JP2020124193A - 癌のcd4+tヘルパー1型応答の監視方法および免疫回復 - Google Patents
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Abstract
【課題】癌を発症した、またはおそれのある哺乳動物被験体を診断または治療するための方法の提供。【解決手段】癌を発症した、またはおそれのある哺乳動物被験体を診断または治療するための方法であって:前記被験体の血液試料由来の抗原提示細胞(APC)またはその前駆体及びCD4+T細胞から、インターフェロン−γ(IFN−γ)の分泌を引き起こす循環抗癌CD4+Th1応答を生成するステップ;及び前記抗癌CD4+Th1応答を検出して前記応答が抑制されたかを決定するステップ;を含む方法。【選択図】図5−1
Description
この出願は2014年3月14日に出願された米国仮特許出願シリアル番号61/95
3726から優先権を主張し利益を得る。
3726から優先権を主張し利益を得る。
承認
本発明は、国立衛生研究所により授与された助成金番号R01 CA096997の下
で部分的に政府の支援で開発された。政府は本発明において一定の権利を有する。
本発明は、国立衛生研究所により授与された助成金番号R01 CA096997の下
で部分的に政府の支援で開発された。政府は本発明において一定の権利を有する。
本発明の実施形態は、癌における免疫応答の進行性の喪失、特に、HER2駆動乳癌に
おける抗HER2/neu CD4+Tヘルパー1型(Th1)応答の損失及びその回復
、ならびにそれに基づく診断監視方法、治療方法及びツールを対象とする。
おける抗HER2/neu CD4+Tヘルパー1型(Th1)応答の損失及びその回復
、ならびにそれに基づく診断監視方法、治療方法及びツールを対象とする。
乳がん(BC)は、世界中の癌関連死亡率の主因である。Jemal,A.,et a
l,Global Cancer Statistics.CA:A Cancer J
ournal for Clinicians 61:69−90(2011)を参照。
遺伝子発現符号の発達により、乳房腫瘍の少なくとも4つの広範な表現型:管腔A及びB
、基底様、及びヒト上皮成長因子受容体2/neu(HER2pos)が、現在認められ
ている。Perou,CM.,et al.,Nature 406:747−52(2
000)を参照。BCの約20〜25%を含むいくつかの腫瘍タイプの分子オンコドライ
バーである、HER2の過剰発現(Meric,F.,et al,J.Am Coll
.Surg.194:488−501(2002))は、高悪性度の臨床経過、化学療法
に対する耐性、及びBCにおける不十分な全体的な予後と関連している。Henson,
E.S.,Clin.Can.Res.12:845−53(2006)(Henson
,et al)及びWang,G.S.,Mol.Med.Rep.6:779−82(
2012)を参照。初期のBCでは、HER2過剰発現は強化された侵襲性(Roses
,R.E.,et al.,Cancer Epidemiol.Biomarkers
& Prev.18(5):1386−9(2009))、腫瘍細胞の遊走(Wolf
−Yadlin,A.,et al,Molecular Systems Biolo
gy 2:54(2006))、及び血管新生因子(Wen,X.F.,et al,O
ncogene 25:6986−96(2006))の発現と関連しており、腫瘍原生
環境を促進することにおけるHER2の重要な役割を示唆している。化学療法との併用で
、HER2標的療法(すなわち、ハーセプチン(登録商標)/トラスツズマブ)、は、H
ER2posBC患者において大幅に改善された生存率を有する(Piccart−Ge
bhart.,M.J.,et al,N.Eng.J.Med.353:1659−7
2(2005))けれども、患者のかなりの割合が、このような治療に耐性を持つように
なる(Pohlmann,P.R.,et al,Clin.Can.Res.15:7
479−91(2009)(Pohlman,et al.))。HER2標的療法に対
する応答速度を向上させるための新たなアプローチと同様に、治療不全のリスクが高い患
者のサブグループを同定する戦略が必要とされている。
l,Global Cancer Statistics.CA:A Cancer J
ournal for Clinicians 61:69−90(2011)を参照。
遺伝子発現符号の発達により、乳房腫瘍の少なくとも4つの広範な表現型:管腔A及びB
、基底様、及びヒト上皮成長因子受容体2/neu(HER2pos)が、現在認められ
ている。Perou,CM.,et al.,Nature 406:747−52(2
000)を参照。BCの約20〜25%を含むいくつかの腫瘍タイプの分子オンコドライ
バーである、HER2の過剰発現(Meric,F.,et al,J.Am Coll
.Surg.194:488−501(2002))は、高悪性度の臨床経過、化学療法
に対する耐性、及びBCにおける不十分な全体的な予後と関連している。Henson,
E.S.,Clin.Can.Res.12:845−53(2006)(Henson
,et al)及びWang,G.S.,Mol.Med.Rep.6:779−82(
2012)を参照。初期のBCでは、HER2過剰発現は強化された侵襲性(Roses
,R.E.,et al.,Cancer Epidemiol.Biomarkers
& Prev.18(5):1386−9(2009))、腫瘍細胞の遊走(Wolf
−Yadlin,A.,et al,Molecular Systems Biolo
gy 2:54(2006))、及び血管新生因子(Wen,X.F.,et al,O
ncogene 25:6986−96(2006))の発現と関連しており、腫瘍原生
環境を促進することにおけるHER2の重要な役割を示唆している。化学療法との併用で
、HER2標的療法(すなわち、ハーセプチン(登録商標)/トラスツズマブ)、は、H
ER2posBC患者において大幅に改善された生存率を有する(Piccart−Ge
bhart.,M.J.,et al,N.Eng.J.Med.353:1659−7
2(2005))けれども、患者のかなりの割合が、このような治療に耐性を持つように
なる(Pohlmann,P.R.,et al,Clin.Can.Res.15:7
479−91(2009)(Pohlman,et al.))。HER2標的療法に対
する応答速度を向上させるための新たなアプローチと同様に、治療不全のリスクが高い患
者のサブグループを同定する戦略が必要とされている。
多くの証拠は、腫瘍微小環境における頑強な細胞性免疫応答がBC、特にHER2po
sサブタイプ、での改善された転帰に関連していることを示す。Alexe.,G.,e
t al.,Can.Res.67:10669−76(2007)を参照。そのために
、これらの抗腫瘍効果の個々の免疫メディエーターを解明することに進歩が見られている
。歴史的に、細胞傷害性CD8+Tリンパ球(CTL)が、抗腫瘍免疫の主要なエフェク
ターであると考えられたが(Mahmoud,S.M.,et al,J.Clin.O
ncol.29:1949−55(2011))、HER2駆動BCにおいてペプチドワ
クチンでCTL応答をブーストすると、最小限の臨床的影響をもたらした(Amin.,
A.,et al.,Cancer Immunol.Immunother.57(1
2):1817−25(2008))、おそらく、Bos,R.,et al,Canc
er Res.70:8368−77(2010)によって報告されたように、CTLは
適切なCD4+Tリンパ球の助けなしに準最適に機能するからである。CTLの発生及び
持続のために重要であることに加えて、CD4+Tヘルパー(Th)細胞は、直接細胞傷
害性殺腫瘍活性、抗腫瘍サイトカイン応答の変調、および長期的な免疫記憶の増強を含む
、他のメカニズムを通して抗腫瘍作用を媒介する(Cintolo,J.A.,et a
l,Future Oncol.8:1273−99(2012))。免疫グロプリンの
クラススイッチを促進することによって、Th細胞はまた、体液性抗腫瘍免疫およびエフ
ェクターB細胞応答に寄与する。Parker,D.C.,et al,Ann.Rev
.Immunol.11:331−60(1993)(Parker,et al.)を
参照。実際、腫瘍微小環境中のインターフェロン(IFN)−γ産生CD4+Tヘルパー
1型(Th1)細胞の浸潤は、BCにおける予後の改善と関連している。Gu−Tran
tien,C,et al.,J.Clin.Inv.123:2873−92(201
3)を参照。
sサブタイプ、での改善された転帰に関連していることを示す。Alexe.,G.,e
t al.,Can.Res.67:10669−76(2007)を参照。そのために
、これらの抗腫瘍効果の個々の免疫メディエーターを解明することに進歩が見られている
。歴史的に、細胞傷害性CD8+Tリンパ球(CTL)が、抗腫瘍免疫の主要なエフェク
ターであると考えられたが(Mahmoud,S.M.,et al,J.Clin.O
ncol.29:1949−55(2011))、HER2駆動BCにおいてペプチドワ
クチンでCTL応答をブーストすると、最小限の臨床的影響をもたらした(Amin.,
A.,et al.,Cancer Immunol.Immunother.57(1
2):1817−25(2008))、おそらく、Bos,R.,et al,Canc
er Res.70:8368−77(2010)によって報告されたように、CTLは
適切なCD4+Tリンパ球の助けなしに準最適に機能するからである。CTLの発生及び
持続のために重要であることに加えて、CD4+Tヘルパー(Th)細胞は、直接細胞傷
害性殺腫瘍活性、抗腫瘍サイトカイン応答の変調、および長期的な免疫記憶の増強を含む
、他のメカニズムを通して抗腫瘍作用を媒介する(Cintolo,J.A.,et a
l,Future Oncol.8:1273−99(2012))。免疫グロプリンの
クラススイッチを促進することによって、Th細胞はまた、体液性抗腫瘍免疫およびエフ
ェクターB細胞応答に寄与する。Parker,D.C.,et al,Ann.Rev
.Immunol.11:331−60(1993)(Parker,et al.)を
参照。実際、腫瘍微小環境中のインターフェロン(IFN)−γ産生CD4+Tヘルパー
1型(Th1)細胞の浸潤は、BCにおける予後の改善と関連している。Gu−Tran
tien,C,et al.,J.Clin.Inv.123:2873−92(201
3)を参照。
Henson,E.S.,Clin.Can.Res.12:845−53(2006)(「Henson,et al」)
Wang,G.S.,Mol.Med.Rep.6:779−82(2012)
Roses,R.E.,et al.,Cancer Epidemiol.Biomarkers & Prev.18(5):1386−9(2009)
Wolf−Yadlin,A.,et al,Molecular Systems Biology 2:54(2006)
Wen,X.F.,et al,Oncogene 25:6986−96(2006)
Piccart−Gebhart.,M.J.,et al,N.Eng.J.Med.353:1659−72(2005)
Pohlmann,P.R.,et al,Clin.Can.Res.15:7479−91(2009)
Gu−Trantien,C,et al.,J.Clin.Inv.123:2873−92(2013)
HER2駆動の乳房腫瘍形成における全身抗HER2 CD4+Th1応答の役割は、
しかし、不明なままである。トラスツズマブと化学療法によるHER2標的治療に対する
応答速度を改善するアプローチと同様に、治療不全のリスクが高い患者のサブグループを
予測する戦略のための、満たされていない必要性が残っている。したがって、1つまたは
それ以上の本発明の実施形態は、本明細書で特定された問題の一つ以上に対処することを
対象にする。
しかし、不明なままである。トラスツズマブと化学療法によるHER2標的治療に対する
応答速度を改善するアプローチと同様に、治療不全のリスクが高い患者のサブグループを
予測する戦略のための、満たされていない必要性が残っている。したがって、1つまたは
それ以上の本発明の実施形態は、本明細書で特定された問題の一つ以上に対処することを
対象にする。
ある広範な態様において、癌を発症した、またはおそれのある哺乳動物被験体を診断ま
たは治療するための方法であって:前記被験体の血液試料由来の抗原提示細胞(APC)
またはその前駆体及びCD4+T細胞から、インターフェロン−γ(IFN−γ)の分泌
を引き起こす循環抗癌CD4+Th1応答を生成するステップ;及び前記抗癌CD4+T
h1応答を検出して前記応答が抑制されたかを決定するステップ;を含む方法が提供され
る。
たは治療するための方法であって:前記被験体の血液試料由来の抗原提示細胞(APC)
またはその前駆体及びCD4+T細胞から、インターフェロン−γ(IFN−γ)の分泌
を引き起こす循環抗癌CD4+Th1応答を生成するステップ;及び前記抗癌CD4+T
h1応答を検出して前記応答が抑制されたかを決定するステップ;を含む方法が提供され
る。
別の態様において、前記生成ステップがさらに:前記血液試料から非培養の末梢血単核
細胞(PBMC)を単離するステップ;及び前記PBMCおよびその中のAPC前駆体の
単球を、前記被験体が罹患した癌の種類に基づく免疫原性MHCクラスII結合ペプチド
を含む組成物でパルスし、それによって前記PBMCにおけるCD4+Th1細胞を活性
化してIFN−γを分泌させるステップ;を含み、ならびに前記検出ステップが、前記分
泌されたIFN−γを検出するステップ;を含む。
細胞(PBMC)を単離するステップ;及び前記PBMCおよびその中のAPC前駆体の
単球を、前記被験体が罹患した癌の種類に基づく免疫原性MHCクラスII結合ペプチド
を含む組成物でパルスし、それによって前記PBMCにおけるCD4+Th1細胞を活性
化してIFN−γを分泌させるステップ;を含み、ならびに前記検出ステップが、前記分
泌されたIFN−γを検出するステップ;を含む。
代替の態様において、前記生成ステップがさらに:前記被験体試料由来の精製したCD
4+T細胞を、前記被験体が罹患した癌の種類に基づく免疫原性MHCクラスII結合ペ
プチドを含む組成物でパルスした前記被験体試料由来のAPC、未成熟または成熟樹状細
胞(DC)とともに共培養し、それにより、前記CD4+T細胞を活性化してIFN−γ
を分泌するステップ;を含み、前記検出ステップが前記分泌されたIFN−γを検出する
ステップを含む。
4+T細胞を、前記被験体が罹患した癌の種類に基づく免疫原性MHCクラスII結合ペ
プチドを含む組成物でパルスした前記被験体試料由来のAPC、未成熟または成熟樹状細
胞(DC)とともに共培養し、それにより、前記CD4+T細胞を活性化してIFN−γ
を分泌するステップ;を含み、前記検出ステップが前記分泌されたIFN−γを検出する
ステップを含む。
ほかの態様において、前記癌が、乳癌、脳腫瘍、膀胱癌、食道癌、肺癌、膵臓癌、肝臓
癌、前立腺癌、卵巣癌、結腸直腸癌、および胃癌から成る群から選択される、またはそれ
らの任意の組み合わせである。
癌、前立腺癌、卵巣癌、結腸直腸癌、および胃癌から成る群から選択される、またはそれ
らの任意の組み合わせである。
ほかの態様において、前記癌がHER2発現である。
さらなる態様において、前記癌がHER2陽性乳癌であり、前記被験体がヒト女性であ
り、そして前記免疫原性MHCクラスII結合ペプチドがHER2分子に基づく。
り、そして前記免疫原性MHCクラスII結合ペプチドがHER2分子に基づく。
好ましい実施形態において、前記組成物がさらに:ペプチド42〜56(配列番号:1
);ペプチド98〜114(配列番号:2);ペプチド328〜345(配列番号:3)
;ペプチド776〜790(配列番号:4);ペプチド927〜941(配列番号:5)
;およびペプチド1166〜1180(配列番号:6);を含むHER2 MHCクラス
II結合ペプチドを含む。
);ペプチド98〜114(配列番号:2);ペプチド328〜345(配列番号:3)
;ペプチド776〜790(配列番号:4);ペプチド927〜941(配列番号:5)
;およびペプチド1166〜1180(配列番号:6);を含むHER2 MHCクラス
II結合ペプチドを含む。
好ましい実施形態において、前記IFN−γの産生が、IFN−γ酵素結合免疫アッセ
イ(ELISPOT)によって測定される。
イ(ELISPOT)によって測定される。
ほかの態様において、HER2特異的CD4+のTh1免疫応答の回復を、その必要の
あるHER2陽性乳癌患者において行う方法であって:前記患者の抗HER2 CD4+
Th1応答を上昇させるために、免疫原性HER2 MHCクラスII結合ペプチドをパ
ルスした自己DCを含有する治療的有効量のDCワクチンを前記患者に投与(DCワクチ
ン接種)するステップ;及び前記応答の増加量を決定するために上記態様の生成及び検出
ステップに従って、前記患者のDCワクチン接種前後の前記抗HER2 CD4+Th1
応答を測定するステップ;を含む方法であって、前記回復を行う方法はさらに:1または
複数の追加の時間間隔で、上記態様の生成及び検出ステップを行うことにより前記患者の
DCワクチン接種後の前記抗HER2 CD4+Th1応答の回復状態を測定して前記応
答の回復を監視するステップを含む、方法がある。
あるHER2陽性乳癌患者において行う方法であって:前記患者の抗HER2 CD4+
Th1応答を上昇させるために、免疫原性HER2 MHCクラスII結合ペプチドをパ
ルスした自己DCを含有する治療的有効量のDCワクチンを前記患者に投与(DCワクチ
ン接種)するステップ;及び前記応答の増加量を決定するために上記態様の生成及び検出
ステップに従って、前記患者のDCワクチン接種前後の前記抗HER2 CD4+Th1
応答を測定するステップ;を含む方法であって、前記回復を行う方法はさらに:1または
複数の追加の時間間隔で、上記態様の生成及び検出ステップを行うことにより前記患者の
DCワクチン接種後の前記抗HER2 CD4+Th1応答の回復状態を測定して前記応
答の回復を監視するステップを含む、方法がある。
ほかの態様において、乳癌または他の癌のために個体をスクリーニングする方法であっ
て:上記態様の生成及び検出ステップに記載の方法に従って前記個体の抗HER2 CD
4+Th1応答を検出して健常な個体と比較して前記応答が抑制されているかを判断する
ステップ;を含む方法がある。
て:上記態様の生成及び検出ステップに記載の方法に従って前記個体の抗HER2 CD
4+Th1応答を検出して健常な個体と比較して前記応答が抑制されているかを判断する
ステップ;を含む方法がある。
ほかの態様において、乳癌またはその他の癌を発症するリスクのある個体をスクリーニ
ングする方法であって:上記態様の生成及び検出ステップに記載の方法に従って前記個体
の抗HER2 CD4+Th1応答を検出して健常な個体と比較して前記応答が抑制され
ているかを判断するステップ;を含む方法がある。
ングする方法であって:上記態様の生成及び検出ステップに記載の方法に従って前記個体
の抗HER2 CD4+Th1応答を検出して健常な個体と比較して前記応答が抑制され
ているかを判断するステップ;を含む方法がある。
ほかの態様において、HER陽性乳癌患者が、化学療法及びトラスツズマブのような標
準的な非免疫療法に十分に応答するかを予測する方法であって:上記態様の生成及び検出
ステップに記載の方法に従って、前記患者の抗HER2 CD4+Th1応答を検出する
ステップ;を含む方法がある。
準的な非免疫療法に十分に応答するかを予測する方法であって:上記態様の生成及び検出
ステップに記載の方法に従って、前記患者の抗HER2 CD4+Th1応答を検出する
ステップ;を含む方法がある。
ほかの態様において、トラスツズマブ及び化学療法で治療されたHER2陽性侵襲性乳
癌(HER2pos−IBC)患者における新しい乳房イベントを予測する方法であって
:上記態様の生成及び検出ステップに記載の方法に従って、前記患者の前記抗HER2
CD4+Th1応答を測定して前記応答が抑制されたかを判断するステップ;を含む方法
がある。
癌(HER2pos−IBC)患者における新しい乳房イベントを予測する方法であって
:上記態様の生成及び検出ステップに記載の方法に従って、前記患者の前記抗HER2
CD4+Th1応答を測定して前記応答が抑制されたかを判断するステップ;を含む方法
がある。
ほかの態様において、HER2陽性乳癌患者において術前補助療法のトラスツズマブ及
び化学療法(T/C)後のHER2陽性乳癌の病理学的応答を予測する方法であって:上
記態様の生成及び検出ステップに記載の方法に従って、前記T/C治療後の前記患者にお
ける抗HER2 CD4+Th1応答の程度を測定して、前記応答が、術前補助療法の病
理学的完全奏効(術後の病理で残存浸潤性乳癌がない)と関連する有意に高い抗HER2
CD4+Th1応答であるか、又は非病理学的完全奏効に関連するより低い応答である
かを判断するステップ;を含み、さらに、前記患者における非病理学的完全奏効の場合に
は、前記患者の抗HER2 CD4+Th1応答が、DCワクチン接種によって回復され
る、方法がある。
び化学療法(T/C)後のHER2陽性乳癌の病理学的応答を予測する方法であって:上
記態様の生成及び検出ステップに記載の方法に従って、前記T/C治療後の前記患者にお
ける抗HER2 CD4+Th1応答の程度を測定して、前記応答が、術前補助療法の病
理学的完全奏効(術後の病理で残存浸潤性乳癌がない)と関連する有意に高い抗HER2
CD4+Th1応答であるか、又は非病理学的完全奏効に関連するより低い応答である
かを判断するステップ;を含み、さらに、前記患者における非病理学的完全奏効の場合に
は、前記患者の抗HER2 CD4+Th1応答が、DCワクチン接種によって回復され
る、方法がある。
さらにほかの広範な態様において、癌を有するまたは発症するリスクがある哺乳動物被
験体を診断または治療するための方法であって:前記被験体から血液を得るステップ;そ
の後抗癌CD4+Th1応答の抑制を測定する血液検査を行うステップ、及び、抑制の場
合には;前記被験体にDCワクチン、トラスツズマブのような標的癌治療、化学療法のよ
うな従来の癌治療、外科手術及び放射線照射からなる群から選択される癌治療薬を有効量
で投与するステップ;を含む、方法がある。
験体を診断または治療するための方法であって:前記被験体から血液を得るステップ;そ
の後抗癌CD4+Th1応答の抑制を測定する血液検査を行うステップ、及び、抑制の場
合には;前記被験体にDCワクチン、トラスツズマブのような標的癌治療、化学療法のよ
うな従来の癌治療、外科手術及び放射線照射からなる群から選択される癌治療薬を有効量
で投与するステップ;を含む、方法がある。
例示的な実施形態のより良い理解のために、それらの他の及びさらなる特徴および利点
とともに、参照は、添付の図面と併せて、以下の記載に言及し、そして請求される実施形
態の範囲は、添付の特許請求の範囲において指摘されるであろう。
とともに、参照は、添付の図面と併せて、以下の記載に言及し、そして請求される実施形
態の範囲は、添付の特許請求の範囲において指摘されるであろう。
添付の図面と併せて読むと、好ましい実施形態の以下の詳細な説明がより良く理解され
るであろう。実施形態を説明するために、図面において示される現在好ましい実施例があ
る。しかしながら、好ましい実施形態は、図面に示された正確な配置および手段に限定さ
れないことが理解されるべきである。
るであろう。実施形態を説明するために、図面において示される現在好ましい実施例があ
る。しかしながら、好ましい実施形態は、図面に示された正確な配置および手段に限定さ
れないことが理解されるべきである。
なお、本実施形態の図面、画像および説明が本発明の実施例に見出すことができる多く
の他の要素を、明確にする目的で、排除する一方、明確な理解に関連する要素を説明する
ために簡略化されていることを理解すべきである。関連技術の当業者は、本発明の実施形
態を実現するために他の要素が望ましい及び/又は必要であることを認識するであろう。
しかしながら、そのような要素は当技術分野でよく知られており、そのような要素は、本
発明の実施形態の理解を容易にしないので、そのような要素の議論は、本明細書において
提供されない。
の他の要素を、明確にする目的で、排除する一方、明確な理解に関連する要素を説明する
ために簡略化されていることを理解すべきである。関連技術の当業者は、本発明の実施形
態を実現するために他の要素が望ましい及び/又は必要であることを認識するであろう。
しかしながら、そのような要素は当技術分野でよく知られており、そのような要素は、本
発明の実施形態の理解を容易にしないので、そのような要素の議論は、本明細書において
提供されない。
「一実施形態」または「実施形態」または実施形態に関連して記載される特定の特徴、
構造、または特性を意味する同類のものなどの本明細書全体を通しての参照は少なくとも
1つの実施形態に含まれる。したがって、「実施形態において」または「一実施形態では
」または本明細書全体を通して様々な場所での同様の語句の出現は必ずしも全てが同じ実
施形態に言及されない。
構造、または特性を意味する同類のものなどの本明細書全体を通しての参照は少なくとも
1つの実施形態に含まれる。したがって、「実施形態において」または「一実施形態では
」または本明細書全体を通して様々な場所での同様の語句の出現は必ずしも全てが同じ実
施形態に言及されない。
さらに、本開示の原理の理解を促進する目的で、参照は、現在本明細書において示され
て記載された実施形態になされ、特定の言語が同じものを説明するために使用されるであ
ろう。それにもかかわらず、本開示の範囲の限定がそれによって意図されないことが理解
されるであろう;任意の変更、説明または図示された実施形態のさらなる改変および本明
細書に示された本開示の原理のさらなる応用は、本開示が関係する当業者に通常起こるで
あろうと考慮される。すべての範囲の制限は、一つ以上の発行された特許の最終的な特許
請求の範囲に従って、及び最終的な特許請求の範囲で表されるように決定されるべきであ
る。
て記載された実施形態になされ、特定の言語が同じものを説明するために使用されるであ
ろう。それにもかかわらず、本開示の範囲の限定がそれによって意図されないことが理解
されるであろう;任意の変更、説明または図示された実施形態のさらなる改変および本明
細書に示された本開示の原理のさらなる応用は、本開示が関係する当業者に通常起こるで
あろうと考慮される。すべての範囲の制限は、一つ以上の発行された特許の最終的な特許
請求の範囲に従って、及び最終的な特許請求の範囲で表されるように決定されるべきであ
る。
定義 別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、
一般的に、本開示の発明の主題が属する技術分野の当業者によって理解されるのと同じ意
味を有する。本明細書に記載のものと類似または同等の任意の方法および材料を本発明の
実施形態の実施または試験に用いることができるが、好ましい方法および材料が記載され
る。
一般的に、本開示の発明の主題が属する技術分野の当業者によって理解されるのと同じ意
味を有する。本明細書に記載のものと類似または同等の任意の方法および材料を本発明の
実施形態の実施または試験に用いることができるが、好ましい方法および材料が記載され
る。
一般に、本明細書中で使用される用語と、細胞培養、分子遺伝学、有機化学、および核
酸化学およびハイブリダイゼーションにおける実験手順は、それらの技術分野でよく知ら
れており、一般的に用いられるものである。
酸化学およびハイブリダイゼーションにおける実験手順は、それらの技術分野でよく知ら
れており、一般的に用いられるものである。
標準的な技術は、核酸及びペプチド合成のために使用される。技術および手順は、一般
に、当該技術分野における従来の方法および種々の一般的参考文献(Sambrook
and Russell,2012,Molecular Cloning,A Lab
oratory Approach,Cold Spring Harbor Pres
s,Cold Spring Harbor,NY,and Ausubel et a
l.,2012,Current Protocols in Molecular B
iology,John Wiley & Sons,NY)に従って行われ、これは、
本明細書を通じて提供される。
に、当該技術分野における従来の方法および種々の一般的参考文献(Sambrook
and Russell,2012,Molecular Cloning,A Lab
oratory Approach,Cold Spring Harbor Pres
s,Cold Spring Harbor,NY,and Ausubel et a
l.,2012,Current Protocols in Molecular B
iology,John Wiley & Sons,NY)に従って行われ、これは、
本明細書を通じて提供される。
本明細書中で使用される命名法及び以下に記載される分析化学および有機合成で使用さ
れる実験手順は、当該技術分野でよく知られており、一般的に使用されるものである。標
準技術またはその改良は、化学合成および化学分析に使用される。
れる実験手順は、当該技術分野でよく知られており、一般的に使用されるものである。標
準技術またはその改良は、化学合成および化学分析に使用される。
本明細書で使用される場合、以下の用語の各々は、この節でそれと関連する意味を有す
る。
る。
冠詞「a」および「an」は、1つまたは複数(すなわち、少なくとも1つ)という冠
詞の文法上の目的を指すために本明細書において使用される。一例として、「an el
ement」は一つの要素または複数の要素を意味する。
詞の文法上の目的を指すために本明細書において使用される。一例として、「an el
ement」は一つの要素または複数の要素を意味する。
量、一時的な持続時間などのような測定可能な値に言及する場合、本明細書において使
用される「約」は、規定値から±20%または±10%、または±5%、または±1%、
または±0.1%の変動を、そのような変動が開示された方法を実行するのに適切である
ように、包含することを意味する。
用される「約」は、規定値から±20%または±10%、または±5%、または±1%、
または±0.1%の変動を、そのような変動が開示された方法を実行するのに適切である
ように、包含することを意味する。
本明細書において使用される乳癌の「術後補助療法」は、一次療法(すなわち、外科手
術)後に行われる任意の治療を指して長期生存の可能性を増加させる。「術前補助療法」
は、一次治療の前に行われる治療である。
術)後に行われる任意の治療を指して長期生存の可能性を増加させる。「術前補助療法」
は、一次治療の前に行われる治療である。
本明細書において使用される用語「抗原」または「ag」は、免疫応答を誘発する分子
として定義される。この免疫応答は、抗体産生、または特定の免疫学的にコンピテントな
細胞の活性化のいずれか、またはその両方を含むことができる。当業者は、実質的に全て
のタンパク質またはペプチドを含む任意の高分子が、抗原として働くことができることを
理解するであろう。さらに、抗原は、組換えまたはゲノムDNAに由来してもよい。当業
者は任意のDNAであって、当該DNAが免疫応答を誘発するたんぱく質をコードするヌ
クレオチド配列または部分的なヌクレオチド配列を含み、従って本明細書においてその用
語が使用されるように「抗原」をエンコードすることを理解するであろう。さらに、当業
者は、抗原が遺伝子の全長ヌクレオチド配列のみでエンコードされる必要がないことを理
解するだろう。本発明の実施形態は、限定されないが、1つ以上の遺伝子の部分的ヌクレ
オチド配列の使用を含み、これらのヌクレオチド配列は、所望の免疫応答を誘発するため
に様々な組み合わせで配置されることが容易に分かるだろう。さらに、当業者は、抗原が
「遺伝子」によってコードされる必要は全くないことを理解するであろう。抗原を生成ま
たは合成することができ、または生物学的試料に由来してもよいことが容易に分かる。そ
のような生物学的サンプは、限定されるものではないが、組織試料、腫瘍試料、細胞また
は生物学的液体を含むことができる。
として定義される。この免疫応答は、抗体産生、または特定の免疫学的にコンピテントな
細胞の活性化のいずれか、またはその両方を含むことができる。当業者は、実質的に全て
のタンパク質またはペプチドを含む任意の高分子が、抗原として働くことができることを
理解するであろう。さらに、抗原は、組換えまたはゲノムDNAに由来してもよい。当業
者は任意のDNAであって、当該DNAが免疫応答を誘発するたんぱく質をコードするヌ
クレオチド配列または部分的なヌクレオチド配列を含み、従って本明細書においてその用
語が使用されるように「抗原」をエンコードすることを理解するであろう。さらに、当業
者は、抗原が遺伝子の全長ヌクレオチド配列のみでエンコードされる必要がないことを理
解するだろう。本発明の実施形態は、限定されないが、1つ以上の遺伝子の部分的ヌクレ
オチド配列の使用を含み、これらのヌクレオチド配列は、所望の免疫応答を誘発するため
に様々な組み合わせで配置されることが容易に分かるだろう。さらに、当業者は、抗原が
「遺伝子」によってコードされる必要は全くないことを理解するであろう。抗原を生成ま
たは合成することができ、または生物学的試料に由来してもよいことが容易に分かる。そ
のような生物学的サンプは、限定されるものではないが、組織試料、腫瘍試料、細胞また
は生物学的液体を含むことができる。
「抗原提示細胞」または「APC」は、T細胞を活性化することができ、限定されるも
のではないが、単球/マクロファージ、B細胞及び樹状細胞(DC)を含みうる、細胞で
ある。
のではないが、単球/マクロファージ、B細胞及び樹状細胞(DC)を含みうる、細胞で
ある。
「抗原パルスAPC」または「抗原負荷APC」は、抗原に曝露して抗原により活性化
されているAPCが含まれる。例えば、APCは、生体外で、例えば抗原の存在下での培
養中、抗原負荷になることができる。APCはまた、抗原への曝露により生体内でロード
することもできる。「抗原負荷APC」は、伝統的に、2つの方法のいずれかで調整する
:(1)抗原ペプチドとして知られる小ペプチドフラグメントを、APCの外側に直接「
パルス」する:または(2)APCを、その後APCによって摂取される全タンパク質ま
たはタンパク質粒子と共にインキュベートする。これらのタンパク質は、APCにより小
ペプチドフラグメントに消化され、最終的に搬送され、APCの表面に提示される。加え
て、抗原負荷APCはまた、細胞へ抗原をコードするポリヌクレオチドを導入することに
よって生成することもできる。
されているAPCが含まれる。例えば、APCは、生体外で、例えば抗原の存在下での培
養中、抗原負荷になることができる。APCはまた、抗原への曝露により生体内でロード
することもできる。「抗原負荷APC」は、伝統的に、2つの方法のいずれかで調整する
:(1)抗原ペプチドとして知られる小ペプチドフラグメントを、APCの外側に直接「
パルス」する:または(2)APCを、その後APCによって摂取される全タンパク質ま
たはタンパク質粒子と共にインキュベートする。これらのタンパク質は、APCにより小
ペプチドフラグメントに消化され、最終的に搬送され、APCの表面に提示される。加え
て、抗原負荷APCはまた、細胞へ抗原をコードするポリヌクレオチドを導入することに
よって生成することもできる。
「抗HER2応答」は、具体的には、HER2タンパク質に対する免疫応答である。
本明細書において使用される用語「抗腫瘍効果」は、腫瘍体積の減少、腫瘍細胞数の減
少、転移の数の減少、平均余命の増加、または癌状態に関連する様々な生理的症状の改善
によって明らかにすることができる生物学的効果を指す。「抗腫瘍効果」はまた、そもそ
も腫瘍の発生の予防における結合ペプチド、ポリヌクレオチド、細胞および抗体の能力に
よって明らかにすることもできる。
少、転移の数の減少、平均余命の増加、または癌状態に関連する様々な生理的症状の改善
によって明らかにすることができる生物学的効果を指す。「抗腫瘍効果」はまた、そもそ
も腫瘍の発生の予防における結合ペプチド、ポリヌクレオチド、細胞および抗体の能力に
よって明らかにすることもできる。
「アポトーシス」は、プログラム細胞死のプロセスである。カスパーゼ3は、頻繁に活
性化される細胞死プロテアーゼである。
性化される細胞死プロテアーゼである。
本明細書において使用する場合、用語「自己」は、そこに後で導入されるのと同じ個体
に由来する任意の材料を指す。
に由来する任意の材料を指す。
本明細書において使用される用語「B細胞」は、骨髄および/または脾臓に由来する細
胞として定義される。B細胞は抗体を産生する形質細胞に発達することができる。
胞として定義される。B細胞は抗体を産生する形質細胞に発達することができる。
結合ペプチド」に関しては「HER2結合ペプチド」を参照。
本明細書において使用される用語「癌」は、正常なコントロールの損失というその独特
の特色が、無秩序な増殖、分化の欠如、局所組織浸潤、および/または転移をもたらす細
胞の過剰増殖として定義される。例としては、限定するものではないが、乳癌、前立腺癌
、卵巣癌、子宮頸癌、皮膚癌、膀胱癌、食道癌、膵臓癌、結腸直腸癌、胃癌、腎臓癌、肝
臓癌、脳腫瘍、リンパ腫、白血病、肺癌、胚細胞腫瘍、等を含む。
の特色が、無秩序な増殖、分化の欠如、局所組織浸潤、および/または転移をもたらす細
胞の過剰増殖として定義される。例としては、限定するものではないが、乳癌、前立腺癌
、卵巣癌、子宮頸癌、皮膚癌、膀胱癌、食道癌、膵臓癌、結腸直腸癌、胃癌、腎臓癌、肝
臓癌、脳腫瘍、リンパ腫、白血病、肺癌、胚細胞腫瘍、等を含む。
「CD4+Th1細胞」、「Th1細胞」、「CD4+ Tヘルパー1型細胞」、「C
D4+ T細胞」などは、表面タンパク質CD4を発現し、高レベルのサイトカインIF
N−γを産生するヘルパーT細胞のサブタイプとして定義される。「ヘルパーT細胞」も
参照。
D4+ T細胞」などは、表面タンパク質CD4を発現し、高レベルのサイトカインIF
N−γを産生するヘルパーT細胞のサブタイプとして定義される。「ヘルパーT細胞」も
参照。
「累積応答」は、与えられた患者群由来の全ての6個のMHCクラスII結合ペプチド
からの反応スポットの総和(IFN−γELISPOT分析での106個の細胞当たりの
スポット形成細胞「SFC」)として表現される、患者群の複合免疫応答を意味する。
からの反応スポットの総和(IFN−γELISPOT分析での106個の細胞当たりの
スポット形成細胞「SFC」)として表現される、患者群の複合免疫応答を意味する。
「DCワクチン接種(DC vaccination)」、「DC免疫化(DC im
munization)」、「DC1免疫化(DC 1 immunization)」
などは、自己樹状細胞を用いて特定の分子を認識してそれらに対して特異的応答を開始す
る免疫システムを利用する戦略を指す。
munization)」、「DC1免疫化(DC 1 immunization)」
などは、自己樹状細胞を用いて特定の分子を認識してそれらに対して特異的応答を開始す
る免疫システムを利用する戦略を指す。
用語「樹状細胞」または「DC」は、生体内、試験管内、生体外、又は宿主ならびに対
象内に存在する、または造血幹細胞または単球に由来することができる抗原提示細胞であ
る。樹状細胞およびそれらの前駆体は、骨髄や末梢血からと同様に、種々のリンパ器官、
例えば、脾臓、リンパ節から単離することができる。DCは、樹状細胞本体から離れた複
数の方向に延びる薄いシート(葉状仮足)を有する特徴的な形態を持つ。一般には、樹状
細胞は、高いレベルのMHCおよび共刺激(例えば、B7−1およびB7−2)分子を発
現する。樹状細胞は、試験管内でのT細胞の抗原特異的な分化を誘導し、試験管内および
生体内での一次T細胞応答を開始することができる。ワクチン生産との関連において、「
活性化されたDC」は、リポ多糖(LPS)などのToll様受容体アゴニストに暴露さ
れたDCである。活性化されたDCは、抗原が付加されてもよくされなくてもよい。「成
熟DC」も参照。
象内に存在する、または造血幹細胞または単球に由来することができる抗原提示細胞であ
る。樹状細胞およびそれらの前駆体は、骨髄や末梢血からと同様に、種々のリンパ器官、
例えば、脾臓、リンパ節から単離することができる。DCは、樹状細胞本体から離れた複
数の方向に延びる薄いシート(葉状仮足)を有する特徴的な形態を持つ。一般には、樹状
細胞は、高いレベルのMHCおよび共刺激(例えば、B7−1およびB7−2)分子を発
現する。樹状細胞は、試験管内でのT細胞の抗原特異的な分化を誘導し、試験管内および
生体内での一次T細胞応答を開始することができる。ワクチン生産との関連において、「
活性化されたDC」は、リポ多糖(LPS)などのToll様受容体アゴニストに暴露さ
れたDCである。活性化されたDCは、抗原が付加されてもよくされなくてもよい。「成
熟DC」も参照。
「DC−1極性化樹状細胞」、「DC1」及び「1型極性化DC」は、IL−12、I
L−18、およびIL−23などのThl−駆動サイトカインを分泌する成熟DCを指す
。DC1は、細胞性免疫を完全に促進することができる。本明細書中の好ましい実施形態
で、DC1はHER2 MHCクラスII結合ペプチドでパルスされる。
L−18、およびIL−23などのThl−駆動サイトカインを分泌する成熟DCを指す
。DC1は、細胞性免疫を完全に促進することができる。本明細書中の好ましい実施形態
で、DC1はHER2 MHCクラスII結合ペプチドでパルスされる。
「エストロゲン受容体(ER)陽性」または「ERpos」癌はエストロゲンの発現に
ついて陽性を感知する癌である。「ER陰性」癌はそのような発現について陰性を感知す
る。ER状態の分析は、当技術分野で公知の任意の方法によって行うことができる。
ついて陽性を感知する癌である。「ER陰性」癌はそのような発現について陰性を感知す
る。ER状態の分析は、当技術分野で公知の任意の方法によって行うことができる。
「HER2」は、ヒト上皮成長因子受容体(EGFR)ファミリーの一員である。HE
R2は、ヒト乳癌の約20%〜25%で過剰発現されており、多くの他の癌において発現
される。
R2は、ヒト乳癌の約20%〜25%で過剰発現されており、多くの他の癌において発現
される。
本明細書中で使用される「HER2結合ペプチド」、「HER2 MHCクラスII結
合ペプチド」、「結合ペプチド」、「HER2ペプチド」、「免疫原性MHCクラスII
結合ペプチド」、「抗原結合ペプチド」、「HER2エピトープ」、「反応性ペプチド」
、及び同様のものは、約20〜25パーセントの全ヒト乳癌およびその等価物で見られる
標的である、HER2/neuタンパク質の配列に由来するか又は基づくMHCクラスI
Iペプチドを指す。HER2細胞外ドメイン「ECD」は、細胞膜に固定、または循環中
のいずれかである細胞の外側にあるHER2のドメインを指し、それらの断片を含む。H
ER2細胞内ドメイン「ICD」は、細胞の細胞質内のHER2/neuタンパク質のド
メインを指す。好ましい実施形態によれば、HER2エピトープまたは他の結合ペプチド
は、3個のHER2 ECDペプチド及び3個のHER2のICDペプチドを含む6個の
HER2結合ペプチドから構成される。
好ましいHER2 ECDペプチドは:
ペプチド42〜56:HLDMLRHLYQGCQVV(配列番号:1);
ペプチド98〜114:RLRIVRGTQLFEDNYAL(配列番号:2);及び
ペプチド328〜345:TQRCEKCSKPCARVCYGL(配列番号:3)を含
み;
好ましいHER2 ICDペプチドは:
ペプチド776〜790:GVGSPYVSRLLGICL(配列番号:4);
ペプチド927〜941:PAREIPDLLEKGERL(配列番号:5);及び
ペプチド1166〜1180:TLERPKTLSPGKNGV(配列番号:6)を含む
。
合ペプチド」、「結合ペプチド」、「HER2ペプチド」、「免疫原性MHCクラスII
結合ペプチド」、「抗原結合ペプチド」、「HER2エピトープ」、「反応性ペプチド」
、及び同様のものは、約20〜25パーセントの全ヒト乳癌およびその等価物で見られる
標的である、HER2/neuタンパク質の配列に由来するか又は基づくMHCクラスI
Iペプチドを指す。HER2細胞外ドメイン「ECD」は、細胞膜に固定、または循環中
のいずれかである細胞の外側にあるHER2のドメインを指し、それらの断片を含む。H
ER2細胞内ドメイン「ICD」は、細胞の細胞質内のHER2/neuタンパク質のド
メインを指す。好ましい実施形態によれば、HER2エピトープまたは他の結合ペプチド
は、3個のHER2 ECDペプチド及び3個のHER2のICDペプチドを含む6個の
HER2結合ペプチドから構成される。
好ましいHER2 ECDペプチドは:
ペプチド42〜56:HLDMLRHLYQGCQVV(配列番号:1);
ペプチド98〜114:RLRIVRGTQLFEDNYAL(配列番号:2);及び
ペプチド328〜345:TQRCEKCSKPCARVCYGL(配列番号:3)を含
み;
好ましいHER2 ICDペプチドは:
ペプチド776〜790:GVGSPYVSRLLGICL(配列番号:4);
ペプチド927〜941:PAREIPDLLEKGERL(配列番号:5);及び
ペプチド1166〜1180:TLERPKTLSPGKNGV(配列番号:6)を含む
。
「HER2pos」は、多数の他のタイプの癌と同様に、乳癌の分類又は分子サブタイ
プである。HER2陽性は、現在FISH(蛍光インサイツハイブリダイゼーション)ア
ッセイによる遺伝子増幅によって定義され、病理学的染色の強度で2+または3+である
。
プである。HER2陽性は、現在FISH(蛍光インサイツハイブリダイゼーション)ア
ッセイによる遺伝子増幅によって定義され、病理学的染色の強度で2+または3+である
。
「HER2neg」はFISHによる遺伝子増幅の欠如によって定義され、ほとんどの
場合0から2+の病理学的染色の範囲を包含することができる。
場合0から2+の病理学的染色の範囲を包含することができる。
「単離された」とは、天然の状態から変更されたまたは除去されたことを意味する。例
えば、生きている動物中に天然に存在する核酸またはペプチドは「単離された」ではない
が、その自然の状態の共存している材料から部分的に又は完全に分離された同じ核酸また
はペプチドは、「単離された」である。単離された核酸またはタンパク質は、実質的に精
製された形態で存在することができ、または、例えば、宿主細胞のような非天然環境で存
在することができる。
えば、生きている動物中に天然に存在する核酸またはペプチドは「単離された」ではない
が、その自然の状態の共存している材料から部分的に又は完全に分離された同じ核酸また
はペプチドは、「単離された」である。単離された核酸またはタンパク質は、実質的に精
製された形態で存在することができ、または、例えば、宿主細胞のような非天然環境で存
在することができる。
本明細書中で使用される用語「主要組織適合遺伝子複合体」または「MHC」は、遺伝
子の特定のクラスターとして定義され、その多くは組織適合性の最も重要な決定要因の一
つである抗原提示に関与する進化的に関連する表面タンパク質をコードする。クラスI
MHC、またはMHCクラスIは、主にCD8 Tリンパ球への抗原提示に機能する。ク
ラスII MHC、またはMHCクラスIIは、主にCD4+ Tリンパ球(Tヘルパー
細胞)への抗原提示に機能する。
子の特定のクラスターとして定義され、その多くは組織適合性の最も重要な決定要因の一
つである抗原提示に関与する進化的に関連する表面タンパク質をコードする。クラスI
MHC、またはMHCクラスIは、主にCD8 Tリンパ球への抗原提示に機能する。ク
ラスII MHC、またはMHCクラスIIは、主にCD4+ Tリンパ球(Tヘルパー
細胞)への抗原提示に機能する。
本明細書中で使用される「成熟DC」は、高いレベルのMHCクラスII、CD80(
B7.1)およびCD86(B7.2)分子を含む、分子を発現する樹状細胞を意味する
。これとは対照的に、未成熟DC(「iDC」または「IDC」)は、低レベルのMHC
クラスII、CD80(B7.1)およびCD86(B7.2)分子を発現し、まだ依然
として抗原を取り入れることができる。「成熟DC」はまた、生体内、試験管内、生体外
、又は宿主ならびに対象内に存在する抗原提示細胞を指し、DC1極性化であってもよい
。(すなわち、細胞性免疫を完全に促進することができる。)
B7.1)およびCD86(B7.2)分子を含む、分子を発現する樹状細胞を意味する
。これとは対照的に、未成熟DC(「iDC」または「IDC」)は、低レベルのMHC
クラスII、CD80(B7.1)およびCD86(B7.2)分子を発現し、まだ依然
として抗原を取り入れることができる。「成熟DC」はまた、生体内、試験管内、生体外
、又は宿主ならびに対象内に存在する抗原提示細胞を指し、DC1極性化であってもよい
。(すなわち、細胞性免疫を完全に促進することができる。)
CD4+Th1応答(またはTh1応答)の「測定基準」は、抗HER2 CD4+T
h1免疫応答を分析した各被験者グループを対象に定義される:各被験者グループ由来の
6個のMHCクラスIIから結合ペプチドで(a)全体的な抗HER2応答(1以上の反
応性ペプチドに応答する被験者のパーセントとして表される);(b)応答レパートリー
(各被験者グループによって認識された反応性ペプチド(n)の平均数として表される)
;及び(c)累積応答(反応性スポットの総和(IFN−γELISPOT解析での10
6個の細胞当たりのスポット形成細「SFC」)として表される)
h1免疫応答を分析した各被験者グループを対象に定義される:各被験者グループ由来の
6個のMHCクラスIIから結合ペプチドで(a)全体的な抗HER2応答(1以上の反
応性ペプチドに応答する被験者のパーセントとして表される);(b)応答レパートリー
(各被験者グループによって認識された反応性ペプチド(n)の平均数として表される)
;及び(c)累積応答(反応性スポットの総和(IFN−γELISPOT解析での10
6個の細胞当たりのスポット形成細「SFC」)として表される)
「明確なHER2neg」は遺伝子増幅されず、病理学的染色で0または1+であると
して定義される。「曖昧なHER2neg」は遺伝子増幅されないが、病理学的染色で2
+であるとして定義される。
して定義される。「曖昧なHER2neg」は遺伝子増幅されないが、病理学的染色で2
+であるとして定義される。
「応答性」または「抗HER2応答」は本明細書中で交換可能に使用され、6個の結合
ペプチドの少なくとも1つに応答する被験者の割合を意味する。
ペプチドの少なくとも1つに応答する被験者の割合を意味する。
「応答レパートリー」は各被験者グループによって認識される反応性ペプチドの平均数
(n)として定義される。
(n)として定義される。
本明細書中で使用される「サンプル」または「生物学的試料」は、限定されるものでは
ないが、血液、臓器、組織、エキソソーム、血漿、唾液、尿および他の体液を含む、被験
者由来の生物学的材料を意味する。試料は、対象から得られた材料の任意の供給源となり
うる。
ないが、血液、臓器、組織、エキソソーム、血漿、唾液、尿および他の体液を含む、被験
者由来の生物学的材料を意味する。試料は、対象から得られた材料の任意の供給源となり
うる。
用語「被験者」、「患者」、「個体」及び同様のものは、本明細書中で交換可能に使用
され、本明細書に記載の方法に適した、それらの任意の動物、または、試験管内であろう
とインサイツであろうとその細胞を指す。特定の非限定的な実施形態では患者、被験者又
は個体は、ヒトである。
され、本明細書に記載の方法に適した、それらの任意の動物、または、試験管内であろう
とインサイツであろうとその細胞を指す。特定の非限定的な実施形態では患者、被験者又
は個体は、ヒトである。
本明細書で使用される用語「標的療法」は、薬物または他の物質を使用する癌治療を指
し、それは抗腫瘍効果を達成するために通常正常細胞にはほとんどダメージを与えない一
方、癌細胞の増殖に関与する特定の標的分子に干渉する。伝統的な細胞傷害性化学療法薬
は、対照的に、すべての活発に分裂する細胞に対して作用する。乳癌治療モノクローナル
抗体では、具体的にはトラスツズマブ/ハーセプチン(登録商標)がHER2/neu膜
受容体を標的とする。
し、それは抗腫瘍効果を達成するために通常正常細胞にはほとんどダメージを与えない一
方、癌細胞の増殖に関与する特定の標的分子に干渉する。伝統的な細胞傷害性化学療法薬
は、対照的に、すべての活発に分裂する細胞に対して作用する。乳癌治療モノクローナル
抗体では、具体的にはトラスツズマブ/ハーセプチン(登録商標)がHER2/neu膜
受容体を標的とする。
「T/C」は、トラスツズマブ及び化学療法と定義される。これは、乳癌手術前/後に
トラスツズマブ及び化学療法の両方を受けた患者を指す。
トラスツズマブ及び化学療法の両方を受けた患者を指す。
本明細書で使用される用語「T―細胞」または「T細胞」は、種々の細胞性免疫反応に
関与する胸腺由来の細胞として定義される。
関与する胸腺由来の細胞として定義される。
用語「Tヘルパー細胞」、「ヘルパーT細胞」、「Th細胞」等は、本明細書中で細胞
に関して使用され、当業者によって同定可能な異なる細胞型を含む、リンパ球のサブグル
ープ(白血球細胞または白血球のタイプ)を示す。具体的には、Tヘルパー細胞は、その
主な機能が他のBおよびTリンパ球および/またはマクロファージの活性化および機能を
促進することであるエフェクターT細胞である。ヘルパーT細胞は、「Th1」または「
タイプ1」および「Th2」または「タイプ2」表現型として知られている二つの主要な
サブタイプの細胞に分化する。これらのTh細胞は、他の白血球を刺激するまたは相互作
用するサイトカイン、タンパク質、またはペプチドを分泌する。本明細書中で使用される
「Th1細胞」、「CD4+Th1細胞」、「CD4+Tヘルパー1型細胞」、「CD4
+T細胞」及び同様のものは、表面糖タンパク質CD4を発現した成熟T細胞を指す。樹
状細胞などの抗原提示ペプチド(APC)の表面上に発現したMHCクラスII分子によ
りペプチド抗原が提示されるときにCD4+Tヘルパー細胞は活性化する。MHC抗原複
合体によるCD4+Tヘルパー細胞の活性化の際に、それは高レベルのインターフェロン
−γ(IFN−γ)のようなサイトカインを分泌する。このような細胞は、宿主細胞内に
住む、ヒトの癌における抗腫瘍応答において重要である特定の疾患を引き起こす微生物に
対して非常に有効であると考えられる。
に関して使用され、当業者によって同定可能な異なる細胞型を含む、リンパ球のサブグル
ープ(白血球細胞または白血球のタイプ)を示す。具体的には、Tヘルパー細胞は、その
主な機能が他のBおよびTリンパ球および/またはマクロファージの活性化および機能を
促進することであるエフェクターT細胞である。ヘルパーT細胞は、「Th1」または「
タイプ1」および「Th2」または「タイプ2」表現型として知られている二つの主要な
サブタイプの細胞に分化する。これらのTh細胞は、他の白血球を刺激するまたは相互作
用するサイトカイン、タンパク質、またはペプチドを分泌する。本明細書中で使用される
「Th1細胞」、「CD4+Th1細胞」、「CD4+Tヘルパー1型細胞」、「CD4
+T細胞」及び同様のものは、表面糖タンパク質CD4を発現した成熟T細胞を指す。樹
状細胞などの抗原提示ペプチド(APC)の表面上に発現したMHCクラスII分子によ
りペプチド抗原が提示されるときにCD4+Tヘルパー細胞は活性化する。MHC抗原複
合体によるCD4+Tヘルパー細胞の活性化の際に、それは高レベルのインターフェロン
−γ(IFN−γ)のようなサイトカインを分泌する。このような細胞は、宿主細胞内に
住む、ヒトの癌における抗腫瘍応答において重要である特定の疾患を引き起こす微生物に
対して非常に有効であると考えられる。
「Treg」、「Treg」および「制御性T細胞」は、本明細書中で使用されて免疫
系の警察官であり、免疫系の抗癌活性を調節するように作用する細胞を指す。彼らは、特
定の癌で増加し、これらの癌の型の免疫療法に対する抵抗性を仲介する。
系の警察官であり、免疫系の抗癌活性を調節するように作用する細胞を指す。彼らは、特
定の癌で増加し、これらの癌の型の免疫療法に対する抵抗性を仲介する。
「治療有効量」または「有効量」は、本明細書中で互換的に使用され、本明細書に記載
されるように、患者に投与したときに特定の生物学的結果を達成するのに有効である、化
合物、製剤、物質、または組成物の量を意味する。本明細書中に記載された化合物、製剤
、物質、または組成物の量は、これは「治療有効量」を構成し、化合物、製剤、物質、ま
たは組成物に応じて変化する、疾患状態およびその重症度、治療するべき患者の年齢、な
どによって変わる。治療有効量は、当該技術分野の当業者によって彼/彼女自身の知識及
び本開示を考慮して通常決定され得る。
されるように、患者に投与したときに特定の生物学的結果を達成するのに有効である、化
合物、製剤、物質、または組成物の量を意味する。本明細書中に記載された化合物、製剤
、物質、または組成物の量は、これは「治療有効量」を構成し、化合物、製剤、物質、ま
たは組成物に応じて変化する、疾患状態およびその重症度、治療するべき患者の年齢、な
どによって変わる。治療有効量は、当該技術分野の当業者によって彼/彼女自身の知識及
び本開示を考慮して通常決定され得る。
用語「治療する(treat)」、「治療すること(treating)」および「治
療(treatment)」は、本明細書に記載された治療または予防の基準を指す。「
治療」の方法は、そのような治療を必要とする、被験体へ本発明の実施形態の組成物を投
与すること又は本発明の実施形態の方法を採用する、例えば、疾患または障害に罹患した
被験者、または最終的にこのような疾患または障害を獲得する可能性がある被験体、が予
防、治療、遅延、その重症度を低下させる、または障害または再発障害の1以上の症状を
回復する、またはそのような治療が存在しない場合に予想される生存期間を超えて被験者
の生存期間を延長するためである。
療(treatment)」は、本明細書に記載された治療または予防の基準を指す。「
治療」の方法は、そのような治療を必要とする、被験体へ本発明の実施形態の組成物を投
与すること又は本発明の実施形態の方法を採用する、例えば、疾患または障害に罹患した
被験者、または最終的にこのような疾患または障害を獲得する可能性がある被験体、が予
防、治療、遅延、その重症度を低下させる、または障害または再発障害の1以上の症状を
回復する、またはそのような治療が存在しない場合に予想される生存期間を超えて被験者
の生存期間を延長するためである。
本明細書で使用される用語「ワクチン」は動物好ましくは哺乳動物、そしてより好まし
くはヒトへの物質の投与後に免疫応答を誘発するために使用される材料、として定義され
る。被験体への導入の際に、ワクチンは、限定するものではないが、抗体、サイトカイン
および/またはほかの細胞応答を含む、免疫応答を誘発することができる。
くはヒトへの物質の投与後に免疫応答を誘発するために使用される材料、として定義され
る。被験体への導入の際に、ワクチンは、限定するものではないが、抗体、サイトカイン
および/またはほかの細胞応答を含む、免疫応答を誘発することができる。
範囲:本開示を通して、実施形態の様々な態様を範囲形式で提示することができる。範
囲形式での記載は便宜と簡潔さのためだけであり、実施形態の範囲の柔軟性のない限定と
して解釈されるべきではないことを理解する必要がある。したがって、範囲の記載は、そ
の範囲内の個々の数値と同様にすべての可能な部分的な範囲を具体的に開示していると考
慮する必要がある。たとえば、1から6のような範囲の記載は、その範囲内の個々の数値
、例えば、1、2、2.7、3、4、5、5.3、および6と同様に、1から3まで、1
から4まで、1から5まで、2から4まで、2から6まで、3から6までなどのように具
体的に開示された部分範囲を有すると考える必要がある。これは、範囲の広さにかかわら
ず適用される。
囲形式での記載は便宜と簡潔さのためだけであり、実施形態の範囲の柔軟性のない限定と
して解釈されるべきではないことを理解する必要がある。したがって、範囲の記載は、そ
の範囲内の個々の数値と同様にすべての可能な部分的な範囲を具体的に開示していると考
慮する必要がある。たとえば、1から6のような範囲の記載は、その範囲内の個々の数値
、例えば、1、2、2.7、3、4、5、5.3、および6と同様に、1から3まで、1
から4まで、1から5まで、2から4まで、2から6まで、3から6までなどのように具
体的に開示された部分範囲を有すると考える必要がある。これは、範囲の広さにかかわら
ず適用される。
参照は、現在いくつかの実施形態に詳細にされており、その例は添付の図面、写真、お
よび/または、図にも示されている。
よび/または、図にも示されている。
説明
乳癌発症の生涯リスクはほぼ8に1である。erb−B2癌遺伝子(HER−2/ne
u)は、分子作動体であり、それは乳癌、卵巣癌、胃食道癌、肺癌、膵臓癌、前立腺癌お
よび他の固形腫瘍のかなりの数で過剰発現される。乳癌の約20〜25%を含むいくつか
の腫瘍タイプにおける分子オンコドライバーである、HER2の過剰発現(HER2po
s)は、より臨床的に悪性度の高い疾患、化学療法に対する抵抗性、高い割合での再発や
転移、及びより悪い全体的な予後と関連する。初期乳癌において、HER2の過剰発現は
、強化された浸潤性、腫瘍細胞の遊走、及び腫瘍形成性環境を促進するHER2の重要な
役割を示唆する、血管新生促進因子の発現と関連する。非浸潤性乳管癌(DCIS)患者
のレトロスペクティブ分析において、HER2を過剰発現するDCIS病変は、HER2
を過剰発現しないDCIS病変よりも浸潤性の高い乳癌と6倍以上関連がある可能性が高
かった。
乳癌発症の生涯リスクはほぼ8に1である。erb−B2癌遺伝子(HER−2/ne
u)は、分子作動体であり、それは乳癌、卵巣癌、胃食道癌、肺癌、膵臓癌、前立腺癌お
よび他の固形腫瘍のかなりの数で過剰発現される。乳癌の約20〜25%を含むいくつか
の腫瘍タイプにおける分子オンコドライバーである、HER2の過剰発現(HER2po
s)は、より臨床的に悪性度の高い疾患、化学療法に対する抵抗性、高い割合での再発や
転移、及びより悪い全体的な予後と関連する。初期乳癌において、HER2の過剰発現は
、強化された浸潤性、腫瘍細胞の遊走、及び腫瘍形成性環境を促進するHER2の重要な
役割を示唆する、血管新生促進因子の発現と関連する。非浸潤性乳管癌(DCIS)患者
のレトロスペクティブ分析において、HER2を過剰発現するDCIS病変は、HER2
を過剰発現しないDCIS病変よりも浸潤性の高い乳癌と6倍以上関連がある可能性が高
かった。
HER2を標的とする分子標的療法、すなわちトラスツズマブは、このタイプの乳癌に
多大な正の臨床効果をもたらしているけれども、進行した疾患状態における既存のHER
2療法に対するほぼ普遍的な抵抗、加えて前記標的療法を受けた女性のかなりの割合での
疾病再発は、HER2を標的とする追加の戦略の必要性を証明する。HER2に対する免
疫系を活性化し腫瘍の進行を軽減するワクチンの可能性及び再発の防止は、求められてい
るが、未だに完全には理解されていない。したがって、HER2乳癌を診断および治療す
るための追加の試験および治療の必要性が依然として存在する。本明細書において説明し
た本実施形態は、これらの問題に対処する。
多大な正の臨床効果をもたらしているけれども、進行した疾患状態における既存のHER
2療法に対するほぼ普遍的な抵抗、加えて前記標的療法を受けた女性のかなりの割合での
疾病再発は、HER2を標的とする追加の戦略の必要性を証明する。HER2に対する免
疫系を活性化し腫瘍の進行を軽減するワクチンの可能性及び再発の防止は、求められてい
るが、未だに完全には理解されていない。したがって、HER2乳癌を診断および治療す
るための追加の試験および治療の必要性が依然として存在する。本明細書において説明し
た本実施形態は、これらの問題に対処する。
HER2主導の乳房腫瘍形成における全身性の抗HER2 CD4+Th1応答の役割
は、しかし、依然として不明である。本明細書に記載の実施形態は、HER2pos乳癌
における腫瘍形成の連続体全体で抗HER2 CD4+Th1応答の進行性喪失の同定に
基づき、それはHER2特異的および調節性T細胞(Treg)非依存性であるように思
われる。具体的には、抗HER2 CD4+Th1応答と、HER2発現及び疾患進行の
間には負の相関がある。さらに、HER2pos浸潤性乳癌における抑制された抗HER
2のTh1応答は、HER2パルス1型に極性化した樹状細胞「DC1」のワクチン接種
後に、差動的に回復した、しかし、抑制された応答は、本明細書中にまたは外科的切除や
放射線などのような他の標準的な治療によって詳述されるように、続くトラスツズマブと
化学療法(T/C)とのHER2標的療法後に回復されなかった。回復した抗HER2の
Th1応答はまた、少なくとも約6ヶ月以上耐久性があるように思われる。
は、しかし、依然として不明である。本明細書に記載の実施形態は、HER2pos乳癌
における腫瘍形成の連続体全体で抗HER2 CD4+Th1応答の進行性喪失の同定に
基づき、それはHER2特異的および調節性T細胞(Treg)非依存性であるように思
われる。具体的には、抗HER2 CD4+Th1応答と、HER2発現及び疾患進行の
間には負の相関がある。さらに、HER2pos浸潤性乳癌における抑制された抗HER
2のTh1応答は、HER2パルス1型に極性化した樹状細胞「DC1」のワクチン接種
後に、差動的に回復した、しかし、抑制された応答は、本明細書中にまたは外科的切除や
放射線などのような他の標準的な治療によって詳述されるように、続くトラスツズマブと
化学療法(T/C)とのHER2標的療法後に回復されなかった。回復した抗HER2の
Th1応答はまた、少なくとも約6ヶ月以上耐久性があるように思われる。
本明細書に記載の好ましい実施形態は、哺乳類の循環抗腫瘍CD4+Thl応答を発生
し、検出する物質及び方法を提供する。循環抗腫瘍CD4+Th1応答(すなわち、IF
N−γ分泌)を生成する血液検査/アッセイが提供され、生じたIFN−γ産生が検出さ
れ、測定される。他の好ましい実施形態では、CD4+Th1細胞および抗原提示細胞ま
たはその前駆体を含む被験体の血液試料は、被験体が罹患している癌の種類に基づき、被
験体に免疫応答を誘導することができるMHCクラスII免疫原性ペプチドでパルスされ
る。好ましくは、抗原提示細胞またはその前駆体は、成熟あるいは未成熟樹状細胞又はそ
れらの単球前駆体である。特に好ましい実施形態において、癌は好ましくはHER2発現
で、哺乳動物被験体は好ましくはヒトであり、より好ましくは、癌はHER2pos乳癌
で、ヒト被験体は女性である。
し、検出する物質及び方法を提供する。循環抗腫瘍CD4+Th1応答(すなわち、IF
N−γ分泌)を生成する血液検査/アッセイが提供され、生じたIFN−γ産生が検出さ
れ、測定される。他の好ましい実施形態では、CD4+Th1細胞および抗原提示細胞ま
たはその前駆体を含む被験体の血液試料は、被験体が罹患している癌の種類に基づき、被
験体に免疫応答を誘導することができるMHCクラスII免疫原性ペプチドでパルスされ
る。好ましくは、抗原提示細胞またはその前駆体は、成熟あるいは未成熟樹状細胞又はそ
れらの単球前駆体である。特に好ましい実施形態において、癌は好ましくはHER2発現
で、哺乳動物被験体は好ましくはヒトであり、より好ましくは、癌はHER2pos乳癌
で、ヒト被験体は女性である。
本明細書中で同定された抗HER2 CD4+Th1応答の減少は、このような血液検
査で発生した検出された免疫応答が、癌診断/応答の予測因子として単独で又はまたは患
者の免疫応答を回復する専門のワクチンの使用と並行して、使用することができる。本明
細書に記載された好ましい実施形態は、このように、癌の診断および治療の焦点を癌に対
する免疫応答を決定しおよび/または予測するための患者の免疫および血液検査の使用に
移動し、腫瘍細胞の同定に依存している診断及び治療方法とは対照的に、患者に再発の危
険性があるかを含む。
査で発生した検出された免疫応答が、癌診断/応答の予測因子として単独で又はまたは患
者の免疫応答を回復する専門のワクチンの使用と並行して、使用することができる。本明
細書に記載された好ましい実施形態は、このように、癌の診断および治療の焦点を癌に対
する免疫応答を決定しおよび/または予測するための患者の免疫および血液検査の使用に
移動し、腫瘍細胞の同定に依存している診断及び治療方法とは対照的に、患者に再発の危
険性があるかを含む。
好ましい実施形態は、哺乳動物被験体における循環抗HER2 CD4+Th1応答を
生成するために、被験体から増殖されていない末梢血単核細胞(PBMC)を単離し、H
ER2由来のMHCクラスII抗原結合ペプチドを含む組成物をPBMCへパルスし、被
験体内で免疫応答を発生することができるようにすることによって提供される。いかなる
特定の理論に拘泥するものではないが、前記結合ペプチドが前記PBMCサンプル中に存
在するCD4+Th1細胞に提示されるとき、前記CD4+Th1細胞を活性化し、活性
化されたCD4+Th1細胞がインターフェロンγ(IFN−γ)を生成する。被験体の
PBMC試料に含まれる前駆体多能性単球由来のDC1(1型極性化樹状細胞)は、抗原
提示細胞(APC)であり、前記結合ペプチドへの暴露時にMHCクラスII抗原結合ペ
プチドを試料中の被験体のCD4+Thl細胞に提示し、これによりCD4+Th1細胞
を活性化しIFN−γを産生/分泌する抗原負荷APCとなる。それによって産生された
IFN−γは、その後分析のために測定される。
生成するために、被験体から増殖されていない末梢血単核細胞(PBMC)を単離し、H
ER2由来のMHCクラスII抗原結合ペプチドを含む組成物をPBMCへパルスし、被
験体内で免疫応答を発生することができるようにすることによって提供される。いかなる
特定の理論に拘泥するものではないが、前記結合ペプチドが前記PBMCサンプル中に存
在するCD4+Th1細胞に提示されるとき、前記CD4+Th1細胞を活性化し、活性
化されたCD4+Th1細胞がインターフェロンγ(IFN−γ)を生成する。被験体の
PBMC試料に含まれる前駆体多能性単球由来のDC1(1型極性化樹状細胞)は、抗原
提示細胞(APC)であり、前記結合ペプチドへの暴露時にMHCクラスII抗原結合ペ
プチドを試料中の被験体のCD4+Thl細胞に提示し、これによりCD4+Th1細胞
を活性化しIFN−γを産生/分泌する抗原負荷APCとなる。それによって産生された
IFN−γは、その後分析のために測定される。
別の好ましい実施形態では、循環抗HER2 CD4+Th1応答は、被験体の血液試
料由来の刺激されていない精製されたCD4+T細胞を、被験体中で免疫応答を生成する
ことができるHER2由来のMHCクラスII抗原結合ペプチドを含む組成物でパルスし
た自家未成熟または成熟樹状細胞(「iDC」または「成熟DC」、総称して、「DC」
)とあらかじめ共培養することによって、哺乳動物被験体中で生成される。いかなる特定
の理論に拘泥するものではないが、前記結合ペプチドがT細胞試料中に存在するCD4+
Th1細胞に提示されたとき、CD4+Th1細胞を活性化し、活性化されたCD4+T
h1細胞は、IFN−γを分泌/生成する。前記未成熟DCは、DC1に成熟し、サンプ
ル中に存在する被験体のCD4+Th1細胞へMHCクラスII結合ペプチドを提示し、
それによってCD4+Th1細胞を活性化しIFN−γを産生させ、それはその後分析の
ために測定される。
料由来の刺激されていない精製されたCD4+T細胞を、被験体中で免疫応答を生成する
ことができるHER2由来のMHCクラスII抗原結合ペプチドを含む組成物でパルスし
た自家未成熟または成熟樹状細胞(「iDC」または「成熟DC」、総称して、「DC」
)とあらかじめ共培養することによって、哺乳動物被験体中で生成される。いかなる特定
の理論に拘泥するものではないが、前記結合ペプチドがT細胞試料中に存在するCD4+
Th1細胞に提示されたとき、CD4+Th1細胞を活性化し、活性化されたCD4+T
h1細胞は、IFN−γを分泌/生成する。前記未成熟DCは、DC1に成熟し、サンプ
ル中に存在する被験体のCD4+Th1細胞へMHCクラスII結合ペプチドを提示し、
それによってCD4+Th1細胞を活性化しIFN−γを産生させ、それはその後分析の
ために測定される。
被験体中で抗HER2免疫応答を生成するための両方の別の好ましい実施形態では、他
の検出方法が使用されてもよいことは当業者によって理解されるべきであるが、抗HER
2 CD4+Th1細胞によって産生されるIFN−γは、IFN−γ酵素結合免疫スポ
ット(ELISPOT)アッセイによって検出及び測定される。例えば、フローサイトメ
トリー、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、および免疫蛍光法(IF)が免疫応
答を監視するために使用することができる。代わりに、患者の免疫モニタリングの実例で
、全CD4+細胞のスポットを示すELISPOTのような直線のIFN−γ試験とは対
照的に、又は加えて、IL−10に対するIFN−γの比を測定することが有利であり得
る(参考例で行われ、図8Eで示されたように)。このような試験は、リスクのある患者
にとって特に有利であろう。さらに、免疫蛍光法の使用は、蛍光で結果を読み取るELI
SPOTリーダーの使用を介して免疫応答を測定し、視覚化する他の方法を提供する。こ
のような場合に、結果は2つ、3つ、またはそれ以上のサイトカイン/他の分泌された免
疫分子を表示するように配置することができ、各々は同じ患者試料中で、異なる色で示さ
れる。
の検出方法が使用されてもよいことは当業者によって理解されるべきであるが、抗HER
2 CD4+Th1細胞によって産生されるIFN−γは、IFN−γ酵素結合免疫スポ
ット(ELISPOT)アッセイによって検出及び測定される。例えば、フローサイトメ
トリー、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、および免疫蛍光法(IF)が免疫応
答を監視するために使用することができる。代わりに、患者の免疫モニタリングの実例で
、全CD4+細胞のスポットを示すELISPOTのような直線のIFN−γ試験とは対
照的に、又は加えて、IL−10に対するIFN−γの比を測定することが有利であり得
る(参考例で行われ、図8Eで示されたように)。このような試験は、リスクのある患者
にとって特に有利であろう。さらに、免疫蛍光法の使用は、蛍光で結果を読み取るELI
SPOTリーダーの使用を介して免疫応答を測定し、視覚化する他の方法を提供する。こ
のような場合に、結果は2つ、3つ、またはそれ以上のサイトカイン/他の分泌された免
疫分子を表示するように配置することができ、各々は同じ患者試料中で、異なる色で示さ
れる。
当業者は、他の適当なAPCが、樹状細胞に加えて、例えばマクロファージ等の単球及
びB細胞を使用できることを容易に理解することができる。
びB細胞を使用できることを容易に理解することができる。
好ましい実施形態では、IFN−γELISPOTアッセイは、IFG−γ産生を検出
するために実行される(正のペプチド応答:最小閾値20SFC/2x105及び刺激さ
れていない対照よりも2倍大きい)。結果は、好ましくは、Th1応答の3つの指標とし
て表現される:(a)全体の抗HER2応答(1以上の反応性ペプチドに応答した被験体
のパーセントとして表現される);(b)応答レパートリー(各被験体グループによって
認識された反応性ペプチド(n)の平均数として表現される);そして、(c)累積応答
(各被験体グループからすべての6のMHCクラスII結合ペプチドからの反応スポット
(IFN−γELISPOT解析から106個の細胞あたりのスポット形成細胞「SFC
」)の総和として表現される)。
するために実行される(正のペプチド応答:最小閾値20SFC/2x105及び刺激さ
れていない対照よりも2倍大きい)。結果は、好ましくは、Th1応答の3つの指標とし
て表現される:(a)全体の抗HER2応答(1以上の反応性ペプチドに応答した被験体
のパーセントとして表現される);(b)応答レパートリー(各被験体グループによって
認識された反応性ペプチド(n)の平均数として表現される);そして、(c)累積応答
(各被験体グループからすべての6のMHCクラスII結合ペプチドからの反応スポット
(IFN−γELISPOT解析から106個の細胞あたりのスポット形成細胞「SFC
」)の総和として表現される)。
HER2pos癌のための好ましい実施形態では、DC、未成熟または1型極性化DC
は、HER2に由来するか基づき患者中に免疫応答を生成することができる6MHCクラ
スII結合ペプチドを含む組成物でパルスされる。
HER2 MHCクラスII結合ペプチドまたはエピトープは、
ペプチド 42−56:HLDMLRHLYQGCQVV(配列番号:1);
ペプチド 98−114:RLRIVRGTQLFEDNYAL(配列番号:2);
ペプチド 328−345:TQRCEKCSKPCARVCYGL(配列番号:3);
ペプチド 776−790:GVGSPYVSRLLGICL(配列番号:4);
ペプチド 927−941 :PAREIPDLLEKGERL(配列番号:5);及び
ペプチド 1166−1180:TLERPKTLSPGKNGV(配列番号:6)を含
む。
ドナーがA2.1の血液型を有する実施形態では、HER2 MHCクラスIペプチドま
たはエピトープは、
ペプチド 369−377:KIFGSLAFL(配列番号:7);及び
ペプチド 689−697:RLLQETELV(配列番号:8)を含む。
は、HER2に由来するか基づき患者中に免疫応答を生成することができる6MHCクラ
スII結合ペプチドを含む組成物でパルスされる。
HER2 MHCクラスII結合ペプチドまたはエピトープは、
ペプチド 42−56:HLDMLRHLYQGCQVV(配列番号:1);
ペプチド 98−114:RLRIVRGTQLFEDNYAL(配列番号:2);
ペプチド 328−345:TQRCEKCSKPCARVCYGL(配列番号:3);
ペプチド 776−790:GVGSPYVSRLLGICL(配列番号:4);
ペプチド 927−941 :PAREIPDLLEKGERL(配列番号:5);及び
ペプチド 1166−1180:TLERPKTLSPGKNGV(配列番号:6)を含
む。
ドナーがA2.1の血液型を有する実施形態では、HER2 MHCクラスIペプチドま
たはエピトープは、
ペプチド 369−377:KIFGSLAFL(配列番号:7);及び
ペプチド 689−697:RLLQETELV(配列番号:8)を含む。
本明細書でさらに記載されるように、好ましい実施形態のHER2結合ペプチド/エピ
トープは、6個の上記参照ペプチドに限定されるものではなく、本明細書でより詳細に説
明するように、配列番号1〜6によって同定された結合ペプチドの機能的同等物または代
替物であるペプチドも含む。A2.1及びA3.1血液型及び他の血液型(例えば、A5
、A6)を有する被験体のために使用することができる、任意の表現型に結合するクラス
Iペプチドを含む追加のクラスIペプチドがある。
トープは、6個の上記参照ペプチドに限定されるものではなく、本明細書でより詳細に説
明するように、配列番号1〜6によって同定された結合ペプチドの機能的同等物または代
替物であるペプチドも含む。A2.1及びA3.1血液型及び他の血液型(例えば、A5
、A6)を有する被験体のために使用することができる、任意の表現型に結合するクラス
Iペプチドを含む追加のクラスIペプチドがある。
乳癌に加えて、例えば、脳、膀胱、食道、肺、膵臓、肝臓、前立腺、卵巣、結腸直腸、
及び胃、およびその他のような、他の多くのHER2pos固形癌があり、それらのため
に本明細書に記載の実施形態の材料及び方法を、診断および治療のために使用することが
できる。
及び胃、およびその他のような、他の多くのHER2pos固形癌があり、それらのため
に本明細書に記載の実施形態の材料及び方法を、診断および治療のために使用することが
できる。
ワクチンは、上述の同じ抗HER2結合ペプチドを用いてHER2発現腫瘍を標的化す
るために開発することができ、または例えば、DNA、RNA、ペプチド、またはタンパ
ク質もしくはICDおよびECDのドメインのようなその構成要素などのような免疫原性
であるHER2の任意の組成物を使用することができる。例えば、被験体は全HER2タ
ンパク質に対するワクチン投与を受けることができ、6個の上述した結合ペプチドは、患
者の免疫応答をモニターするために使用することができる。同様に、ワクチンは、HER
1、HER3、およびc−METを含むHER2ファミリーの他のメンバーのような他の
タイプの癌のために開発することができる。
るために開発することができ、または例えば、DNA、RNA、ペプチド、またはタンパ
ク質もしくはICDおよびECDのドメインのようなその構成要素などのような免疫原性
であるHER2の任意の組成物を使用することができる。例えば、被験体は全HER2タ
ンパク質に対するワクチン投与を受けることができ、6個の上述した結合ペプチドは、患
者の免疫応答をモニターするために使用することができる。同様に、ワクチンは、HER
1、HER3、およびc−METを含むHER2ファミリーの他のメンバーのような他の
タイプの癌のために開発することができる。
現在の好ましい実施形態は、女性のHER2pos乳がんを治療し、診断することに関
しているが、本発明の実施形態は、女性の人間に限定されないことは当業者によって直ち
に理解されるべきである。現在好ましい実施形態は、男性のヒト、例えば、HER2を発
現する前立腺癌を、ならびに他の哺乳動物被験体を含む。
しているが、本発明の実施形態は、女性の人間に限定されないことは当業者によって直ち
に理解されるべきである。現在好ましい実施形態は、男性のヒト、例えば、HER2を発
現する前立腺癌を、ならびに他の哺乳動物被験体を含む。
組成物
好ましい実施形態は、HER2タンパク質に由来するか、またはそうでなければ基づい
て単離されたペプチドの使用を含む。好ましい実施形態の結合ペプチドは、対応するHE
R2タンパク質のエピトープを提示する。現在好ましい実施形態は、6つのHER2 M
HCクラスII結合ペプチド/エピトープを備えているが、患者において免疫学的に十分
に活性である限り、HER2分子全体の任意の成分が他の結合ペプチドの供給源として使
用することができ、他の可能なMHCクラスII HER2ペプチドが、本実施形態で使
用されうる。
好ましい実施形態は、HER2タンパク質に由来するか、またはそうでなければ基づい
て単離されたペプチドの使用を含む。好ましい実施形態の結合ペプチドは、対応するHE
R2タンパク質のエピトープを提示する。現在好ましい実施形態は、6つのHER2 M
HCクラスII結合ペプチド/エピトープを備えているが、患者において免疫学的に十分
に活性である限り、HER2分子全体の任意の成分が他の結合ペプチドの供給源として使
用することができ、他の可能なMHCクラスII HER2ペプチドが、本実施形態で使
用されうる。
好ましい実施形態では、HER2結合ペプチドは配列:
ペプチド 42〜56:HLDMLRHLYQGCQVV(配列番号:1);
ペプチド 98〜114:RLRIVRGTQLFEDNYAL(配列番号:2);
ペプチド 328〜345:TQRCEKCSKPCARVCYGL(配列番号:3);
ペプチド 776〜790:GVGSPYVSRLLGICL(配列番号:4);
ペプチド 927〜941:PAREIPDLLEKGERL(配列番号:5);及び
ペプチド 1166〜1180:TLERPKTLSPGKNGV(配列番号:6)
を有する6個のHER2 MHCクラスII結合ペプチドを含む。
ペプチド 42〜56:HLDMLRHLYQGCQVV(配列番号:1);
ペプチド 98〜114:RLRIVRGTQLFEDNYAL(配列番号:2);
ペプチド 328〜345:TQRCEKCSKPCARVCYGL(配列番号:3);
ペプチド 776〜790:GVGSPYVSRLLGICL(配列番号:4);
ペプチド 927〜941:PAREIPDLLEKGERL(配列番号:5);及び
ペプチド 1166〜1180:TLERPKTLSPGKNGV(配列番号:6)
を有する6個のHER2 MHCクラスII結合ペプチドを含む。
配列番号:1によって識別されるHER2エピトープはHER2タンパク質の42〜5
6の位置を表す。配列番号:2によって識別されるHER2エピトープはHER2タンパ
ク質の98〜114の位置を表す。配列番号:3によって識別されるHER2エピトープ
はHER2タンパク質の328〜345の位置を表す。配列番号:4によって識別される
HER2エピトープはHER2タンパク質の776〜790の位置を表す。配列番号:5
によって識別されるHER2エピトープはHER2タンパク質の927〜941の位置を
表す。配列番号:6によって識別されるHER2エピトープはHER2タンパク質の11
66〜1180の位置を表す。
6の位置を表す。配列番号:2によって識別されるHER2エピトープはHER2タンパ
ク質の98〜114の位置を表す。配列番号:3によって識別されるHER2エピトープ
はHER2タンパク質の328〜345の位置を表す。配列番号:4によって識別される
HER2エピトープはHER2タンパク質の776〜790の位置を表す。配列番号:5
によって識別されるHER2エピトープはHER2タンパク質の927〜941の位置を
表す。配列番号:6によって識別されるHER2エピトープはHER2タンパク質の11
66〜1180の位置を表す。
さらに、当業者は、本明細書に記載の実施形態は、本明細書の好ましい実施形態に関連
して記載された全6個の結合ペプチドを使用することに限定されるものではないことを理
解することができる。IFN−γの産生を引き起こすために、患者のCD4+T細胞に十
分な免疫学的活性がなければならないことを注意して、低域が2つまたは3つ程度の任意
の数の記載された結合ペプチドが、患者の血液検査に使用されうる。したがって、本明細
書の好ましい実施形態に関連して記載された一組の6個のものより少ない及び又は異なる
HER由来クラスII結合ペプチドが使用されている場合には、結合ペプチドの数は、被
験体で生成された免疫応答に応じておそらく実質的に6よりも小さいか大きいだろう。
して記載された全6個の結合ペプチドを使用することに限定されるものではないことを理
解することができる。IFN−γの産生を引き起こすために、患者のCD4+T細胞に十
分な免疫学的活性がなければならないことを注意して、低域が2つまたは3つ程度の任意
の数の記載された結合ペプチドが、患者の血液検査に使用されうる。したがって、本明細
書の好ましい実施形態に関連して記載された一組の6個のものより少ない及び又は異なる
HER由来クラスII結合ペプチドが使用されている場合には、結合ペプチドの数は、被
験体で生成された免疫応答に応じておそらく実質的に6よりも小さいか大きいだろう。
本明細書に記載されたように、好ましい実施形態のHER2結合ペプチドはまた、配列
番号:1〜6によって同定されるペプチドの機能的等価物であるペプチドを包含する。こ
のような機能的等価物は、対応するHER2ペプチド配列中の1以上のアミノ酸が置換さ
れるか、または、1以上のアミノ酸が対応する基準配列から削除されるか、または、加え
られるという改変された配列を有していてもよい。例えば、1〜3個のアミノ酸がアミノ
末端、カルボキシル末端、またはその両方に加えられてもよい。いくつかの例では、HE
R2ペプチドはグリコシル化することができる。
番号:1〜6によって同定されるペプチドの機能的等価物であるペプチドを包含する。こ
のような機能的等価物は、対応するHER2ペプチド配列中の1以上のアミノ酸が置換さ
れるか、または、1以上のアミノ酸が対応する基準配列から削除されるか、または、加え
られるという改変された配列を有していてもよい。例えば、1〜3個のアミノ酸がアミノ
末端、カルボキシル末端、またはその両方に加えられてもよい。いくつかの例では、HE
R2ペプチドはグリコシル化することができる。
前記HER2結合ペプチド又は本実施形態に従う任意のペプチドは、環化されても直鎖
状であってもよい。環化したとき、エピトープは、任意の適切な方法で環化することがで
きる。例えば、ジスルフィド結合は所望のコンフォメーション(confirmatio
n)を提供するために選択されたシステイン(Cys)対の間に形成されてもよい。環化
エピトープの形成は、免疫応答を改善するコンフォメーションを提供することができると
考えられている。
状であってもよい。環化したとき、エピトープは、任意の適切な方法で環化することがで
きる。例えば、ジスルフィド結合は所望のコンフォメーション(confirmatio
n)を提供するために選択されたシステイン(Cys)対の間に形成されてもよい。環化
エピトープの形成は、免疫応答を改善するコンフォメーションを提供することができると
考えられている。
他の例では、HER2結合ペプチドは、HER2結合ペプチドのレトロ−インベルソ異
性体であってもよい。レトロ−インベルソ修飾は、ペプチド骨格内のすべてのアミド結合
の逆転を含む。この逆転は、配列の方向を反転し、L−アミノ酸の代わりにD−アミノ酸
を使用して、各アミノ酸残基のキラリティーを反転することによって達成することができ
る。このレトロ−インベルソ異性体形態は、少なくとも一部のペプチド結合の平面性と配
座制限を保持することができる。
性体であってもよい。レトロ−インベルソ修飾は、ペプチド骨格内のすべてのアミド結合
の逆転を含む。この逆転は、配列の方向を反転し、L−アミノ酸の代わりにD−アミノ酸
を使用して、各アミノ酸残基のキラリティーを反転することによって達成することができ
る。このレトロ−インベルソ異性体形態は、少なくとも一部のペプチド結合の平面性と配
座制限を保持することができる。
非保存的アミノ酸置換および/または保存的置換もまた、行うことができる。置換され
たアミノ酸が基準配列中の対応するアミノ酸と類似の構造または化学的特性を有する場合
、置換は、保存的アミノ酸置換である。一例として、保存的アミノ酸置換は、1つの脂肪
族または疎水性アミノ酸、例えば、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシンのほか
のものとの置換;1つのヒドロキシル含有アミノ酸、例えば、セリン及びスレオニンのほ
かのものとの置換;1つの酸性残基、例えば、グルタミン酸またはアスパラギン酸のほか
のものとの置換;1つのアミド含有残基、例えば、アスパラギンおよびグルタミンのほか
のものとの置換;1つの芳香族残基、例えば、フェニルアラニンおよびチロシンのほかの
ものとの置換;1つの塩基性残基、例えば、リジン、アルギニン及びヒスチジンのほかの
ものとの置換;1つの小さなアミノ酸、例えば、アラニン、セリン、トレオニン、メチオ
ニン、及びグリシンのほかのものとの置換、を含む。
たアミノ酸が基準配列中の対応するアミノ酸と類似の構造または化学的特性を有する場合
、置換は、保存的アミノ酸置換である。一例として、保存的アミノ酸置換は、1つの脂肪
族または疎水性アミノ酸、例えば、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシンのほか
のものとの置換;1つのヒドロキシル含有アミノ酸、例えば、セリン及びスレオニンのほ
かのものとの置換;1つの酸性残基、例えば、グルタミン酸またはアスパラギン酸のほか
のものとの置換;1つのアミド含有残基、例えば、アスパラギンおよびグルタミンのほか
のものとの置換;1つの芳香族残基、例えば、フェニルアラニンおよびチロシンのほかの
ものとの置換;1つの塩基性残基、例えば、リジン、アルギニン及びヒスチジンのほかの
ものとの置換;1つの小さなアミノ酸、例えば、アラニン、セリン、トレオニン、メチオ
ニン、及びグリシンのほかのものとの置換、を含む。
いくつかの例では、好ましい実施形態の結合ペプチドの配列の一つのアミノ末端、カル
ボキシ末端、またはその両方で欠失および付加がある。例えば、HER2結合ペプチド等
価物は、対応するHER2結合ペプチド配列と少なくとも70%同一、少なくとも80%
同一、少なくとも85%同一、少なくとも90%同一、少なくとも91%、少なくとも9
2%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少
なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を
有する。少なくとも90%同一である配列は1以上の変更、すなわち、基準配列の10ア
ミノ酸あたりの欠失、付加および置換の任意の組み合わせ、を有していない。パーセント
同一性は、当技術分野で知られているか開発されたプログラムを使用して、基準配列と変
異体のアミノ酸配列を比較することによって決定される
ボキシ末端、またはその両方で欠失および付加がある。例えば、HER2結合ペプチド等
価物は、対応するHER2結合ペプチド配列と少なくとも70%同一、少なくとも80%
同一、少なくとも85%同一、少なくとも90%同一、少なくとも91%、少なくとも9
2%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少
なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を
有する。少なくとも90%同一である配列は1以上の変更、すなわち、基準配列の10ア
ミノ酸あたりの欠失、付加および置換の任意の組み合わせ、を有していない。パーセント
同一性は、当技術分野で知られているか開発されたプログラムを使用して、基準配列と変
異体のアミノ酸配列を比較することによって決定される
対応するHER2結合ペプチド配列よりも長い機能的等価物については、前記機能的等
価物は、HER2ペプチド配列に対して少なくとも90%同一である配列を有することが
でき前記配列は野生型HER2タンパク質におけるHER2ペプチド配列に隣接する。
価物は、HER2ペプチド配列に対して少なくとも90%同一である配列を有することが
でき前記配列は野生型HER2タンパク質におけるHER2ペプチド配列に隣接する。
ペプチドの配列を変更し、その後、CD4+Th1細胞への結合ペプチド/エピトープ
を提示する被験体の単球、樹状細胞または他の抗原提示細胞を刺激する能力について、得
られたポリペプチドをアッセイすることによってHER2結合ペプチドの機能的等価物を
識別することができる。
を提示する被験体の単球、樹状細胞または他の抗原提示細胞を刺激する能力について、得
られたポリペプチドをアッセイすることによってHER2結合ペプチドの機能的等価物を
識別することができる。
他の実施形態によれば、キメラペプチドおよび1つ以上のキメラペプチドを含む組成物
が提供される。様々な実施形態によれば、キメラペプチドは、HER2ペプチド、別のペ
プチド、および他のペプチドのHER2ペプチドを結合するリンカーを含む。さらに、任
意の適当なリンカーが使用されてもよいことが理解されるであろう。例えば、使用される
ペプチドに依存して、HER2結合ペプチドは、他の結合ペプチドのアミノまたはカルボ
キシ末端のいずれかに結合してもよい。他のペプチドの位置及び選択は、HER2ペプチ
ドがアルファへリックス状かβ−ターン状か鎖状かという構造的特徴に依存する。
が提供される。様々な実施形態によれば、キメラペプチドは、HER2ペプチド、別のペ
プチド、および他のペプチドのHER2ペプチドを結合するリンカーを含む。さらに、任
意の適当なリンカーが使用されてもよいことが理解されるであろう。例えば、使用される
ペプチドに依存して、HER2結合ペプチドは、他の結合ペプチドのアミノまたはカルボ
キシ末端のいずれかに結合してもよい。他のペプチドの位置及び選択は、HER2ペプチ
ドがアルファへリックス状かβ−ターン状か鎖状かという構造的特徴に依存する。
別の実施形態において、リンカーは、長さで約2から約15のアミノ酸、約2から約1
0個のアミノ酸、約2から約6個のアミノ酸のペプチドでありうる。キメラペプチドは直
鎖状でも環化していてもよい。さらに、HER2ペプチド、他のペプチド、および/また
はリンカーが、レトロ−インベルソ形であってもよい。このように、HER2ペプチドは
、沿ってレトロインベルソ形であってもよい。あるいは、HER2ペプチドと他のペプチ
ドは、レトロインベルソ形であってもよい。別の例では、HER2ペプチド、他のエピト
ープ、およびリンカーはレトロインベルソ形であってもよい。
0個のアミノ酸、約2から約6個のアミノ酸のペプチドでありうる。キメラペプチドは直
鎖状でも環化していてもよい。さらに、HER2ペプチド、他のペプチド、および/また
はリンカーが、レトロ−インベルソ形であってもよい。このように、HER2ペプチドは
、沿ってレトロインベルソ形であってもよい。あるいは、HER2ペプチドと他のペプチ
ドは、レトロインベルソ形であってもよい。別の例では、HER2ペプチド、他のエピト
ープ、およびリンカーはレトロインベルソ形であってもよい。
キメラペプチドを含むペプチドは、周知の技術を用いて調製することができる。例えば
、ペプチドは、組換えDNA技術または化学合成のいずれかを用いて、合成的に調製する
ことができる。本発明の実施形態のペプチドは、個々に合成されるか、または2以上のペ
プチドから構成されるより長いポリペプチドとして、合成されうる。現在好ましい実施形
態のペプチドは、好ましくは単離される、すなわち、他の天然に存在する宿主細胞タンパ
ク質およびそれらの断片を実質的に含まない。
、ペプチドは、組換えDNA技術または化学合成のいずれかを用いて、合成的に調製する
ことができる。本発明の実施形態のペプチドは、個々に合成されるか、または2以上のペ
プチドから構成されるより長いポリペプチドとして、合成されうる。現在好ましい実施形
態のペプチドは、好ましくは単離される、すなわち、他の天然に存在する宿主細胞タンパ
ク質およびそれらの断片を実質的に含まない。
本発明の実施形態のペプチドおよびキメラペプチドは、市販のペプチド合成機を使用し
て合成することができる。例えば、Kaumaya,P.T.P.,et al,「De
Novo」Engineering of Peptide Immunogenic
and Antigenic Determinants as Potential
Vaccines,in Peptides,Design,Synthesis a
nd Biological Activity,pp133−164(1994)に記
載された化学的方法を使用することができる。例えば、HER2結合ペプチドは、キメラ
ペプチドを形成するために他の結合ペプチドと共直線的に合成することができる。ペプチ
ド合成は、Fmoc/T−But化学を用いて行うことができる。ペプチドおよびキメラ
ペプチドは、任意の適切な方法で環化することができる。例えば、異なるように保護され
たシステイン残基、ヨウ素酸化、Acm基の除去を高めるための水の添加、及びジスルフ
ィド結合の付随的形成、および/またはシリルクロライド−スルホキシド法を使用するこ
とによって、ジスルフィド結合を達成することができる。
て合成することができる。例えば、Kaumaya,P.T.P.,et al,「De
Novo」Engineering of Peptide Immunogenic
and Antigenic Determinants as Potential
Vaccines,in Peptides,Design,Synthesis a
nd Biological Activity,pp133−164(1994)に記
載された化学的方法を使用することができる。例えば、HER2結合ペプチドは、キメラ
ペプチドを形成するために他の結合ペプチドと共直線的に合成することができる。ペプチ
ド合成は、Fmoc/T−But化学を用いて行うことができる。ペプチドおよびキメラ
ペプチドは、任意の適切な方法で環化することができる。例えば、異なるように保護され
たシステイン残基、ヨウ素酸化、Acm基の除去を高めるための水の添加、及びジスルフ
ィド結合の付随的形成、および/またはシリルクロライド−スルホキシド法を使用するこ
とによって、ジスルフィド結合を達成することができる。
ペプチドおよびキメラペプチドは、無細胞翻訳系と、エピトープまたは結合ペプチドを
コードしたDNA構築物に由来するRNA分子を使用して製造することができる。あるい
は、エピトープまたはキメラペプチドを、各エピトープまたはキメラペプチドをコードす
るDNA配列を含む発現ベクターで宿主細胞をトランスフェクトし、その後、宿主細胞に
おけるポリペプチドの発現を誘導することによって作製することができる。組換え体の生
産のために、結合性ペプチドエピトープ、キメラペプチド、またはその変異体をコードす
る1つ以上の配列を含む組換え構築物が、リン酸カルシウムトランスフェクション、DE
AE−デキストラン媒介トランスフェクション、マイクロインジェクション、カチオン性
脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープローデ
ィング、弾丸導入又は感染などの従来の方法により宿主細胞に導入される。
コードしたDNA構築物に由来するRNA分子を使用して製造することができる。あるい
は、エピトープまたはキメラペプチドを、各エピトープまたはキメラペプチドをコードす
るDNA配列を含む発現ベクターで宿主細胞をトランスフェクトし、その後、宿主細胞に
おけるポリペプチドの発現を誘導することによって作製することができる。組換え体の生
産のために、結合性ペプチドエピトープ、キメラペプチド、またはその変異体をコードす
る1つ以上の配列を含む組換え構築物が、リン酸カルシウムトランスフェクション、DE
AE−デキストラン媒介トランスフェクション、マイクロインジェクション、カチオン性
脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープローデ
ィング、弾丸導入又は感染などの従来の方法により宿主細胞に導入される。
本発明の実施形態の結合ペプチドは、結合ペプチドの生物学的活性を破壊しない限り、
グリコシル化、側鎖酸化、またはリン酸化などの修飾を含んでいてもよい。他の修飾は、
D−アミノ酸または他のアミノ酸模倣体の取り込みを含む。
グリコシル化、側鎖酸化、またはリン酸化などの修飾を含んでいてもよい。他の修飾は、
D−アミノ酸または他のアミノ酸模倣体の取り込みを含む。
実施形態の結合ペプチドは、2つ以上のペプチドを含む組合せとして調製することがで
きる。ペプチドは、カクテルであってもよく、または標準的な技術を用いて互いに結合さ
せてもよい。例えば、ペプチドは、単一のポリペプチド配列として発現させることができ
る。組み合わせにおけるペプチドは、同一でも異なっていてもよい。
きる。ペプチドは、カクテルであってもよく、または標準的な技術を用いて互いに結合さ
せてもよい。例えば、ペプチドは、単一のポリペプチド配列として発現させることができ
る。組み合わせにおけるペプチドは、同一でも異なっていてもよい。
本発明の実施形態もまた、得られたペプチド(またはDNA)が本明細書に記載された
配列と同一ではなく、しかし、本明細書に開示されるペプチドと同じ生物学的特性を有す
るような、1個以上のアミノ酸で改変されたペプチドである(または、同じものをコード
するヌクレオチド配列に言及する場合、一つ以上の塩基対で改変する)前記実施形態の前
記ペプチドの(または同じものをコードしたDNAの)「変異体」、「誘導体」、および
「バリアント」を包含すると解釈されるべきである。
配列と同一ではなく、しかし、本明細書に開示されるペプチドと同じ生物学的特性を有す
るような、1個以上のアミノ酸で改変されたペプチドである(または、同じものをコード
するヌクレオチド配列に言及する場合、一つ以上の塩基対で改変する)前記実施形態の前
記ペプチドの(または同じものをコードしたDNAの)「変異体」、「誘導体」、および
「バリアント」を包含すると解釈されるべきである。
いくつかの実施形態はまた、配列番号:1〜6のいずれか1つ以上の配列を有するペプ
チドから選択された少なくとも1つのペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する
。核酸配列は、RNAに転写されるDNA配列及びペプチドに翻訳されるRNA配列の両
方を含む。他の実施形態によれば、ポリヌクレオチドは、好ましい態様のペプチドのアミ
ノ酸配列から推測される。当技術分野で知られているように、冗長コドンが原因で、翻訳
されたペプチドの生物学的活性を保持しながら、いくつかの代替的なポリヌクレオチドが
可能である。
チドから選択された少なくとも1つのペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する
。核酸配列は、RNAに転写されるDNA配列及びペプチドに翻訳されるRNA配列の両
方を含む。他の実施形態によれば、ポリヌクレオチドは、好ましい態様のペプチドのアミ
ノ酸配列から推測される。当技術分野で知られているように、冗長コドンが原因で、翻訳
されたペプチドの生物学的活性を保持しながら、いくつかの代替的なポリヌクレオチドが
可能である。
さらに、好ましい実施形態では、本明細書に開示される結合ペプチドと実質的な相同性
を有するペプチドをコードする単離された核酸を包含する。好ましくは、本発明のペプチ
ドをコードする単離された核酸のヌクレオチド配列は、好適な実施形態の結合ペプチドを
コードする単離された核酸のヌクレオチド配列と「実質的に相同」で、すなわち、約60
%の相同性、より好ましくは約70%の相同性、さらにより好ましくは約80%の相同性
、より好ましくは約90%の相同性、さらにより好ましくは、約95%の相同性、さらに
より好ましくは約99%相同である。
を有するペプチドをコードする単離された核酸を包含する。好ましくは、本発明のペプチ
ドをコードする単離された核酸のヌクレオチド配列は、好適な実施形態の結合ペプチドを
コードする単離された核酸のヌクレオチド配列と「実質的に相同」で、すなわち、約60
%の相同性、より好ましくは約70%の相同性、さらにより好ましくは約80%の相同性
、より好ましくは約90%の相同性、さらにより好ましくは、約95%の相同性、さらに
より好ましくは約99%相同である。
元の結合ペプチドの免疫学的活性を保持しなければならないという規定のもとで、好ま
しい実施形態の範囲は、より短い及びより長いペプチドおよびポリヌクレオチドを含む、
ホモログ、アナログ、バリアント、誘導体および塩を、同様に一又は複数のアミノ酸又は
核酸が置換されたペプチドおよびポリヌクレオチド類似体を、同様に、当技術分野で知ら
れているようなアミノ酸または核酸の誘導体、非天然アミノ酸または核酸および合成アミ
ノ酸、または核酸を包含することは、明示的に理解されるべきである。具体的には、アク
ティブな活性結合ペプチドの断片だけでなく、拡張物、抱合体および混合物が本明細書に
記載の原理に従って包含される。
しい実施形態の範囲は、より短い及びより長いペプチドおよびポリヌクレオチドを含む、
ホモログ、アナログ、バリアント、誘導体および塩を、同様に一又は複数のアミノ酸又は
核酸が置換されたペプチドおよびポリヌクレオチド類似体を、同様に、当技術分野で知ら
れているようなアミノ酸または核酸の誘導体、非天然アミノ酸または核酸および合成アミ
ノ酸、または核酸を包含することは、明示的に理解されるべきである。具体的には、アク
ティブな活性結合ペプチドの断片だけでなく、拡張物、抱合体および混合物が本明細書に
記載の原理に従って包含される。
好ましい実施形態は、これらの相同なDNAが、本明細書に開示される結合ペプチドの
生物学的活性を有するならば、本明細書に記載され参照された核酸に相同な、任意のおよ
び全ての単離された核酸を含むと解釈されるべきである。
生物学的活性を有するならば、本明細書に記載され参照された核酸に相同な、任意のおよ
び全ての単離された核酸を含むと解釈されるべきである。
当業者は好ましい実施形態の核酸は好ましい実施態様のペプチドをコードするRNAま
たはDNA配列及びそれらの任意の、無細胞である場合または細胞と関連しているときに
ヌクレオチド配列をより安定にするDNAまたはRNAの化学修飾を含む、改変型を包含
することを理解するだろう。ヌクレオチドの化学修飾はまた、ヌクレオチド配列が細胞に
よって取り込まれる効率、または細胞内で発現される効率強化するために使用されてもよ
い。任意の及び全てのヌクレオチド配列の改変の組み合わせは、好ましい実施形態におい
て熟慮される。
たはDNA配列及びそれらの任意の、無細胞である場合または細胞と関連しているときに
ヌクレオチド配列をより安定にするDNAまたはRNAの化学修飾を含む、改変型を包含
することを理解するだろう。ヌクレオチドの化学修飾はまた、ヌクレオチド配列が細胞に
よって取り込まれる効率、または細胞内で発現される効率強化するために使用されてもよ
い。任意の及び全てのヌクレオチド配列の改変の組み合わせは、好ましい実施形態におい
て熟慮される。
さらに、例えば、上記のSambrookおよびRussellによるおよび上記のA
usubelらによるもののような当該分野で周知の組換えDNA方法論を用いて、あら
ゆる手順を好ましい実施形態のペプチドの変異体、誘導体もしくは変異型の生成に使用す
ることができる。ポリペプチドをコードするDNA配列を改変することによりペプチドま
たはポリペプチド中のアミノ酸の変化を導入するための手順は、当技術分野で周知であり
、これらの、またはほかの論文にも記載されている。
usubelらによるもののような当該分野で周知の組換えDNA方法論を用いて、あら
ゆる手順を好ましい実施形態のペプチドの変異体、誘導体もしくは変異型の生成に使用す
ることができる。ポリペプチドをコードするDNA配列を改変することによりペプチドま
たはポリペプチド中のアミノ酸の変化を導入するための手順は、当技術分野で周知であり
、これらの、またはほかの論文にも記載されている。
好ましい実施形態の結合ペプチドをコードする核酸は、例えばレトロウイルスベクター
のような適切なベクターに組み込むことができる。これらのベクターは、当該分野で周知
である。核酸またはそれらを含むベクターは、有効に所望の細胞に導入することができ、
細胞は好ましくは患者由来である。
のような適切なベクターに組み込むことができる。これらのベクターは、当該分野で周知
である。核酸またはそれらを含むベクターは、有効に所望の細胞に導入することができ、
細胞は好ましくは患者由来である。
凍結保存
PBMCを被験体から得て、分離した後、本明細書に記載された任意の血液検査/アッ
セイを実行する前に、当業者に周知の方法を使用して凍結保存することができる。
PBMCを被験体から得て、分離した後、本明細書に記載された任意の血液検査/アッ
セイを実行する前に、当業者に周知の方法を使用して凍結保存することができる。
診断/予後/治療モニタリングツールとしての使用 本明細書に記載されるように、循環
HER2−反応性IFN−γposCD4+Th1細胞の減少は、早くもDCIS乳癌で
始まり、実質的に早期侵襲ステージIのHER2pos腫瘍で減少することが見出された
。より具体的には、健康なドナーからHER2pos DCIS(非浸潤性乳管癌)を経
てHER2pos IBC(浸潤性乳癌)への乳房の腫瘍形成における連続体にわたり、
段階的な抗HER2 CD4+Th1応答の減少がある。免疫応答のこの損失は起因する
ものがなく、すなわち、癌関連免疫抑制によるものではなく、おそらく侵襲病変への転位
の増加に関連しておらず、調節性T細胞とは無関係である。
HER2−反応性IFN−γposCD4+Th1細胞の減少は、早くもDCIS乳癌で
始まり、実質的に早期侵襲ステージIのHER2pos腫瘍で減少することが見出された
。より具体的には、健康なドナーからHER2pos DCIS(非浸潤性乳管癌)を経
てHER2pos IBC(浸潤性乳癌)への乳房の腫瘍形成における連続体にわたり、
段階的な抗HER2 CD4+Th1応答の減少がある。免疫応答のこの損失は起因する
ものがなく、すなわち、癌関連免疫抑制によるものではなく、おそらく侵襲病変への転位
の増加に関連しておらず、調節性T細胞とは無関係である。
抗HER2 CD4+のTh1免疫応答の損失のこの知見に基づいた実施形態は、明ら
かに健康な個人のための、マンモグラフィーまたは他のスクリーニング手法を介して検出
されないかもしれない乳癌および他の癌のスクリーニング方法を提供し、好ましい実施形
態の血液検査は抗HER2 CD4+のTh1応答を検出するためのものである、迅速な
免疫試験/アッセイを実行することを含む。健康な個人のものよりも低くなっている個人
試験結果により、より決定的なテストが可能になり、より迅速な治療オプションの実行が
可能になるだろう。例えば、本明細書中の血液検査は、有利には、ワクチン接種がHER
−2発現乳癌のリスクを低減することが考えられる、リスクのある患者を同定するために
使用されることができる。例えば、リスクのある患者は応答を減少させうる授乳、妊娠、
およびその他の生活のストレスイベントの完了後のものであってもよい。
かに健康な個人のための、マンモグラフィーまたは他のスクリーニング手法を介して検出
されないかもしれない乳癌および他の癌のスクリーニング方法を提供し、好ましい実施形
態の血液検査は抗HER2 CD4+のTh1応答を検出するためのものである、迅速な
免疫試験/アッセイを実行することを含む。健康な個人のものよりも低くなっている個人
試験結果により、より決定的なテストが可能になり、より迅速な治療オプションの実行が
可能になるだろう。例えば、本明細書中の血液検査は、有利には、ワクチン接種がHER
−2発現乳癌のリスクを低減することが考えられる、リスクのある患者を同定するために
使用されることができる。例えば、リスクのある患者は応答を減少させうる授乳、妊娠、
およびその他の生活のストレスイベントの完了後のものであってもよい。
このようなスクリーニング方法は、遺伝的素質や生活要因のような要因により乳癌を発
症するリスクが高い患者にとって有益であり得る。診断の観点から、免疫バイオマーカー
は、高リスク患者の抗HER2Th1免疫の変動をスクリーニングするために開発するこ
とができる。IHC染色や乳房生検標本のFISHプロファイリングは、腫瘍の進化の分
離したスナップショットのみを提供しているが、(例えばこの潜在的なバイオマーカーと
同様に)免疫プロファイリングでは、腫瘍の自然史及び免疫影響を垣間見ることができる
。任意の乳癌と診断された患者が、HER2発現する新しい乳房イベントまたは再発のた
めの危険にさらされる可能性があるかどうか予測するために使用することができる。
症するリスクが高い患者にとって有益であり得る。診断の観点から、免疫バイオマーカー
は、高リスク患者の抗HER2Th1免疫の変動をスクリーニングするために開発するこ
とができる。IHC染色や乳房生検標本のFISHプロファイリングは、腫瘍の進化の分
離したスナップショットのみを提供しているが、(例えばこの潜在的なバイオマーカーと
同様に)免疫プロファイリングでは、腫瘍の自然史及び免疫影響を垣間見ることができる
。任意の乳癌と診断された患者が、HER2発現する新しい乳房イベントまたは再発のた
めの危険にさらされる可能性があるかどうか予測するために使用することができる。
別の実施形態では、抗HER2 Th1応答の喪失に基づく診断またはモニタリング試
験は、HER2pos乳癌患者が化学療法+トラスツズマブなどのような標準的な非免疫
療法によく応答するかどうかを予測するために使用することができる。
験は、HER2pos乳癌患者が化学療法+トラスツズマブなどのような標準的な非免疫
療法によく応答するかどうかを予測するために使用することができる。
さらなる実施形態によれば、本明細書に詳細に説明するように、標的(例えば、トラス
ツズマブ)又は従来の(すなわち、化学療法)乳癌の治療と比べて、HER2由来クラス
IIペプチド(DC1免疫)と自家DC1のワクチン接種を経て、CD4+のTh1応答
を優先的に復元することが可能である。このように、HER2pos−IBC患者におい
て、HER2−パルスDCワクチン接種後はCD4+のTh1応答が効果的に回復したが
、トラスツズマブ/細胞毒性化学療法(「T/C」)治療後は回復しなかった。好ましい
実施形態の血液検査は、したがって、Th1免疫応答の回復、または非回復の程度を決定
するために、ワクチン接種前とワクチン接種後に実行される,したがって、患者は乳癌治
療後本明細書における血液検査を介して以前に見つかったCD4+Th1免疫損失がワク
チン接種によって回復したかどうかを測定することで簡単に自分のCD4+Th1応答を
再評価することができる。
ツズマブ)又は従来の(すなわち、化学療法)乳癌の治療と比べて、HER2由来クラス
IIペプチド(DC1免疫)と自家DC1のワクチン接種を経て、CD4+のTh1応答
を優先的に復元することが可能である。このように、HER2pos−IBC患者におい
て、HER2−パルスDCワクチン接種後はCD4+のTh1応答が効果的に回復したが
、トラスツズマブ/細胞毒性化学療法(「T/C」)治療後は回復しなかった。好ましい
実施形態の血液検査は、したがって、Th1免疫応答の回復、または非回復の程度を決定
するために、ワクチン接種前とワクチン接種後に実行される,したがって、患者は乳癌治
療後本明細書における血液検査を介して以前に見つかったCD4+Th1免疫損失がワク
チン接種によって回復したかどうかを測定することで簡単に自分のCD4+Th1応答を
再評価することができる。
別の実施形態では、抗HER2 CD4+Th1応答の減少に依存する血液検査は、D
C1のワクチン接種が抗HER2免疫を癌のさらなる侵入に対する保護を提供することが
できるレベルに十分に回復し増加したかを決定するために使用されてもよい。DC1ワク
チン接種後、患者のCD4+Th1免疫状態を追跡するために、好ましい実施形態の血液
検査を好ましくは患者の医師によって推奨されるスケジュールで、何度も行うことができ
る。これらの追加の試験は、ワクチン接種後、ワクチンが誘導したHER2腫瘍標的に対
する感作の耐久性と長期間にわたる保護の可能性のために、例えば、少なくとも約60ヶ
月以上まで、何ヶ月も行うことができる。
C1のワクチン接種が抗HER2免疫を癌のさらなる侵入に対する保護を提供することが
できるレベルに十分に回復し増加したかを決定するために使用されてもよい。DC1ワク
チン接種後、患者のCD4+Th1免疫状態を追跡するために、好ましい実施形態の血液
検査を好ましくは患者の医師によって推奨されるスケジュールで、何度も行うことができ
る。これらの追加の試験は、ワクチン接種後、ワクチンが誘導したHER2腫瘍標的に対
する感作の耐久性と長期間にわたる保護の可能性のために、例えば、少なくとも約60ヶ
月以上まで、何ヶ月も行うことができる。
本明細書における血液検査を使用することは、HER2発現浸潤性乳癌患者の化学/ト
ラスツズマブ治療後のHER2−反応の程度を示すために使用されてもよい。相関はこの
ような患者が治療にどの程度よく応答するかで本明細書に示されており、それによって、
結果を予測する。例えば、抑制された抗HER2 Th1応答は、免疫補助T/ C治療
を受けた患者におけるその後の再発のリスク増加を予測する。
ラスツズマブ治療後のHER2−反応の程度を示すために使用されてもよい。相関はこの
ような患者が治療にどの程度よく応答するかで本明細書に示されており、それによって、
結果を予測する。例えば、抑制された抗HER2 Th1応答は、免疫補助T/ C治療
を受けた患者におけるその後の再発のリスク増加を予測する。
他の実施形態は、HER2pos浸潤性乳癌の患者に見られる抗HER2 CD4+T
h1損失を増強または復元するための免疫戦略、すなわち、DCワクチン接種のための方
法を提供する。「免疫回復」のためのこの能力は、治療のために現在のトラスツズマブ療
法と組み合わせて利用することができる。また、化学療法+トラスツズマブを含む標準的
な治療法と予防接種を組み合わせるための論理的根拠も提供するであろう。
h1損失を増強または復元するための免疫戦略、すなわち、DCワクチン接種のための方
法を提供する。「免疫回復」のためのこの能力は、治療のために現在のトラスツズマブ療
法と組み合わせて利用することができる。また、化学療法+トラスツズマブを含む標準的
な治療法と予防接種を組み合わせるための論理的根拠も提供するであろう。
別の実施形態は、新しい乳房イベントのリスクを予測するための免疫相関を示唆する。
化学療法/トラスツズマブで処置されたHER2pos−IBC患者において、応答の変
動、より具体的には、抑制された抗HER2 CD4+Th1応答が、新規乳癌イベント
のリスク増加と関連していることが示された。したがって、そのような抑制された応答は
、患者がおそらく新しい乳房イベントに耐えるかどうかのような結果を予測するために使
用することができ、そうであれば、おそらく追加の治療が必要になる。バイオマーカーを
、このようにそれに基づいて開発することができる。
化学療法/トラスツズマブで処置されたHER2pos−IBC患者において、応答の変
動、より具体的には、抑制された抗HER2 CD4+Th1応答が、新規乳癌イベント
のリスク増加と関連していることが示された。したがって、そのような抑制された応答は
、患者がおそらく新しい乳房イベントに耐えるかどうかのような結果を予測するために使
用することができ、そうであれば、おそらく追加の治療が必要になる。バイオマーカーを
、このようにそれに基づいて開発することができる。
さらに、IFN−γおよびTNF受容体を発現している、HER2pos乳癌細胞が、
Th1由来サイトカイン(Th1細胞によって産生される原型サイトカイン、IFN−γ
及びTNF−αを含む)に曝露されるとアポトーシスを起こすという、本明細書に記載の
観測は、乳房退縮などの生理学的プロセス中に抗HER2 Th1細胞がHER2発現細
胞を制御または排除することに有用であることを示唆する。IFN−γおよびTNF−a
受容体の発現は、本明細書に記載のように試験したすべてのHER2pos乳癌細胞株で
見出され、これらの抗HER2 CD4+Th1細胞は、HER2発現乳癌細胞株のアポ
トーシスを引き起こす可溶性因子を産生することがわかった。これは、抗HER2 Th
1は、乳房退縮などの生理学的プロセス中にHER2発現細胞を制御または排除すること
に役立っていることを示唆し、クラスIInegクラスIpos腫瘍細胞を認識すること
はできない、CD4+Th1細胞がそれにもかかわらずどのように腫瘍細胞の破壊を媒介
することができるのか説明することができる。
Th1由来サイトカイン(Th1細胞によって産生される原型サイトカイン、IFN−γ
及びTNF−αを含む)に曝露されるとアポトーシスを起こすという、本明細書に記載の
観測は、乳房退縮などの生理学的プロセス中に抗HER2 Th1細胞がHER2発現細
胞を制御または排除することに有用であることを示唆する。IFN−γおよびTNF−a
受容体の発現は、本明細書に記載のように試験したすべてのHER2pos乳癌細胞株で
見出され、これらの抗HER2 CD4+Th1細胞は、HER2発現乳癌細胞株のアポ
トーシスを引き起こす可溶性因子を産生することがわかった。これは、抗HER2 Th
1は、乳房退縮などの生理学的プロセス中にHER2発現細胞を制御または排除すること
に役立っていることを示唆し、クラスIInegクラスIpos腫瘍細胞を認識すること
はできない、CD4+Th1細胞がそれにもかかわらずどのように腫瘍細胞の破壊を媒介
することができるのか説明することができる。
本明細書に詳細に記載されるように、さらなる実施形態は、HER2pos乳癌におけ
る標準術前補助療法に対する病理学的応答性を予測するための免疫相関を提供する。実験
はHER2発現侵襲乳癌患者のための化学/トラスツズマブ治療後のHER2応答度が、
治療への応答度とどれだけ相関するかを研究するために設計された。このような実験は、
標準術前補助療法に対する病理学的応答性を予測するための免疫相関を明らかにした。関
連性は、病理学的完全寛解を有さなかった患者と比較したときに、術前補助完全反応者と
有意に高い抗HER2 CD4+のTh1応答との間に見出された。
る標準術前補助療法に対する病理学的応答性を予測するための免疫相関を提供する。実験
はHER2発現侵襲乳癌患者のための化学/トラスツズマブ治療後のHER2応答度が、
治療への応答度とどれだけ相関するかを研究するために設計された。このような実験は、
標準術前補助療法に対する病理学的応答性を予測するための免疫相関を明らかにした。関
連性は、病理学的完全寛解を有さなかった患者と比較したときに、術前補助完全反応者と
有意に高い抗HER2 CD4+のTh1応答との間に見出された。
T/C処理HER2pos−IBC患者のHER2特異的なTh1抑制の大きさが、新
しい乳房イベントの続く再発の危険性の増加と相関する一方、対照的に、抗HER2 C
D4+のTh1免疫の上述の保存は術前補助化学療法に対する完全な病理的応答と関連す
る。まとめると、これらのデータは、抗HER2Th1免疫反応性を臨床的または病理学
的障害のリスクがある脆弱な患者のサブグループを同定するためのバイオマーカーとして
使用することができる旨示唆する。
しい乳房イベントの続く再発の危険性の増加と相関する一方、対照的に、抗HER2 C
D4+のTh1免疫の上述の保存は術前補助化学療法に対する完全な病理的応答と関連す
る。まとめると、これらのデータは、抗HER2Th1免疫反応性を臨床的または病理学
的障害のリスクがある脆弱な患者のサブグループを同定するためのバイオマーカーとして
使用することができる旨示唆する。
本明細書に記載された本発明の実施形態は、HER2発現乳腺腫瘍の特定の参照例を含
むことができるけれども、当業者によって理解されるべきであるように、例示するだけだ
が、卵巣、胃、食道、肺、膵臓、肝臓、前立腺および他の固形腫瘍のような他のタイプの
HER2発現腫瘍が、本発明の実施形態の教示から利益を得ることができる。同様に、当
業者は、本明細書の教示をトリプルネガティブ及びER陽性、ならびに他の腫瘍を含む非
HER2発現乳癌に拡張できることを理解できる。
むことができるけれども、当業者によって理解されるべきであるように、例示するだけだ
が、卵巣、胃、食道、肺、膵臓、肝臓、前立腺および他の固形腫瘍のような他のタイプの
HER2発現腫瘍が、本発明の実施形態の教示から利益を得ることができる。同様に、当
業者は、本明細書の教示をトリプルネガティブ及びER陽性、ならびに他の腫瘍を含む非
HER2発現乳癌に拡張できることを理解できる。
さらに、好ましい実施形態に従って使用することができる受容体チロシンキナーゼファ
ミリーの他のHERファミリーのターゲットが存在する。HERファミリーは、4つの関
連するシグナル伝達分子から構成される:種々の癌に関与しているHER1、HER2、
HER3、およびHER4。過剰発現HER−2が乳癌の約20%から25%に見られる
ことが知られているが、他のHERファミリーメンバーが他の癌と同様に、初期および浸
潤性両方の乳癌に関与していることが判明した。例えば、HER1は、少数の乳癌に発現
し、一般的にトリプルネガティブである。C−Metは、HER3を活性化する多くの癌
の再発に関与する成長因子受容体である。HER3は、結腸癌、前立腺癌、乳癌および黒
色腫で過剰発現される。HER3は、DCIS病変および乳癌の大多数において発現され
る。HER3は、DC1 HER2ワクチン接種を受けた一部の患者における手術の時点
で残存DCISにおいて検出されうる。したがって、乳癌および他の固形がんを引き起こ
すような、HER3、HER1およびc−Metのような他のHERファミリーターゲッ
トは、有益に標的とされ、本明細書に記載されたHER2でなされたように、これらの他
のターゲットに対するペプチドワクチンが開発されうる。従って、患者の乳房の腫瘍で発
現している分子の同定のためのHER2、HER3、HER1およびC−Metのような
オンコドライバー/提案されたオンコドライバーを含む乳癌パネルを、治療の補助剤とし
て開発することができ、ワクチン標的分子として使用することができる。従って、HER
2のために本明細書に記載されたDC1ワクチンに加えて、同様のワクチンを、非HER
2発現乳癌タイプのために開発することができることが期待される。
ミリーの他のHERファミリーのターゲットが存在する。HERファミリーは、4つの関
連するシグナル伝達分子から構成される:種々の癌に関与しているHER1、HER2、
HER3、およびHER4。過剰発現HER−2が乳癌の約20%から25%に見られる
ことが知られているが、他のHERファミリーメンバーが他の癌と同様に、初期および浸
潤性両方の乳癌に関与していることが判明した。例えば、HER1は、少数の乳癌に発現
し、一般的にトリプルネガティブである。C−Metは、HER3を活性化する多くの癌
の再発に関与する成長因子受容体である。HER3は、結腸癌、前立腺癌、乳癌および黒
色腫で過剰発現される。HER3は、DCIS病変および乳癌の大多数において発現され
る。HER3は、DC1 HER2ワクチン接種を受けた一部の患者における手術の時点
で残存DCISにおいて検出されうる。したがって、乳癌および他の固形がんを引き起こ
すような、HER3、HER1およびc−Metのような他のHERファミリーターゲッ
トは、有益に標的とされ、本明細書に記載されたHER2でなされたように、これらの他
のターゲットに対するペプチドワクチンが開発されうる。従って、患者の乳房の腫瘍で発
現している分子の同定のためのHER2、HER3、HER1およびC−Metのような
オンコドライバー/提案されたオンコドライバーを含む乳癌パネルを、治療の補助剤とし
て開発することができ、ワクチン標的分子として使用することができる。従って、HER
2のために本明細書に記載されたDC1ワクチンに加えて、同様のワクチンを、非HER
2発現乳癌タイプのために開発することができることが期待される。
実施例
好ましい実施形態は、以下の実験実施例を参照してさらに詳細に記載される。これらの
実施例は、例示のみを目的として提供され、特記しない限り限定することを意図するもの
ではない。したがって、好ましい実施形態は以下の実施例に決して限定されるべきでなく
、むしろ、本明細書で提供される教示の結果として明らかになるありとあらゆる変更を包
含すると解釈されるべきである。
好ましい実施形態は、以下の実験実施例を参照してさらに詳細に記載される。これらの
実施例は、例示のみを目的として提供され、特記しない限り限定することを意図するもの
ではない。したがって、好ましい実施形態は以下の実施例に決して限定されるべきでなく
、むしろ、本明細書で提供される教示の結果として明らかになるありとあらゆる変更を包
含すると解釈されるべきである。
さらに説明することなく、当業者は、前述の説明及び以下の例示的な実施例を使用して
、本発明の実施形態を作成し、利用し、そして請求項に記載された方法を実行することが
できる。以下の実施例は、したがって、特に好ましい実施形態を指摘し、そしていかなる
方法でも開示の残りを限定するものとして解釈されるべきではない。
、本発明の実施形態を作成し、利用し、そして請求項に記載された方法を実行することが
できる。以下の実施例は、したがって、特に好ましい実施形態を指摘し、そしていかなる
方法でも開示の残りを限定するものとして解釈されるべきではない。
以下の参考例は、方法、結果、及び考察のセクションを含む。
参考例
方法
患者の選択と研究計画
方法
患者の選択と研究計画
ペンシルベニア大学の施設内審査委員会による承認の後、現在記載されている研究に参
加するために143人の患者が連続して募集され、インフォームドコンセントが得られた
。健康なドナー(HD)(n=21)、及び良性乳房疾患(BD)(n=10)、HER
2neg−DCIS(n=11)、HER2neg(0/1+)IBC(n=11)、H
ER2pos−DCIS(n=31)を有する患者、及びHER2pos−IBC(n=
22)の患者における抗HER2 CD4+Th1(Th1)の応答を試験した。患者の
Th1応答を、HER2pos−DCISのための術前補助DC1免疫試験に登録し、手
術でステージIのHER2pos−IBCを有することが判明した(n=11)免疫前後
に(すぐに及び6ヶ月以降に)分析した。未処置のHER2pos−IBC患者における
Th1応答をT/C処置されたステージI−III HER2pos−IBC患者(n=
37)における応答と比較した。図1は、研究適格患者とドナーコホートを示す。T/C
治療HER2pos−IBC患者は、任意の局所のまたは遠隔の再発として定義される、
BEの発生のため調査した。以下の表1は、本研究集団の人口統計学的及び腫瘍関連特性
を示す(個々の患者のサブグループにとっての年齢、人種、AJCC病理学的段階、ホル
モン受容体の状態、化学療法のタイミング及びトラスツズマブの完了からの時間(適用で
きる場合))(「IBC」:浸潤性乳癌;「DCIS」:非浸潤性乳管癌;「T/C」:
トラスツズマブ/化学療法)。T/C治療後、HER2pos−IBC患者は、任意の局
所領域または遠隔の再発として定義される、その後の乳房イベント(BE)の発生のため
に観察された。すべての被験者のTh1免疫応答が発生し、将来に向かって分析を行った
。
加するために143人の患者が連続して募集され、インフォームドコンセントが得られた
。健康なドナー(HD)(n=21)、及び良性乳房疾患(BD)(n=10)、HER
2neg−DCIS(n=11)、HER2neg(0/1+)IBC(n=11)、H
ER2pos−DCIS(n=31)を有する患者、及びHER2pos−IBC(n=
22)の患者における抗HER2 CD4+Th1(Th1)の応答を試験した。患者の
Th1応答を、HER2pos−DCISのための術前補助DC1免疫試験に登録し、手
術でステージIのHER2pos−IBCを有することが判明した(n=11)免疫前後
に(すぐに及び6ヶ月以降に)分析した。未処置のHER2pos−IBC患者における
Th1応答をT/C処置されたステージI−III HER2pos−IBC患者(n=
37)における応答と比較した。図1は、研究適格患者とドナーコホートを示す。T/C
治療HER2pos−IBC患者は、任意の局所のまたは遠隔の再発として定義される、
BEの発生のため調査した。以下の表1は、本研究集団の人口統計学的及び腫瘍関連特性
を示す(個々の患者のサブグループにとっての年齢、人種、AJCC病理学的段階、ホル
モン受容体の状態、化学療法のタイミング及びトラスツズマブの完了からの時間(適用で
きる場合))(「IBC」:浸潤性乳癌;「DCIS」:非浸潤性乳管癌;「T/C」:
トラスツズマブ/化学療法)。T/C治療後、HER2pos−IBC患者は、任意の局
所領域または遠隔の再発として定義される、その後の乳房イベント(BE)の発生のため
に観察された。すべての被験者のTh1免疫応答が発生し、将来に向かって分析を行った
。
ワクチン試験計画とワクチン接種手順 HER2pos−DCISを有する患者のため
の、HER2−パルス、1型−極性化DCワクチン接種の二つの術前補助試験が行われた
。DCワクチンは、以前に記載したように調製した。Koski,G.K.,et al
,J.Immonother.35(1):54(2012)(Koski,et al
.);Sharma,A.,et al,Cancer 118(17):4354(2
012)(Sharma,et al.);Fracol,M.,et al.,Ann
.Surg.Oncol.20(10):3233(2013);Lee,M.K.4t
h,et al,Expert Rev8(ll):e74698(2013);Cze
rniecki,B.J.,et al,Cancer Res.67(4):1842
(2007);Czerniecki,B.J.,et al,Cancer Res.
67(14):6531(2007);and U.S.Published Appl
ication US2013/0183343Alを参照する。
の、HER2−パルス、1型−極性化DCワクチン接種の二つの術前補助試験が行われた
。DCワクチンは、以前に記載したように調製した。Koski,G.K.,et al
,J.Immonother.35(1):54(2012)(Koski,et al
.);Sharma,A.,et al,Cancer 118(17):4354(2
012)(Sharma,et al.);Fracol,M.,et al.,Ann
.Surg.Oncol.20(10):3233(2013);Lee,M.K.4t
h,et al,Expert Rev8(ll):e74698(2013);Cze
rniecki,B.J.,et al,Cancer Res.67(4):1842
(2007);Czerniecki,B.J.,et al,Cancer Res.
67(14):6531(2007);and U.S.Published Appl
ication US2013/0183343Alを参照する。
本研究で使用されるDCワクチン接種戦略は図2に示される。そこで示されるように、
タンデム白血球搬出/向流遠心エルトリエーションを経由して被験体から単球DC前駆体
(CD14+末梢血単核細胞)を得た。DCを、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子
(GM−CSF)(250IU/mL;Berlex,Wayne,NJ)及びIL−4
(1000u/mL、R&Dシステムズ、ミネソタ州ミネアポリス)−これらは、未成熟
DC(iDC)と考えられているとともに、マクロファージ無血清培地(SFM)(CE
LLGRO/メディアテック、バージニア州マナッサス)で一晩培養した。次の日iDC
を、6個のHER2 MHCクラスII結合ペプチドでパルスした(42〜56(配列番
号:1)、98〜114(配列番号:2)、及び328〜345(配列番号:3)(HE
R2の細胞外ドメイン)、及び776〜790(配列番号:4)、927〜941(配列
番号:5)、及び1166〜1180(配列番号:6)(HER2の細胞内ドメイン))
(Disis,M.L.,et al.,Clin.Can.Res.5:1289(1
999))(United Biochemical Research,Seattl
e,WA;peptides stored lyophilized and rec
onstituted in sterile PBS for use、を参照する)
。インキュベーションの8〜12時間後に、IFN−γ(1,000U/mL)を添加し
た。次の日、回収の6時間前にNIH標準試料リポ多糖(LPS)を添加し(10ng/
mL)、1型極性化表現型(DC1)への完全なDC活性化を達成した。HLA−A2.
1POS患者に対して、2つの追加のMHCクラスI結合ペプチド(ペプチド369〜3
77(配列番号:7)及びペプチド689〜697(配列番号:8)でDC1をパルスし
た。回収した細胞を洗浄し、70%を超える生存率、グラム染色陰性、及びエンドトキシ
ン5EU/キロ未満のロット放出基準を確認した。
タンデム白血球搬出/向流遠心エルトリエーションを経由して被験体から単球DC前駆体
(CD14+末梢血単核細胞)を得た。DCを、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子
(GM−CSF)(250IU/mL;Berlex,Wayne,NJ)及びIL−4
(1000u/mL、R&Dシステムズ、ミネソタ州ミネアポリス)−これらは、未成熟
DC(iDC)と考えられているとともに、マクロファージ無血清培地(SFM)(CE
LLGRO/メディアテック、バージニア州マナッサス)で一晩培養した。次の日iDC
を、6個のHER2 MHCクラスII結合ペプチドでパルスした(42〜56(配列番
号:1)、98〜114(配列番号:2)、及び328〜345(配列番号:3)(HE
R2の細胞外ドメイン)、及び776〜790(配列番号:4)、927〜941(配列
番号:5)、及び1166〜1180(配列番号:6)(HER2の細胞内ドメイン))
(Disis,M.L.,et al.,Clin.Can.Res.5:1289(1
999))(United Biochemical Research,Seattl
e,WA;peptides stored lyophilized and rec
onstituted in sterile PBS for use、を参照する)
。インキュベーションの8〜12時間後に、IFN−γ(1,000U/mL)を添加し
た。次の日、回収の6時間前にNIH標準試料リポ多糖(LPS)を添加し(10ng/
mL)、1型極性化表現型(DC1)への完全なDC活性化を達成した。HLA−A2.
1POS患者に対して、2つの追加のMHCクラスI結合ペプチド(ペプチド369〜3
77(配列番号:7)及びペプチド689〜697(配列番号:8)でDC1をパルスし
た。回収した細胞を洗浄し、70%を超える生存率、グラム染色陰性、及びエンドトキシ
ン5EU/キロ未満のロット放出基準を確認した。
Koskiらにより記載されたように、節内及び/または病巣内のワクチン注射を行っ
た。簡潔にいうと、ワクチン接種は、ペンシルバニア大学病院の国立衛生研究所が指定し
た総合臨床研究センターで投与した。注射薬は、1mlの滅菌生理食塩水に懸濁された1
0〜20百万個のHER2パルスDCを含み、鼠径部リンパ節、乳房、または両方に超音
波誘導によって投与された。ワクチン接種は、6週間にわたって週1回投与され、そして
全ての患者は、6回のワクチン接種を完了した。ワクチン接種関連の安全性及び毒性デー
タは、シャルマらによって以前に報告されている。
た。簡潔にいうと、ワクチン接種は、ペンシルバニア大学病院の国立衛生研究所が指定し
た総合臨床研究センターで投与した。注射薬は、1mlの滅菌生理食塩水に懸濁された1
0〜20百万個のHER2パルスDCを含み、鼠径部リンパ節、乳房、または両方に超音
波誘導によって投与された。ワクチン接種は、6週間にわたって週1回投与され、そして
全ての患者は、6回のワクチン接種を完了した。ワクチン接種関連の安全性及び毒性デー
タは、シャルマらによって以前に報告されている。
免疫応答の検出
上記で参照した6個のHER2クラスII結合ペプチドでパルスした患者の非培養の末
梢血単核細胞(PBMC)から、酵素結合免疫吸着スポット(ELISPOT)アッセイ
を用いてIFN−γ産生を測定することによって循環抗HER2 CD4+Th1応答を
生成した。ELISPOTはKoskiらにより記載された方法に従って行った。簡潔に
いうと、PVDFメンブレンプレート(マブテック社、シンシナティ、OH)を、抗IF
N−γ捕捉抗体(1−D1K(Mabtech社))により一晩コーティングした。密度
勾配遠心分離を用いて単離した凍結保存PBMCを、5%ヒト血清を補充した予熱DME
M中で解凍した。プレートを洗浄し、ブロッキングした後、PBMCをトリプリケートで
播種し(2×105細胞/ウェル)、プレートを24〜36時間37℃でHER2由来ク
ラスII結合ペプチド(4μg)(ペプチド 42〜56(配列番号:l)、ペプチド
98〜114(配列番号:2)、ペプチド 328〜345(配列番号:3)、ペプチド
776〜790(配列番号:4)、ペプチド 927〜941(配列番号:5)、及び
ペプチド 1166〜1180(配列番号: 6)、培地単独(無刺激対照)で、又は陽
性対照(抗ヒトCD3及び抗CD28抗体、(各0.5μg/mL)、共にBD Pha
rmingen社、San Diego,CA)と共にインキュベートした。洗浄後、検
出抗体(7 B6−l−ビオチン(マブテック社);100μg/mL)を各ウェルに添
加し、プレートを37℃で2時間インキュベートした。次に、PBS+0.5%FCS中
で1:1000に希釈したストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼをインキュ
ベーション前に37℃で追加の1時間添加した。その後、TMB基質溶液(Kirkeg
aard&Perry Laboratories、Gaithersburg、MD)
を添加しスポット形成を明らかにした。発色後、ウェルを水道水で洗浄した。スポット形
成細胞(SFC)は、自動ELISPOT リーダー(ImmunoSpot CTL,
Cleveland,OH)を用いて計数した。
上記で参照した6個のHER2クラスII結合ペプチドでパルスした患者の非培養の末
梢血単核細胞(PBMC)から、酵素結合免疫吸着スポット(ELISPOT)アッセイ
を用いてIFN−γ産生を測定することによって循環抗HER2 CD4+Th1応答を
生成した。ELISPOTはKoskiらにより記載された方法に従って行った。簡潔に
いうと、PVDFメンブレンプレート(マブテック社、シンシナティ、OH)を、抗IF
N−γ捕捉抗体(1−D1K(Mabtech社))により一晩コーティングした。密度
勾配遠心分離を用いて単離した凍結保存PBMCを、5%ヒト血清を補充した予熱DME
M中で解凍した。プレートを洗浄し、ブロッキングした後、PBMCをトリプリケートで
播種し(2×105細胞/ウェル)、プレートを24〜36時間37℃でHER2由来ク
ラスII結合ペプチド(4μg)(ペプチド 42〜56(配列番号:l)、ペプチド
98〜114(配列番号:2)、ペプチド 328〜345(配列番号:3)、ペプチド
776〜790(配列番号:4)、ペプチド 927〜941(配列番号:5)、及び
ペプチド 1166〜1180(配列番号: 6)、培地単独(無刺激対照)で、又は陽
性対照(抗ヒトCD3及び抗CD28抗体、(各0.5μg/mL)、共にBD Pha
rmingen社、San Diego,CA)と共にインキュベートした。洗浄後、検
出抗体(7 B6−l−ビオチン(マブテック社);100μg/mL)を各ウェルに添
加し、プレートを37℃で2時間インキュベートした。次に、PBS+0.5%FCS中
で1:1000に希釈したストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼをインキュ
ベーション前に37℃で追加の1時間添加した。その後、TMB基質溶液(Kirkeg
aard&Perry Laboratories、Gaithersburg、MD)
を添加しスポット形成を明らかにした。発色後、ウェルを水道水で洗浄した。スポット形
成細胞(SFC)は、自動ELISPOT リーダー(ImmunoSpot CTL,
Cleveland,OH)を用いて計数した。
さらに、リコール(recall)Thl応答を、特定の患者のサブセット由来の評価
可能なPBMCを1:100に希釈した呼び戻し刺激カンジダ・アルビカンス(Alle
rmed Laboratories,San Diego,CA)及び破傷風トキソイ
ド(Santa Cruz Biotechnology,Dallas,TX)で刺激
することで、試験した。Treg及び/又はTh2表現型の相対的機能活性を決定するた
めに、IL−10産生をGuerkov,R.E.,et al,J.Immunol.
Meth.279:111(2003)に記載されたように、2.5μg/mLの抗CD
3抗体を陽性対照として使用して、ELISPOTで測定した。
可能なPBMCを1:100に希釈した呼び戻し刺激カンジダ・アルビカンス(Alle
rmed Laboratories,San Diego,CA)及び破傷風トキソイ
ド(Santa Cruz Biotechnology,Dallas,TX)で刺激
することで、試験した。Treg及び/又はTh2表現型の相対的機能活性を決定するた
めに、IL−10産生をGuerkov,R.E.,et al,J.Immunol.
Meth.279:111(2003)に記載されたように、2.5μg/mLの抗CD
3抗体を陽性対照として使用して、ELISPOTで測定した。
ELISPOTアッセイにおける複製間の可変性は小さいので(データは示さず)、抗
原特異的応答を決定する経験的方法を行った。個々のHER2クラスIIペプチドに対す
る正の応答を(1)刺激されていないバックグラウンドを差し引いた後の実験ウェルにお
ける、20 SFC/2XL05細胞の最小閾値;及び(2)バックグラウンドを超える
抗原特異的なSFCの少なくとも2倍の増加、と定義した。各患者群に対するCD4+T
h1応答の3つの別々の測定基準は:(A)全体の抗HER2応答性(1つより多いペプ
チドに応答する患者の割合)(応答性)、(B)反応性ペプチドの平均数(応答レパート
リー)、及び(C)6個のペプチド全体の累積応答(SFC/106細胞として報告)(
累積応答)、と定義した。
原特異的応答を決定する経験的方法を行った。個々のHER2クラスIIペプチドに対す
る正の応答を(1)刺激されていないバックグラウンドを差し引いた後の実験ウェルにお
ける、20 SFC/2XL05細胞の最小閾値;及び(2)バックグラウンドを超える
抗原特異的なSFCの少なくとも2倍の増加、と定義した。各患者群に対するCD4+T
h1応答の3つの別々の測定基準は:(A)全体の抗HER2応答性(1つより多いペプ
チドに応答する患者の割合)(応答性)、(B)反応性ペプチドの平均数(応答レパート
リー)、及び(C)6個のペプチド全体の累積応答(SFC/106細胞として報告)(
累積応答)、と定義した。
ELISPOTのアッセイ間の精度
ELISPOTのアッセイ間の精度は前述のように、Maecker,H.T.,et
al.BMC Immunology 9:9(2008)(Maecker,et
al.)によって実行した。平均分散(CV)(3日間で3つの並列複製)を、HER2
細胞外ドメイン(ECD)ペプチドミックス(ペプチド42〜56(配列番号:1);ペ
プチド98〜114(配列番号:2);及びペプチド328〜345(配列番号:3))
で生体外で刺激した5人のドナーの累積Thl応答に対してプロットしたとき、特徴的な
非直線関係が観測された。図3Aに示すように、累積応答がゼロに近づくと平均CVは劇
的に増加した。CVと累積応答レベルとの間の非直線関係のため、別の3日間の3回のア
ッセイの標準偏差(SD)をアッセイ間の可変性の尺度として累積Th1応答に対してプ
ロットした。同上。図3Bに示すように、SDは累積応答と直線関係であることが見出さ
れた(実線は、平行点線で示される回帰の95%信頼区間を伴う、生成されたSDの線形
回帰を表す)。(R2=0.96.p<0.0001)
ELISPOTのアッセイ間の精度は前述のように、Maecker,H.T.,et
al.BMC Immunology 9:9(2008)(Maecker,et
al.)によって実行した。平均分散(CV)(3日間で3つの並列複製)を、HER2
細胞外ドメイン(ECD)ペプチドミックス(ペプチド42〜56(配列番号:1);ペ
プチド98〜114(配列番号:2);及びペプチド328〜345(配列番号:3))
で生体外で刺激した5人のドナーの累積Thl応答に対してプロットしたとき、特徴的な
非直線関係が観測された。図3Aに示すように、累積応答がゼロに近づくと平均CVは劇
的に増加した。CVと累積応答レベルとの間の非直線関係のため、別の3日間の3回のア
ッセイの標準偏差(SD)をアッセイ間の可変性の尺度として累積Th1応答に対してプ
ロットした。同上。図3Bに示すように、SDは累積応答と直線関係であることが見出さ
れた(実線は、平行点線で示される回帰の95%信頼区間を伴う、生成されたSDの線形
回帰を表す)。(R2=0.96.p<0.0001)
直線性の研究は、その研究において2人の高応答HER2−反応性の応答者から提供さ
れたPBMCのトリプリケートサンプルを既知で同種の非HER2応答者からのPBMC
に連続的に希釈し、そしてex vivoでHER2 ECDペプチドミックス(ペプチ
ド42〜56(配列番号:1)、ペプチド98〜114(配列番号:2)及びペプチド3
28〜345(配列番号:3))で刺激して、行われた。同じ非応答ドナーをすべてのア
ッセイに使用した。刺激されていないバックグラウンドを各希釈ポイントについて差し引
いた。両方のドナー(#1:三角;#2:丸)において、Th1応答と希釈濃度の間には
有意な線形関係が観察された。まとめると、これらのデータは、EISPOTアッセイは
、正確で信頼性が高く、再現性があることを示唆している。
れたPBMCのトリプリケートサンプルを既知で同種の非HER2応答者からのPBMC
に連続的に希釈し、そしてex vivoでHER2 ECDペプチドミックス(ペプチ
ド42〜56(配列番号:1)、ペプチド98〜114(配列番号:2)及びペプチド3
28〜345(配列番号:3))で刺激して、行われた。同じ非応答ドナーをすべてのア
ッセイに使用した。刺激されていないバックグラウンドを各希釈ポイントについて差し引
いた。両方のドナー(#1:三角;#2:丸)において、Th1応答と希釈濃度の間には
有意な線形関係が観察された。まとめると、これらのデータは、EISPOTアッセイは
、正確で信頼性が高く、再現性があることを示唆している。
HER2抗体検出
ELISAを、内因性のIgG1及びIgG4抗HER2抗体について患者の血清を試
験するために実施した。EIA/RIAプレートを、重炭酸塩緩衝液中のHER2 EC
Dペプチド(5μg/ml、Speed Biosystems社、Rockville
、MD)でコーティングし、室温(RT)で一晩インキュベートした。翌日、プレートを
PBS中の1%カゼインでブロックし、血清(1:100希釈)をブロッキング緩衝液に
四重(quadruplicate)に添加し、2時間インキュベートし、1:500希
釈のIgG1またはIgG4(ライフテクノロジーズ、グランドアイランド、NY)のい
ずれかに特異的なHRP結合抗ヒト二次抗体を添加する前に、3回洗浄した。1時間のイ
ンキュベーション後、プレートを洗浄し、TMB基質溶液(カークガード&ペリー・ラボ
ラトリーズ)を用いて現像した。
ELISAを、内因性のIgG1及びIgG4抗HER2抗体について患者の血清を試
験するために実施した。EIA/RIAプレートを、重炭酸塩緩衝液中のHER2 EC
Dペプチド(5μg/ml、Speed Biosystems社、Rockville
、MD)でコーティングし、室温(RT)で一晩インキュベートした。翌日、プレートを
PBS中の1%カゼインでブロックし、血清(1:100希釈)をブロッキング緩衝液に
四重(quadruplicate)に添加し、2時間インキュベートし、1:500希
釈のIgG1またはIgG4(ライフテクノロジーズ、グランドアイランド、NY)のい
ずれかに特異的なHRP結合抗ヒト二次抗体を添加する前に、3回洗浄した。1時間のイ
ンキュベーション後、プレートを洗浄し、TMB基質溶液(カークガード&ペリー・ラボ
ラトリーズ)を用いて現像した。
フローサイトメトリー
PBMC懸濁液を、FACS緩衝液(PBS+1%FCS+0.01%アジド)中で調
製し、抗ヒト−CD3、−CD4、−CD8、−CD83、−HLA−DR、−CDlポ
ンド、−CD33、−CD19、−CD56、−CD16(全てBD Bioscien
ces社、San Jose, CA)、−CD4、及びCD25(ともにBioleg
end、サンディエゴ、CA)を使用し、相対的なPBMCの免疫表現型を決定した。洗
浄後、細胞を、抗体の混合物と室温で30分間インキュベートした。インキュベーション
後、細胞をFACS緩衝液で3回洗浄し、2%パラホルムアルデヒドで固定した。染色し
た試料を、24時間以内に分析した。FoxP3固定/透過処理キット(Biolege
nd)を使用して抗FoxP3(eBioscience社、San Diego, C
A)を有するPBMCの細胞内染色を、製造業者の指示に従って行った。フローサイトメ
トリー分析は、BD LSR−IIサイトメーターを用いて行い、データセットは、セル
クエストプロTMソフトウェア(BD Biosciences)を用いて分析した。
PBMC懸濁液を、FACS緩衝液(PBS+1%FCS+0.01%アジド)中で調
製し、抗ヒト−CD3、−CD4、−CD8、−CD83、−HLA−DR、−CDlポ
ンド、−CD33、−CD19、−CD56、−CD16(全てBD Bioscien
ces社、San Jose, CA)、−CD4、及びCD25(ともにBioleg
end、サンディエゴ、CA)を使用し、相対的なPBMCの免疫表現型を決定した。洗
浄後、細胞を、抗体の混合物と室温で30分間インキュベートした。インキュベーション
後、細胞をFACS緩衝液で3回洗浄し、2%パラホルムアルデヒドで固定した。染色し
た試料を、24時間以内に分析した。FoxP3固定/透過処理キット(Biolege
nd)を使用して抗FoxP3(eBioscience社、San Diego, C
A)を有するPBMCの細胞内染色を、製造業者の指示に従って行った。フローサイトメ
トリー分析は、BD LSR−IIサイトメーターを用いて行い、データセットは、セル
クエストプロTMソフトウェア(BD Biosciences)を用いて分析した。
病理学的染色
HER2pos−DCISと−IBC腫瘍由来のホルマリン固定、パラフィン包埋組織
ブロックの薄片を作り、ヘマトキシリン及びエオシン(H&E)で染色し、腫瘍周囲のリ
ンパ球浸潤を評価した。HER2pos−DCISと−IBC腫瘍由来のサンプルケース
において、多重標識IF(パーキンエルマー、マサチューセッツ州ウォルサム)を使用し
てリンパ球亜集団を調べた(以下を参照,Wang,C,et al.,Journal
for Immunotherapy of Cancer 118:1(Suppl
.1)54(2013)(Wang,C,et al)。腫瘍は、チラミドシグナル増幅
を用いる同種の蛍光標識で、CD4、CD8、CD20及び4’6’−ジアミノ−2−フ
ェニルインドール(DAPI)について染色した。画像は、ベクトラマルチスペクトル顕
微鏡を用いて、腫瘍、間質、及びT−/B−リンパ球を識別するパターン認識ソフトウェ
アで分析した。
HER2pos−DCISと−IBC腫瘍由来のホルマリン固定、パラフィン包埋組織
ブロックの薄片を作り、ヘマトキシリン及びエオシン(H&E)で染色し、腫瘍周囲のリ
ンパ球浸潤を評価した。HER2pos−DCISと−IBC腫瘍由来のサンプルケース
において、多重標識IF(パーキンエルマー、マサチューセッツ州ウォルサム)を使用し
てリンパ球亜集団を調べた(以下を参照,Wang,C,et al.,Journal
for Immunotherapy of Cancer 118:1(Suppl
.1)54(2013)(Wang,C,et al)。腫瘍は、チラミドシグナル増幅
を用いる同種の蛍光標識で、CD4、CD8、CD20及び4’6’−ジアミノ−2−フ
ェニルインドール(DAPI)について染色した。画像は、ベクトラマルチスペクトル顕
微鏡を用いて、腫瘍、間質、及びT−/B−リンパ球を識別するパターン認識ソフトウェ
アで分析した。
アポトーシスアッセイ
HER2発現のスペクトラムを有するBC細胞株((Ithimakin,S.,et
al,Can.Res.73:1635−46(2013)))−HER2highS
K−BR−3、HER2intermediateMCF−7、HER2lowMDA−
MB−231(American Type Culture Collection)
−をRPMI−1640+10%FBS(CELLGRO/メディアテック、バージニア
州マナッサス)で培養した。50x103BC細胞をトランスウェルシステム(BD B
iosciences社)に播種し、そして、106CD4+T細胞及び105DC1(
成熟DC)またはiDC(未成熟DC)と共培養した。DC1、iDC及びCD4+T細
胞を、シャルマらにより記載されるように、ワクチン接種後の選択した患者から得た。D
Cl/iDCを、クラスIIHER2または無関係の対照BRAFペプチド(20μg/
ml)で37℃24時間パルスした。具体的には、Figure10Aに示すように、5
0xl03SK−BR−3細胞を、培地のみ(完全培地)、106ヒトCD4+T細胞の
み(CD4+のみ)、106CD4+T細胞+105の各HER2クラスIIペプチド(
iDCH)−または無関係なクラスII BRAFペプチド(iDCB)−パルスiDC
、及び106CD4+T細胞+105の各HER2(DCl H)−またはBRAF(D
Cl B)−パルスDCIと共培養した。DC1/iDCを、クラスII HER2また
は無関係な対照BRAFペプチド(20μg/ml)で37℃24時間パルスした。対照
ウェルは、培地またはCD4+T細胞のみを含有した。
HER2発現のスペクトラムを有するBC細胞株((Ithimakin,S.,et
al,Can.Res.73:1635−46(2013)))−HER2highS
K−BR−3、HER2intermediateMCF−7、HER2lowMDA−
MB−231(American Type Culture Collection)
−をRPMI−1640+10%FBS(CELLGRO/メディアテック、バージニア
州マナッサス)で培養した。50x103BC細胞をトランスウェルシステム(BD B
iosciences社)に播種し、そして、106CD4+T細胞及び105DC1(
成熟DC)またはiDC(未成熟DC)と共培養した。DC1、iDC及びCD4+T細
胞を、シャルマらにより記載されるように、ワクチン接種後の選択した患者から得た。D
Cl/iDCを、クラスIIHER2または無関係の対照BRAFペプチド(20μg/
ml)で37℃24時間パルスした。具体的には、Figure10Aに示すように、5
0xl03SK−BR−3細胞を、培地のみ(完全培地)、106ヒトCD4+T細胞の
み(CD4+のみ)、106CD4+T細胞+105の各HER2クラスIIペプチド(
iDCH)−または無関係なクラスII BRAFペプチド(iDCB)−パルスiDC
、及び106CD4+T細胞+105の各HER2(DCl H)−またはBRAF(D
Cl B)−パルスDCIと共培養した。DC1/iDCを、クラスII HER2また
は無関係な対照BRAFペプチド(20μg/ml)で37℃24時間パルスした。対照
ウェルは、培地またはCD4+T細胞のみを含有した。
ポリクローナルヤギIgG抗ヒトTNF−α(0.75ng/mL TNF−αあたり
0.06μg/mL)及びIFN−γ(5ng/mL IFNーγあたり0.3μg/m
L)抗体(R&Dシステムズ、ミネソタ州ミネアポリス)を使用してヤギIgGアイソタ
イプを対照としてTh1サイトカインを中和した。処置後、BC細胞を溶解し、切断され
たカスパーゼ3を検出するためのウエスタンブロット分析に供した。核の断片化の程度は
、DAPI染色により評価した。さらに、(i)iDC:CD4+又はDC1:CD4+
T細胞共培養由来の上清、又は(ii)TNF−α(示されるように10−200ng/
mL)+IFN−γ(示されるように100−2000U/mL)(R&D Syste
ms)とインキュベートした50x103BC細胞のアポトーシスを、切断されたカスパ
ーゼ3の検出によって試験した。
0.06μg/mL)及びIFN−γ(5ng/mL IFNーγあたり0.3μg/m
L)抗体(R&Dシステムズ、ミネソタ州ミネアポリス)を使用してヤギIgGアイソタ
イプを対照としてTh1サイトカインを中和した。処置後、BC細胞を溶解し、切断され
たカスパーゼ3を検出するためのウエスタンブロット分析に供した。核の断片化の程度は
、DAPI染色により評価した。さらに、(i)iDC:CD4+又はDC1:CD4+
T細胞共培養由来の上清、又は(ii)TNF−α(示されるように10−200ng/
mL)+IFN−γ(示されるように100−2000U/mL)(R&D Syste
ms)とインキュベートした50x103BC細胞のアポトーシスを、切断されたカスパ
ーゼ3の検出によって試験した。
高レベルのげっ歯類HER2/ErbB2(HER2highTUBO及びMMC15
[後者はLi−Xin Wang,Cleveland Clinicの寛大な支援])
及びHER2low/neg(4T1)を発現したトランスジェニックマウス乳癌細胞株
を、培地単独(RPMI−1640+10%FCS)、組換えマウスrmTNF−α(1
ng/mL;Peprotech社製)単独、rmIFN−γ(12.5ng/ml;P
eprotech社製)単独、またはrmTNF−α+rmIFN−γの組み合わせとと
もに37℃で72時間インキュベートした。トリプシン処理後、回収した細胞を洗浄し、
FACS緩衝液に再懸濁し、FITCアネキシンV(4μ1)及びPI(2μ1)を添加
した。細胞を、20分間、4℃でインキュベートし、2回洗浄し、フローサイトメトリー
に供した。アポトーシス細胞は、両方のマーカーについて陽性染色されたものと定義した
。ビンキュリンは、ローディングコントロールとして使用した。アポトーシスの誘導倍率
を示す、対応する平均カスパーゼ3/ビンキュリン比±SEMを、イメージJソフトウェ
アを用いて定量した。
[後者はLi−Xin Wang,Cleveland Clinicの寛大な支援])
及びHER2low/neg(4T1)を発現したトランスジェニックマウス乳癌細胞株
を、培地単独(RPMI−1640+10%FCS)、組換えマウスrmTNF−α(1
ng/mL;Peprotech社製)単独、rmIFN−γ(12.5ng/ml;P
eprotech社製)単独、またはrmTNF−α+rmIFN−γの組み合わせとと
もに37℃で72時間インキュベートした。トリプシン処理後、回収した細胞を洗浄し、
FACS緩衝液に再懸濁し、FITCアネキシンV(4μ1)及びPI(2μ1)を添加
した。細胞を、20分間、4℃でインキュベートし、2回洗浄し、フローサイトメトリー
に供した。アポトーシス細胞は、両方のマーカーについて陽性染色されたものと定義した
。ビンキュリンは、ローディングコントロールとして使用した。アポトーシスの誘導倍率
を示す、対応する平均カスパーゼ3/ビンキュリン比±SEMを、イメージJソフトウェ
アを用いて定量した。
ELISA
IFN−γ及びTNF−α(BD Pharmingen社製)用の捕捉及びビオチン
化検出抗体及び標準物質を製造業者のプロトコルに従って使用した。
IFN−γ及びTNF−α(BD Pharmingen社製)用の捕捉及びビオチン
化検出抗体及び標準物質を製造業者のプロトコルに従って使用した。
統計解析
記述統計を、患者の特性、免疫応答変数の分布を要約するために使用した。連続変数は
平均、SEM、及び頻度と割合による範囲及びカテゴリの変数によって要約した。データ
変換(自然対数または平方根)は、パラメトリック試験の仮定を満たすために必要なとき
に、適用した。事後Scheffeペアテスト(パラメトリック)又はKruskal−
Wallisテスト(ノンパラメトリック)を有する分散分析は、3より大きい群の連続
変数を比較するために使用した。スチューデントのt検定は、2群の比較のために使用し
た。フィッシャーの正確確率検定は、マルチレベルのテーブルにおけるカテゴリ変数を比
較するために使用した。スチューデントのペアt検定とマクネマーの正確確率検定はTh
1応答変数における患者内ペアの変化を評価するために使用された(例えば、ワクチン接
種前対ワクチン接種後)。p値p<00.05は、統計的に有意とみなした。すべての試
験を両側で行った。統計分析は、SPSS(IBM社製)またはStatXact(Cy
tel社カリフォルニア州サンディエゴ)のいずれかで行った。
記述統計を、患者の特性、免疫応答変数の分布を要約するために使用した。連続変数は
平均、SEM、及び頻度と割合による範囲及びカテゴリの変数によって要約した。データ
変換(自然対数または平方根)は、パラメトリック試験の仮定を満たすために必要なとき
に、適用した。事後Scheffeペアテスト(パラメトリック)又はKruskal−
Wallisテスト(ノンパラメトリック)を有する分散分析は、3より大きい群の連続
変数を比較するために使用した。スチューデントのt検定は、2群の比較のために使用し
た。フィッシャーの正確確率検定は、マルチレベルのテーブルにおけるカテゴリ変数を比
較するために使用した。スチューデントのペアt検定とマクネマーの正確確率検定はTh
1応答変数における患者内ペアの変化を評価するために使用された(例えば、ワクチン接
種前対ワクチン接種後)。p値p<00.05は、統計的に有意とみなした。すべての試
験を両側で行った。統計分析は、SPSS(IBM社製)またはStatXact(Cy
tel社カリフォルニア州サンディエゴ)のいずれかで行った。
結果
患者の特性
ランダムで継続的な登録後、143人の被験者が試験の包含基準を満たした。参加者の
平均年齢は53.1±1.4(範囲、21〜88)歳で大部分(79.0%)は白人種だ
った。採血された時点での患者/ドナーコホートは、図1及び上記の方法の節のセクショ
ンに示される。研究参加者のドナーの人口統計学及び腫瘍関連特性は、上記表1に詳述さ
れる。HER2pos−DCIS及び−IBCコホートの、それぞれの26人(83.9
%)及び11人(50.0%)の患者は、それぞれ以前に、HER2pos−DCISの
ための術前補助1型極性化(DC1)ワクチン接種試験に登録していて、彼らの患者/腫
瘍特性はSharmaらによって報告されている。
患者の特性
ランダムで継続的な登録後、143人の被験者が試験の包含基準を満たした。参加者の
平均年齢は53.1±1.4(範囲、21〜88)歳で大部分(79.0%)は白人種だ
った。採血された時点での患者/ドナーコホートは、図1及び上記の方法の節のセクショ
ンに示される。研究参加者のドナーの人口統計学及び腫瘍関連特性は、上記表1に詳述さ
れる。HER2pos−DCIS及び−IBCコホートの、それぞれの26人(83.9
%)及び11人(50.0%)の患者は、それぞれ以前に、HER2pos−DCISの
ための術前補助1型極性化(DC1)ワクチン接種試験に登録していて、彼らの患者/腫
瘍特性はSharmaらによって報告されている。
全身性の抗HER2のTh1免疫の損失は、乳房腫瘍形成の進行と相関する
末梢血単核細胞(PBMC)を使用して、腫瘍形成の連続体に亘って全身抗HER2
CD4+Th1応答の変化を生体外でのHER2ペプチド刺激IFN−γELISPOT
アッセイ法により、予め調べた。3個のTh1応答の測定基準をグループ間で比較した:
(a)全体の抗HER2応答(1より多いペプチドに応答する患者の割合)、(b)反応
性ペプチドの平均数(レパートリー)、及び(c)上述した6個のクラスIIペプチドに
亘る累積応答。健康なドナー(HD)、または良性乳房疾患(BD)患者と比較したとき
(図1、コホートA)、Th1応答における有意な段階的な減少がHER2pos乳癌患
者において観察された。未治療HER2pos−DCIS(図1、コホートC)で開始し
、治療ナイーブステージI/IIHER2pos−IBC(図1、コホートF)における
低点に達し、Th1免疫のこの進行性の損失は、すべてのTh1応答の測定基準全体に均
一に観察された。例えば、全体的な抗HER2応答は、HD/BDにおける100%から
HER2pos−DCISにおける84%に、HER2pos−IBC患者における32
%に減少した(p<0.0001)。同様の有意な段階的な減衰応答レパートリー(5.
2±0.2対4.5±0.4対2.0±0.3対0.4±0.2、p<0.0001)及
び累積応答(259.9±23.5対225.1±25.5対126.1±24.4対3
2.3±5.4、スポット形成細胞(SFC)/106細胞、p<0.0001)が、H
D、BD、HER2pos−DCIS、及びステージI/IIHER2pos−IBC患
者に亘る、それぞれに、図5Aに示すように全体で観察された。事後の比較では、応答レ
パートリー(p<0.001)及び累積応答(P=0.001)によって評価して全体的
な応答性(P=0.07)で評価しないとき、HER2pos−DCIS患者におけるT
h1応答は、HDにおける応答よりも有意に低かった。HER2pos−IBC患者での
Th1応答は、これらの患者が、HER2pos−DCIS患者と比較して有意に低い全
体的な応答性(P=0.0003)、レパートリー(p=0.001)、及び累積応答(
p<0.001)を示したことでさらに抑制された。106のPBMCあたりの反応性細
胞の割合は、HDにおける0.03%からHER2pos−IBC患者における0.00
3%に及んだ。
末梢血単核細胞(PBMC)を使用して、腫瘍形成の連続体に亘って全身抗HER2
CD4+Th1応答の変化を生体外でのHER2ペプチド刺激IFN−γELISPOT
アッセイ法により、予め調べた。3個のTh1応答の測定基準をグループ間で比較した:
(a)全体の抗HER2応答(1より多いペプチドに応答する患者の割合)、(b)反応
性ペプチドの平均数(レパートリー)、及び(c)上述した6個のクラスIIペプチドに
亘る累積応答。健康なドナー(HD)、または良性乳房疾患(BD)患者と比較したとき
(図1、コホートA)、Th1応答における有意な段階的な減少がHER2pos乳癌患
者において観察された。未治療HER2pos−DCIS(図1、コホートC)で開始し
、治療ナイーブステージI/IIHER2pos−IBC(図1、コホートF)における
低点に達し、Th1免疫のこの進行性の損失は、すべてのTh1応答の測定基準全体に均
一に観察された。例えば、全体的な抗HER2応答は、HD/BDにおける100%から
HER2pos−DCISにおける84%に、HER2pos−IBC患者における32
%に減少した(p<0.0001)。同様の有意な段階的な減衰応答レパートリー(5.
2±0.2対4.5±0.4対2.0±0.3対0.4±0.2、p<0.0001)及
び累積応答(259.9±23.5対225.1±25.5対126.1±24.4対3
2.3±5.4、スポット形成細胞(SFC)/106細胞、p<0.0001)が、H
D、BD、HER2pos−DCIS、及びステージI/IIHER2pos−IBC患
者に亘る、それぞれに、図5Aに示すように全体で観察された。事後の比較では、応答レ
パートリー(p<0.001)及び累積応答(P=0.001)によって評価して全体的
な応答性(P=0.07)で評価しないとき、HER2pos−DCIS患者におけるT
h1応答は、HDにおける応答よりも有意に低かった。HER2pos−IBC患者での
Th1応答は、これらの患者が、HER2pos−DCIS患者と比較して有意に低い全
体的な応答性(P=0.0003)、レパートリー(p=0.001)、及び累積応答(
p<0.001)を示したことでさらに抑制された。106のPBMCあたりの反応性細
胞の割合は、HDにおける0.03%からHER2pos−IBC患者における0.00
3%に及んだ。
未治療HER2neg−DCIS(図1コホートB)またはHER2neg−IBC(
図1コホートD)の患者及びHD/BD患者におけるTh1応答は感知できるほどに変化
しなかったことに留意すべきである。HER2neg−DCIS患者と比較して、しかし
ながら、HER2pos−DCIS患者は有意に低い抗HER2のTh1レパートリー(
p<0.001)及び累積応答(p=0.02)を実証した。同様に、HER2neg−
IBC患者と比較して、HER2pos−IBC患者は、図5Aに示されるように低い応
答性(P=0.0003)、レパートリー(P<0.001)、及び累積応答(p<0.
001)を有した。
図1コホートD)の患者及びHD/BD患者におけるTh1応答は感知できるほどに変化
しなかったことに留意すべきである。HER2neg−DCIS患者と比較して、しかし
ながら、HER2pos−DCIS患者は有意に低い抗HER2のTh1レパートリー(
p<0.001)及び累積応答(p=0.02)を実証した。同様に、HER2neg−
IBC患者と比較して、HER2pos−IBC患者は、図5Aに示されるように低い応
答性(P=0.0003)、レパートリー(P<0.001)、及び累積応答(p<0.
001)を有した。
患者グループ全体で累積Th1応答への個々のHER2ペプチド特異的な貢献は、図6
に示すように、すべてのHER2細胞外ドメイン(ECD)と細胞内ドメイン(ICD)
ペプチド応答プロファイル(P<0.0050)に亘って、HD/BDからHER2po
s−IBC患者と類似の段階的なTh1減衰を明らかにした。不均衡なDCIS/IBC
患者における選択HER2エピトープに対するTh1免疫応答の集束は、HER2pos
腫瘍形成における進行性のTh1損失を説明できないことがある。
に示すように、すべてのHER2細胞外ドメイン(ECD)と細胞内ドメイン(ICD)
ペプチド応答プロファイル(P<0.0050)に亘って、HD/BDからHER2po
s−IBC患者と類似の段階的なTh1減衰を明らかにした。不均衡なDCIS/IBC
患者における選択HER2エピトープに対するTh1免疫応答の集束は、HER2pos
腫瘍形成における進行性のTh1損失を説明できないことがある。
HD/BDドナーにおけるTh1応答が特定のサブグループ内で不釣り合いに高いかを
調べるため、応答を、年齢(<50歳(n=16)、>50歳(n=15))、閉経状態
(閉経前(n=16)、閉経後(n=15))、人種(白人(n=23)、その他(黒人
/アジア人/など;n=8))、または妊娠回数(ゼロ(n=12)、>1(n=19)
妊娠)によって比較した。抗HER2のTh1レパートリーまたは累積応答において有意
差は年齢、人種、または閉経状態によって層別化したHDサブグループにおいては観察さ
れなかった。しかし、妊娠ドナー(すなわち>1妊娠)は、非妊娠ドナー(図5(c))
に比べ有意に高い抗HER2のTh1レパートリー(5.3±0.2対4.6±0.2、
P=0.01)及び累積応答(293.1±21.2対178.2±19.0、P=0.
0008)を有していた。HD/BD及びHER2pos−IBCドナー(各n=4)に
おけるTh1応答の時間的な可変性を調べた。図7に見られるように、同じ患者から>6
ヶ月の間隔で採取した血液で、比較的変化のないTh1レパートリーと累積応答が時間を
かけて観察した。HER2pos−IBCにおいて、抗HER2 IgGl及びIgG4
抗体応答が失われた。
調べるため、応答を、年齢(<50歳(n=16)、>50歳(n=15))、閉経状態
(閉経前(n=16)、閉経後(n=15))、人種(白人(n=23)、その他(黒人
/アジア人/など;n=8))、または妊娠回数(ゼロ(n=12)、>1(n=19)
妊娠)によって比較した。抗HER2のTh1レパートリーまたは累積応答において有意
差は年齢、人種、または閉経状態によって層別化したHDサブグループにおいては観察さ
れなかった。しかし、妊娠ドナー(すなわち>1妊娠)は、非妊娠ドナー(図5(c))
に比べ有意に高い抗HER2のTh1レパートリー(5.3±0.2対4.6±0.2、
P=0.01)及び累積応答(293.1±21.2対178.2±19.0、P=0.
0008)を有していた。HD/BD及びHER2pos−IBCドナー(各n=4)に
おけるTh1応答の時間的な可変性を調べた。図7に見られるように、同じ患者から>6
ヶ月の間隔で採取した血液で、比較的変化のないTh1レパートリーと累積応答が時間を
かけて観察した。HER2pos−IBCにおいて、抗HER2 IgGl及びIgG4
抗体応答が失われた。
HER2pos乳房腫瘍形成を減衰するHD内の既存の抗HER2のTh1応答に注目
した後、HD、HER2pos−DCIS及びHER2pos−IBC患者由来の入手可
能な血清を用いて、組換えHER2 ECDペプチドに対する血清反応性を試験した。T
h1免疫に関連したIgG1及び慢性抗原曝露に関連したIgG4の両方を評価した。H
D(n=12)及び未処置HER2pos−IBCの患者(n=7)と比較して、HER
2pos−DCIS患者(n=10 IgG1、n=11 IgG4)において、抗HE
R2 IgG1及びIgG4(共にp<0.0001両方)の両方のレベルにおける相対
的な増加を図5Dに示されるようにELISAによって観察した。HER2pos−IB
C患者における比較的低い抗HER2抗体レベルは内因性抗HER2応答が疾患の進行の
際に失われたことを示唆する。
した後、HD、HER2pos−DCIS及びHER2pos−IBC患者由来の入手可
能な血清を用いて、組換えHER2 ECDペプチドに対する血清反応性を試験した。T
h1免疫に関連したIgG1及び慢性抗原曝露に関連したIgG4の両方を評価した。H
D(n=12)及び未処置HER2pos−IBCの患者(n=7)と比較して、HER
2pos−DCIS患者(n=10 IgG1、n=11 IgG4)において、抗HE
R2 IgG1及びIgG4(共にp<0.0001両方)の両方のレベルにおける相対
的な増加を図5Dに示されるようにELISAによって観察した。HER2pos−IB
C患者における比較的低い抗HER2抗体レベルは内因性抗HER2応答が疾患の進行の
際に失われたことを示唆する。
曖昧なHER2発現IBC患者におけるCD4+Th1応答は明確なHER2neg−I
BCと著しく異なる
HER2neg−IBC患者におけるTh1プロファイルを、抗HER2Th1免疫力
の相対的低下を伴うサブグループを識別するために調べた。明確なHER2neg−IB
C(IHC0/1+)患者(n=11)と比較して、曖昧なHER2発現(IHC2+/
FISH陰性)IBC患者(n=7)は、有意に低い全体的な応答性(28.6%[IH
C2+]対100%[IHC0/1+]、P=0.002)、レパートリー(0.3±0
.2対3.9±0.3、p<0.0001)、及び累積応答(21.4±6.5対191
.2±11.7 SFC/106細胞、p=0.002)を示した。曖昧なHER2発現
IBC患者におけるTh1応答は、図5Aに示されるHER2pos−IBC患者に見ら
れるものと同様だった。ELISPOTにより測定されるIL−10産生及びフローサイ
トメトリーによるTreg(CD4+CD25+FoxP3+)細胞の相対比率によって
測定されるIL−10産生は、曖昧なHER2neg−IBC患者及び明確なHER2n
eg−IBC患者の間で有意差はなかった(データは示さず)。
BCと著しく異なる
HER2neg−IBC患者におけるTh1プロファイルを、抗HER2Th1免疫力
の相対的低下を伴うサブグループを識別するために調べた。明確なHER2neg−IB
C(IHC0/1+)患者(n=11)と比較して、曖昧なHER2発現(IHC2+/
FISH陰性)IBC患者(n=7)は、有意に低い全体的な応答性(28.6%[IH
C2+]対100%[IHC0/1+]、P=0.002)、レパートリー(0.3±0
.2対3.9±0.3、p<0.0001)、及び累積応答(21.4±6.5対191
.2±11.7 SFC/106細胞、p=0.002)を示した。曖昧なHER2発現
IBC患者におけるTh1応答は、図5Aに示されるHER2pos−IBC患者に見ら
れるものと同様だった。ELISPOTにより測定されるIL−10産生及びフローサイ
トメトリーによるTreg(CD4+CD25+FoxP3+)細胞の相対比率によって
測定されるIL−10産生は、曖昧なHER2neg−IBC患者及び明確なHER2n
eg−IBC患者の間で有意差はなかった(データは示さず)。
Th1応答の損失は、ホストレベルのT細胞免疫反応不顕性、又は増加した免疫抑制性の
循環免疫表現型に関係するものではない
評価可能なドナーのサブグループにおける免疫力をIFN−γELISPOTを介して
抗CD3/抗CD28に対するTh1応答を測定することによって評価した;これらの応
答はまた、すべてのELISPOTアッセイにおけるドナー特異的ポジティブコントロー
ルとしての機能も果たした。抗CD3/CD28応答のメディアンは、それぞれ図5(b
)に見られるように、HD/BD(n=31)、HER2neg−DCIS(n=11)
、HER2neg−IBC(n=11)、HER2pos−DCIS(n=5)HER2
pos−IBC(n=11)、及びT/C治療HER2pos−IBC(n=37)のコ
ホートとの間に、差がなかった(1098対1104対1032対1099対1318対
1032 SFC/2xl05細胞、p=0.22)。さらに、刺激をリコールするため
のTh1応答は[破傷風トキソイド(105±17.0対96±15.6対101±11
.3SFC/2xl05)、及びカンジダ・アルビカンス(185±10.2対199±
15.3対181±14.6 SFC/2xl05)]、それぞれ図8Aに見られるよう
に、評価したHD(n=10)、HER2pos−IBC(n=11)、及びT/C治療
IBC(n=10)のコホート間で同様だった。まとめると、これらのデータは、HER
2ドライブBCにおける進行性の抗HER2 Th1応答の損失が、ホストレベルのT細
胞免疫反応不顕性またはIBC患者のPBMC中の損なわれた抗原提示能に起因するもの
ではないことを示唆している。
循環免疫表現型に関係するものではない
評価可能なドナーのサブグループにおける免疫力をIFN−γELISPOTを介して
抗CD3/抗CD28に対するTh1応答を測定することによって評価した;これらの応
答はまた、すべてのELISPOTアッセイにおけるドナー特異的ポジティブコントロー
ルとしての機能も果たした。抗CD3/CD28応答のメディアンは、それぞれ図5(b
)に見られるように、HD/BD(n=31)、HER2neg−DCIS(n=11)
、HER2neg−IBC(n=11)、HER2pos−DCIS(n=5)HER2
pos−IBC(n=11)、及びT/C治療HER2pos−IBC(n=37)のコ
ホートとの間に、差がなかった(1098対1104対1032対1099対1318対
1032 SFC/2xl05細胞、p=0.22)。さらに、刺激をリコールするため
のTh1応答は[破傷風トキソイド(105±17.0対96±15.6対101±11
.3SFC/2xl05)、及びカンジダ・アルビカンス(185±10.2対199±
15.3対181±14.6 SFC/2xl05)]、それぞれ図8Aに見られるよう
に、評価したHD(n=10)、HER2pos−IBC(n=11)、及びT/C治療
IBC(n=10)のコホート間で同様だった。まとめると、これらのデータは、HER
2ドライブBCにおける進行性の抗HER2 Th1応答の損失が、ホストレベルのT細
胞免疫反応不顕性またはIBC患者のPBMC中の損なわれた抗原提示能に起因するもの
ではないことを示唆している。
フローサイトメトリーを用いて、CD3+CD4+(72.8±2.3%対62.6±
3.2%対63.3±6.9%、P=0.26)及びCD3+CD8+(25.1±2.
9%対37.9±4.7%対38.2±6.6%、P=0.15)の細胞の平均割合は、
それぞれ図8Bに示されているように、HD、HER2pos−IBC、およびT/C治
療HER2pos−IBCのコホートからのPBMCの間で有意な差はなかった。グルー
プ間でB細胞(CD19+)またはナチュラルキラー(NK)細胞(CD3−CD16+
)の割合に差は観察されなかった(データは示さず)。その後、全身の免疫抑制表現型を
次のグループ間で比較した。図8Cに示すようにHD、HER2pos−IBC、及びT
/C−治療HER2pos−IBCのサブグループの間で、それぞれ、CD4+CD25
+FoxP3+細胞(Treg細胞)(1.8±0.3%対1.5±0.2%対1.7±
0.3%、P=0.78)、及びCD11b+CD33+HLA−DR−CD83−細胞
(骨髄由来サプレッサー細胞「MDSC」)(0.6±0.1%対1.0±0.3%対0
.9±0.1%、P=0.33)の平均の割合に有意差は認められなかった。
3.2%対63.3±6.9%、P=0.26)及びCD3+CD8+(25.1±2.
9%対37.9±4.7%対38.2±6.6%、P=0.15)の細胞の平均割合は、
それぞれ図8Bに示されているように、HD、HER2pos−IBC、およびT/C治
療HER2pos−IBCのコホートからのPBMCの間で有意な差はなかった。グルー
プ間でB細胞(CD19+)またはナチュラルキラー(NK)細胞(CD3−CD16+
)の割合に差は観察されなかった(データは示さず)。その後、全身の免疫抑制表現型を
次のグループ間で比較した。図8Cに示すようにHD、HER2pos−IBC、及びT
/C−治療HER2pos−IBCのサブグループの間で、それぞれ、CD4+CD25
+FoxP3+細胞(Treg細胞)(1.8±0.3%対1.5±0.2%対1.7±
0.3%、P=0.78)、及びCD11b+CD33+HLA−DR−CD83−細胞
(骨髄由来サプレッサー細胞「MDSC」)(0.6±0.1%対1.0±0.3%対0
.9±0.1%、P=0.33)の平均の割合に有意差は認められなかった。
HER2特異的IL−10産生、Tヘルパー2型(Th2)及び/またはTreg機能
の代用もまた、ELISPOTを介して患者サブグループ間で試験した。図8Dは、抗H
ER2応答性(すべて100%)、レパートリー(1.8±0.4対1.8±0.2対2
.0±0.3)、及び累積応答(77.4±15.2対66.6±8.2対92.8±4
.7)は、それぞれ、HD、HER2pos−IBC、及びT/C治療IBCコホート間
で有意差がなかったことを示している。図8Eは、抗CD3刺激に対するIL−10産生
がすべての評価グループ間で類似していたことを示している。全体的なIL−10産生は
サブグループ間で差はなかったが、ドナーが一致したHER2特異的IFN−γ:IL−
10産生比はHDにおける6.6:1(相対的なTh1に有利な表現型)から、未処理及
びT/C治療HER2pos−IBC患者における、それぞれ0.74:1及び0.97
:1(相対的にTreg/Th2に有利な表現型)へ劇的に変化した(P=0.009)
(上パネル)。
の代用もまた、ELISPOTを介して患者サブグループ間で試験した。図8Dは、抗H
ER2応答性(すべて100%)、レパートリー(1.8±0.4対1.8±0.2対2
.0±0.3)、及び累積応答(77.4±15.2対66.6±8.2対92.8±4
.7)は、それぞれ、HD、HER2pos−IBC、及びT/C治療IBCコホート間
で有意差がなかったことを示している。図8Eは、抗CD3刺激に対するIL−10産生
がすべての評価グループ間で類似していたことを示している。全体的なIL−10産生は
サブグループ間で差はなかったが、ドナーが一致したHER2特異的IFN−γ:IL−
10産生比はHDにおける6.6:1(相対的なTh1に有利な表現型)から、未処理及
びT/C治療HER2pos−IBC患者における、それぞれ0.74:1及び0.97
:1(相対的にTreg/Th2に有利な表現型)へ劇的に変化した(P=0.009)
(上パネル)。
全身のTh1応答の損失は、HER2pos−IBC病変への不均衡なTリンパ球の輸送
とは無関係である
全身IFN−γposCD4+応答の損失がIBC病変への不均衡なリンパ球輸送に関
連しているかを決定するために、病理学的レビューのために利用可能な14個のHER2
pos−DCIS及び8個のHER2pos−IBC病変の免疫組織化学(IHC)分析
を実施した。結果を図9Aに示す。中程度(>15%の間質の関与)から高程度(>25
%)のリンパ球のレベルが、評価可能な患者(上、矢印で示す)の大部分(12/14;
85.7%)におけるDCIS含有管の外側の間質領域で集約することが観察された一方
、リンパ球(矢印)の相対的な不足は、全8人のIBC患者において侵襲病巣の周りに見
られた(98/8;100%)(下)。
とは無関係である
全身IFN−γposCD4+応答の損失がIBC病変への不均衡なリンパ球輸送に関
連しているかを決定するために、病理学的レビューのために利用可能な14個のHER2
pos−DCIS及び8個のHER2pos−IBC病変の免疫組織化学(IHC)分析
を実施した。結果を図9Aに示す。中程度(>15%の間質の関与)から高程度(>25
%)のリンパ球のレベルが、評価可能な患者(上、矢印で示す)の大部分(12/14;
85.7%)におけるDCIS含有管の外側の間質領域で集約することが観察された一方
、リンパ球(矢印)の相対的な不足は、全8人のIBC患者において侵襲病巣の周りに見
られた(98/8;100%)(下)。
リンパ球の表現型を、腫瘍及び間質領域を識別する新規な多重標識免疫蛍光(IF)イ
メージング技術によって分析し、Wang,C,らにより記載されるように相対的なCD
4+(緑信号)、CD8+(黄色)、及びCD20+(赤)の亜集団を確実に検出した。
結果を図9Bに示す。HER2pos−IBC腫瘍における間質性(StL)及び腫瘍浸
潤リンパ球(TIL)の大部分はCD8+細胞(右上のパネル)から構成されていた。ま
た、CD4+TIL/StLの相対的な不足が、DCIS病変(左上のパネル)と比較し
てHER2pos−IBC腫瘍で観察された。HER2pos−IBC病変への不釣り合
いな腫瘍周囲CD4+ T細胞の輸送では、IFN−γposCD4+T細胞サブセット
の全身枯渇を説明できないかもしれない。
メージング技術によって分析し、Wang,C,らにより記載されるように相対的なCD
4+(緑信号)、CD8+(黄色)、及びCD20+(赤)の亜集団を確実に検出した。
結果を図9Bに示す。HER2pos−IBC腫瘍における間質性(StL)及び腫瘍浸
潤リンパ球(TIL)の大部分はCD8+細胞(右上のパネル)から構成されていた。ま
た、CD4+TIL/StLの相対的な不足が、DCIS病変(左上のパネル)と比較し
てHER2pos−IBC腫瘍で観察された。HER2pos−IBC病変への不釣り合
いな腫瘍周囲CD4+ T細胞の輸送では、IFN−γposCD4+T細胞サブセット
の全身枯渇を説明できないかもしれない。
高/中度HER2発現であるが低HER2発現でないBC細胞は、CD4+Th1媒介ア
ポトーシスに対して感受性がある
試験管内でのHER2highSK−BR−3、HER2intermediateM
CF−7、及びHER2lowMDA−MB−231 BC細胞株のTh1媒介効果もま
た評価した。HER2パルスDC1で感作したHER2クラスIIペプチド特異的CD4
+Th1細胞の増加割合を、上記のタイプのHER発現BC細胞と、トランスウェル培養
系を用いて共培養したところ、図10Aで示されるウエスタンブロット分析でカスパーゼ
3が増加していることから証明されているようにSK−BR−3は著しい用量依存性アポ
トーシスを起こし、図11Aで認められるようにMCF−7で著しい用量依存性アポトー
シスを起こすがMDA−MB−231 BC細胞株で起こさなかった。対照的に、図10
A及び11Aに見られるように、未成熟DC(iDC H及びiDC B)または対照ク
ラスIIペプチド(BRAF)パルスDC1(DC1 B)で感作したCD4+ T細胞
と共培養したBC細胞においては、アポトーシスは比較的わずかであった。ELISAに
よるこれらの共培養上清中でなされたTh1サイトカインの定量から、図10Aに示され
るCD4+:BRAF制御DCl、共培養に比べて、CD4+T細胞:HER2パルスD
ClからのIFN−γ及びTNF−α産生が有意に増加することが示され、これは観察さ
れたアポトーシスの程度に相当するものであった。
ポトーシスに対して感受性がある
試験管内でのHER2highSK−BR−3、HER2intermediateM
CF−7、及びHER2lowMDA−MB−231 BC細胞株のTh1媒介効果もま
た評価した。HER2パルスDC1で感作したHER2クラスIIペプチド特異的CD4
+Th1細胞の増加割合を、上記のタイプのHER発現BC細胞と、トランスウェル培養
系を用いて共培養したところ、図10Aで示されるウエスタンブロット分析でカスパーゼ
3が増加していることから証明されているようにSK−BR−3は著しい用量依存性アポ
トーシスを起こし、図11Aで認められるようにMCF−7で著しい用量依存性アポトー
シスを起こすがMDA−MB−231 BC細胞株で起こさなかった。対照的に、図10
A及び11Aに見られるように、未成熟DC(iDC H及びiDC B)または対照ク
ラスIIペプチド(BRAF)パルスDC1(DC1 B)で感作したCD4+ T細胞
と共培養したBC細胞においては、アポトーシスは比較的わずかであった。ELISAに
よるこれらの共培養上清中でなされたTh1サイトカインの定量から、図10Aに示され
るCD4+:BRAF制御DCl、共培養に比べて、CD4+T細胞:HER2パルスD
ClからのIFN−γ及びTNF−α産生が有意に増加することが示され、これは観察さ
れたアポトーシスの程度に相当するものであった。
図11Bに示すように、CD4+T細胞:HER2パルスDC1共培養由来の上清と共
にインキュベートした場合も、SK−BR−3細胞において同様に特異的なアポトーシス
を観察したが、CD4+:HER2−iDCまたはCD4+:BRAF制御−DC1共培
養では観測されなかった。図10B、右の写真とバーグラフに見られるように、対照と比
較して、HER2特異的Th1細胞は、DAPI染色によって証明されるようにSK−B
R−3のアポトーシスにおいて25倍の増加を生じた。まとめると、これらのデータは抗
HER2 CD4+Th1細胞は、低HER2発現ではなく高/中度HER2発現した乳
癌細胞のアポトーシスを仲介する可溶性因子を産生することを示唆する。
にインキュベートした場合も、SK−BR−3細胞において同様に特異的なアポトーシス
を観察したが、CD4+:HER2−iDCまたはCD4+:BRAF制御−DC1共培
養では観測されなかった。図10B、右の写真とバーグラフに見られるように、対照と比
較して、HER2特異的Th1細胞は、DAPI染色によって証明されるようにSK−B
R−3のアポトーシスにおいて25倍の増加を生じた。まとめると、これらのデータは抗
HER2 CD4+Th1細胞は、低HER2発現ではなく高/中度HER2発現した乳
癌細胞のアポトーシスを仲介する可溶性因子を産生することを示唆する。
重要なことに、HER2highSK−BR−3のアポトーシスは図10Aに見られる
ように、IFN−γ及びTNF−αを中和することによって有意に救出され得、HER2
特異的細胞のアポトーシスを媒介することにおいて、多面的なTh1サイトカインの重要
な役割を示唆している。これらの知見をさらに調査するために、BC細胞に対するIFN
−γ及びTNF−a治療の影響を試験した。HER2発現にかかわらず、図10Cに見ら
れるように、ヒトBC細胞は一様に、IFN−γ及びTNFーa受容体の発現を維持した
。図11Cに見られるように、IFN−γ及びTNF−a処理は、HER2highSK
−BR−3及びHER2intermediateMCF−7の有意なアポトーシスを生
じたが、HER2lowMDA−MB−231細胞のアポトーシスを生じなかった。次に
、MDA−MB−231細胞におけるHER2発現の復元が、Th1サイトカイン媒介性
アポトーシスに対する感受性を回復するかを評価するために、MDA−MB−231細胞
を野生型HER2プラスミド(pcDNA−HER2)または対照空ベクター(pcDN
A3;Mark I.Greeneの寛大な贈与、ペンシルバニア大学)で安定的に形質
移入し、IFN−γ及びTNF−α(それぞれ、2000U/ml及び200ng/ml
;図11CでMDA−MB−231細胞に対して使用したものと同等の用量)で処理した
。HER2を形質移入したMDA−MB−231細胞においては、著しいIFN−γ/T
NF−α誘導アポトーシスを観察したが、ベクターを形質移入した細胞においては観察し
なかった(データは示さず)。
ように、IFN−γ及びTNF−αを中和することによって有意に救出され得、HER2
特異的細胞のアポトーシスを媒介することにおいて、多面的なTh1サイトカインの重要
な役割を示唆している。これらの知見をさらに調査するために、BC細胞に対するIFN
−γ及びTNF−a治療の影響を試験した。HER2発現にかかわらず、図10Cに見ら
れるように、ヒトBC細胞は一様に、IFN−γ及びTNFーa受容体の発現を維持した
。図11Cに見られるように、IFN−γ及びTNF−a処理は、HER2highSK
−BR−3及びHER2intermediateMCF−7の有意なアポトーシスを生
じたが、HER2lowMDA−MB−231細胞のアポトーシスを生じなかった。次に
、MDA−MB−231細胞におけるHER2発現の復元が、Th1サイトカイン媒介性
アポトーシスに対する感受性を回復するかを評価するために、MDA−MB−231細胞
を野生型HER2プラスミド(pcDNA−HER2)または対照空ベクター(pcDN
A3;Mark I.Greeneの寛大な贈与、ペンシルバニア大学)で安定的に形質
移入し、IFN−γ及びTNF−α(それぞれ、2000U/ml及び200ng/ml
;図11CでMDA−MB−231細胞に対して使用したものと同等の用量)で処理した
。HER2を形質移入したMDA−MB−231細胞においては、著しいIFN−γ/T
NF−α誘導アポトーシスを観察したが、ベクターを形質移入した細胞においては観察し
なかった(データは示さず)。
最後に、このTh1サイトカイン媒介HER2特異的アポトーシスは、トランスジェニ
ックマウス乳癌細胞で裏付けられた。図10Dに見られるように、いずれかのサイトカイ
ン単独でなく、組換えマウスIFN−γ及びTNF−αを用いた二重処置により、HER
2highTUBO及びMMC15の有意なアポトーシスを生じたが、HER2low/
neg4T1細胞のアポトーシスは生じなかった。
ックマウス乳癌細胞で裏付けられた。図10Dに見られるように、いずれかのサイトカイ
ン単独でなく、組換えマウスIFN−γ及びTNF−αを用いた二重処置により、HER
2highTUBO及びMMC15の有意なアポトーシスを生じたが、HER2low/
neg4T1細胞のアポトーシスは生じなかった。
HER2pos−IBCにおけるTh1応答損失は、HER2パルスDCワクチン接種し
た後に回復するが、HER2標的又は従来の治療後は回復しない
T/C治療及びHER2パルスDC1ワクチン接種後のHER2pos−IBC患者に
おけるTh1応答の差動効果を分析し、結果を図12A、上パネルに示した。未治療ステ
ージI/II HER2pos−IBC患者(n=22;図1コホートF)及びT/C治
療ステージI−III HER2pos−IBC患者(n=37;図1コホートG)は、
抗HER2応答性(31.6%未処理対45.9%のT/C治療、P=0.39)、レパ
ートリー(0.4±0.2対0.8±0.2、P=0.24)、または累積応答(32.
3±5.4対54.5±12.0 SFC/106、P=0.97)で有意に異ならなか
った。しかしながら、図12B、上パネルに示すように、11人のステージI HER2
pos−IBC患者(図1コホートH)におけるHER2パルスDC1ワクチン接種後は
、抗HER2応答性(18.2%ワクチン前対90.9%ワクチン後、p=0.0035
)、レパートリー(0.3±0.2対3.7±0.5、p<0.0001)、及び累積応
答(29.7±7.9対162.8±33.7 SFC/106、P<0.0001)に
おいて、著しい改善が認められた。T/C治療後でなく、DC1ワクチン接種後の著しい
Th1回復効果は、図12Cに見られるように、ステージI未処理(n=11)、T/C
治療(n=8)、及びワクチン接種(n=11)HER2pos−IBC患者間のステー
ジ対応比較で持続した。
た後に回復するが、HER2標的又は従来の治療後は回復しない
T/C治療及びHER2パルスDC1ワクチン接種後のHER2pos−IBC患者に
おけるTh1応答の差動効果を分析し、結果を図12A、上パネルに示した。未治療ステ
ージI/II HER2pos−IBC患者(n=22;図1コホートF)及びT/C治
療ステージI−III HER2pos−IBC患者(n=37;図1コホートG)は、
抗HER2応答性(31.6%未処理対45.9%のT/C治療、P=0.39)、レパ
ートリー(0.4±0.2対0.8±0.2、P=0.24)、または累積応答(32.
3±5.4対54.5±12.0 SFC/106、P=0.97)で有意に異ならなか
った。しかしながら、図12B、上パネルに示すように、11人のステージI HER2
pos−IBC患者(図1コホートH)におけるHER2パルスDC1ワクチン接種後は
、抗HER2応答性(18.2%ワクチン前対90.9%ワクチン後、p=0.0035
)、レパートリー(0.3±0.2対3.7±0.5、p<0.0001)、及び累積応
答(29.7±7.9対162.8±33.7 SFC/106、P<0.0001)に
おいて、著しい改善が認められた。T/C治療後でなく、DC1ワクチン接種後の著しい
Th1回復効果は、図12Cに見られるように、ステージI未処理(n=11)、T/C
治療(n=8)、及びワクチン接種(n=11)HER2pos−IBC患者間のステー
ジ対応比較で持続した。
T/Cの治療後と比較して、DC1ワクチン接種後のIFN−γpos:IL−10p
os応答性T細胞の相対的な割合の違いを試験した。同時に行われたドナーを一致させた
比較では、HER2特異的IFN−γ(196.8±56.8ワクチン後対32.1±6
.1プレワクチンSFC/106、p=0.02)及びIL−10(79.0±7.4対
33.8±5.1 SFC/106、P=0.001)の両方の応答がHER2パルスD
C1ワクチン接種後に増強された一方、相対的なIFN−γ:IL−10応答比は、0.
95:1(相対的にTreg/Th2に有利な)ワクチン接種前から、2.5:1(Th
1に有利な)ワクチン接種後(P=0.008)にシフトした。しかし、相対的なIFN
−γ:IL−10応答比は、未処理(0.74:1、p=0.78)のHER2pos−
IBC患者と比較して、T/C治療後では、Th1有利な表現型に向けた有意なシフトを
示さなかった(0.97:1)。図12A及び12Bの下部水平棒グラフを参照。
os応答性T細胞の相対的な割合の違いを試験した。同時に行われたドナーを一致させた
比較では、HER2特異的IFN−γ(196.8±56.8ワクチン後対32.1±6
.1プレワクチンSFC/106、p=0.02)及びIL−10(79.0±7.4対
33.8±5.1 SFC/106、P=0.001)の両方の応答がHER2パルスD
C1ワクチン接種後に増強された一方、相対的なIFN−γ:IL−10応答比は、0.
95:1(相対的にTreg/Th2に有利な)ワクチン接種前から、2.5:1(Th
1に有利な)ワクチン接種後(P=0.008)にシフトした。しかし、相対的なIFN
−γ:IL−10応答比は、未処理(0.74:1、p=0.78)のHER2pos−
IBC患者と比較して、T/C治療後では、Th1有利な表現型に向けた有意なシフトを
示さなかった(0.97:1)。図12A及び12Bの下部水平棒グラフを参照。
ワクチン接種後6カ月以上の長期的なTh1免疫評価が、9人(81.8%)の患者に
対して可能だった。図12D及び12Eに示すように、すべての患者においてワクチン接
種後の術後化学療法が完了したにもかかわらず、耐久性のある抗HER2Th1応答を1
6月(6−60の範囲)の中央値対ワクチン接種前ベースラインで観測した:抗HER2
応答性(100%ワクチン後6カ月以下対22.2%ワクチン前、p=0.008)、レ
パートリー(4.0±0.4対0.3±0.2、p<0.0001)、累積応答(255
.1±49.2対33.8±9.2 SFC/106、P=0.006)。
対して可能だった。図12D及び12Eに示すように、すべての患者においてワクチン接
種後の術後化学療法が完了したにもかかわらず、耐久性のある抗HER2Th1応答を1
6月(6−60の範囲)の中央値対ワクチン接種前ベースラインで観測した:抗HER2
応答性(100%ワクチン後6カ月以下対22.2%ワクチン前、p=0.008)、レ
パートリー(4.0±0.4対0.3±0.2、p<0.0001)、累積応答(255
.1±49.2対33.8±9.2 SFC/106、P=0.006)。
一連の化学療法(術前補助療法または術後補助療法)によるTh1応答性の変化を調査
するために、T/C治療したコホートのサブグループ解析を行った:登録を検討するため
の所定のトラスツズマブの完了からの時間(6ヶ月未満又は6カ月以上);エストロゲン
受容体の状態(ERposまたはERneg);及び病理学的ステージ(Ι−III)。
図13Aは、化学療法のシーケンス(術前補助療法[n=12]対術後補助療法[n=2
5];)が、図13Bは、トラスツズマブ完了からの時間(<6カ月を超える[n=16
]対6ヶ月以下[n=21];)が、または図13Cは、ER状態(ERpos[n=2
1]対ERneg[n=16];)が、抗HER2Th1応答、レパートリー、または累
積応答(全てp=NS)に影響を与えないことを示す。重要なことに、図13DはAJC
CステージI(n=8)、ステージII(n=20)、またはステージIII(n=9)
T/C−治療患者が、任意のTh1計量によって差は認められず、HER2pos−IB
Cで観察された抗HER2Th1の欠乏が疾病負荷とは無関係であったことを示唆してい
る。また、これらのデータはまとめて、特定のサブグループの支配的なTh1反応性プロ
ファイルはT/C治療HER2pos−IBC患者において包括的に観察された免疫回復
の不足の原因とならないことを示唆している。
するために、T/C治療したコホートのサブグループ解析を行った:登録を検討するため
の所定のトラスツズマブの完了からの時間(6ヶ月未満又は6カ月以上);エストロゲン
受容体の状態(ERposまたはERneg);及び病理学的ステージ(Ι−III)。
図13Aは、化学療法のシーケンス(術前補助療法[n=12]対術後補助療法[n=2
5];)が、図13Bは、トラスツズマブ完了からの時間(<6カ月を超える[n=16
]対6ヶ月以下[n=21];)が、または図13Cは、ER状態(ERpos[n=2
1]対ERneg[n=16];)が、抗HER2Th1応答、レパートリー、または累
積応答(全てp=NS)に影響を与えないことを示す。重要なことに、図13DはAJC
CステージI(n=8)、ステージII(n=20)、またはステージIII(n=9)
T/C−治療患者が、任意のTh1計量によって差は認められず、HER2pos−IB
Cで観察された抗HER2Th1の欠乏が疾病負荷とは無関係であったことを示唆してい
る。また、これらのデータはまとめて、特定のサブグループの支配的なTh1反応性プロ
ファイルはT/C治療HER2pos−IBC患者において包括的に観察された免疫回復
の不足の原因とならないことを示唆している。
抑制された抗HER2のTh1応答は有害臨床病理学的結果と相関する
これらの知見のトランスレーショナルな(translational)関連性を評価
するために、T/C治療HER2pos−IBC患者におけるTh1応答の変動がその後
の乳房イベント(BE;任意の局所領域/遠隔再発と定義する)の発生に関連するか判断
するために評価を行った。追跡期間の中央値は33.5(四分位範囲「IQR」25.5
〜45.8)か月だった。以下の表2に示すように(トラスツズマブ及び化学療法後に、
引き続き乳がんイベント(任意の局所領域または全身再発として定義される)を受けるH
ER2pos−IBC患者の人口統計学的及び臨床的特徴を示す)、8人の患者(21.
6%)が29(IQR16.2〜36)カ月持続時間の中央値でT/C治療後のBEを負
った。図13Eの左のパネル、BEのない患者と比較して、BEを受ける患者は抗HER
2応答性(上)(12.5%+BE対55.2%BEなし;P=0.048)及び累積応
答(下)(9.4±3.6対66.9±14.5 SFC/106;P=0.046)が
大幅に抑制されたが、応答レパートリー(中央)(1.03±0.3対0.13±0.1
;P=0.11)はそうでなかった、ことを示す。
これらの知見のトランスレーショナルな(translational)関連性を評価
するために、T/C治療HER2pos−IBC患者におけるTh1応答の変動がその後
の乳房イベント(BE;任意の局所領域/遠隔再発と定義する)の発生に関連するか判断
するために評価を行った。追跡期間の中央値は33.5(四分位範囲「IQR」25.5
〜45.8)か月だった。以下の表2に示すように(トラスツズマブ及び化学療法後に、
引き続き乳がんイベント(任意の局所領域または全身再発として定義される)を受けるH
ER2pos−IBC患者の人口統計学的及び臨床的特徴を示す)、8人の患者(21.
6%)が29(IQR16.2〜36)カ月持続時間の中央値でT/C治療後のBEを負
った。図13Eの左のパネル、BEのない患者と比較して、BEを受ける患者は抗HER
2応答性(上)(12.5%+BE対55.2%BEなし;P=0.048)及び累積応
答(下)(9.4±3.6対66.9±14.5 SFC/106;P=0.046)が
大幅に抑制されたが、応答レパートリー(中央)(1.03±0.3対0.13±0.1
;P=0.11)はそうでなかった、ことを示す。
術前補助療法T/Cを受けた12人の(32.4%)T/C治療HER2pos−IB
C患者において、抗HER−2のTh1応答を、病理学的完全応答者(pCR;術後の病
態上残留浸潤性BCの証拠がない患者として定義される)と非−pCR患者間で比較した
。図13E、右パネルにおける結果は、4人の患者(33.3%)において達成された、
pCRが、非−pCRの患者と比較して、有意に高い抗HER2レパートリー(3.3±
1.1対0.13±0.13、P=0.002)(中央)及び累積応答(193.1±6
4.9対13.6±4.6、P=0.002)(下)と関連付けられ、抗HER2応答(
100%対25%、P=0.06)(上)は、統計的有意性に達しなかったことを示す。
C患者において、抗HER−2のTh1応答を、病理学的完全応答者(pCR;術後の病
態上残留浸潤性BCの証拠がない患者として定義される)と非−pCR患者間で比較した
。図13E、右パネルにおける結果は、4人の患者(33.3%)において達成された、
pCRが、非−pCRの患者と比較して、有意に高い抗HER2レパートリー(3.3±
1.1対0.13±0.13、P=0.002)(中央)及び累積応答(193.1±6
4.9対13.6±4.6、P=0.002)(下)と関連付けられ、抗HER2応答(
100%対25%、P=0.06)(上)は、統計的有意性に達しなかったことを示す。
考察
チェックポイント阻害剤の出現(Topalian,S.L.,et al.,N.E
ng.J.Med.366:2443−54(2012))、及び組織特異的エピトープ
に対するワクチン(Kantoff,P.W.,et al,N.Eng.J.Med.
363:411−22(2010))、Toll様受容体アゴニスト又は養子T細胞療法
(Kalos,M.,et al,Sci.Transl.Med.3(95):95r
a73(2011)and Rosenberg,S.A.,Nature Revie
ws Clinical Oncology 8:577−85(2011))のような
免疫調節戦略の使用はより効果的な癌免疫療法のためのお膳立てをする。これらの治療の
多くは、広範な免疫調節を対象としている。これらの発見と同時に、ゲノムプロファイリ
ングは、V−RAFマウス肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ−BL(BRAF)、上皮成長
因子受容体(EGFR)、肝細胞増殖因子受容体(C−MET)、及びHER2を含む、
腫瘍形成の特異的分子ドライバを特定してきた。治療法は、このような「オンコドライバ
ー(oncodrivers)」を標的とした治療方法は応答速度を奨励することを達成
する一方、その成功は相対的に短命である、なぜなら多くの腫瘍は最終的に再発するか、
または治療抵抗性になるからである(Pohlmann,et al.and Flah
erty,K.T.,et al,N.Eng.J.Med.363:809−19(2
010))。腫瘍の発生時にオンコドライバー特異的な免疫欠陥を特定することは、特定
の癌サブタイプに合わせた治療の機会を提供しうる。本明細書で記載されるのは、既定の
BC表現型、すなわちHER2/neuの分子オンコドライバーに特異的な腫瘍形成にお
いてCD4+Th1免疫欠陥を識別する第1の研究であると考えられる。
チェックポイント阻害剤の出現(Topalian,S.L.,et al.,N.E
ng.J.Med.366:2443−54(2012))、及び組織特異的エピトープ
に対するワクチン(Kantoff,P.W.,et al,N.Eng.J.Med.
363:411−22(2010))、Toll様受容体アゴニスト又は養子T細胞療法
(Kalos,M.,et al,Sci.Transl.Med.3(95):95r
a73(2011)and Rosenberg,S.A.,Nature Revie
ws Clinical Oncology 8:577−85(2011))のような
免疫調節戦略の使用はより効果的な癌免疫療法のためのお膳立てをする。これらの治療の
多くは、広範な免疫調節を対象としている。これらの発見と同時に、ゲノムプロファイリ
ングは、V−RAFマウス肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ−BL(BRAF)、上皮成長
因子受容体(EGFR)、肝細胞増殖因子受容体(C−MET)、及びHER2を含む、
腫瘍形成の特異的分子ドライバを特定してきた。治療法は、このような「オンコドライバ
ー(oncodrivers)」を標的とした治療方法は応答速度を奨励することを達成
する一方、その成功は相対的に短命である、なぜなら多くの腫瘍は最終的に再発するか、
または治療抵抗性になるからである(Pohlmann,et al.and Flah
erty,K.T.,et al,N.Eng.J.Med.363:809−19(2
010))。腫瘍の発生時にオンコドライバー特異的な免疫欠陥を特定することは、特定
の癌サブタイプに合わせた治療の機会を提供しうる。本明細書で記載されるのは、既定の
BC表現型、すなわちHER2/neuの分子オンコドライバーに特異的な腫瘍形成にお
いてCD4+Th1免疫欠陥を識別する第1の研究であると考えられる。
抗HER2 CD4+Th1免疫における減衰は、前悪性DCIS段階で始まり、そし
て次第に早期侵襲性疾患状態で失われる。さらに、Th1免疫は、HER2過剰発現の表
現型において特異的に失われたように思われる。広範な腫瘍形成性連続体を利用して、H
ER2neg−DCIS及びHER2neg−IBC患者(IHC0/1+)における抗
HER2Th1応答がHD/BDドナーにおいて見られるものに酷似しており、HER2
pos(IHC3+または2+/FISH陽性)DCIS及びIBC患者それぞれにおい
て見られるTh1応答よりも有意に高かったことが本明細書において実証されている:そ
のうえ、Th1免疫は曖昧なHER2発現(IHC2+/FISH陰性)個体において失
われ、HER2pos−IBC患者において見られるそれと似ているように思われる。特
に、HER2neg−IBC患者におけるHER2特異的CD4+免疫の維持は、部分的
には、CD8+T細胞を活性化することを目的としたHER2ペプチドでのワクチン接種
後のその改善された臨床転帰を説明しうる。Benavides,L.C.,et al
,Clin.Can.Res.15:2895−904 (2009)を参照。
て次第に早期侵襲性疾患状態で失われる。さらに、Th1免疫は、HER2過剰発現の表
現型において特異的に失われたように思われる。広範な腫瘍形成性連続体を利用して、H
ER2neg−DCIS及びHER2neg−IBC患者(IHC0/1+)における抗
HER2Th1応答がHD/BDドナーにおいて見られるものに酷似しており、HER2
pos(IHC3+または2+/FISH陽性)DCIS及びIBC患者それぞれにおい
て見られるTh1応答よりも有意に高かったことが本明細書において実証されている:そ
のうえ、Th1免疫は曖昧なHER2発現(IHC2+/FISH陰性)個体において失
われ、HER2pos−IBC患者において見られるそれと似ているように思われる。特
に、HER2neg−IBC患者におけるHER2特異的CD4+免疫の維持は、部分的
には、CD8+T細胞を活性化することを目的としたHER2ペプチドでのワクチン接種
後のその改善された臨床転帰を説明しうる。Benavides,L.C.,et al
,Clin.Can.Res.15:2895−904 (2009)を参照。
幾分驚くべきことに、HD/BDは、容易に識別できる循環抗HER2 Th1細胞の
集団を維持した。HER2は、通常は妊娠及び授乳期間中の分岐乳管細胞における膜成分
であるので(Press,M,F.,et al,Oncogene 5:953−62
(1990))、HD/BDにおける既存のCD4+T細胞応答が、乳房内の抗原提示細
胞(APC)によるHER2エピトープ提示の結果として生成されることは妥当である。
実際、年齢、人種、または閉経状態とは独立しているが、HD/BDにおける既存の抗H
ER2Th1免疫は、非妊娠ドナーと比較して妊娠中に高かった。特に、後者は、BCの
発生のためのリスクが高い集団である。さらに、in vitroでIFN−γ/TNF
受容体を発現している、HER2lowでなく、HER2highBC細胞株における、
サイトカインIFN−γ及びTNF−αを介したHER2特異的Th1の著しいアポトー
シス促進効果は抗HER2Th1が、乳房退縮などの生理学的プロセス中でHER2過剰
発現細胞を制御または除去することに役立ちうることを暗示する。したがって、HDにお
ける既存の抗HER2Th1免疫は、抗HER2Th1機能の抑止が腫瘍駆動機構を表し
てHER2pos腫瘍形成時の免疫監視を回避しうる一方、腫瘍形成イベントに対する保
護を与えうる。興味深いことに、最近の証拠は、循環腫瘍関連抗原(例えば、MAGE6
、EphA2)特異的CD4+Th1の優先的な死プログラミングが活動性疾患に罹患し
たメラノーマ患者において観察される免疫機能障害に貢献しうることを示唆している(W
esa,A.K.,et al,Front.Oncol.4:266(2014)。同
様のメカニズムが本研究において観察された抗HER2 CD4+Th1免疫の損失に関
与している可能性がある。そのような機構を解読したり、標的化することは、一次BC防
止を目的とした免疫介入の開発のために重要でありうる。これらのメカニズムは、乳房の
恒常性における抗HER2 Th1細胞の機能的意義と同様に、さらなる研究を保証する
。
集団を維持した。HER2は、通常は妊娠及び授乳期間中の分岐乳管細胞における膜成分
であるので(Press,M,F.,et al,Oncogene 5:953−62
(1990))、HD/BDにおける既存のCD4+T細胞応答が、乳房内の抗原提示細
胞(APC)によるHER2エピトープ提示の結果として生成されることは妥当である。
実際、年齢、人種、または閉経状態とは独立しているが、HD/BDにおける既存の抗H
ER2Th1免疫は、非妊娠ドナーと比較して妊娠中に高かった。特に、後者は、BCの
発生のためのリスクが高い集団である。さらに、in vitroでIFN−γ/TNF
受容体を発現している、HER2lowでなく、HER2highBC細胞株における、
サイトカインIFN−γ及びTNF−αを介したHER2特異的Th1の著しいアポトー
シス促進効果は抗HER2Th1が、乳房退縮などの生理学的プロセス中でHER2過剰
発現細胞を制御または除去することに役立ちうることを暗示する。したがって、HDにお
ける既存の抗HER2Th1免疫は、抗HER2Th1機能の抑止が腫瘍駆動機構を表し
てHER2pos腫瘍形成時の免疫監視を回避しうる一方、腫瘍形成イベントに対する保
護を与えうる。興味深いことに、最近の証拠は、循環腫瘍関連抗原(例えば、MAGE6
、EphA2)特異的CD4+Th1の優先的な死プログラミングが活動性疾患に罹患し
たメラノーマ患者において観察される免疫機能障害に貢献しうることを示唆している(W
esa,A.K.,et al,Front.Oncol.4:266(2014)。同
様のメカニズムが本研究において観察された抗HER2 CD4+Th1免疫の損失に関
与している可能性がある。そのような機構を解読したり、標的化することは、一次BC防
止を目的とした免疫介入の開発のために重要でありうる。これらのメカニズムは、乳房の
恒常性における抗HER2 Th1細胞の機能的意義と同様に、さらなる研究を保証する
。
HD/BDにおいて、先行するHER2Th1免疫は維持されたものの、HER2−反
応性液性応答は維持されなかった。健康乳房においては、非炎症性の設定でのAPCによ
るCD4+Th1細胞のプライミングは、IFN−γ/TNF−α分泌を介して、HER
2発現細胞の恒常性に寄与する一方、抗体産生を駆動しない場合がある。しかし、HER
2pos−DCISでは、HER2−反応性IgG1/IgG4の相対的な増加が非存在
ではなく、中間のTh1応答と関連していた。発生している腫瘍上のHER2抗原性刺激
の出現、その後の炎症性環境に残存するTh1細胞へのAPCによる提示により、一過性
の抗体産生が可能となり得る。最終的に、HER2pos−IBCにおいて、CD4+T
細胞ヘルプの漸減は、抗体の継続的な生産を侵食し、それらの最終的な消失を生じうる。
適応免疫の両腕のこの散逸により、原発性腫瘍の予防及び調節ができないこのような患者
となり得る。
応性液性応答は維持されなかった。健康乳房においては、非炎症性の設定でのAPCによ
るCD4+Th1細胞のプライミングは、IFN−γ/TNF−α分泌を介して、HER
2発現細胞の恒常性に寄与する一方、抗体産生を駆動しない場合がある。しかし、HER
2pos−DCISでは、HER2−反応性IgG1/IgG4の相対的な増加が非存在
ではなく、中間のTh1応答と関連していた。発生している腫瘍上のHER2抗原性刺激
の出現、その後の炎症性環境に残存するTh1細胞へのAPCによる提示により、一過性
の抗体産生が可能となり得る。最終的に、HER2pos−IBCにおいて、CD4+T
細胞ヘルプの漸減は、抗体の継続的な生産を侵食し、それらの最終的な消失を生じうる。
適応免疫の両腕のこの散逸により、原発性腫瘍の予防及び調節ができないこのような患者
となり得る。
上述のものに加えて、抗HER2のTh1免疫の損失は、慢性的なT細胞の枯渇、共阻
害シグナル(例えば、TIM、PD−L1、CTLA−4など)を引き起こす末梢性耐性
又はHER2反応性免疫表現型における変化、等の他のメカニズムを反映しうる。実際に
、全体的なIL−10応答は、腫瘍形成連続体にわたって維持されているが、抗原特異的
IFN−γ:IL−10の比率で評価した場合、HER2特異的応答は、強くTh1に有
利な(HD/BDにおいて)表現型から、相対的にTh2/Tregに有利な(HER2
pos−IBCにおいて)表現型へ機能的にシフトする。したがって、7/22(32%
)のHER2pos−IBC患者における、弱められているとはいえ無傷のTh1応答は
、腫瘍形成時のTh1抗腫瘍免疫防御と免疫寛容誘導性とのTreg/Th2寄与との間
の進行中のバランス(Levings,M,K,et al,Blood 105:1
162−9(2005))を反映している可能性がある。
害シグナル(例えば、TIM、PD−L1、CTLA−4など)を引き起こす末梢性耐性
又はHER2反応性免疫表現型における変化、等の他のメカニズムを反映しうる。実際に
、全体的なIL−10応答は、腫瘍形成連続体にわたって維持されているが、抗原特異的
IFN−γ:IL−10の比率で評価した場合、HER2特異的応答は、強くTh1に有
利な(HD/BDにおいて)表現型から、相対的にTh2/Tregに有利な(HER2
pos−IBCにおいて)表現型へ機能的にシフトする。したがって、7/22(32%
)のHER2pos−IBC患者における、弱められているとはいえ無傷のTh1応答は
、腫瘍形成時のTh1抗腫瘍免疫防御と免疫寛容誘導性とのTreg/Th2寄与との間
の進行中のバランス(Levings,M,K,et al,Blood 105:1
162−9(2005))を反映している可能性がある。
それにもかかわらず、抗HER2Th1免疫の損失は、HER2pos−IBC患者に
おける循環免疫抑制集団の絶対的な増加に起因しなかった。以前の研究は、進行(ステー
ジIII/IV)BC(Liyanage,U.K.,et al,J.Immunol
.169:2756−61(2002))及び他の固形腫瘍(Zhang,B.,et
al,PLOS ONE 8(2):e57114(2013))におけるより高いレベ
ルのTreg及び/またはMDSCを報告しているが、本研究では、初期段階(ステージ
I/II)のIBC患者は、HDに匹敵する免疫抑制プロファイルを持っているように思
われる。これらの患者における抗HER2Th1応答の劇的な減少は、従って、より一層
説得力がある。さらに、末梢血液中の抗HER2 IFN−γposCD4+T細胞のサ
ブセットにおけるこの減少は、(i)進行腫瘍形成に対する選択的HER2ペプチド反応
性に対してバイアスが観察されないため免疫変形には無関係であり、または、浸潤性腫瘍
へ輸送するCD4+T細胞が極めて多いこととは無関係であった。しかし、後者の知見は
、これらのデータが腫瘍微小環境におけるHER2特異的CD4+TILの隔離または枯
渇を説明できるものではなく、注意して解釈されるべきである。最後に、IBC患者にお
ける全身性のホストレベルT細胞免疫反応不顕性によって、抗HER2Th1免疫抑制を
説明することができないかもしれない。しかし、本研究では、この現象の可能な説明とし
て、抗原特異的な細胞レベルの免疫反応不顕性を完全に除外することはできない。
おける循環免疫抑制集団の絶対的な増加に起因しなかった。以前の研究は、進行(ステー
ジIII/IV)BC(Liyanage,U.K.,et al,J.Immunol
.169:2756−61(2002))及び他の固形腫瘍(Zhang,B.,et
al,PLOS ONE 8(2):e57114(2013))におけるより高いレベ
ルのTreg及び/またはMDSCを報告しているが、本研究では、初期段階(ステージ
I/II)のIBC患者は、HDに匹敵する免疫抑制プロファイルを持っているように思
われる。これらの患者における抗HER2Th1応答の劇的な減少は、従って、より一層
説得力がある。さらに、末梢血液中の抗HER2 IFN−γposCD4+T細胞のサ
ブセットにおけるこの減少は、(i)進行腫瘍形成に対する選択的HER2ペプチド反応
性に対してバイアスが観察されないため免疫変形には無関係であり、または、浸潤性腫瘍
へ輸送するCD4+T細胞が極めて多いこととは無関係であった。しかし、後者の知見は
、これらのデータが腫瘍微小環境におけるHER2特異的CD4+TILの隔離または枯
渇を説明できるものではなく、注意して解釈されるべきである。最後に、IBC患者にお
ける全身性のホストレベルT細胞免疫反応不顕性によって、抗HER2Th1免疫抑制を
説明することができないかもしれない。しかし、本研究では、この現象の可能な説明とし
て、抗原特異的な細胞レベルの免疫反応不顕性を完全に除外することはできない。
重要なことは、この抗HER2Th1抑制が、T/C治療HER2pos−IBC患者
における局所領域または遠隔再発のリスク増加と関連していたことである。対照的に、抗
HER2Th1の保存は、術前補助T/C後のpCRに相関した。まとめると、これらの
データは、HER2指向療法後の抗HER2Th1免疫反応性を監視することが臨床的ま
たは病理学的障害のリスクがある脆弱なサブグループを識別しうることを示唆している。
さらに、抗HER2Th1欠陥と良好でない臨床病理学的結果との関連性から、このよう
な免疫欠陥を反転しうる治療戦略の探索が保証される。
における局所領域または遠隔再発のリスク増加と関連していたことである。対照的に、抗
HER2Th1の保存は、術前補助T/C後のpCRに相関した。まとめると、これらの
データは、HER2指向療法後の抗HER2Th1免疫反応性を監視することが臨床的ま
たは病理学的障害のリスクがある脆弱なサブグループを識別しうることを示唆している。
さらに、抗HER2Th1欠陥と良好でない臨床病理学的結果との関連性から、このよう
な免疫欠陥を反転しうる治療戦略の探索が保証される。
疾病負担(すなわち、病理学的段階)について制御した後でさえも、HER2pos−
IBC患者における抑制された抗HER2Th1応答は、外科手術、放射線照射、化学療
法、またはHER2標的トラスツズマブによって包括的に影響を受けないままである。複
数の研究で、HER2pos腫瘍において成長を低減しアポトーシスを誘導するトラスツ
ズマブの能力(Dogan,I.,et al.,Mol.Cell.Biochem.
347:41−51(2011))や、HER2pos細胞を細胞毒性化学療法の殺腫瘍
効果に感作するトラスツズマブの能力が実証されている(Henson,E.S.,et
al,Clin.Cancer Res.12:645−53(2006))。これら
の利点にもかかわらず、トラスツズマブの使用は、ステージI疾患を有するものを含む、
大多数の患者においてHER2特異的なTh1免疫を認めうるほどには回復しなかった、
その上、これらのHER2標的治療に対するほぼ普遍的な耐性が、進行した疾患状態で観
察された。Pohlmanら。HER2を標的とする追加の戦略が、したがって、必要と
される。
IBC患者における抑制された抗HER2Th1応答は、外科手術、放射線照射、化学療
法、またはHER2標的トラスツズマブによって包括的に影響を受けないままである。複
数の研究で、HER2pos腫瘍において成長を低減しアポトーシスを誘導するトラスツ
ズマブの能力(Dogan,I.,et al.,Mol.Cell.Biochem.
347:41−51(2011))や、HER2pos細胞を細胞毒性化学療法の殺腫瘍
効果に感作するトラスツズマブの能力が実証されている(Henson,E.S.,et
al,Clin.Cancer Res.12:645−53(2006))。これら
の利点にもかかわらず、トラスツズマブの使用は、ステージI疾患を有するものを含む、
大多数の患者においてHER2特異的なTh1免疫を認めうるほどには回復しなかった、
その上、これらのHER2標的治療に対するほぼ普遍的な耐性が、進行した疾患状態で観
察された。Pohlmanら。HER2を標的とする追加の戦略が、したがって、必要と
される。
本明細書で記載されたそのような戦略は、HER2由来のクラスIIペプチドを用いた
自家DC1免疫であってもよい。HER2pos−IBC患者における術前補助HER2
−パルスDC1ワクチン接種に続いて(手術が続く)、抗HER2Th1免疫の耐久性の
回復が、ワクチン接種後最大60ヶ月まで観察された。要するに、これらのデータは、(
i)適切な免疫学的介入で矯正され得ることから、このHER2特異的CD4+Th1免
疫欠陥が、免疫学的に「固定された」ものでないことを示唆しており、更に、(ii)既
存の体液性に基づくHER2−標的療法とワクチン接種(または他の免疫調節戦略)との
組み合わせにより、この疾患における長期的結果を改善し得ること示唆している。実際に
、マウスモデルにおいて、細胞性のHER2指向免疫(IFN−γ−producing
CD4+,but not CD8+,T−cells(Sakai,Y.,et a
l,Cancer Res.64:8022−8(2004))及び体液性のHER2指
向免疫の協働は、HER2pos腫瘍の根絶に必須である(Reilly,R.T.,e
t al,Cancer Res.61:880−3(2001))。
自家DC1免疫であってもよい。HER2pos−IBC患者における術前補助HER2
−パルスDC1ワクチン接種に続いて(手術が続く)、抗HER2Th1免疫の耐久性の
回復が、ワクチン接種後最大60ヶ月まで観察された。要するに、これらのデータは、(
i)適切な免疫学的介入で矯正され得ることから、このHER2特異的CD4+Th1免
疫欠陥が、免疫学的に「固定された」ものでないことを示唆しており、更に、(ii)既
存の体液性に基づくHER2−標的療法とワクチン接種(または他の免疫調節戦略)との
組み合わせにより、この疾患における長期的結果を改善し得ること示唆している。実際に
、マウスモデルにおいて、細胞性のHER2指向免疫(IFN−γ−producing
CD4+,but not CD8+,T−cells(Sakai,Y.,et a
l,Cancer Res.64:8022−8(2004))及び体液性のHER2指
向免疫の協働は、HER2pos腫瘍の根絶に必須である(Reilly,R.T.,e
t al,Cancer Res.61:880−3(2001))。
まとめると、現在の知見は、HER2pos−BC患者の免疫監視及び治療の選択のた
めの意味を有する。考察したように、それは、HER2−駆動BCを有する高リスク集団
における標準的なHER2標的療法に対する抗HER2免疫の追加を正当化する。確かに
、試験では、術前補助T/C後の残存疾患を有するHER2pos−IBC患者、及び術
後補助療法後の進行性疾患を有するものにおいて、そのような組み合わせを検査すること
が始められてきている。また、従来のサーベイランス戦略(放射線画像、乳房生検標本の
IHC/FISHプロファイリングなど)は、腫瘍の進化の単離したスナップショットを
提供するのみであるが、高リスク患者の抗HER2Th1免疫をリアルタイムの変動で監
視することで、腫瘍の自然史及び免疫影響を垣間見る機会が提供され得る。CD4+Th
1免疫検出プロトコルを将来のBC臨床試験設計へ思慮深く組み込むことは正当と思われ
る。
めの意味を有する。考察したように、それは、HER2−駆動BCを有する高リスク集団
における標準的なHER2標的療法に対する抗HER2免疫の追加を正当化する。確かに
、試験では、術前補助T/C後の残存疾患を有するHER2pos−IBC患者、及び術
後補助療法後の進行性疾患を有するものにおいて、そのような組み合わせを検査すること
が始められてきている。また、従来のサーベイランス戦略(放射線画像、乳房生検標本の
IHC/FISHプロファイリングなど)は、腫瘍の進化の単離したスナップショットを
提供するのみであるが、高リスク患者の抗HER2Th1免疫をリアルタイムの変動で監
視することで、腫瘍の自然史及び免疫影響を垣間見る機会が提供され得る。CD4+Th
1免疫検出プロトコルを将来のBC臨床試験設計へ思慮深く組み込むことは正当と思われ
る。
要約すると、本明細書は、我々の知る限り、乳房腫瘍形成の間の分子オンコドライバー
に対するCD4+Th1免疫の進行性及び特異的な損失についての最初の記述であると考
えられる。抑制した抗HER2Th1免疫に関連した好ましくない臨床的及び病理学的転
帰への瞥見は、ワクチン接種または他の免疫調節戦略を有する免疫回復は腫瘍の進行を緩
和するまたは再発を防止するために、これらの高リスク患者において探求する価値がある
かもしれないことを暗示する。抗HER2 CD4+応答が他のHER2pos癌(すな
わち、卵巣、胃、など)で失われるのかを判断、及び他の分子オンコドライバーに対する
Th1免疫について腫瘍形成中に全身性の損失があるかの判断をする更なる研究が保証さ
れる。
に対するCD4+Th1免疫の進行性及び特異的な損失についての最初の記述であると考
えられる。抑制した抗HER2Th1免疫に関連した好ましくない臨床的及び病理学的転
帰への瞥見は、ワクチン接種または他の免疫調節戦略を有する免疫回復は腫瘍の進行を緩
和するまたは再発を防止するために、これらの高リスク患者において探求する価値がある
かもしれないことを暗示する。抗HER2 CD4+応答が他のHER2pos癌(すな
わち、卵巣、胃、など)で失われるのかを判断、及び他の分子オンコドライバーに対する
Th1免疫について腫瘍形成中に全身性の損失があるかの判断をする更なる研究が保証さ
れる。
実験例
抗HER2 CD4+Th1応答は、HER2陽性乳癌における術前補助療法後の病理的
応答に相関する新規免疫である
現代的な治療では、より大きな切除可能な腫瘍を有する患者は、多くの場合、トラスツ
ズマブと化学療法(T/C)の術前補助投与から、ほぼ40%〜60%病理学的完全応答
(pCR)を達成する恩恵を受ける。Gianni,L.,et al,Lancet
375:377−84(2010);Untch,M.,et al,J.Clin.O
ncol.28:2024−31(2010);Untch,M.,et al,J.C
lin.Oncol.29:3351−7(2011)を参照。外科手術での残留疾患の
事実(<pCR)と比較することで、術前補助T/C後のpCRの達成は、減少した再発
及び改善された長期生存のための確立された代理である。
抗HER2 CD4+Th1応答は、HER2陽性乳癌における術前補助療法後の病理的
応答に相関する新規免疫である
現代的な治療では、より大きな切除可能な腫瘍を有する患者は、多くの場合、トラスツ
ズマブと化学療法(T/C)の術前補助投与から、ほぼ40%〜60%病理学的完全応答
(pCR)を達成する恩恵を受ける。Gianni,L.,et al,Lancet
375:377−84(2010);Untch,M.,et al,J.Clin.O
ncol.28:2024−31(2010);Untch,M.,et al,J.C
lin.Oncol.29:3351−7(2011)を参照。外科手術での残留疾患の
事実(<pCR)と比較することで、術前補助T/C後のpCRの達成は、減少した再発
及び改善された長期生存のための確立された代理である。
上記参考例は、HER2pos乳房癌における腫瘍形成連続体に亘る抗HER2 CD
4+ Tヘルパー1型(Th1)免疫における進行性の損失を実証した。特に興味深いの
は、このHER2特異的なTh1応答が、HER2neg(0−1+)浸潤性乳癌(IB
C)を宿す患者と同様に、健康なボランティアで保存されていることである。HER2p
os−IBC患者において、この抗HER2Th1欠陥は、外科的切除、放射線照射、ま
たはT/C治療等の標準的治療の影響を受けないが、代わりにHER2パルス1型極性化
樹状細胞(DC1)のワクチン接種後に「復元」され得る。さらに、抑制された抗HER
2Th1応答が、術後補助T/C治療患者におけるその後の再発リスクの増加を予測して
いることも示された。これらの知見は、同様の抑制された抗HER2Th1応答が、別の
既知の再発の前兆、すなわち、術前補助T/C後の<pCR状況(Kim,M.M.,e
t al,Ann.Oncol.24:1999−2004(2013))においても観
察されるものでるかの研究を促した。逆に、抗HER2Th1応答の保存/回復をpCR
に関連付け得ると仮定された。従って、pCRと<pCR患者との間の抗HER2Th1
応答における違いを試験して病理的応答に相関する変更可能な免疫を同定した。
4+ Tヘルパー1型(Th1)免疫における進行性の損失を実証した。特に興味深いの
は、このHER2特異的なTh1応答が、HER2neg(0−1+)浸潤性乳癌(IB
C)を宿す患者と同様に、健康なボランティアで保存されていることである。HER2p
os−IBC患者において、この抗HER2Th1欠陥は、外科的切除、放射線照射、ま
たはT/C治療等の標準的治療の影響を受けないが、代わりにHER2パルス1型極性化
樹状細胞(DC1)のワクチン接種後に「復元」され得る。さらに、抑制された抗HER
2Th1応答が、術後補助T/C治療患者におけるその後の再発リスクの増加を予測して
いることも示された。これらの知見は、同様の抑制された抗HER2Th1応答が、別の
既知の再発の前兆、すなわち、術前補助T/C後の<pCR状況(Kim,M.M.,e
t al,Ann.Oncol.24:1999−2004(2013))においても観
察されるものでるかの研究を促した。逆に、抗HER2Th1応答の保存/回復をpCR
に関連付け得ると仮定された。従って、pCRと<pCR患者との間の抗HER2Th1
応答における違いを試験して病理的応答に相関する変更可能な免疫を同定した。
87人のHER2pos−IBC患者(3+または2+/FISH陽性)を対象に抗H
ER2 CD4+Th1応答を前向きに分析し、ステージI/II HER2pos−I
BC患者(n=22)とステージI−III T/C治療HER2pos−IBC患者(
n=65)との間で応答を比較した。抗HER2Th1応答を、術後補助トラスツズマブ
の完了後に生成したT/C治療コホートにおいて、応答は、化学療法のタイミングによっ
て層別化し(すなわち、術後補助対術前補助)、さらに術前補助コホート内のpCR状態
及び<pCR状態によりサブ層別化した。pCRを、切除乳房標本及び採取リンパ節の病
理学的検査で残留浸潤癌が存在しないことと定義した(すなわち、ypTO/Tis y
pNO)。
ER2 CD4+Th1応答を前向きに分析し、ステージI/II HER2pos−I
BC患者(n=22)とステージI−III T/C治療HER2pos−IBC患者(
n=65)との間で応答を比較した。抗HER2Th1応答を、術後補助トラスツズマブ
の完了後に生成したT/C治療コホートにおいて、応答は、化学療法のタイミングによっ
て層別化し(すなわち、術後補助対術前補助)、さらに術前補助コホート内のpCR状態
及び<pCR状態によりサブ層別化した。pCRを、切除乳房標本及び採取リンパ節の病
理学的検査で残留浸潤癌が存在しないことと定義した(すなわち、ypTO/Tis y
pNO)。
<pCRコホートにおける四人の患者を補充して術後補助HER2パルス1型極性化D
C(DC1)ワクチン接種試験(NCT02061423)に参加させた。これらの患者
における抗HER2Th1応答を、免疫前後に分析した。
C(DC1)ワクチン接種試験(NCT02061423)に参加させた。これらの患者
における抗HER2Th1応答を、免疫前後に分析した。
方法
参考例に記載のように、循環抗HER2 CD4+Th1応答を、生体外で6個のHE
R2由来クラスIIペプチド(ペプチド42〜56、ペプチド98〜114、ペプチド3
28〜345、776〜790ペプチド、ペプチド927〜941、及びペプチド116
6〜1180)(配列番号:1−6)でパルスした非培養PBMCにおいて、酵素結合免
疫吸着スポット(ELISPOT)アッセイを介してIFN−γ産生を測定することによ
って試験した。参考例に記載のようにELISPOTを行った。HLA−A2.1pos
ドナー由来のPBMCを、PMA(50ng/ml)及びイオノマイシン(1μg/ml
シグマアルドリッチ)を陽性対照として;二つのHER2由来クラスIペプチド:ペプチ
ド369〜377(配列番号:7)及びペプチド689〜697(配列番号:8)で刺激
した。
参考例に記載のように、循環抗HER2 CD4+Th1応答を、生体外で6個のHE
R2由来クラスIIペプチド(ペプチド42〜56、ペプチド98〜114、ペプチド3
28〜345、776〜790ペプチド、ペプチド927〜941、及びペプチド116
6〜1180)(配列番号:1−6)でパルスした非培養PBMCにおいて、酵素結合免
疫吸着スポット(ELISPOT)アッセイを介してIFN−γ産生を測定することによ
って試験した。参考例に記載のようにELISPOTを行った。HLA−A2.1pos
ドナー由来のPBMCを、PMA(50ng/ml)及びイオノマイシン(1μg/ml
シグマアルドリッチ)を陽性対照として;二つのHER2由来クラスIペプチド:ペプチ
ド369〜377(配列番号:7)及びペプチド689〜697(配列番号:8)で刺激
した。
抗原特異的応答を決定するための経験的方法を用いた。個々のHER2ペプチドに対す
る正の応答を次のように定義した:(1)未刺激のバックグラウンドを差し引いた後の実
験ウェルにおける20 SFC/2xl05細胞の最小閾値;及び(2)バックグラウン
ドを超える抗原特異的なSFCの2倍以下の増加。Th1応答の測定基準は、参考例で説
明したように、抗HER2応答性、反応性ペプチドの数(レパートリー)、及び6ペプチ
ド全体の累積応答(SFC/106細胞)だった。術後補助HER2−パルス1型極性化
樹状細胞(DC1)ワクチン接種を受けた<pCR患者(n=4)のTh1応答を免疫前
/後に分析した。
る正の応答を次のように定義した:(1)未刺激のバックグラウンドを差し引いた後の実
験ウェルにおける20 SFC/2xl05細胞の最小閾値;及び(2)バックグラウン
ドを超える抗原特異的なSFCの2倍以下の増加。Th1応答の測定基準は、参考例で説
明したように、抗HER2応答性、反応性ペプチドの数(レパートリー)、及び6ペプチ
ド全体の累積応答(SFC/106細胞)だった。術後補助HER2−パルス1型極性化
樹状細胞(DC1)ワクチン接種を受けた<pCR患者(n=4)のTh1応答を免疫前
/後に分析した。
結果
研究は、87人の患者を含んでいた。未治療HER2pos−IBC患者(n=22)
における抑制された抗HER2Th1応答は、T/C治療(n=65)の後に、全体的に
改善しなかった。術後補助T/Cと比較して、術前補助T/C(61.5%)はより高い
Th1レパートリー(1.5対0.8、P=0.048)と関連していた。pCR(n=
16)及び<pCR(n=24)患者は、人口統計学的/臨床的特性において差が認めら
れなかった一方、pCR患者はERneg腫瘍をより持っているようだった。pCR患者
は<pCR患者と比較して、劇的に高い抗HER2応答性(94%対33%、P=0.0
002)、レパートリー(3.3対0.3、p<0.0001)、及び累積応答(148
.2対22.4、p<0.0001)を示した。この相違は、CD4+T−bet+IF
N−γ+表現型によって媒介され、<pCR患者の免疫不全、ホストレベルのT細胞免疫
反応不顕性、または増加した免疫抑制集団に起因しなかった。4人の<pCR患者におい
て、Th1レパートリー(3.7対0.5、P=0.014)及び累積応答(192.3
対33.9、P=0.014)はHER2−パルスDC1ワクチン接種後に有意に改善し
た。
研究は、87人の患者を含んでいた。未治療HER2pos−IBC患者(n=22)
における抑制された抗HER2Th1応答は、T/C治療(n=65)の後に、全体的に
改善しなかった。術後補助T/Cと比較して、術前補助T/C(61.5%)はより高い
Th1レパートリー(1.5対0.8、P=0.048)と関連していた。pCR(n=
16)及び<pCR(n=24)患者は、人口統計学的/臨床的特性において差が認めら
れなかった一方、pCR患者はERneg腫瘍をより持っているようだった。pCR患者
は<pCR患者と比較して、劇的に高い抗HER2応答性(94%対33%、P=0.0
002)、レパートリー(3.3対0.3、p<0.0001)、及び累積応答(148
.2対22.4、p<0.0001)を示した。この相違は、CD4+T−bet+IF
N−γ+表現型によって媒介され、<pCR患者の免疫不全、ホストレベルのT細胞免疫
反応不顕性、または増加した免疫抑制集団に起因しなかった。4人の<pCR患者におい
て、Th1レパートリー(3.7対0.5、P=0.014)及び累積応答(192.3
対33.9、P=0.014)はHER2−パルスDC1ワクチン接種後に有意に改善し
た。
結論
抗HER2 Th1応答は、術前補助T/C後の病理学的応答と相関する新規の免疫で
ある。<pCR患者で術前補助療法を受けたHER−2発現患者において、抑制されたT
h1応答は、HER2Th1免疫介入で復元することができ、pCRまたは再発率を改善
させることができる。
抗HER2 Th1応答は、術前補助T/C後の病理学的応答と相関する新規の免疫で
ある。<pCR患者で術前補助療法を受けたHER−2発現患者において、抑制されたT
h1応答は、HER2Th1免疫介入で復元することができ、pCRまたは再発率を改善
させることができる。
したがって、高リスクの<pCRサブグループのために術前補助T/C療法への及び/
又は術後補助設定においてHER2標的Th1免疫介入の付加を、正当化することができ
る。さらに、抑制された抗HER2Th1免疫が、術後補助T/C−治療患者におけるそ
の後の再発と相関するという、参考例における実証を考慮すると、抗HER2Th1免疫
におけるリアルタイムの変動のために高リスク<pCR患者を監視することは、既存のX
線撮影の監視を補完し、治療的に介入する重要な手段を特定するのに役立つ。
又は術後補助設定においてHER2標的Th1免疫介入の付加を、正当化することができ
る。さらに、抑制された抗HER2Th1免疫が、術後補助T/C−治療患者におけるそ
の後の再発と相関するという、参考例における実証を考慮すると、抗HER2Th1免疫
におけるリアルタイムの変動のために高リスク<pCR患者を監視することは、既存のX
線撮影の監視を補完し、治療的に介入する重要な手段を特定するのに役立つ。
要約すると、これは、HER2pos−IBC患者において、術前補助T/C後の抗H
ER2 CD4+Th1免疫とpCRとの間の重要な関連性を最初に記載したものと考え
られる。因果関係は確認できないが、術前補助T/C後の<pCR患者において観察され
る劇的なIFN−γ+抗HER2Th1欠陥は、HER2Th1介入による免疫救出によ
り、これらの高リスク患者における結果を改善することで、標準的なHER2標的戦略を
補完できる可能性を提起している。
ER2 CD4+Th1免疫とpCRとの間の重要な関連性を最初に記載したものと考え
られる。因果関係は確認できないが、術前補助T/C後の<pCR患者において観察され
る劇的なIFN−γ+抗HER2Th1欠陥は、HER2Th1介入による免疫救出によ
り、これらの高リスク患者における結果を改善することで、標準的なHER2標的戦略を
補完できる可能性を提起している。
本明細書において引用される各々及びすべての特許、特許出願及び刊行物の開示は、本
明細書によりその全体が参照により本明細書の中に組み込まれる。
明細書によりその全体が参照により本明細書の中に組み込まれる。
本開示は、例示及び記述の目的のために提示されているが、排出又は限定を意図するも
のではない。多くの変更及び変形が当業者には明らかであろう。実施形態は、原則及び実
践的な応用を説明するために、そして当業者である他人が考えられる特定の用途に適した
様々な変形を有する様々な実施形態の開示を理解するために、選択され説明された。
のではない。多くの変更及び変形が当業者には明らかであろう。実施形態は、原則及び実
践的な応用を説明するために、そして当業者である他人が考えられる特定の用途に適した
様々な変形を有する様々な実施形態の開示を理解するために、選択され説明された。
例示的な実施形態は、添付の図面を参照して本明細書に記載されているが、実施形態は
これらの特定の記述に限定されず、様々な他の変更及び改変は当業者によって開示の範囲
または精神を逸脱せずにその中に考案されてもよいことを理解すべきである。添付の特許
請求の範囲は全てのそのような実施形態及び同等の変形を含むと解釈されることを意図す
る。
これらの特定の記述に限定されず、様々な他の変更及び改変は当業者によって開示の範囲
または精神を逸脱せずにその中に考案されてもよいことを理解すべきである。添付の特許
請求の範囲は全てのそのような実施形態及び同等の変形を含むと解釈されることを意図す
る。
Claims (21)
- 癌を発症した、またはおそれのある哺乳動物被験体を診断または治療するための方法で
あって:
前記被験体の血液試料由来の抗原提示細胞(APC)またはその前駆体及びCD4+T
細胞から、インターフェロン−γ(IFN−γ)の分泌を引き起こす循環抗癌CD4+T
h1応答を生成するステップ;及び
前記抗癌CD4+Th1応答を検出して前記応答が抑制されたかを決定するステップ;
を含む方法。 - 前記生成ステップがさらに:
前記血液試料から非培養の末梢血単核細胞(PBMC)を単離するステップ;及び
前記PBMCおよびその中のAPC前駆体の単球を、前記被験体が罹患した癌の種類に
基づく免疫原性MHCクラスII結合ペプチドを含む組成物でパルスし、それによって前
記PBMCにおけるCD4+Th1細胞を活性化してIFN−γを分泌させるステップ;
を含み、ならびに
前記検出ステップが、前記分泌されたIFN−γを検出するステップ;を含む、請求項
1に記載の方法。 - 前記生成ステップがさらに:
前記被験体試料由来の精製したCD4+T細胞を、前記被験体が罹患した癌の種類に基
づく免疫原性MHCクラスII結合ペプチドを含む組成物でパルスした前記被験体試料由
来のAPC、未成熟または成熟樹状細胞(DC)とともに共培養し、それにより、前記C
D4+T細胞を活性化してIFN−γを分泌するステップ;を含み、及び
前記検出ステップが前記分泌されたIFN−γを検出するステップ;を含む、請求項1
に記載の方法。 - 前記癌が、乳癌、脳腫瘍、膀胱癌、食道癌、肺癌、膵臓癌、肝臓癌、前立腺癌、卵巣癌
、結腸直腸癌、および胃癌から成る群から選択される、またはそれらの任意の組み合わせ
である、請求項1に記載の方法。 - 前記癌がHER2発現である、請求項4に記載の方法。
- 前記癌がHER2陽性乳癌であり、前記被験体がヒト女性であり、そして前記免疫原性
MHCクラスII結合ペプチドがHER2分子に基づく、請求項2に記載の方法。 - 前記癌がHER2陽性乳癌であり、前記被験体がヒト女性であり、そして前記免疫原性
MHCクラスIIペプチドがHER2分子に基づく、請求項3に記載の方法。 - 前記組成物がさらに:
ペプチド42〜56:HLDMLRHLYQGCQVV(配列番号:1);
ペプチド98〜114:RLRIVRGTQLFEDNYAL(配列番号:2);
ペプチド328〜345:TQRCEKCSKPCARVCYGL(配列番号:3);
ペプチド776〜790:GVGSPYVSRLLGICL(配列番号:4);
ペプチド927〜941:PAREIPDLLEKGERL(配列番号:5);
およびペプチド1166〜1180:TLERPKTLSPGKNGV(配列番号:6
);
を含むHER2 MHCクラスII結合ペプチドを含む、請求項6に記載の方法。 - 前記組成物がさらに:
ペプチド42〜56:HLDMLRHLYQGCQVV(配列番号:1);
ペプチド98〜114:RLRIVRGTQLFEDNYAL(配列番号:2);
ペプチド328〜345:TQRCEKCSKPCARVCYGL(配列番号:3);
ペプチド776〜790:GVGSPYVSRLLGICL(配列番号:4);
ペプチド927〜941:PAREIPDLLEKGERL(配列番号:5);
およびペプチド1166〜1180:TLERPKTLSPGKNGV(配列番号:6
);
を含むHER2 MHCクラスII結合ペプチドを含む、請求項7に記載の方法。 - 前記IFN−γの分泌が、IFN−γ酵素結合免疫アッセイ(ELISPOT)によっ
て測定される、請求項1に記載の方法。 - HER2特異的CD4+のTh1免疫応答の回復を、その必要のあるHER2陽性乳癌
患者において行う方法であって:
前記患者の抗HER2 CD4+Th1応答を上昇させるために、免疫原性HER2
MHCクラスII結合ペプチドをパルスした自己DCを含有する治療的有効量のDCワク
チンを前記患者に投与(DCワクチン接種)するステップ;及び
前記応答の増加量を決定するために請求項8に記載の方法に従って、
前記患者のDCワクチン接種前後の前記抗HER2 CD4+Th1応答を測定するステ
ップ;を含む方法。 - HER2特異的CD4+のTh1免疫応答の回復を、その必要のあるHER2陽性乳癌
患者において行う方法であって:
前記患者の抗HER2 CD4+Th1応答を上昇させるために、免疫原性HER2
MHCクラスII結合ペプチドをパルスした自己DCを含有する治療的有効量のDCワク
チンを前記患者に投与(DCワクチン接種)するステップ;及び
前記応答の増加量を決定するために請求項9に記載の方法にしたがって、前記患者のD
Cワクチン接種前後の前記抗HER2 CD4+Th1応答を測定するステップ;を含む
方法。 - 1または複数の追加の時間間隔で、請求項8に記載の方法を行うことにより前記患者の
DCワクチン接種後の前記抗HER2 CD4+Th1応答の回復状態を測定して前記応
答の回復を監視するステップをさらに含む、請求項11に記載の方法。 - 1または複数の追加の時間間隔で、請求項9に記載の方法を行うことにより前記患者の
DCワクチン接種後の前記抗HER2 CD4+Th1応答の回復状態を測定して前記応
答の回復を監視するステップをさらに含む、請求項12に記載の方法。 - 乳癌または他の癌のために個体をスクリーニングする方法であって:
請求項1に記載の方法に従って、前記個体の抗HER2 CD4+Th1応答を検出し
て健常な個体と比較して前記応答が抑制されているかを判断するステップ;を含む方法。 - 乳癌またはその他の癌を発症するリスクのある個体をスクリーニングする方法であって
:
請求項1に記載の方法に従って前記個体の抗HER2 CD4+Th1応答を検出して
健常な個体と比較して前記応答が抑制されているかを判断するステップ;を含む方法。 - HER陽性乳癌患者が、化学療法及びトラスツズマブのような標準的な非免疫療法に十
分に応答するかを予測する方法であって:
請求項1に記載の方法に従って、前記患者の抗HER2 CD4+Th1応答を検出す
るステップ;を含む方法。 - トラスツズマブ及び化学療法で治療されたHER2陽性侵襲性乳癌(HER2pos−
IBC)患者における新しい乳房イベントを予測する方法であって:
請求項1に記載の方法に従って前記患者の前記抗HER2 CD4+Th1応答を測定
して前記応答が抑制されたかを判断するステップ;を含む方法。 - HER2陽性乳癌患者において術前補助療法のトラスツズマブ及び化学療法(T/C)
後のHER2陽性乳癌の病理学的応答を予測する方法であって:
請求項1に記載の方法に従って、前記T/C治療後の前記患者における抗HER2 C
D4+Th1応答の程度を測定して、前記応答が、術前補助療法の病理学的完全奏効(術
後の病理で残存浸潤性乳癌がない)と関連する有意に高い抗HER2 CD4+Th1応
答であるか、又は非病理学的完全奏効に関連するより低い応答であるかを判断するステッ
プ;を含む、方法。 - 前記患者における非病理学的完全奏効の場合には、前記患者の抗HER2 CD4+T
h1応答が、請求項11の方法に従って、DCワクチン接種によって回復される、請求項
19に記載の方法。 - 癌を有するまたは発症するリスクがある哺乳動物被験体を診断または治療するための方
法であって:
前記被験体から血液を得るステップ;
その後抗癌CD4+Th1応答の抑制を測定する血液検査を行うステップ、及び、抑制
の場合には;
前記被験体に、DCワクチン、トラスツズマブのような標的癌治療、化学療法のような
従来の癌治療、外科手術及び放射線照射からなる群から選択される癌治療薬を有効量で投
与するステップ;を含む、方法。
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