JP2018512438A - Dnaコード化化合物ライブラリーの固相合成方法 - Google Patents
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Abstract
Description
ビルディングブロック(Synthetic Building Block):シントンとも呼ばれ、物理的および化学的特性、及び生化学的性質を有する、新薬(西洋薬、農薬)の研究開発過程において必須な小分子化合物をいう。
固相担体:固相反応において担持するための固相物質をいう。
リンカー分子:結合分子とも呼ばれ、DNA、小分子化合物ライブラリー、及び固相担体を結合する、特定の官能基を有する化合物をいう。
CPG(Controlled Pore Glass):微多孔質ガラスビーズであり、材質がシリカである。 CPG球体の内部に数多くの不規則な細孔があり、間隙ネットワークが大きく、細孔のサイズを孔径と呼ばれ、孔径が安定する。
固相担体G-1とリンカー分子L-1とを反応させた後、分離、精製し、L-G-1を得るステップaと、
DNAとリンカー分子L-0とを反応させた後、分離、精製し、L-2を得るステップbと、
L-G-1とL-2とを反応させた後、分離、精製し、L-G-2を得るステップcと、
L-G-2の保護基を脱離させ、L-G-2-1を得るステップdと、
方法1、方法2、方法3若しくは方法4、又はそれらの任意の組合せを採用するステップeと、
L-G-3-I、L-G-3-1及び/又はL-G-3-2の固相担体を除去し、DNAコード化した化合物ライブラリーであるL-D-Tを得るステップfと、を含み、
前記方法1は、L-G-2-1とR1とを反応させ、分離、精製し、L-G-2-1-1を得た後、L-G-2-1-1をDNAコード化し、L-G-3-Iを得るステップを含み、
前記方法2は、
L-G-2-1と骨格分子とを反応させ、分離、精製し、L-G-2-2を得るステップiと、
L-G-2-2又はL-G-2-2の保護基を脱離させた後、R1と反応させ、分離、精製し、L-G-2-2-1を得、L-G-2-2-1をDNAコード化し、L-G-3-1を得るステップiiと、を含み、
前記方法3は、
L-G-2-1と骨格分子とを反応させ、分離、精製し、L-G-2-2を得るステップとi、
L-G-2-2又はL-G-2-2の保護基を脱離させた後、R1と反応させ、分離、精製し、L-G-2-2-1を得、L-G-2-2-1をDNAコード化し、L-G-3-1を得るステップiiと、
L-G-3-1又はL-G-3-1の保護基を脱離させた後、R2と反応させ、分離、精製し、L-G-3-1-1を得、L-G-3-1-1をDNAコード化し、L-G-3-2を得るステップiiiと、を含み、
前記方法4:
L-G-2-1と骨格分子とを反応させ、分離、精製し、L-G-2-2を得、L-G-2-2をDNAコード化し、L-G-3-1を得るステップiと、
L-G-3-1又はL-G-3-1の保護基を脱離させた後、R2と反応させ、分離、精製し、L-G-3-1-1を得、L-G-3-1-1をDNAコード化し、L-G-3-2を得るステップiiと、を含み、
ここで、R1、R2は、ビルディングブロックである。
さらに、ステップaにおいて、前記固相担体は、アミノ反応性官能基を有する固相担体から選択され、好ましくは、前記固相担体が
である。
さらに、ステップaにおいて、前記リンカー分子L-1は、エステル基、脂質基、チオエステル基、O-ニトロベンジル基、クマリン基、芳香族ケトン基、アジド基、ヒドロキシル基、メルカプト基、チオエーテル基、カルボキシル基、アルデヒド基、アミノ基、アミン基、アミド基、アルケニル基、アルキニル基からなる群から選択されるいずれか1種又は複数種の官能基を有する化合物であり、好ましくは、前記リンカー分子L-1は、
又は
である。
さらに、ステップaにおいて、固相担体G-1とリンカー分子L-1との重量比が1:0.08〜0.2であり、好ましくは、固相担体G-1とリンカー分子L-1との重量比が1:0.138である。
さらに、ステップaにおいて、反応溶媒は、ハロゲン化炭化水素系溶媒であり、好ましくは、反応溶媒は、ジクロロメタンである。
さらに、ステップaにおいて、反応温度は、15〜25℃、反応時間は、12〜16時間である。
さらに、ステップaにおいて、分離、精製の方法は、溶媒を除去し、固体を得た後、DMF及びジクロロメタンで固体を洗浄することである。
さらに、ステップaにおいて、前記L-G-1は、
である。
さらに、ステップbにおいて、前記DNAは、一本鎖DNAである。
さらに、ステップbにおいて、前記リンカー分子L-0は、エステル基、脂質基、チオエステル基、O-ニトロベンジル基、クマリン基、芳香族ケトン基、アジド基、ヒドロキシル基、メルカプト基、チオエーテル基、カルボキシル基、アルデヒド基、アミノ基、アミン基、アミド基、アルケニル基、アルキニル基からなる群から選択されるいずれか1種又は複数種を含む官能基を有する化合物であり、好ましくは、前記リンカー分子L-0は、
又は
である。
さらに、ステップbにおいて、反応は、縮合剤の条件下で進む。
さらに、ステップbにおいて、前記縮合剤は、2-クロロ-4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジンである。
さらに、ステップbにおいて、DNAとリンカー分子L-0とのモル比は、1:50~300であり、リンカー分子L-0と縮合剤とのモル比は、1:1〜2であり、好ましくは、DNAとリンカー分子L-0とのモル比は、1:100であり、リンカー分子L-0と縮合剤とのモル比は、1:1である。
さらに、ステップbにおいて、反応温度は、15〜25℃、反応時間は、12〜16時間である。
さらに、ステップbにおいて、分離、精製の方法は、pH=4〜5に調節し、その後、エタノールを加え、-20℃で沈殿した後、遠心して得られた固体を洗浄することである。
さらに、ステップbにおいて、前記L-2は、
である。
さらに、ステップcにおいて、反応は、有機溶媒の条件下で進み、好ましくは、反応は、ピリジンの条件下で進む。
さらに、ステップcにおいて、L-G-1とL-2とのモル比は2〜10:1であり、L-G-1とピリジンとの重量体積比は、1:0.8〜2.5 mg/μLであり、好ましくは、L-G-1とL-2とのモル比は5:1であり、L-G-1とピリジンとの重量体積比は、1:1 mg/μLである。
さらに、ステップcにおいて、反応温度は、20〜45℃、反応時間は、14〜30 時間であり、好ましくは、反応温度は、40℃、反応時間は、21hである。
さらに、ステップcにおいて、分離、精製の方法は、溶媒を除去し、固体を得、固体を水及びTEAA緩衝溶液で洗浄することである。
さらに、ステップcにおいて、前記L-G-2は、
である。
さらに、ステップdにおいて、前記保護基は、アミノ保護基であり、好ましくは、前記保護基は、フルオレニルメトキシカルボニルである。
さらに、ステップdにおいて、L-G-2は、ピペリジン、窒素含有溶媒の条件下でその保護基を脱離し、前記L-G-2とピペリジンとのモル体積比は、1:100~10000mol/Lであり、前記ピペリジンと窒素含有溶媒との体積比は、1〜4:5〜20である。
さらに、ステップdにおいて、前記L-G-2-1は、
である。
さらに、ステップeにおいて、DNAコード化の方法は、タグ配列iをL-G-2-1-1、L-G-2-2-1、L-G-3-1-1又はL-G-2-2のDNA直列に接続させることにより、タグ配列iでRiにタグを特異的に付け(ここで、Riは、ビルディングブロックであり、i=1,2であり)、合成の過程において、新しいRiを導入するたびに、DNA又はタグ配列(i-1)にタグ配列iを直列に接続させ、合成が終了した後、タグ配列iに末端配列を接続させることである。
さらに、ステップeにおいて、前記R1、R2は、それぞれ又は同時に、多官能基化合物から選択され、前記多官能基は、互いに独立してアミノ基、カルボキシル基、アルデヒド基、アルケニル基、アルキニル基、ハロゲン、アジド基、ヒドロキシル基、メルカプト基、フェニル基のうちのいずれか2種又は2種以上から選択され、好ましくは、前記R1、R2は、それぞれ又は同時にアミノ酸、置換されているか又は置換されていないカルボン酸、置換されているか又は置換されていないアミン、置換されているか又は置換されていないオレフィン、置換されているか又は置換されていないアルキン、置換されているか又は置換されていないアルデヒド、イソシアネートから選択され、より好ましくは、前記R1、R2は、それぞれ又は同時にイソシアネート、ベンジルアルコール又は安息香酸から選択される。
さらに、ステップeにおいて、前記骨格分子は、ヒドロキシル基、アミノ基、カルボキシル基、シアノ、アルデヒド基のうちのいずれか1種又は2種以上を含む。
さらに、ステップeにおいて、前記骨格分子は、p-ヒドロキシフェニルプロピオン酸、p-アミノ安息香酸、p-ヒドロキシフェニルグリシン、N-フルオレニルメトキシカルボニル-グリシン、N-フルオレニルメトキシカルボニル-L-フェニルアラニン、tert-ブチルイソニトリル、シクロヘキシルイソニトリル、3-メチルブチルアルデヒド、シクロペンチルアルデヒド、
のうちのいずれか1種又は2種以上から選択される。
さらに、ステップeの方法1において、反応は、有機アミン及び有機溶媒の条件下で進み、好ましくは、反応は、トリエチルアミン及びN,N-ジメチルホルムアミドの条件下で進む。
さらに、ステップeの方法1において、L-G-2-1と、R1と、有機アミンとのモル比は、1:50~500:50~500であり、L-G-2-1と有機溶媒とのモル体積比は、1:50~500 nmol/μLであり、好ましくは、L-G-2-1と、R1と、有機アミンとのモル比は、1:150:150であり、L-G-2-1と有機溶媒とのモル体積比は、1:240nmol/μLである。
さらに、ステップeの方法1において、反応温度は、25℃〜30℃、反応時間は、12h〜16hである。
さらに、ステップeの方法1において、分離、精製の方法は、溶媒を除去し、固体を得、固体を水及びTEAA緩衝溶液で洗浄することである。
さらに、ステップeの方法2又は方法3において、ステップiの反応は、縮合剤、有機アミン及び有機溶媒の条件下で進み、ステップeの方法4において、ステップiの反応は、有機溶媒の条件下で進み、好ましくは、反応は、2-(7-アゾベンゾトリアゾール)-N,N,N',N'-テトラメチル尿素ヘキサフルオロホスフェート、N,N-ジイソプロピルエチルアミン及び窒素含有溶媒の条件下で進み、
前記L-G-2-1と、骨格分子と、縮合剤と、有機アミンとのモル比は、1:50~500:50~500:50~500であり、前記化合物L-G-2-1と窒素含有溶媒とのモル体積比は、50~500 nmol/μLである。
さらに、ステップeの方法2、方法3又は方法4において、ステップiの反応温度は、25℃〜30℃、反応時間は、12h〜16hである。
さらに、ステップeの方法2、方法3又は方法4において、ステップiの分離、精製の方法は、溶媒を除去し、固体を得、固体を水及びTEAA緩衝溶液で洗浄することである。
さらに、ステップeの方法2、方法3又は方法4において、ステップiiの反応は、有機アミン又は有機ホスフィン及び有機溶媒の条件下で進み、好ましくは、前記有機アミンは、N,N-ジイソプロピルエチルアミン又はトリエチルアミンから選択され、前記有機ホスフィンは、トリフェニルホスフィンから選択され、前記有機溶媒は、ハロゲン化炭化水素系溶媒、エーテル系溶媒又は窒素含有溶媒から選択され、好ましくは、前記エーテル系溶媒は、テトラヒドロフランから選択され、前記窒素含有溶媒は、N,N-ジメチルホルムアミドから選択される。
さらに、ステップeの方法2、方法3又は方法4において、ステップiiの反応温度は、25℃〜30℃、反応時間は、12h〜16hである。
さらに、ステップeの方法2、方法3又は方法4において、ステップiiの分離、精製の方法は、溶媒を除去し、固体を得、固体を水及びTEAA緩衝溶液で洗浄することである。
さらに、ステップeの方法2、方法3又は方法4において、L-G-2-2又はL-G-3-1の保護基を脱離させる方法は、L-G-2-2又はL-G-3-1にピペリジンを加え、25℃〜30℃で2h〜6h撹拌しながら反応させた後、溶媒を除去し、固体を得、固体を水及びTEAA緩衝溶液で洗浄することである。
さらに、ステップeの方法3又は方法4において、R2との反応は、有機アミン及び有機溶媒の条件下で進み、好ましくは、前記有機アミンは、N,N-ジイソプロピルエチルアミン又はトリエチルアミンから選択され、有機溶媒は、ハロゲン化炭化水素系溶媒から選択される。
さらに、ステップeの方法3又は方法4において、R2との反応の反応温度は、25℃〜30℃、反応時間は、12h〜16hである。
さらに、ステップeの方法3又は方法4において、ステップiiiの分離、精製の方法は、溶媒を除去し、固体を得、固体を水及びTEAA緩衝溶液で洗浄することである。
さらに、ステップeにおいて、
前記L-G-3-Iは、
であり、
前記L-G-2-2は、
又は
であり、
前記L-G-3-1は、
、
又は
であり、
其中,Rjは、イソシアネートを形成できる基である。
さらに、ステップfにおいて、固相担体を除去する方法は
(a)L-G-3-I、L-G-3-1及び/又はL-G-3-2に塩基を加え、反応させた後、分離、精製すること、又は
(b)L-G-3-I、L-G-3-1及び/又はL-G-3-2にPBS緩衝溶液を加え、光源下で分解反応させた後、分離、精製することである。
さらに、(a)において、前記塩基は、有機塩基又は無機塩基から選択され、反応温度は、30~60℃、反応時間は、1~10時間であり、好ましくは、前記無機塩基は、アンモニア水であり、反応温度は、55℃、反応時間は、1時間である。
さらに、(b)において、前記光源の波長は、365nmであり、分解反応の反応温度は、25℃〜40℃、反応時間は、1h〜8hである。
さらに、(a)及び/又は(b)において、分離、精製の方法は、水及びTEAA緩衝溶液で洗浄して得られた濾液を濃縮した後、エタノールを加え、-20℃で沈殿した後、遠心して固体を得、洗浄することである。
さらに、ステップfにおいて、前記L-D-Tは、
、
、
、
又は
;
であり、Rjは、イソシアネートを形成できる基であり、R1-aは、CH2又はC6H5CH2CHであり、R1-bは、n-ブチル、イソブチル、tert-ブチル又はシクロヘキシルであり、R1-cは、n-プロピル、イソプロピル又はシクロペンチルであり、Rkは、カルボン酸、アルデヒド、イソシアネートのいずれか1種とアミノとの反応により生成される基である。
式I
(式Iにおいて、
は、化合物ライブラリーの骨格分子であり、
Ri'は、水素又はビルディングブロックから選択され、
Eは、アミン基、アルケニル基、アルキニル基、アミド基、脂質基、チオエーテル基又はアジド基から選択され、
Aは、ヒドロキシル基、メルカプト基から選択され、
Bは、
、
、
、
又は
から選択され、Rは、水素、C1〜C8アルキル基若しくはC1〜C8アルケニル基であり、又はB1における原子と環を形成し、B1は、置換されているか又は置換されていないアルキニル基、アミノ基、カルボキシル基、アルデヒド基、アジド基又はメルカプト基から選択され、
は、DNAを示す。)
さらに、前記骨格分子は、ヒドロキシル基、アミノ基、カルボキシル基、シアノ基、アルデヒド基のうちのいずれか1種又は2種以上を含む。
さらに、前記骨格分子は、p-ヒドロキシフェニルプロピオン酸、p-アミノ安息香酸、p-ヒドロキシフェニルグリシン、N-フルオレニルメトキシカルボニル-グリシン、N-フルオレニルメトキシカルボニル-L-フェニルアラニン、tert-ブチルイソニトリル、シクロヘキシルイソニトリル、3-メチルブチルアルデヒド、シクロペンチルアルデヒド、
のうちのいずれか1種又は2種以上からなる群から選択される。
さらに、前記Aの長さは、10〜50個の原子である。
さらに、以下のDNAコード化化合物ライブラリー、即ち、
、
、
、
又は
を含み、
Rjは、イソシアネートを形成できる基であり、R1-aは、CH2又はC6H5CH2CHであり、R1-bは、n-ブチル、イソブチル、tert-ブチル又はシクロヘキシルであり、R1-cは、n-プロピル、イソプロピル又はシクロペンチルであり、Rkは、任意のカルボン酸、アルデヒド、イソシアネートのいずれか1種とアミノとの反応により生成される基である。
(1)、G-1 (0.5 g, 負荷量:32 μmol/g)に3 mLの化合物L-1(69 mg, 0.1 mmol;製造者: Aldrich)を含有するジクロロメタン溶液を加え、室温で一晩反応させ、反応終了後、ろ過により溶媒を除去し、固体を得た。LC-MS検出により濾液に化合物L-1を含まないことを確認したまで、固体をそれぞれDMF(2 mL×3)及びジクロロメタン(2 mL×3)で洗浄し、L-G-1を得た。
L-G-1の一部を取り、ピペリジンでFmoc保護基を脱離させ、遊離アミノ基の紫外線吸収により定量した結果、CPGの負荷量は14.5 μmol/gであることを確認した。
(2)一本鎖DNAを30 μLのNaHCO3緩衝溶液に溶解させ、20 mlのL-0(1.0 mg, 3.0 μmol;製造者:Aldrich)のDMSO溶液、10 μLのDMT-MM (0.83 mg, 3.0 μmol)の水溶液を順次加え、室温で一晩反応させ、反応終了後、3MのHCl溶液を加えてpH=4〜5に調節し、240 μLのエタノールを加え、-20℃で2 時間沈殿した後、遠心し、固体を得えた。固体を85%のエタノールで1回洗浄し、L-2を得た。
(3)L-G-1 (10 mg, 140 nmol)に90 μLのL-2 (28 nmol)を含有する水溶液及び10 μLのピリジンを加え、40℃で21時間撹拌しながら反応させ、反応終了後、ろ過により溶媒を除去し、固体を得た。固体をそれぞれ蒸留水及び0.1MのTEAA緩衝溶液で3回洗浄し、L-G-2を得た。
(4)L-G-2に窒素含有溶媒及びピペリジンを加え、25℃〜30℃で4h~ 6h撹拌しながら反応させ、反応終了後、ろ過により溶媒を除去し、濾過ケーキを得た。濾過ケーキをそれぞれ蒸留水及び0.1MのTEAA緩衝溶液で3回洗浄し,L-G-2-1を得た。
前記L-G-2とピペリジンとのモル体積比は、1:(1〜4)mol/mlであり、前記ピペリジンと窒素含有溶媒との体積比は、(1〜4):(5〜20)である。
(5)L-G-2-1にカルボン酸官能基を有する骨格分子、2-(7-アゾベンゾトリアゾール)-N,N,N',N'-テトラメチル尿素ヘキサフルオロホスフェート、N,N-ジイソプロピルエチルアミン、及びハロゲン化炭化水素系溶媒を加え、25℃〜30℃で撹拌しながら12h〜16h反応させた後、ろ過により溶媒を除去し、濾過ケーキを得た。濾過ケーキそれぞれ蒸留水及び0.1MのTEAA緩衝溶液で3回洗浄し、L-G-2-2.aを得た。
前記L-G-2-1と、カルボン酸官能基を有する骨格分子と、2-(7-アゾベンゾトリアゾール)-N,N,N',N'-テトラメチル尿素ヘキサフルオロホスフェートと、N,N-ジイソプロピルエチルアミンとのモル比は1:(1〜2):(1〜2):(2〜4)であり、前記化合物L-G-2-1とハロゲン化炭化水素系溶媒との質量体積比は、1:(9〜20)g/mlである。
(6)L-G-2-2.aにRi(Riは、ビルディングブロックであり、イソシアネート、ベンジルアルコール又は安息香酸から選択されることがき、i=1、2又は3である)、N,N-ジイソプロピルエチルアミン、及びハロゲン化炭化水素系溶媒を加え、25℃〜30℃で12h〜16h撹拌しながら反応させた後、ろ過により溶媒を除去し、濾過ケーキを得た。濾過ケーキをそれぞれ蒸留水及び0.1MのTEAA緩衝溶液で3回洗浄し、L-G-2-2-1.aを得た。
各ステップのビルディングブロック化学反応による精製が終了した度に、特許出願(出願番号:201210555548.3、発明名称:「リード化合物の合成及びスクリーニング方法、並びにキット」)に開示されたDNAコード技術により本発明の化合物ライブラリーのR1、R2、R3に対して生体触媒によるDNAコードを行い、L-G-3-1.aを得た。
(7)塩基除去又は光除去の方法により、L-G-3-1.aにおけるCPGを除去し、DNAコード化した化合物ライブラリーL-D-T-1を得た。
Fmoc:フルオレニルメトキシカルボニル、DMF:N,N-ジメチルホルムアミド;DMSO:ジメチルスルホキシド;DMT-MM:2-クロロ-4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン;TEAA:酢酸トリエチルアミン;DIEA:N,N-ジイソプロピルエチルアミン。
G-1(0.5 g、CPG初期負荷量:32 μmol/g、上海凌江実業発展有限公司)に3 mLの化合物L-1(69 mg,0.1 mmol;製造者:Aldrich)を含有するジクロロメタン溶液を加え、室温で一晩反応させ、反応終了後、ろ過により溶媒を除去し、固体を得た。固体をそれぞれDMF(2 mL×3)及びジクロロメタン(2 mL×3)で洗浄し、L-G-1を得た。
L-G-1を取り、そこにピペリジンでFmoc保護基を脱離させ、Fmocの脱離生成物の紫外線吸収により定量した結果、L-G-1の負荷量が14.5 μmol/g、収量が91%であることを確認した。
一本鎖DNA(32.0 nmol,分子量7663.9)(一本鎖DNAの配列:GGAGCTTGTGAATTCTGGCACTCG)を30 μLのNaHCO3緩衝溶液に溶解させ、20 mlのL-0(1.0 mg,3.0 μmol;製造者:Aldrich)のDMSO溶液、10 μLのDMT-MM(0.83 mg,3.0 μmol)の水溶液を加え、室温で一晩反応させ、反応終了後、3MのHCl溶液を加えてpH=4〜5に調節し、240 μLのエタノールを加え、-20℃で2時間沈殿した後遠心し、固体を得た。固体を85%エタノールで1回洗浄し、L-2を得た。OD紫外線吸収により定量した結果、L-2の量が28.0 nmol、収量が80%であることを確認した。
MS (ESI) m/z 7979.6(M+1)+。
L-G-1 (10 mg, 140 nmol)に90 μLのL-2 (28 nmol)を含有する水溶液及び10 μLのピリジンを加え、40℃で21時間撹拌しながら反応させ、反応終了後、ろ過により溶媒を除去し、固体を得た。固体をそれぞれ蒸留水及び0.1MのTEAA緩衝溶液で3回洗浄し、L-G-2を得た。
L-G-2(8.0 mg)にDMF(160 μL)及びピペリジン(40 μL)を加え、25℃〜30℃で6h撹拌しながら反応させ、反応終了後、ろ過により溶媒を除去し、濾過ケーキを得た。濾過ケーキをそれぞれ蒸留水及び0.1MのTEAA緩衝溶液で3回洗浄し、L-G-2-1を得た。
L-G-2-1の一部(3.0 mg)を取り、そこに150 μLの濃アンモニア水を加え、55℃に加熱し、1時間反応させ、固相担体を除去し、ろ過後減圧蒸留して溶媒を除去し、固体をそれぞれ0.1 MのTEAA緩衝液及び蒸留水3回洗浄した。250 μLエタノール及び100 μL酢酸-酢酸ナトリウム緩衝液(pH=4.7,0.5 M)を加え、-20℃で沈殿し、DNA成分を得た。OD紫外線吸収により定量した結果、L-G-2-1におけるDNA物質量が6.0 nmol、収量が65%であることを確認した。
MS (ESI) m/z 8251.0(M+1)+。
L-G-2-1にカルボン酸官能基を有する骨格分子、2-(7-アゾベンゾトリアゾール)-N,N,N',N'-テトラメチル尿素ヘキサフルオロホスフェート、DIEA、及びDMFを加え、25℃〜30℃で16h撹拌しながら反応させた後、ろ過により溶媒を除去し、濾過ケーキを得た。濾過ケーキをそれぞれ蒸留水及び0.1MのTEAA緩衝溶液で3回洗浄し、L-G-2-2.aを得た。
MS (ESI) m/z 8369.7(M+1)+。
L-G-2-2.aにRj'(Rj'は、ビルディングブロックであり、Rjで置換されたイソシアネートから選択される)、DIEA及びDMFを加え、25℃〜30℃で16h撹拌しながら反応させた後、ろ過により溶媒を除去し、濾過ケーキを得た。濾過ケーキをそれぞれ蒸留水及び0.1MのTEAA緩衝溶液で3回洗浄し、L-G-2-2-1.aを得た。
発明名称:「リード化合物の合成及びスクリーニング方法、並びにキット」(出願番号:201210555548.3)に記載のDNAコード化方法により、L-G-2-2-1.aに対して固相条件下でのDNAコード化(一本鎖DNAの配列:GGAGCTTGTGAAGGCTGGCACTCG)を行い、L-G-3-1.aを得た。
コード化終了後、固体をそれぞれ0.1 MのTEAA緩衝溶液(4×100μL)及び蒸留水(4×100 μL)で洗浄し、さらに、100 μL蒸留水で洗浄した後、固体の一部を取り、そこに50μLのアンモニア水を加え、55℃で1時間反応させ、固体をそれぞれ0.1MのTEAA緩衝溶液及び蒸留水で3回洗浄し、得られた濾液をエタノールで沈殿し、凍結乾燥した後、アガロース電気泳動検出に使用した。
塩基除去又は光除去の方法によりL-G-3-1.aにおけるCPGを除去し、DNAコード化した化合物ライブラリーL-D-T-1を得た。
(1)実施例1における L-G-1の調製方法に従って、L-G-1を得た。
(2)実施例1におけるL-2の調製方法に従って、L-2を得た。
(3)実施例1におけるL-G-2の調製方法に従って、L-G-2を得た。
(4)実施例1におけるL-G-2-1の調製方法に従って、L-G-2-1を得た。
(5)L-G-3-1.bの調製
L-G-2-1(5.0 mg)に2-エチルフェニルイソシアネート(1.47 mg;製造者:Alfa)、トリエチルアミン(5 μL)及びDMF(15 μL)を加え、25℃〜30℃で16h反応させた後、ろ過により溶媒を除去し、濾過ケーキを得た。濾過ケーキをそれぞれ蒸留水及び0.1MのTEAA緩衝溶液で3回洗浄し、L-G-2-1-1.bを得た。
L-G-2-1-1.bの一部(2.0 mg)を取り、そこに150 μLの濃アンモニア水を加え、55℃に加熱し、1時間反応させて固相担体を除去し、ろ過後減圧蒸留して溶媒を除去し、固体をそれぞれ0.1 MのTEAA緩衝液及び蒸留水で3回洗浄した。250 μLエタノール及び100 μL酢酸-酢酸ナトリウム緩衝液(pH=4.7,0.5 M)を加え、-20℃で沈殿し、DNA成分を得た。OD紫外線吸収により定量した結果、L-G-2-1-1.bにおけるDNA物質量が2.5 nmol、収量が63%であることを確認した。
MS (ESI) m/z 8395.4(M+1)+。
発明名称:「リード化合物の合成及びスクリーニング方法、並びにキット」(出願番号:201210555548.3)に記載のDNAコード化方法により、L-G-2-1-1.bに対して、固相条件下でのDNAコード化(一本鎖DNAの配列:GGAGCTTGTGAACCCTGGCACTCG)を行い、L-G-3-1.bを得た。
コード化終了後、固体をそれぞれ0.1 MのTEAA緩衝溶液(4×100μL)及び蒸留水(4×100 μL)で洗浄し、さらに、100 μL蒸留水で洗浄した後、固体の一部を取り、50 μLのアンモニア水を加え、55℃で1 時間反応させ、固体をそれぞれ0.1MのTEAA緩衝溶液及び蒸留水で3回洗浄し、得られた濾液をエタノールで沈殿し、凍結乾燥し、アガロース電気泳動検出に使用した。
(6)実施例1におけるL-D-T-1の調製方法に従って、L-D-T-2を得た。
(1)実施例1における L-G-1の調製方法に従って、L-G-1を得た。
(2)実施例1におけるL-2の調製方法に従って、L-2を得た。
(3)実施例1におけるL-G-2の調製方法に従って、L-G-2を得た。
(4)実施例1におけるL-G-2-1の調製方法に従って、L-G-2-1を得た。
(5)L-G-2-2.cの調製
L-G-2-1(20 mg)にp-アミノ安息香酸(4.15 mg,製造者:Alfa)、2-(7-アゾベンゾトリアゾール)-N,N,N',N'-テトラメチル尿素ヘキサフルオロホスフェート(6.9 mg,製造者:Alfa)、DIEA(20 μL)、及びDMF(60 μL)を加え、25℃〜30℃で16h撹拌しながら反応させた後、ろ過により溶媒を除去し、濾過ケーキを得た。濾過ケーキをそれぞれ蒸留水及び0.1MのTEAA緩衝溶液で3回洗浄し、L-G-2-2.cを得た。
L-G-2-2.cの一部(2.0 mg)を取り、150 μLの濃アンモニア水を加え、55℃に加熱し、1時間反応させて固相担体を除去し、ろ過後減圧蒸留して溶媒を除去し、固体をそれぞれ0.1 MのTEAA緩衝液及び蒸留水で3回洗浄した。250 μLエタノール及び100 μL酢酸-酢酸ナトリウム緩衝液(pH=4.7,0.5 M)を加え、-20℃で沈殿し、DNA成分を得た。OD紫外線吸収により定量した結果、L-G-2-2.cにおけるDNA物質量が3.0 nmol、収量が75%であることを確認した。
MS (ESI) m/z 8369.7(M+1)+。
(6)L-G-3-1.cの調製
L-G-2-2.c(10 mg)に安息香酸(2.0 mg)、2-(7-アゾベンゾトリアゾール)-N,N,N',N'-テトラメチル尿素ヘキサフルオロホスフェート(6.9 mg,製造者: Alfa)、DIEA(20 μL)、及びDMF(60 μL)を加え、25℃〜30℃で16h撹拌しながら反応させた後、ろ過により溶媒を除去し、濾過ケーキを得た。濾過ケーキをそれぞれ蒸留水及び0.1Mの TEAA緩衝溶液で3回洗浄し、L-G-2-2-1.cを得た。
L-G-2-2-1.cの一部(2.0 mg)を取り、そこに150 μLの濃アンモニア水を加え、55℃に加熱し、1時間反応させて固相担体を除去し、ろ過後減圧蒸留して溶媒を除去し、固体をそれぞれ0.1 MのTEAA緩衝液及び蒸留水で3回洗浄した。250 μLエタノール及び100 μL酢酸-酢酸ナトリウム緩衝液(pH=4.7,0.5 M)を加え、-20℃で沈殿し、DNA成分を得た。OD紫外線吸収により定量した結果、L-G-2-2-1.cにおけるDNA物質量が1.5 nmol、収量が38%であることを確認した。
MS (ESI) m/z 8473.1(M+1)+。
発明名称:「リード化合物の合成及びスクリーニング方法、並びにキット」(出願番号:201210555548.3)に記載のDNAコード化方法により、L-G-2-2-1.cに対して、固相条件下でのDNAコード化(一本鎖DNAの配列:GGAGCTTGTGAAATCTGGCACTCG)を行い、L-G-3-1.cを得た。
コード化した後、固体をそれぞれ0.1MのTEAA緩衝溶液(4×100μL)及び蒸留水(4×100 μL)で洗浄し、100 μL蒸留水で洗浄し、洗浄した後、固体の一部を取り、そこに50 μLのアンモニア水を加え、55℃で1 時間反応させ、固体をそれぞれ0.1MのTEAA緩衝溶液及び蒸留水で3回洗浄し、得られた濾液をエタノールで沈殿し、凍結乾燥し、アガロース電気泳動検出に使用した。
(7)実施例1におけるL-D-T-1の調製方法に従って、L-D-T-3を得た。
(1)実施例1における L-G-1の調製方法に従って、L-G-1を得た。
(2)実施例1におけるL-2の調製方法に従って、L-2を得た。
(3)実施例1におけるL-G-2の調製方法に従って、L-G-2を得た。
(4)実施例1におけるL-G-2-1の調製方法に従って、L-G-2-1を得た。
(5)L-G-2-2.dの調製
L-G-2-1(20 mg)にS-2(17.4 mg,製造者:Alfa)、2-(7-アゾベンゾトリアゾール)-N,N,N',N'-テトラメチル尿素ヘキサフルオロホスフェート(6.9 mg,製造者:Alfa)、DIEA(20 μL)及びDMF(60 μL)を加え、25℃〜30℃で16h撹拌しながら反応させた後、ろ過により溶媒を除去し、濾過ケーキを得た。濾過ケーキをそれぞれ蒸留水及び0.1MのTEAA緩衝溶液で3回洗浄し、L-G-2-2.dを得た。
L-G-2-2.dの一部(2.0 mg)を取り、そこに150 μLの濃アンモニア水を加え、55℃に加熱し、1時間反応させて固相担体を除去し、ろ過後減圧蒸留して溶媒を除去し、固体をそれぞれ0.1MのTEAA緩衝液及び蒸留水で3回洗浄した。250 μLエタノール及び100 μL酢酸-酢酸ナトリウム緩衝液(pH=4.7,0.5 M)を加え、-20℃で沈殿し、DNA成分を得た。OD紫外線吸収により定量した結果、L-G-2-2.dにおけるDNA物質量が2.0 nmol、収量が50%であることを確認した。
MS (ESI) m/z 8698.0(M+1)+。
(6)、L-G-3-1.dの調製
L-G-2-2.d(15 mg)にピペリジン(40 μL)を加え、25℃〜30℃で6h撹拌しながら反応させた後、ろ過により溶媒を除去し、濾過ケーキを得た。濾過ケーキをそれぞれ蒸留水及び0.1MのTEAA緩衝溶液で3回洗浄し、固体を得た。固体にRj'(Rj'は、Rjで置換されたイソシアネートであり、 1.5 mg)、トリエチルアミン(10 μL)、及びDMF(100 μL)を加え、25℃〜30℃で16h反応させた後、ろ過により溶媒を除去し、濾過ケーキを得た。濾過ケーキをそれぞれ蒸留水及び0.1MのTEAA緩衝溶液で3回洗浄し、L-G-2-2-1.dを得た。
発明名称:「リード化合物の合成及びスクリーニング方法、並びにキット」(出願番号:201210555548.3)に記載のDNAコード化方法により、L-G-2-2-1.dに対して固相条件下でのDNAコード化(一本鎖DNAの配列:GGAGCTTGTGAATACTGGCACTCG)を行い、L-G-3-1.dを得た。
コード化した後、固体をそれぞれ0.1Mの TEAA緩衝溶液(4×100 μL)及び蒸留水(4×100 μL)で洗浄し、さらに100 μL蒸留水で洗浄し、洗浄した後、固体の一部を取り、50 μLアンモニア水を加え、55℃下で1 時間反応させ、固体をそれぞれ0.1MのTEAA緩衝溶液及び蒸留水で3回洗浄し、得られた濾液をエタノールで沈殿し、凍結乾燥し、アガロース電気泳動検出に使用した。
(7)、L-D-T-4化合物ライブラリーの合成
L-G-3-1.d(10 mg)を取り、そこに150 μLの濃アンモニア水を加え、55℃に加熱し、1時間反応させて固相担体を除去し、ろ過後減圧蒸留して溶媒を除去し、固体をそれぞれ0.1MのTEAA緩衝液及び蒸留水で3回洗浄した。250 μLエタノール及び100 μL酢酸-酢酸ナトリウム緩衝液(pH=4.7,0.5 M)を加え、-20℃で沈殿し、L-D-T-4を得た。
(1)実施例1における L-G-1の調製方法に従って、L-G-1を得た。
(2)実施例1におけるL-2の調製方法に従って、L-2を得た。
(3)実施例1におけるL-G-2の調製方法に従って、L-G-2を得た。
(4)実施例1におけるL-G-2-1の調製方法に従って、L-G-2-1を得た。
(5)L-G-2-2.eの調製
L-G-2-1にS-1、S-2、S-3及びDMFを加え、25~30℃で16h撹拌しながら反応させた後、ろ過により溶媒を除去し、濾過ケーキを得た。濾過ケーキをそれぞれ蒸留水及び0.1MのTEAA緩衝溶液で3回洗浄し、L-G-2-2.eを得た。
具体的には、L-G-2-1(20 mg)にN-フルオレニルメトキシカルボニル-グリシン(S-1)(製造者:Alfa,14.8 mg)、tert-ブチルイソニトリル(S-2)(製造者:Alfa,4.2 mg)、3-メチルブチルアルデヒド(S-3)(製造者:Alfa,4.3 mg)、及びDMF(100 μL)を加え、25℃〜30℃で16 h撹拌しながら反応させた後、ろ過により溶媒を除去し、濾過ケーキを得た。濾過ケーキをそれぞれ蒸留水及び0.1MのTEAA緩衝溶液で3回洗浄し、L-G-2-2.eを得た。
L-G-2-2.eの一部(2 mg)を取り、150 μLの濃アンモニア水を加え、55℃に加熱し、1時間反応させて固相担体を除去し、ろ過後減圧蒸留して溶媒を除去し、固体をそれぞれ0.1 MのTEAA緩衝液及び蒸留水で3回洗浄した。250 μLエタノール及び100 μL酢酸-酢酸ナトリウム緩衝液(pH=4.7,0.5 M)を加え、-20℃で沈殿し、DNA成分を得た。OD紫外線吸収により定量した結果、L-G-2-2.eにおけるDNA物質量が38 nmol、収量が76%であることを確認した。
MS (ESI) m/z 9111.4(M+1)+。
(6)、L-G-3-1.eの調製
発明名称:「リード化合物の合成及びスクリーニング方法、並びにキット」(出願番号:201210555548.3)に記載のDNAコード化方法により、L-G-2-2.eに対して固相条件下でのDNAコード化(一本鎖DNAの配列:GGAGCTTGTGAACGCTGGCACTCG)を行い、L-G-2-2-1.eを得た。コード化した後、固体をそれぞれ0.1MのTEAA緩衝溶液(4×100μL)及び蒸留水(4×100 μL)で洗浄し、さらに100 μL蒸留水で洗浄した後、固体の一部を取り、50 μLのアンモニア水を加え、55℃で1 時間反応させ、固体をそれぞれ0.1MのTEAA緩衝溶液及び蒸留水で3回洗浄し、得られた濾液をエタノールで沈殿し、凍結乾燥し、アガロース電気泳動検出に使用した。
L-G-2-2-1.e(10 mg)にピペリジン(40 μL)を加え、25℃〜30℃で6h撹拌しながら反応させた後、ろ過により溶媒を除去し、濾過ケーキを得た。濾過ケーキをそれぞれ蒸留水及び0.1MのTEAA緩衝溶液で3回洗浄し、固体を得た。固体にRk'(官能基にカルボン酸、アルデヒド基又はイソシアネートを有するビルディングブロックから選択できる)、2-(7-アゾベンゾトリアゾール)-N,N,N',N'-テトラメチル尿素ヘキサフルオロホスフェート(6.1 mg,製造者:Alfa)、DIEA(20 μL)、及びDMF (60 μL)を加え、25℃〜30℃で16h撹拌しながら反応させた後、ろ過により溶媒を除去し,濾過ケーキを得た。濾過ケーキをそれぞれ蒸留水及び0.1MのTEAA緩衝溶液で3回洗浄し、L-G-3-1-1.eを得た。
発明名称:「リード化合物の合成及びスクリーニング方法、並びにキット」(出願番号:201210555548.3)に記載のDNAコード化方法により、L-G-3-1-1.eに対して固相条件下でのDNAコード化(一本鎖DNAの配列:GGAGCTTGTGAAGCCTGGCACTCG)を行い、L-G-3-1.eを得た。コード化した後、固体をそれぞれ0.1MのTEAA緩衝溶液(4×100 μL)及び蒸留水(4×100 μL)で洗浄し、100 μL蒸留水で洗浄した後、固体の一部を取り、50 μLアンモニア水を加え、55℃で1 時間反応させ、固体をそれぞれ0.1MのTEAA緩衝溶液及び蒸留水で3回洗浄し、得られた濾液をエタノールで沈殿し、凍結乾燥し、アガロース電気泳動検出に使用した。
(7)、L-D-T-5化合物ライブラリーの合成
L-G-3-1.e(2 mg)を取り、そこにアンモニア水(40μL)を加え、55℃で1 h反応させ、固体をそれぞれ蒸留水及び0.1MのTEAA緩衝溶液で数回洗浄し、濾液を得た。濾液を濃縮し、適量のエタノールを加え、-20℃で沈殿し、2h後遠心し、固体を得た。固体を85%エタノールで1回洗浄し、DNAコード化した化合物ライブラリーL-D-T-5を得た。
(1)実施例1におけるL-G-1の調製方法に従って、L-G-1を得た。
(2)実施例1におけるL-2の調製方法に従って、L-2を得た。
(3)実施例1におけるL-G-2の調製方法に従って、L-G-2を得た。
(4)実施例1におけるL-G-2-1の調製方法に従って、L-G-2-1を得た。
(5)L-G-2-2.fの調製
L-G-2-1にS-1、S-2、S-3及びDMFを加え、25~30℃で16h撹拌しながら反応させた後、ろ過により溶媒を除去し、濾過ケーキを得た。濾過ケーキをそれぞれ蒸留水及び0.1MのTEAA緩衝溶液で3回洗浄し、L-G-2-2.fを得た。
具体的には、L-G-2-1(20 mg)にN-フルオレニルメトキシカルボニル-L-フェニルアラニン(S-1)(製造者:Alfa,15.1 mg)、シクロヘキシルイソニトリル(S-2)(製造者:Alfa,4.8 mg)、シクロペンチルアルデヒド(S-3)(製造者:Alfa,4.1 mg)、及びDMF(100 μL)を加え、25℃〜30℃で16 h撹拌しながら反応させた後、ろ過により溶媒を除去し、濾過ケーキを得た。濾過ケーキをそれぞれ蒸留水及び0.1MのTEAA緩衝溶液で3回洗浄し、L-G-2-2.fを得た。
上述L-G-2-2.fの一部(2 mg)を取り、150 μLの濃アンモニア水を加え、55℃に加熱し、1時間反応させて固相担体を除去し、ろ過後減圧蒸留して溶媒を除去し、固体をそれぞれ0.1 MのTEAA緩衝液及び蒸留水で3回洗浄した。250 μLエタノール及び100 μL酢酸-酢酸ナトリウム緩衝液(pH=4.7,0.5 M)を加え、-20℃で沈殿し、DNA成分を得た。OD紫外線吸収により定量した結果、L-G-2-2.fにおけるDNA物質量が35 nmol、収量が70%であることを確認した。
MS (ESI) m/z 9241.9(M+1)+。
(6)、L-G-3-1.fの調製
発明名称:「リード化合物の合成及びスクリーニング方法、並びにキット」(出願番号:201210555548.3)に記載のDNAコード化方法により、L-G-2-2.fに対して固相条件下でのDNAコード化(一本鎖DNAの配列:GGAGCTTGTGAACGATGGCACTCG)を行い、L-G-2-2-1.fを得た。コード化した後、固体をそれぞれ0.1MのTEAA緩衝溶液(4×100μL)及び蒸留水(4×100 μL)で洗浄し、さらに、100 μL蒸留水で洗浄した後、固体の一部を取り、そこに50 μLアンモニア水を加え、55℃で1時間反応させ、固体をそれぞれ0.1MのTEAA緩衝溶液及び蒸留水で3回洗浄し、得られた濾液をエタノールで沈殿し、凍結乾燥し、アガロース電気泳動検出に使用した。
L-G-2-2-1.f(10 mg)にピペリジン(40 μL)を加え、25℃〜30℃で6h撹拌しながら反応させた後、ろ過により溶媒を除去し、濾過ケーキを得た。濾過ケーキをそれぞれ蒸留水及び0.1MのTEAA緩衝溶液で3回洗浄し、固体を得た。固体にRk'(官能基にカルボン酸、アルデヒド基及イソシアネートを有するビルディングブロックから選択できる)、2-(7-アゾベンゾトリアゾール)-N,N,N',N'-テトラメチル尿素ヘキサフルオロホスフェート(6.1 mg,製造者:Alfa)、DIEA(20 μL)、及びDMF(60 μL)を加え、25℃〜30℃で16h撹拌しながら反応させた後、ろ過により溶媒を除去し、濾過ケーキを得た。濾過ケーキをそれぞれ蒸留水及び0.1MのTEAA緩衝溶液で3回洗浄し、L-G-3-1-1.fを得た。
発明名称:「リード化合物の合成及びスクリーニング方法、並びにキット」(出願番号:201210555548.3)に記載のDNAコード化方法によりL-G-3-1-1.fに対して固相条件下でのDNAコード化(一本鎖DNAの配列:GGAGCTTGTGAAGCGTGGCACTCG)を行い、L-G-3-1.fを得た。コード化した後、固体をそれぞれ0.1MのTEAA緩衝溶液(4×100 μL)及び蒸留水(4×100 μL)で洗浄し、さらに100 μL蒸留水で洗浄した後、固体の一部を取り、50 μLアンモニア水を加え、55℃で1時間反応させ、固体をそれぞれ0.1MのTEAA緩衝溶液及び蒸留水で3回洗浄し、得られた濾液をエタノールで沈殿し、凍結乾燥し、アガロース電気泳動検出に使用した。
(7)、L-D-T-6化合物ライブラリーの合成
L-G-3-1.f(2 mg)を取り、アンモニア水(40 μL)を加え、55℃で1 h反応させ、固体をそれぞれ蒸留水及び0.1MのTEAA緩衝溶液で2回洗浄し、濾液を得た。濾液を濃縮し、適量のエタノールを加え、-20℃で沈殿し、2h後遠心し、固体を得た。固体を85%エタノールで1回洗浄し、DNAコード化した化合物ライブラリーであるL-D-T-6を得た。
Claims (54)
- 固相担体G-1とリンカー分子L-1とを反応させた後、分離、精製し、L-G-1を得るステップaと、
DNAとリンカー分子L-0とを反応させた後、分離、精製し、L-2を得るステップbと、
L-G-1とL-2とを反応させた後、分離、精製し、L-G-2を得るステップcと、
L-G-2の保護基を脱離させ、L-G-2-1を得るステップdと、
方法1、方法2、方法3若しくは方法4、又はそれらの任意の組合せを採用するステップeと、
L-G-3-I、L-G-3-1及び/又はL-G-3-2の固相担体を除去し、DNAコード化した化合物ライブラリーであるL-D-Tを得るステップfと、を含み、
前記方法1は、L-G-2-1とR1とを反応させ、分離、精製し、L-G-2-1-1を得た後、L-G-2-1-1をDNAコード化し、L-G-3-Iを得るステップを含み、
前記方法2は、
L-G-2-1と骨格分子とを反応させ、分離、精製し、L-G-2-2を得るステップiと、
L-G-2-2又はL-G-2-2の保護基を脱離させた後、R1と反応させ、分離、精製し、L-G-2-2-1を得、L-G-2-2-1をDNAコード化し、L-G-3-1を得るステップiiと、を含み、
前記方法3は、
L-G-2-1と骨格分子とを反応させ、分離、精製し、L-G-2-2を得るステップとi、
L-G-2-2又はL-G-2-2の保護基を脱離させた後、R1と反応させ、分離、精製し、L-G-2-2-1を得、L-G-2-2-1をDNAコード化し、L-G-3-1を得るステップiiと、
L-G-3-1又はL-G-3-1の保護基を脱離させた後、R2と反応させ、分離、精製し、L-G-3-1-1を得、L-G-3-1-1をDNAコード化し、L-G-3-2を得るステップiiiと、を含み、
前記方法4は、
L-G-2-1と骨格分子とを反応させ、分離、精製し、L-G-2-2を得、L-G-2-2をDNAコード化し、L-G-3-1を得るステップiと、
L-G-3-1又はL-G-3-1の保護基を脱離させた後、R2と反応させ、分離、精製し、L-G-3-1-1を得、L-G-3-1-1をDNAコード化し、L-G-3-2を得るステップiiと、を含み、
ここで、R1、R2は、ビルディングブロックであることを特徴とするDNAコード化化合物ライブラリーの固相合成方法。 - 前記ステップaにおいて、前記固相担体は、PEG樹脂、PEGA樹脂、無機物固相担体、PEシートのうちいずれか1種又は複数種からなる群から選択されることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記ステップaにおいて、前記固相担体は、アミノ反応性官能基を有する固相担体から選択され、好ましくは、前記固相担体が
であることを特徴とする請求項1に記載の方法。 - 前記ステップaにおいて、前記リンカー分子L-1は、エステル基、脂質基、チオエステル基、O-ニトロベンジル基、クマリン基、芳香族ケトン基、アジド基、ヒドロキシル基、メルカプト基、チオエーテル基、カルボキシル基、アルデヒド基、アミノ基、アミン基、アミド基、アルケニル基、アルキニル基からなる群から選択されるいずれか1種又は複数種の官能基を有する化合物であり、好ましくは、前記リンカー分子L-1は、
又は
であることを特徴とする請求項1に記載の方法。 - 前記ステップaにおいて、固相担体G-1とリンカー分子L-1との重量比が1:0.08〜0.2であり、好ましくは、固相担体G-1とリンカー分子L-1との重量比が1:0.138であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記ステップaにおいて、反応溶媒は、ハロゲン化炭化水素系溶媒であり、好ましくは、反応溶媒は、ジクロロメタンであることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記ステップaにおいて、反応温度は、15〜25℃、反応時間は、12〜16時間であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記ステップaにおいて、分離、精製の方法は、溶媒を除去し、固体を得た後、DMF及びジクロロメタンで固体を洗浄することであることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記ステップaにおいて、前記L-G-1は、
であることを特徴とする請求項1に記載の方法。 - 前記ステップbにおいて、前記DNAは、一本鎖DNAであることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記ステップbにおいて、前記リンカー分子L-0は、エステル基、脂質基、チオエステル基、O-ニトロベンジル基、クマリン基、芳香族ケトン基、アジド基、ヒドロキシル基、メルカプト基、チオエーテル基、カルボキシル基、アルデヒド基、アミノ基、アミン基、アミド基、アルケニル基、アルキニル基からなる群から選択されるいずれか1種又は複数種を含む官能基を有する化合物であり、好ましくは、前記リンカー分子L-0は、
又は
であることを特徴とする請求項1に記載の方法。 - 前記ステップbにおいて、反応は、縮合剤の条件下で進むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記ステップbにおいて、前記縮合剤は、2-クロロ-4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジンであることを特徴とする請求項12に記載の方法。
- 前記ステップbにおいて、DNAとリンカー分子L-0とのモル比は、1:50~300であり、リンカー分子L-0と縮合剤とのモル比は、1:1〜2であり、好ましくは、DNAとリンカー分子L-0とのモル比は、1:100であり、リンカー分子L-0と縮合剤とのモル比は、1:1であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記ステップbにおいて、反応温度は、15〜25℃、反応時間は、12〜16時間であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記ステップbにおいて、分離、精製の方法は、pH=4〜5に調節し、その後、エタノールを加え、-20℃で沈殿した後、遠心して得られた固体を洗浄することであることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記ステップbにおいて、前記L-2は、
であることを特徴とする請求項1に記載の方法。 - 前記ステップcにおいて、反応は、有機溶媒の条件下で進み、好ましくは、反応は、ピリジンの条件下で進むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記ステップcにおいて、L-G-1とL-2とのモル比は、2〜10:1であり、L-G-1とピリジンとの重量体積比は、1:0.8〜2.5 mg/μLであり、好ましくは、L-G-1とL-2とのモル比は、5:1であり、L-G-1とピリジンとの重量体積比は、1:1 mg/μLであることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記ステップcにおいて、反応温度は、20〜45℃、反応時間は、14〜30 時間であり、好ましくは、反応温度は、40℃、反応時間は、21hであることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記ステップcにおいて、分離、精製の方法は、溶媒を除去し、固体を得、固体を水及びTEAA緩衝溶液で洗浄することであることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記ステップcにおいて、前記L-G-2は、
であることを特徴とする請求項1に記載の方法。 - 前記ステップdにおいて、前記保護基は、アミノ保護基であり、好ましくは、前記保護基は、フルオレニルメトキシカルボニルであることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記ステップdにおいて、L-G-2は、ピペリジン、窒素含有溶媒の条件下でその保護基を脱離し、前記L-G-2とピペリジンとのモル体積比は、1:100~10000mol/Lであり、前記ピペリジンと窒素含有溶媒との体積比は、1〜4:5〜20であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記ステップdにおいて、前記L-G-2-1は、
であることを特徴とする請求項1に記載の方法。 - 前記ステップeにおいて、DNAコード化の方法は、タグ配列iをL-G-2-1-1、L-G-2-2-1、L-G-3-1-1又はL-G-2-2のDNA直列に接続させることにより、タグ配列iでRiにタグを特異的に付け(ここで、Riは、ビルディングブロックであり、i=1,2であり)、合成の過程において、新しいRiを導入するたびに、DNA又はタグ配列(i-1)にタグ配列iを直列に接続させ、合成が終了した後、タグ配列iに末端配列を接続させることであることを特徴とする請求項1〜25のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ステップeにおいて、前記R1、R2は、それぞれ又は同時に、多官能基化合物から選択され、前記多官能基は、互いに独立してアミノ基、カルボキシル基、アルデヒド基、アルケニル基、アルキニル基、ハロゲン、アジド基、ヒドロキシル基、メルカプト基、フェニル基のうちのいずれか2種又は2種以上から選択され、好ましくは、前記R1、R2は、それぞれ又は同時にアミノ酸、置換されているか又は置換されていないカルボン酸、置換されているか又は置換されていないアミン、置換されているか又は置換されていないオレフィン、置換されているか又は置換されていないアルキン、置換されているか又は置換されていないアルデヒド、イソシアネートから選択され、より好ましくは、前記R1、R2は、それぞれ又は同時にイソシアネート、ベンジルアルコール又は安息香酸から選択されることを特徴とする請求項1〜25のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ステップeにおいて、前記骨格分子は、ヒドロキシル基、アミノ基、カルボキシル基、シアノ、アルデヒド基のうちのいずれか1種又は2種以上を含むことを特徴とする請求項1〜25のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ステップeにおいて、前記骨格分子は、p-ヒドロキシフェニルプロピオン酸、p-アミノ安息香酸、p-ヒドロキシフェニルグリシン、N-フルオレニルメトキシカルボニル-グリシン、N-フルオレニルメトキシカルボニル-L-フェニルアラニン、tert-ブチルイソニトリル、シクロヘキシルイソニトリル、3-メチルブチルアルデヒド、シクロペンチルアルデヒド、
のうちのいずれか1種又は2種以上から選択されることを特徴とする請求項1〜25のいずれか一項に記載の方法。 - 前記ステップeの方法1において、反応は、有機アミン及び有機溶媒の条件下で進み、好ましくは、反応は、トリエチルアミン及びN,N-ジメチルホルムアミドの条件下で進むことを特徴とする請求項1〜25のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ステップeの方法1において、L-G-2-1と、R1と、有機アミンとのモル比は、1:50~500:50~500であり、L-G-2-1と有機溶媒とのモル体積比は、1:50~500 nmol/μLであり、好ましくは、L-G-2-1と、R1と、有機アミンとのモル比は、1:150:150であり、L-G-2-1と有機溶媒とのモル体積比は、1:240nmol/μLであることを特徴とする請求項30に記載の方法。
- 前記ステップeの方法1において、反応温度は、25℃〜30℃、反応時間は、12h〜16hであることを特徴とする請求項1〜25のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ステップeの方法1において、分離、精製の方法は、溶媒を除去し、固体を得、固体を水及びTEAA緩衝溶液で洗浄することであることを特徴とする請求項1〜25のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ステップeの方法2又は方法3において、ステップiの反応は、縮合剤、有機アミン及び有機溶媒の条件下で進み、ステップeの方法4において、ステップiの反応は、有機溶媒の条件下で進み、好ましくは、反応は、2-(7-アゾベンゾトリアゾール)-N,N,N',N'-テトラメチル尿素ヘキサフルオロホスフェート、N,N-ジイソプロピルエチルアミン及び窒素含有溶媒の条件下で進み、
前記L-G-2-1と、骨格分子と、縮合剤と、有機アミンとのモル比は、1:50~500:50~500:50~500であり、前記化合物L-G-2-1と窒素含有溶媒とのモル体積比は、50~500 nmol/μLであることを特徴とする請求項1〜25のいずれか一項に記載の方法。 - 前記ステップeの方法2、方法3又は方法4において、ステップiの反応温度は、25℃〜30℃、反応時間は、12h〜16hであることを特徴とする請求項1〜25のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ステップeの方法2、方法3又は方法4において、ステップiの分離、精製の方法は、溶媒を除去し、固体を得、固体を水及びTEAA緩衝溶液で洗浄することであることを特徴とする請求項1〜25のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ステップeの方法2、方法3又は方法4において、ステップiiの反応は、有機アミン又は有機ホスフィン及び有機溶媒の条件下で進み、好ましくは、前記有機アミンは、N,N-ジイソプロピルエチルアミン又はトリエチルアミンから選択され、前記有機ホスフィンは、トリフェニルホスフィンから選択され、前記有機溶媒は、ハロゲン化炭化水素系溶媒、エーテル系溶媒又は窒素含有溶媒から選択され、好ましくは、前記エーテル系溶媒は、テトラヒドロフランから選択され、前記窒素含有溶媒は、N,N-ジメチルホルムアミドから選択されることを特徴とする請求項1〜25のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ステップeの方法2、方法3又は方法4において、ステップiiの反応温度は、25℃〜30℃、反応時間は、12h〜16hであることを特徴とする請求項1〜25のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ステップeの方法2、方法3又は方法4において、ステップiiの分離、精製の方法は、溶媒を除去し、固体を得、固体を水及びTEAA緩衝溶液で洗浄することであることを特徴とする請求項1〜25のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ステップeの方法2、方法3又は方法4において、L-G-2-2又はL-G-3-1の保護基を脱離させる方法は、L-G-2-2又はL-G-3-1にピペリジンを加え、25℃〜30℃で2h〜6h撹拌しながら反応させた後、溶媒を除去し、固体を得、固体を水及びTEAA緩衝溶液で洗浄することであることを特徴とする請求項1〜25のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ステップeの方法3又は方法4において、R2との反応は、有機アミン及び有機溶媒の条件下で進み、好ましくは、前記有機アミンは、N,N-ジイソプロピルエチルアミン又はトリエチルアミンから選択され、有機溶媒は、ハロゲン化炭化水素系溶媒から選択されることを特徴とする請求項1〜25のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ステップeの方法3又は方法4において、R2との反応の反応温度は、25℃〜30℃、反応時間は、12h〜16hであることを特徴とする請求項1〜25のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ステップeの方法3又は方法4において、ステップiiiの分離、精製の方法は、溶媒を除去し、固体を得、固体を水及びTEAA緩衝溶液で洗浄することであることを特徴とする請求項1〜25のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ステップeにおいて、
前記L-G-3-Iは、
であり、
前記L-G-2-2は、
又は
であり、
前記L-G-3-1は、
、
又は
であり、Rjは、イソシアネートを形成できる基であることを特徴とする請求項1〜25のいずれか一項に記載の方法。 - 前記ステップfにおいて、固相担体を除去する方法は
(a)L-G-3-I、L-G-3-1及び/又はL-G-3-2に塩基を加え、反応させた後、分離、精製すること、又は
(b)L-G-3-I、L-G-3-1及び/又はL-G-3-2にPBS緩衝溶液を加え、光源下で分解反応させた後、分離、精製することであることを特徴とする請求項1〜25のいずれか一項に記載の方法。 - 前記(a)において、前記塩基は、有機塩基又は無機塩基から選択され、反応温度は、30~60℃、反応時間は、1~10時間であり、好ましくは、前記無機塩基は、アンモニア水であり、反応温度は、55℃、反応時間は、1時間であることを特徴とする請求項45に記載の方法。
- 前記(b)において、前記光源の波長は、365nmであり、分解反応の反応温度は、25℃〜40℃、反応時間は、1h〜8hであることを特徴とする請求項45に記載の方法。
- 前記(a)及び/又は(b)において、分離、精製の方法は、水及びTEAA緩衝溶液で洗浄して得られた濾液を濃縮した後、エタノールを加え、-20℃で沈殿した後、遠心して固体を得、洗浄することであることを特徴とする請求項45に記載の方法。
- 前記ステップfにおいて、前記L-D-Tは、
、
、
、
又は
であり、Rjは、イソシアネートを形成できる基であり、R1-aは、CH2又はC6H5CH2CHであり、R1-bは、n-ブチル、イソブチル、tert-ブチル又はシクロヘキシルであり、R1-cは、n-プロピル、イソプロピル又はシクロペンチルであり、Rkは、カルボン酸、アルデヒド、イソシアネートのいずれか1種とアミノとの反応により生成される基であることを特徴とする請求項1〜25のいずれか一項に記載の方法。 - 式Iに表される一般式を有することを特徴とするDNAコード化化合物ライブラリー。
式I
(式Iにおいて、
は、化合物ライブラリーの骨格分子であり、
Ri'は、水素又はビルディングブロックから選択され、
Eは、アミン基、アルケニル基、アルキニル基、アミド基、脂質基、チオエーテル基又はアジド基から選択され、
Aは、ヒドロキシル基、メルカプト基から選択され、
Bは、
、
、
、
又は
から選択され、Rは、水素、C1〜C8アルキル基若しくはC1〜C8アルケニル基であり、又はB1における原子と環を形成し、B1は、置換されているか又は置換されていないアルキニル基、アミノ基、カルボキシル基、アルデヒド基、アジド基又はメルカプト基から選択され、
は、DNAを示す。) - 前記骨格分子は、ヒドロキシル基、アミノ基、カルボキシル基、シアノ基、アルデヒド基のうちのいずれか1種又は2種以上を含むことを特徴とする請求項50に記載のDNAコード化化合物ライブラリー。
- 前記骨格分子は、p-ヒドロキシフェニルプロピオン酸、p-アミノ安息香酸、p-ヒドロキシフェニルグリシン、N-フルオレニルメトキシカルボニル-グリシン、N-フルオレニルメトキシカルボニル-L-フェニルアラニン、tert-ブチルイソニトリル、シクロヘキシルイソニトリル、3-メチルブチルアルデヒド、シクロペンチルアルデヒド、
のうちのいずれか1種又は2種以上からなる群から選択されることを特徴とする請求項51に記載のDNAコード化化合物ライブラリー。 - 前記Aの長さは、10〜50個の原子であることを特徴とする請求項50に記載のDNAコード化化合物ライブラリー。
- 以下のDNAコード化化合物ライブラリー、即ち、
、
、
、
又は
を含み、
Rjは、イソシアネートを形成できる基であり、R1-aは、CH2又はC6H5CH2CHであり、R1-bは、n-ブチル、イソブチル、tert-ブチル又はシクロヘキシルであり、R1-cは、n-プロピル、イソプロピル又はシクロペンチルであり、Rkは、任意のカルボン酸、アルデヒド、イソシアネートのいずれか1種とアミノとの反応により生成される基であることを特徴とする請求項50に記載のDNAコード化化合物ライブラリー。
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