または「タイプ１」および「Ｔｈ２」または「タイプ２」表現型として知られている二つの主要なサブタイプの細胞に分化する。これらのＴｈ細胞は、他の白血球を刺激するまたは相互作用するサイトカイン、タンパク質、またはペプチドを分泌する。本明細書中で使用される「Ｔｈ１細胞」、「ＣＤ４^＋Ｔｈ１細胞」、「ＣＤ４^＋Ｔヘルパー１型細胞」、「ＣＤ４^＋Ｔ細胞」及び同様のものは、表面糖タンパク質ＣＤ４を発現した成熟Ｔ細胞を指す。樹状細胞などの抗原提示ペプチド（ＡＰＣ）の表面上に発現したＭＨＣクラスＩＩ分子によりペプチド抗原が提示されるときにＣＤ４^＋Ｔヘルパー細胞は活性化する。ＭＨＣ抗原複合体によるＣＤ４^＋Ｔヘルパー細胞の活性化の際に、それは高レベルのインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）のようなサイトカインを分泌する。このような細胞は、宿主細胞内に住む、ヒトの癌における抗腫瘍応答において重要である特定の疾患を引き起こす微生物に対して非常に有効であると考えられる。

「Ｔｒｅｇ」、「Ｔ_ｒｅｇ」および「制御性Ｔ細胞」は、本明細書中で使用されて免疫系の警察官であり、免疫系の抗癌活性を調節するように作用する細胞を指す。彼らは、特定の癌で増加し、これらの癌の型の免疫療法に対する抵抗性を仲介する。

「治療有効量」または「有効量」は、本明細書中で互換的に使用され、本明細書に記載されるように、患者に投与したときに特定の生物学的結果を達成するのに有効である、化合物、製剤、物質、または組成物の量を意味する。本明細書中に記載された化合物、製剤、物質、または組成物の量は、これは「治療有効量」を構成し、化合物、製剤、物質、または組成物に応じて変化する、疾患状態およびその重症度、治療するべき患者の年齢、などによって変わる。治療有効量は、当該技術分野の当業者によって彼／彼女自身の知識及び本開示を考慮して通常決定され得る。

用語「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」および「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、本明細書に記載された治療または予防の基準を指す。「治療」の方法は、そのような治療を必要とする、被験体へ本発明の実施形態の組成物を投与すること又は本発明の実施形態の方法を採用する、例えば、疾患または障害に罹患した被験者、または最終的にこのような疾患または障害を獲得する可能性がある被験体、が予防、治療、遅延、その重症度を低下させる、または障害または再発障害の１以上の症状を回復する、またはそのような治療が存在しない場合に予想される生存期間を超えて被験者の生存期間を延長するためである。

本明細書で使用される用語「ワクチン」は動物好ましくは哺乳動物、そしてより好ましくはヒトへの物質の投与後に免疫応答を誘発するために使用される材料、として定義される。被験体への導入の際に、ワクチンは、限定するものではないが、抗体、サイトカインおよび／またはほかの細胞応答を含む、免疫応答を誘発することができる。

範囲：本開示を通して、実施形態の様々な態様を範囲形式で提示することができる。範囲形式での記載は便宜と簡潔さのためだけであり、実施形態の範囲の柔軟性のない限定として解釈されるべきではないことを理解する必要がある。したがって、範囲の記載は、その範囲内の個々の数値と同様にすべての可能な部分的な範囲を具体的に開示していると考慮する必要がある。たとえば、１から６のような範囲の記載は、その範囲内の個々の数値、例えば、１、２、２．７、３、４、５、５．３、および６と同様に、１から３まで、１から４まで、１から５まで、２から４まで、２から６まで、３から６までなどのように具体的に開示された部分範囲を有すると考える必要がある。これは、範囲の広さにかかわらず適用される。

参照は、現在いくつかの実施形態に詳細にされており、その例は添付の図面、写真、および／または、図にも示されている。

説明
乳癌発症の生涯リスクはほぼ８に１である。ｅｒｂ−Ｂ２癌遺伝子（ＨＥＲ−２／ｎｅｕ）は、分子作動体であり、それは乳癌、卵巣癌、胃食道癌、肺癌、膵臓癌、前立腺癌および他の固形腫瘍のかなりの数で過剰発現される。乳癌の約２０〜２５％を含むいくつかの腫瘍タイプにおける分子オンコドライバーである、ＨＥＲ２の過剰発現（ＨＥＲ２^ｐｏｓ）は、より臨床的に悪性度の高い疾患、化学療法に対する抵抗性、高い割合での再発や転移、及びより悪い全体的な予後と関連する。初期乳癌において、ＨＥＲ２の過剰発現は、強化された浸潤性、腫瘍細胞の遊走、及び腫瘍形成性環境を促進するＨＥＲ２の重要な役割を示唆する、血管新生促進因子の発現と関連する。非浸潤性乳管癌（ＤＣＩＳ）患者のレトロスペクティブ分析において、ＨＥＲ２を過剰発現するＤＣＩＳ病変は、ＨＥＲ２を過剰発現しないＤＣＩＳ病変よりも浸潤性の高い乳癌と６倍以上関連がある可能性が高かった。

ＨＥＲ２を標的とする分子標的療法、すなわちトラスツズマブは、このタイプの乳癌に多大な正の臨床効果をもたらしているけれども、進行した疾患状態における既存のＨＥＲ２療法に対するほぼ普遍的な抵抗、加えて前記標的療法を受けた女性のかなりの割合での疾病再発は、ＨＥＲ２を標的とする追加の戦略の必要性を証明する。ＨＥＲ２に対する免疫系を活性化し腫瘍の進行を軽減するワクチンの可能性及び再発の防止は、求められているが、未だに完全には理解されていない。したがって、ＨＥＲ２乳癌を診断および治療するための追加の試験および治療の必要性が依然として存在する。本明細書において説明した本実施形態は、これらの問題に対処する。

ＨＥＲ２主導の乳房腫瘍形成における全身性の抗ＨＥＲ２ＣＤ４^＋Ｔｈ１応答の役割は、しかし、依然として不明である。本明細書に記載の実施形態は、ＨＥＲ２^ｐｏｓ乳癌における腫瘍形成の連続体全体で抗ＨＥＲ２ＣＤ４^＋Ｔｈ１応答の進行性喪失の同定に基づき、それはＨＥＲ２特異的および調節性Ｔ細胞（Ｔ_ｒｅｇ）非依存性であるように思われる。具体的には、抗ＨＥＲ２ＣＤ４^＋Ｔｈ１応答と、ＨＥＲ２発現及び疾患進行の間には負の相関がある。さらに、ＨＥＲ２^ｐｏｓ浸潤性乳癌における抑制された抗ＨＥＲ２のＴｈ１応答は、ＨＥＲ２パルス１型に極性化した樹状細胞「ＤＣ１」のワクチン接種後に、差動的に回復した、しかし、抑制された応答は、本明細書中にまたは外科的切除や放射線などのような他の標準的な治療によって詳述されるように、続くトラスツズマブと化学療法（Ｔ／Ｃ）とのＨＥＲ２標的療法後に回復されなかった。回復した抗ＨＥＲ２のＴｈ１応答はまた、少なくとも約６ヶ月以上耐久性があるように思われる。

本明細書に記載の好ましい実施形態は、哺乳類の循環抗腫瘍ＣＤ４^＋Ｔｈｌ応答を発生し、検出する物質及び方法を提供する。循環抗腫瘍ＣＤ４^＋Ｔｈ１応答（すなわち、ＩＦＮ−γ分泌）を生成する血液検査／アッセイが提供され、生じたＩＦＮ−γ産生が検出され、測定される。他の好ましい実施形態では、ＣＤ４^＋Ｔｈ１細胞および抗原提示細胞またはその前駆体を含む被験体の血液試料は、被験体が罹患している癌の種類に基づき、被験体に免疫応答を誘導することができるＭＨＣクラスＩＩ免疫原性ペプチドでパルスされる。好ましくは、抗原提示細胞またはその前駆体は、成熟あるいは未成熟樹状細胞又はそれらの単球前駆体である。特に好ましい実施形態において、癌は好ましくはＨＥＲ２発現で、哺乳動物被験体は好ましくはヒトであり、より好ましくは、癌はＨＥＲ２^ｐｏｓ乳癌で、ヒト被験体は女性である。

本明細書中で同定された抗ＨＥＲ２ＣＤ４^＋Ｔｈ１応答の減少は、このような血液検査で発生した検出された免疫応答が、癌診断／応答の予測因子として単独で又はまたは患者の免疫応答を回復する専門のワクチンの使用と並行して、使用することができる。本明細書に記載された好ましい実施形態は、このように、癌の診断および治療の焦点を癌に対する免疫応答を決定しおよび／または予測するための患者の免疫および血液検査の使用に移動し、腫瘍細胞の同定に依存している診断及び治療方法とは対照的に、患者に再発の危険性があるかを含む。

好ましい実施形態は、哺乳動物被験体における循環抗ＨＥＲ２ＣＤ４^＋Ｔｈ１応答を生成するために、被験体から増殖されていない末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離し、ＨＥＲ２由来のＭＨＣクラスＩＩ抗原結合ペプチドを含む組成物をＰＢＭＣへパルスし、被験体内で免疫応答を発生することができるようにすることによって提供される。いかなる特定の理論に拘泥するものではないが、前記結合ペプチドが前記ＰＢＭＣサンプル中に存在するＣＤ４^＋Ｔｈ１細胞に提示されるとき、前記ＣＤ４^＋Ｔｈ１細胞を活性化し、活性化されたＣＤ４^＋Ｔｈ１細胞がインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）を生成する。被験体のＰＢＭＣ試料に含まれる前駆体多能性単球由来のＤＣ１（１型極性化樹状細胞）は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）であり、前記結合ペプチドへの暴露時にＭＨＣクラスＩＩ抗原結合ペプチドを試料中の被験体のＣＤ４^＋Ｔｈｌ細胞に提示し、これによりＣＤ４^＋Ｔｈ１細胞を活性化しＩＦＮ−γを産生／分泌する抗原負荷ＡＰＣとなる。それによって産生されたＩＦＮ−γは、その後分析のために測定される。

別の好ましい実施形態では、循環抗ＨＥＲ２ＣＤ４^＋Ｔｈ１応答は、被験体の血液試料由来の刺激されていない精製されたＣＤ４^＋Ｔ細胞を、被験体中で免疫応答を生成することができるＨＥＲ２由来のＭＨＣクラスＩＩ抗原結合ペプチドを含む組成物でパルスした自家未成熟または成熟樹状細胞（「ｉＤＣ」または「成熟ＤＣ」、総称して、「ＤＣ」）とあらかじめ共培養することによって、哺乳動物被験体中で生成される。いかなる特定の理論に拘泥するものではないが、前記結合ペプチドがＴ細胞試料中に存在するＣＤ４^＋Ｔｈ１細胞に提示されたとき、ＣＤ４^＋Ｔｈ１細胞を活性化し、活性化されたＣＤ４^＋Ｔｈ１細胞は、ＩＦＮ−γを分泌／生成する。前記未成熟ＤＣは、ＤＣ１に成熟し、サンプル中に存在する被験体のＣＤ４^＋Ｔｈ１細胞へＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドを提示し、それによってＣＤ４^＋Ｔｈ１細胞を活性化しＩＦＮ−γを産生させ、それはその後分析のために測定される。

被験体中で抗ＨＥＲ２免疫応答を生成するための両方の別の好ましい実施形態では、他の検出方法が使用されてもよいことは当業者によって理解されるべきであるが、抗ＨＥＲ２ＣＤ４^＋Ｔｈ１細胞によって産生されるＩＦＮ−γは、ＩＦＮ−γ酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイによって検出及び測定される。例えば、フローサイトメトリー、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、および免疫蛍光法（ＩＦ）が免疫応答を監視するために使用することができる。代わりに、患者の免疫モニタリングの実例で、全ＣＤ４^＋細胞のスポットを示すＥＬＩＳＰＯＴのような直線のＩＦＮ−γ試験とは対照的に、又は加えて、ＩＬ−１０に対するＩＦＮ−γの比を測定することが有利であり得る（参考例で行われ、図８Ｅで示されたように）。このような試験は、リスクのある患者にとって特に有利であろう。さらに、免疫蛍光法の使用は、蛍光で結果を読み取るＥＬＩＳＰＯＴリーダーの使用を介して免疫応答を測定し、視覚化する他の方法を提供する。このような場合に、結果は２つ、３つ、またはそれ以上のサイトカイン／他の分泌された免疫分子を表示するように配置することができ、各々は同じ患者試料中で、異なる色で示される。

当業者は、他の適当なＡＰＣが、樹状細胞に加えて、例えばマクロファージ等の単球及びＢ細胞を使用できることを容易に理解することができる。

好ましい実施形態では、ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、ＩＦＧ−γ産生を検出するために実行される（正のペプチド応答：最小閾値２０ＳＦＣ／２ｘ１０^５及び刺激されていない対照よりも２倍大きい）。結果は、好ましくは、Ｔｈ１応答の３つの指標として表現される：（ａ）全体の抗ＨＥＲ２応答（１以上の反応性ペプチドに応答した被験体のパーセントとして表現される）；（ｂ）応答レパートリー（各被験体グループによって認識された反応性ペプチド（ｎ）の平均数として表現される）；そして、（ｃ）累積応答（各被験体グループからすべての６のＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドからの反応スポット（ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ解析から１０^６個の細胞あたりのスポット形成細胞「ＳＦＣ」）の総和として表現される）。

ＨＥＲ２^ｐｏｓ癌のための好ましい実施形態では、ＤＣ、未成熟または１型極性化ＤＣは、ＨＥＲ２に由来するか基づき患者中に免疫応答を生成することができる６ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドを含む組成物でパルスされる。
ＨＥＲ２ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドまたはエピトープは、
ペプチド４２−５６：ＨＬＤＭＬＲＨＬＹＱＧＣＱＶＶ（配列番号：１）；
ペプチド９８−１１４：ＲＬＲＩＶＲＧＴＱＬＦＥＤＮＹＡＬ（配列番号：２）；
ペプチド３２８−３４５：ＴＱＲＣＥＫＣＳＫＰＣＡＲＶＣＹＧＬ（配列番号：３）；
ペプチド７７６−７９０：ＧＶＧＳＰＹＶＳＲＬＬＧＩＣＬ（配列番号：４）；
ペプチド９２７−９４１：ＰＡＲＥＩＰＤＬＬＥＫＧＥＲＬ（配列番号：５）；及び
ペプチド１１６６−１１８０：ＴＬＥＲＰＫＴＬＳＰＧＫＮＧＶ（配列番号：６）を含む。
ドナーがＡ２．１の血液型を有する実施形態では、ＨＥＲ２ＭＨＣクラスＩペプチドまたはエピトープは、
ペプチド３６９−３７７：ＫＩＦＧＳＬＡＦＬ（配列番号：７）；及び
ペプチド６８９−６９７：ＲＬＬＱＥＴＥＬＶ（配列番号：８）を含む。

本明細書でさらに記載されるように、好ましい実施形態のＨＥＲ２結合ペプチド／エピトープは、６個の上記参照ペプチドに限定されるものではなく、本明細書でより詳細に説明するように、配列番号１〜６によって同定された結合ペプチドの機能的同等物または代替物であるペプチドも含む。Ａ２．１及びＡ３．１血液型及び他の血液型（例えば、Ａ５、Ａ６）を有する被験体のために使用することができる、任意の表現型に結合するクラスＩペプチドを含む追加のクラスＩペプチドがある。

乳癌に加えて、例えば、脳、膀胱、食道、肺、膵臓、肝臓、前立腺、卵巣、結腸直腸、及び胃、およびその他のような、他の多くのＨＥＲ２^ｐｏｓ固形癌があり、それらのために本明細書に記載の実施形態の材料及び方法を、診断および治療のために使用することができる。

ワクチンは、上述の同じ抗ＨＥＲ２結合ペプチドを用いてＨＥＲ２発現腫瘍を標的化するために開発することができ、または例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、またはタンパク質もしくはＩＣＤおよびＥＣＤのドメインのようなその構成要素などのような免疫原性であるＨＥＲ２の任意の組成物を使用することができる。例えば、被験体は全ＨＥＲ２タンパク質に対するワクチン投与を受けることができ、６個の上述した結合ペプチドは、患者の免疫応答をモニターするために使用することができる。同様に、ワクチンは、ＨＥＲ１、ＨＥＲ３、およびｃ−ＭＥＴを含むＨＥＲ２ファミリーの他のメンバーのような他のタイプの癌のために開発することができる。

現在の好ましい実施形態は、女性のＨＥＲ２^ｐｏｓ乳がんを治療し、診断することに関しているが、本発明の実施形態は、女性の人間に限定されないことは当業者によって直ちに理解されるべきである。現在好ましい実施形態は、男性のヒト、例えば、ＨＥＲ２を発現する前立腺癌を、ならびに他の哺乳動物被験体を含む。

組成物
好ましい実施形態は、ＨＥＲ２タンパク質に由来するか、またはそうでなければ基づいて単離されたペプチドの使用を含む。好ましい実施形態の結合ペプチドは、対応するＨＥＲ２タンパク質のエピトープを提示する。現在好ましい実施形態は、６つのＨＥＲ２ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチド／エピトープを備えているが、患者において免疫学的に十分に活性である限り、ＨＥＲ２分子全体の任意の成分が他の結合ペプチドの供給源として使用することができ、他の可能なＭＨＣクラスＩＩＨＥＲ２ペプチドが、本実施形態で使用されうる。

好ましい実施形態では、ＨＥＲ２結合ペプチドは配列：
ペプチド４２〜５６：ＨＬＤＭＬＲＨＬＹＱＧＣＱＶＶ（配列番号：１）；
ペプチド９８〜１１４：ＲＬＲＩＶＲＧＴＱＬＦＥＤＮＹＡＬ（配列番号：２）；
ペプチド３２８〜３４５：ＴＱＲＣＥＫＣＳＫＰＣＡＲＶＣＹＧＬ（配列番号：３）；
ペプチド７７６〜７９０：ＧＶＧＳＰＹＶＳＲＬＬＧＩＣＬ（配列番号：４）；
ペプチド９２７〜９４１：ＰＡＲＥＩＰＤＬＬＥＫＧＥＲＬ（配列番号：５）；及び
ペプチド１１６６〜１１８０：ＴＬＥＲＰＫＴＬＳＰＧＫＮＧＶ（配列番号：６）
を有する６個のＨＥＲ２ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドを含む。

配列番号：１によって識別されるＨＥＲ２エピトープはＨＥＲ２タンパク質の４２〜５６の位置を表す。配列番号：２によって識別されるＨＥＲ２エピトープはＨＥＲ２タンパク質の９８〜１１４の位置を表す。配列番号：３によって識別されるＨＥＲ２エピトープはＨＥＲ２タンパク質の３２８〜３４５の位置を表す。配列番号：４によって識別されるＨＥＲ２エピトープはＨＥＲ２タンパク質の７７６〜７９０の位置を表す。配列番号：５によって識別されるＨＥＲ２エピトープはＨＥＲ２タンパク質の９２７〜９４１の位置を表す。配列番号：６によって識別されるＨＥＲ２エピトープはＨＥＲ２タンパク質の１１６６〜１１８０の位置を表す。

さらに、当業者は、本明細書に記載の実施形態は、本明細書の好ましい実施形態に関連して記載された全６個の結合ペプチドを使用することに限定されるものではないことを理解することができる。ＩＦＮ−γの産生を引き起こすために、患者のＣＤ４^＋Ｔ細胞に十分な免疫学的活性がなければならないことを注意して、低域が２つまたは３つ程度の任意の数の記載された結合ペプチドが、患者の血液検査に使用されうる。したがって、本明細書の好ましい実施形態に関連して記載された一組の６個のものより少ない及び又は異なるＨＥＲ由来クラスＩＩ結合ペプチドが使用されている場合には、結合ペプチドの数は、被験体で生成された免疫応答に応じておそらく実質的に６よりも小さいか大きいだろう。

本明細書に記載されたように、好ましい実施形態のＨＥＲ２結合ペプチドはまた、配列番号：１〜６によって同定されるペプチドの機能的等価物であるペプチドを包含する。このような機能的等価物は、対応するＨＥＲ２ペプチド配列中の１以上のアミノ酸が置換されるか、または、１以上のアミノ酸が対応する基準配列から削除されるか、または、加えられるという改変された配列を有していてもよい。例えば、１〜３個のアミノ酸がアミノ末端、カルボキシル末端、またはその両方に加えられてもよい。いくつかの例では、ＨＥＲ２ペプチドはグリコシル化することができる。

前記ＨＥＲ２結合ペプチド又は本実施形態に従う任意のペプチドは、環化されても直鎖状であってもよい。環化したとき、エピトープは、任意の適切な方法で環化することができる。例えば、ジスルフィド結合は所望のコンフォメーション（ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ）を提供するために選択されたシステイン（Ｃｙｓ）対の間に形成されてもよい。環化エピトープの形成は、免疫応答を改善するコンフォメーションを提供することができると考えられている。

他の例では、ＨＥＲ２結合ペプチドは、ＨＥＲ２結合ペプチドのレトロ−インベルソ異性体であってもよい。レトロ−インベルソ修飾は、ペプチド骨格内のすべてのアミド結合の逆転を含む。この逆転は、配列の方向を反転し、Ｌ−アミノ酸の代わりにＤ−アミノ酸を使用して、各アミノ酸残基のキラリティーを反転することによって達成することができる。このレトロ−インベルソ異性体形態は、少なくとも一部のペプチド結合の平面性と配座制限を保持することができる。

非保存的アミノ酸置換および／または保存的置換もまた、行うことができる。置換されたアミノ酸が基準配列中の対応するアミノ酸と類似の構造または化学的特性を有する場合、置換は、保存的アミノ酸置換である。一例として、保存的アミノ酸置換は、１つの脂肪族または疎水性アミノ酸、例えば、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシンのほかのものとの置換；１つのヒドロキシル含有アミノ酸、例えば、セリン及びスレオニンのほかのものとの置換；１つの酸性残基、例えば、グルタミン酸またはアスパラギン酸のほかのものとの置換；１つのアミド含有残基、例えば、アスパラギンおよびグルタミンのほかのものとの置換；１つの芳香族残基、例えば、フェニルアラニンおよびチロシンのほかのものとの置換；１つの塩基性残基、例えば、リジン、アルギニン及びヒスチジンのほかのものとの置換；１つの小さなアミノ酸、例えば、アラニン、セリン、トレオニン、メチオニン、及びグリシンのほかのものとの置換、を含む。

いくつかの例では、好ましい実施形態の結合ペプチドの配列の一つのアミノ末端、カルボキシ末端、またはその両方で欠失および付加がある。例えば、ＨＥＲ２結合ペプチド等価物は、対応するＨＥＲ２結合ペプチド配列と少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有する。少なくとも９０％同一である配列は１以上の変更、すなわち、基準配列の１０アミノ酸あたりの欠失、付加および置換の任意の組み合わせ、を有していない。パーセント同一性は、当技術分野で知られているか開発されたプログラムを使用して、基準配列と変異体のアミノ酸配列を比較することによって決定される

対応するＨＥＲ２結合ペプチド配列よりも長い機能的等価物については、前記機能的等価物は、ＨＥＲ２ペプチド配列に対して少なくとも９０％同一である配列を有することができ前記配列は野生型ＨＥＲ２タンパク質におけるＨＥＲ２ペプチド配列に隣接する。

ペプチドの配列を変更し、その後、ＣＤ４^＋Ｔｈ１細胞への結合ペプチド／エピトープを提示する被験体の単球、樹状細胞または他の抗原提示細胞を刺激する能力について、得られたポリペプチドをアッセイすることによってＨＥＲ２結合ペプチドの機能的等価物を識別することができる。

他の実施形態によれば、キメラペプチドおよび１つ以上のキメラペプチドを含む組成物が提供される。様々な実施形態によれば、キメラペプチドは、ＨＥＲ２ペプチド、別のペプチド、および他のペプチドのＨＥＲ２ペプチドを結合するリンカーを含む。さらに、任意の適当なリンカーが使用されてもよいことが理解されるであろう。例えば、使用されるペプチドに依存して、ＨＥＲ２結合ペプチドは、他の結合ペプチドのアミノまたはカルボキシ末端のいずれかに結合してもよい。他のペプチドの位置及び選択は、ＨＥＲ２ペプチドがアルファへリックス状かβ−ターン状か鎖状かという構造的特徴に依存する。

別の実施形態において、リンカーは、長さで約２から約１５のアミノ酸、約２から約１０個のアミノ酸、約２から約６個のアミノ酸のペプチドでありうる。キメラペプチドは直鎖状でも環化していてもよい。さらに、ＨＥＲ２ペプチド、他のペプチド、および／またはリンカーが、レトロ−インベルソ形であってもよい。このように、ＨＥＲ２ペプチドは、沿ってレトロインベルソ形であってもよい。あるいは、ＨＥＲ２ペプチドと他のペプチドは、レトロインベルソ形であってもよい。別の例では、ＨＥＲ２ペプチド、他のエピトープ、およびリンカーはレトロインベルソ形であってもよい。

キメラペプチドを含むペプチドは、周知の技術を用いて調製することができる。例えば、ペプチドは、組換えＤＮＡ技術または化学合成のいずれかを用いて、合成的に調製することができる。本発明の実施形態のペプチドは、個々に合成されるか、または２以上のペプチドから構成されるより長いポリペプチドとして、合成されうる。現在好ましい実施形態のペプチドは、好ましくは単離される、すなわち、他の天然に存在する宿主細胞タンパク質およびそれらの断片を実質的に含まない。

本発明の実施形態のペプチドおよびキメラペプチドは、市販のペプチド合成機を使用して合成することができる。例えば、Ｋａｕｍａｙａ，Ｐ．Ｔ．Ｐ．，ｅｔａｌ，「ＤｅＮｏｖｏ」ＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｏｆＰｅｐｔｉｄｅＩｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃａｎｄＡｎｔｉｇｅｎｉｃＤｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓａｓＰｏｔｅｎｔｉａｌＶａｃｃｉｎｅｓ，ｉｎＰｅｐｔｉｄｅｓ，Ｄｅｓｉｇｎ，ＳｙｎｔｈｅｓｉｓａｎｄＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＡｃｔｉｖｉｔｙ，ｐｐ１３３−１６４（１９９４）に記載された化学的方法を使用することができる。例えば、ＨＥＲ２結合ペプチドは、キメラペプチドを形成するために他の結合ペプチドと共直線的に合成することができる。ペプチド合成は、Ｆｍｏｃ／Ｔ−Ｂｕｔ化学を用いて行うことができる。ペプチドおよびキメラペプチドは、任意の適切な方法で環化することができる。例えば、異なるように保護されたシステイン残基、ヨウ素酸化、Ａｃｍ基の除去を高めるための水の添加、及びジスルフィド結合の付随的形成、および／またはシリルクロライド−スルホキシド法を使用することによって、ジスルフィド結合を達成することができる。

ペプチドおよびキメラペプチドは、無細胞翻訳系と、エピトープまたは結合ペプチドをコードしたＤＮＡ構築物に由来するＲＮＡ分子を使用して製造することができる。あるいは、エピトープまたはキメラペプチドを、各エピトープまたはキメラペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターで宿主細胞をトランスフェクトし、その後、宿主細胞におけるポリペプチドの発現を誘導することによって作製することができる。組換え体の生産のために、結合性ペプチドエピトープ、キメラペプチド、またはその変異体をコードする１つ以上の配列を含む組換え構築物が、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープローディング、弾丸導入又は感染などの従来の方法により宿主細胞に導入される。

本発明の実施形態の結合ペプチドは、結合ペプチドの生物学的活性を破壊しない限り、グリコシル化、側鎖酸化、またはリン酸化などの修飾を含んでいてもよい。他の修飾は、Ｄ−アミノ酸または他のアミノ酸模倣体の取り込みを含む。

実施形態の結合ペプチドは、２つ以上のペプチドを含む組合せとして調製することができる。ペプチドは、カクテルであってもよく、または標準的な技術を用いて互いに結合させてもよい。例えば、ペプチドは、単一のポリペプチド配列として発現させることができる。組み合わせにおけるペプチドは、同一でも異なっていてもよい。

本発明の実施形態もまた、得られたペプチド（またはＤＮＡ）が本明細書に記載された配列と同一ではなく、しかし、本明細書に開示されるペプチドと同じ生物学的特性を有するような、１個以上のアミノ酸で改変されたペプチドである（または、同じものをコードするヌクレオチド配列に言及する場合、一つ以上の塩基対で改変する）前記実施形態の前記ペプチドの（または同じものをコードしたＤＮＡの）「変異体」、「誘導体」、および「バリアント」を包含すると解釈されるべきである。

いくつかの実施形態はまた、配列番号：１〜６のいずれか１つ以上の配列を有するペプチドから選択された少なくとも１つのペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。核酸配列は、ＲＮＡに転写されるＤＮＡ配列及びペプチドに翻訳されるＲＮＡ配列の両方を含む。他の実施形態によれば、ポリヌクレオチドは、好ましい態様のペプチドのアミノ酸配列から推測される。当技術分野で知られているように、冗長コドンが原因で、翻訳されたペプチドの生物学的活性を保持しながら、いくつかの代替的なポリヌクレオチドが可能である。

さらに、好ましい実施形態では、本明細書に開示される結合ペプチドと実質的な相同性を有するペプチドをコードする単離された核酸を包含する。好ましくは、本発明のペプチドをコードする単離された核酸のヌクレオチド配列は、好適な実施形態の結合ペプチドをコードする単離された核酸のヌクレオチド配列と「実質的に相同」で、すなわち、約６０％の相同性、より好ましくは約７０％の相同性、さらにより好ましくは約８０％の相同性、より好ましくは約９０％の相同性、さらにより好ましくは、約９５％の相同性、さらにより好ましくは約９９％相同である。

元の結合ペプチドの免疫学的活性を保持しなければならないという規定のもとで、好ましい実施形態の範囲は、より短い及びより長いペプチドおよびポリヌクレオチドを含む、ホモログ、アナログ、バリアント、誘導体および塩を、同様に一又は複数のアミノ酸又は核酸が置換されたペプチドおよびポリヌクレオチド類似体を、同様に、当技術分野で知られているようなアミノ酸または核酸の誘導体、非天然アミノ酸または核酸および合成アミノ酸、または核酸を包含することは、明示的に理解されるべきである。具体的には、アクティブな活性結合ペプチドの断片だけでなく、拡張物、抱合体および混合物が本明細書に記載の原理に従って包含される。

好ましい実施形態は、これらの相同なＤＮＡが、本明細書に開示される結合ペプチドの生物学的活性を有するならば、本明細書に記載され参照された核酸に相同な、任意のおよび全ての単離された核酸を含むと解釈されるべきである。

当業者は好ましい実施形態の核酸は好ましい実施態様のペプチドをコードするＲＮＡまたはＤＮＡ配列及びそれらの任意の、無細胞である場合または細胞と関連しているときにヌクレオチド配列をより安定にするＤＮＡまたはＲＮＡの化学修飾を含む、改変型を包含することを理解するだろう。ヌクレオチドの化学修飾はまた、ヌクレオチド配列が細胞によって取り込まれる効率、または細胞内で発現される効率強化するために使用されてもよい。任意の及び全てのヌクレオチド配列の改変の組み合わせは、好ましい実施形態において熟慮される。

さらに、例えば、上記のＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌによるおよび上記のＡｕｓｕｂｅｌらによるもののような当該分野で周知の組換えＤＮＡ方法論を用いて、あらゆる手順を好ましい実施形態のペプチドの変異体、誘導体もしくは変異型の生成に使用することができる。ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を改変することによりペプチドまたはポリペプチド中のアミノ酸の変化を導入するための手順は、当技術分野で周知であり、これらの、またはほかの論文にも記載されている。

好ましい実施形態の結合ペプチドをコードする核酸は、例えばレトロウイルスベクターのような適切なベクターに組み込むことができる。これらのベクターは、当該分野で周知である。核酸またはそれらを含むベクターは、有効に所望の細胞に導入することができ、細胞は好ましくは患者由来である。

凍結保存
ＰＢＭＣを被験体から得て、分離した後、本明細書に記載された任意の血液検査／アッセイを実行する前に、当業者に周知の方法を使用して凍結保存することができる。

診断／予後／治療モニタリングツールとしての使用本明細書に記載されるように、循環ＨＥＲ２−反応性ＩＦＮ−γ^ｐｏｓＣＤ４^＋Ｔｈ１細胞の減少は、早くもＤＣＩＳ乳癌で始まり、実質的に早期侵襲ステージＩのＨＥＲ２^ｐｏｓ腫瘍で減少することが見出された。より具体的には、健康なドナーからＨＥＲ２^ｐｏｓＤＣＩＳ（非浸潤性乳管癌）を経てＨＥＲ２^ｐｏｓＩＢＣ（浸潤性乳癌）への乳房の腫瘍形成における連続体にわたり、段階的な抗ＨＥＲ２ＣＤ４^＋Ｔｈ１応答の減少がある。免疫応答のこの損失は起因するものがなく、すなわち、癌関連免疫抑制によるものではなく、おそらく侵襲病変への転位の増加に関連しておらず、調節性Ｔ細胞とは無関係である。

抗ＨＥＲ２ＣＤ４^＋のＴｈ１免疫応答の損失のこの知見に基づいた実施形態は、明らかに健康な個人のための、マンモグラフィーまたは他のスクリーニング手法を介して検出されないかもしれない乳癌および他の癌のスクリーニング方法を提供し、好ましい実施形態の血液検査は抗ＨＥＲ２ＣＤ４^＋のＴｈ１応答を検出するためのものである、迅速な免疫試験／アッセイを実行することを含む。健康な個人のものよりも低くなっている個人試験結果により、より決定的なテストが可能になり、より迅速な治療オプションの実行が可能になるだろう。例えば、本明細書中の血液検査は、有利には、ワクチン接種がＨＥＲ−２発現乳癌のリスクを低減することが考えられる、リスクのある患者を同定するために使用されることができる。例えば、リスクのある患者は応答を減少させうる授乳、妊娠、およびその他の生活のストレスイベントの完了後のものであってもよい。

このようなスクリーニング方法は、遺伝的素質や生活要因のような要因により乳癌を発症するリスクが高い患者にとって有益であり得る。診断の観点から、免疫バイオマーカーは、高リスク患者の抗ＨＥＲ２Ｔｈ１免疫の変動をスクリーニングするために開発することができる。ＩＨＣ染色や乳房生検標本のＦＩＳＨプロファイリングは、腫瘍の進化の分離したスナップショットのみを提供しているが、（例えばこの潜在的なバイオマーカーと同様に）免疫プロファイリングでは、腫瘍の自然史及び免疫影響を垣間見ることができる。任意の乳癌と診断された患者が、ＨＥＲ２発現する新しい乳房イベントまたは再発のための危険にさらされる可能性があるかどうか予測するために使用することができる。

別の実施形態では、抗ＨＥＲ２Ｔｈ１応答の喪失に基づく診断またはモニタリング試験は、ＨＥＲ２^ｐｏｓ乳癌患者が化学療法＋トラスツズマブなどのような標準的な非免疫療法によく応答するかどうかを予測するために使用することができる。

さらなる実施形態によれば、本明細書に詳細に説明するように、標的（例えば、トラスツズマブ）又は従来の（すなわち、化学療法）乳癌の治療と比べて、ＨＥＲ２由来クラスＩＩペプチド（ＤＣ１免疫）と自家ＤＣ１のワクチン接種を経て、ＣＤ４^＋のＴｈ１応答を優先的に復元することが可能である。このように、ＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣ患者において、ＨＥＲ２−パルスＤＣワクチン接種後はＣＤ４^＋のＴｈ１応答が効果的に回復したが、トラスツズマブ／細胞毒性化学療法（「Ｔ／Ｃ」）治療後は回復しなかった。好ましい実施形態の血液検査は、したがって、Ｔｈ１免疫応答の回復、または非回復の程度を決定するために、ワクチン接種前とワクチン接種後に実行される，したがって、患者は乳癌治療後本明細書における血液検査を介して以前に見つかったＣＤ４^＋Ｔｈ１免疫損失がワクチン接種によって回復したかどうかを測定することで簡単に自分のＣＤ４^＋Ｔｈ１応答を再評価することができる。

別の実施形態では、抗ＨＥＲ２ＣＤ４^＋Ｔｈ１応答の減少に依存する血液検査は、ＤＣ１のワクチン接種が抗ＨＥＲ２免疫を癌のさらなる侵入に対する保護を提供することができるレベルに十分に回復し増加したかを決定するために使用されてもよい。ＤＣ１ワクチン接種後、患者のＣＤ４^＋Ｔｈ１免疫状態を追跡するために、好ましい実施形態の血液検査を好ましくは患者の医師によって推奨されるスケジュールで、何度も行うことができる。これらの追加の試験は、ワクチン接種後、ワクチンが誘導したＨＥＲ２腫瘍標的に対する感作の耐久性と長期間にわたる保護の可能性のために、例えば、少なくとも約６０ヶ月以上まで、何ヶ月も行うことができる。

本明細書における血液検査を使用することは、ＨＥＲ２発現浸潤性乳癌患者の化学／トラスツズマブ治療後のＨＥＲ２−反応の程度を示すために使用されてもよい。相関はこのような患者が治療にどの程度よく応答するかで本明細書に示されており、それによって、結果を予測する。例えば、抑制された抗ＨＥＲ２Ｔｈ１応答は、免疫補助Ｔ／Ｃ治療を受けた患者におけるその後の再発のリスク増加を予測する。

他の実施形態は、ＨＥＲ２^ｐｏｓ浸潤性乳癌の患者に見られる抗ＨＥＲ２ＣＤ４^＋Ｔｈ１損失を増強または復元するための免疫戦略、すなわち、ＤＣワクチン接種のための方法を提供する。「免疫回復」のためのこの能力は、治療のために現在のトラスツズマブ療法と組み合わせて利用することができる。また、化学療法＋トラスツズマブを含む標準的な治療法と予防接種を組み合わせるための論理的根拠も提供するであろう。

別の実施形態は、新しい乳房イベントのリスクを予測するための免疫相関を示唆する。化学療法／トラスツズマブで処置されたＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣ患者において、応答の変動、より具体的には、抑制された抗ＨＥＲ２ＣＤ４^＋Ｔｈ１応答が、新規乳癌イベントのリスク増加と関連していることが示された。したがって、そのような抑制された応答は、患者がおそらく新しい乳房イベントに耐えるかどうかのような結果を予測するために使用することができ、そうであれば、おそらく追加の治療が必要になる。バイオマーカーを、このようにそれに基づいて開発することができる。

さらに、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ受容体を発現している、ＨＥＲ２^ｐｏｓ乳癌細胞が、Ｔｈ１由来サイトカイン（Ｔｈ１細胞によって産生される原型サイトカイン、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αを含む）に曝露されるとアポトーシスを起こすという、本明細書に記載の観測は、乳房退縮などの生理学的プロセス中に抗ＨＥＲ２Ｔｈ１細胞がＨＥＲ２発現細胞を制御または排除することに有用であることを示唆する。ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−ａ受容体の発現は、本明細書に記載のように試験したすべてのＨＥＲ２^ｐｏｓ乳癌細胞株で見出され、これらの抗ＨＥＲ２ＣＤ４^＋Ｔｈ１細胞は、ＨＥＲ２発現乳癌細胞株のアポトーシスを引き起こす可溶性因子を産生することがわかった。これは、抗ＨＥＲ２Ｔｈ１は、乳房退縮などの生理学的プロセス中にＨＥＲ２発現細胞を制御または排除することに役立っていることを示唆し、クラスＩＩ^ｎｅｇクラスＩ^ｐｏｓ腫瘍細胞を認識することはできない、ＣＤ４^＋Ｔｈ１細胞がそれにもかかわらずどのように腫瘍細胞の破壊を媒介することができるのか説明することができる。

本明細書に詳細に記載されるように、さらなる実施形態は、ＨＥＲ２^ｐｏｓ乳癌における標準術前補助療法に対する病理学的応答性を予測するための免疫相関を提供する。実験はＨＥＲ２発現侵襲乳癌患者のための化学／トラスツズマブ治療後のＨＥＲ２応答度が、治療への応答度とどれだけ相関するかを研究するために設計された。このような実験は、標準術前補助療法に対する病理学的応答性を予測するための免疫相関を明らかにした。関連性は、病理学的完全寛解を有さなかった患者と比較したときに、術前補助完全反応者と有意に高い抗ＨＥＲ２ＣＤ４^＋のＴｈ１応答との間に見出された。

Ｔ／Ｃ処理ＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣ患者のＨＥＲ２特異的なＴｈ１抑制の大きさが、新しい乳房イベントの続く再発の危険性の増加と相関する一方、対照的に、抗ＨＥＲ２ＣＤ４^＋のＴｈ１免疫の上述の保存は術前補助化学療法に対する完全な病理的応答と関連する。まとめると、これらのデータは、抗ＨＥＲ２Ｔｈ１免疫反応性を臨床的または病理学的障害のリスクがある脆弱な患者のサブグループを同定するためのバイオマーカーとして使用することができる旨示唆する。

本明細書に記載された本発明の実施形態は、ＨＥＲ２発現乳腺腫瘍の特定の参照例を含むことができるけれども、当業者によって理解されるべきであるように、例示するだけだが、卵巣、胃、食道、肺、膵臓、肝臓、前立腺および他の固形腫瘍のような他のタイプのＨＥＲ２発現腫瘍が、本発明の実施形態の教示から利益を得ることができる。同様に、当業者は、本明細書の教示をトリプルネガティブ及びＥＲ陽性、ならびに他の腫瘍を含む非ＨＥＲ２発現乳癌に拡張できることを理解できる。

さらに、好ましい実施形態に従って使用することができる受容体チロシンキナーゼファミリーの他のＨＥＲファミリーのターゲットが存在する。ＨＥＲファミリーは、４つの関連するシグナル伝達分子から構成される：種々の癌に関与しているＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、およびＨＥＲ４。過剰発現ＨＥＲ−２が乳癌の約２０％から２５％に見られることが知られているが、他のＨＥＲファミリーメンバーが他の癌と同様に、初期および浸潤性両方の乳癌に関与していることが判明した。例えば、ＨＥＲ１は、少数の乳癌に発現し、一般的にトリプルネガティブである。Ｃ−Ｍｅｔは、ＨＥＲ３を活性化する多くの癌の再発に関与する成長因子受容体である。ＨＥＲ３は、結腸癌、前立腺癌、乳癌および黒色腫で過剰発現される。ＨＥＲ３は、ＤＣＩＳ病変および乳癌の大多数において発現される。ＨＥＲ３は、ＤＣ１ＨＥＲ２ワクチン接種を受けた一部の患者における手術の時点で残存ＤＣＩＳにおいて検出されうる。したがって、乳癌および他の固形がんを引き起こすような、ＨＥＲ３、ＨＥＲ１およびｃ−Ｍｅｔのような他のＨＥＲファミリーターゲットは、有益に標的とされ、本明細書に記載されたＨＥＲ２でなされたように、これらの他のターゲットに対するペプチドワクチンが開発されうる。従って、患者の乳房の腫瘍で発現している分子の同定のためのＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ１およびＣ−Ｍｅｔのようなオンコドライバー／提案されたオンコドライバーを含む乳癌パネルを、治療の補助剤として開発することができ、ワクチン標的分子として使用することができる。従って、ＨＥＲ２のために本明細書に記載されたＤＣ１ワクチンに加えて、同様のワクチンを、非ＨＥＲ２発現乳癌タイプのために開発することができることが期待される。

実施例
好ましい実施形態は、以下の実験実施例を参照してさらに詳細に記載される。これらの実施例は、例示のみを目的として提供され、特記しない限り限定することを意図するものではない。したがって、好ましい実施形態は以下の実施例に決して限定されるべきでなく、むしろ、本明細書で提供される教示の結果として明らかになるありとあらゆる変更を包含すると解釈されるべきである。

さらに説明することなく、当業者は、前述の説明及び以下の例示的な実施例を使用して、本発明の実施形態を作成し、利用し、そして請求項に記載された方法を実行することができる。以下の実施例は、したがって、特に好ましい実施形態を指摘し、そしていかなる方法でも開示の残りを限定するものとして解釈されるべきではない。

以下の参考例は、方法、結果、及び考察のセクションを含む。

参考例
方法
患者の選択と研究計画

ペンシルベニア大学の施設内審査委員会による承認の後、現在記載されている研究に参加するために１４３人の患者が連続して募集され、インフォームドコンセントが得られた。健康なドナー（ＨＤ）（ｎ＝２１）、及び良性乳房疾患（ＢＤ）（ｎ＝１０）、ＨＥＲ２^ｎｅｇ−ＤＣＩＳ（ｎ＝１１）、ＨＥＲ２^ｎｅｇ（０／１＋）ＩＢＣ（ｎ＝１１）、ＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＤＣＩＳ（ｎ＝３１）を有する患者、及びＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣ（ｎ＝２２）の患者における抗ＨＥＲ２ＣＤ４^＋Ｔｈ１（Ｔｈ１）の応答を試験した。患者のＴｈ１応答を、ＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＤＣＩＳのための術前補助ＤＣ１免疫試験に登録し、手術でステージＩのＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣを有することが判明した（ｎ＝１１）免疫前後に（すぐに及び６ヶ月以降に）分析した。未処置のＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣ患者におけるＴｈ１応答をＴ／Ｃ処置されたステージＩ−ＩＩＩＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣ患者（ｎ＝３７）における応答と比較した。図１は、研究適格患者とドナーコホートを示す。Ｔ／Ｃ治療ＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣ患者は、任意の局所のまたは遠隔の再発として定義される、ＢＥの発生のため調査した。以下の表１は、本研究集団の人口統計学的及び腫瘍関連特性を示す（個々の患者のサブグループにとっての年齢、人種、ＡＪＣＣ病理学的段階、ホルモン受容体の状態、化学療法のタイミング及びトラスツズマブの完了からの時間（適用できる場合））（「ＩＢＣ」：浸潤性乳癌；「ＤＣＩＳ」：非浸潤性乳管癌；「Ｔ／Ｃ」：トラスツズマブ／化学療法）。Ｔ／Ｃ治療後、ＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣ患者は、任意の局所領域または遠隔の再発として定義される、その後の乳房イベント（ＢＥ）の発生のために観察された。すべての被験者のＴｈ１免疫応答が発生し、将来に向かって分析を行った。

ワクチン試験計画とワクチン接種手順ＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＤＣＩＳを有する患者のための、ＨＥＲ２−パルス、１型−極性化ＤＣワクチン接種の二つの術前補助試験が行われた。ＤＣワクチンは、以前に記載したように調製した。Ｋｏｓｋｉ，Ｇ．Ｋ．，ｅｔａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｏｎｏｔｈｅｒ．３５（１）：５４（２０１２）（Ｋｏｓｋｉ，ｅｔａｌ．）；Ｓｈａｒｍａ，Ａ．，ｅｔａｌ，Ｃａｎｃｅｒ１１８（１７）：４３５４（２０１２）（Ｓｈａｒｍａ，ｅｔａｌ．）；Ｆｒａｃｏｌ，Ｍ．，ｅｔａｌ．，Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．２０（１０）：３２３３（２０１３）；Ｌｅｅ，Ｍ．Ｋ．４ｔｈ，ｅｔａｌ，ＥｘｐｅｒｔＲｅｖ８（ｌｌ）：ｅ７４６９８（２０１３）；Ｃｚｅｒｎｉｅｃｋｉ，Ｂ．Ｊ．，ｅｔａｌ，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．６７（４）：１８４２（２００７）；Ｃｚｅｒｎｉｅｃｋｉ，Ｂ．Ｊ．，ｅｔａｌ，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．６７（１４）：６５３１（２００７）；ａｎｄＵ．Ｓ．ＰｕｂｌｉｓｈｅｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎＵＳ２０１３／０１８３３４３Ａｌを参照する。

本研究で使用されるＤＣワクチン接種戦略は図２に示される。そこで示されるように、タンデム白血球搬出／向流遠心エルトリエーションを経由して被験体から単球ＤＣ前駆体（ＣＤ１４^＋末梢血単核細胞）を得た。ＤＣを、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）（２５０ＩＵ／ｍＬ；Ｂｅｒｌｅｘ，Ｗａｙｎｅ，ＮＪ）及びＩＬ−４（１０００ｕ／ｍＬ、Ｒ＆Ｄシステムズ、ミネソタ州ミネアポリス）−これらは、未成熟ＤＣ（ｉＤＣ）と考えられているとともに、マクロファージ無血清培地（ＳＦＭ）（ＣＥＬＬＧＲＯ／メディアテック、バージニア州マナッサス）で一晩培養した。次の日ｉＤＣを、６個のＨＥＲ２ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドでパルスした（４２〜５６（配列番号：１）、９８〜１１４（配列番号：２）、及び３２８〜３４５（配列番号：３）（ＨＥＲ２の細胞外ドメイン）、及び７７６〜７９０（配列番号：４）、９２７〜９４１（配列番号：５）、及び１１６６〜１１８０（配列番号：６）（ＨＥＲ２の細胞内ドメイン））（Ｄｉｓｉｓ，Ｍ．Ｌ．，ｅｔａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎ．Ｒｅｓ．５（６）：１２８９（１９９９））（Ｄｉｓｉｓｅｔａｌ）（ＵｎｉｔｅｄＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ；ｐｅｐｔｉｄｅｓｓｔｏｒｅｄｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄａｎｄｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｄｉｎｓｔｅｒｉｌｅＰＢＳｆｏｒｕｓｅ、を参照する）。インキュベーションの８〜１２時間後に、ＩＦＮ−γ（１，０００Ｕ／ｍＬ）を添加した。次の日、回収の６時間前にＮＩＨ標準試料リポ多糖（ＬＰＳ）を添加し（１０ｎｇ／ｍＬ）、１型極性化表現型（ＤＣ１）への完全なＤＣ活性化を達成した。ＨＬＡ−Ａ２．１^ＰＯＳ患者に対して、２つの追加のＭＨＣクラスＩ結合ペプチド（ペプチド３６９〜３７７（配列番号：７）及びペプチド６８９〜６９７（配列番号：８）でＤＣ１をパルスした。回収した細胞を洗浄し、７０％を超える生存率、グラム染色陰性、及びエンドトキシン５ＥＵ／キロ未満のロット放出基準を確認した。

Ｋｏｓｋｉらにより記載されたように、節内及び／または病巣内のワクチン注射を行った。簡潔にいうと、ワクチン接種は、ペンシルバニア大学病院の国立衛生研究所が指定した総合臨床研究センターで投与した。注射薬は、１ｍｌの滅菌生理食塩水に懸濁された１０〜２０百万個のＨＥＲ２パルスＤＣを含み、鼠径部リンパ節、乳房、または両方に超音波誘導によって投与された。ワクチン接種は、６週間にわたって週１回投与され、そして全ての患者は、６回のワクチン接種を完了した。ワクチン接種関連の安全性及び毒性データは、シャルマらによって以前に報告されている。

免疫応答の検出
上記で参照した６個のＨＥＲ２クラスＩＩ結合ペプチドでパルスした患者の非培養の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から、酵素結合免疫吸着スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイを用いてＩＦＮ−γ産生を測定することによって循環抗ＨＥＲ２ＣＤ４^＋Ｔｈ１応答を生成した。ＥＬＩＳＰＯＴはＫｏｓｋｉらにより記載された方法に従って行った。簡潔にいうと、ＰＶＤＦメンブレンプレート（マブテック社、シンシナティ、ＯＨ）を、抗ＩＦＮ−γ捕捉抗体（１−Ｄ１Ｋ（Ｍａｂｔｅｃｈ社））により一晩コーティングした。密度勾配遠心分離を用いて単離した凍結保存ＰＢＭＣを、５％ヒト血清を補充した予熱ＤＭＥＭ中で解凍した。プレートを洗浄し、ブロッキングした後、ＰＢＭＣをトリプリケートで播種し（２×１０^５細胞／ウェル）、プレートを２４〜３６時間３７℃でＨＥＲ２由来クラスＩＩ結合ペプチド（４μｇ）（ペプチド４２〜５６（配列番号：ｌ）、ペプチド９８〜１１４（配列番号：２）、ペプチド３２８〜３４５（配列番号：３）、ペプチド７７６〜７９０（配列番号：４）、ペプチド９２７〜９４１（配列番号：５）、及びペプチド１１６６〜１１８０（配列番号：６）、培地単独（無刺激対照）で、又は陽性対照（抗ヒトＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体、（各０．５μｇ／ｍＬ）、共にＢＤＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ社、ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）と共にインキュベートした。洗浄後、検出抗体（７Ｂ６−ｌ−ビオチン（マブテック社）；１００μｇ／ｍＬ）を各ウェルに添加し、プレートを３７℃で２時間インキュベートした。次に、ＰＢＳ＋０．５％ＦＣＳ中で１：１０００に希釈したストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼをインキュベーション前に３７℃で追加の１時間添加した。その後、ＴＭＢ基質溶液（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆ＰｅｒｒｙＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を添加しスポット形成を明らかにした。発色後、ウェルを水道水で洗浄した。スポット形成細胞（ＳＦＣ）は、自動ＥＬＩＳＰＯＴリーダー（ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔＣＴＬ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）を用いて計数した。

さらに、リコール（ｒｅｃａｌｌ）Ｔｈｌ応答を、特定の患者のサブセット由来の評価可能なＰＢＭＣを１：１００に希釈した呼び戻し刺激カンジダ・アルビカンス（ＡｌｌｅｒｍｅｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）及び破傷風トキソイド（ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ）で刺激することで、試験した。Ｔ_ｒｅｇ及び／又はＴｈ２表現型の相対的機能活性を決定するために、ＩＬ−１０産生をＧｕｅｒｋｏｖ，Ｒ．Ｅ．，ｅｔａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２７９：１１１（２００３）に記載されたように、２．５μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３抗体を陽性対照として使用して、ＥＬＩＳＰＯＴで測定した。

ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおける複製間の可変性は小さいので（データは示さず）、抗原特異的応答を決定する経験的方法を行った。個々のＨＥＲ２クラスＩＩペプチドに対する正の応答を（１）刺激されていないバックグラウンドを差し引いた後の実験ウェルにおける、２０ＳＦＣ／２ＸＬ０^５細胞の最小閾値；及び（２）バックグラウンドを超える抗原特異的なＳＦＣの少なくとも２倍の増加、と定義した。各患者群に対するＣＤ４^＋Ｔｈ１応答の３つの別々の測定基準は：（Ａ）全体の抗ＨＥＲ２応答性（１つより多いペプチドに応答する患者の割合）（応答性）、（Ｂ）反応性ペプチドの平均数（応答レパートリー）、及び（Ｃ）６個のペプチド全体の累積応答（ＳＦＣ／１０^６細胞として報告）（累積応答）、と定義した。

ＥＬＩＳＰＯＴのアッセイ間の精度
ＥＬＩＳＰＯＴのアッセイ間の精度は前述のように、Ｍａｅｃｋｅｒ，Ｈ．Ｔ．，ｅｔａｌ．ＢＭＣＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ９：９（２００８）（Ｍａｅｃｋｅｒ，ｅｔａｌ．）によって実行した。平均分散（ＣＶ）（３日間で３つの並列複製）を、ＨＥＲ２細胞外ドメイン（ＥＣＤ）ペプチドミックス（ペプチド４２〜５６（配列番号：１）；ペプチド９８〜１１４（配列番号：２）；及びペプチド３２８〜３４５（配列番号：３））で生体外で刺激した５人のドナーの累積Ｔｈｌ応答に対してプロットしたとき、特徴的な非直線関係が観測された。図３Ａに示すように、累積応答がゼロに近づくと平均ＣＶは劇的に増加した。ＣＶと累積応答レベルとの間の非直線関係のため、別の３日間の３回のアッセイの標準偏差（ＳＤ）をアッセイ間の可変性の尺度として累積Ｔｈ１応答に対してプロットした。同上。図３Ｂに示すように、ＳＤは累積応答と直線関係であることが見出された（実線は、平行点線で示される回帰の９５％信頼区間を伴う、生成されたＳＤの線形回帰を表す）。（Ｒ^２＝０．９６．ｐ＜０．０００１）

直線性の研究は、その研究において２人の高応答ＨＥＲ２−反応性の応答者から提供されたＰＢＭＣのトリプリケートサンプルを既知で同種の非ＨＥＲ２応答者からのＰＢＭＣに連続的に希釈し、そしてｅｘｖｉｖｏでＨＥＲ２ＥＣＤペプチドミックス（ペプチド４２〜５６（配列番号：１）、ペプチド９８〜１１４（配列番号：２）及びペプチド３２８〜３４５（配列番号：３））で刺激して、行われた。同じ非応答ドナーをすべてのアッセイに使用した。刺激されていないバックグラウンドを各希釈ポイントについて差し引いた。両方のドナー（＃１：三角；＃２：丸）において、Ｔｈ１応答と希釈濃度の間には有意な線形関係が観察された。まとめると、これらのデータは、ＥＩＳＰＯＴアッセイは、正確で信頼性が高く、再現性があることを示唆している。

ＨＥＲ２抗体検出
ＥＬＩＳＡを、内因性のＩｇＧ１及びＩｇＧ４抗ＨＥＲ２抗体について患者の血清を試験するために実施した。ＥＩＡ／ＲＩＡプレートを、重炭酸塩緩衝液中のＨＥＲ２ＥＣＤペプチド（５μｇ／ｍｌ、ＳｐｅｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）でコーティングし、室温（ＲＴ）で一晩インキュベートした。翌日、プレートをＰＢＳ中の１％カゼインでブロックし、血清（１：１００希釈）をブロッキング緩衝液に四重（ｑｕａｄｒｕｐｌｉｃａｔｅ）に添加し、２時間インキュベートし、１：５００希釈のＩｇＧ１またはＩｇＧ４（ライフテクノロジーズ、グランドアイランド、ＮＹ）のいずれかに特異的なＨＲＰ結合抗ヒト二次抗体を添加する前に、３回洗浄した。１時間のインキュベーション後、プレートを洗浄し、ＴＭＢ基質溶液（カークガード＆ペリー・ラボラトリーズ）を用いて現像した。

フローサイトメトリー
ＰＢＭＣ懸濁液を、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋１％ＦＣＳ＋０．０１％アジド）中で調製し、抗ヒト−ＣＤ３、−ＣＤ４、−ＣＤ８、−ＣＤ８３、−ＨＬＡ−ＤＲ、−ＣＤｌポンド、−ＣＤ３３、−ＣＤ１９、−ＣＤ５６、−ＣＤ１６（全てＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ＳａｎＪｏｓｅ，ＣＡ）、−ＣＤ４、及びＣＤ２５（ともにＢｉｏｌｅｇｅｎｄ、サンディエゴ、ＣＡ）を使用し、相対的なＰＢＭＣの免疫表現型を決定した。洗浄後、細胞を、抗体の混合物と室温で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄し、２％パラホルムアルデヒドで固定した。染色した試料を、２４時間以内に分析した。ＦｏｘＰ３固定／透過処理キット（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用して抗ＦｏｘＰ３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）を有するＰＢＭＣの細胞内染色を、製造業者の指示に従って行った。フローサイトメトリー分析は、ＢＤＬＳＲ−ＩＩサイトメーターを用いて行い、データセットは、セルクエストプロＴＭソフトウェア（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析した。

病理学的染色
ＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＤＣＩＳと−ＩＢＣ腫瘍由来のホルマリン固定、パラフィン包埋組織ブロックの薄片を作り、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色し、腫瘍周囲のリンパ球浸潤を評価した。ＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＤＣＩＳと−ＩＢＣ腫瘍由来のサンプルケースにおいて、多重標識ＩＦ（パーキンエルマー、マサチューセッツ州ウォルサム）を使用してリンパ球亜集団を調べた（以下を参照，Ｗａｎｇ，Ｃ，ｅｔａｌ．，ＪｏｕｒｎａｌｆｏｒＩｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙｏｆＣａｎｃｅｒ１１８：１（Ｓｕｐｐｌ．１）５４（２０１３）（Ｗａｎｇ，Ｃ，ｅｔａｌ）。腫瘍は、チラミドシグナル増幅を用いる同種の蛍光標識で、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２０及び４’６’−ジアミノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）について染色した。画像は、ベクトラマルチスペクトル顕微鏡を用いて、腫瘍、間質、及びＴ−／Ｂ−リンパ球を識別するパターン認識ソフトウェアで分析した。

アポトーシスアッセイ
ＨＥＲ２発現のスペクトラムを有するＢＣ細胞株（（Ｉｔｈｉｍａｋｉｎ，Ｓ．，ｅｔａｌ，Ｃａｎ．Ｒｅｓ．７３：１６３５−４６（２０１３）））−ＨＥＲ２^ｈｉｇｈＳＫ−ＢＲ−３、ＨＥＲ２^{ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ}ＭＣＦ−７、ＨＥＲ２^ｌｏｗＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）−をＲＰＭＩ−１６４０＋１０％ＦＢＳ（ＣＥＬＬＧＲＯ／メディアテック、バージニア州マナッサス）で培養した。５０ｘ１０^３ＢＣ細胞をトランスウェルシステム（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）に播種し、そして、１０^６ＣＤ４^＋Ｔ細胞及び１０^５ＤＣ１（成熟ＤＣ）またはｉＤＣ（未成熟ＤＣ）と共培養した。ＤＣ１、ｉＤＣ及びＣＤ４^＋Ｔ細胞を、シャルマらにより記載されるように、ワクチン接種後の選択した患者から得た。ＤＣｌ／ｉＤＣを、クラスＩＩＨＥＲ２または無関係の対照ＢＲＡＦペプチド（２０μｇ／ｍｌ）で３７℃２４時間パルスした。具体的には、Ｆｉｇｕｒｅ１０Ａに示すように、５０ｘｌ０^３ＳＫ−ＢＲ−３細胞を、培地のみ（完全培地）、１０^６ヒトＣＤ４^＋Ｔ細胞のみ（ＣＤ４^＋のみ）、１０^６ＣＤ４^＋Ｔ細胞＋１０^５の各ＨＥＲ２クラスＩＩペプチド（ｉＤＣＨ）−または無関係なクラスＩＩＢＲＡＦペプチド（ｉＤＣＢ）−パルスｉＤＣ、及び１０^６ＣＤ４^＋Ｔ細胞＋１０^５の各ＨＥＲ２（ＤＣｌＨ）−またはＢＲＡＦ（ＤＣｌＢ）−パルスＤＣＩと共培養した。ＤＣ１／ｉＤＣを、クラスＩＩＨＥＲ２または無関係な対照ＢＲＡＦペプチド（２０μｇ／ｍｌ）で３７℃２４時間パルスした。対照ウェルは、培地またはＣＤ４^＋Ｔ細胞のみを含有した。

ポリクローナルヤギＩｇＧ抗ヒトＴＮＦ−α（０．７５ｎｇ／ｍＬＴＮＦ−αあたり０．０６μｇ／ｍＬ）及びＩＦＮ−γ（５ｎｇ／ｍＬＩＦＮーγあたり０．３μｇ／ｍＬ）抗体（Ｒ＆Ｄシステムズ、ミネソタ州ミネアポリス）を使用してヤギＩｇＧアイソタイプを対照としてＴｈ１サイトカインを中和した。処置後、ＢＣ細胞を溶解し、切断されたカスパーゼ３を検出するためのウエスタンブロット分析に供した。核の断片化の程度は、ＤＡＰＩ染色により評価した。さらに、（ｉ）ｉＤＣ：ＣＤ４^＋又はＤＣ１：ＣＤ４^＋Ｔ細胞共培養由来の上清、又は（ｉｉ）ＴＮＦ−α（示されるように１０−２００ｎｇ／ｍＬ）＋ＩＦＮ−γ（示されるように１００−２０００Ｕ／ｍＬ）（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）とインキュベートした５０ｘ１０^３ＢＣ細胞のアポトーシスを、切断されたカスパーゼ３の検出によって試験した。

高レベルのげっ歯類ＨＥＲ２／ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２^ｈｉｇｈＴＵＢＯ及びＭＭＣ１５［後者はＬｉ−ＸｉｎＷａｎｇ，ＣｌｅｖｅｌａｎｄＣｌｉｎｉｃの寛大な支援］）及びＨＥＲ２^{ｌｏｗ／ｎｅｇ}（４Ｔ１）を発現したトランスジェニックマウス乳癌細胞株を、培地単独（ＲＰＭＩ−１６４０＋１０％ＦＣＳ）、組換えマウスｒｍＴＮＦ−α（１ｎｇ／ｍＬ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）単独、ｒｍＩＦＮ−γ（１２．５ｎｇ／ｍｌ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）単独、またはｒｍＴＮＦ−α＋ｒｍＩＦＮ−γの組み合わせとともに３７℃で７２時間インキュベートした。トリプシン処理後、回収した細胞を洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、ＦＩＴＣアネキシンＶ（４μ１）及びＰＩ（２μ１）を添加した。細胞を、２０分間、４℃でインキュベートし、２回洗浄し、フローサイトメトリーに供した。アポトーシス細胞は、両方のマーカーについて陽性染色されたものと定義した。ビンキュリンは、ローディングコントロールとして使用した。アポトーシスの誘導倍率を示す、対応する平均カスパーゼ３／ビンキュリン比±ＳＥＭを、イメージＪソフトウェアを用いて定量した。

ＥＬＩＳＡ
ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−α（ＢＤＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）用の捕捉及びビオチン化検出抗体及び標準物質を製造業者のプロトコルに従って使用した。

統計解析
記述統計を、患者の特性、免疫応答変数の分布を要約するために使用した。連続変数は平均、ＳＥＭ、及び頻度と割合による範囲及びカテゴリの変数によって要約した。データ変換（自然対数または平方根）は、パラメトリック試験の仮定を満たすために必要なときに、適用した。事後Ｓｃｈｅｆｆｅペアテスト（パラメトリック）又はＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓテスト（ノンパラメトリック）を有する分散分析は、３より大きい群の連続変数を比較するために使用した。スチューデントのｔ検定は、２群の比較のために使用した。フィッシャーの正確確率検定は、マルチレベルのテーブルにおけるカテゴリ変数を比較するために使用した。スチューデントのペアｔ検定とマクネマーの正確確率検定はＴｈ１応答変数における患者内ペアの変化を評価するために使用された（例えば、ワクチン接種前対ワクチン接種後）。ｐ値ｐ＜００．０５は、統計的に有意とみなした。すべての試験を両側で行った。統計分析は、ＳＰＳＳ（ＩＢＭ社製）またはＳｔａｔＸａｃｔ（Ｃｙｔｅｌ社カリフォルニア州サンディエゴ）のいずれかで行った。

結果
患者の特性
ランダムで継続的な登録後、１４３人の被験者が試験の包含基準を満たした。参加者の平均年齢は５３．１±１．４（範囲、２１〜８８）歳で大部分（７９．０％）は白人種だった。採血された時点での患者／ドナーコホートは、図１及び上記の方法の節のセクションに示される。研究参加者のドナーの人口統計学及び腫瘍関連特性は、上記表１に詳述される。ＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＤＣＩＳ及び−ＩＢＣコホートの、それぞれの２６人（８３．９％）及び１１人（５０．０％）の患者は、それぞれ以前に、ＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＤＣＩＳのための術前補助１型極性化（ＤＣ１）ワクチン接種試験に登録していて、彼らの患者／腫瘍特性はＳｈａｒｍａらによって報告されている。

全身性の抗ＨＥＲ２のＴｈ１免疫の損失は、乳房腫瘍形成の進行と相関する
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を使用して、腫瘍形成の連続体に亘って全身抗ＨＥＲ２ＣＤ４^＋Ｔｈ１応答の変化を生体外でのＨＥＲ２ペプチド刺激ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイ法により、予め調べた。３個のＴｈ１応答の測定基準をグループ間で比較した：（ａ）全体の抗ＨＥＲ２応答（１より多いペプチドに応答する患者の割合）、（ｂ）反応性ペプチドの平均数（レパートリー）、及び（ｃ）上述した６個のクラスＩＩペプチドに亘る累積応答。健康なドナー（ＨＤ）、または良性乳房疾患（ＢＤ）患者と比較したとき（図１、コホートＡ）、Ｔｈ１応答における有意な段階的な減少がＨＥＲ２^ｐｏｓ乳癌患者において観察された。未治療ＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＤＣＩＳ（図１、コホートＣ）で開始し、治療ナイーブステージＩ／ＩＩＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣ（図１、コホートＦ）における低点に達し、Ｔｈ１免疫のこの進行性の損失は、すべてのＴｈ１応答の測定基準全体に均一に観察された。例えば、全体的な抗ＨＥＲ２応答は、ＨＤ／ＢＤにおける１００％からＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＤＣＩＳにおける８４％に、ＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣ患者における３２％に減少した（ｐ＜０．０００１）。同様の有意な段階的な減衰応答レパートリー（５．２±０．２対４．５±０．４対２．０±０．３対０．４±０．２、ｐ＜０．０００１）及び累積応答（２５９．９±２３．５対２２５．１±２５．５対１２６．１±２４．４対３２．３±５．４、スポット形成細胞（ＳＦＣ）／１０^６細胞、ｐ＜０．０００１）が、ＨＤ、ＢＤ、ＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＤＣＩＳ、及びステージＩ／ＩＩＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣ患者に亘る、それぞれに、図５Ａに示すように全体で観察された。事後の比較では、応答レパートリー（ｐ＜０．００１）及び累積応答（Ｐ＝０．００１）によって評価して全体的な応答性（Ｐ＝０．０７）で評価しないとき、ＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＤＣＩＳ患者におけるＴｈ１応答は、ＨＤにおける応答よりも有意に低かった。ＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣ患者でのＴｈ１応答は、これらの患者が、ＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＤＣＩＳ患者と比較して有意に低い全体的な応答性（Ｐ＝０．０００３）、レパートリー（ｐ＝０．００１）、及び累積応答（ｐ＜０．００１）を示したことでさらに抑制された。１０^６のＰＢＭＣあたりの反応性細胞の割合は、ＨＤにおける０．０３％からＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣ患者における０．００３％に及んだ。

未治療ＨＥＲ２^ｎｅｇ−ＤＣＩＳ（図１コホートＢ）またはＨＥＲ２^ｎｅｇ−ＩＢＣ（図１コホートＤ）の患者及びＨＤ／ＢＤ患者におけるＴｈ１応答は感知できるほどに変化しなかったことに留意すべきである。ＨＥＲ２^ｎｅｇ−ＤＣＩＳ患者と比較して、しかしながら、ＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＤＣＩＳ患者は有意に低い抗ＨＥＲ２のＴｈ１レパートリー（ｐ＜０．００１）及び累積応答（ｐ＝０．０２）を実証した。同様に、ＨＥＲ２^ｎｅｇ−ＩＢＣ患者と比較して、ＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣ患者は、図５Ａに示されるように低い応答性（Ｐ＝０．０００３）、レパートリー（Ｐ＜０．００１）、及び累積応答（ｐ＜０．００１）を有した。

患者グループ全体で累積Ｔｈ１応答への個々のＨＥＲ２ペプチド特異的な貢献は、図６に示すように、すべてのＨＥＲ２細胞外ドメイン（ＥＣＤ）と細胞内ドメイン（ＩＣＤ）ペプチド応答プロファイル（Ｐ＜０．００５０）に亘って、ＨＤ／ＢＤからＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣ患者と類似の段階的なＴｈ１減衰を明らかにした。不均衡なＤＣＩＳ／ＩＢＣ患者における選択ＨＥＲ２エピトープに対するＴｈ１免疫応答の集束は、ＨＥＲ２^ｐｏｓ腫瘍形成における進行性のＴｈ１損失を説明できないことがある。

ＨＤ／ＢＤドナーにおけるＴｈ１応答が特定のサブグループ内で不釣り合いに高いかを調べるため、応答を、年齢（＜５０歳（ｎ＝１６）、＞５０歳（ｎ＝１５））、閉経状態（閉経前（ｎ＝１６）、閉経後（ｎ＝１５））、人種（白人（ｎ＝２３）、その他（黒人／アジア人／など；ｎ＝８））、または妊娠回数（ゼロ（ｎ＝１２）、＞１（ｎ＝１９）妊娠）によって比較した。抗ＨＥＲ２のＴｈ１レパートリーまたは累積応答において有意差は年齢、人種、または閉経状態によって層別化したＨＤサブグループにおいては観察されなかった。しかし、妊娠ドナー（すなわち＞１妊娠）は、非妊娠ドナー（図５（ｃ））に比べ有意に高い抗ＨＥＲ２のＴｈ１レパートリー（５．３±０．２対４．６±０．２、Ｐ＝０．０１）及び累積応答（２９３．１±２１．２対１７８．２±１９．０、Ｐ＝０．０００８）を有していた。ＨＤ／ＢＤ及びＨＥＲ２ｐｏｓ−ＩＢＣドナー（各ｎ＝４）におけるＴｈ１応答の時間的な可変性を調べた。図７に見られるように、同じ患者から＞６ヶ月の間隔で採取した血液で、比較的変化のないＴｈ１レパートリーと累積応答が時間をかけて観察した。ＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣにおいて、抗ＨＥＲ２ＩｇＧｌ及びＩｇＧ４抗体応答が失われた。

ＨＥＲ２^ｐｏｓ乳房腫瘍形成を減衰するＨＤ内の既存の抗ＨＥＲ２のＴｈ１応答に注目した後、ＨＤ、ＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＤＣＩＳ及びＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣ患者由来の入手可能な血清を用いて、組換えＨＥＲ２ＥＣＤペプチドに対する血清反応性を試験した。Ｔｈ１免疫に関連したＩｇＧ１及び慢性抗原曝露に関連したＩｇＧ４の両方を評価した。ＨＤ（ｎ＝１２）及び未処置ＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣの患者（ｎ＝７）と比較して、ＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＤＣＩＳ患者（ｎ＝１０ＩｇＧ１、ｎ＝１１ＩｇＧ４）において、抗ＨＥＲ２ＩｇＧ１及びＩｇＧ４（共にｐ＜０．０００１両方）の両方のレベルにおける相対的な増加を図５Ｄに示されるようにＥＬＩＳＡによって観察した。ＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣ患者における比較的低い抗ＨＥＲ２抗体レベルは内因性抗ＨＥＲ２応答が疾患の進行の際に失われたことを示唆する。

曖昧なＨＥＲ２発現ＩＢＣ患者におけるＣＤ４^＋Ｔｈ１応答は明確なＨＥＲ２^ｎｅｇ−ＩＢＣと著しく異なる
ＨＥＲ２^ｎｅｇ−ＩＢＣ患者におけるＴｈ１プロファイルを、抗ＨＥＲ２Ｔｈ１免疫力の相対的低下を伴うサブグループを識別するために調べた。明確なＨＥＲ２^ｎｅｇ−ＩＢＣ（ＩＨＣ０／１＋）患者（ｎ＝１１）と比較して、曖昧なＨＥＲ２発現（ＩＨＣ２＋／ＦＩＳＨ陰性）ＩＢＣ患者（ｎ＝７）は、有意に低い全体的な応答性（２８．６％［ＩＨＣ２＋］対１００％［ＩＨＣ０／１＋］、Ｐ＝０．００２）、レパートリー（０．３±０．２対３．９±０．３、ｐ＜０．０００１）、及び累積応答（２１．４±６．５対１９１．２±１１．７ＳＦＣ／１０^６細胞、ｐ＝０．００２）を示した。曖昧なＨＥＲ２発現ＩＢＣ患者におけるＴｈ１応答は、図５Ａに示されるＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣ患者に見られるものと同様だった。ＥＬＩＳＰＯＴにより測定されるＩＬ−１０産生及びフローサイトメトリーによるＴ_ｒｅｇ（ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＦｏｘＰ３^＋）細胞の相対比率によって測定されるＩＬ−１０産生は、曖昧なＨＥＲ２^ｎｅｇ−ＩＢＣ患者及び明確なＨＥＲ２^ｎｅｇ−ＩＢＣ患者の間で有意差はなかった（データは示さず）。

Ｔｈ１応答の損失は、ホストレベルのＴ細胞免疫反応不顕性、又は増加した免疫抑制性の循環免疫表現型に関係するものではない
評価可能なドナーのサブグループにおける免疫力をＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴを介して抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８に対するＴｈ１応答を測定することによって評価した；これらの応答はまた、すべてのＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおけるドナー特異的ポジティブコントロールとしての機能も果たした。抗ＣＤ３／ＣＤ２８応答のメディアンは、それぞれ図５（ｂ）に見られるように、ＨＤ／ＢＤ（ｎ＝３１）、ＨＥＲ２^ｎｅｇ−ＤＣＩＳ（ｎ＝１１）、ＨＥＲ２^ｎｅｇ−ＩＢＣ（ｎ＝１１）、ＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＤＣＩＳ（ｎ＝５）ＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣ（ｎ＝１１）、及びＴ／Ｃ治療ＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣ（ｎ＝３７）のコホートとの間に、差がなかった（１０９８対１１０４対１０３２対１０９９対１３１８対１０３２ＳＦＣ／２ｘｌ０^５細胞、ｐ＝０．２２）。さらに、刺激をリコールするためのＴｈ１応答は［破傷風トキソイド（１０５±１７．０対９６±１５．６対１０１±１１．３ＳＦＣ／２ｘｌ０^５）、及びカンジダ・アルビカンス（１８５±１０．２対１９９±１５．３対１８１±１４．６ＳＦＣ／２ｘｌ０^５）］、それぞれ図８Ａに見られるように、評価したＨＤ（ｎ＝１０）、ＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣ（ｎ＝１１）、及びＴ／Ｃ治療ＩＢＣ（ｎ＝１０）のコホート間で同様だった。まとめると、これらのデータは、ＨＥＲ２ドライブＢＣにおける進行性の抗ＨＥＲ２Ｔｈ１応答の損失が、ホストレベルのＴ細胞免疫反応不顕性またはＩＢＣ患者のＰＢＭＣ中の損なわれた抗原提示能に起因するものではないことを示唆している。

フローサイトメトリーを用いて、ＣＤ３＋ＣＤ４＋（７２．８±２．３％対６２．６±３．２％対６３．３±６．９％、Ｐ＝０．２６）及びＣＤ３＋ＣＤ８＋（２５．１±２．９％対３７．９±４．７％対３８．２±６．６％、Ｐ＝０．１５）の細胞の平均割合は、それぞれ図８Ｂに示されているように、ＨＤ、ＨＥＲ２ｐｏｓ−ＩＢＣ、およびＴ／Ｃ治療ＨＥＲ２ｐｏｓ−ＩＢＣのコホートからのＰＢＭＣの間で有意な差はなかった。グループ間でＢ細胞（ＣＤ１９＋）またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞（ＣＤ３−ＣＤ１６＋）の割合に差は観察されなかった（データは示さず）。その後、全身の免疫抑制表現型を次のグループ間で比較した。図８Ｃに示すようにＨＤ、ＨＥＲ２ｐｏｓ−ＩＢＣ、及びＴ／Ｃ−治療ＨＥＲ２ｐｏｓ−ＩＢＣのサブグループの間で、それぞれ、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋細胞（Ｔｒｅｇ細胞）（１．８±０．３％対１．５±０．２％対１．７±０．３％、Ｐ＝０．７８）、及びＣＤ１１ｂ＋ＣＤ３３＋ＨＬＡ−ＤＲ−ＣＤ８３−細胞（骨髄由来サプレッサー細胞「ＭＤＳＣ」）（０．６±０．１％対１．０±０．３％対０．９±０．１％、Ｐ＝０．３３）の平均の割合に有意差は認められなかった。

ＨＥＲ２特異的ＩＬ−１０産生、Ｔヘルパー２型（Ｔｈ２）及び／またはＴ_ｒｅｇ機能の代用もまた、ＥＬＩＳＰＯＴを介して患者サブグループ間で試験した。図８Ｄは、抗ＨＥＲ２応答性（すべて１００％）、レパートリー（１．８±０．４対１．８±０．２対２．０±０．３）、及び累積応答（７７．４±１５．２対６６．６±８．２対９２．８±４．７）は、それぞれ、ＨＤ、ＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣ、及びＴ／Ｃ治療ＩＢＣコホート間で有意差がなかったことを示している。図８Ｅは、抗ＣＤ３刺激に対するＩＬ−１０産生がすべての評価グループ間で類似していたことを示している。全体的なＩＬ−１０産生はサブグループ間で差はなかったが、ドナーが一致したＨＥＲ２特異的ＩＦＮ−γ：ＩＬ−１０産生比はＨＤにおける６．６：１（相対的なＴｈ１に有利な表現型）から、未処理及びＴ／Ｃ治療ＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣ患者における、それぞれ０．７４：１及び０．９７：１（相対的にＴ_ｒｅｇ／Ｔｈ２に有利な表現型）へ劇的に変化した（Ｐ＝０．００９）（上パネル）。

全身のＴｈ１応答の損失は、ＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣ病変への不均衡なＴリンパ球の輸送とは無関係である
全身ＩＦＮ−γ^ｐｏｓＣＤ４^＋応答の損失がＩＢＣ病変への不均衡なリンパ球輸送に関連しているかを決定するために、病理学的レビューのために利用可能な１４個のＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＤＣＩＳ及び８個のＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣ病変の免疫組織化学（ＩＨＣ）分析を実施した。結果を図９Ａに示す。中程度（＞１５％の間質の関与）から高程度（＞２５％）のリンパ球のレベルが、評価可能な患者（上、矢印で示す）の大部分（１２／１４；８５．７％）におけるＤＣＩＳ含有管の外側の間質領域で集約することが観察された一方、リンパ球（矢印）の相対的な不足は、全８人のＩＢＣ患者において侵襲病巣の周りに見られた（９８／８；１００％）（下）。

リンパ球の表現型を、腫瘍及び間質領域を識別する新規な多重標識免疫蛍光（ＩＦ）イメージング技術によって分析し、Ｗａｎｇ，Ｃ，らにより記載されるように相対的なＣＤ４^＋（緑信号）、ＣＤ８^＋（黄色）、及びＣＤ２０^＋（赤）の亜集団を確実に検出した。結果を図９Ｂに示す。ＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣ腫瘍における間質性（ＳｔＬ）及び腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の大部分はＣＤ８^＋細胞（右上のパネル）から構成されていた。また、ＣＤ４^＋ＴＩＬ／ＳｔＬの相対的な不足が、ＤＣＩＳ病変（左上のパネル）と比較してＨＥＲ２ｐｏｓ−ＩＢＣ腫瘍で観察された。ＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣ病変への不釣り合いな腫瘍周囲ＣＤ４^＋Ｔ細胞の輸送では、ＩＦＮ−γ^ｐｏｓＣＤ４^＋Ｔ細胞サブセットの全身枯渇を説明できないかもしれない。

高／中度ＨＥＲ２発現であるが低ＨＥＲ２発現でないＢＣ細胞は、ＣＤ４^＋Ｔｈ１媒介アポトーシスに対して感受性がある
試験管内でのＨＥＲ２^ｈｉｇｈＳＫ−ＢＲ−３、ＨＥＲ２^{ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ}ＭＣＦ−７、及びＨＥＲ２^ｌｏｗＭＤＡ−ＭＢ−２３１ＢＣ細胞株のＴｈ１媒介効果もまた評価した。ＨＥＲ２パルスＤＣ１で感作したＨＥＲ２クラスＩＩペプチド特異的ＣＤ４^＋Ｔｈ１細胞の増加割合を、上記のタイプのＨＥＲ発現ＢＣ細胞と、トランスウェル培養系を用いて共培養したところ、図１０Ａで示されるウエスタンブロット分析でカスパーゼ３が増加していることから証明されているようにＳＫ−ＢＲ−３は著しい用量依存性アポトーシスを起こし、図１１Ａで認められるようにＭＣＦ−７で著しい用量依存性アポトーシスを起こすがＭＤＡ−ＭＢ−２３１ＢＣ細胞株で起こさなかった。対照的に、図１０Ａ及び１１Ａに見られるように、未成熟ＤＣ（ｉＤＣＨ及びｉＤＣＢ）または対照クラスＩＩペプチド（ＢＲＡＦ）パルスＤＣ１（ＤＣ１Ｂ）で感作したＣＤ４^＋Ｔ細胞と共培養したＢＣ細胞においては、アポトーシスは比較的わずかであった。ＥＬＩＳＡによるこれらの共培養上清中でなされたＴｈ１サイトカインの定量から、図１０Ａに示されるＣＤ４^＋：ＢＲＡＦ制御ＤＣｌ、共培養に比べて、ＣＤ４^＋Ｔ細胞：ＨＥＲ２パルスＤＣｌからのＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−α産生が有意に増加することが示され、これは観察されたアポトーシスの程度に相当するものであった。

図１１Ｂに示すように、ＣＤ４^＋Ｔ細胞：ＨＥＲ２パルスＤＣ１共培養由来の上清と共にインキュベートした場合も、ＳＫ−ＢＲ−３細胞において同様に特異的なアポトーシスを観察したが、ＣＤ４^＋：ＨＥＲ２−ｉＤＣまたはＣＤ４^＋：ＢＲＡＦ制御−ＤＣ１共培養では観測されなかった。図１０Ｂ、右の写真とバーグラフに見られるように、対照と比較して、ＨＥＲ２特異的Ｔｈ１細胞は、ＤＡＰＩ染色によって証明されるようにＳＫ−ＢＲ−３のアポトーシスにおいて２５倍の増加を生じた。まとめると、これらのデータは抗ＨＥＲ２ＣＤ４^＋Ｔｈ１細胞は、低ＨＥＲ２発現ではなく高／中度ＨＥＲ２発現した乳癌細胞のアポトーシスを仲介する可溶性因子を産生することを示唆する。

重要なことに、ＨＥＲ２^ｈｉｇｈＳＫ−ＢＲ−３のアポトーシスは図１０Ａに見られるように、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αを中和することによって有意に救出され得、ＨＥＲ２特異的細胞のアポトーシスを媒介することにおいて、多面的なＴｈ１サイトカインの重要な役割を示唆している。これらの知見をさらに調査するために、ＢＣ細胞に対するＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−ａ治療の影響を試験した。ＨＥＲ２発現にかかわらず、図１０Ｃに見られるように、ヒトＢＣ細胞は一様に、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦーａ受容体の発現を維持した。図１１Ｃに見られるように、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−ａ処理は、ＨＥＲ２^ｈｉｇｈＳＫ−ＢＲ−３及びＨＥＲ２^{ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ}ＭＣＦ−７の有意なアポトーシスを生じたが、ＨＥＲ２^ｌｏｗＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のアポトーシスを生じなかった。次に、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞におけるＨＥＲ２発現の復元が、Ｔｈ１サイトカイン媒介性アポトーシスに対する感受性を回復するかを評価するために、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を野生型ＨＥＲ２プラスミド（ｐｃＤＮＡ−ＨＥＲ２）または対照空ベクター（ｐｃＤＮＡ３；ＭａｒｋＩ．Ｇｒｅｅｎｅの寛大な贈与、ペンシルバニア大学）で安定的に形質移入し、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−α（それぞれ、２０００Ｕ／ｍｌ及び２００ｎｇ／ｍｌ；図１１ＣでＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に対して使用したものと同等の用量）で処理した。ＨＥＲ２を形質移入したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞においては、著しいＩＦＮ−γ／ＴＮＦ−α誘導アポトーシスを観察したが、ベクターを形質移入した細胞においては観察しなかった（データは示さず）。

最後に、このＴｈ１サイトカイン媒介ＨＥＲ２特異的アポトーシスは、トランスジェニックマウス乳癌細胞で裏付けられた。図１０Ｄに見られるように、いずれかのサイトカイン単独でなく、組換えマウスＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αを用いた二重処置により、ＨＥＲ２^ｈｉｇｈＴＵＢＯ及びＭＭＣ１５の有意なアポトーシスを生じたが、ＨＥＲ２^{ｌｏｗ／ｎｅｇ}４Ｔ１細胞のアポトーシスは生じなかった。

ＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣにおけるＴｈ１応答損失は、ＨＥＲ２パルスＤＣワクチン接種した後に回復するが、ＨＥＲ２標的又は従来の治療後は回復しない
Ｔ／Ｃ治療及びＨＥＲ２パルスＤＣ１ワクチン接種後のＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣ患者におけるＴｈ１応答の差動効果を分析し、結果を図１２Ａ、上パネルに示した。未治療ステージＩ／ＩＩＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣ患者（ｎ＝２２；図１コホートＦ）及びＴ／Ｃ治療ステージＩ−ＩＩＩＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣ患者（ｎ＝３７；図１コホートＧ）は、抗ＨＥＲ２応答性（３１．６％未処理対４５．９％のＴ／Ｃ治療、Ｐ＝０．３９）、レパートリー（０．４±０．２対０．８±０．２、Ｐ＝０．２４）、または累積応答（３２．３±５．４対５４．５±１２．０ＳＦＣ／１０^６、Ｐ＝０．９７）で有意に異ならなかった。しかしながら、図１２Ｂ、上パネルに示すように、１１人のステージＩＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣ患者（図１コホートＨ）におけるＨＥＲ２パルスＤＣ１ワクチン接種後は、抗ＨＥＲ２応答性（１８．２％ワクチン前対９０．９％ワクチン後、ｐ＝０．００３５）、レパートリー（０．３±０．２対３．７±０．５、ｐ＜０．０００１）、及び累積応答（２９．７±７．９対１６２．８±３３．７ＳＦＣ／１０^６、Ｐ＜０．０００１）において、著しい改善が認められた。Ｔ／Ｃ治療後でなく、ＤＣ１ワクチン接種後の著しいＴｈ１回復効果は、図１２Ｃに見られるように、ステージＩ未処理（ｎ＝１１）、Ｔ／Ｃ治療（ｎ＝８）、及びワクチン接種（ｎ＝１１）ＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣ患者間のステージ対応比較で持続した。

Ｔ／Ｃの治療後と比較して、ＤＣ１ワクチン接種後のＩＦＮ−γ^ｐｏｓ：ＩＬ−１０^ｐｏｓ応答性Ｔ細胞の相対的な割合の違いを試験した。同時に行われたドナーを一致させた比較では、ＨＥＲ２特異的ＩＦＮ−γ（１９６．８±５６．８ワクチン後対３２．１±６．１プレワクチンＳＦＣ／１０^６、ｐ＝０．０２）及びＩＬ−１０（７９．０±７．４対３３．８±５．１ＳＦＣ／１０^６、Ｐ＝０．００１）の両方の応答がＨＥＲ２パルスＤＣ１ワクチン接種後に増強された一方、相対的なＩＦＮ−γ：ＩＬ−１０応答比は、０．９５：１（相対的にＴ_ｒｅｇ／Ｔｈ２に有利な）ワクチン接種前から、２．５：１（Ｔｈ１に有利な）ワクチン接種後（Ｐ＝０．００８）にシフトした。しかし、相対的なＩＦＮ−γ：ＩＬ−１０応答比は、未処理（０．７４：１、ｐ＝０．７８）のＨＥＲ２ｐｏｓ−ＩＢＣ患者と比較して、Ｔ／Ｃ治療後では、Ｔｈ１有利な表現型に向けた有意なシフトを示さなかった（０．９７：１）。図１２Ａ及び１２Ｂの下部水平棒グラフを参照。

ワクチン接種後６カ月以上の長期的なＴｈ１免疫評価が、９人（８１．８％）の患者に対して可能だった。図１２Ｄ及び１２Ｅに示すように、すべての患者においてワクチン接種後の術後化学療法が完了したにもかかわらず、耐久性のある抗ＨＥＲ２Ｔｈ１応答を１６月（６−６０の範囲）の中央値対ワクチン接種前ベースラインで観測した：抗ＨＥＲ２応答性（１００％ワクチン後６カ月以下対２２．２％ワクチン前、ｐ＝０．００８）、レパートリー（４．０±０．４対０．３±０．２、ｐ＜０．０００１）、累積応答（２５５．１±４９．２対３３．８±９．２ＳＦＣ／１０^６、Ｐ＝０．００６）。

一連の化学療法（術前補助療法または術後補助療法）によるＴｈ１応答性の変化を調査するために、Ｔ／Ｃ治療したコホートのサブグループ解析を行った：登録を検討するための所定のトラスツズマブの完了からの時間（６ヶ月未満又は６カ月以上）；エストロゲン受容体の状態（ＥＲ^ｐｏｓまたはＥＲ^ｎｅｇ）；及び病理学的ステージ（Ι−ＩＩＩ）。図１３Ａは、化学療法のシーケンス（術前補助療法［ｎ＝１２］対術後補助療法［ｎ＝２５］；）が、図１３Ｂは、トラスツズマブ完了からの時間（＜６カ月を超える［ｎ＝１６］対６ヶ月以下［ｎ＝２１］；）が、または図１３Ｃは、ＥＲ状態（ＥＲ^ｐｏｓ［ｎ＝２１］対ＥＲ^ｎｅｇ［ｎ＝１６］；）が、抗ＨＥＲ２Ｔｈ１応答、レパートリー、または累積応答（全てｐ＝ＮＳ）に影響を与えないことを示す。重要なことに、図１３ＤはＡＪＣＣステージＩ（ｎ＝８）、ステージＩＩ（ｎ＝２０）、またはステージＩＩＩ（ｎ＝９）Ｔ／Ｃ−治療患者が、任意のＴｈ１計量によって差は認められず、ＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣで観察された抗ＨＥＲ２Ｔｈ１の欠乏が疾病負荷とは無関係であったことを示唆している。また、これらのデータはまとめて、特定のサブグループの支配的なＴｈ１反応性プロファイルはＴ／Ｃ治療ＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣ患者において包括的に観察された免疫回復の不足の原因とならないことを示唆している。

抑制された抗ＨＥＲ２のＴｈ１応答は有害臨床病理学的結果と相関する
これらの知見のトランスレーショナルな（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ）関連性を評価するために、Ｔ／Ｃ治療ＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣ患者におけるＴｈ１応答の変動がその後の乳房イベント（ＢＥ；任意の局所領域／遠隔再発と定義する）の発生に関連するか判断するために評価を行った。追跡期間の中央値は３３．５（四分位範囲「ＩＱＲ」２５．５〜４５．８）か月だった。以下の表２に示すように（トラスツズマブ及び化学療法後に、引き続き乳がんイベント（任意の局所領域または全身再発として定義される）を受けるＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣ患者の人口統計学的及び臨床的特徴を示す）、８人の患者（２１．６％）が２９（ＩＱＲ１６．２〜３６）カ月持続時間の中央値でＴ／Ｃ治療後のＢＥを負った。図１３Ｅの左のパネル、ＢＥのない患者と比較して、ＢＥを受ける患者は抗ＨＥＲ２応答性（上）（１２．５％＋ＢＥ対５５．２％ＢＥなし；Ｐ＝０．０４８）及び累積応答（下）（９．４±３．６対６６．９±１４．５ＳＦＣ／１０^６；Ｐ＝０．０４６）が大幅に抑制されたが、応答レパートリー（中央）（１．０３±０．３対０．１３±０．１；Ｐ＝０．１１）はそうでなかった、ことを示す。

術前補助療法Ｔ／Ｃを受けた１２人の（３２．４％）Ｔ／Ｃ治療ＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣ患者において、抗ＨＥＲ−２のＴｈ１応答を、病理学的完全応答者（ｐＣＲ；術後の病態上残留浸潤性ＢＣの証拠がない患者として定義される）と非−ｐＣＲ患者間で比較した。図１３Ｅ、右パネルにおける結果は、４人の患者（３３．３％）において達成された、ｐＣＲが、非−ｐＣＲの患者と比較して、有意に高い抗ＨＥＲ２レパートリー（３．３±１．１対０．１３±０．１３、Ｐ＝０．００２）（中央）及び累積応答（１９３．１±６４．９対１３．６±４．６、Ｐ＝０．００２）（下）と関連付けられ、抗ＨＥＲ２応答（１００％対２５％、Ｐ＝０．０６）（上）は、統計的有意性に達しなかったことを示す。

考察
チェックポイント阻害剤の出現（Ｔｏｐａｌｉａｎ，Ｓ．Ｌ．，ｅｔａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６６：２４４３−５４（２０１２））、及び組織特異的エピトープに対するワクチン（Ｋａｎｔｏｆｆ，Ｐ．Ｗ．，ｅｔａｌ，Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６３：４１１−２２（２０１０））、Ｔｏｌｌ様受容体アゴニスト又は養子Ｔ細胞療法（Ｋａｌｏｓ，Ｍ．，ｅｔａｌ，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．３（９５）：９５ｒａ７３（２０１１）ａｎｄＲｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．，ＮａｔｕｒｅＲｅｖｉｅｗｓＣｌｉｎｉｃａｌＯｎｃｏｌｏｇｙ８：５７７−８５（２０１１））のような免疫調節戦略の使用はより効果的な癌免疫療法のためのお膳立てをする。これらの治療の多くは、広範な免疫調節を対象としている。これらの発見と同時に、ゲノムプロファイリングは、Ｖ−ＲＡＦマウス肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ−ＢＬ（ＢＲＡＦ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、肝細胞増殖因子受容体（Ｃ−ＭＥＴ）、及びＨＥＲ２を含む、腫瘍形成の特異的分子ドライバを特定してきた。治療法は、このような「オンコドライバー（ｏｎｃｏｄｒｉｖｅｒｓ）」を標的とした治療方法は応答速度を奨励することを達成する一方、その成功は相対的に短命である、なぜなら多くの腫瘍は最終的に再発するか、または治療抵抗性になるからである（Ｐｏｈｌｍａｎｎ，ｅｔａｌ．ａｎｄＦｌａｈｅｒｔｙ，Ｋ．Ｔ．，ｅｔａｌ，Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６３：８０９−１９（２０１０））。腫瘍の発生時にオンコドライバー特異的な免疫欠陥を特定することは、特定の癌サブタイプに合わせた治療の機会を提供しうる。本明細書で記載されるのは、既定のＢＣ表現型、すなわちＨＥＲ２／ｎｅｕの分子オンコドライバーに特異的な腫瘍形成においてＣＤ４^＋Ｔｈ１免疫欠陥を識別する第１の研究であると考えられる。

抗ＨＥＲ２ＣＤ４^＋Ｔｈ１免疫における減衰は、前悪性ＤＣＩＳ段階で始まり、そして次第に早期侵襲性疾患状態で失われる。さらに、Ｔｈ１免疫は、ＨＥＲ２過剰発現の表現型において特異的に失われたように思われる。広範な腫瘍形成性連続体を利用して、ＨＥＲ２^ｎｅｇ−ＤＣＩＳ及びＨＥＲ２^ｎｅｇ−ＩＢＣ患者（ＩＨＣ０／１＋）における抗ＨＥＲ２Ｔｈ１応答がＨＤ／ＢＤドナーにおいて見られるものに酷似しており、ＨＥＲ２^ｐｏｓ（ＩＨＣ３＋または２＋／ＦＩＳＨ陽性）ＤＣＩＳ及びＩＢＣ患者それぞれにおいて見られるＴｈ１応答よりも有意に高かったことが本明細書において実証されている：そのうえ、Ｔｈ１免疫は曖昧なＨＥＲ２発現（ＩＨＣ２＋／ＦＩＳＨ陰性）個体において失われ、ＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣ患者において見られるそれと似ているように思われる。特に、ＨＥＲ２^ｎｅｇ−ＩＢＣ患者におけるＨＥＲ２特異的ＣＤ４^＋免疫の維持は、部分的には、ＣＤ８^＋Ｔ細胞を活性化することを目的としたＨＥＲ２ペプチドでのワクチン接種後のその改善された臨床転帰を説明しうる。Ｂｅｎａｖｉｄｅｓ，Ｌ．Ｃ．，ｅｔａｌ，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎ．Ｒｅｓ．１５：２８９５−９０４（２００９）を参照。

幾分驚くべきことに、ＨＤ／ＢＤは、容易に識別できる循環抗ＨＥＲ２Ｔｈ１細胞の集団を維持した。ＨＥＲ２は、通常は妊娠及び授乳期間中の分岐乳管細胞における膜成分であるので（Ｐｒｅｓｓ，Ｍ，Ｆ．，ｅｔａｌ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ５：９５３−６２（１９９０））、ＨＤ／ＢＤにおける既存のＣＤ４^＋Ｔ細胞応答が、乳房内の抗原提示細胞（ＡＰＣ）によるＨＥＲ２エピトープ提示の結果として生成されることは妥当である。実際、年齢、人種、または閉経状態とは独立しているが、ＨＤ／ＢＤにおける既存の抗ＨＥＲ２Ｔｈ１免疫は、非妊娠ドナーと比較して妊娠中に高かった。特に、後者は、ＢＣの発生のためのリスクが高い集団である。さらに、ｉｎｖｉｔｒｏでＩＦＮ−γ／ＴＮＦ受容体を発現している、ＨＥＲ２^ｌｏｗでなく、ＨＥＲ２^ｈｉｇｈＢＣ細胞株における、サイトカインＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αを介したＨＥＲ２特異的Ｔｈ１の著しいアポトーシス促進効果は抗ＨＥＲ２Ｔｈ１が、乳房退縮などの生理学的プロセス中でＨＥＲ２過剰発現細胞を制御または除去することに役立ちうることを暗示する。したがって、ＨＤにおける既存の抗ＨＥＲ２Ｔｈ１免疫は、抗ＨＥＲ２Ｔｈ１機能の抑止が腫瘍駆動機構を表してＨＥＲ２^ｐｏｓ腫瘍形成時の免疫監視を回避しうる一方、腫瘍形成イベントに対する保護を与えうる。興味深いことに、最近の証拠は、循環腫瘍関連抗原（例えば、ＭＡＧＥ６、ＥｐｈＡ２）特異的ＣＤ４^＋Ｔｈ１の優先的な死プログラミングが活動性疾患に罹患したメラノーマ患者において観察される免疫機能障害に貢献しうることを示唆している（Ｗｅｓａ，Ａ．Ｋ．，ｅｔａｌ，Ｆｒｏｎｔ．Ｏｎｃｏｌ．４：２６６（２０１４）。同様のメカニズムが本研究において観察された抗ＨＥＲ２ＣＤ４^＋Ｔｈ１免疫の損失に関与している可能性がある。そのような機構を解読したり、標的化することは、一次ＢＣ防止を目的とした免疫介入の開発のために重要でありうる。これらのメカニズムは、乳房の恒常性における抗ＨＥＲ２Ｔｈ１細胞の機能的意義と同様に、さらなる研究を保証する。

ＨＤ／ＢＤにおいて、先行するＨＥＲ２Ｔｈ１免疫は維持されたものの、ＨＥＲ２−反応性液性応答は維持されなかった。健康乳房においては、非炎症性の設定でのＡＰＣによるＣＤ４^＋Ｔｈ１細胞のプライミングは、ＩＦＮ−γ／ＴＮＦ−α分泌を介して、ＨＥＲ２発現細胞の恒常性に寄与する一方、抗体産生を駆動しない場合がある。しかし、ＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＤＣＩＳでは、ＨＥＲ２−反応性ＩｇＧ１／ＩｇＧ４の相対的な増加が非存在ではなく、中間のＴｈ１応答と関連していた。発生している腫瘍上のＨＥＲ２抗原性刺激の出現、その後の炎症性環境に残存するＴｈ１細胞へのＡＰＣによる提示により、一過性の抗体産生が可能となり得る。最終的に、ＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣにおいて、ＣＤ４^＋Ｔ細胞ヘルプの漸減は、抗体の継続的な生産を侵食し、それらの最終的な消失を生じうる。適応免疫の両腕のこの散逸により、原発性腫瘍の予防及び調節ができないこのような患者となり得る。

上述のものに加えて、抗ＨＥＲ２のＴｈ１免疫の損失は、慢性的なＴ細胞の枯渇、共阻害シグナル（例えば、ＴＩＭ、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４など）を引き起こす末梢性耐性又はＨＥＲ２反応性免疫表現型における変化、等の他のメカニズムを反映しうる。実際に、全体的なＩＬ−１０応答は、腫瘍形成連続体にわたって維持されているが、抗原特異的ＩＦＮ−γ：ＩＬ−１０の比率で評価した場合、ＨＥＲ２特異的応答は、強くＴｈ１に有利な（ＨＤ／ＢＤにおいて）表現型から、相対的にＴｈ２／Ｔｒｅｇに有利な（ＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣにおいて）表現型へ機能的にシフトする。したがって、７／２２（３２％）のＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣ患者における、弱められているとはいえ無傷のＴｈ１応答は、腫瘍形成時のＴｈ１抗腫瘍免疫防御と免疫寛容誘導性とのＴｒｅｇ／Ｔｈ２寄与との間の進行中のバランス（Ｌｅｖｉｎｇｓ，Ｍ，Ｋ，ｅｔａｌ，Ｂｌｏｏｄ１０５：１１６２−９（２００５））を反映している可能性がある。

それにもかかわらず、抗ＨＥＲ２Ｔｈ１免疫の損失は、ＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣ患者における循環免疫抑制集団の絶対的な増加に起因しなかった。以前の研究は、進行（ステージＩＩＩ／ＩＶ）ＢＣ（Ｌｉｙａｎａｇｅ，Ｕ．Ｋ．，ｅｔａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：２７５６−６１（２００２））及び他の固形腫瘍（Ｚｈａｎｇ，Ｂ．，ｅｔａｌ，ＰＬＯＳＯＮＥ８（２）：ｅ５７１１４（２０１３））におけるより高いレベルのＴｒｅｇ及び／またはＭＤＳＣを報告しているが、本研究では、初期段階（ステージＩ／ＩＩ）のＩＢＣ患者は、ＨＤに匹敵する免疫抑制プロファイルを持っているように思われる。これらの患者における抗ＨＥＲ２Ｔｈ１応答の劇的な減少は、従って、より一層説得力がある。さらに、末梢血液中の抗ＨＥＲ２ＩＦＮ−γ^ｐｏｓＣＤ４^＋Ｔ細胞のサブセットにおけるこの減少は、（ｉ）進行腫瘍形成に対する選択的ＨＥＲ２ペプチド反応性に対してバイアスが観察されないため免疫変形には無関係であり、または、浸潤性腫瘍へ輸送するＣＤ４^＋Ｔ細胞が極めて多いこととは無関係であった。しかし、後者の知見は、これらのデータが腫瘍微小環境におけるＨＥＲ２特異的ＣＤ４^＋ＴＩＬの隔離または枯渇を説明できるものではなく、注意して解釈されるべきである。最後に、ＩＢＣ患者における全身性のホストレベルＴ細胞免疫反応不顕性によって、抗ＨＥＲ２Ｔｈ１免疫抑制を説明することができないかもしれない。しかし、本研究では、この現象の可能な説明として、抗原特異的な細胞レベルの免疫反応不顕性を完全に除外することはできない。

重要なことは、この抗ＨＥＲ２Ｔｈ１抑制が、Ｔ／Ｃ治療ＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣ患者における局所領域または遠隔再発のリスク増加と関連していたことである。対照的に、抗ＨＥＲ２Ｔｈ１の保存は、術前補助Ｔ／Ｃ後のｐＣＲに相関した。まとめると、これらのデータは、ＨＥＲ２指向療法後の抗ＨＥＲ２Ｔｈ１免疫反応性を監視することが臨床的または病理学的障害のリスクがある脆弱なサブグループを識別しうることを示唆している。さらに、抗ＨＥＲ２Ｔｈ１欠陥と良好でない臨床病理学的結果との関連性から、このような免疫欠陥を反転しうる治療戦略の探索が保証される。

疾病負担（すなわち、病理学的段階）について制御した後でさえも、ＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣ患者における抑制された抗ＨＥＲ２Ｔｈ１応答は、外科手術、放射線照射、化学療法、またはＨＥＲ２標的トラスツズマブによって包括的に影響を受けないままである。複数の研究で、ＨＥＲ２^ｐｏｓ腫瘍において成長を低減しアポトーシスを誘導するトラスツズマブの能力（Ｄｏｇａｎ，Ｉ．，ｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３４７：４１−５１（２０１１））や、ＨＥＲ２^ｐｏｓ細胞を細胞毒性化学療法の殺腫瘍効果に感作するトラスツズマブの能力が実証されている（Ｈｅｎｓｏｎ，Ｅ．Ｓ．，ｅｔａｌ，Ｃｌｉｎ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．１２：６４５−５３（２００６））。これらの利点にもかかわらず、トラスツズマブの使用は、ステージＩ疾患を有するものを含む、大多数の患者においてＨＥＲ２特異的なＴｈ１免疫を認めうるほどには回復しなかった、その上、これらのＨＥＲ２標的治療に対するほぼ普遍的な耐性が、進行した疾患状態で観察された。Ｐｏｈｌｍａｎら。ＨＥＲ２を標的とする追加の戦略が、したがって、必要とされる。

本明細書で記載されたそのような戦略は、ＨＥＲ２由来のクラスＩＩペプチドを用いた自家ＤＣ１免疫であってもよい。ＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣ患者における術前補助ＨＥＲ２−パルスＤＣ１ワクチン接種に続いて（手術が続く）、抗ＨＥＲ２Ｔｈ１免疫の耐久性の回復が、ワクチン接種後最大６０ヶ月まで観察された。要するに、これらのデータは、（ｉ）適切な免疫学的介入で矯正され得ることから、このＨＥＲ２特異的ＣＤ４^＋Ｔｈ１免疫欠陥が、免疫学的に「固定された」ものでないことを示唆しており、更に、（ｉｉ）既存の体液性に基づくＨＥＲ２−標的療法とワクチン接種（または他の免疫調節戦略）との組み合わせにより、この疾患における長期的結果を改善し得ること示唆している。実際に、マウスモデルにおいて、細胞性のＨＥＲ２指向免疫（ＩＦＮ−γ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇＣＤ４^＋，ｂｕｔｎｏｔＣＤ８^＋，Ｔ−ｃｅｌｌｓ（Ｓａｋａｉ，Ｙ．，ｅｔａｌ，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．６４：８０２２−８（２００４））及び体液性のＨＥＲ２指向免疫の協働は、ＨＥＲ２^ｐｏｓ腫瘍の根絶に必須である（Ｒｅｉｌｌｙ，Ｒ．Ｔ．，ｅｔａｌ，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．６１：８８０−３（２００１））。

まとめると、現在の知見は、ＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＢＣ患者の免疫監視及び治療の選択のための意味を有する。考察したように、それは、ＨＥＲ２−駆動ＢＣを有する高リスク集団における標準的なＨＥＲ２標的療法に対する抗ＨＥＲ２免疫の追加を正当化する。確かに、試験では、術前補助Ｔ／Ｃ後の残存疾患を有するＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣ患者、及び術後補助療法後の進行性疾患を有するものにおいて、そのような組み合わせを検査することが始められてきている。また、従来のサーベイランス戦略（放射線画像、乳房生検標本のＩＨＣ／ＦＩＳＨプロファイリングなど）は、腫瘍の進化の単離したスナップショットを提供するのみであるが、高リスク患者の抗ＨＥＲ２Ｔｈ１免疫をリアルタイムの変動で監視することで、腫瘍の自然史及び免疫影響を垣間見る機会が提供され得る。ＣＤ４^＋Ｔｈ１免疫検出プロトコルを将来のＢＣ臨床試験設計へ思慮深く組み込むことは正当と思われる。

要約すると、本明細書は、我々の知る限り、乳房腫瘍形成の間の分子オンコドライバーに対するＣＤ４^＋Ｔｈ１免疫の進行性及び特異的な損失についての最初の記述であると考えられる。抑制した抗ＨＥＲ２Ｔｈ１免疫に関連した好ましくない臨床的及び病理学的転帰への瞥見は、ワクチン接種または他の免疫調節戦略を有する免疫回復は腫瘍の進行を緩和するまたは再発を防止するために、これらの高リスク患者において探求する価値があるかもしれないことを暗示する。抗ＨＥＲ２ＣＤ４^＋応答が他のＨＥＲ２^ｐｏｓ癌（すなわち、卵巣、胃、など）で失われるのかを判断、及び他の分子オンコドライバーに対するＴｈ１免疫について腫瘍形成中に全身性の損失があるかの判断をする更なる研究が保証される。

実験例１
抗ＨＥＲ２ＣＤ４^＋Ｔｈ１応答は、ＨＥＲ２陽性乳癌における術前補助療法後の病理的応答に相関する新規免疫である
現代的な治療では、より大きな切除可能な腫瘍を有する患者は、多くの場合、トラスツズマブと化学療法（Ｔ／Ｃ）の術前補助投与から、ほぼ４０％〜６０％病理学的完全応答（ｐＣＲ）を達成する恩恵を受ける。Ｇｉａｎｎｉ，Ｌ．，ｅｔａｌ，Ｌａｎｃｅｔ３７５：３７７−８４（２０１０）；Ｕｎｔｃｈ，Ｍ．，ｅｔａｌ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２８：２０２４−３１（２０１０）；Ｕｎｔｃｈ，Ｍ．，ｅｔａｌ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２９：３３５１−７（２０１１）を参照。外科手術での残留疾患の事実（＜ｐＣＲ）と比較することで、術前補助Ｔ／Ｃ後のｐＣＲの達成は、減少した再発及び改善された長期生存のための確立された代理である。

上記参考例は、ＨＥＲ２^ｐｏｓ乳房癌における腫瘍形成連続体に亘る抗ＨＥＲ２ＣＤ４^＋Ｔヘルパー１型（Ｔｈ１）免疫における進行性の損失を実証した。特に興味深いのは、このＨＥＲ２特異的なＴｈ１応答が、ＨＥＲ２^ｎｅｇ（０−１＋）浸潤性乳癌（ＩＢＣ）を宿す患者と同様に、健康なボランティアで保存されていることである。ＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣ患者において、この抗ＨＥＲ２Ｔｈ１欠陥は、外科的切除、放射線照射、またはＴ／Ｃ治療等の標準的治療の影響を受けないが、代わりにＨＥＲ２パルス１型極性化樹状細胞（ＤＣ１）のワクチン接種後に「復元」され得る。さらに、抑制された抗ＨＥＲ２Ｔｈ１応答が、術後補助Ｔ／Ｃ治療患者におけるその後の再発リスクの増加を予測していることも示された。これらの知見は、同様の抑制された抗ＨＥＲ２Ｔｈ１応答が、別の既知の再発の前兆、すなわち、術前補助Ｔ／Ｃ後の＜ｐＣＲ状況（Ｋｉｍ，Ｍ．Ｍ．，ｅｔａｌ，Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｌ．２４：１９９９−２００４（２０１３））においても観察されるものでるかの研究を促した。逆に、抗ＨＥＲ２Ｔｈ１応答の保存／回復をｐＣＲに関連付け得ると仮定された。従って、ｐＣＲと＜ｐＣＲ患者との間の抗ＨＥＲ２Ｔｈ１応答における違いを試験して病理的応答に相関する変更可能な免疫を同定した。

８７人のＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣ患者（３^＋または２^＋／ＦＩＳＨ陽性）を対象に抗ＨＥＲ２ＣＤ４^＋Ｔｈ１応答を前向きに分析し、ステージＩ／ＩＩＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣ患者（ｎ＝２２）とステージＩ−ＩＩＩＴ／Ｃ治療ＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣ患者（ｎ＝６５）との間で応答を比較した。抗ＨＥＲ２Ｔｈ１応答を、術後補助トラスツズマブの完了後に生成したＴ／Ｃ治療コホートにおいて、応答は、化学療法のタイミングによって層別化し（すなわち、術後補助対術前補助）、さらに術前補助コホート内のｐＣＲ状態及び＜ｐＣＲ状態によりサブ層別化した。ｐＣＲを、切除乳房標本及び採取リンパ節の病理学的検査で残留浸潤癌が存在しないことと定義した（すなわち、ｙｐＴＯ／ＴｉｓｙｐＮＯ）。

＜ｐＣＲコホートにおける四人の患者を補充して術後補助ＨＥＲ２パルス１型極性化ＤＣ（ＤＣ１）ワクチン接種試験（ＮＣＴ０２０６１４２３）に参加させた。これらの患者における抗ＨＥＲ２Ｔｈ１応答を、免疫前後に分析した。

方法
参考例に記載のように、循環抗ＨＥＲ２ＣＤ４^＋Ｔｈ１応答を、生体外で６個のＨＥＲ２由来クラスＩＩペプチド（ペプチド４２〜５６、ペプチド９８〜１１４、ペプチド３２８〜３４５、７７６〜７９０ペプチド、ペプチド９２７〜９４１、及びペプチド１１６６〜１１８０）（配列番号：１−６）でパルスした非培養ＰＢＭＣにおいて、酵素結合免疫吸着スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイを介してＩＦＮ−γ産生を測定することによって試験した。参考例に記載のようにＥＬＩＳＰＯＴを行った。ＨＬＡ−Ａ２．１ｐｏｓドナー由来のＰＢＭＣを、ＰＭＡ（５０ｎｇ／ｍｌ）及びイオノマイシン（１μｇ／ｍｌシグマアルドリッチ）を陽性対照として；二つのＨＥＲ２由来クラスＩペプチド：ペプチド３６９〜３７７（配列番号：７）及びペプチド６８９〜６９７（配列番号：８）で刺激した。

抗原特異的応答を決定するための経験的方法を用いた。個々のＨＥＲ２ペプチドに対する正の応答を次のように定義した：（１）未刺激のバックグラウンドを差し引いた後の実験ウェルにおける２０ＳＦＣ／２ｘｌ０^５細胞の最小閾値；及び（２）バックグラウンドを超える抗原特異的なＳＦＣの２倍以下の増加。Ｔｈ１応答の測定基準は、参考例で説明したように、抗ＨＥＲ２応答性、反応性ペプチドの数（レパートリー）、及び６ペプチド全体の累積応答（ＳＦＣ／１０^６細胞）だった。術後補助ＨＥＲ２−パルス１型極性化樹状細胞（ＤＣ１）ワクチン接種を受けた＜ｐＣＲ患者（ｎ＝４）のＴｈ１応答を免疫前／後に分析した。

結果
研究は、８７人の患者を含んでいた。未治療ＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣ患者（ｎ＝２２）における抑制された抗ＨＥＲ２Ｔｈ１応答は、Ｔ／Ｃ治療（ｎ＝６５）の後に、全体的に改善しなかった。術後補助Ｔ／Ｃと比較して、術前補助Ｔ／Ｃ（６１．５％）はより高いＴｈ１レパートリー（１．５対０．８、Ｐ＝０．０４８）と関連していた。ｐＣＲ（ｎ＝１６）及び＜ｐＣＲ（ｎ＝２４）患者は、人口統計学的／臨床的特性において差が認められなかった一方、ｐＣＲ患者はＥＲ^ｎｅｇ腫瘍をより持っているようだった。ｐＣＲ患者は＜ｐＣＲ患者と比較して、劇的に高い抗ＨＥＲ２応答性（９４％対３３％、Ｐ＝０．０００２）、レパートリー（３．３対０．３、ｐ＜０．０００１）、及び累積応答（１４８．２対２２．４、ｐ＜０．０００１）を示した。この相違は、ＣＤ４^＋Ｔ−ｂｅｔ^＋ＩＦＮ−γ^＋表現型によって媒介され、＜ｐＣＲ患者の免疫不全、ホストレベルのＴ細胞免疫反応不顕性、または増加した免疫抑制集団に起因しなかった。４人の＜ｐＣＲ患者において、Ｔｈ１レパートリー（３．７対０．５、Ｐ＝０．０１４）及び累積応答（１９２．３対３３．９、Ｐ＝０．０１４）はＨＥＲ２−パルスＤＣ１ワクチン接種後に有意に改善した。

結論
抗ＨＥＲ２Ｔｈ１応答は、術前補助Ｔ／Ｃ後の病理学的応答と相関する新規の免疫である。＜ｐＣＲ患者で術前補助療法を受けたＨＥＲ−２発現患者において、抑制されたＴｈ１応答は、ＨＥＲ２Ｔｈ１免疫介入で復元することができ、ｐＣＲまたは再発率を改善させることができる。

したがって、高リスクの＜ｐＣＲサブグループのために術前補助Ｔ／Ｃ療法への及び／又は術後補助設定においてＨＥＲ２標的Ｔｈ１免疫介入の付加を、正当化することができる。さらに、抑制された抗ＨＥＲ２Ｔｈ１免疫が、術後補助Ｔ／Ｃ−治療患者におけるその後の再発と相関するという、参考例における実証を考慮すると、抗ＨＥＲ２Ｔｈ１免疫におけるリアルタイムの変動のために高リスク＜ｐＣＲ患者を監視することは、既存のＸ線撮影の監視を補完し、治療的に介入する重要な手段を特定するのに役立つ。

要約すると、これは、ＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣ患者において、術前補助Ｔ／Ｃ後の抗ＨＥＲ２ＣＤ４＋Ｔｈ１免疫とｐＣＲとの間の重要な関連性を最初に記載したものと考えられる。因果関係は確認できないが、術前補助Ｔ／Ｃ後の＜ｐＣＲ患者において観察される劇的なＩＦＮ−γ^＋抗ＨＥＲ２Ｔｈ１欠陥は、ＨＥＲ２Ｔｈ１介入による免疫救出により、これらの高リスク患者における結果を改善することで、標準的なＨＥＲ２標的戦略を補完できる可能性を提起している。

実験例２
抑制された抗ＨＥＲ２ＣＤ４＋Ｔヘルパー１型応答は完全に治療したＨＥＲ２−陽性乳癌患者の再発と関連する−免疫監視の新しい役割

前向きなコホートを用いる本明細書の参考例において示されるように、ＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＢＣにおける腫瘍形成の連続全体で（健康なドナーからＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＤＣＩＳを通して、そして最終的にＨＥＲ２^ｐｏｓ侵襲ＢＣ患者へ及ぶ）、抗ＨＥＲ２ＣＤ４^＋Ｔヘルパー１型（Ｔｈ１）免疫における進行性の喪失がある。Ｄａｔｔａ，Ｊ．，ｅｔａｌ．，ＯｎｃｏＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ４：８ｅ１０２２３０１（２０１５）ＤＯＩ：１０．１０８０／２１６２４０２Ｘ．２０１５．１０２２３０１（Ｄａｔｔａ，Ｊ．，ｅｔａｌ．ＯｎｃｏＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）を参照。また、本明細書の実験例１において、抑制された抗ＨＥＲ２Ｔｈ１免疫は、不利な臨床病理学的な結果である手術時の残留疾患と相関する一方、抗ＨＥＲ２Ｔｈ１応答は、ＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＢＣにおける術前補助トラスツズマブ／化学療法（Ｔ＋Ｃ）後の病理学的応答と相関する新規免疫であることが示される。Ｄａｔｔａ，Ｊ．，ｅｔａｌ．，ＢｒｅａｓｔＣａｎｃｅｒＲｅｓ．１７（１）：７１（２０１５）（Ｄａｔｔａ，ｅｔａｌ．ＢｒｅａｓｔＣａｎｃｅｒＲｅｓ．）を参照。

これらの観察に照らして、抗ＨＥＲ２Ｔｈ１免疫がまた、完全に処理されたＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＢＣ患者における局所領域および／または遠隔再発と関連する可能性があるという仮説を立てた。探索性のコホートにおいて、免疫が疾患の再発と関連があるかを識別するために、再発及び無病のＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＢＣ患者間の相違を検査した。

方法
試験計画
ペンシルベニア大学の施設内倫理委員会による承認の後、インフォームドコンセントを得た後９５人のＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＢＣ患者を、非バイアスされた方法で募集した。適格患者は、組織学的に確認された浸潤性乳癌（ＩＢＣ）及びＨＥＲ２／ｎｅｕの過剰発現（ＩＨＣ３＋または２＋／ＦＩＳＨ陽性）を有し、免疫抑制薬を受けていなかった。未治療（すなわち、登録時に決定的な治療を受けていない）のステージＩ−ＩＩＩＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣ患者（ｎ＝２２）における抗ＨＥＲ２ＣＤ４^＋Ｔｈ１応答をＴ＋Ｃ治療を完了したステージＩ−ＩＶＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣ患者（ｎ＝７３；すなわち、術前補助又は術後補助のＴ＋Ｃ決定的な治療）のＴｈ１応答と比較した。Ｔ＋Ｃ治療を受けた患者では、分析は再発状態によって層別化した。

ＨＥＲ２^ｐｏｓ−確認された再発を、任意の局所領域（乳房／胸壁中での再発、腋窩不全）又は遠隔（肺、骨、脳転移など）の乳房イベント、またはその両方として定義した。再発に陥ったすべての患者は、追加の化学療法、ＨＥＲ２標的療法、または実験的（例えば、ＨＥＲ２パルス樹状細胞ワクチン接種）プロトコルの開始前に登録された。非再発患者は、彼らが最短２４ヶ月の経過観察で無病であった場合にのみ、分析の対象とした。図１４は、本実験例のための研究集団のフロー図である。

トラスツズマブ及び化学療法計画の予定と投与
Ｔ＋Ｃ−治療を受けた患者は、以下の療法のいずれかを術前または術後のいずれかで受けた：（１）ＡＣ／ＴＨ：アドリアマイシン／シクロフォスファミド（４サイクルで２週毎）その後タキソールとトラスツズマブの併用（１２週間、毎週）。（２）ＴＣＨ：トラスツズマブを併用したタキソテール／カルボプラチン（６サイクルで３週間毎）、または（３）ＴＣ−Ｈ：トラスツズマブを併用したタキソテール／シクロフォスファミド（４サイクルごとに３週間）。すべての患者は、通年の治療を完了するために追加のトラスツズマブ単独（３週間毎）治療を受けた。

免疫反応検出
参考例で上述したように、末梢血抗ＨＥＲ２ＣＤ４^＋Ｔｈ１応答を、生体外で６個のＨＥＲ２由来ＭＨＣクラスＩＩ−ペプチド（４２〜５６、９８〜１１４、３２８〜３４５、７７６〜７９０、９２７〜９４１、１１６６〜１１８０）でパルスした非培養のＰＢＭＣで、ＥＬＩＳＰＯＴを介してＩＦＮ−γ産生を測定することによって、試験した；Ｄａｔｔａ，Ｊ．，ｅｔａｌ．，ＯｎｃｏＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ；Ｄａｔｔａ，Ｊ．，ｅｔａｌ．，ＢｒｅａｓｔＣａｎｃｅｒＲｅｓ．、ａｎｄＫｏｓｋｉ，ｅｔａｌも参照。簡潔にいうと、２５〜３０ｍＬの全血を各研究参加者から、５本のヘパリン添加収集チューブ（ＢＤバイオサイエンス）に回収した。静脈切開の直後（＜４−６時間）、ＰＢＭＣを製造業者の指示に従って密度勾配遠心分離（すなわち、フィコール−パック法、ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて単離し、−８０℃で、１０％ＤＭＳＯヒト血清中に１０×１０^６細胞／ｍＬで凍結保存した。すべてのＰＢＭＣを凍結保存から４週間以内に利用した。解凍時の生存率は、６０〜８０％だった。ＰＶＤＦ膜プレート（Ｍａｂｔｅｃｈ社社）を、抗ＩＦＮ−γ捕捉抗体で一晩コーティングした。凍結保存したＰＢＭＣを、予熱したＤＭＥＭ＋５％ヒト血清中で解凍し、前記培地中で１×１０^６のＰＢＭＣで調製した。プレートを洗浄してブロックした後、ＰＢＭＣををトリプリケートで播種し（２×１０^５細胞／ウェル）、いずれかのＨＥＲ２ペプチド（複数可）（４μｇの、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社、ピスカタウェイ、ＮＪ）、培地単独（非刺激対照）、または陽性対照（抗ヒトＣＤ３／ＣＤ２８抗体［０．５μｇ／ｍＬ；ＢＤＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製］）と共に２４〜４８時間３７℃でインキュベートした。

評価可能な患者では、１：１００に希釈したカンジダ・アルビカンス［Ａｌｌｅｒｍｅｄ研究所］および破傷風トキソイド［サンタクルズ］のリコール刺激に対するＴｈ１応答を参考例に記載の通り試験した。Ｄａｔｔａ，Ｊ．，ｅｔａｌ．，ＢｒｅａｓｔＣａｎｃｅｒＲｅｓらにより記載されたように、Ｔヘルパー２型（Ｔｈ２）および制御性Ｔ細胞（Ｔ_ｒｅｇ）の機能の代替物である、ＨＥＲ２特異的ＩＬ−４およびＩＬ−１０産生をＥＬＩＳＰＯＴによって測定した。

抗ＨＥＲ２Ｔｈ１応答性を参考例に記載のように経験的方法論を用いて決定した。個々のＨＥＲ２ペプチドに対する陽性／反応性応答を、刺激されていないバックグラウンドを差し引いた後の実験ウェル中２０スポット形成細胞［ＳＦＣ］／２×１０^５ＰＢＭＣと定義した。３個の抗ＨＥＲ２Ｔｈ１応答の測定基準：（ａ）応答性（６個のペプチドの少なくとも１つに応答する患者の割合）、（ｂ）レパートリー（反応性ペプチドの平均数）、（ｃ）６個のペプチド全体の累積応答（ＳＦＣ／１０^６細胞）を測定した。

フローサイトメトリー
ＰＢＭＣをＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ＋１％ＦＣＳ＋０．０１％アジド）内に懸濁した。ＰＥ／ＦＩＴＣ／Ｃｙ５の共役マウス抗ヒトＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ２５、Ｔ−ｂｅｔ、ＧＡＴＡ−３、ＩＦＮ−γ、またはサブクラス適合対照（ＢＤバイオサイエンス）を、Ｄａｔｔａ，Ｊ．，ｅｔａｌ．，ＢｒｅａｓｔＣａｎｃｅｒＲｅｓに記載されたように相対ＰＢＭＣ免疫表現型を決定するために使用した。ＦｏｘＰ３の固定／透過化キット（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用して、抗ＦｏｘＰ３の細胞内染色を、製造業者の指示に従って行った。分析は、ＢＤＬＳＲ−ＩＩサイトメーターを使用して実行し、データセットをＣｅｌｌＱｕｅｓｔＰｒｏソフトウェアを用いて分析した。

Ｔｈ１対Ｔｈ２サブタイプの機能的寄与
ＰＢＭＣを２４ウェルプレートにＤＭＥＭ＋５％ヒト血清中１．２×１０^６細胞／ｍＬで再懸濁し、ＨＥＲ２クラスＩＩペプチド混合物（２４μｇ／ｍＬ）でパルスした。刺激を受けていない及び各ドナーからの抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体をパルスしたＰＢＭＣを、それぞれ、負および正の対照とした。３７℃で６時間インキュベーションした後、タンパク質輸送阻害剤ブレフェルジンＡ（シグマアルドリッチ；を１０μｇ／ｍｌ）を各試料に添加し、一晩インキュベートした。洗浄後、細胞を室温で３０分間、抗ヒトＣＤ４で染色した。細胞をその後、製造者の指示に従って二回洗浄し、Ｆｏｘｐ３固定／透過化キット（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を用いて固定し、透過処理し、そして、抗Ｔ−ｂｅｔ、抗ＧＡＴＡ−３、および抗ＩＦＮ−γ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で３０分間染色した。インキュベーション後、細胞を洗浄し、ＢＤＬＳＲ−ＩＩサイトメーターで分析した。

統計解析
記述統計により、患者の特性および免疫応答変数の分布を要約した。示されるように、非再発と再発ＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣコホート間の比較を行った：（ａ）２群／単変量試験−独立スチューデントのｔ検定（パラメトリック連続）、ウィルコクソン順位和検定（ノンパラメトリック連続）、およびχ^２検定（カテゴリカル）。（ｂ）２群未満のテスト−事後ボンフェローニテストと一方向分散分析。単変量試験でｐ＜０．１を持つ変数を、前方に段階的多変量ロジスティック回帰モデルに入力して再発に対する独立した相関を決定した（バイナリ結果はい／いいえ）。

単変量無病生存率（ＤＦＳ）の推定値は、抗ＨＥＲ２のＴｈ１応答性およびその他の共変量によって層別化し、カプラン・マイヤー法により調べた。非再発患者（最小２４ヶ月の経過観察）の観測は、最後の既知の経過観察で打ち切られた。多様な経過観察のためのすべての変数と対照の即時的な危険性を分析するために、Ｃｏｘ比例ハザードモデリングを行った。Ｃｏｘモデルの仮定を経時的なハザードの相互作用や比例を含め、評価した。Ｐ＜０．０５は、統計的に有意とみなした。すべての試験を両側検定で行った。分析は、ＳＰＳＳＶ２２（ＩＢＭ社、アーモンク、ＮＹ）を用いて行った。

結果
患者の特性
全体のコホート（ｎ＝９５）の人口統計および腫瘍関連の特性を以下の表３に詳述する。Ｔ＋Ｃ治療患者（ｎ＝７３）では年齢の中央値は４９歳（範囲、２４〜８５）で、大部分が白人だった（８７．５％）。患者の大多数は、エストロゲン／プロゲステロン受容体陽性（ＥＲ／ＰＲ^ｐｏｓ）腫瘍（５８．９％）を有し、局所的な進行／リンパ節陽性疾患を提示する（臨床ステージＩ：９．６％、ＩＩ：４７．９％、ＩＩＩ：４２．５％）。術前補助Ｔ＋Ｃを３７人（５０．７％）の患者に投与した。単純または非定型的乳房切除術を最も頻繁に（５３．４％）行い、アドリアマイシン／シクロフォスファミド／タキソール／ハーセプチンは、一般に利用されるＴ＋Ｃ措置（５７．５％）だった。

２５人（３４．２％）の患者が以下の表４に示すように、局所領域での再発、遠隔再発、または両方を負った；これらの患者の大多数（ｎ＝２１、８４％）でのＴｈ１応答を、再発の診断時に決定した。

抗ＨＥＲ２ＣＤ４^＋のＴｈ１応答は、再発を負ったＨＥＲ２^ｐｏｓＩＢＣ患者において抑制される。
図１５Ａにおいて、未治療（ｎ＝２２）、Ｔ＋Ｃ治療非再発（ｎ＝４８）、及びＴ＋Ｃ治療再発（ｎ＝２５）患者の間で抗ＨＥＲ２Ｔｈ１応答性、レパートリー、および累積応答を比較した。未治療患者からの抗ＨＥＲ２Ｔｈ１応答を「ベースライン」として使用して、再発のない患者と比較して、再発を負ったＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣ患者において、大幅に抑制された抗ＨＥＲ２Ｔｈ１応答性（未治療：３６．４％対再発：８．０％対非再発：８３．３％、Ｐ＜０．０００１）（上）、レパートリー（０．６±０．２対０．１±０．１対１．５±０．２、Ｐ＜Ｏ．０００１）（中央）、および累積応答（３２．８±４．７対１４．８±２．０対８０．２±１１．０、Ｐ＜０．０００１）（下）をそれぞれ、観察した。

図１５Ｂにおいて、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８刺激（Ｐ＝０．５７）、破傷風トキソイド（Ｐ＝０．４１）、およびカンジダ（Ｐ＝０．７４）に対するＩＦＮ−γ^＋の応答は、それぞれ、非再発と再発コホート間で有意差は見られず、観察された抗ＨＥＲ２Ｔｈ１の相違が再発を負った患者における免疫不全またはホストレベルのＴ細胞アネルギーに起因しないことを示唆している。

再発患者における抑制された抗ＨＥＲ２Ｔ細胞応答は、Ｔｈ２またはＴ_ｒｅｇではなく、Ｔｈ１表現型に起因する。
図１５Ｃは、Ｔ−ｂｅｔ（Ｔｈ１転写因子（Ｓｚａｂｏ，Ｓ．Ｊ．，ｅｔａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２９５（５５５３）：３３８−３４２（２００２）を参照）またはＧＡＴＡ−３（Ｔｈ２転写因子（Ｚｈｅｎｇ，Ｗ．，ｅｔａｌ，Ｃｅｌｌ８９（４）：５８７−５９６（１９９７）を参照）及び細胞内ＩＦＮ−γの共発現についてフローサイトメトリーにより評価したＨＥＲ２刺激ＰＢＭＣを示す（上）。非再発コホートと比較して再発コホートにおいて、それぞれ、ＨＥＲ２特異的ＣＤ４^＋ＧＡＴＡ−３^＋のＩＦＮ−γ^＋またはＣＤ４^＋ＧＡＴＡ−３^＋のＩＦＮ−γ⁻ではなくＣＤ４^＋Ｔ−ｂｅｔ^＋のＩＦＮ−γ^＋（０．２５±０．１％対０．０２±０．０１％、Ｐ＝０．０３９）表現型の大幅の割合の減少が観察された（中央）。ＨＥＲ２−刺激ＩＬ−４^＋応答性（Ｐ＝１．００）、レパートリー（Ｐ＝０．８４）、および累積応答（Ｐ＝０．４６）−Ｔｈ２機能の基準−は非再発と再発コホートとの間で差がなかった（下）。

さらに、図１５Ｄは、循環Ｔ_ｒｅｇ（すなわち、ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋Ｆｏｘｐ３^＋）表現型の絶対的な割合が非再発と再発コホートとの間でそれぞれが差がなかったことを示す（１．３±０．３対１．６±０．４、Ｐ＝０．６１）。ＨＥＲ２−刺激ＩＬ−１０^＋応答性（Ｐ＝１．００）、レパートリー（Ｐ＝０．７４）、および累積応答（Ｐ＝０．６６）−Ｔｒｅｇ機能の基準−は２つのコホート間で類似していた。

抗ＨＥＲ２Ｔｈ１応答は、無病生存率と独立して関連する
関連する人口統計学的／臨床病理学的特徴から交絡調整により、抗ＨＥＲ２Ｔｈ１応答と再発との間の関連の独立性を試験した。一変量テストで、再発及び非再発コホートにおいて年齢、閉経状態、人種、肥満度指数、併存疾患、臨床ステージ、ホルモン受容体状態、ＬＶＩの存在、核異型度、または乳房切除の必要によって差は認められなかった。しかし、術後補助Ｔ＋Ｃを受けた患者（Ｐ＝０．０２１）および術前補助療法後に残存病変を有するもの（Ｐ＝０．００６）の間で再発はより高頻度に見られた。多変量回帰を介してこれらの関連の変数を調節すると、以下の表５に見られるようにＴ＋Ｃ療法の順序（Ｐ＝０．３０４）ではなく抗ＨＥＲ２Ｔｈ１応答（Ｐ＜０．０００１）が、依然として再発と独立して関連していた。

図１６は解析的コホートを中央値４４カ月（ＩＱＲ３１）で抗ＨＥＲ２Ｔｈ１応答性によって階層化すると、Ｔｈ１応答性の患者と比較してＴｈ１非応答性の患者が、有意に亢進した無病生存期間（ＤＦＳ）（中央値４７対１１３ヶ月、Ｐ＜Ｏ．０００１）を実証したことを示す、この関連はコックスモデリングによって裏付けられた−Ｔｈ１非応答コホートを対象とした危険率：１５．２、９５％ＣＩ３．５ー６６．７（Ｐ＜Ｏ．００１）。

議論
この分析では、循環抗ＨＥＲ２ＣＤ４^＋Ｔｈ１応答が完全に治療されたＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣ患者における乳癌再発と相関がある新規免疫となりうることが示されている。免疫不全またはホストレベルのＴ細胞アネルギーに起因しない一方、再発を被る患者における抑制された抗ＨＥＲ２Ｔ細胞応答はＴｈ２又はＴ_ｒｅｇでなく、主にＴｈ１表現型によって駆動される。関連する人口統計学的／臨床病理学的因子を制御すると、抗ＩＴＥＲ２Ｔｈ１応答は、独立して再発と関連していた、リスク調整後の分析で、Ｔｈ１−非応答性の患者はＴｈ１応答性患者と比較して有意に亢進したＤＦＳを実証した。これは疾患の再発と乳房腫瘍経営における既知のオンコドライバーーすなわちＨＥＲ２／ｎｅｕと特異的に関連するホストレベルの免疫との間の相関の最初の証明であるようだ。

これらのデータは、トラスツズマブからの利益（術後補助（Ｐｅｒｅｚ，Ｅ．Ａ．，ｅｔａｌ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．３３（７）：７０１−７０８（２０１５）ＤＯＬ１０．１２００／ＪＣＯ．２０１４．５７．６２９８）又は術前補助（Ｇｉａｎｎｉ，Ｌ．，ｅｔａｌ，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．７２（２４Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）：Ｓ６−７（２０１２）設定の両方）は、Ｔｈ１遺伝子がＩＦＮ−γ／ＴＮＦに特に支配的な役割を付与している、免疫に富む腫瘍のコホートに制限される可能性があることを示唆しているという最近の証拠に照らして特に興味深い。Ｐｅｒｅｚらを参照。まとめると、循環抗ＨＥＲ２のＴｈ１免疫の欠乏と同様に、腫瘍レベルのＴｈ１遺伝子発現の非存在がＨＥＲ２標的療法の失敗を予測しうるようである。これらの観察は、Ｔｈ１サイトカインＩＦＮ−γ／ＴＮＦ−αがＨＥＲ２特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞が媒介するトラスツズマブで治療したＨＥＲ２過剰発現乳癌のターゲティングを促進する上で決定的に必要であることを示す、試験管内での証拠により部分的に説明することができる。Ｄａｔｔａ，Ｊ．，ｅｔａｌ，ＹａｌｅＪ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．８７（４）：４９１−５１８（２０１４）；Ｄａｔｔａ，Ｊ．，ｅｔａｌ，Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２７１（２０１５）；ａｎｄＤａｔｔａ，Ｊ．，ｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＩｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．３（５）：４５５−４６３（２０１５）を参照。したがって、抗ＨＥＲ２Ｔｈ１免疫におけるリアルタイムの変動のため完全に治療されたＨＥＲ２^ｐｏｓＢＣ患者を監視することは、臨床病理学的障害の危険性のある脆弱な集団を明らかにすることができる。このような免疫監視は、既存の放射線監視を補完しないことがありうるが、抗ＨＥＲ２Ｔｈ１標的免疫介入などの治療的介入のための重要な機会を、同定することができる。Ｄａｔｔａ，ｅｔａｌ．ＢｒｅａｓｔＣａｎｃｅｒＲｅｓ．を参照。

免疫応答は、疾患の再発時に調べたので、これらの患者における抗ＨＥＲ２Ｔｈ１免疫が指標トラスツズマブ療法の完了後に抑制されるのかまたは再発の発生と同時に減少したのかは依然として不明のままである。ＨＥＲ２標的療法の完了前後の抗ＨＥＲ２Ｔｈ１応答の長期的な調査は、将来の臨床試験の文脈において必要とされているようである。その他の制限に言及する必要がある。第１に、この実験例に関する研究計画の性質上、本明細書における調査結果は、仮説生成と解釈すべきであり大規模な検証が必要とされる。第２に、この研究は、別のＨＥＲ２標的薬（例えば、ラパチニブ、ペルツズマブなど）で治療した後の抗ＨＥＲ２Ｔｈ１免疫の影響に対処することはできない。最後に、これらの患者における抗ＨＥＲ２Ｔｈ１免疫監視の場合はやむをえないが、本研究では、このような監視のための数値上の閾値を設けることができない。しかし、当業者は、更なる研究により医師が本明細書に記載されるような血液検査で監視するために従うことができ、おそらく、本明細書に記載の樹状細胞に基づく抗ＨＥＲ２ワクチンのような、抗ＨＥＲ２追加免疫療法を受けた患者を治療して抗ＨＥＲ２応答性を回復することができる、数値上の閾値の確立につながると理解することができる

要するに、抑制された抗ＨＥＲ２ＣＤ４^＋Ｔｈ１応答はＨＥＲ２標的療法の完了後のＨＥＲ２^ｐｏｓＩＢＣ患者における再発に関連する新規な免疫である。この実験例のデータは、（既存の放射線監視を補完し、臨床病理学的障害のリスクを有する脆弱な集団を同定するために）完全に治療されたＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＩＢＣ患者における免疫監視の役割を強調する。

全体的に要約すると、循環抗ＨＥＲ２Ｔｈ１免疫は、完全に治療されたＨＥＲ２^ｐｏｓ−ＢＣ患者における免疫監視および治療選択のための有望な意味合いを有する、トラスツズマブ療法後の再発に動的な相関があることが本明細書に示される。ＨＥＲ２陽性乳癌患者は、その免疫状態を治療前、中及び後の血液検査で監視させて医師や他の医療従事者が再発のリスクを測定し、例えばＤＣワクチンまたは他の癌ワクチンのような、抗ＨＥＲ２免疫を高める治療により再発のリスクを低減することを可能にする。

実験例３
抗ＨＥＲ２Ｔｈ１応答は、ＨＥＲ２陽性乳癌患者における術前補助化学療法に対する応答を評価する点で乳房ＭＲＩよりも優れている

術前化学療法（ｎＣＴ）は、４０〜６７％に至るまで、完全な病理学的応答（ＰＣＲ）を実現する。ＹｕａｎＹ，ｅｔａｌ，Ａｍ．Ｊ．Ｒａｄｉｏｌ．１９５（ｌ）：２６０−２６８（２０１０）。治療後の乳房磁気共鳴画像（ｐＭＲＩ）は、現在、特異性（９０．７％）が高く、感度（６３．１％）が低いゴールドスタンダードと考えられている。Ｈｙｌｔｏｎ，Ｎ．Ｍ．，ｅｔａｌ，Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ２６３（３）：６６３−７２（２０１２Ｊｕｎ）。抗ＨＥＲ２Ｔｈ１応答は、ＨＥＲ２^＋ＢＣ患者におけるｎＣＴ治療後の病理学的応答と関連する。Ｄａｔｔａ，Ｊ．，ｅｔＢｒｅａｓｔＣａｎｃｅｒＲｅｓ．１７：７１．ｄｏｉ：１０．１１８６／ｓｌ３０５８−０１５−０５８４−ｌ（２０１５Ｎａｙ２３）ｐＣＲを有する患者を識別することは、その後の治療を調整するのに役立つ。これは、術前補助治療後をガイドする敏感なツールを開発するのに欠かせない。この研究において、ＨＥＲ２^＋ＢＣ患者における完全な病理学的応答の評価のために治療後のＭＲＩを、抗ＨＥＲ２Ｔｈ１応答と比較した。

方法
ペンシルバニア大学で３０人の患者を遡及的に組織学的に確認されたＩＢＣと同定し、ＨＥＲ２／ｎｅｕの過剰発現を確認した。いずれの患者においても、遠隔転移の証拠はなく、いずれも免疫抑制薬物療法を受けていなかった。患者に、偏りのない方法で抗ＨＥＲ２ＴＨ１分析を行った。最初の治療後のＭＲＩレポートを収集し、画像診断は、ＰＣＲおよび免疫応答を知らされていない乳房の放射線科医によって検討された。画像処理に基づく腫瘍応答を、標準ＲＥＣＩＳＴ基準に基づいて評価し、これは固体の病変と同様に非質量増大評価を含むように変更された。完全な病理学的応答は、切除乳房検体および試料採取されたリンパ節の病理学的検査での残留浸潤癌の不存在として定義した（すなわち、ｙｐＴＯ／ＴｉｓのｙｐＮＯ）。参考例に記載されたように、循環抗ＨＥＲ２ＣＤ４^＋Ｔｈ１応答を、累積応答を決定するために酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイを介してＩＦＮ−γ産生を測定することによって、生体外で６個のＨＥＲ２由来ＭＨＣクラスＩＩペプチド（ペプチド４２〜５６、ペプチド９８〜１１４、ペプチド３２８〜３４５、ペプチド７７６〜７９０、ペプチド９２７〜９４１、およびペプチド１１６６〜１１８０）（配列番号：１〜６）でパルスした非刺激ＰＢＭＣにおいて検討した。参考例に記載のようにＥＬＩＳＰＯＴを行った。ＭＲＩおよび抗ＨＥＲ２Ｔｈｌ応答は、病理学的応答と相関し、標準的な診断の指標が計算された。

最も一般的に利用される治療計画はアドリアマイシン／シクロフォスファミド／タキソール／ハーセプチンである。最も一般的な外科介入は乳房切除術だった。患者の特徴は以下の通りである：

結果
完全な病理学的応答（ＰａｔｈＣＲ）による被験者のＨＥＲ２累積応答の分布は、１３人の患者がＰａｔｈＣＲを有しており（平均値±ＳＤ＝１６７．０±１１５．６ＳＦＣ／１０^６細胞、最小値＝５３．０ＳＦＣ／１０^６、最大値＝４１８．０ＳＦＣ／１０^６細胞）、１７人の患者がＰａｔｈＣＲを有していなかった（平均値±ＳＤ＝２３．９±１５．２ＳＦＣ／１０^６細胞、最小値＝０．４ＳＦＣ／１０^６、最大値＝５３．３ＳＦＣ／１０^６細胞）。患者は、５０ＳＦＣ／１０^６細胞のカットポイントに二分された（「低」＜５０、「高」＞５０）。

ＨＥＲ２患者のＭＲＩおよびＨＥＲ２累積応答の診断特性は以下の通りである。ＰＰＶ＝陽性予測値；ＮＰＶ＝陰性予測値

最初のｐＭＲＩは、上記の表に示すように、抗ＨＥＲ２Ｔｈ１応答と比較してＰＣＲのためにはるかに低い診断結果となった。盲検化した再審査ｐＭＲＩの２８人の患者のサブセットにおいては、ＰＣＲの診断結果は、抗ＨＥＲ２Ｔｈ１応答より著しく劣ったままであった（感度４６．２％対１００．０％、特異度６４．７％対９４．１％、全体の精度９６．７％対５６．７％）。患者を、エストロゲン受容体の状態によって層別化した場合にも、同様の所見が観察された、番号２，３，４，７及び９の番号のデータ参照。

結論
抗ＨＥＲ２Ｔｈ１免疫応答は、治療後のＭＲＩと比較して著しく正確な診断指標を実証した。「高い」抗ＨＥＲ２Ｔｈ１応答の存在は、ＨＥＲ２^＋ＢＣにおけるＰＣＲの評価において治療後にＭＲＩを使用することより優れている。当業者は、本明細書に提示される方法を用いて、ＨＥＲ２^＋ＢＣ患者の術前補助化学療法に対する応答を評価する点で、患者の免疫応答を監視する利点を理解するであろう。

本明細書において引用される各々及びすべての特許、特許出願及び刊行物の開示は、本明細書によりその全体が参照により本明細書の中に組み込まれる。

本開示は、例示及び記述の目的のために提示されているが、排出又は限定を意図するものではない。多くの変更及び変形が当業者には明らかであろう。実施形態は、原則及び実践的な応用を説明するために、そして当業者である他人が考えられる特定の用途に適した様々な変形を有する様々な実施形態の開示を理解するために、選択され説明された。

例示的な実施形態は、添付の図面を参照して本明細書に記載されているが、実施形態はこれらの特定の記述に限定されず、様々な他の変更及び改変は当業者によって開示の範囲または精神を逸脱せずにその中に考案されてもよいことを理解すべきである。添付の特許請求の範囲は全てのそのような実施形態及び同等の変形を含むと解釈されることを意図する。

Claims

癌を発症した、またはおそれのある哺乳動物被験体を診断または治療するための方法であって：
前記被験体の血液試料由来の抗原提示細胞（ＡＰＣ）またはその前駆体及びＣＤ４^＋Ｔ細胞から、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）の分泌を引き起こす循環抗癌ＣＤ４^＋Ｔｈ１応答を生成するステップ；及び
前記抗癌ＣＤ４^＋Ｔｈ１応答を検出して前記応答が抑制されたかを決定するステップ；
を含む方法。
前記生成ステップがさらに：
前記血液試料から非培養の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離するステップ；及び
前記ＰＢＭＣおよびその中のＡＰＣ前駆体の単球を、前記被験体が罹患した癌の種類に基づく免疫原性ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドを含む組成物でパルスし、それによって前記ＰＢＭＣにおけるＣＤ４^＋Ｔｈ１細胞を活性化してＩＦＮ−γを分泌させるステップ；を含み、ならびに
前記検出ステップが、前記分泌されたＩＦＮ−γを検出するステップ；を含む、請求項１に記載の方法。
前記生成ステップがさらに：
前記被験体試料由来の精製したＣＤ４^＋Ｔ細胞を、前記被験体が罹患した癌の種類に基づく免疫原性ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドを含む組成物でパルスした前記被験体試料由来のＡＰＣ、未成熟または成熟樹状細胞（ＤＣ）とともに共培養し、それにより、前記ＣＤ４^＋Ｔ細胞を活性化してＩＦＮ−γを分泌するステップ；を含み、及び
前記検出ステップが前記分泌されたＩＦＮ−γを検出するステップ；を含む、請求項１に記載の方法。
前記癌が、乳癌、脳腫瘍、膀胱癌、食道癌、肺癌、膵臓癌、肝臓癌、前立腺癌、卵巣癌、結腸直腸癌、および胃癌から成る群から選択される、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項１に記載の方法。
前記癌がＨＥＲ２発現である、請求項４に記載の方法。
前記癌がＨＥＲ２陽性乳癌であり、前記被験体がヒト女性であり、そして前記免疫原性ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドがＨＥＲ２分子に基づく、請求項２に記載の方法。
前記癌がＨＥＲ２陽性乳癌であり、前記被験体がヒト女性であり、そして前記免疫原性ＭＨＣクラスＩＩペプチドがＨＥＲ２分子に基づく、請求項３に記載の方法。
前記組成物がさらに：
ペプチド４２〜５６：ＨＬＤＭＬＲＨＬＹＱＧＣＱＶＶ（配列番号：１）；
ペプチド９８〜１１４：ＲＬＲＩＶＲＧＴＱＬＦＥＤＮＹＡＬ（配列番号：２）；
ペプチド３２８〜３４５：ＴＱＲＣＥＫＣＳＫＰＣＡＲＶＣＹＧＬ（配列番号：３）；
ペプチド７７６〜７９０：ＧＶＧＳＰＹＶＳＲＬＬＧＩＣＬ（配列番号：４）；
ペプチド９２７〜９４１：ＰＡＲＥＩＰＤＬＬＥＫＧＥＲＬ（配列番号：５）；
およびペプチド１１６６〜１１８０：ＴＬＥＲＰＫＴＬＳＰＧＫＮＧＶ（配列番号：６）；
を含むＨＥＲ２ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドを含む、請求項６に記載の方法。
前記組成物がさらに：
ペプチド４２〜５６：ＨＬＤＭＬＲＨＬＹＱＧＣＱＶＶ（配列番号：１）；
ペプチド９８〜１１４：ＲＬＲＩＶＲＧＴＱＬＦＥＤＮＹＡＬ（配列番号：２）；
ペプチド３２８〜３４５：ＴＱＲＣＥＫＣＳＫＰＣＡＲＶＣＹＧＬ（配列番号：３）；
ペプチド７７６〜７９０：ＧＶＧＳＰＹＶＳＲＬＬＧＩＣＬ（配列番号：４）；
ペプチド９２７〜９４１：ＰＡＲＥＩＰＤＬＬＥＫＧＥＲＬ（配列番号：５）；
およびペプチド１１６６〜１１８０：ＴＬＥＲＰＫＴＬＳＰＧＫＮＧＶ（配列番号：６）；
を含むＨＥＲ２ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドを含む、請求項７に記載の方法。
前記ＩＦＮ−γの分泌が、ＩＦＮ−γ酵素結合免疫アッセイ（ＥＬＩＳＰＯＴ）によって測定される、請求項１に記載の方法。
ＨＥＲ２特異的ＣＤ４^＋のＴｈ１免疫応答の回復を、その必要のあるＨＥＲ２陽性乳癌患者において行う方法であって：
前記患者の抗ＨＥＲ２ＣＤ４^＋Ｔｈ１応答を上昇させるために、免疫原性ＨＥＲ２ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドをパルスした自己ＤＣを含有する治療的有効量のＤＣワクチンを前記患者に投与（ＤＣワクチン接種）するステップ；及び
前記応答の増加量を決定するために請求項８に記載の方法に従って、
前記患者のＤＣワクチン接種前後の前記抗ＨＥＲ２ＣＤ４^＋Ｔｈ１応答を測定するステップ；を含む方法。
ＨＥＲ２特異的ＣＤ４^＋のＴｈ１免疫応答の回復を、その必要のあるＨＥＲ２陽性乳癌患者において行う方法であって：
前記患者の抗ＨＥＲ２ＣＤ４^＋Ｔｈ１応答を上昇させるために、免疫原性ＨＥＲ２ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドをパルスした自己ＤＣを含有する治療的有効量のＤＣワクチンを前記患者に投与（ＤＣワクチン接種）するステップ；及び
前記応答の増加量を決定するために請求項９に記載の方法にしたがって、前記患者のＤＣワクチン接種前後の前記抗ＨＥＲ２ＣＤ４^＋Ｔｈ１応答を測定するステップ；を含む方法。
１または複数の追加の時間間隔で、請求項８に記載の方法を行うことにより前記患者のＤＣワクチン接種後の前記抗ＨＥＲ２ＣＤ４^＋Ｔｈ１応答の回復状態を測定して前記応答の回復を監視するステップをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
１または複数の追加の時間間隔で、請求項９に記載の方法を行うことにより前記患者のＤＣワクチン接種後の前記抗ＨＥＲ２ＣＤ４^＋Ｔｈ１応答の回復状態を測定して前記応答の回復を監視するステップをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
乳癌または他の癌のために個体をスクリーニングする方法であって：
請求項１に記載の方法に従って、前記個体の抗ＨＥＲ２ＣＤ４^＋Ｔｈ１応答を検出して健常な個体と比較して前記応答が抑制されているかを判断するステップ；を含む方法。
乳癌またはその他の癌を発症するリスクのある個体をスクリーニングする方法であって：
請求項１に記載の方法に従って前記個体の抗ＨＥＲ２ＣＤ４^＋Ｔｈ１応答を検出して健常な個体と比較して前記応答が抑制されているかを判断するステップ；を含む方法。
ＨＥＲ陽性乳癌患者が、化学療法及びトラスツズマブのような標準的な非免疫療法に十分に応答するかを予測する方法であって：
請求項１に記載の方法に従って、前記患者の抗ＨＥＲ２ＣＤ４^＋Ｔｈ１応答を検出するステップ；を含む方法。
トラスツズマブ及び化学療法で治療されたＨＥＲ２陽性侵襲性乳癌（ＨＥＲ２ｐｏｓ−ＩＢＣ）患者における新しい乳房イベントを予測する方法であって：
請求項１に記載の方法に従って前記患者の前記抗ＨＥＲ２ＣＤ４^＋Ｔｈ１応答を測定して前記応答が抑制されたかを判断するステップ；を含む方法。
ＨＥＲ２陽性乳癌患者において術前補助療法のトラスツズマブ及び化学療法（Ｔ／Ｃ）後のＨＥＲ２陽性乳癌の病理学的応答を予測する方法であって：
請求項１に記載の方法に従って、前記Ｔ／Ｃ治療後の前記患者における抗ＨＥＲ２ＣＤ４^＋Ｔｈ１応答の程度を測定して、前記応答が、術前補助療法の病理学的完全奏効（術後の病理で残存浸潤性乳癌がない）と関連する有意に高い抗ＨＥＲ２ＣＤ４^＋Ｔｈ１応答であるか、又は非病理学的完全奏効に関連するより低い応答であるかを判断するステップ；を含む、方法。
前記患者における非病理学的完全奏効の場合には、前記患者の抗ＨＥＲ２ＣＤ４^＋Ｔｈ１応答が、請求項１１の方法に従って、ＤＣワクチン接種によって回復される、請求項１９に記載の方法。
癌を有するまたは発症するリスクがある哺乳動物被験体を診断または治療するための方法であって：
前記被験体から血液を得るステップ；
その後抗癌ＣＤ４^＋Ｔｈ１応答の抑制を測定する血液検査を行うステップ、及び、抑制の場合には；
前記被験体に、ＤＣワクチン、トラスツズマブのような標的癌治療、化学療法のような従来の癌治療、外科手術及び放射線照射からなる群から選択される癌治療薬を有効量で投与するステップ；を含む、方法。
標的乳がん治療に加え化学療法を完了した後に前記癌の再発リスクを評価するためにＨＥＲ^ｐｏｓＩＢＣ患者を監視する方法であって、請求項１の方法に従って前記治療後の患者における抗ＨＥＲ２ＣＤ４^＋Ｔｈｌ応答度を測定して、前記応答が前記癌の再発と相関する有意に抑制された抗ＨＥＲ２ＣＤ４^＋Ｔｈｌ応答か又は非再発と相関するより高い抗ＨＥＲ２ＣＤ４^＋Ｔｈｌ応答かを決定するステップを含む、方法。
前記標的治療が、前記患者への薬剤トラスツズマブの投与を含む、請求項２２に記載の方法。