JP2018512883A - 組換え型ヌクレオシド特異的リボヌクレアーゼ及びその生成法と使用法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、いずれもその全容が参照により本明細書に組み込まれている、2015年4月23日に出願された米国仮特許出願第62/151,546号、及び更に2015年4月23日に出願された米国仮特許出願第62/151,640号に関するものであり、その優先権を主張するものである。
本発明は、アメリカ国立科学財団によって与えられた認可番号CHE-1156449の下、及びアメリカ国立衛生研究所によって与えられた認可番号GM058843の下で政府の支援によってなされた。米国政府は、本発明において確固たる権利を有することができる。
本明細書に組み込まれその一部分を構成する添付の配列表は、本発明の実施形態を例証するものであり、上記の本発明の一般的記載及び下記の詳細な記載と共に本発明の原理の説明として役立つ。
MC1アミノ酸配列を鋳型として使用し、大腸菌の天然コドンバイアスがある合成遺伝子を、http://www.idtdna.com/CodonOptで利用可能なIntegrated DNA Technologies社からのコドン修飾ツールを使用して設計した。生じた配列は配列番号1として与えられる。BamH1部位とHindIII部位をそれぞれ5'末端及び3'末端に加えて、pET22bベクター(EMD-Millipore社)のIPTG(イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド)誘導的発現カセットへのクローニングを可能にした。このような戦略によって、pelBリーダーペプチドのN末端融合及びHis-タグ(His)6配列のC末端融合があるMC1ポリペプチドが生成すると予想した。pelBシグナルペプチドは原形質周辺空間に融合タンパク質を誘導し、これによって宿主細胞RNA機構に対するリボヌクレアーゼ活性の任意の考えられる有害な影響を未然に防ぐと予想される。
4つの異なる実験変数、タンパク質誘導の増殖段階、増殖温度、誘導時間、及びインデューサーの濃度を調べてRNaseMC1の誘導的発現に最適な条件を決定した。
誘導したMC1タンパク質を、バッチプロセス又は製造者の説明に従いニッケル-セファロース樹脂(Novagen社)を使用したカラムクロマトグラフィーのいずれかによって精製した。最適発現条件の調査中バッチ精製を利用し、カラムクロマトグラフィーは大規模精製のために実施した。精製したタンパク質収量はブラッドフォードアッセイによって測定した。溶出タンパク質は100mM酢酸アンモニウム(pH5.5)バッファーと交換し、Amicon Ultra 0.5mLフィルターを使用して濃縮した。
溶出画分中の推定MC1タンパク質の存在を、4%〜20%変性ポリアクリルアミドゲル(Precise、Thermo Scientific社)上の約24kDaポリペプチドの検出によって確認した。精製タンパク質の非特異的RNase活性は、10μL体積中で1時間37℃において、200pmolの基質オリゴヌクレオチド、UAACUAUAACG(配列番号12)、及び所定量(100〜800ng)のタンパク質をインキュベートすることによって試験した。260nmにおけるUV-吸光度測定値(A260)を、製造者の説明に従いナノフォトメーター(Implen社)でT0及び1時間後(T1h)において記録した。RNAオリゴマーを含有しタンパク質は含有しないバッファー対照も同一の形式でアッセイした。
tRNATyrI基質によって、MC1の切断性に対する修飾ヌクレオシドの影響の初期研究が可能となった。このtRNAは多数の修飾ヌクレオシド、4-チオウリジン[s4U8]、2'-O-メチルグアノシン[Gm17]、クエオシン[Q34]、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデノシン[ms2i6A37]、5-メチルウリジン[m5U54]、及び2つのシュードウリジン[Ψ39とΨ55]を含有する。ウリジンとシュードウリジンは質量に基づいて区別できない一方で、他の修飾は典型的非修飾ヌクレオシドからのその特徴的質量シフトによって直接確認することができ、MS/MSデータの調査によってtRNATyrI配列全体内に配置することができる。
特に興味深いのは、MC1の切断が修飾ウリジンの存在によって影響を受けるかどうかを決定することであった。tRNATyrIは3つの修飾ウリジン(s4U、m5U、及びΨ)を含有するので、LC-MS/MSデータは、s4Uとm5Uが切断に関して認識されるか又はされない予想消化産物をin silicoで生成し、これらの予想m/z値と実験データを比較することによって評価した。このデータによって、s4Uとm5UがMC1によって認識されないシナリオに対応するm/z値の存在が明らかとなった。例えば、消化産物UGGGG[s4U]pはm/z1012.3で検出し(図6A、図6B)、この配列はMS/MSによって確認された(図6C)。同様に、m/z1320.5での消化産物UCGAAGG[m5U]の検出によって記したようにm5Uは切断基質として認識されず、図9中に示したように、これはMS/MSデータによっても確認された。図9中、(A)は消化産物UCGAAGG[m5U](位置47〜54)に対応するm/z1320.2のXICであり、(B)は37.7分におけるXICと関連するMSであり、(C)はm/z1320.6前駆体イオンのCIDタンデム質量スペクトルである。MSにおいて観察した同時溶出イオン(m/z1284.6)は、tRNATyrIIイソデコーダー(RY1661)に属するMC1消化産物(UCACAGAC、位置46〜53)に対応する。配列情報を示すフラグメントイオンを標識する。星印(*)はc-タイプのフラグメントイオンを示し、黒丸記号(●)はy-タイプのフラグメントイオンを示す。
MC1がシュードウリジンを基質として認識する場合、m/z628.4(ΨC)及びm/z815.1(ΨCGAA)で予想消化産物を予想する。前者は図5中に例示したように発見し、後者と一致するデータは図10中に示す。図10中、(A)は消化産物ΨCGAAp(位置55〜59)に対応するm/z815.4のXICであり、(B)は37.7分におけるXICと関連するMSであり、(C)はm/z815.4前駆体イオンのCIDタンデムMSである。配列情報を示すフラグメントイオンを標識する。シュードウリジンを質量によってウリジンと区別することはできないが、配列UC又はUCGAAに対応する他のtRNATyrI消化産物は予想されない。したがって、ウリジンとシュードウリジンはMC1のヌクレオシド特異性の点で区別できない。
MC1によるtRNATyrIの切断パターンの分析によって、多量の修飾ヌクレオシドがウリジンに先行する場合、切断が観察されなかったことも明らかとなった。例えば、図11中に示したように、オリゴヌクレオチドU[Q]UA[ms2i6A]Aに関してそれぞれ3'-直鎖状リン酸と2',3'-環状リン酸消化産物と一致するm/z1100.5とm/z1091.7で検出した消化産物によって記したように、位置34におけるクエオシンはU35でMC1による切断を阻害した。これらの前駆体イオンのタンデムMSによって配列を確認し、ウリジンの認識及び切断に対する5'-ヌクレオシドの影響が明らかとなった。図11中、(A)はm/z1091.5のXICであり、(B)は48.3分におけるXICと関連するMSであり、(C)はm/z1091.7前駆体イオンのCIDタンデムMSであり、配列情報を示すフラグメントイオンを標識する。質量スペクトルによって、U[Q]UA[ms2i6A]Aの直鎖状(m/z1100.5)と2',3'-環状リン酸(m/z1091.7)消化産物(配列番号7の位置33〜38)の両方に関する二重帯電イオンが明らかとなる。オリゴヌクレオチドにおける115Daの損失によるクエオシンの断片化をMSにおいて示す。
ピクルス型品種のキュウリ(Cucumis sativus)の乾燥種子を粉末状にすりつぶし、激しく攪拌しながら0.14MのNaClを含有する5mMリン酸ナトリウム(pH7.2)を使用し一晩4℃で抽出した。次いで抽出物を4層のチーズクロスを介して濾過し、20%氷酢酸を用いてpH4まで酸性状態にした。次いで濾過物を20分間10,000rpmで遠心分離し、ペレットは廃棄した。次いで上澄みを更に30分間15,000rpmで遠心分離し、生成したペレットは再度廃棄した。次いで抽出物をWhatman No.1濾過紙を介して濾過し、大部分の残存粒子を除去した。
濃縮純タンパク質のアリコート(2.5μL、5μL、7μL)を、1μLの220mM酢酸アンモニウム及び200pmolのRNAオリゴヌクレオチド配列、AUCACCUCCUUUCU(配列番号13)と組み合わせた。オートクレーブ処理水を使用して10μLの一定体積にサンプルを希釈した。次いでこれらのサンプルを37℃又は50℃のいずれかで2時間インキュベートし、260nmにおける吸光度をモニタリングした。ブランク(オートクレーブ処理水及び酢酸アンモニウム)と陰性対照(オートクレーブ処理水、酢酸アンモニウム、及びRNAオリゴヌクレオチド)の両方もインキュベートした。A260における吸光度の増大は活性酵素の存在に原因があると考えられた。
精製したタンパク質をトリプシンで消化した。タンパク質分解酵素トリプシンでの処理後クサチビンのLC-MS分析によって同定したトリプシンによって生じたペプチドをTable 3 (表3)中に示す。2つの他の低分子シードコートタンパク質に関するトリプシンによって生じたペプチドも発見した。表中に挙げた最初の2つペプチドは文献中で以前から知られている。トリプシンによって生じたペプチドの一部のアミノ酸配列を、Protein Lynx(Waters社)を使用してキュウリタンパク質データベース(GCF_0000040752_ASM407V2_protein.faa)に対してブラスト処理して、RNaseMC様タンパク質として予想ポリペプチドを同定した。
酵素の活性を、タンパク質のアリコートとRNAをインキュベートしA260を調べることによって試験した。活性アッセイは、1μLの1:10希釈濃縮タンパク質、1μLの濃縮タンパク質、2μLの濃縮タンパク質、及び5μLの濃縮タンパク質を使用して実施した。それぞれのサンプルは10μLの合計体積を有しており、200pmolのRNAオリゴヌクレオチド配列、AUCACCUCCUUUCU(配列番号13)、及び1μLの220mM酢酸アンモニウムを含有していた。ブランクはタンパク質又はRNAを含有しておらず、陰性対照はタンパク質を含有していなかった。サンプルは37℃と50℃の両方でインキュベートし、吸光度はNanodropを使用して調べた。
Claims (20)
- ウリジン特異的組換え型RNaseMC1及びシチジン特異的組換え型RNaseクサチビンからなる群から選択される組換え型リボヌクレアーゼ。
- ウリジン特異的組換え型RNaseMC1が配列番号2を有し、シチジン特異的組換え型RNaseクサチビンが配列番号4を有する、請求項1に記載の組換え型リボヌクレアーゼ。
- 組換え型リボヌクレアーゼが配列番号2である、請求項1に記載の組換え型リボヌクレアーゼ。
- 組換え型リボヌクレアーゼが配列番号4である、請求項1に記載の組換え型リボヌクレアーゼ。
- RNA配列を分析する方法であって、
第一の組換え型リボヌクレアーゼでRNAを消化しRNA配列のヌクレオチドを含む消化産物を得る工程であって、第一の組換え型リボヌクレアーゼがウリジン特異的組換え型RNaseMC1とシチジン特異的組換え型RNaseクサチビンの少なくとも1つを含む、工程、及び
分析法を使用して消化産物を分析し少なくとも数個のヌクレオチドの同一性を得る工程
を含む、方法。 - 第二のリボヌクレアーゼでRNAを消化する工程を更に含む、請求項5に記載の方法。
- 第二のリボヌクレアーゼがRNaseT1、RNaseA、RNaseU2、及びこれらの混合物からなる群から選択される、請求項6に記載の方法。
- ウリジン特異的組換え型RNaseMC1が配列番号2を有し、シチジン特異的組換え型RNaseクサチビンが配列番号4を有する、請求項5から7のいずれか一項に記載の方法。
- 第一の組換え型リボヌクレアーゼがウリジン特異的組換え型RNaseMC1である、請求項5から7のいずれか一項に記載の方法。
- 第一の組換え型リボヌクレアーゼがシチジン特異的組換え型RNaseクサチビンである、請求項5から7のいずれか一項に記載の方法。
- 分析法が質量分析法、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法、ハイスループット塩基配列決定法、及びこれらの組合せからなる群から選択される、請求項5から7のいずれか一項に記載の方法。
- 分析法が質量分析法を含む、請求項11に記載の方法。
- 分析法がハイスループット塩基配列決定法を含む、請求項11に記載の方法。
- ハイスループット塩基配列決定法がRNA-Seqを含む、請求項13に記載の方法。
- RNAがmRNA、tRNA、rRNA、lncRNA、又はこれらの組合せである、請求項5から7及び12から14のいずれか一項に記載の方法。
- 組換え型リボヌクレアーゼを作製する方法であって、
宿主に組換え型DNA配列を導入する工程、
宿主内の組換え型DNA配列の発現を活性化し組換え型リボヌクレアーゼを生成する工程であって、組換え型リボヌクレアーゼがウリジン特異的組換え型RNaseMC1とシチジン特異的組換え型RNaseクサチビンの少なくとも1つを含む、工程、及び
宿主から組換え型リボヌクレアーゼを単離する工程
を含む、方法。 - 宿主が大腸菌である、請求項16に記載の方法。
- ウリジン特異的組換え型RNaseMC1が配列番号2を有し、シチジン特異的組換え型RNaseクサチビンが配列番号4を有する、請求項16又は17に記載の方法。
- 組換え型リボヌクレアーゼがウリジン特異的組換え型RNaseMC1である、請求項16から18のいずれか一項に記載の方法。
- 組換え型リボヌクレアーゼがシチジン特異的組換え型RNaseクサチビンである、請求項16から18のいずれか一項に記載の方法。
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